Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Адаптация дрожжей Yarrowia lipolytica к стрессовым воздействиям

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Адаптация дрожжей Yarrowia lipolytica к стрессовым воздействиям"

ООЗ164348

На правах рукописи БИРЮКОВА ЕЛЕНА НИКОЛАЕВНА

Адаптация дрожжей Уаггоп>1а Иро1уйса к стрессовым

воздействиям

(03 00 07 - микробиология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 2007

003164348

Работа выполнена в лаборатории анаэробного метаболизма микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им Г К Скрябина РАН и в Путинском государственном университете, г Пущино

Научный руководитель-

доктор биологических наук, проф В.К. Акименко

Официальные оппоненты

Доктор биологических наук Н В Доронина

Доктор биологических наук, профессор Т А Белозерская

(Институт биохимии им Баха РАН)

Ведущая организация-

Институт микробиологии им СН Виноградского РАН

Защита состоится 26 октября 2007 г в 9 00 час на заседании Диссертационного совета Д 002 121 01 при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им Г К Скрябина РАН

по адресу 142290, г. Пущино, Московской обл., проспект Науки, 5

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и физиологии микроорганизмов им Г К Скрябина РАН

Автореферат размещен на сайте- http7/www lbpm ru

Автореферат разослан » 2007 г

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук

ВМ Вагабов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

В природных экосистемах микроорганизмы постоянно подвергаются воздействию неблагоприятных факторов внешней среды (стрессоров) К ним относится недостаток элементов питания, активные формы кислорода (АФК), неоптимальная температура, pH, ионная сила, наличие ионов тяжелых металлов, высокая концентрация этанола, высушивание, воздействие токсических метаболитов растительного, микробного и антропогенного происхождения (Ruis and Schuller, 1995) Понятием «стресс» определяют общий комплекс неспецифических компенсаторно-приспособительных процессов, развивающихся у организмов в ответ на воздействие стрессоров

Первичный ответ микробной клетки направлен на то, чтобы нивелировать сдвиги внутриклеточного равновесия и обеспечить выживание Если клетка не способна преодолеть стресс, возможно возникновение сигналов, приводящих к глобальным изменениям метаболизма, вызывающим повреждение мембран, денатурацию и агрегацию клеточных белков (Svensater et al., 2000)

Обязательным признаком стрессового состояния является его обратимость, возможность возврата к нормальному функционированию при соответствующих изменениях факторов среды (Феофилова, 2003)

Исследование адаптационных механизмов у микроорганизмов особенно актуально, поскольку именно в стрессовых условиях они способны осуществлять процессы, важные для человека, такие как детоксикация вредных соединений, синтез и накопление различных метаболитов (антибиотиков, токсинов, пигментов и др )

В отличие от высших организмов, микроорганизмы ограничены в выборе своего микроокружения, но способны включать специальные реакции в ответ на изменения окружающей среды, что обеспечивает им выживание и конкурентоспособность по отношению к другим организмам Кроме того, вследствие более примитивной организации и отсутствия промежуточных стадий регуляции микроорганизмы являются удобным объектом исследований, поскольку обладают высокой адаптационной способностью и выживаемостью в стрессовых условиях (Плакунов и др, 2004)

На данный момент различные аспекты адаптации к стрессовым воздействиям изучены для сравнительно ограниченного числа микроорганизмов Исследования в основном проводились на бактериях Е colt и дрожжах Saccharomyces cerevisiae, а также фрагментарно - на Candida albicans и грибах-Neurospora crassa

Объектом данного исследования были выбраны дрожжи Yarrowia hpolytica, поскольку они являются продуцентами многих практически ^ " ^ ценных соединений (органических кислот, липаз, цитохрома с и др) Кроме f \ того, Y hpolytica представляют собой классическую модель для изучения ~~ 1

1

энергетического обмена клеток - их митохондриальная дыхательная цепь содержит три пункта сопряжения, в чем сходна с дыхательной цепью животных и растительных клеток

Цель данной работы заключалась в выявлении адаптационного потенциала дрожжей Г 1гро1уПса в различных стрессовых условиях (окислительный, тепловой, этанольный стрессы) Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи

1 Охарактеризовать выживаемость и дыхательную активность Г Ьро1уПса из различных фаз роста при воздействии оксидантов, температуры и этанола, а также выявить условия повышения устойчивости клеток к этим стрессорам.

2 Определить участие основных антиоксидантных ферментов (каталазы, супероксиддисмутазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, глутатионредуктазы), а также НАД+-зависимой алкогольдегидрогеназы в защите клеток от стрессовых воздействий

3 Исследовать динамику внутриклеточного содержания цАМФ, как одного из основных факторов, контролирующих действие защитных механизмов

4 Изучить влияние стрессовых воздействий на ультраструктурную организацию клеток V 1гро1уПса

Научная новизна работы.

Впервые в сравнительном аспекте изучены и систематизированы данные о механизмах адаптации аэробных дрожжей У кро1уйса к действию оксидантов, температуры и этанола Установлено, что клетки, адаптированные (тепловая «закалка» - 37°С, воздействие малых доз оксидантов - 0 5 мМ Н202, 50 мкМ менадиона, 5 мкМ юглона, преинкубация 4% этанолом, 60 мин) к одному етрессорному воздействию, способны индуцировать развитие устойчивости к другим стрессорам Предполагается наличие общего фактора, контролирующего запуск защитных механизмов у дрожжей У Ьро1уПса

Детальные исследования дыхательной активности клеток в различных стрессовых условиях выявили, что основная, цитохромная, дыхательная цепь является одной из мишеней действия стрессоров В процессе адаптации 7. Ьро1уйса активировался альтернативный путь переноса электронов, непосредственно участвующий в сохранении устойчивости клеток

Показана однотипность ответа клеток на различные стрессовые воздействия отрицательная динамика внутриклеточного уровня цАМФ коррелировала с увеличением активностей антиоксидантных ферментов (каталазы, супероксиддисмутазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, глутатионредуктазы) и НАД+-зависимой алкогольдегидрогеназы, а также появлением альтернативной оксидазы и существенными изменениями ультраструктуры клеток

Практическая значимость

Представленные в работе результаты можно рассматривать как пример реакции биологической системы на неблагоприятные факторы внешней среды

Изучение адаптивного ответа клеток на стрессовые воздействия необходимо при глобальном химическом загрязнении окружающей среды, а также в связи с важной ролью дрожжей в трофических цепях и сохранении микробного разнообразия сложившихся наземных биоценозов

Полученные знания об адаптационных механизмах дрожжей Y hpolytica также могут быть использованы в биотехнологии, при проведении процессов микробиологического синтеза различных соединений

Полученные результаты вносят существенный вклад в современные представления о механизмах адаптации микроорганизмов к стрессовым воздействиям и возможной их роли в эволюционных процессах

Апробация работы.

Основные материалы диссертации были представлены на 3-й Международной конференции по Yarrowia hpolytica «Биология клетки и биотехнология нетрадиционных дрожжей» (Дрезден, Германия, 2002), на 11-м съезде ICY (Бразилия, 2004), на 8-ой школе конференции молодых ученых (Пущино, 2004), на конференции «Проблемы загрязнения окружающей среды» (Пермь, 2005)

Публикации.

Материалы диссертации представлены в 3-х научных статьях (1 принята к печати) и 4 тезисах.

Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на ^страницах машинописного текста и содержит разделы введение, обзор литературы (главы 1, 2, 3), материалы и методы исследования (глава 4), результаты и обсуждение (главы 5, 6, 7, 8, 9, 10), выводы и список литературы (250 источников) В тексте представлено 28 рисунков и 4 таблицы

Благодарность. Автор выражает искреннюю благодарность и признательность научному руководителю д б н, проф Акименко В К, д б н, в н.с Меденцеву А Г., к б н , с н с Аринбасаровой А Ю , к б н, с н.с Соколову АП, дбн, проф Троценко ЮА. за помощь и поддержку при выполнении этой работы, кбн, снс Сузиной НЕ - за проведение электронно-микроскопических исследований

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Материалы и методы исследования.

