Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биосинтез внеклеточного гетерогликана штаммом 228 CRYPTOCOCCUS LUTEOLUS (SAITO) SKINNER 1922

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Биосинтез внеклеточного гетерогликана штаммом 228 CRYPTOCOCCUS LUTEOLUS (SAITO) SKINNER 1922"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИИ САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ ХИМИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ АКАДЕМИЯ

Беспалов Андрей Александрович БИОСИНТЕЗ ВНЕКЛЕТОЧНОГО ГЕТЕРОГЛИКАНА ШТАММОМ 228 CRYPTOCOCCUS LUTEOLUS (SAITO) SKINNER 1922.

03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1997 год

РГ6 од

- Ь ДЬН 1997

На правах рукописи

Работа выполнена на кафедре микробиологии Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии. Научный руководитель: доктор биологических наук Н.П.Блинов. Официальные оппоненты:

1. Доктор биологических наук Е.П. Яковлева.

2. Доктор технических наук И.И. Шамолина.

Ведущая организация: Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет).

Защита состоится ... 1997 г. В 7?3. часов на заседа-

нии специализированного Совета К-084.63.01 Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии (197376, Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова, 14).

С диссертацией можно ознакомиться: в научной библиотеке СПХФА

Автореферат разослан 1997 г.

Ученный секретарь специализированного совета: кандидат биологических наук

Н.В. Кириллова

Общая характеристика работы.

Данная работа является продолжением исследований, проводимых на кафедре микробиологии Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии по изучению биосинтеза, химического строения и биологической активности дрожжевых внеклеточных полисахаридов.

Актуальность проблемы. Микробные полисахариды привлекают к себе большое внимание исследователей различного профиля, что обусловлено их уникальным строением, физико-химическими и биологическими свойствами. Поэтому они интересны для применения в качестве вспомогательных веществ в фармацевтической, косметической, пищевой, нефтедобывающей промышленности. В медицинскую практику внедрены или внедряются лечебные и диагностические препараты на основе микробных полисахаридов. В ряду экзо-полисахаридов определенный интерес представляют гетерогликаны, образуемые сапрофитными криптококками - базидиомицетовыми дрожжами. Водные растворы гетерогликанов обладают сравнительно высокой вязкостью, что определяет перспективность их применения в качестве загустителей кремов, мазей, стабилизаторов эмульсий и суспензий. Кроме того, они не токсичны, проявляют иммуномодулирующие, антивирусные и детоксицирующие свойства. Наличие карбоксильных групп открывает широкие возможности для использования их в качестве ковапентно связанных носителей для низкомолекулярных лекарственных веществ, а так же для химической модификации этих полимеров.

Однако, несмотря на то, что полисахариды находятся в большем или меньшем количестве в клетках всех представителей микробного мира, или выделяются отдельными видами в окружающую среду, лишь немногие из них детально изучены к настоящему времени и внедрены в промышленность. Это относится и к полисахаридам дрожжей рода СгурЮсоссиБ.

Цель данной работы заключалась в изучении влияния различных источников углерода на рост Сгур1ососсиз 1и1ео1иБ штамм 228 и биосинтез полисахарида, на качественные и количественные характеристики лютелана (химический состав, молекулярно-массовое распределение и некоторые физико-химические свойства).

Задачи исследования: 1. Изучить влияние на биосинтез лютелана различных источников углерода. 2. Оптимизировать питательную среду с целью повышения эффективности процесса биосинтеза лютелана. 3. Изучить измене-

ние основных биохимических параметров ферментации при выращивании Сг.ЫеоЬэ на оптимизированных питательных средах. 4. Определить некоторые физико-химические характеристики (степень полидисперсности, моноса-харидный состав, реологические свойства) лютслана, образуемого Сг.1и1ео1из штамм 228 на оптимизированных питательных средах.

Научная новнзна н практическая значимость:

- показано, что авторегулятором развития клеток продуцента является размер полисахаридной капсулы;

-установлено, что добавление в питательную среду с глюкозой мальтозы, маннитола, сорбитола, дульцитола стимулирует в основном рост Сг.11Пео1из, а добавление солей органических кислот (натрия ацетата, натрия цитрата, натрия оксалата, калия тартрата и калия сукцината) существенно стимулирует процесс полисахаридообразования;

-для штамма 228 Сг.1и1ео1аз впервые показана возможность синтеза полисахарида из неуглеводных компонентов питательной среды - солей органических кислот;

- проведена оптимизация соотношения глюкозы и других углеродных добавок в питательных средах;

- доказано, что углеродные добавки не влияют на качественный состав моносахаридных звеньев в молекуле лютелана и их процентное соотношение;

- при использовании в качестве единственного источника углерода солей органических кислот снижается количество глюкуроновой кислоты в молекуле полисахарида и наблюдается преимущественное образование низкомолекулярного лютелана;

- показано, что полисахарид, образуемый Сг.1и1ео1из на оптимизированных средах, при добавлении мальтозы, маннитола, сорбитола, дульцитола и солей органических кислот по реологическим свойствам не отличается от лютелана, синтезируемого на контрольной среде Голубева, а при использовании солей органических кислот в качестве единственного источника углерода на 40-50% по сравнению с контролем снижается вязкость водных растворов эк-зогликана;

- определены коэффициенты уравнений, с помощью которых описаны размножение СгЛШео!^ и биосинтез лютелана на оптимизированных пита-

тельных средах;

- установлено, что присутствие в питательной среде производных глюкозы (натриевой соли [З-О-тио-глюкозы, 2-ацетил-амино-2-дезокси-Э-глюкозы, Э-глюкозамина гидрохлорида и 2-амино-2-дезокси-0-глюкозы) подавляет рост продуцента и биосинтез лютелана, что может являться следствием нарушения процессов синтеза компонентов клеточной стенки;

- показано, что добавление в среду Голубева, содержащую 1% глюкозы такого же количества 2-амино-2-дезокси-0-глюкозы блокирует синтез экзопо-лисахарида, но не влияет на рост и размножение клеток Сг.1и1ео1из, что служит веским доказательством правомочности отнесения лютелана к вторичным метаболитам и может являться одним из методов получения бескапсульных клеток;

- при использовании в качестве углеродных добавок солей органических кислот существенно возрастает биосинтетическая активность продуцента и снижается стоимость полисахарида по сравнению со стоимостью лютелана, получаемого при выращивании культуры на контрольной среде Голубева.

