Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка эффективного дрожжевого продуцента янтарной кислоты для ферментации при низких значениях pH

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Разработка эффективного дрожжевого продуцента янтарной кислоты для ферментации при низких значениях pH"

На правах рукописи

Юзбашев Тигран Владимирович

Разработка эффективного дрожжевого продуцента янтарной кислоты для ферментации при низких значениях рН

03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА-2011

1 7 О ЕВ 2011

4854389

Работа выполнена в лаборатории Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов»

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор, Синеокий Сергей Павлович

ФГУП «ГосНИИгенетика»

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, Лившиц Виталий Аркадьевич

ЗАО «АГРИ»

кандидат биологических наук, Манухов Илья Владимирович

ФГУП «ГосНИИгенетика»

Ведущая организация: Институт общей генетики

им. Н.И. Вавилова РАН

Защита состоится « » февраля 2011 года в часов на заседании

диссертационного совета Д.217.013.01 при ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» по адресу: 117545, Москва, 1-ый Дорожный пр., д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ГосНИИгенетика»

Автореферат разослан « Ж января 2011г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук, доцент

Т.Л. Воюшина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Янтарная кислота - двухосновная карбоновая кислота, интермедиа? цикла Кребса, накапливается некоторыми анаэробными бактериями в качестве продукта брожения. Наличие двух карбоксильных групп, расположенных по краям молекулы, позволяет получать из нее многие химические соединения, среди которых важные предшественники органического синтеза, полимеры, растворители, детергенты и др. Янтарная кислота в виде солей, сукцинатов, в больших масштабах применяется в роли антиобледенителей на ответственных участках дорог и аэропортов. По оценке специалистов министерства энергетики США, янтарная кислота входит в список 12 веществ, которые в ближайшем будущем будут производиться из биомассы и придут на смену продуктам нефтехимии. Тем не менее, в настоящее время основным источником янтарной кислоты является 1,4-бутандиол, получаемый из нефти. Однако в Европе и США уже действуют 5 экспериментальных установок, производящих янтарную кислоту путем ферментации из возобновляемого сырья.

Производство янтарной кислоты с применением бактериальных культур имеет существенный недостаток с точки зрения экономичности процесса. В ходе ферментации происходит накопление кислоты, и, так как ферментацию необходимо вести при нейтральных значениях рН, необходим эквимолярный расход щелочи. Более подходящими для этих целей могли бы быть грибные или дрожжевые культуры, среди которых многие штаммы обладают способностью адаптироваться к кислотной среде. Однако в немногочисленных работах, опубликованных на данный момент и описывающих накопление сукцината эукариотами, уровни продукции несопоставимо низки по сравнению с результатами, продемонстрированными на бактериях. Исходя из этого, перед нами была поставлена задача конструирования дрожжевого штамма, накапливающего янтарную кислоту в условиях, не требующих добавления нейтрализующего агента. Потенциально применение такого штамма в промышленности может позволить снизить себестоимость производимой янтарной кислоты, а значит, увеличить конкурентоспособность продукта но отношению к янтарной кислоте, производимой из нефти.

Пели и задачи исследования. Данная работа посвящена изучению возможности микробиологической продукции янтарной кислоты в условиях, не требующих добавления титрующего агента.

В связи с этим ставились следующие задачи:

- выбор подходящего микроорганизма, оптимальных условий ферментации и пути синтеза для продукции янтарной кислоты в условиях без титрующего агента;

- конструирование штамма дрожжей, накапливающего янтарную кислоту в аэробных условиях;

- оптимизация штамма методом селекции для продукции янтарной кислоты в условиях без титрующего агента;

- анализ и характеристика полученного дрожжевого штамма-продуцента.

Научная новизна. В работе впервые продемонстрирована потенциальная возможность микробного синтеза янтарной кислоты без добавления титрующего агента. До настоящего времени были описаны лишь бактериальные штаммы, продуцирующие значимые количества янтарной кислоты. В представленной работе синтез янтарной кислоты осуществляется в аэробных условиях дрожжами Коггоша Нро!уНса. Благодаря активной дыхательной цепи клетки обладают большей энергией и способны адаптироваться к низким значениям рН и высокой концентрации янтарной кислоты в среде. В работе использован оригинальный подход для изоляции Тв-мутаций по гену 5'ОЯ/, кодирующему флавин-содержащую субъединицу сукцинатдегидрогеназы. Полученный штамм использован для подбора условий для селекции трансформанта с делецией по гену 50Я2. На основе штамма с делецией по гену 811112 в три этапа селекцией получен мутант #18-12-35, накапливающий янтарную кислоту в условиях без нейтрализующего агента в количестве до 63 г/л. С использованием методов ЯМР и ПМР определены особенности биосинтеза янтарной кислоты у предшествующего мутанта #18-12. Необходимо отметить, что исходный штамм, несущий делецию по гену ЖЖ, оказался не способен утилизировать глюкозу, но рос на средах с глицерином. Однако в ходе селекции штамма с делецией были получены производные, способные утилизировать глюкозу и накапливать янтарную кислоту. Трудно предположить, будет ли такое предпочтение в отношении субстратов общим для других аэробных дрожжей, поскольку инактивация сукцинатдегидрогеназы у облигатно аэробного микроорганизма, т.е. микроорганизма, не способного к брожению, в работе показана впервые.

Практическая ценность работы. Производство янтарной кислоты является одним из приоритетных направлений современной биотехнологии. Наиболее затратной стадией при производстве янтарной кислоты является ферментация, требующая для поддержания нейтральных значений рН расхода эквимолярных количеств щелочи. В работе разработан дрожжевой штамм, синтезирующий янтарную кислоту через окислительную ветвь цикла Кребса. Такой путь синтеза позволяет вести процесс в аэробных условиях при активном дыхании, что обеспечивает клетку избытком энергии, необходимой для адаптации клеток к высокой концентрации кислоты и низкому значению рН. Полученные результаты исследования представляют потенциальный интерес для биотехнологии и могут

быть использованы для получения промышленного дрожжевого штамма-продуцента янтарной кислоты, обладающего рядом преимуществ по сравнению с существующими бактериальными продуцентами. Полученный дрожжевой штамм #18-12-35 накапливает янтарную кислоту в количестве до 63 г/л при росте на среде с глицерином и не требует поддержания нейтральных значений рН среды при ферментации.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на двух международных конференциях: «Российско-Германский Форум по Биотехнологии 2010» в Мюнхене и «Дрожжи, как Модель и Инструмент 2010» в Страсбурге.

Диссертационная работа была апробирована на заседании секции «Генетика микроорганизмов» Ученого совета ФГУП «ГосНИИгенетика».

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ, в том числе статья и патент.

Структура н объем работы. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы, список литературы. Работа изложена на страницах

машинописного текста и содержит лз рисунков и р таблиц. Список цитируемой литературы содержит еРЗ источников, в том числе на русском языке.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Попытка инактивации геиа SDH1 в штамме К lipolytica Polf

Первые попытки инактивации генов SDH1 и SDH2, кодирующих субъединицы сукцинатдегидрогеназы, при помощи конструкции для интеграции по двойному кроссинговеру оказались безуспешными (Рис. 5). Так, среди опубликованных работ не было данных о возможности инактивации этого фермента у облигатно аэробного микроорганизма, такого как дрожжи К lipolytica. Нами была предпринята попытка инактивации гена SDH1 в два последовательных этапа рекомбинации. Для этих целей была сконструирована плазмида pURA-dSDHl. Из Рисунка 1 видно, что линеаризованная по сайту рестрикции Mlul плазмида pURA-dSDHl может встраиваться в область промотора гена SDH1 по одиночному кроссинговеру. При встраивании по аддитивному механизму должны образовываться две копии гена SDH1, первая из них неактивная с делецией в 195 п.н., другая функциональная с геном дикого типа. При селекции на вырезание

встроенной плазмиды на среде с 5-FOA могут образовываться два типа штаммов: штамм с геном SDH1 дикого типа и штамм с неактивным геном SDHI.

SDH1

X

URA3

Deletion XmaJI I &SDH1

"T

SDH1

v „ v ASDH1 Deletion

Рис. 1. Механизм инактивации гена SDH1 в две стадии, (а) интеграция плазмиды plJRA-dSDHl в геном К lipolytlca. (б) вырезание конструкции с образованием гена SDH1 дикого типа, (в) вырезание конструкции с образованием гена SDH1 с делецией. PI, Р2 и РЗ обозначены места отжига праймеров chromSDHl-F, SDHl-seq-R и M13/pUC reverse sequencing primer, соответственно.

В соответствие с этим был получен трансформант штамма Polf, содержащий плазмиду pURA-dSDHl в локусе гена SDH1. Корректность встраивания была подтверждена при помощи ПЦР с использованием локус-специфических праймеров chromSDHl-F и M13/pUC reverse sequencing primer (Рис. 1). С полученным штаммом была проведена селекция на среде YNB с казаминовыми кислотами (0,2%), глюкозой (2%) и 5-FOA (0,1%). Частоты появления устойчивых клонов при такой селекции находились в пределах 10"4 - 10"", что на несколько порядков превышает частоту спонтанного мутагенеза (10"?). Однако из 143-х отобранных колоний около половины после пересева оказались

нежизнеспособными, что можно объяснить летальным фенотипом штамма с делецией по гену SDHI. Из числа оставшихся все 83 клона оказались способны расти на среде YNB с лейцином (0,01%), урацилом (0,005%) и сукцинатом натрия (2%) в качестве единственного источника углерода, что предполагает наличие дикого гена SDHI. Из них 12 случайно выбранных клонов были также проанализированы на наличие делеции в гене SDHI при помощи молекулярного подхода. При конструировании плазмиды pURA-dSDHl в область делеции был добавлен сайт ХтаЛ. Благодаря этому стало возможным при помощи рестрикции отличить дикий ген от гена с делецией. После амплификации по праймерам chromSDHl-F. SDHl-seq-R с ДНК 12-ти штаммов полученные фрагменты длиной 1944 п.н. обрабатывали ХтаЛ. В результате, при наличии делеции в гене SDH1, размер фрагмента на электрофорезе должен снизиться до 1753 п.н. Однако, как можно видеть из результатов электрофореза (Рис. 2), все 12 фрагментов, полученных из соответствующих штаммов, не содержали сайт ХтаЛ, т.е. несли дикий аллель гена SDHI. Вследствие этого было сделано предположение о летальном или условно летальном фенотипе делеции по гену SDH1.