В работе изучались дрожжи Yarrowia hpolytica ВКМ Y-2378 (syn Yarrowia hpolytica Y-155), полученные из ВКМ ИБФМ им Г К Скрябина РАН Выращивание проводили на солевой среде Ридер, содержащей 1%

3

глюкозу в качестве единственного источника углерода и энергии Исследовались клетки из экспоненциальной (10-12 ч) и стационарной (24 ч) фаз роста

Определение активности дыхания. Скорость потребления кислорода измеряли полярографически с помощью закрытого тефлоновой плёнкой платинового электрода типа Кларка Конечный объем пробы составлял 2 мл, температура измерения 20-22°С Концентрацию кислорода, растворенного в среде, принимали равной 250 мкМ Активность дыхания выражали в нмоль CV(mhh на 1 мг сухих клеток)

Условия окислительного стресса были смоделированы путем инкубирования клеток в присутствии Н202, или супероксид-генерирующих агентов менадиона (2-метил-1,4-нафтохинон) и юглона (5-окси-1,4-нафтохинон), теплового стресса - путём инкубирования клеток при температуре 45°С, этанольного стресса - путём инкубирования клеток в присутствии различных концентраций этанола

Для адаптации клетки подвергали мягким стрессовым воздействиям обработке малыми дозами оксидантов (Н202, менадиона, юглона), этанола, а также инкубации при 37°С Варьировали концентрацию стрессоров и время предобработки

Определение выживаемости клеток. Выживаемость клеток определяли путем их высева на сусло-агар Учет колоний осуществляли после 48 - 72 ч культивирования при 29°С

Экстракция и определение цАМФ. Экстракцию цАМФ из клеток осуществляли хлорной кислотой (5%). Для этого клеточную суспензию смешивали с хлорной кислотой (50%) и инкубировали на ледяной бане Экстракт нейтрализовали 5н КОН при интенсивном перемешивании Осадок удаляли центрифугированием при 15000 g 60 мин Экстракт хранили при -15°С Определение цАМФ проводили по стандартной методике, используя набор фирмы «Amersham»

Получение бесклеточных экстрактов. Клетки дважды промывали дистиллированной водой и суспендировали в 50 мМ трис-фосфатном буфере (рН 7 0), содержащем 0.5 мМ ФМСФ (фенилметилсульфонилфторид) -ингибитор протеаз, после чего разрушали на прессе Френча Гомогенат центрифугировали при 105000 g 60 минут Осадок отбрасывали, а супернатант использовали для определения активности ферментов

Определение еупероксиддисмутазы (СОД). Активность СОД определяли по ингибированию восстановления 10 мкМ цитохрома с (при 550 нм) в присутствии 0 5 мМ ксантина и 0 5 Е ксантиноксидазы (Mccord and Fndovich, 1969) За единицу активности принимали количество фермента, вызывающее 50% ингибирование скорости восстановления цитохрома с

Определение каталазы. Активность каталазы оценивали по изменению поглощения Н202, Е240 = 0 32 mM'^cm"1 (Beers and Sizer, 1952) Среда измерения содержала трис-фосфатный буфер (50 мМ, рН 7 0) и Н202 (25 мМ).

Определение глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы. Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы определяли по восстановлению НАДФ+, Е340 = 6 22 мМ'^см"1 (Као and Hassan, 1985) Среда измерения содержала трис-фосфатный буфер (50 мМ, pH 7 0) и НАДФ+ (0 5 мМ)

Определение глутатионредуктазы. Активность глутатионредуктазы измеряли по убыли НАДФН в присутствии окисленного глутатиона, Е340 = 6 22 мМ'^см"1 (Strutton et al, 1987) Среда измерения содержала трис-фосфатный буфер (50 мМ, pH 7 0), НАДФН (0 15 мМ), MgCl2 (3 мМ), окисленный глутатион (10 мМ)

Определение НАД+-зависимой алкогольдегидрогеназы. Активность НАД^-зависимой алкогольдегидрогеназы измеряли по восстановлению НАД1", Е340 = 6 22 мМ'^см"1 (Barth et al, 1997) Среда измерения содержала трис-фосфатный буфер (50 мМ, pH 8 8), НАД4" (200 мкМ) и этанол (50 мМ)

Спектрофотометрические измерения проводили на регистрирующем спектрофотометре «Shimadzu» UV-160 (Япония) Активность ферментов выражали в мкмоль /(мин на 1 мг белка)

Определение белка. Содержание белка определяли с использованием биуретового реактива (при 540 нм) (Gornall et al, 1949) Изучение ультраструктуры клеток.

Клетки центрифугировали при 15000 g, осадок фиксировали в 1 5%-ом растворе глутарового альдегида в 0 05М какодилатном буфере (pH 7 2) при 4°С в течение 1 час, трижды отмывали тем же буфером и дополнительно фиксировали в 1%-ом растворе 0s04 в 0 05М какодилатном буфере (pH 7 2) в течение 3 ч, при 20°С После обезвоживания спиртом материал заключали в эпоксидную смолу Ероп 812 Ультратонкие срезы монтировали на опорные сеточки, контрастировали в течение 30 мин в 3% растворе уранилацетата в 70% спирте и дополнительно контрастировали цитратом свинца по Рейнольдсу (Reynolds, 1963) Ультратонкие срезы просматривали в электронном микроскопе JEM-100В (JEOL, Япония) при ускоряющем напряжении 80 кв

В работе использовали коммерческий препарат Н202 (3%), юглон, цитохром с фирмы , «Sigma», ФМСФ, менадион, ксантин, ксантиноксидазу фирмы «ICN»

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Устойчивость дрожжей F. lipolytica к окислительному стрессу

Данные, характеризующие чувствительность клеток к различным концентрациям оксидантов, представлены на рис 1 (А - С) Увеличение концентрации оксиданта приводило к снижению выживаемости Y lipolytica Для клеток из экспоненциальной фазы роста летальными (выживаемость -менее 1%), являлись концентрации Н202 - 120 мМ, менадиона - 0 5 мМ и юглона - 0 05 мМ (кривые 1) Следует отметить, что чувствительность клеток к Н202 и супероксидгенерирующим агентам (менадион, юглон), отличалась на 2-3 порядка

Летальная концентрация оксидантов может быть увеличена путем предварительной обработки клеток низкими дозами оксидантов Нг02 - 0 5 мМ, менадиона - 0 05 мМ, юглона - 0 005 мМ Эти концентрации были выбраны в соответствии с данными по выживаемости, которая в указанных условиях сохранялась на достаточно высоком уровне - 90 % (рис 1 А - С, кривые 1) Оптимальное время предобработки оксидантами - 60 мин, было выбрано эмпирически

Менадион, мМ

а? 100

I

1 \.

я 0,014— -------

т-

0,025

0,05

Рис. 1. Устойчивость Y hpolyhca из экспоненциальной (1,3) и стационарной (2) фаз роста к различным концентрациям оксидантов.