Публикации: материалы диссертации отражены в 5 публикациях и доложены на Международном конгрессе "Молодежь и наука - третье тысячелетие", Москва, 29 января - 4 февраля 1996 г.

Объем и структура работы: диссертация изложена на 174 страницах машинописного текста. Содержит 26 таблиц и 52 рисунка. Список литературы - 283 наименования.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Объекты и методы исследования. В работе использовали штамм №0 №0411 СгурЮсоссиБ 11йео1из (Бако) Бктпег 1922, имеющий порядковый номер 228 в коллекции микроорганизмов кафедры микробиологии Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии и далее в работе упоминаемый как штамм №228. По морфолого-физиологическим признакам культура соответствует описанию, данному в работе Голубева (1980). Тест-культуру хранили в пробирках с сусло-агаром при температуре +4 СС. (Семенов, 1990). Пересев культур из пробирок длительного хранения проводили 1 раз в 6 месяцев.

Для получения посевного материала использовали культуру в пробирках на скошенном сусло-агаре, однократно пересеянную из пробирок длительного

хранения и инкубированную в течение двух суток при +24-25°С в термостате. Посевной материал выращивали на модифицированной среде Голубева следующего состава (г/л дистиллированной воды): глюкоза - 50, (NHt^SO,» - 2,0, КН2Р04-2Н20 - 3,56, Na2HP04-2H20 - 7,22, MgS04-7H20 - 0,5, NaCl - 0,5, CaClr2H20 - 0,001, MnCl2-4H20 - 0,0015, FeS04-7H20 - 0,01, дрожжевой экстракт - 0,4. Стерилизацию среды проводили при 147,1 кПа в течение 30 минут. рН среды после стерилизации - 6,9-7,1.

Посевной материал выращивали в 50-200 мл питательной среды (в зависимости от требуемого количества посевного материала) в колбах Эрленмейе-ра объемом 750 мл, на качалках (220 об/мин) при температуре +24-25°С в течение 48 часов. Для засева посевной колбы использовали взвесь культуры в стерильной дистиллированной воде (5 мл) из одной пробирки.

Ферментацию проводили в аналогичных условиях в течение 120 часов. Посевной материал вносили в количестве 10 % от объема питательной среды в засеваемой колбе.

Все опыты повторяли не менее трех раз. Пробы ферментационной массы для определения биохимических показателей процесса ферментации отбирали в стерильных условиях каждые 12 часов.

Значения рН и еН культуральной жидкости определяли потенциометри-чески. Количество биомассы клеток продуцента (г/л сухих клеток) устанавливали по оптической плотности разведенной в 100 раз культуральной жидкости на спектрофотометре СФ-26 при длине волны 560 нм с помощью калибровочного графика, а также весовым методом.

Содержание "нативного" (с клетками продуцента) полисахарида (НПС) определяли гравиметрическим методом: определенный объем культуральной жидкости осаждали 96% этанолом, осадок отделяли фильтрацией под вакуумом, сушили при 40-60 °С в течение 48 часов и взвешивали.

Редуцирующие вещества определяли по реакции с ортотолуидиновым реактивом (Билай, 1982). Концентрацию ионов NH4+ - реактивом Несслера (Хансон, Филлипс, 1984).

Выделение лютелана проводили из культуральной жидкости, предварительно разведенной дистиллированной водой в 1,5-2 раза, в зависимости от вязкости ферментационной массы. Клетки продуцента осаждали на центрифуге при 15000 об/мин в течение 20 минут. Контроль за отсутствием клеток в су-

пернатанте осуществляли микроскопически. Супернатант упаривали в 4-5 раз на вакуумном роторном выпарном аппарате (вакуум 0,8-0,9 ат, температура кипения 40-50°С). Лютелан осаждали 2-2,5 объемами 96% этилового спирта при температуре 18-20 °С. Образовавшийся осадок отделяли декантацией и/или на центрифуге при 6000 об/мин в течение 10 минут. Осадок обезвоживали этанолом или ацетоном, растирали в фарфоровой ступке и сушили при 4060 °С до постоянного веса.

Очистку внеклеточных полисахаридов от низкомолекулярных примесей осуществляли с помощью диализа против проточной воды в течение суток, а затем против дистиллированной воды в течение двух суток.

Полный кислотный гидролиз полисахарида проводили 2Н серной кислотой. Для этого 10 мг полисахарида и 0,5 мл 2Н НгБОд помещали в запаянную ампулу (объем ампулы 1 мл) и выдерживали 4 часа при 100 °С на водяной бане. Гидролизат разбавляли 0,5 мл дистиллированной воды и нейтрализовали карбонатом бария до нейтральных значений рН (по индикаторной бумаге). Осадок сульфата бария отделяли при 6000 об/мин в течение 15 минут на центрифуге. Полученные смеси моносахаридов использовали для качественного определения индивидуальных углеводов.

Качественный анализ смеси моносахаридов проводили восходящей тонкослойной хроматографией на пластиках 5ПирЬо1 50x120 мм (Ахрем, Кузнецова, 1965). Пятна моносахаров проявляли кислым фталатом анилина (Захарова, Косенко, 1982).

Количественный состав смеси определяли методом восходящей бумажной хроматографии на бумаге РЫ-11 в системе растворителей н-бутанол-уксусная кислота-вода=9:1:4. Использовали трехкратное пропускание системы растворителей.