Рис. 2. Электрофорез ПЦР-ПДРФ фрагментов из 12-ти клонов, полученных после вырезания плазмиды pURA-dSDHl. М - ДНК маркер (Fermentas, Литва). С 1 по 12 -электрофорез ПЦР-фрагментов 12-ти штаммов по праймерам chromSDHl-F и SDHl-seq-R и после обработки эндонуклеазой ХтаЛ. 13 - ПЦР-ПДРФ штамма Polf.

2. Получение штаммов К lipolytica с Ts-мутациями по гену SDH1

Мы предположили, что изоляция Ts-мутации по гену SDHI может позволить оценить влияние инактивации сукцинатдегидрогеназы в штамме У. lipolytica на его

способность продуцировать янтарную кислоту в аэробных условиях. Более того, в случае, если инактивация сукцинатдегидрогеназы приводит не к полной, а условной летали, то наличие такого мутанта должно было позволить определить условия или компоненты сред, при которых этот штамм останется жизнеспособным в непермиссивных условиях.

SDH1

Ecogil

P1 Р2 P1 Р2

SDH1 Is-SDHI Ts-mutation

Рис. 3. Рекомбинационный механизм переноса Ts-мутации в хромосомальную копию гена SDH1. (а) интеграция плазмиды plTRA-ddSDHl в геном V. lipolytica. (б) вырезание конструкции с образованием штамма с геном SDHI дикого типа, (в) вырезание конструкции с образованием штамма несущего Ts-мутацию в гене SDH1. PI, Р2 и РЗ - места отжига праймеров chromSDHl-F, downSDHl-R и M13/pUC reverse sequencing primer, соответственно.

Для этих целей была сконструирована плазмида pURA-ddSDHl. Из Рисунка 3 видно, что линеаризованная по сайту рестрикции Есо9 II плазмида pURA-ddSDHl может встраиваться в последовательность гена SDH1 по одиночному кроссинговеру. При встраивании по аддитивному механизму должны образоваться две копии гена SDH1, первая из которых дикого типа, а другая содержит делецию начала гена. При этом, если в исходной плазмиде в гене SDH1 ниже сайта Есо9 II

находится Ts-мутация, то эта мутация также окажется в первой копии гена. В результате полученный штамм будет обладать Ts-фенотипом и может быть отобран в ходе скрининга. При селекции на вырезание встроенной плазмиды на среде с 5-FOA, могут образовываться два типа штаммов. При прохождении рекомбинации в области выше Ts-мутации должен образовываться штамм с геном SDH1 дикого типа, тогда как при рекомбинации в области ниже Ts-мутации штамм должен сохранять Ts-фенотип,

[ Селекция на I выщеппение 5-FOA

(20-С) глюкоза 2% (YNB)

проверка встраивания по ПЦР

<32-С) глюкоза 2% (YNB)

реплика З'Ю3 трансформантов

(трансформация^ Y. lipolytics I

| in vitro мутагенез I (ОМГА)

I J Странсформация J

J ^ I B.coU J

(7*1D6 колоний)

Ts#8

Рис. 4. Схема эксперимента по получению Ts-мутаций в гене SDHI (пояснения в тексте). Внизу - рост трех отобранных Ts-мутантов и контрольного штамма Polf(ura+) при 20"С и 32°С на средах с глюкозой и глицерином. Фотография сделана на 4-ые сутки инкубации.

В соответствие с этим перед трансформацией штамма Polf был проведен in vitro мутагенез плазмиды pURA-ddSDHl О-метилгидроксиламином с последующей трансформацией штамма Е. coli XLl-Blue и повторным выделением плазмиды для закрепления мутаций (Рис. 4). Полученную библиотеку мутантных плазмид линеаризовали по сайту Есо9\\ и использовали для трансформации штамма К lipolytica Polf. 3000 отобранных при 20°С трансформантов анализировали на способность расти при пермиссивной (20°С) и непермиссивной (32°С) температуре.

В восьми трансформантах, обладающих Ts-фенотипом, корректность встраивания в локус SDH 1 была проанализирована при помощи ПЦР с использованием праймеров chromSDHl-F и M13/pUC reverse sequencing primer (Рис. 3). Вследствие этого были обнаружены три трансформанта #0134, #2007 и #2737, обладающие Ts-фенотипом и имеющие вставку в нужном локусе. Однако, так как при аддитивной интеграции плазмиды образуются прямые повторы, у полученных клонов наблюдалась нестабильность (щепление) фенотипа, связанная с рекомбинационным вырезанием конструкции. Для получения стабильных Ts-мутантов с тремя отобранными клонами была проведена селекция на вырезание конструкции на среде с 5-FOA по аналогии с трансформантами с плазмидой pURA-dSDHl. Отобранные клоны повторно анализировали на наличие Ts-фенотипа. В результате этого из трансформантов #0134, #2007 и #2737 были получены стабильные Ts-мутанты, обозначенные, как Ts#l, Ts#6 и Ts#8, соответственно. Для локализации мутаций были секвенированы ПЦР-продукты, полученные по праймерам chromSDHl-F и downSDHl-R (Рис. 3) с суммарной геномной ДНК каждого из трех штаммов. Анализ последовательности выявил, что штамм Ts#l содержит в гене SDH1 транзицию G на А, вызывающую аминокислотную замену остатка глютаминовой кислоты в положении 483 на лизин. В других двух штаммах Ts#6 и Ts#8 SDH1 ген содержал одинаковую транзицию С на Т, вызывающую аминокислотную замену остатка серина на фенилаланин в положении 675. Как можно видеть из Рисунка 4, мутанты Ts#6 и Ts#8 имеют более строгий фенотип, чем Ts#l, так как при 32°С на среде с глюкозой у этих мутантов рост полностью отсутствует. Для дальнейшей работы был отобран мутант Ts#6. Полученные штаммы также изучали на способность расти на разных средах при непермиссивной температуре. К удивлению, было обнаружено, что все три штамма способны расти на среде с 5% (объем) глицерином в качестве единственного источника углерода. Такой фенотип штамма Т. lipolytica при инактивации сукцинатдегидрогеназы был диаметрально противоположен тому, что было ранее опубликовано в экспериментах на других дрожжах, Saccharomyces cerevisiae и Kluyveromyces lactis. Необходимо отметить, что в случае последних двух культур рост на глюкозе возможен за счет спиртового брожения - метаболического пути, который является альтернативой дыханию и, следовательно, не требует ни активности сукцинатдегидрогеназы, ни работы цикла Кребса в целом.

3. Инактивация гена SDH2 в штамме ¥. lipolytica Polf

Благодаря знанию фенотипа Ts-мутантов У. lipolytica по гену SDH1 стало возможным отобрать штамм, несущий делецию по одному из SDH генов. Для этих целей методом ПЦР была получена конструкция, несущая селективный маркер

ПЛАЗ, фланкированный промоторной и терминаторной областью гена 5ИН2 (Рис. 5 А). Конструкция была использована для трансформации штамма К. Иро1уЧса Ро 1 ^ Отбор трансформантов вели по комплементации ауксотрофности по урацилу на среде УКВ с казаминовыми кислотами и глицерином (5%) в качестве источника углерода. Полученные трансформанты тестировали на способность расти на среде с 2% сукцинатом натрия в качестве единственного источника углерода. Клоны, которые потеряли такую способность, дополнительно анализировали методом ПЦР на наличие вставки гена иЯАЗ в локусе 5Х>Я2, Для этого использовали локус-специфические праймеры сЬгош80Н2-Р и сЬесШКАЗ-Я (Рис. 5 А). Один из трансформантов с делецией по гену 50Я2 был обозначен как РоИЛбсйй и отобран для дальнейшей работы.

глицерин 10%

РоИ (ига4) Ро-К ДзсЙ12

Ро« (ига*) Ро"К Д5сЖ2

глицерин 5%

РоИ (игз+) Рои Дваьг

глюкоза 2%

РсК (ига+) Ро« ДБсЖг

Рис. 5. Конструирование штамма К Чро1уйса с делецией по гену $ОИ2. А - механизм выключения гена 5ИН2 по двойному кроссинговеру. Р1 и Р2 - места отжига праймеров сЬгош80Н2-Р и сЬеск1ЖАЗ-К, соответственно. Б - рост штамма с делецией Ро1ГД«()Ь2 и контрольного штамма РоИ(ига+) на средах УР1) и УРС. Высев производили серией последовательных десятикратных разведений. Снимки получены на вторые сутки инкубации при 30°С.

Тест на рост выявил, что штамм РоП^ДвсН^ неспособен расти даже на богатой среде с глюкозой (Рис. 5 Б). По аналогии с Тв-мутантами оптимальной для роста

оказалась среда с 5% глицерином. Однако даже на этой среде штамм заметно отстает в росте от контрольного штамма Г'о 1 Г(ига+). Интересно отметить, что добавление глюкозы или ее неутшшзируемого аналога 2-дезокси-0-глюкозы в среду с 5% глицерином не приводило к подавлению роста. Из чего можно предположить, что отсутствие роста на глюкозе не является следствием катаболитной репрессии какой-либо важной ферментативной реакции. В качестве одной из возможных причин такого феномена может быть разница в энергии, получаемой клетками при окислении глицерина и глюкозы. Так, две молекулы глицерина, как более восстановленного субстрата, в результате дыхания дают клетке приблизительно на 3 молекулы АТФ больше, в сравнении с одной молекулой глюкозы. Тем не менее, кажется маловероятным, что столь незначительная разница в энергии может оказаться решающей при росте на разных субстратах.

4. Измерение активности сукцинатдегидрогеназы в штаммах К Иро1уНса, дефектных по субъединицам вйМ и 8(1Ь2

Для подтверждения инактивации сукцинатдегидрогеназы ее активность была измерена в штаммах с Тя-мутацией Тъ#6 и делецией Ро1ГДзс1Ь2. Активность фермента измеряли в митохондриальной фракции с ферроцианидом калия в качестве акцептора по уменьшению оптической плотности при 420 нм. Как можно видеть из Таблицы 1, мутации по обеим субъединицам приводят к потере активности всего сукцинатдегидрогеназного комплекса.