1, 2 - без предобработки, 3 - предобработка Н202 (0 5 мМ) (А), менадионом (0 05 мМ) (Б), юглоном (0 005 мМ) (С), 60 мин

Юглон, мМ

На рис 2 представлены данные по выживаемости У 1гро\уПса после воздействия различных концентраций этанола в течение 60 мин (клетки выращены на 1% глюкозе) Увеличение концентрации спирта приводило к резкому снижению выживаемости клеток из экспоненциальной фазы роста (кривая 1) Летальная концентрация этанола составляла 15% Предварительная обработка клеток малой дозой спирта приводила к увеличению устойчивости Для адаптирования клеток была выбрана концентрация этанола 5%, в соответствии с данными по выживаемости, представленными на рис 2 (кривая 3)

Была также изучена термотолерантность Г Нро1уПса различных фаз роста (рис 3). Клетки из экспоненциальной фазы роста были высокочувствительны к повышенной температуре (45°С) через 4 мин жизнеспособными оставались лишь 4% клеток (кривая 1) При 37°С выживаемость сохранялась на исходном уровне в течение 60 мин (кривая 3) Выдерживание клеток при этой температуре, 60 мин (адаптация) обеспечивала их устойчивость при 45°С (кривая 4)

б

Следует отметить, что клетки 7 Ьро1уйса из стационарной фазы роста (рис 1, 3, кривые 2, рис 2, кривая 4) были более устойчивы ко всем стрессорам, чем клетки из экспоненциальной фазы (рис 1-3, кривые 1) Это обусловлено тем, что в процессе перехода в стационарную фазу роста в клетках происходит включение механизмов, повышающих их устойчивость к стрессовым воздействиям

Время инкубации, мин

Рис. 2 Устойчивость К Л\polytica, из экспоненциальной (1, 2, 3) и стационарной (4) фаз роста к этанолу (15%)

1, 4 - без обработки, 2 - предобработка этанолом, 2%, 3 - предобработка этанолом, 5%

о 10 20 зо

Время инкубации, мин.

Рис 3. Устойчивость ¥ Ьро1уПса из экспоненциальной (1, 3; 4) и стационарной (2) фаз роста к тепловому воздействию.

1, 2 - 45°С, 3 - 37°С, 4 - 45°С, преинкубация при 37°С

Была изучена возможность перекрестной устойчивости клеток Как показано на рис 4 (кривая 2), предобработка клеток из экспоненциальной фазы роста нелетальной дозой Нг02 (0 5 мМ, 60 мин) приводила к увеличению выживаемости (до 30%) при последующем воздействии высокой температуры (45°С)

И наоборот, как показано на рис 5 (кривая 2), тепловая «закалка» обеспечивала повышение устойчивости к действию оксидантов, (120 мМ Н202) Адаптация в присутствии этанола (5%) приводила к повышению устойчивости к воздействию как оксидантов, так и температуры (рис 6, кривые 3,4)

Литературные данные по перекрестной устойчивости у дрожжей при воздействии различных стрессовых факторов фрагментарны и неоднозначны Так, клетки 51 сегеумше после предобработки Н2О2 (СоНшвоп е1 а1, 1992), или менадионом (БЬйегу-О'Впеп й а1, 1993), оставались чувствительными к повышенной температуре, а мягкая тепловая предобработка (37°С) не вызывала развития устойчивости к Н2О2 (СоШпвоп е1 а1, 1992) Тот факт, что дрожжи различных таксономических групп по-разному реагируют на стрессоры, говорит о вариабельности адаптивных механизмов и предполагает, что действие стрессоров, возможно, обусловлено их специфичностью и мишенью в клетке, на которую направлено их воздействие

Время инкубации, мин

Рис 4. Устойчивость К Лро1уПса к тепловому воздействию (45°С) в зависимости от предобработки малыми дозами оксидантов

1- без предобработки (контроль), 2 - предобработка Н2Ог (0 5 мМ, 60 мин), 3 - предобработка менадионом (0 05 мМ, 60 мин)

Время инкубации, мяв

Рис. 5 Устойчивость К Ьро1уйса в условиях окислительного стресса (120 мМ Н2О2) в зависимости от тепловой «закалки» и предобработки малой дозой оксиданта 1 - без предобработки (контроль), 2 -преинкубация при 37°С (60 мин), 3 -предобработка нелегальной дозой На02 (0 5 мМ, 60 мин)

Время инкубации, мин

Рис. 6. Влияние предобработки этанолом на выживаемость ¥ 11ро1упса из экспоненциальной фазы роста в условиях теплового (1, 3) и окислительного (2, 4) стрессов. Клетки выращены на глюкозе (1%). 1,2 - без предобработки (контроль), 3, 4 -предобработка этанолом (5 %, 60 мин)

Дыхательная активность Г. Нро1уйса в стрессовых условиях

На рис 7-9 представлены данные по изменению дыхательной активности клеток при различных стрессах В условиях окислительного (120 мМ Н202), теплового (45°С) и этанольного (15 %) стрессов дыхание клеток из экспоненциальной фазы роста резко снижалось Адаптация (мягкие стрессовые воздействия) приводила к сохранению дыхательной активности У 1гро1уПса на более высоком уровне во всех стрессовых условиях (рис 7-9, кривые 3) Дыхание клеток из стационарной фазы роста было менее подвержено губительному действию стрессоров (рис. 7, 8, кривые 4, рис 9, кривая 2) Во всех указанных случаях у У ЫроХуПса отмечалась корреляция активности дыхания (рис 7-9) и выживаемости (рис 1-3)

Время инкубации, мин

Рис. 7. Дыхательная активность У Иро1уйса в условиях окислительного стресса.

1, 2, 3 - клетки из экспоненциальной фазы роста, 4 - клетки из стационарной фазы роста 1, 4 - 120 мМ Н202, 2 - 0 5 мМ Н202, 3 - 120 мМ Н202 (предобработка 0 5 мМ Н202, 60 мин)

Время инкубации, мин

Рис 8 Дыхательная активность У Нро1уПса в условиях теплового стресса

1, 2, 3 - клетки из экспоненциальной фазы роста, 4 - клетки из стационарной фазы роста 1, 4 - 45°С, 2 - 37°С, 3 - 45°С (преинкубация при 37°С, 60 мин)

Рис. 9. Дыхательная активность У Иро1уйса, выращенных на глюкозе (1%) в условиях этанольиого стресса.

1, 3, 4 - клетки из экспоненциальной фазы роста, 2 - клетки из стационарной фазы роста

Концентрация этанола 1-5%, 2, 4-15 %, 3 - 15 %, предобработка этанолом (5%, 60 мин)

Результаты, представленные на рис 7-9 позволяют предположить, что одной из мишеней действия всех стресс-факторов является дыхательная цепь, повреждение которой прямо или косвенно приводит к образованию АФК на уровне убихинона По литературным данным (Р1е8о£зку-У^ е1 а1, 1990), АФК вызывают перекисное окисление кардиолипина, который абсолютно необходим для активности цитохромоксидазы и непосредственно инактивирует переносчики электронов по дыхательной цепи, АТФазу, трансгидрогеназу и другие белки Как было показано ранее (Меденцев, 2004), при нарушении функционирования дыхательной цепи у дрожжей и грибов появляется альтернативный путь переноса электронов

а

20 40 60 80 Время инкубации, мин

Таблица. 1. Активность дыхания У. Иро1уйса в условиях окислительного, теплового и этанольного стрессов.

Условия опыта, фаза роста Дыхание, нмоль Ог/(мин на 1 мг сухих клеток) Ингибирование дыхания, % Активность альтернативной оксидазы, нмоль Ог/(мин на 1 мг сухих клеток)

КСЫ, 1 мМ Антимицин А, 5мкМ КСЫ (1мМ)+ БГК**(5 мМ)

Экспоненциальная, без предобработки 15 8 98 98 100 0

Стационарная, без предобработки 10 9 +190* +160* 96 32

Экспоненциальная, тепловая предобработка (37°С, 60 мин) 168 70 68 98 55

Экспоненциальная, предобработка Н2О2, (0 5 мМ, 60 мин) 16 5 60 70 97 65

Экспоненциальная, предобработка этанолом (5%, 60 мин) 16 0 65 68 95 60

* - знак « + » указывает на стимулирующее действие ингибитора

** - БГК - бензгидроксамовая кислота, ингибитор альтернативной оксидазы

С целью показать появление альтернативной оксидазы у 7 1гро1уиса в стрессовых условиях был проведен ингибиторный анализ дыхательной активности Результаты представлены в табл 1 Можно видеть, что дыхание У 1гро1уйса из экспоненциальной фазы роста было высоко чувствительно как к цианиду, так и к антимицину А, и подавлялось в их присутствии почти на 100% Скорость потребления кислорода клетками из стационарной фазы роста не только не ингибировалась цианидом, но заметно ускорялось в его присутствии, совместное действие этих ингибиторов полностью подавляло дыхание, что свидетельствует о существовании цианидрезистентной оксидазы