Содержание белка в гликане определяли по методу Варбурга и Кристиана по оптической плотности при 260 и 280 нм (Хансон, Филлипс, 1984).

Зольность препарата определяли по разнице веса после сжигания навески полисахарида в фарфоровом тигле при температуре 500 °С в течение 6 часов.

Оптическое вращение 0,1% водных растворов полисахаридных образцов измеряли на автоматическом поляриметре "Регкт-Е1тег" 241 с натриевой лампой в стеклянной кювете длиной 100 мм, объемом 50 мл.

Молекулярно-массовое распределение образцов полисахаридов оценивали по результатам гель-хроматографии на колонке 0,8x20 см, наполненной сефарозой 4Б (Захарова, Косенко, 1982).

Рост биомассы клеток СгЛшеоШэ описывали с помощью уравнения

Ферлхурста, атакже Перла и Рида (Бейли, Оллис, 1989): — = КХ(1-ЪХ),

где к - максимальная скорость роста в данных условиях, р - предельная емкость среды, соответствующая предельной плотности популяции клеток при исчерпании всех ресурсов среды.

Параметры образования полисахарида описывали с помощью уравнения

Льюдикина-Пайрета (Бейли, Оллис, 1989): — = а — + ВХ ,

с11 си

где а - вклад, вносимый в образование продукта клетками, находящимися в экспоненциальной фазе размножения, а Р - клетками, находящимися в стационарной фазе размножения.

Кинематическую вязкость водных растворов лютелана измеряли на вискозиметре Оствальда с диаметром капилляра 0,73 мм. Образцы для измерения вязкости растворяли в дистиллированной воде в течение 24 часов.

Результаты и их обсуждение.

Влнянне состава среды и условий культивирования на биосинтез лютелана. Изучение влияния различных источников углерода на рост, размножение СгЛЩеоЬэ и биосинтез полисахарида (таблица 1) показало, что синтез лютелана происходит при использовании всех испытанных нами источников углеродного питания. Следует отметить некоторую стимуляцию роста и синтеза лютелана хорошо ассимилируемыми культурой дисахаридами - мальтозой и сахарозой, однако, биосинтетическая активность продуцента в обоих случаях была ниже, чем при выращивании Сг.1щео1из на контрольной среде Голубева с глюкозой.

При использовании в качестве единственного источника углерода моносахаридов (маннозы, галактозы, ксилозы) выход лютелана и биосинтетическая активность клеток продуцента во всех случаях ниже, чем в контроле (среда Голубева с глюкозой). Более сложная картина имела место при выращивании СгЛщеоЫ на сахароспиртах в качестве единственных источников углерода: от подавления биосинтеза лютелана сорбитолом и дульцитолом, до существенной стимуляции роста и синтеза полисахарида на средах с маннитолом. При росте

Таблица 1.

Влияние источников углерода на рост и биосинтез полисахарида Сг.Ыео!!«.

Тип источника углерода Биомасса, г/л Нативный полисахарид, г/л Биосинтетическая активность, %*

глюкоза (контроль) 16,27+0,64 19,37+0,12 119,1613,93

галактоза 15,40±0,43 16,60±0,31 107,7911,75

дульцитол 14,60±0,91 16,70±0,26 114,3810,98

ксилоза 13,80±0,87 15,31+0,56 110,9410,78

мальтоза 20,27±0,58 22,0310,59 108,6810,57

маннитол 24,00±0,32 26,4010,26 110,0010,71

манноза 15,61+0,92 17,7410,76 113,7110,32

молочная сыворотка 13,00+0,43 14,0510,12 108,0810,78

рамноза 12,61 ±0,31 14,0210,33 111,1810,77

сахароза 18,90±0,54 21,5010,67 113,80+1,05

сорбитол 14,67+1,15 16,3710,35 111,5910,56

натрия ацетат 4,55±0,22 16,6211,12 363,52120,31

натрия цитрат 2,11±0,15 8,7310,21 413,74156,55

натрия оксалат 3,10±0,30 9,2010,36 296,77162,95

калия тартрат 3,23±0,25 15,1011,01 467,49112,36

калия сукцинат 3,40±0,20 14,4310,40 424,41130,67

*- отношение массы нативного полисахарида к биомассе клеток, выраженное в процентах, характеризует продуктивность культуры.

Сг.1(Лео1из на средах с солями органических кислот (натрия ацетатом, натрия цитратом, натрия оксалатом, калия тартратом и калия сукцинатом) происходит существенное подавление роста клеток дрожжей (13-28% от контроля в зависимости от соли). Однако, при использовании всех указанных солей органических кислот в качестве единственного источника углерода биосинтетическая активность продуцента повышается в 3-4 раза по сравнению с контрольной средой Голубева на глюкозе. Оптимальными в исследованном диапазоне (5100 г/л) были следующие концентрации солей органических кислот при их ис-

пользовании в качестве единственного источника углерода: натрия ацетат - 50 г/л; натрия цитрат - 50 г/л; натрия оксалат - 45 г/л; калия тартрат - 35 г/л; калия сукцинат - 50г/л. При этих концентрациях в 2-4 раза увеличивается количество образуемого экзополисахарида, но уменьшается молекулярная масса лютелана и, как следствие, на 40-50% снижается вязкость его водных растворов. Однако, низкая концентрация биомассы в питательных средах с солями органических кислот существенно снижает затраты на выделение и очистку полисахарида, а его низкая молекулярная масса, возможно, позволит использовать такой люте-лан в качестве плазмозаменителя, энтеросорбента и носителя лекарственных веществ.