Таблица 1. Измерение активности сукцинатдегиарогеназы.

Штамм Мутации в SDH генах Температура роста Удельная активность SDH (ед/мг белка)"

Polf(ura+) дикий тип 30°С 168 ±21

PolfAsdh2 &sdh2::URA3 30°С < 1% "

Ts#6 SDHl(Ts)S67SF 24°С 112 ±28

32°С <1%

24°С (30 мин; 40°С) "* 105 ± 22

- за единицу активности SDH принято количество фермента, необходимое для окисления 1,0 ммоль сукцината в минуту.

- активность менее одного процента от активности штамма Polf(ura+).

- в скобках отмечены время и температура обработки митохондриальной фракции перед измерением активности.

Однако, как и ожидалось, активность сукцинатдегидрогеназного комплекса сохраняется на близком к контролю уровне при росте мутанта Тв#6 при пермиссивной температуре 20°С. Интересно отметить, что в последнем случае прогрев выделенной митохондриальной фракции в течение 30 мин при 40°С не приводит к значительной потере активности сукцинатдегидрогеназы (Таб. 1). Было отмечено, что большее время, равно как и более высокая температура приводят уже к потере активности сукцинатдегидрогеназы в контрольном штамме РоИ(ига+), из чего можно заключить, что полученная мутация 8ег675РЬе не снижает термостабильность фермента как таковую, а действует на более ранней стадии. Так, например, при непермиссивной температуре она может препятствовать правильному фолдингу, транспорту в митохондрию или сборке субъединиц в комплекс.

5. Влияние инактивацни субъединнц и 8(]Ь2 в К Иро1уИса на продукцию янтарной кислоты

Штаммы с делецией РоНД5с1Ь2 и Тэ-мутацией Тв#6 были изучены на способность аккумулировать органические кислоты при ферментации в среде УРО с 5% глицерином в аэробных условиях в качалочных колбах. Для стабилизации рН в среду на второй день ферментации добавляли мел. Продукция органических кислот в культуральной жидкости на 5-ый день ферментации отображена в Таблице 2. Как можно видеть из таблицы, инактивация каждой из двух субъединиц, флавин-содержащей и железосерной, приводит к накоплению янтарной кислоты в среде в количествах 24 и 19 г/л, соответственно. Однако необходимо отметить, что в условиях без добавления СаС03 продукция янтарной кислоты штаммами РоНДвсИгё и Тэ#6 не превышала уровня 4 г/л.

Таблица 2. Продукция органических кислот штаммами РоНЛ5(1Ь2 и ТаНб.

Штамм Температура Продукция 0| зганических кислот (г/л)

ЯК ПК а-КГК УК лк

Ро1Г(ига+) 30°С 0 0 1.4 1,02 6,37

РОНЛ511112 30°С 24,0 0 0,5 12,2 6,14

Тя#6 32°С 19,04 6,13 2,72 14,73 0

- ЯК, ПК, а-КГК, УК, ЛК обозначены янтарная, пировииоградная, а-кетоглутаровая, уксусная и лимонная кислоты.

6. Селекция штамма Ро1ГА$с1112 на повышение жизнеспособности

Так как Тэ-мутант при селекции мог ревертировать к дикому типу, для дальнейшей работы использовали только штамм с делецией, РоНД8с1Ь2. Клетки

штамма РоНДбсИй обрабатывали мутагеном (К-метил-И'-нитро-Ы-нитрозогуанидином) и высевали на среду УЫВ с лейцином и глицерином (2%). 36 наиболее быстрорастущих клона анализировали на способность продуцировать янтарную кислоту при ферментации в пробирках со средой УРО с 5% глицерином. Продукция мутантов в условиях с добавлением и без добавления СаС03 на 5-ые и 7-ые сутки, соответственно, отображена в диаграмме на Рисунке 6 Как можно видеть из результатов ферментации, большинство мутантов превосходят исходный штамм РоН'А8с1Ь2 по продукции в условиях без стабилизации рН среды. Наибольший уровень продукции 30,2 г/л в условиях со стабилизацией рН наблюдался при ферментации мутанта #3. В отсутствии СаС03 максимальная продукция составила 17,5 г/л у мутанта #18.

> >

Мутатны штамма Ро11 ДбсП|2

Рис. 6. Скрининг мутантов первого поколения штамма РоИА8(1112 на продукцию янтарной кислоты. Серыми столбиками обозначена продукция янтарной кислоты в среде УРО с 5% глицерином на 5-ые сутки в условиях с добавлением СаСОз-Черными столбиками обозначена продукция янтарной кислоты в аналогичных условиях, но на 7-ые сутки и без добавления СаСОз- Исходный штамм Ро1ГА.8(Ш2 и контрольный штамм 1'о I Г(ига ) обозначены их коллекционными номерами ¥-3312 и ¥-3483, соответственно.

Мутанты #3 и #18, показавшие наибольшие уровни продукции янтарной кислоты в условиях со стабилизацией и без стабилизации рН, соответственно, использовали для дальнейшей селекции. Перед мутагенезом было установлено, что пороговой концентрацией янтарной кислоты в среде, которая блокирует рост обоих штаммов, является 30 г/л. После мутагенеза клетки обоих штаммов высевали на агаризовапную среду УКВ содержащую лейцин, глицерин (5%) и 30 г/л янтарной кислоты (рН 2,3). 10 мутантов штамма #3 и 30 мутантов штамма #18, отобранных на этой среде, были проанализированы на способность продуцировать янтарную кислоту в условиях без добавления СаСОэ (Рис. 7). Как можно видеть из результатов ферментации, продукция мутантов, производных от штамма #3, не превосходит уровня 15 г/л, тогда как потомки штамма #18 демонстрируют большие

уровни продукции. Так, продукция янтарной кислоты мутантами #18-12 и #18-25 составила 28,2 и 32.5 г/л. соответственно.

Рис. 7. Скрининг на продукцию янтарной кислоты мутантов второго поколения, производных от штаммов #3 и #18. Столбиками обозначен уровень продукции янтарной кислоты в среде УРС е 5% глицерином на 7-ые сутки и без добавления СаСОз.

Штаммы #18-12 и #18-25 также анализировали более подробно на способность продуцировать органические кислоты на 7-ые сутки при ферментации в среде УРО с разной концентрацией глицерина и без добавления СаС03. (Таб. 3). Как можно видеть из результатов ферментации, штамм #18-25 на среде с 5% глицерином продуцирует большие количества янтарной кислоты, чем штамм #18-12. Однако при повышении начальной концентрации глицерина в среде уровень продукции штамма #18-25 резко снижается. С другой стороны, штамм #18-12 при повышении концентрации глицерина до 10% увеличивает и продукцию янтарной кислоты до уровня 32,2 г/л.

Таблица 3. Продукция органических кислот штаммами #18-12 и #18-25 при разной исходной концентрации глицерина в среде.

Штамм Глицерин (объем %) Продукция органических кислот (г/л) *

ЯК ПК а-КГК УК ЛК

#18-12 5% 22,5 1,2 5,6 0 1,1

10% 32,2 1,6 7,8 10,7 1,1

15% 30,0 1,8 8,3 10,2 1,5

#18-25 5% 25,3 1,4 3,9 12,9 1,2

10% 18,3 4,3 2,9 13,3 1,1

15% 12,3 4,7 2,1 10,9 1,2

- ЯК, ПК, а-КГК, УК, ЛК обозначены янтарная, пировииоградная, а-кетоглутаровая, уксусная и лимонная кислоты.

Для дальнейшей селекции был выбран мутант #18-12, т.к. он превосходил лучший по продукции штамм #18-25 при более высоких исходных концентрациях глицерина. После мутагенеза клетки штамма #18-12 в одинаковом титре (108 клеток) высевали на 16 чашек Петри со средой УКВ, содержащей лейцин и глицерин (5%). Концентрация янтарной кислоты в среде варьировала от 40 до 120 г/л, при этом значение рН среды разнилось от 2,3 до 4,5. Количества клонов, подсчитанных на чашках со средой разного состава, сведены в Таблицу 4.

Таблица 4. Число мутантов штамма #18-12, отобранных на средах с разной концентрацией янтарной кислоты и рН.

Янтарная к-та ...................-.....\0'/Л) рН среды — 40 50 60 70 100 120

2,3 0 0 0 0

3 124 61* 0 0

3,5 160 28 0 0

4 220 11 20

4,5 280

- выделением отмечены эксперименты, клоны из которых были отобраны для скрининга.

45v... _ i I 5 ...

1 35 5- II III || | 1 npRil lililí!II ЕЕВЕЕВЕЕЕ 1 |

11И111 ¡11 ¡ ш ¡ ¡ II ¡ 1 iilllilllllllll !1Ш!

45 £40 35 30 25 20 15 10 5

_ : 1 í

mim na ta M Ш na утанты штамм I а «18- ш 2

Рис. 8. Скрининг на продукцию янтарной кислоты мутантов третьего поколения, производных от штамма #18-12. Столбиками обозначены уровни продукции янтарной кислоты на 5-ые сутки в среде УРС с 15% глицерином без добавления СаСОз.

Для скрининга были отобраны 20 мутантов (с #18-12-1 по #18-12-20) со среды с 50 г/л янтарной кислоты (рН 3,0), 20 мутантов (с #18-12-21 по #18-12-40) со среды с 70 г/л янтарной кислоты (рН 3,5) и 18 мутантов (с #18-12-41 по #18-12-58) со среды с 120 г/л янтарной кислоты (рН 4,0). Продукция янтарной кислоты 58-ми мутантов при ферментации в пробирках без добавления СаСОз отображена на Рисунке 8. Как можно видеть из результатов скрининга, наибольший уровень продукции янтарной кислоты (47,6 г/л) был обнаружен при ферментации мутанта #18-12-35.

7. Динамика накопления янтарной кислоты штаммом #18-12-35

Продукцию штамма #18-12-35, как наиболее эффективного среди отобранных мутантов, изучали при ферментации в колбах и в периодической культуре в ферментере. Ферментацию в колбах проводили в среде УРй при начальной концентрации глицерина 5%, 10%, 15% и 20%.