После мягких стрессовых воздействий наблюдалось снижение ингибирующего действия КСМ на дыхание клеток, которое также полностью подавлялось при совместном действии КСК и БГК, что также говорит о появлении альтернативного пути окисления

На рис 10-12 представлены данные по выживаемости Г Ьро1уПса в зависимости от функциональной активности основной, цитохромной, дыхательной цепи и альтернативного пути переноса электронов в условиях окислительного, теплового и этанольного стрессов (в присутствии антимицина А и БГК)

2 И

20 40 60

Время инкубации, мин

20 40 60 Время инкубации, мин

Рис 10 Влияние ингибиторов дыхания на выживаемость У hpofytica из стационарной (А) и экспоненциальной (Б) фаз роста в условиях окислительного стресса (120 мМ Н202)

Клетки из экспоненциальной фазы роста были адаптированы к условиям окислительного стресса (0 5 мМ Н202,60 мин)

1 - контроль (без ингибиторов), 2 - антимицин А (5мкМ), 3 - БГК (5мМ), 4 - антимицин А + БГК

Оказалось, что в присутствии антимицина А (кривые 2), ингибирующего основную дыхательную цепь, выживаемость клеток была выше, чем в присутствии БГК (кривые 3), подавляющей альтернативную оксидазу Другими словами, во всех стрессовых условиях функционирование альтернативной оксидазы обеспечивало выживаемость клеток на более высоком уровне, по сравнению с основной дыхательной цепью Эта закономерность имела место как в случае клеток из экспоненциальной (адаптированные клетки), так и стационарной фаз роста (рис 10-12). Следует отметить, что активность альтернативной оксидазы у клеток из стационарной фазы роста в 5 раз выше (табл 1), что, вероятно, и обеспечивает их устойчивость на более высоком уровне

Ч©

-В

8

100 10 1 0,1 0,01

0 15 30

Время инкубации, мин

Рис 11. Влияние ингибиторов дыхания на выживаемость У. Ьро1уПса из экспоненциальной фазы роста в условиях теплового стресса

Клетки из экспоненциальной фазы роста были адаптированы к условиям теплового стресса (37°С 60 мин)

1 - контроль (без ингибиторов), 2 -антимицин А (5 мкМ), 3 - БГК (5 мМ), 4 -антимицин А + БГК

•чО О4 100 4

■е 53 о 10-

£

еа г 1 ■

к г м 0,1-

15

30

Время инкубации, мин

Рис. 12. Влияние ингибиторов дыхания на выживаемость К Ьро1уПса из экспоненциальной фазы роста в условиях этанольного стресса.

Клетки из экспоненциальной фазы роста были адаптированы к условиям этанольного стресса (5% этанола, 60 мин) 1 - контроль (без ингибиторов), 2 -антимицин А (5 мкМ), 3 - БГК (5 мМ), 4-антимицин А + БГК

По литературным данным (Меденцев и др, 1999) альтернативная оксидаза ответвляется от основной дыхательной цепи на уровне коэнзима <3 (убихинона) и переносит на кислород восстановительные эквиваленты от комплекса I (эндогенная НАДН-дегидрогеназа) и комплекса II (экзогенная НАДН-дегидрогеназа, сукцинатдегидрогеназа, глицерофосфат-

дегидрогеназа) Следовательно, можно полагать, что слабым звеном в основной дыхательной цепи в ответ на действие оксидантов, температуры и этанола является цитохромный участок от убихинона до цитохромоксидазы Наиболее вероятным претендентом на роль слабого звена может быть относительно подвижный компонент дыхательной цепи - цитохром с.

Изменение динамики внутриклеточного пула цАМФ при воздействии оксидантов, температуры и этанола

Механизмы, регулирующие адаптивный ответ клеток, мало изучены Если принять во внимание, что один вид стресса способен индуцировать развитие устойчивости к другим стрессовым воздействиям, можно предположить наличие общего фактора, контролирующего запуск определенных защитных механизмов

Нами было исследовано изменение внутриклеточного содержания цАМФ, как одной из сигнальных молекул, в ответ на действие оксидантов, температуры и этанола На рис 13-15 видно, что содержание цАМФ в отсутствии стрессоров (контроль) оставалось относительно стабильным В стрессовых условиях после кратковременного увеличения происходило снижение концентрации этого нуклеотида до уровня, ниже исходного

I i

Время, мин

Рве 13. Содержание цАМФ в клетках ¥. ¡гро^гса в условиях теплового стресса.

1 - 29°С (контроль), 2 - 45°С, 3 - 37°С

Время, мин

Рис. 14. Содержание цАМФ в клетках ¥. Ыро1уйса в условиях окислительного стресса

1 - без Н202 (контроль), 2 - 120 мМ Н202, 3-05 мМ Н202

< а

Рис. 15. Содержание цАМФ в клетках К кро1уЛса в условиях этанольного стресса

1 - без этанола (контроль), 2 - 15% этанола, 3 - 5% этанола

Уровень цАМФ в клетке определяется соотношением активностей аденилатциклазы (синтез цАМФ) и фосфодиэстеразы (распад цАМФ) Можно полагать, что увеличение уровня цАМФ в первые минуты после воздействия на клетки каждого из используемых стрессоров обусловлено увеличением активности аденилатциклазы, после чего в клетках происходит снижение внутриклеточного рН, что приводит к падению активности аденилатциклазы и стимуляции фосфодиэстеразы

По литературным данным (Belazzi, 1991), действие цАМФ (с участием цАМФ-зависимой протеинкиназы А) на стрессовые гены связано с наличием в этих генах регуляторной последовательности CREs (cAMP-responsive elements) Последовательность CREs впервые охарактеризована как регуляторный элемент в гене соматостатина крыс При регуляции транскрипции гена соматостатина крыс увеличение уровня цАМФ ведет к фосфорилированию CREs-связывающего фактора (белка CREB) В фосфорилированной форме CREB приводил к увеличению индукции гена

В отличие от позвоночных, где последовательность CRE действует как усиливающий фактор (enhancer), у эукариотных микроорганизмов эта последовательность действует как «выключатель» гена при высокой концентрации глюкозы и повышенном уровне цАМФ После исчерпания

глюкозы и снижения уровня нуклеотида происходит дефосфорилирование белка CREB, который диссоциирует от элемента CRE, в результате чего происходит активация транскрипции генов (Wang et al, 1994) В настоящее время у грибов известно более 5 белков, транскрипция генов которых регулируется цАМФ по отрицательному (негативному) механизму Учитывая особенности действия цАМФ у дрожжей как негативного фактора транскрипции ряда генов (Belazzi, 1991), можно полагать, что именно снижение уровня этого метаболита приводит к активации защитных механизмов

Активность антиоксидантных ферментов и НАД+-зависимой алкогольдегидрогеназы в условиях окислительного, теплового и этанольного стрессов

Для дальнейшего исследования механизмов адаптации Y lipolytica к стрессовым воздействиям были определены активности антиоксидантных ферментов Результаты представлены в табл 2

Оказалось, что в процессе адаптации к действию как оксидантов, так и других стрессоров, в клетках Y lipolytica в несколько раз возрастали активности каталазы и СОД, антиоксидантных ферментов, непосредственно участвующих в детоксикации АФК Увеличение активности этих ферментов в присутствии этанола можно объяснить тем, что его метаболизм в клетках эукариот сопровождается образованием значительного количества органических перекисей (Gille et al, 1993) При повышении температуры увеличивается скорость переноса электронов по дыхательной цепи и, как следствие, генерация АФК (Рихванов и др, 2003)