Стимулирующий эффект солей органических кислот на процесс полиса-харидообразования может быть объяснен тем, что потребление культурой анионов органических кислот способствует созданию оптимального изменения значения рН в ходе ферментации, которое в противном случае имеет тенденцию к снижению за счет потребления ионов аммония. Так, на контрольной среде Голубева рН культуральной жидкости к концу ферментации снижался с 7,1 до 5,5 (рисунок 1), а при добавлении солей органических кислот оставался стабильным в течении всей ферментации или даже повышался до 8,2 при добавлении натрия ацетата (рисунок 2). Подобный факт отмечен при выращивании продуцента ксантана на средах с добавкой органических кислот - цитрата, пирувата и т.д. (8ои\у, 1980).

Кроме того, возможно непосредственное включение солей органических кислот в энергетический обмен в цикле трикарбоновых кислот.

Оптимизация соотношения глюкозы и углеродных добавок. С целью изучения влияния совместного присутствия глюкозы и углеродных добавок на рост Сг.1иСео!из и биосинтез полисахарида была проведена серия предварительных экспериментов, в результате чего установлена стимуляция процессов биосинтеза лютелана при добавлении в среду Голубева мальтозы, дульцитола, сорбитола, маннитола и солей органических кислот (натрия ацетата, натрия цитрата, натрия оксалата, калия тартрата и калия сукцината). В связи с этим была предпринята попытка оптимизировать соотношение глюкозы и углеродных добавок с целью интенсификации процессов полисахаридообразования.

Для этого соотношение глюкозы и отобранных источников углерода варьировали с интервалом в 10 г/л до их общего количества 50 г/л. Кроме того, в питательной среде оставляли 50 г/л глюкозы и вносили углеводные добавки

Биомасса, г/л РВ, г/л 40 ^

НПС, г/л \ 35 -

30 25 20 15 10 5 0

Г т

Х | Г-!""*.....

- 7

еН, мВ*10-2

;рн

Аммонийный азот, мкг/мл

.. -1.........16

---- A j.

^ Условные обозначения:

. —о—Биомасса 4

—»— РВ

3 —X—НПС

—л—Аммонийный азот 2 ••-ж---рН , —•—еН

О Время ферментации,ч

О 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120

Рисунок 1. Изменение биохимических параметров ферментации при выращивании Сг.1и(ео1и5 на контрольной среде Голубева с 50 г/л глюкозы.

НПС, г/л 30 Биомасса, г/л РВ, г/л

Т 12 еН, мВ*10-2 •х

i рН

Аммонийный азот, мкг/мл

6 Условные обозначения: —□— Биомасса —»— РВ 4 —х—НПС

—л— Аммонийный азот 2 - -ж- -рН —•—еН

---- 0

0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 Время ферментации, ч

Рисунок 2. Изменение биохимических параметров ферментации при выращивании Сг.11Иео1из на среде Голубева с 30 г/л натрия ацетата (глюкоза - 20 г/л).

50\0 40\10 30\20 20\30 10\40 0\50 50/10 50/20 50/30 50/40 50/50 Соотношение

Условные обозначения: глюкоза/маннитол, г/л

■ Биомасса, г/л 0 Нативный полисахарид, г/л О Биосинтетическая активность

Рисунок 3. Влияние соотношения глюкозы и маннитола на биосинтез лю-телана.

до 100 г/л общего количества источников углерода с интервалом 10 г/л. В качестве контрольной во всех опытах использовали среду Голубева с 50 г/л глюкозы (соотношение 50/0). Данные по оптимизации соотношения глюкозы и маннитола представлены на рисунке 3. При оптимизации соотношений глюкозы с сорбитолом, дульцитолом и мальтозой общая тенденция изменения количества биомассы, нативного полисахарида (НПС) и биосинтетической активности (БА) продуцента была сходна с таковой для глюкозы и маннитола.

На основании полученных результатов можно сделать вывод о том, что использованные в опытах углеводные добавки (мальтоза, маннитол, сорбитол и дульцитол) в большей степени, по сравнению с полисахаридообразованием, стимулируют рост продуцента. Оптимальным для увеличения биосинтетической активности культуры продуцента является, по нашим данным, соотношение глюкозы и исследуемых углеводов 40:10 г/л.

При этом соотношении к концу ферментации наблюдается увеличение количества биомассы на 10-20% и нативного полисахарида - на 5-25% по сравнению с контрольной средой Голубева в зависимости от типа добавки. Это соотношение обеспечивает максимальную биосинтетическую активность продуцента по сравнению с другими, исследованными нами соотношениями глюкозы и углеводных добавок и кроме основной ферментации может быть также рекомендовано для подращивания посевного материала.

Оптимизация соотношений глюкозы н солей органических кислот. При использовании солей органических кислот в качестве единственных ис-

точников углерода или добавок к среде Голубева с глюкозой происходило су-* щественное повышение биосинтетической активности Сг.1Шео1и5 на фоне выраженного подавления роста продуцента. Оптимизация соотношения глюкозы и солей органических кислот (натрия ацетата, натрия цитрата, натрия оксалата, калия тартрата и калия сукцината) заключалась в поиске такого их соотношения, при котором достигалась бы максимальная биосинтетическая активность продуцента. Эти соотношения для глюкозы и солей органических кислот следующие: 20/30 г/л для всех исследованных солей за исключением натрия оксалата, для которого оптимальным является соотношение 30/20 г/л. Основные тенденции изменения количества биомассы, нативного полисахарида и биосинтетической активности клеток Сг.ЫеоЬэ при варьировании соотношений глюкозы и солей органических кислот были сходными с представленными на рисунке 4. При указанных соотношениях значительно возрастало количество синтезированного полисахарида и заметно снижался выход биомассы клеток Сг.1шео1из по сравнению с контрольной средой Голубева и средами без добавления солей органических кислот, обеспечивавшими условия, оптимальные для роста и размножения продуцента. Это, очевидно, согласуется с гипотезой Акименко и Трутко (1991), предполагающих, что в условиях снижения скорости роста синтез метаболитов протекает более интенсивно.