701 60

В 40-

-- 5% mi tjvn

-•-- 10%rrv42pm 15%nvuspm 20%тоцерт

2010-

з 4

Время (сутки)

Рис. 9. Динамика накопления янтарной кислоты штаммом #18-12-35 при ферментации в колбах со средой YPG с различной исходной концентрацией глицерина и без добавления CaCOj.

Из Рисунка 9 видно, что максимальное накопление янтарной кислоты (63,2 г/л) происходит на 6-ые сутки культивирования при исходной концентрации глицерина в среде 10%. В Таблице 5 детально отображена динамика накопления органических кислот в этом эксперименте. Интересно отметить, что, несмотря на исчерпание глицерина в среде уже на четвертые сутки, накопление янтарной кислоты продолжалось еще в течение двух суток, хотя и со сниженной скоростью. Из содержания других органических кислот в среде на 5-ые сутки видно, что они в совокупности не могли выступить в качестве предшественников для синтеза янтарной кислоты. Можно предположить, что последние двое суток янтарная

кислота формировалась из предварительно запасенных в ходе роста внутриклеточных веществ. Важно, что к концу ферментации в культуральной жидкости полностью отсутствовали примеси уксусной и лимонной кислоты. Отсутствие уксусной кислоты среди продуктов является дополнительным преимуществом отобранного мутанта #18-12-35, т.к. эта примесь является одним из основных факторов, затрудняющих очистку янтарной кислоты при ее биотехнологическом производстве. Присутствие в культуральной жидкости а-кетоглутаровой кислоты, хотя и является нежелательным, но не должно быть критичным для технологии очистки. Известен доступный химический подход, позволяющий просто и без предварительной очистки осуществлять окисление а-кетоглутаровой кислоты до янтарной в реакции с перекисью водорода. Из эксперимента можно также рассчитать долю от максимальной теоретической конверсии, которая составила 78%.

Таблица 5. Продукция органических кислот штаммом #18-12-35 при исходной концентрации глицерина в среде 10% (126 г/л).

Сутки Продукция органических Остаток Конверсия % от макс.

кислот (г/л) глицерина (г/г) теор.

ЯК ПК а-КГК УК ЛК (г/л) конверсии

2 14,7 3,2 3,0 0,4 1,5 - -

3 31,4 м 6,2 0,5 1,6 21,8 - -

4 47,4 0 6,7 1,4 2,0 0 - -

6 63,2 0,7 9,4 0 0 0 0,5 78%

- ЯК, ПК, а-КГК, УК, ЛК обозначены янтарная, иировиноградная, а-кетоглутаровая, уксусная и лимонная кислоты.

При культивировании штамма #18-12-35 в периодической культуре в ферментере со средой аналогичного состава было обнаружено, что рН среды за первые 2-ое суток быстро понижался до уровня 3,0 (Рис. 10). Накопление основной массы янтарной кислоты (около 70%) происходило уже после этого, со 2-х по 4-ые сутки. Таким образом, на примере штамма #18-12-35 впервые была продемонстрирована принципиальная возможность микробной продукции янтарной кислоты при низких значениях рН. Необходимо отметить, что представленные результаты не являются оптимальными, но отражают динамику процесса в периодической культуре. Начиная с 5-х суток, после исчерпания субстрата, происходило существенное понижение сухой массы клеток. Подсчет клеток путем микроскопирования и числа колониеобразующих единиц на 4-ый и 10-ый день не выявил существенных изменений в титре, что исключает потерю массы клеток в результате лизиса. Совокупность полученных данных согласуется с предположением о том, что в качестве субстрата для синтеза янтарной кислоты

могут выступать накопленные в клетках питательные вещества, например, такие характерные для дрожжей запасные сахара, как гликоген и трегалоза.

Рис. 10. Динамика накопления янтарной кислоты при культивировании штамма #18-12-35 в периодической культуре в ферментере в среде УРС с 10% (126 г/л) глицерином без р11-статирования.

8. Анализ метаболического пути синтеза янтарной кислоты в штамме К Иро1уйса, лишенном активности сукцинатдегндрогеназы

Принципиальным для выбора подхода к дальнейшей оптимизации продуцента методами генной инженерии является то, какой из путей синтеза является основным при синтезе янтарной кислоты. Очевидно, что синтез по восстановительной ветви цикла Кребса не может вносить значительный вклад в продукцию в связи с недостатком восстановленных эквивалентов при аэробных условиях культивирования. Более вероятным в этих условиях выглядит синтез по окислительной ветви цикла Кребса. Однако, учитывая такую особенность биохимии дрожжей У. Про1уИса, как активность глиоксилатного цикла при росте на гексозах, нельзя исключить, что этот путь также вносит значительный вклад в синтез продукта.

Как можно видеть из результатов анализа состава органических кислот в культуральной жидкости при ферментации штамма #18-12-35, основной примесью (около 15% по массе) является а-кетоглутаровая кислота. Накопление этого метаболита предположительно вызвано недостаточной активностью а-кетоглутаратдегидрогеназы. Для устранения примеси и повышения продукции, в зависимости от того какой из путей синтеза является основным, могут быть предложены два альтернативных подхода. В случае, если основным путем является окислительная ветвь цикла Кребса, а-кетоглутаратдегидрогеназная реакция оказывается узким местом, и штамм может быть улучшен путем повышения экспрессии генов, кодирующих субъединицы этого фермента. Напротив, если основным путем является глиоксилатный цикл, то эффект может быть достигнут снижением активности изоцитратдегидрогеназы - предыдущего фермента в цикле Кребса.

Важным инструментом для определения пути синтеза продукта является изотопный анализ с использование пС-меченых субстратов. Одним из препятствий, ограничивающих применение метода, является наличие в метаболизме изучаемого организма циклических реакций, ведущих к рандомизации распределения 13С-углерода в анализируемом продукте. Например, таким путем является пентозофосфатный шунт, содержащий циклические последовательности реакций. Забегая вперед, необходимо отметить, что в исследуемом штамме в ходе анализа была обнаружена достаточно высокая, на уровне, сопоставимом с гликолизом, активность пентозофосфатного пути. Вследствие этого использование коммерчески доступного 1,3-|3С-глицерина в качестве субстрата для изотопного анализа оказалось неинформативным. Последнее вызвано тем, что в ходе реакций пентозофосфатного пути происходит рандомизация распределения 13С-меченого углерода в молекуле пирувата, предшественника янтарной кислоты. В качестве подходящего субстрата для такого эксперимента может быть использована 1,6-13С-глюкоза. При использовании этого субстрата активность пентозофосфатного пути не будет вызывать рандомизации положения ,3С-углерода в пирувате, а приведет к образованию немеченого и 3-|3С-меченого пирувата в строгом соотношение 2:3 (Рис. 11).

Несмотря на то, что исходный штамм РоИДвсЦгё не утилизировал глюкозу, высев полученных в ходе селекции мутантов на агаризованную среду УРГ) выявил способность некоторых из них расти на этом субстрате. В числе этих штаммов оказался отобранный как лучший продуцент после второго раунда мутагенеза штамм #18-12, который в дальнейшем использовали для изотопного анализа при росте на 1,6-|3С-глюкозе.

В результате гликолиза из 1,6-13С-глюкозы должен образовываться 3-,3С-пируват, который, в зависимости от того, будет использована окислительная ветвь цикла Кребса (митохондриальный путь), восстановительная его ветвь

(цитозольный путь) или глиоксилатный цикл (пероксисомальный путь), преобразуется в 1,3-'3С-сукцинат (продукт-1), 2-'3С-сукцинат (продукт-5) или 2,3-|3С-сукцинат (продукт-2), соответственно (Рис. 11). Помимо этого, в случае если митохондриальный и пероксисомальный пути будут работать совместно, могут образовываться некоторые количества продуктов-3 и -4 за счет обмена интермедиатами (малат, оксапоацетат, цитрат, изоцитрат) между компартментами. Однако в результате того, что митохондриальный продукт-4 может быть образован только из интермедиатов глиоксилатного цикла (2,3-|3С-малат, 2,3-|3С-оксалоацетат, 2,3,4-'3С-цитрат, 2,3,4-13С-изоцитрат), совместно с ним в предыдущем глиоксилатном цикле как минимум в эквимолярном количестве будет образован и продукт-2.

Рис. 11. Схема биосннтеза возможных изотопомеров янтарной кислоты при ферментации штамма #18-12 на среде с 1,6-13С-глюкозой. Черными и белыми кружками обозначены, соответственно, ,3С-меченые и немеченые атомы углерода в составе интермедиатов центрального метаболизма. На схеме не учтено включение в метаболизм немеченого пирувата, образуемого из пентозофосфатного пути (см. объяснение в тексте). Пзотоиомеры янтарной кислоты обведены и каждому пути синтеза присвоен номер соответствующего продукта. В процентах приведены рассчитанные из результатов эксперимента величины минимальной доли глюкозы, утилизируемой через пентозофосфатный путь, и минимальной доли янтарной кислоты, образуемой по окислительной ветви цикла Кребса.

Помимо основных продуктов-1, -2, -3, -4 и -5, теоретически возможно образование минорных продуктов-Г, -2', -3' и -4' (Рис. 11), которые могут образовываться совместно с основными, в том случае если некоторая часть 3-'3С-оксалоацетата будет превращаться в 2-13С-оксалоацетат. Такое превращение

может происходить при высокой активности ферментов цитозольного пути в двух направлениях: оксалоацетат —» малат —► фумарат —► малат —► оксалоацетат. При этом соотношение любого минорного продукта и соответствующего основного продукта (например, продукта-Г и продукта-1) не может превышать пропорции 1:1, а в случае продукта-4' его доля не может превышать четверти в смеси с продуктами-4, -2 и -2'.

Активность пентозофосфатного пути, как говорилось выше, будет вести к появлению, наряду с 3-'3С-пируватом, еще и молекул немеченого пирувата. Включение в метаболизм последнего вызовет равновероятное замещение в любом из четырех возможных положений молекулы янтарной кислоты |3С-углерода на немеченый. Важно отметить, что при этом вероятность такого замещения будет пропорциональна активности пентозофосфатного пути.