Были также измерены активности ферментов, поддерживающих редокс-потенциал в клетке глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, обеспечивающей уровень восстановительных эквивалентов, и глутатионредуктазы, поддерживающей пул восстановленного глутатиона Увеличение активности этих ферментов наблюдалось при всех стрессовых воздействиях, включая действие этанола

Кроме того, в условиях этанольного стресса отмечалась увеличение активности НАД+-зависимой алкогольдегидрогеназы, что является закономерным для Y lipolytica, способных использовать этанол в качестве единственного источника углерода и энергии (Ильченко и др , 2005). Следует особо отметить повышение активности этого фермента также при адаптации клеток к действию оксидантов и температуры, что предполагает неспецифичность общего ответа клетки

Повышение активности всех указанных ферментов наблюдалось при переходе клеток в стационарную фазу роста, что согласуется с данными по выживаемости в стрессовых условиях

Таким образом, в ответ на любое стрессовое воздействие у Y lipolytica дополнительно синтезируются, по крайней мере, 5 ферментов, в различной степени участвующих в механизме адаптации

* Активность НАДФ+-зависимой алкогольдегидрогеназы не обнаружена

14

Таблица. 2. Активность антиоксидантных ферментов и НАД+-зависимой алкогольдегидрогеназы К Иро1уИса в условиях окислительного, теплового и этанольного стрессов.

Условия, фаза роста культуры Активность, мкмоль/(мин на 1 мг белка)

Катал аза НАД-зависимая алкоголь-дегидрогеназа сод Глкжозо-6-фосфат-дегидрогеназа Глутатион-редуктаза

Экспоненциальная, без предобработки (контроль) 28 0± 1 3 42± 1 2 4 2 ±0.45 73 0 ± 2 3 24 1 ± 2 1

Стационарная, без преобработки 75 0 ± 4 3 120 ±10 0 8 4 ± 1 1 103 0±4 0 69 2 ± 1 3

Экспоненциальная, предобработка Н202 (0 5 мМ, 60 мин) 93 0 ± 0 5 160±1 1 6 5 ±0 7 116 0± 10 9 58 1 ±64

Экспоненциальная, предобработка менадионом (0 05 мМ, 60 мин) 120 0± 1 6 21 ±1 3 21 6±23 138 2 ± 13 6 66 3 ± 7 6

Экспоненциальная, тепловая предобработка (37°С, 60 мин) 105 0 ± 0 5 39 ±2 1 11 2±2 1 120.0 ± 1 3 40 0 ± 0 7

Экспоненциальная, предобработка этанолом (5%, 60 мин) 90 0 ±13.6 110± 11 0 7 5 ± 0 5 185 2 ±15 6 56 3 ± 7 6

Ультраструктура клеток К Иро1уйса в условиях окислительного, теплового и эганольного стрессов.

Рис. 16. Ультратонкий срез клегок У. Пропса из экспоненциальной фазы роста (контроль).

Рис. 17. Ультратонкий срез клеток У. Иро1уйса из стационарной фазы роста (контроль).

Рис. 18. Ультратонкий срез клеток У. ЩнАуйси из экспоненциальной фазы роста после воздействия нелетальной дозы оксиданта (0.5 мМ Н202, 60 мин).

Рис. 19 Ультратонкий срез клеток У. Иро1уЧса из экспоненциальной фазы роста после мягкой тепловой обработки (37°С, 60 мин).

Рис. 20. Ультратонкий срез клеток К lipolyrica, выращенных на этаноле (1%).

Р

Я - ядро, Яш - ядрышко, Кс - клеточная стенка, Цм - цитоплазматическая мембрана, Л -лизосома, ЭР - зндогшазматический ретикулум, М - митохондрия, П - пероксисома, В -вакуоль, Лп - липиды, Гл - глобулярные структуры, Р - полифосфаты, Ин - инвагинации цитоплазматической мембраны. Длина масштабной метки 1 мкм.

Как показано на рис. 16 и 17 у 7. lipolytica присутствовали все органеллы, характерные для дрожжевых клеток. Клетки из стационарной фазы роста характеризовались увеличением размеров лизосом и вакуолей, занимающих больший объём клетки, уменьшением размеров митохондрий. Как в экспоненциальной, так и в стационарной фазах роста, на цитоплазматической мембране клеток отмечалось присутствие единичных поверхностных глобулярных структур.

На рис. 18 и 19 видно, что у клеток после мягких стрессовых воздействий (низкая доза оксидантов и тепловая «закалка»), отмечалось увеличение на цитоплазматической мембране численности глобулярных структур; увеличение размера митохондрий и пероксисом, появление липидных и полифосфатных гранул.

Этанол и другие короткоцепочечные спирты могут легко диффундировать через липидный бислой, по-разному воздействуя на физико-химические и структурные свойства цитоплазматической и митохондриальной мембран (Lloyd et al., 1993). На рис. 20 показано, что цитоплазматическая мембрана клеток, выращенных на этаноле (1%), характеризуются наличием чётко выраженных инвагинаций и полным отсутствием глобулярных структур. Кроме того, следует отметить увеличение размеров митохондрий и появление полифосфатных гранул. Такие же особенности структурной организации мембраны наблюдались у клеток, выращенных на глюкозе и адаптированных к этанолу (5%).

Без адаптации в условиях окислительного (120 мМ H2C>2, 60 мин), теплового (45°С, 5 мин) и этанольного (15%, 60 мин) стрессов отмечался в различной степени лизис клеток.

Появление множества крупных пероксисом в процессе адаптации ко всем изученным стрессовым воздействиям, согласуется с результатами измерения активности антиоксидантных ферментов, а увеличение размера митохондрий - с данными по изменению активности дыхания.

Таким образом, в процессе адаптации дрожжей У 1гро1уПса к различным стрессовым воздействиям происходило изменение ультраструктурной организации клеток, а именно увеличение размеров митохондрий, увеличение численности и размеров пероксисом, появление полифосфатных гранул и изменение структуры цитоплазматической мембраны

В заключение следует подчеркнуть, что у У 1гро1уПса не зависимо от вида стресса происходило снижение уровня внутриклеточного цАМФ, увеличение активностей антиоксидантных ферментов (каталазы, супероксидисмутазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, глутатионредуктазы) и НАД+-зависимой алкогольдегидрогеназы, а также появление альтернативного пути переноса электронов и изменение ультраструктуры клеток Однотипность ответа клеток на все стресс-факторы предполагает неспецифичность защитных механизмов

ВЫВОДЫ

1 Определена устойчивость дрожжей Уаггота 1гро1уйса в условиях окислительного, теплового и этанольного стрессов Найдены пути повышения выживаемости клеток мягкая тепловая «закалка», предобработка клеток нелетальными дозами оксидантов или этанола Показана перекрестная устойчивость дрожжей к различным стресс-факторам

2 Изучение дыхательной активности клеток в стрессовых условиях выявило участие альтернативной цианидрезистентной оксидазы в адаптивном ответе клеток Альтернативный путь переноса электронов более устойчив к стрессовым воздействиям по сравнению с основной, цитохромной, дыхательной цепью

3 Установлено, что в ответ на любое стрессовое воздействие в клетках происходит увеличение активностей антиоксидантных ферментов (каталазы, супероксидцисмутазы, глюкозо-б-фосфатдегидрогеназы, глутатионредуктазы) и НАД+-зависимой алкогольдегидрогеназы

4 Во всех изученных стрессовых условиях обнаружены существенные изменения ультраструктурной организации клеток увеличение размера митохондрий, возрастание количества и размеров пероксисом, накопление полифосфатных гранул, а также изменение цитоплазматической мембраны - образование инвагинаций (этанольный стресс) или глобулярных структур (окислительный и тепловой стрессы)

5. Показано снижение внутриклеточного уровня цАМФ у У Ьро1уПса при различных стрессовых воздействиях, что коррелирует с увеличением активности антиоксидантных систем и НАД+зависимой алкогольдегидрогеназы Однотипность стрессового ответа при повышении устойчивости клеток предполагает наличие общего центра активации защитных механизмов

Список работ, опубликованных по материалам диссертации.