Следует также отметить тот факт, что при добавлении к питательной среде солей органических кислот в период выхода культуры продуцента на стационарную фазу размножения (56 часов ферментации) выход нативного полисахарида увеличивается в 1,2 раза, а для натрия цитрата и калия янтарно-кислого эта цифра составляет 1,5, 1,6 раза соответственно. При этом наблюдается увеличение биосинтетической активности в 1,2 - 1,3 раза по сравнению с контрольной средой Голубева.

В случаях использования глюкозы и углеродных добавок в соотношениях, когда их суммарное количество превышает 50 г/л экономически нецелесообразно из-за того, что к концу ферментации в культуральной жидкости остается неиспользованным значительное (30-40%) количество источника углерода.

При оптимальных соотношениях глюкозы и углеродных добавок были построены кривые роста биомассы, биосинтеза полисахарида, изменения рН и еН в ходе ферментации, кривые потребления редуцирующих веществ (РВ) и аммонийного азота.

Биомасса, г/л 35 НПС, г/л 30 25 20 15 10 5 0

5,0 4,0 3,0 -2,0 - 1,0 0,0

Биосингетическая активность

50/0 40/10 30/20 20/30 10\40 0/50 50/10 50/20 50/30 50/40 50/50 Соотношение

Условные обозначения: глюкоза/натрия ацетат, г/л

1 Биомасса, г/л □ НативньвЧ полисахарид, г/л □ Биосингетическая активность

Рисунок 4. Влияние соотношения глюкозы и натрия ацетата на рост Сг.Ыео1и$ и бносинтез полисахарида.

При этом изменение основных биохимических параметров ферментации было достаточно типичным для сред с добавлением мальтозы, маннитола, дульцитола, сорбитола и контрольной среды Голубева (рисунок 1). При добавлении солей органических кислот - натрия цитрата, натрия оксалата, калия тартрата и калия сукцината кривые изменения биохимических параметров ферментации были сходными для указанных солей и питательной среды с добавлением натрия ацетата (рисунок 2).

Влияние производных глюкозы на рост Сг.11Йео1и5 и бносинтез лю-телана. При изучении влияния солей органических кислот на рост и размножение Сг.1Щео1из нами было отмечено, что стимуляция биосинтетических процессов в клетках продуцента происходит на фоне значительного подавления их размножения. Поэтому мы попытались выяснить, будет ли наблюдаться сверхсинтез лютелана и в условиях направленного подавления размножения клеток продуцента, например, с помощью антиметаболитов. Особенностью антиметаболитов является то, что их подавляющее действие уменьшается при добавлении одного или нескольких метаболитов. Обычно структура антиметаболитов сходна со структурой соответствующих метаболитов.

При использовании производных глюкозы (натриевой соли (З-Э-тиоглюкозы, 2-ацетиламино-2-дезокси-0-глюкозы, гидрохлорида О-глюкозамина, 2-амино-2-дезокси-0-глюкозы) в качестве единственных источников углерода происходит полное подавление роста дрожжей и синтеза поли-

сахарида не происходит. Вероятно, они подавляют образование незаменимых метаболитов, например, полисахаридов клеточной стенки, что в конечном итоге приводит к гибели клеток.

В нашей работе мы наблюдали почти полное разрушение клеточных стенок на средах с производными глюкозы в качестве единственных источников углерода.

Следует также отметить тот факт, что добавление в среду Голубева, содержащую 1% глюкозы, такого же количества 2-амино-2-дезокси-0-глюкозы блокирует синтез экзополисахарида, но не влияет на рост и размножение клеток СгЛшеоЬи, что служит веским доказательством правомочности отнесения лютелана к вторичным метаболитам и может являться одним из методов получения бескапсульных клеток.

Присутствие в питательной среде глюкозы существенно снижает инги-бирующее влияние ее производных на рост клеток Сг.1шео1из и биосинтез ими полисахарида, причем тем больше, чем выше эта концентрация. Однако, инги-бирующее влияние натриевой соли Р-О-тио-глюкозы не удается снять даже при повышении концентрации глюкозы до 100 г/л. Возможно, что подавление роста и синтеза полисахарида может быть также связано с использованием натриевой соли Р-О-тио-глюкозы в качестве источника серы, но ее ингибирую-щий эффект не удается снять и в присутствии серосодержащих аминокислот в сравнимых концентрациях и концентрациях в 2-3 раза выше, чем Р-О-тио-глюкозы.

Таким образом, можно предположить, что производные глюкозы конкурентно (за исключением р-О-тиоглюкозы) ингибируют ферменты основных метаболических путей утилизации глюкозы, в том числе и пути биосинтеза полисахарида. Добавление в питательную среду Р-О-тиоглюкозы, вероятно, необратимо блокирует ферменты, необходимые для нормальной жизнедеятельности клеток Сг.ЫеоШз, что приводит к полному прекращению роста, размножения клеток и биосинтеза метаболитов.

Биосинтетическая активность клеток Сг.1и!ео1и5 в стационарной фазе размноження. В настоящее время еще неизвестно, связан ли синтез полисахарида непосредственно с ростом и размножением клеток продуцента. Если связан, то основной путь увеличения продуктивности клеток - достижение высокой удельной скорости размножения. Если же синтез экзогликана не связан

со скоростью роста продуцента, то снижение скорости биосинтеза в стационарной фазе размножения может быть обусловлено следующими факторами: исчерпанием питательных веществ; выделением в среду репрессоров синтеза полисахарида; нарушением поглощения и экскреции веществ вследствие изменения проницаемости клеточных мембран или за счет образования мощной полисахаридной капсулы.

Мы попытались изучить способность клеток СгЛтеоЫэ, находящихся в стационарной фазе размножения, синтезировать полисахарид при переносе их в среды, в которых, по предварительным данным, не происходило интенсивного размножения культуры (среды с глюкозой и М§804, глюкозой и КН2Р04, глюкозой и (ТЧН^гБ04). В качестве контроля использовали среду Голубева с 50 г/л глюкозы.