В соответствии с этим, штамм #18-12 растили в маленьком объеме среды УРЭ, содержащей в качестве источника углерода 1,6-13С-меченую глюкозу (5%). На вторые сутки ферментации в среду вносили стерильный мел (5%). Спустя 7 суток культуральную жидкость использовали для экстракции содержащейся в ней янтарной кислоты. После испарения органической фазы остаток сухого вещества использовали для анализа методами ПМР и ЯМР (Рис. 12 н 13).

Рис. 12. ПМР спектр изотопомеров янтарной кислоты, полученных при ферментации штамма #18-12 на среде с 1,6-13С-глюкозой. Центральный пик соответствует немеченому углероду, а сумма боковых - 13С-углероду в метиленовой группе молекул янтарной кислоты.

Из спектра ПМР на Рисунке 12 видно, что у продуцируемой янтарной кислоты в центральном положение (метиленовые группы) отношение числа 1ЭС-меченых

атомов углерода к немеченым составляет 0,8. Однако при утилизации 1,6-|3С-глюкозы через гликолиз среди ожидаемых изотопомеров (Рис. 11) это соотношение не может быть ниже величины 1,0 (1 меченый к 1-му немеченому). Учитывая равновероятное исключение меченого углерода в продукте при появлении немеченого пирувата, можно вычислить минимальную долю глюкозы, утилизируемую через пентозофосфатный путь. Так, минимальная доля немеченого пирувата составит 1/9. Из чего видно, что как минимум 5 из 18 молекул пирувата образуются из пентозофосфатного пути. В результате этого минимальная доля глюкозы, утилизируемой через пентозофосфатный путь, должна составлять не менее 32%.

(l.4-13COCr) (Чз-"СНг)

Рис. 13. ЯМР спектр изотопомеров янтарной кислоты, полученных при ферментации штамма #18-12 на среде с 1,6-|3С-глюкозой. Левый пик соответствует 13С-углероду в карбоксильной группе, а правый - в метиленовой группе молекул янтарной кислоты.

На Рисунке 13 из спектра ЯМР видно, что отношение количества 13С-метки в центральных (метиленовых) группах к ее количеству в боковых (карбоксильных) группах у продуцируемой янтарной кислоты составляет 1,21. При этом необходимо отметить, что добавление немеченого пирувата будет равновероятно снижать содержание метки как в боковых, так и в центральных группах и, следовательно, может не учитываться при расчете этого соотношения в смеси полученных изотопомеров. Учитывая распределение метки в метиленовых и карбоксильных группах всех четырех изотопомеров (Рис. 11), соотношение 1,21 может быть получено только в том случае, если основным продуктом является 1,3-13С-

меченный сукцинат, т.е. продукт-1 или -4'. При этом минимальное его содержание (83%) возможно в смеси с 2-,3С-меченным сукцинатом. С другой стороны, как обсуждалось выше, для минорного продукта-4' максимальная доля не может превышать четверти в смеси с продуктами-2, -2' и -4.

Суммируя вышесказанное, можно заключить, что в полученном штамме #18-12 при росте на глюкозе основным путем синтеза янтарной кислоты является окислительная ветвь цикла Кребса. Минимальная доля продукта, синтезируемого этим путем, составляет 83%. При этом как минимум 32% глюкозы в штамме утилизируется через пентозофосфатный путь. Последняя величина хорошо согласуется с данными, опубликованными ранее для изогенного дикого штамма У. Иро1уиса W29, где активность пентозофосфатного пути оценивается в районе 40%. Столь высокая активность этого пути объясняется тем, что для У. Нро1уИса пентозофосфатный путь является единственным источником регенерации восстановленного НАДФН, необходимого для роста биомассы. На основании полученных данных можно также рассчитать, что в полученном штамме #18-12 минимальная доля глюкозы, расходуемая на регенерацию восстановленного НАДФН, составляет 5%.

Очевидно, что при культивировании штамма #18-12 на среде с глицерином активность пентозофосфатного пути и вклад окислительной ветви цикла Кребса в синтез янтарной кислоты могут отличаться от данных, полученных на среде с глюкозой. Однако стоит упомянуть, что глюкоза является более доступным и, как следствие, более перспективным субстратом для биотехнологического производства. В связи с этим одним из основных направлений дальнейших исследований по этой теме является конструирование на базе штамма #18-12 продуцента янтарной кислоты, устойчивого к низким значениям рН и при этом эффективно утилизирующего глюкозу. Другим важным направлением дальнейших исследований является повышение продукции янтарной кислоты и увеличение конверсии путем снижения содержания примеси а-кетоглутаровой кислоты в продукте. Исходя из данных о том, что основным путем синтеза янтарной кислоты в полученном штамме является окислительная ветвь цикла Кребса, узким местом в синтезе должна быть а-кетоглутаратдегидрогеназная реакция. Для решения этой задачи в дальнейшем предполагается увеличить в штамме активность а-кетоглутаратдегидрогеназы путем повышения экспрессии генов, кодирующих субъединицы этого фермента.

выводы

1. Разработан подход для направленного получения Тэ-мутаций в летальных и условно-летальных генах дрожжей К. Иро1у11са. Предложенный подход успешно использован для получения Тв-мутаций (01и483Ьуз и 5ег675РЬе) в гене БОШ дрожжей У. Иро1уНса.

2. Впервые на облигатно-аэробном микроорганизме изучены свойства штамма, лишенного активности сукцинатдегидрогеназы. Инактивация сукцинатдегидрогеназы в диком штамме дрожжей У. /¡ро/уп'са приводит к неспособности культуры расти на средах с глюкозой, при этом культура утилизирует глицерин и накапливает значительные количества янтарной кислоты. В результате использования селекционного подхода из штамма с делецией по гену БОН2 получен мутант #18-12, способный утилизировать глюкозу и накапливать янтарную кислоту.

3. Впервые продемонстрирована принципиальная возможность микробной продукции янтарной кислоты в условиях без рН-статирования. Полученный штамм У. Иро1уйса #18-12-35 способен накапливать до 63 г/л янтарной кислоты без добавления нейтрализующего агента.

4. Определены особенности биосинтеза янтарной кислоты в штамме #18-12, утилизирующем глюкозу. Анализ распределения |3С-меченых атомов углерода в спектре ЯМР и ПМР показал, что более 32% глюкозы утилизируется через пентозофосфатный путь и более 83% янтарной кислоты синтезируется по окислительной ветви цикла Кребса в митохондрии.

Слисок публикаций по теме диссертации

1. Юзбашев Т.В., Соболевская Т.И., Тихонова Е.Ю., Выборная Т.В., Лаптев И.А., Синеокий С.П. Интегративный вектор Random-URA3-RPT для последовательного введения множественных копий генетических элементов в дрожжи Yarrowia lipolytica. Патент РФ № 2376376. Дата приоритета 16.11.2006.

2. Sineoky S.P., Yuzbashev T.V., Yuzbasheva E.Y., Sobolevskaya T.I., Laptev I.A., Vybornaya T.V. A method for production succinic acid using a yeast belonging to the genus Yarrowia. Patent Application WO 2010/087503 Al. Priority date 30.01.2009.

3. Yuzbashev T.V., Yuzbasheva E.Y., Sobolevskaya T.I., Laptev I.A., Vybornaya T.V., Larina A.S., et al. Production of succinic acid at low pH by a recombinant strain of the aerobic yeast Yarrowia lipolytica. Biotechnol Bioeng 2010; 107:673-82.

4. Yuzbashev T.V. Microbial production of C-4 metabolites. German-Russian Forum Biotechnology, 16-18.06.2010 Munich, Germany; p. 42.

5. Yuzbashev T.V., Yuzbasheva E.Y. Is it possible to produce succinic acid at low pH? Levures Modeles et Outils IX, 30.08-02.09.2010 Strasbourg, France; p. 49.

Подписано в печать: 12.01.2011

Заказ № 4817 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Юзбашев, Тигран Владимирович

I. ВВЕДЕНИЕ.

1. Актуальность темы.

2. Цели и задачи исследования.

3. Научная новизна.

4. Практическая ценность работы.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Потребность в янтарной кислоте и перспективы ее производства.

2. Пути синтеза янтарной кислоты в клетке.

3. Механизм токсичного действия слабых органических кислот.

4. Выбор метаболического пути и микроорганизма для продукции янтарной кислоты при низких значениях рН.

5. Некоторые особенности центрального метаболизма У Иро1уИса.

6. Экологический аспект производства био-сукцината.

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Среды и штаммы.

2. Идентификация ОКР в геноме У Иро1уИса.

3. Конструирование плазмид р1ЖА-с!8ВН1 и риКА-сШЗБШ.

4. Конструирование плазмид риС19-иКАЗ-КРТ и рК-1гр4с1-Нр2.

5. Последовательное введение копий гена ЫР2 в геном У Нро1уйса.

6. Конструирование штамма с ТБ-мутацией в гене £ОЯ7.

7. Конструирование штамма с делецией по гену ££>//2.

8. Конструирование ига+ производного штамма от Ро15.

9. Химический мутагенез дрожжей У. Иро\уйса.

10. Условия культивирования и определение скорости роста.

11. Периодическое культивирование в ферментере.

12. ВЭЖХ анализ состава культуральной жидкости.

13. Измерение активности сукцинатдегидрогеназы.

14. Измерение активности липазы.

15. Гибридизация по Саузерну.

16. Анализ 13С-изотопомеров янтарной кислоты.

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Инактивация сукцинатдегидрогеназы в штамме Y. lipolytica Polf.

1.1. Попытка инактивация гена SDH1 в штамме Y. lipolytica Polf.

1.2. Разработка подхода для отбора Ts-мутаций по летальным генам в Y. lipolytica, на примере гена SDH1.

1.3. Инактивация гена SDH2 в штамме Y. lipolytica Polf.

1.4. Измерение активности сукцинатдегидрогеназы в штаммах Y. lipolytica, дефектных по субъединицам Sdhl и Sdh2.

1.5. Влияние инактивации субъединиц Sdhl и Sdh2 в Y lipolytica на продукцию янтарной кислоты.

2. Селекция штамма Y lipolytica PolfAsdh2 на повышение продукции янтарной кислоты

2.1. Селекция штамма PolfAsdh2 на повышение жизнеспособности.