Статьи:

1 Бирюкова Е Н, Меденцев А Г, Аринбасарова А Ю, Акименко В К

(2006) Устойчивость дрожжей Yarrowia lipolyttca к окислительному

стрессу Микробиология, 75, № 3,293-298

2 Бирюкова Е Н, Меденцев А Г, Аринбасарова А Ю , Акименко В К

(2007) Адаптация дрожжей Yarrowia lipolytica к тепловому стрессу

Микробиология, 76, № 2,184-190

Тезисы:

1. Бирюкова ЕН (2004) Устойчивость дрожжей Yarrowia lipolytica к действию оксидантов 8-я международная Пущинская школа-конференция молодых учёных, 142

2. Armbasaxova A Y, Biryukova Е N, Medentsev A G and Akimenko VK (2002) Effects of nucleotides on alternative oxidase activity in Yarrowia lipolytica mitochondria Third Yarrowia lipolytica International meeting Cell biology and biotechnology of a nonconventional yeast Dresden, Germany, 100

3 Armbasarova A Y , Biryukova E N , Medentsev A G and Akimenko V К (2004) Adaptation of yeast Yarrowia lipolytica to oxidative stress 11th ICY, PM-04, Rio de Janeiro, Brazil, 104

4 Аринбасарова А Ю , Меденцев А Г , Бирюкова E.H, Акименко В К (2005) Цианидрезистентное дыхание в ответе грибов на стрессовые воздействия «Проблемы загрязнения окружающей среды» (г Пермь)

Подписано в печать 20 09 2007 г Исполнено 21 09 2007 г г Печать трафаретная

Заказ № 743 Тираж 90 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495)975-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Бирюкова, Елена Николаевна

Список сокращений.

I. ВВЕДЕНИЕ

1.1 Актуальность проблемы.

1.2 Состояние вопроса.

1.3 Цель и задачи исследования.

1.4 Научная новизна.

1.5 Практическая значимость.

1.6 Апробация работы.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Окислительный стресс.

1.1. Источники АФК.

1.2. Механизм действия АФК.

1.3.3ащитные системы против окислительного стресса.

1.3.1. Антиоксидантные системы.

Альтернативные переносчики электронов (терминальные оксидазы).

Образование изоформ ферментов.

1.3.4. Системы, поддерживающие редокс-потенциал в клетке.

1.3.5. Системы, восстанавливающие повреждения.

1.3.6. Полиамины в защите клеток от окислительного стресса.

1.4. Регуляция генной экспрессии антиоксидантных систем.

Глава 2. Тепловой стресс.

2.1. Белки теплового шока.

2.2. Регуляция синтеза белков теплового шока.

2.3. Убиквитин.

2.4. Белки общего стрессорного ответа.

2.5. Трегалоза.

2.6. Спирты, участвующие в защите клеток от теплового воздействия.

Глава 3. Этанольный стресс.

3.1. Влияние этанола на плазматическую мембрану.

3.2. Метаболизм этанола.

III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЯ ЧАСТЬ

Глава 4. Материалы и методы исследования.

4.1. Микроорганизмы и условия выращивания.

4.2. Определение активности дыхания.

4.3. Создание стрессовых условий.

4.4. Определение выживаемости клеток.

4.5. Определение влияния рН на выживаемость клеток.

4.6. Экстракция и определение цАМФ.

4.7. Получение бесклеточных экстрактов.

4.8. Определение супероксиддисмутазы.

4.9. Определение каталазы.

4.10. Определение глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы.

4.11. Определение глутатионредуктазы.

4.12. Определение НАД+-зависимой алкогольдегидрогеназы.

4.13. Определение белка.

4.14. Ультратонкие срезы клеток

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 5. Адаптация Y. lipolytica к действию оксидантов.

5.1. Выживаемость клеток в зависимости от действия оксидантов (Н202, менадиона и юглона).

5.2. Перекрёстная устойчивость Y. lipolytica к различным оксидантам.

5.3. Активность антиоксидантных ферментов Y. lipolytica.

Глава 6. Адаптация Y. lipolytica к действию температуры.

6.1 Выживаемость Y. lipolytica после воздействия температуры.

6.2. Перекрёстная устойчивость клеток к различным стрессам.

6.3 Влияние рН на термоустойчивость Y. lipolytica.

6.4. Активность антиоксидантных ферментов Y. lipolytica в условиях теплового стресса.

Глава 7. Адаптация Y. lipolytica к действию этанола.

7.1 Выживаемость клеток после воздействия этанола.

7.2 Перекрёстная устойчивость клеток к различным стрессам.

7.3 Активность антиоксидантных ферментов в условиях этанольного стресса.

Глава 8. Дыхательная активность Y. lipolytica в условиях окислительного теплового и этанольного стрессов.

8.1 Дыхательная активность Y. lipolytica в условиях окислительного стресса.

8.2 Дыхательная активность Y. lipolytica в условиях теплового стресса.

8.3. Участие альтернативной оксидазы в адаптивном ответе клеток на окислительный и тепловой стрессы.

8.4 Дыхательная активность Y. lipolytica в условиях этанольного стресса.

8.5 Участие альтернативной оксидазы в адаптивном ответе клеток на действие этанола.

Глава 9. Изменение динамики внутриклеточного пула цАМФ при воздействии оксидантов, температуры и этанола.

Глава 10. Изучение изменений ультраструктуры клеток Y. lipolytica в условиях окислительного, теплового и этанольного стрессов.

10.1. Ультраструктура клеток из различных фаз роста.

10.2. Ультраструктура клеток Y. lipolytica в условиях окислительного стресса.

10.3. Ультраструктура клеток К lipolytica в условиях теплового шока.

10.4. Ультраструктура клеток Y. lipolytica в условиях этанольного стресса.

V. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Адаптация дрожжей Yarrowia lipolytica к стрессовым воздействиям"

1. Актуальностьпроблемы.

В природных экосистемах микроорганизмы постоянно подвергаются воздействию неблагоприятных факторов внешней среды (стрессоров). К ним относится: недостаток элементов питания, активные формы кислорода (АФК), неоптимальная температура, рН, ионная сила, наличие ионов тяжёлых металлов, высокая концентрация этанола, высушивание, воздействие токсических метаболитов растительного, микробного и антропогенного происхождения (Ruis and Schuller, 1995). Понятием «стресс» определяют общий комплекс неспецифических компенсаторно-приспособительных процессов, развивающихся у организмов в ответ на воздействие стрессоров.

Первичный ответ микробной клетки направлен на то, чтобы нивелировать сдвиги внутриклеточного равновесия и обеспечить выживание. Если клетка не способна преодолеть стресс, возможно возникновение сигналов, приводящих к глобальным изменениям метаболизма, вызывающим повреждение мембран, денатурацию и агрегацию клеточных белков (Svensater et al., 2000).

Обязательным признаком стрессового состояния является его обратимость, возможность возврата к нормальному функционированию при соответствующих изменениях факторов окружающей среды (Феофилова, 2003).

Исследование адаптационных механизмов у микроорганизмов особенно актуально, поскольку именно в стрессовых условиях они способны осуществлять процессы, важные для человека, такие как детоксикация вредных соединений, синтез и накопление различных метаболитов (антибиотиков, токсинов, пигментов и др.).

В отличие от высших организмов, микроорганизмы ограничены в выборе своего микроокружения, но способны включать специальные реакции в ответ на изменения окружающей среды, что обеспечивает им выживание и конкурентоспособность по отношению к другим организмам. Кроме того, вследствие более примитивной организации и отсутствия промежуточных стадий регуляции микроорганизмы являются удобным объектом исследований, поскольку обладают высокой адаптационной способностью и выживаемостью в стрессовых условиях (Плакунов и др., 2004).