При переносе клеток Сг.1Щео1из в среду с глюкозой и М§804, глюкозой и КНгР04, глюкозой и (N111)2804 значение рН культуральной жидкости снижалось до 3,5 - 4,0 на вторые сутки роста, был отмечен незначительный прирост биомассы клеток и полисахарида, причем полученные результаты были практически идентичными для всех четырех сред. Вероятно, при высоких концентрациях глюкозы и отсутствии фосфатного буфера в среде не происходит нейтрализации органических кислот, образующихся при окислении источников углерода, и они в значительном количестве выделяются в ферментационную среду.

В случае переноса клеток продуцента в контрольную среду Голубева количество биомассы клеток увеличивается в 1,5 раза на вторые сутки ферментации. Значение рН культуральной жидкости снижается до 6,2 - 6,0, в среде накапливается полисахарид, причем его количество пропорционально приросту клеточной массы (по весу клеток).

Поскольку при выращивании Сг.ШеоЬз на среде Голубева с 50 г/л глюкозы происходит торможение роста численности популяции уже к 48 часам, но среда остается пригодной для роста и размножения клеток, можно предположить, что авторегулятором развития является полисахарид, а именно - полиса-харидная капсула. При больших размерах полисахаридной капсулы происходит ограничение доступа экзогенных питательных веществ в клетку и она останавливается в своем развитии в в гфазе, а жизнеспособность клеток поддерживается за счет внутренних энергетических ресурсов. Поступление экзогенных источников питания при удалении полисахаридной капсулы индуцирует

переход клетки из G| в S-фазу (фазу, в которой происходит синтез ДНК). Действительно, после 4-кратной промывки физиологическим раствором NaCl, центрифугирования при 18000 об/мин и возвращения в прежнюю питательную среду 72-часовых клеток происходило их дальнейшее размножение, рост и синтез полисахарида. В результате такой отмывки, по данным микроскопии, размер полисахаридной капсулы уменьшался в среднем в 2 раза.

Таким образом, можно предположить, что авторегулятором развития клеток Cr.luteolus является размер полисахаридной капсулы: даже частичное ее удаление индуцировало дальнейшее размножение клеток и синтез полисахарида, что, на наш взгляд, согласуется и с данными, полученными при добавлении лютелана в питательную среду. Так, при изучении влияния возраста посевного материала на биосинтез лютелана (Григорьянц, 1995) было отмечено увеличение его выхода (примерно в 2 раза) при использовании 48-часового посевного материала по сравнению с 16-40-часовым. Возможной причиной этого мог быть полисахарид, вносимый в питательную среду вместе с посевным материалом и оказывающий стимулирующий эффект на процессы роста и биосинтеза, как это происходит, например, при синтезе декстрана. Однако, добавление экзогликана в питательную среду существенно не сказывалось на росте Cr.luteolus - количество биомассы остается близким к контролю , в то время как количество синтезированного полисахарида снижается. Возможно, что присутствие лютелана в питательной среде способствует включению механизма ингибирования по принципу обратной связи (feedback-ингибирование), когда тормозится активность фермента в начале биосинтетического пути конечным продуктом, в данном случае - полисахаридом. Поэтому, отмывание клеток от полисахарида (удаление продукта из зоны реакции) может способствовать стимуляции биосинтетических процессов, в то время как добавление лютелана приводит к снижению скорости его синтеза. Очевидно, именно по этой причине разбавление культуральной жидкости водопроводной водой в процессе ферментации стимулирует образование экзогликана Aureobasidium pullulans (Кравченко, 1986).

Но не исключено, что процесс регуляции биосинтеза полисахарида представляет собой достаточно сложную цепь взаимосвязанных процессов, включающую и ингибирование по принципу обратной связи (feedback), и концентрацию полисахарида в среде, размер полисахаридной капсулы и, возмож-

но, плотность клеточной популяции и степень обедненности среды питательными веществами.

Химический состав н свойства лютелана, образуемого Сг.Мео1из на различных средах. Для оценки гомогенности лютелана, образуемого Сг.1Шео1из на оптимизированных средах была проведена гель-хроматография полисахаридных образцов на колонке с сефарозой 4Б, а также тонкослойная хроматография гидролизованных образцов полимера. В целом по результатам наших исследований можно сказать, что молекулярно-массовое распределение полисахарида, образуемого при добавлении в питательную среду с глюкозой солей органических кислот, существенно не меняется по сравнению с контрольной средой (таблица 2). Максимальной полидисперсностью обладали полисахариды, образуемые Сг.ЫеоЬБ на средах с добавлением маннитола и сор-битола.

При определении моносахаридного состава (таблица 3) диализованных гетерогликанов установлено, что все исследованные полисахариды являлись глюкуроноксиломаннанами, причем содержание маннозы во всех полисахаридах превышало 50%. Максимальное количество маннозы обнаружено в полисахаридах, синтезируемых Сг.1Щео1из на контрольной среде Голубева с 50 г/л глюкозы (67%), среде с глюкозой и натрия ацетатом (20/30 г/л) - 64% и среде с натрия ацетатом (40 г/л) - 62%. В лютелане, образуемом на средах с солями органических кислот в качестве единственного источника углерода и среде с добавлением натрия оксалата отмечено максимальное содержание ксилозы (2127% по сравнению с 11% на контрольной среде Голубева), при этом на указанных средах снижалось количество глюкуроновой кислоты до 14-20%.

Зольность исходных гликанов колебалась от 27 до 36% и снижалась после диализа до 10-20%, что согласуется с содержанием в лютелане 14-27% глюкуроновой кислоты, которая осаждается в виде тройной калий-натрий-магниевой соли (Колева, 1986) и является основной причиной высокой зольности полисахаридных образцов. Все исходные препараты содержали небольшое количество белков (0,03-0,05%), которые могли быть связанными с полисахаридами или могли оставаться между волокнами полимеров при их осаждении из вязких растворов.