2.2. Селекция мутантов #3 и #18 на повышение устойчивости к янтарной кислоте

2.3. Селекция мутанта #18-12 на повышение устойчивости к янтарной кислоте.

3. Характеризация полученного штамма Y. lipolytica #18-12-35.

3.1. Динамика накопления янтарной кислоты штаммом #18-12-35.

3.2. Анализ метаболического пути синтеза янтарной кислоты в штамме Y. lipolytica, лишенном активности сукцинатдегидрогеназы.

4. Разработка системы для последовательной многокопийной интегративной трансформации штаммов Y. lipolytica.

4.1. Разработка интегративного вектора для последовательного введения копий в штаммы Y. lipolytica.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка эффективного дрожжевого продуцента янтарной кислоты для ферментации при низких значениях pH"

1. Актуальность темы

Биотехнология как наука в век высоких технологий является одной из востребованных и, как следствие, быстрорастущих областей знаний. Одной из основных задач современной биотехнологии является необходимость глобального перехода мировой промышленности с невозобновляемых природных ресурсов (таких, как нефть и газ) на возобновляемые (растительное сырье). Для этого необходимы технологии, которые позволят эффективно преобразовывать растительные углеводы и жиры в компоненты, служащие сырьем для химической промышленности и энергетики. Решением поставленной задачи является использование микроорганизмов, специально разработанных для этих целей.

Янтарная кислота — двухосновная карбоновая кислота, интермедиат цикла Кребса, накапливается некоторыми анаэробными бактериями в качестве продукта брожения (Song and Sang 2006). Наличие двух карбоксильных групп, расположенных по краям молекулы, позволяет получать на ее основе многие химические соединения, среди которых важные предшественники органического синтеза, полимеры, растворители, детергенты и др. (Sauer et al. 2008). Янтарная кислота в виде солей, сукцинатов, в больших масштабах применяется в роли антиобледенителей на ответственных участках дорог и аэропортов. По оценке специалистов министерства энергетики США, янтарная кислота входит в список 12 веществ, которые в ближайшем будущем будут производиться из биомассы и придут на смену продуктам нефтехимииhttp://www 1 .eere.eneray.gov/biomass/pdfs/35523.pdi'). Тем* не менее в настоящее время основным источником янтарной кислоты является 1,4-бутандиол, получаемый из нефти. Однако в Европе и США уже действуют 5; экспериментальных установок, производящих янтарную; кислоту путем ферментации из возобновляемого сырья (Chailener 2009).

Производство янтарной кислоты- с применением» бактериальных: культур- имеет существенный недостаток с точки зрения экономичности;1 процесса;, В ходе: ферментации происходит накопление кислоты, и, так, как ферментацию необходимо, вести при нейтральных значениях рН, требуется эквимолярный расход ¡щелочи. Более подходящими для этих целой могли бы быть- грибные или дрожжевые: культуры, среди которых многие штаммы обладают, способностью1 адаптироваться к кислотной среде. Однако в немногочисленных работах, опубликованных на данный момент . и описывающих накопление сукцината эукариотами, уровни .продукции несопоставимо низки по . сравнению с результатами, продемонстрированными на бактериях (Gallmetzer et al. 2002: Lupianez et al. 1974; Muratsubaki 1987; Sato 1972). Исходя из' этого перед нами была; поставлена задача, конструирования дрожжевого; штамма, накапливающего янтарную' кислоту в условиях, не требующих добавления нейтрализующего агентш .Потенциально применение такого; штамма: в промышленргости может позволить снизить, себестоимость производимой янтарной кислоты, а значит, увеличить конкурентоспособность продукта по отношению к янтарной кислоте, производимой из нефти.

2. Цёли и задачи исследования

Данная работа посвящена изучению возможности микробиологической продукции янтарной кислоты в условиях, не требующих добавления титрующего агента.,

В связи: с этим ставились следующие.задачи:

- выбор; подходящего микроорганизма^ оптимальных условий ферментации и. пути синтеза, для продукции янтарной кислоты в. условиях без титрующего агента;

- конструирование штамма дрожжей, накапливающего янтарную кислоту;

- оптимизация штамма методом селекции для продукции янтарной кислоты в условиях без титрующего агента;

- анализ и характеристика полученного дрожжевого штамма-продуцента.

3. Научная новизна

В работе впервые продемонстрирована потенциальная возможность микробного синтеза янтарной кислоты в условиях без добавления титрующего агента. До настоящего времени были описаны лишь бактериальные штаммы, продуцирующие значимые количества янтарной кислоты (Jantama et al. 2008а). Биосинтез у них происходит по восстановительной ветви цикла Кребса в анаэробных условиях культивирования. Из энергетических соображений при этой метаболической схеме синтеза невозможно вести ферментацию без рН-статирования. В представленной работе синтез янтарной кислоты осуществляется дрожжами Yarrowia lipolytica при использовании окислительной ветви-цикла Кребса в аэробных условиях. Благодаря активной дыхательной цепи клетки обладают большей энергией и способны адаптироваться к низким значениям рН и высокой концентрации янтарной кислоты1 в среде. В работе использован оригинальный подход для изоляции Ts-мутаций по гену • SDH1, кодирующему флавин-содержащую субъединицу сукцинатдегидрогеназы. Полученный штамм использован для подбора условий селекции трансформанта с делецией по гену SDH2. На основе штамма с делецией по гену SDH2 селекцией в три этапа получен мутант #18-12-35, накапливающий янтарную кислоту в условиях без нейтрализующего агента в количестве до 63 г/л. С использованием методов ЯМР и ПМР определены особенности биосинтеза янтарной кислоты у предшествующего мутанта #18-12.

Необходимо отметить, что исходный штамм, несущий делецию по гену SDH2,' оказался не способен утилизировать глюкозу, по рос на средах с, глицерином. Такой; фенотип может быть объяснен с: точки зрения разной энергии окисления глицерина и глюкозы, получаемой« в виде: АТР при-окислительном; фосфорилировании. Однако в ходе дальнейшей селекции на основе штамма» с: делецией были получены производные;, способные утилизировать глюкозу и накапливать янтарную кислоту. Трудно^ предположить, будет ли такое предпочтение в отношении субстратов.общим для других аэробных дрожжей, поскольку инактивация, сукцинатдегидрогеназы у облигатно аэробного микроорганизма, т.е. микроорганизма; не способного к брожению, в работе показана впервые. 4. Практическая ценность работы

Производство янтарной- кислоты является одним из приоритетных направлений? современной; биотехнологии. Наиболее затратной стадией при производстве янтарной кислоты является ферментация, • требующая для поддержания нейтральных значений рН расхода эквимолярных количеств щелочи.' В работе впервые показана принципиальная возможность микробного синтеза янтарной кислоты- при низких значениях рН, что позволяет избежать нежелательного расхода- нейтрализующего; агента, и; как следствие, существенно снизить себестоимость продукта. Основным физиологическим: фактором, препятствующим накоплению слабой органической кислоты без ее нейтрализации-щелочью, является недостаток метаболической? энергии, необходимой« для адаптации» клеток к кислотным условиям среды в, ходе ферментации. В связи с этим в работе-сконструирован дрожжевой штамм, синтезирующий янтарную кис лоту через окислительную ветвь цикла Кребса. Такой путь синтеза. позволяет вести процесс, в аэробных условиях при? активном- дыхании, что обеспечивает клетку избытком: энергии, необходимой для адаптации клеток к высокой концентрации кислоты и низкому значению рН. Результаты исследования представляют потенциальный интерес для биотехнологии и могут быть использованы для получения промышленного дрожжевого штамма-продуцента янтарной кислоты, обладающего рядом преимуществ по сравнению с существующими бактериальными продуцентами. Сконструированный дрожжевой штамм #18-12-35 накапливает янтарную кислоту в количестве до 63 г/л при росте на среде с глицерином и не требует поддержания нейтральных значений рН среды при ферментации.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Юзбашев, Тигран Владимирович

VI. выводы

1. Разработан подход для направленного получения Тэ-мутаций в летальных и условно-летальных генах дрожжей У. Иро1уйса. Предложенный подход успешно использован для получения Тэ-мутаций (С1и483Ьуз и 8ег675РЬе) в гене БЭШ дрожжей У. Иро1уИса.

2. Впервые на облигатно-аэробном микроорганизме изучены свойства штамма, лишенного активности сукцинатдегидрогеназы. Инактивация сукцинатдегидрогеназы в диком штамме дрожжей У. Иро1уИса приводит к неспособности культуры расти на средах с глюкозой, при этом культура утилизирует глицерин и накапливает значительные количества янтарной кислоты. В результате использования селекционного подхода из штамма с делецией по гену 57Ж2 получен мутант #18-12, способный утилизировать глюкозу и накапливать янтарную кислоту.

3. Впервые продемонстрирована принципиальная возможность микробной продукции янтарной кислоты в условиях без рН-статирования. Полученный штамм У Нро1уйса #18-12-35 способен накапливать до 63 г/л янтарной кислоты без добавления нейтрализующего агента.

4. Определены особенности биосинтеза янтарной кислоты в штамме

17

18-12, утилизирующем глюкозу. Анализ распределения С-меченых атомов углерода в спектре ЯМР и ПМР показал, что более 32% глюкозы утилизируется через пентозофосфатный путь и более 83% янтарной кислоты синтезируется по окислительной ветви цикла Кребса в митохондрии.

У. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В представленной работе была поставлена цель по изучению возможности микробиологической продукции янтарной кислоты в условиях, не требующих добавления титрующего агента. На основе анализа литературы было сделано предположение, что основным препятствием на пути к конструированию такого микроорганизма-продуцента является нехватка метаболической энергии, необходимой для выброса из клетки анионов янтарной кислоты и поддержания нейтральных значений внутриклеточного рН. Исходя из этого, было предложено в конструируемом продуценте для синтеза янтарной кислоты в аэробных условиях использовать окислительную ветвь цикла Кребса. В качестве объекта были выбраны аэробные дрожжи Y. lipolytica, т.к. этот организм лишен метаболических путей, необходимых для брожения, и способен накапливать существенные количества ряда органических кислот — интермедиатов цикла Кребса.