На данный момент различные аспекты адаптации к стрессовым воздействиям изучены для сравнительно ограниченного числа микроорганизмов. Исследования в основном проводились на бактериях Е. coli и дрожжах Saccharomyces cerevisiae, а также фрагментарно - на Candida albicans и грибах - Neurospora crassa.

Объектом данного исследования были выбраны дрожжи Y. lipolytica, поскольку они являются продуцентами многих практически ценных соединений (органических кислот, липаз, цитохрома с и др.). Кроме того, Y. lipolytica представляют собой классическую модель для изучения энергетического обмена клеток - их митохондриальная дыхательная цепь содержит три пункта сопряжения, в чём сходна с дыхательной цепью животных и растительных клеток.

1.2. Состояние вопроса

В последние годы всё большее внимание исследователей привлекает двойственная роль, которую играет кислород в живых организмах, и которая получила название «парадокс кислорода». Для большей части современных организмов кислород является обязательным и ничем не заменимым компонентом окружающей среды. Это связано с ключевой ролью кислорода, которую он играет в энергетике клеток, являясь конечным акцептором электронов в дыхательной цепи. Организованный и управляемый поток электронов по дыхательной цепи от субстратов к кислороду составляет основу одного из самых эффективных молекулярных механизмов, выработанных организмами в процессе эволюции для получения энергии. С другой стороны, в процессе дыхания в результате неполного восстановления кислорода образуются АФК, включая Н2О2, 0{ и ОН". АФК высоко токсичны для клетки т.к. вызывают окисление липидов (Imlay et al., 1988), белков (Jamieson, 1995) и ДНК (Ruis and Schuller, 1995). Было высказано предположение (Piper,

1995), что действие стрессора может быть связано с нарушением митохондриальной цепи переноса электронов. Дыхательная активность клеток грибов в стрессовых условиях практически не изучена.

Влияние АФК на организмы неоднозначно. В последнее время механизмы окислительного стресса привлекают интерес исследователей, прежде всего, из-за его широко признанной роли в этиологии как «нормального» старения, так и серьёзных патологий, представляющих собой актуальную проблему для здравоохранения (Skulachev,

1996). У грибов Neurospora crassa (Белозерская и др., 2006) и миксомицетов Dictiostelium discoideum (Bloomfield and Pears, 2003) показано, что АФК играют роль сигнальных молекул, необходимых для цитодифференцировки на определенных этапах развития организма.

Несмотря на наличие в литературе отдельных фактов, указывающих на влияние окислительного стресса на организмы, процессы адаптации микроорганизмов к окислительному стрессу в настоящее время (особенно у дрожжей с аэробным типом обмена) изучены недостаточно и требуют дальнейшего исследования.

Важным фактором для сохранения жизнеспособности живых существ является температура. Резкие колебания температуры окружающей среды в сторону понижения или повышения являются обычным явлением в жизни микроорганизмов и сопровождаются значительными изменениями скорости роста, дыхания и всех метаболических процессов.

Этанол при высоких концентрациях способен подавлять физиологическую активность S. cerevisiae (Piper, 1995). Токсичность этанола и других спиртов связана с их способностью: подавлять биосинтез макромолекул (Ingram et al., 1984); денатурировать белки цитоплазмы (Mishra, 1993); снижать активность гликолитических ферментов (Costa et al., 1993); нарушать транспортные процессы ионов и метаболитов через плазматическую мембрану (Jones et al., 1989); изменять липидный состав мембран (van Uden, 1985). Данные о влиянии этанола на жизнеспособность и дыхательную активность дрожжей в настоящее время практически отсутствуют.

Таким образом, процесс адаптации дрожжей к стрессовым воздействиям на данный момент изучен в основном на S. cerevisiae, фрагментарно на Candida albicans и Neurospora crassa. Исследования стрессовых состояний у дрожжей необходимы для лучшего понимания особенностей биологии дрожжей.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Бирюкова, Елена Николаевна

ВЫВОДЫ

1. Определена устойчивость дрожжей Yarrowia lipolytica в условиях окислительного, теплового и этанольного стрессов. Найдены пути повышения выживаемости клеток: мягкая тепловая «закалка», предобработка клеток нелетальными дозами оксидантов или этанола. Показана перекрёстная устойчивость дрожжей к различным стресс-факторам.

2. Изучение дыхательной активности клеток в стрессовых условиях выявило участие альтернативной цианидрезистентной оксидазы в адаптивном ответе клеток. Альтернативный путь переноса электронов более устойчив к стрессовым воздействиям по сравнению с основной, цитохромной, дыхательной цепью.

3. Установлено, что в ответ на любое стрессовое воздействие в клетках происходит увеличение активностей антиоксидантных ферментов (каталазы, супероксиддисмутазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, глутатионредуктазы) и НАД+-зависимой алкогольдегидрогеназы.

4. Во всех изученных стрессовых условиях обнаружены существенные изменения ультраструктурной организации клеток: увеличение размера митохондрий, возрастание количества и размеров пероксисом; накопление полифосфатных гранул, а также изменение цитоплазматической мембраны - образование инвагинаций (этанольный стресс) или глобулярных структур (окислительный и тепловой стрессы).

5. Показано снижение внутриклеточного уровня цАМФ у Y. lipolytica при различных стрессовых воздействиях, что коррелирует с увеличением активности антиоксидантных систем и НАД+зависимой алкогольдегидрогеназы. Однотипность стрессового ответа при повышении устойчивости клеток предполагает наличие общего центра активации защитных механизмов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бирюкова, Елена Николаевна, Пущино

1. Абызов С.С., Мицкевич И.Н. (1993) Микрофлора континентальных и морских льдов Антарктики (к проблеме использования айсбергов как ресурсов пресной воды). Микробиология, 62, №6,994-998.

2. Андреев А.Ю., Кушнарёв Ю.Е., Старков А.А. (2005) Метаболизм активных форм кислорода в митохондриях. Биохимия, 70, вып. 2,246-264.

3. Баснакьян И.А. (2003) Стресс у бактерий. М. Медицина, 136.

4. Белозерская Т.А., Гесслер Н.Н. (2006) Окислительный стресс и дифференцировка у Neurospora crassa. Микробиология, 75, № 4, 497-501.

5. Брюханов A.JL, Нетрусов А.И. (2004) Каталаза и супероксиддисмутаза: распространение, свойства и физиологическая роль в клетках строгих анаэробов. Биохимия, 69, № 9,1170-1186.

6. Брюханов A.JL, Тауэр Р.К., Нетрусов А.И. (2002) Каталаза и супероксиддисмутаза в клетках строго анаэробных микроорганизмов. Микробиология, 71, 330-335.

7. Гаенко Г.П., Решетников И.В., Дуда В.И., Плеханова И.О., Гусев М.В. (1985) Супероксиддисмутаза в спорах Clostridium butyricum. Микробиология, 54, 322-324.

8. Гусев Н.Б., Богачёва Н.В., Марстон С.Б. (2002) Структура и свойства малых белков теплового шока и их взаимодействие с белками цитоскелета. Биохимия, 67, № 5, 613623.

9. Закирова О.Н., Смирнова Г.В. (2001) Роль антиоксидантных систем в отклике бактерий Escherichia coli на температурные стрессы. Тезисы V Международной конференции по проблемам загрязнения окружающей среды. Пермь, 21.

10. Ильченко А.П., Чернявская О.Г., Финогенова Т.В. (2005) Метаболизм этанола у дрожжей Yarrowia и Torulopsis. Прикладная биохимия и микробиология, 41, № 5, 487494.

11. Лианг J1.K., Вонг К.К., Жу K.JL, Ши З.М. (2006) Накопление трегалозы мутантным штаммом Saccharomycopsis fibuligera sdu не является стрессовым ответом. Биохимия, 71, вып. 12,1589-1596.