Кинематическая вязкость 0,1% водных растворов экзогликанов при 20°С колебалась от 5,7 мм2/с для контрольного лютелана (среда Голубева с 50 г/л

Таблица 2.

Коэффициенты объемного распределения полисахарндных фракций в зависимости от источника углерода, использованного в питательной

среде.

Соотношение источников углерода Коэффициенты объемного распределения полисахаридных фракций

1 пик 2 пик 3 пик 4 пик 5 пик

глюкоза (50 г/л) 0,077 0,303 0,868

натрия ацетат (50 г/л) 0,039 0,830

натрия цитрат (50 г/л) 0,039 0,868

натрия оксалат (45 г/л) 0,039 0,906

калия тартрат (35 г/л) 0,077 0,868

калия сукцинат (50 г/л) 0,039 0,906

мальтоза -10 г/л, глюкоза - 40 г/л 0,152 0,793

маннитол - 10 г/л, глюкоза - 40 г/л 0,039 0,416 0,680 0,981

сорбитол -10 г/л, глюкоза - 40 г/л 0,077 0,228 0,303 0,454 0,830

дульцитол - 10 г/л, глюкоза - 40 г/л 0,152 0,529

натрия ацетат - 30 г/л, глюкоза - 20 г/л 0,039 0,680 0,830

натрия цитрат - 30 г/л, глюкоза - 20 г/л 0,039 0,868

натрия оксалат - 20 г/л, глюкоза - 30 г/л 0,039 0,680 0,906

калия тартрат - 30 г/л, глюкоза - 20 г/л 0,077 0,680 0,868

калия сукцинат - 30 г/л, глюкоза - 20 г/л 0,039 0,906

глюкозы) до 2 мм2/с для лютелана, образуемого на среде с 45 г/л Натрия окса-лата. В целом вязкость водных растворов лютелана была достаточно стабильной в диапазоне температур от 20°С до 60°С и снижалась на 20-30% при повышении температуры до 90°С. Вязкость водных растворов лютелана, образуемого СгЛшеоШэ на средах с солями органических кислот в качестве единственного источника углерода была, в среднем, вдвое ниже по сравнению с контролем и средами, в которых соли органических кислот использовались в качестве добавок к глюкозе. Это полностью согласуется с данными по гель-хроматографии полисахарида, синтезируемого СгЛШеоШв при использовании солей органических кислот: в таком лютелане отмечалось преобладание низкомолекулярной фракции. Кроме того, примерно в 1,5 раза ниже по сравнению с контролем была вязкость полисахарида на средах с добавлением сорбитола и дульцитола, что может быть связано с высокой степенью дисперсности этих полисахаридов.

Собственные значения рН 0,1% водных растворов лютелана, полученного на различных средах, находятся в диапазоне 6-7. Вязкость всех исследованных образцов была стабильной в диапазоне рН от 5 до 10 и заметно снижалась лишь в сильнокислой и щелочной областях рН.

На основании проведенных исследований мы предлагаем 2 модифицированные среды Голубева, в которых из сравнительно дешевых и доступных источников углеродного питания синтезируются полисахариды, максимально стабильные по основным физико-химическим показателям. Кроме того, в зависимости от целей практического использования лютелана и необходимых свойств, на рекомендуемых средах удается получать как низкомолекулярный лютелан (при использовании натрия ацетата), так и высокомолекулярный - на среде с глюкозой и натрия ацетатом:

■ I среда (г/л дистиллированной воды): глюкоза - 20; натрия ацетат - 30; (ЫН4)28 04 - 2,0; КН2Р04«2Н20 - 3,56; Ка2НР04*2Н20 - 7,22; №^804*7Н20 - 0,5; №С1 - 0,5; СаС12*2Н20 - 0,001; МпС12«7Н20 - 0,0015; Ре804*7Н20 - 0,01; дрожжевой экстракт - 0,4.

■ 2 среда (г/л дистиллированной воды): натрия ацетат -50; (№14)2504 -2,0; КН2Р04*2Н20 - 3,56; Ыа2НР04«2Н20-7,22; М§804»7Н20-0,5; ЫаС1-0,5; СаС!2»2Н20 - 0,001; МпС12»7Н20 - 0,0015; Рс504«7Н20 - 0,01; дрожжевой экстракт - 0,4.

1аолнца

Химический состав лютелана, синтезируемого Сг.1и1ео1из на различных питательных средах.

Источник углерода, г/л Выход лютелана, г/л Зольность, % Влажность, % Белок, % [Л 0,1% н2о Моносахаридный состав лютелана*

Манноза Ксилоза Глюкуроновая кислота

I II III IV V VI VII VIII IX

контроль (глюкоза - 50) 2,97 27,88±6,83 10,87±3,82 0,05±0,04 -6° 67 И 22

глюкоза/мальтоза (40/10) 4,60 28,37±4,15 9,74±2,22 0,04±0,02 -12" 59 15 26

глюкоза/маннитол (40/10) 3,86 29,47±4,15 10,74±2,15 0,03±0,02 -9° 59 15 26

глюкоза/сорбитол (40/10) 2,10 29,47+6,15 10,74±2,15 0,03±0,02 -1Г 60 14 26

глюкоза/дульцитол (40/10) 3,63 29,47±7,15 12,74±2,33 0,04±0,02 -15° 62 15 23

глюкоза/натрия ацетат (20/30) 14,30 32,57±2,15 11,54±2,53 0,04±0,02 -4° 64 12 24

глюкоза/натрия цитрат (20/30) 20,30 32,45+4,50 10,60+1,53 0,04±0,02 -5° 61 12 27

глюкоза/натрия оксалат (30/20) 24,90 33,45+5,50 12,63±1,15 0,04±0,02 -3° 59 21 20