Для конструирования штамма Y. lipolytica, продуцирующего янтарную кислоту, в первую очередь были изучены возможные подходы для инактивации ферментного комплекса сукцинтадегидрогеназы. На основе генетического эксперимента с использованием штамма Y. lipolytica со встроенной в геном плазмидой pURA-dSDHl было сделано предположение о летальном или условно летальном действии делеции по гену SDH1. Был разработан подход для направленного получения Ts-мутаций по летальным генам в Y. lipolytica. Полученные штаммы Ts#l, Ts#6 и Ts#8, несущие Ts-мутаций в гене SDH1, позволили установить, что инактивация сукцинатдегидрогеназы в Y. lipolytica ведет к условной летали, т.к. полученные штаммы оказались способны расти в непермиссивных условиях на средах, содержащих глицерин, но не росли на средах с глюкозой. Благодаря этому стало возможно отобрать трансформант PolfAsdh2 с делецией по гену SDH2. Измерение активности фермента сукцинатдегидрогеназы в штаммах Тб#6 и PolfAsdh2 показало, что мутация в каждой из двух субединиц, флавин-содержащей и железо-серной, приводит к потере функциональности всего комплекса. Также оба штамма при росте в богатой среде с глицерином- в присутствии нейтрализующего агента СаСОз накапливали около 20 г/л янтарной кислоты.

Штамм сделецией Ро1ТДзёЬ2 использовали для трехэтапной селекции на повышение продукции янтарной кислоты. В первом раунде, селекции после мутагенеза был получен штамм #18, обладающий большей жизнеспособностью и способный накапливать 17,5 г/л янтарной-кислоты в, условиях без стабилизации рН. В двух последующих раундах селекции на повышение устойчивости к янтарной, кислоте были получены- штаммы #18-1-2 и #18-12-35, накапливающие, соответственно, 32;2 и 47,6 г/л продукта в условиях без стабилизации рН.

При ферментации в колбах в богатой, среде с оптимальной концентрацией глицерина (10%) продукция штамма #18-12-35 на 6-ые сутки составила 63,2 г/л. Анализ динамики, накопления* янтарной кислоты в аналогичной среде в ферментере показал, что секреция основной массы продукта наблюдается уже после понижения рН* до- уровня 3,0, что свидетельствовало о* достижении поставленной цели исследования. Для анализа пути синтеза янтарной кислоты в полученных штаммах было предложено использовать изотопный анализ. Однако среди коммерчески доступных субстратов для такого исследования могла быть использована 1 только 1,6- С-глюкоза. Несколько мутантов, из числа полученных в ходе селекции, среди которых оказался* и промежуточный штамм #18-12, оказались способными расти на среде с глюкозой. Анализ распределения 13С-меченых атомов углерода в спектре ЯМР и ПМР выявил, что более 32% глюкозы утилизируется через пентозофосфатный путь и более 83% янтарной кислоты синтезируется по окислительной ветви цикла Кребса. По результатам анализа и с учетом наличия существенной (около 15% по массе) примеси а-кетоглутаровой кислоты было сделано предположение о недостаточной активности в полученных штаммах а-кетоглутаратдегидрогеназы. Для оптимизации свойств полученных штаммов-продуцентов в качестве дальнейшей перспективы было предложено увеличить активность этого ферментного комплекса путем повышения экспрессии соответствующих генов. Однако для реализации такой возможности требовалось разработать систему для эффективной одновременной экспрессии в У Нро1уНса нескольких различных генов.

В соответствии с этим была разработана система для последовательной многокопийной интегративной трансформации штаммов У. Иро1уйса. В качестве примера в геном штамма У. Нро1уНса РоН были последовательно введены 3 дополнительные копии гена ЫР2. Наличие копий и их эффективная экспрессия были продемонстрированы методом гибридизации по Саузерну и повышением активности липазы в культуральной жидкости, соответственно. В дальнейшем данная система может быть использована на полученных штаммах, продуцирующих янтарную кислоту при низких значениях рН, для одновременной экспрессии генов, кодирующих субъединицы а-кетоглутаратдегидрогеназного комплекса.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Юзбашев, Тигран Владимирович, Москва

1. Ильченко АП, Чернявская ОГ, Шишканова НВ, Финогенова ТВ. 2001.

2. Особенности метаболизма дрожжей Yarrowia lipolytica при синтезе из этанола а-кетоглутаровой и лимонной кислот. Влияние NH4+. и [Оо] на синтез и дыхание. Микробиология 70(2): 189-195.

3. Ильченко АП, Чернявская ОГ, Шишканова НВ, Финогенова ТВ. 2002.

4. Особенности метаболизма дрожжей Yarrowia lipolytica при синтезе из этанола а-кетоглутаровой и лимонной кислот. Сравнительное изучение функционирования ферментов центрального метаболизма. Микробиология 71(3):316-22.

5. Лозинова АБ, Финогенова ТВ, Шишканова НВ, Илларионова ВИ, Карклинь Р Я, Пелцмане ИЖ, Раминя ЛО, Лука ВТ, Кестарис Б Я; 1982. А.с. №695230 // Б.И. №23. С.307.

6. Синеокий СП, Юзбашев ТВ, Лаптев ИА, Юзбашева ЕЮ, Выборная ТВ, Соболевская ТИ; 2007. Штамм дрожжей Yarrowia lipolytica -продуцент липазы. Патент РФ № 2355754. Дата приоритета 25.12.2007.

7. Финогенова ТВ, Гринчак АВ, Илларионова ВИ, Шишканова НВ. 1979.

8. Биосинтез лимонной и изолимонной кислот природным и мутантным штаммами Candida lipolytica на средах с различными источниками углерода. Прикл. биохимия и микробиология 15(6):811-16.

9. Финогенова ТВ, Моргунов ИГ, Камзолова ОГ, Чернявская ОГ. 2005.

10. Перспективы производства органических кислот дрожжами Yarrowia lipolytica. Прикл. биохимия и микробиология 41(5):478-86.

11. Arikawa Y, Kuroyanagi T, ShiniosakaM,MuratsubakiFI, Enomoto K, Kodaira . R, Okazaki M. 1999. Effect of gene disruptions of the TCA cycle on production of succinic acid in Saccharomyces cerevisiae. J Biosci.Bioeng '■■'■; 87(l):28-36. \ ■ "

12. Bahler J, Wu JQ, Longtine MS, Shah NG, McKenzie A, 3rd, Steever AB, Wach. A, Philippsen P, Pringle JR. 1998. Heterologous modules for efficient;and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe. Yeast 14(10):943-51. ' " ' . " ; v

13. Bankar AV, Kumar AR, Zinjarde SS. 2009. Environmental and industrialapplications of Yarrowia lipolytica. Appl Microbiol Biotechnol 84(5):847-65. V ' ' . . '

14. Barth G, Gaillardin C. 1997. Physiology and genetics of the dimorphic fungus

15. Yarrowia lipolytica. FEMS^-Micrpbipl-^^Rev 19(4);219-37. Bart h G, ScheuberT. 1993. Cloning of the isocitrate lyase gene (ICL1) from

16. Blank EM, Lehmbeck F, Sauer U. 2005. Metabolic-flux and'network analysis in fourteen'hemiascomycetous yeasts. FEMS Yeast Res 5(6-7):545-58.

17. Bordes F, Fudalej F, Dossat V, Nicaud JM, Marty A. 2007. A new recombinant protein expression system for high-throughput screening in the yeast Yarrowia lipolytica. J MicrobiolMethods 70(3):493-502.

18. Borges ER, Jr. PereiraN. 2010. Succinic acid production'from sugarcane bagasse hemicellulose hydrolysate by Actinobacillus succinogenes. J Ind Microbiol Biotechnol.

19. Bradford'MM. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72:248-54.

20. Branduardi P, Fossati T, Sauer M, Pagani R, Mattanovich D, PorroD. 2007. Biosynthesis of vitamin C by yeast leads to increased.stress resistance. PEoSOne 2(10):el092.

21. Burghoorn HP, Soteropoulos P, Paderu P, Kashiwazaki R, Perlin DS. 2002. Molecular* evaluation of the plasma membrane proton pump from* Aspergillus fumigatus. Antimicrob*Agents Chemother 46(3):615-24.

22. Carmelo V, Santos H, Sa-Gorreia I. 1997. Effect of extracellular acidification on the activity of plasma membrane ATPase and on'the cytosolic and vacuolar pH of Saccharomyces cerevisiae. Biochim Biophys Acta 1325(l):63-70.

23. Challener C. 2009. Sugar never tasted so sweet. Speciality Chemicals Magazine (ISSN 0262-2262) 29 (5):42-44.

24. Corte-Real M, Eeao C. 1990. Transport of malic acid and other dicarboxylicacids in the yeast Hansenula anomala. Appl Environ Microbiol 56(4): 110913.

25. Donnelly MI, Millard CS, Clark DP, Chen MJ, Rathke JW. 1998. A novelfermentation pathway in an Escherichia coli mutant producing succinic acid, acetic acid, and ethanol. Appl Biochem Biotechnol 70-72:187-98.

26. Dower WJ, Miller JF, Ragsdale CW. 1988. High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation. Nucleic Acids Res 16(13):6127-45.

27. Dujon B, Sherman D, Fischer G, Durrens P, Casaregola S, Lafontaine I, De Montigny J, Marck C, Neuveglise C, Talla E and others. 2004. Genome evolution in yeasts. Nature 430(6995):35-44.

28. Fickers P, Destain J, Thonart P. 2009. Improvement of Yarrowia lipolytica lipase production by fed-batch fermentation. J Basic Microbiol 49(2):212-5.

29. Fickers P, Fudalej F, Nicaud JM, Destain J, Thonart P. 2005. Selection of new over-producing derivatives for the improvement of extracellular lipase production by the non-conventional yeast Yarrowia lipolytica. J Biotechnol 115(4):379-86.

30. Fickers P, Le DallMT, Gaillardin C, Thonart P, Nicaud JM. 2003a. Newdisruption cassettes for rapid gene disruption and marker rescue in the yeast Yarrowia lipolytica. J Microbiol Methods 55(3):727-37.

31. Fickers P, Nicaud JM, Destain J, Thonart P. 2003b. Overproduction of lipase by Yarrowia lipolytica mutants. Appl Microbiol Biotechnol 63(2): 136-42.