12. Меденцев А.Г., Акименко В.К. (1992) Влияние условий культивирования на биосинтез нафтохиноновых метаболитов грибом Fusarium decemcellulare. Микробиология, 61,5, 542-546.

13. Меденцев А.Г., Аринбасарова А.Ю., Акименко В.К. (2001) Адаптация фитопатогенного гриба Fusarium decemcellulare к окислительному стрессу. Микробиология, 70, № 1, 1-5.

14. Меденцев А.Г., Баскунов Б.П., Акименко В.К. (1988) Образование нафтохиноновых пигментов грибами Fusarium decemcellulare и их влияние на метаболизм продуцента. Биохимия, 53, № 3,413-423.

15. Меденцев А.Г., Акименко В.К. (1999) Развитие и активация цианидрезистентного дыхания у дрожжей Yarrowia lipolytica. Биохимия, 64, № 8,1123-1131.

16. Меденцев А.Г., Аринбасарова А.Ю., Акименко В.К. (2001). Содержание цАМФ в условиях индукции альтернативной оксидазы в клетках дрожжей Yarrowia lipolytica. Микробиология, 70, № 1,29-33.

17. Меньшикова Е.Б., Зенков Н.К. (1993) Антиоксиданты и ингибиторы радикальных окислительных процессов. Успехи современной биологии, 113,4,442-452.

18. Николаев Ю.А. (2004) Внеклеточные факторы адаптации бактерий к неблагоприятным условиям среды. Прикладная биохимия и микробиология, 40, № 4, 387-397.

19. Плакунов В.К., Гейдебрехт О.В., Шелемех О.В. (2004) Множественный стресс у микроорганизмов зло или благо? Юбилейный сборник к 70-летию института Микробиологии им. С.Н. Виноградского, 361-375.

20. Реммель Н.М., Титова В.А., Кратасюк В.А. (2003) Мониторинг окислительного стресса в биологических образцах биолюминисцентным методом. Бюлл. эксп. биол. и мед., 136, №8, 238-240.

21. Сингх Н.Н. (1995) Начальные этапы окисления первичных спиртов в клетках дрожжей, растущих на различных субстратах. Автореферат дис. канд. биол. наук. Пущипо: ИБФМ РАН, 19.

22. Смирнова Г.В., Музыка Н.А., Красных Т.А. (2001) Роль антиоксидантных ферментов в ответе бактерий Escherichia coli на осмотический шок. Тезисы V Международной конференции по проблемам загрязнения окружающей среды. Пермь, 45.

23. Терешина В.М. (2005) Термоустойчивость у грибов: роль белков теплового шока и трегалозы. Микробиология, 74, № 3, 293-304.

24. Терешина В.М., Меморская А.С., Морозова Е.В., Козлова В.П., Феофилова Е.П. (2000) Изменения в составе углеводов цитозоля спор грибов в связи с температурой обитания и в процессе хранения. Микробиология, 69, № 4, 511-517.

25. Феофилова Е.П. (1992) Трегалоза, стресс и анабиоз. Микробиология, 61, № 5, 741754.

26. Феофилова Е.П., Терешина В.М. (1999) Термофилия мицелиальных грибов с позиций биохимической адаптации к температурному стрессу. Прикл. Биохим. и микробиол., 35, № 5,546-556.

27. Феофилова Е.П., Терешина В.М., Меморская А.С., Хохлова Н.С. (2ООО) О различных механизмах биохимической адаптации мицелиальных грибов к температурному стрессу: изменения в составе липидов. Микробиология, 69, №5, 612-619.

28. Терешина В.М., Полотебнова М.В., Феофилова Е.П. (1987) Активность трегалазы спор дикого штамма Cunninghamella japonica с пониженной способностью к синтезу трегалозы. Микробиология, 56, №. 5, 753-758.

29. Ткаченко А.Г., Пшеничников М.Р., Нустерова Л.Ю. (1999) Структурно-функциональные свойства ДНК как объект защитных функций путресцина в адаптации Escherichia coli к окислительному стрессу. Микробиология, 68,27-32.

30. Alexandre Н., Rousseaux I., and Charpentier С. (1993) Ethanol adaptation mechanisms in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol. Appl. Biochem, 20,173-183.

31. Arthur H. and Watson K. (1976) Thermal adaptation in yeast: growth temperatures, membrane lipid, and cytochrome composition of psychrophilic, mesophilic, and the themophilic yeasts. J. Bacterial, 128, № 1, 56-68.

32. Barth G. and Gaillardin C. (1997) Physiology and genetics of dimorphic fungus Yarrowia lipolytica. FEMSMicrobiology Reviews, 19,219-237.

33. Barton J.K., Den Hollander J.A. and Hopfield J.J. (1982). Shulman R.G. 13C nuclear magnetic resonance study of trehalose mobilization in yaest spores. J. Bacteriol, 151, № 1, 177-185.

34. Beaven M. J., Charpentier C. and Rose A. H. (1982). Production and tolerance of ethanol in relation to phospholipids fatty acyl composition in Saccharomyces cerevisiae NCYC 431. J. Gen. Microbiol, 128,1447-1455.

35. Beers R. and Siser I.W. (1952) A spectrophotometric method for measuring breakdown of hydrogen peroxide by catalase. J. Biol. Chem., 195, №1,276-289.

36. Belazzi T. (1991) Negative regulation of transcription of the Saccharomyces cerevisiae catalase T (CTT1) gene by cAMP is mediated by a positive control element. EMBO J., 10, 585-592.

37. Benaroudj N., Do Нее Lee and Goldberg A.L. (2001) Trehalose accumulation during cellular stress protects cells and cellular proteins from damage by oxygen radicals. J. Biol. Chem, 276, № 26,24261-24267.

38. Bertsova Y.V., Bogachev A.V. and Skulachev V.P. (1997) Generation of protonic potential by the c/-type quinol oxidase of Azotobacter vinelandii. FEBS Lett., 414,369-72.

39. Bissinger P.H., Weiser R., Schanz M., Adam G., HartingA., and Ruis H. (1989) Control of Saccharomyces cerevisiae catalase T gene (CTT1) expression by nutrient supply via the RAS-cyclic AMP pathway. Mol. Cell Biol., 9, №5, 309-315.

40. Bloomfield G. and Pears C. (2003) Superoxide signaling required for multicellular development of Dictyostelium. J. Cell. Sci., 116, № 16, 3387-3397.

41. Brambilla L., Cairo G., Sestili P., O'Donnel V., Azzi A., and Cantoni O. (1997) Mitochondrial respiratory chain deficiency leads to overexpression of antioxidant enzymes. FEBS Lett., 418,247-250.

42. Bray T.M. and Bettger W.J. (1990) The physiological role of zinc as an antioxidant. Free Radic. Biol. Med., 8,281-291.

43. Brehelin C., Mouaheb N., Verdoucq L., Lancelin J.M. and Meyer Y. (2000) Characterization of determinants of the specificity of arabidopsis thioredoxins h in yeast complementation. J.Biol.Chem., 275, № 41, 31641-31647.

44. Bruschi M., Hatchikian E.C., Bonicel J., Bovier-Lapierre G. and Couchoud P. (1977) The N-terminal sequence of Superoxide dismutase from the strict anaerobe Desulfovibrio desulfuricans. FEBS Lett., 16, 121-124.

45. Bonch-Osmolovskaya E.A., Miroshnichenko M.L., Kostrikina N.A. and Chernykh N.A. (1990) Thermoproteus uzoniensis sp. nov., a new extremely thermophilic archaebacterium from Kamchatka continental hot springs. Arch. Microbiol, 154, 556-574.

46. Boorstein W.R. and Craig E.A. (1990) Regulation of a yeast HSP70 gene by a cAMP responsive transcriptional control element. EMBO J., 9,2543-2553.51.5457,58.