глюкоза/калия тартрат (20/30) 14,20 35,47±2,25 12,74±1,53 0,05±0,02 -5° 59 18 23

глюкоза/калия сукцинат (20/30) 15,70 35,32±4,50 11,60±1,22 0,04±0,02 -5° 57 18 25

натрия ацетат (50) 12,01 35,39±3,15 11,74±1,23 0,04±0,02 -2° 62 24 14

натрия цитрат (50) 6,62 34,15±2,13 12,53±1,48 0,04±0,02 -4° 58 26 16

натрия оксалат (45) 7,16 34,86±5,33 12,15±1,25 0,05±0,01 -2° 59 27 14

калия тартрат (35) 13,03 36,07±5,50 10,68±1,57 0,04±0,02 -5° 57 26 17

калия сукцинат (50) 11,03 35,83±4,61 10,87±1,54 0,04 ±0,02 -5° 58 25 17

На первой среде выход лютелана возрастает с 2,97 г/л на контрольной среде Голубева до 14,3 г/л, что приводит к снижению себестоимости лютелана на 64%; на второй - количество синтезированного лютелана составляет 12 г/л, а его стоимость на 44% ниже. Кроме того, процесс отделения биомассы из-за ее низкой концентрации (30% от контроля) на второй среде значительно упрощается.

Выводы.

1. Сг.1[Лео!и5 синтезирует внеклеточный полисахарид - лютелан из мо-ноз (глюкозы, галактозы, дульцитола, ксилозы, маннитола, маннозы, рамно-зы, сорбитола), биоз (мальтозы, лактозы, сахарозы), а также из неуглеводных компонентов питательных сред при использовании в качестве единственного источника углерода солей органических кислот - натрия ацетата, натрия цитрата, натрия оксалата, калия тартрата и калия сукцината.

2. Комбинации глюкозы с мальтозой и сахароспиртами - маннитолом и дульцитолом способствуют размножению Сг.1Шео1из и повышению выхода нативного полисахарида при их соотношении с глюкозой 10:40 г/л.

Добавление в среду Голубева с глюкозой солей органических кислот (натрия ацетата, натрия цитрата, натрия оксалата, калия тартрата и калия сукцината) приводит к существенной стимуляции полисахаридообразования. Высокие концентрации солей органических кислот ингибируют рост и размножение продуцента. Оптимальными для увеличения эффективности процесса биосинтеза лютелана являются следующие соотношения глюкозы и солей органических кислот в среде Голубева: 30:20 г/л для натрия оксалата, 20:30 г/л - для всех остальных солей.

3. Молекулярно-массовое распределение, моносахаридный состав и реологические свойства полисахарида, образуемого Сг.11Лео1из при оптимальных соотношениях глюкозы и углеродных добавок, существенно не меняются по сравнению с лютеланом, синтезируемым на контрольной среде Голубева (глюкоза - 50 г/л), за исключением сред с добавлением маннитола и сорбитола: полисахарид, синтезируемый на этих средах, имеет наибольшую полидисперсность. При использовании в качестве единственного источника углерода солей органических кислот снижается количество глюкуроновой кислоты в молекуле полисахарида и наблюдается преимущественное образование низкомолекулярного лютелана.

4. Предложены два варианта модифицированной среды Голубева в целях получения экзополисахарида с заданными свойствами.

5. Производные глюкозы (натриевая соль Р-О-тиоглюкозы, 2-

ацетиламино-2-дезокси-0-глюкоза, гидрохлорид D-глюкозамина, 2-амино-2-дезокси-Б-глюкоза) подавляют рост, размножение штамма 228 Cr.luteolus и биосинтез лютелана.

6. Показано, что размер полисахаридной капсулы является авторегулятором размножения продуцента.

7. Использование в качестве добавок к среде Голубева с глюкозой солей органических кислот приводит к снижению себестоимости полисахарида в среднем на 50% при общем увеличении количества образованного полисахарида в 5-7 раз.

8. Предложено сократить время ферментации Cr.luteolus на средах, рекомендованных нами в качестве оптимальных на 48 часов при добавлении калия тартрата, калия сукцината, натрия оксалата, натрия цитрата, маннитола, сорбитола и дульцитола; при добавлении мальтозы и натрия ацетата - на 24 часа по сравнению со временем ферментации на контрольной среде Голубева.

Список публикаций:

1. А. А. Беспалов. Влияние солей органических кислот на рост и биосинтез полисахарида дрожжами Cryptococcus luteolus (Saito) Skinner, штамм 228 // Микол. и фитопатол. - 1996. - Т.ЗО, в.1. - С.39-43.

2. А. А. Беспалов, Н. П. Блинов. Влияние углеводных добавок на размножение и биосинтез экзополисахарида дрожжами Cryptococcus luteolus (Saito) Skinner, штамм 228 // Микол. и фитопатол. - 1996. - Т.ЗО, в.2. - С.20-25.

3. А .А. Беспалов, Н. П. Блинов. Влияние смешанных источников питания на рост Cryptococcus luteolus (Saito) Skinner штамм 228 и биосинтез полисахарида // Тез. докладов научн. сессии, поев. 100-летию со дня рожд. проф. Преображенского. - Москва, 21-22 октября 1996. - С. 35-36.

4. А .А. Беспалов, Н. П. Блинов. Молекулярно-массовое распределение экзополисахарида, образуемого Cryptococcus luteolus (Saito) Skinner, штамм 228 при совместном присутствии двух источников углерода // Актуальные проблемы создания новых лекарственных средств.: Тез. докладов Всеросс. научн. конф. в СПХФА. - СПб, 21-23 ноября 1996. - С. 9.

5. А .А. Беспалов, А. О. Григорьянц, Н. П. Блинов. Влияние источников /глерода на рост Cryptococcus luteolus (Saito) Skinner штамм 228 и биосинтез толисахарида // Актуальные проблемы создания новых лекарственных средств: Гез. докладов Всеросс. научн. конф. в СПХФА. - СПб, 21-23 ноября 1996. - С. 9.