32. Flores CL, Gancedo C. 2005. Yarrowia lipolytica mutants devoid of pyruvate carboxylase activity show an unusual growth phenotype. Eukaryot Cell 4(2):356-64.

33. Fournier P, GuyaneuxL, Chasles M, Gaillardin C. 1991. Scarcity of ars sequences isolated in a morphogenesis mutant of the yeast Yarrowia lipolytica. Yeast 7(l):25-36.

34. Gabrielczyk T. 2009. BASF setzt auf fermentation von plattformchemikalie.

35. Transkript (ISSN 1435-5272) Life Sciences-Magazine 15 Jahrgang 11:2829 (in german).

36. Gallmetzer M, Meraner J, Burgstaller W. 2002. Succinate synthesis and excretion by Penicillium simplicissimum under aerobic and anaerobic conditions. FEMS Microbiol Lett 210(2):221-5.

37. Goldberg I, Rokem S, Pines O. 2006. Organic acids: old metabolites, new themes. J Chem Tech Biotechnol 81(10): 1601-11.

38. Guettler MV, Jain MK, Rumler D; 1996. Method for making succinic acid,bacterial variants for use in the-process, and methods of obtaining variants. Patent US 5,573,931.

39. Jantama K, Zhang X, Moore JC, Shanmugam KT, Svoronos SA, Ingram LO. 2008b. Eliminating side products and increasing succinate yields in engineered strains of Escherichia coli C. Biotechnol Bioeng 101(5):881-93.

40. Juretzek T, Le Dall M, Mauersberger S, Gaillardin C, Barth G, Nicaud J. 2001. Vectors for gene expression and amplification in the yeast Yarrowia lipolytica. Yeast 18(2):97-113.

41. Kadonaga JT, Knowles JR. 1985.,A simple and efficient method for chemical mutagenesis of DNA. Nucleic Acids Res 13(5): 1733-45.

42. Kubo Y, Takagi H, Nakamori S. 2000. Effect of gene disruption of succinate dehydrogenase on succinate production in a sake yeast strain. J Biosci Bioeng 90(6):619-24.

43. Kunze M, Pracharoenwattana I, Smith SM, Hartig A. 2006. A central role for the peroxisomal membrane in glyoxylate cycle function. Biochim Biophys Acta 1763(12):1441-52.

44. Dall MT, Nicaud JM, Gaillardin C. 1994. Multiple-copy integration in the yeast Yarrowia lipolytica. Curr Genet 26(l):38-44.1.e SJ, Song H, Lee SY. 2006. Genome-based metabolic engineering of

45. Madzak C, Gaillardin G, Beckerich JM. 2004. Heterologous protein: expression-andsecretionin the non-conveiitionalyeast Yarrowialipolytica.J Biotechnol 109(l-2):63-81.

46. Madzak C, Treton B, Blanchin-Roland S. 2000: Strong hybrid promoters:andintegrative expression/secretionwectors for quasirconstitutive expression of heterologous proteins in the yeast Yarrowia lipolytica. J Mol Microbiol Biotechnol 2(2):207-16. •

47. Makri A, Fakas Si Aggelis G. 2010. Metabolic activities of biotechnological:interest m-Yarrowia lipolytica grown on glycerol inirepeated batch cultures. Bioresour Technol 101 (7):2351 -8.

48. Matsuoka MjUeda Y, Aiba S. 1980. Role and control of isocitrate lyase in Candida lipolytica. J Bacteriol 144(2):692-7.

49. McKinlay JB, Vieille C, Zeikus JG. 2007- Prospects for a bio-based succinate industry. Appl Microbiol Biotechnol 76(4):727-40. ,

50. Meynial-Salles I, Dorotyn S, Soucaille P. 2008. A new process for the continuous production of succinic acid from glucose at high yield, titer, and productivity. Biotechnol Bioeng 99(1): 129-35.

51. Muratsubaki H. 1987. Regulation of reductive production of succinate under anaerobic conditions in baker's yeast. J Biochem 102(4):705-14.

52. Nelson DL, Cox MM. 2004. Lehninger: Principles of Biochemistry: W. H. Freeman and Company.

53. Nicaud JM, Fabre E, Gaillardin C. 1989. Expression of invertase activity in ,

54. Yarrowia lipolytica and its use as a selective marker. Curr Genet 16(4):253-60.

55. Nicaud JM, Madzak C, van den Broek P, Gysler C, Duboc P; Niederberger P, Gaillardin C. 2002. Protein expression and secretion in the yeast Yarrowia lipolytica. FEMS Yeast Res 2(3):371-9.

56. Okino S, Noburyu R, Suda M, Jojima T, Inui M, Yukawa H. 2008. An efficient succinic acid production ^process in a metabolically engineered Corynebacterium glutamicum strain. Appl Microbiol Biotechnol 81(3):459-64.

57. Papanikolaou S, Galiotou-Panayotou M, Chevalot I, Komaitis M, Marc I, Aggelis G. 2006. Influence of glucose and saturated free-fatty acid mixtures on citric acid and lipid production by Yarrowia lipolytica. Curr Microbiol 52(2): 13442.

58. Papanikolaou S, Muniglia L, Chevalot I, Aggelis G, Marc I. 2002. Yarrowia lipolytica as a potential producer of citric acid from raw glycerol. J Appl Microbiol 92(4):737-44.

59. Pigiiede G, Wang H, Fudalej F,.Gaillardin G, Seman M, Nicaud JM: 2000.

60. Characterization of an extracellular lipase encoded by L1P2 in Yarrowia lipolytica. J Bacteriol 182(10):2802-10.

61. Pines O, Even-Rain S, Elnathan N, Battat E, Aharonov O, Gibson D, Goldberg 1. . 1996. 1'he cytosolic pathway of E-malic acid synthesis in Saccharomyces cerevisiae: the roleofliimarase. ApplMicrobiol Biotechnol 46(4):393-9.

62. Piot P. 2010. Manufacturing new platform chemicals. European biotechnology science'and; industry news (ISSN .1618-8276) issue 5-6; 9:38-39^

63. Piper PW. 1999: Yeast,superoxide dismutasemutants reveal,a pro-oxidant'action-ofweak organicacidlfood: preservatives. Free Radic BiolMed27(lT- • ' 12): 1219-27. . ' .'• . ■ '" •

64. Rane KD, Sims KA. 1994. Oxygen uptake and citric acid production by Candida lipolytica Y 1095. Biotechnol Bioeng 43(2): 131 -7.

65. Rane KD, Sims KA. 1995. Citric acid production by Candida lipolytica Y 1095 in cell recycle and fed-batch fermentors. Biotechnol Bioeng 46(4):325-32.

66. Saliola M, Bärtoccioni PC, De-Maria I, EodilT, Falcone C. 2004.The deletion of. the succinate dehydrogenasegenei^/SD/fiin Kluyveromyces lactis does not lead to respiratory deficiency. Eukaryot Cell 3(3):589-97.

67. Sambrook Jj Maniatis T, Fritsch EF. . 1989: Molecularcloning: a laboratory manual. ;N.:Y.: Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor.

68. Sato M, T. Nakahara, and K. Yamada. 1972. Fermentative production of succinic acid from n-paraffin by Candida.brumptii IFO 0731. Agric Biol Chem 36:1969-1974. .

69. Sauer M, Porro D; Mattanovich D, Branduardi P. 2008. Microbial production of organic acids: expanding the markets. Trends Biotechnol 26(2): 100-8.

70. Scholten E, Renz T, Thomas J. 2009. Continuous cultivation approach for fermentative succinic acid production from, crude glycerol by Basfia succiniciproducens DDI. Biotechnol Lett 31(12):1947-51.

71. Schuller C, Mamnun YM, Mollapour M, Krapf G, Schuster M, Bauer BE, Piper PW, Kuchler K. 2004. Global phenotypic analysis and transcriptional profiling defines the weak acid stress response regulon in Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell 15(2):706-20.

72. Serrano R. 1988. H+-ATPase from plasma membranes of Saccharomycescerevisiae and A vena sativa roots: purification and reconstitution. Methods Enzymol 157:533-44.

73. Sineoky SP; Yuzbashev TV, Yuzbasheva EY, Sobolevskaya TI, Laptev IA,

74. Vybornaya TV; 2009. A method for production succinic acid using a yeast belonging to the genus Yarrowia. Patent Application WO 2010/087503 Al.1. Priority date 30.01.2009.

75. Smith EH, Janknecht R, Maher LJ, 3rd. 2007. Succinate inhibition of alphaketoglutarate-dependent enzymes in a yeast model of paraganglioma. Hum Mol Genet 16(24):3136-48.

76. Song H, Sang YL. 2006. Production of succinic acid by bacterial fermentation. Enzyme Microb Technol 39(3):352-61.

77. Szeto SS, Reinke SN, Sykes BD, Lemire BD. 2007. Ubiquinone-binding site mutations in the Saccharomyces cerevisiae succinate dehydrogenase generate superoxide and lead to the accumulation of succinate. J Biol Chem 282(37):27518-26.

78. Vemuri GN, Eiteman MA, Altman E. 2002a. Effects of growth mode and pyruvate carboxylase on succinic acid production by metabolically engineered strains of Escherichia coli. AppL Environ Microbiol 68(4): 1715

79. Vemuri GN, Eiteman MA, Altman E. 2002b. Succinate production in dual-phase Escherichia coli fermentations depends on the time of transition from aerobic to anaerobic conditions. J Ind Microbiol Biotechnol 28(6):325-32.

80. Vernis L, Abbas A, Chasles M, Gaillardin CM, Brun C, Huberman JA, Fournier P. 1997. An origin of replication and a centromere are both needed to establish a replicative plasmid in the yeast Yarrowia lipolytica. Mol Cell Biol 17(4): 1995-2004.

81. Yuzbashev TV, Yuzbasheva EY, Laptev IA, Sobolevskaya TI, Vybornaya TV, Larina AS, Gvilava IT, Antonova SV, Sineoky SP. 2011. Is it possible to produce succinic acid at a low pH? Bioeng Bugs 2(2):(in press).

82. Zeikus JG, Jain MK, Elankovan P. 1999. Biotechnology of succinic acidproduction and markets for derived industrial products. Appl Microbiol Biotechnol 51:545-552.27.