Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности CRYPTOCOCCUS LUTEOLUS (SAITO) SKINNER в связи с продукцией лютелана

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Особенности CRYPTOCOCCUS LUTEOLUS (SAITO) SKINNER в связи с продукцией лютелана"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И МЕДИЦИНСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ХИМИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ

0JJ

На правах рукописи

" ■ 1

Григорьяиц Александр Олегович

ОСОБЕННОСТИ CRYPTOCOCCUS LUTEOLUS (SAITO) SKINNER В СВЯЗИ С ПРОДУКЦИЕЙ ЛЮТЕЛАНА

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург, 1995

Работа выполнена на кафедре микробиологии Санкт-Петербургского химико-фармацевтического института (ректор - проф. Г.П.Яковлев)

Научный руководитель: доктор биологических наук, з.д.н. РФ, академик СПбИА, профессор Н.П.Елинов.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Яковлева Елена Павловна; кандидат биологических наук Меледина Татьяна Викторовна Ведущая организация: Санкт-Петербургский государственный технологический институт - техн. университет, кафедра технологии микробиологического синтеза.

Защита состоится .... 1996 г. В часов на заседании спе-

циализированного Совета К-084.63.01 Санкт-Петербургского химико-фармацевти-чиского института (197376, Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова, 14,).

С диссертацией можно ознакомиться: в научной библиотеке СПХФИ

Автореферат разослан "■?.!..*..¡/К^.М... 1996 г.

Ученный секретарь специализированного совета:

кандидат биологических наук Н.В.Кириллова

Общая характеристика работы.

Данная работа является продолжением исследований, проводимых на кафед-1е микробиологии Санкт-Петербургского химико-фармацевтического института по юучению биосинтеза, химического строения и биологической активности дрожжевых (неклеточных полисахаридов.

Актуальность проблемы. Экзогликаны, продуцируемые различными группами ликроорганизмов, в настоящее время широко используются в качестве вспомогательных веществ в фармацевтической, косметической, пищевой, нефтедобывающей тромышленности, а так же в медецине в качестве профилактических и лечебных средств. Для этих целей представляют определенный интерес гетерогликаны, образуемые криптококками - сапрофитными базидиомицетовыми дрожжами. Водные растворы гетерогликанов обладают сравнительно высокой вязкостью, что делает их перспективными в качестве загустителей кремов, мазей, стабилизаторов эмульсий и суспензий. Креме того, они не токсичны, проявляют иммуномодулирующие, антивирусные и детоксицирующие свойства. Наличие карбоксильных групп открывает широкие возможности для использования их в качестве ковалеитно связянных носителей для низкомолекулярных лекарственных веществ, а так же для химической модификации этих полимеров.

Сапрофитные криптококки в аноморфном состоянии достаточно стабильны при выращивании и хранении а лабораторных условиях. Однако, их физиологические особенности и продуктивность по экзогликанам (при различных параметрах выращивания продуцентов) остаются мало исследованными.

Проблема "Микробные полисахариды" в приложении к криптококковым гете-рогликанам актуальна для более глубокого изучения биологии базидиомицетовых дрожжевых организмов, для синтеза и технологии получения полимерных углеводов в приложении к интересам в областях фармации и медицины.

Цель данной работы заключалась в изучении оптимальных условий для биосинтеза лютелана - внеклеточного полисахарида образуемого культурой Сг.1и1ео!иэ мтамм 228. По предварительным данным, этот штамм способен накопливать в куль-туральной жидкости значительное количество экзогликана.

Задачи исследования: 1. Исследовать биосинтез лютелана в зависимости от качества и количества различных источников питания; 2. Изучить влияние физико-химических факторов на процесс биосинтеза полимера; 3. Провести оптимизацию процесса биосинтеза экзогликана; 4. Изучить реологические характеристики лютела-

на.

Научная новизна и практическая значимость. Изучено влияние вида и концентрации источников углеродного и азотного питания на образование полисахарида Cr.luteolus - доказано, что лютелан синтезируется культурой в питательных средах со всеми избранными веществами. Однако, дисахариды стимулируют биосинтез, а гид-ролизат крахмала и нитратный азот угнетают образование лютелана. Повышение содержания глюкозы в среде сопровождается увеличением количества полисахарида, но эффективность процесса (по глюкозе) снижается.

- Показано, что для образования лютелана культура Cr.luteolus нуждается в ионах магния. Другие изученные микроэлементы (марганец, железо, кальций) влияют только на образование биомассы клеток продуцента.

- В изученном диапазоне концентраций наиболее значимыми факторами для биосинтеза лютелана являются содержание глюкозы, аммония сульфата, магния сульфата и неорганического фосфора в среде.

- Оптимизирован состав среды для образования лютелана. Разработана и предложена среда, обеспечивающая 50% увеличение количества нативного полисахарида, при 10% снижении его стоимости.

- Составлена математическая модель биосинтеза лютелана культурой Cr.luteolus, которая может быть использована для динамического управления процессом образования полисахарида.

- Изучены реологические характеристики веяных растворов полисахарида в диапазоне концентраций 0,1 -1%.

Публикации: материалы данной диссертации опубликованы в 3 портных работах.

Объем и структура работы: диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста. Содержит 23 таблицы и 30 рисунков. Список литературы 239 наименований.

Экспериментальная часть.

Объекты и методы исследования. В работе использовали штамм №228 Cr.luteolus (Saito) Skinner. Культура была получена из коллекции микроорганизмов кафедры микробиологии Санкт-Петербургского химико-формацевтического института. По морфологическим признакам она соответствует описанию, данному в работе (Голубев, 1980). Штамм 228 Cr.luteolus хранили в пробирках диаметром 20 мм, содержащих 5 мл скошенного сусло-агара при температуре +4 °С. Пересев его при

длительном хранении проводили 1 раз в 6 месяцев. Для получения посевного мате->иала использовали культуру в пробирках на скошенном сусло-агаре после одно-ратного пересева из пробирок длительного хранения и инкубирования в течении 2х ;уток при 24-25 °С в термостате. Посевной материал выращивали на среде следующего состава (г/п дистиллированной воды): глюкоза - 50,0, (NH4)2SO* - 2,0, <Н2Р04-2Н20 - 3,56, Na2HP04-2H20 - 7,22, MgS04-7H20 - 0,5, NaCI - 0,5, CaCI2-2H20 -3,001, МпС|2-4Н20 - 0,0015, FeS04-7H20 - 0,01, дрожжевой экстракт - 0,4. Среду стерилизовали при 147,1 кПа в течении 30 минут, рН среды до стерилизации 6,9-7,1.

Посевной материал выращивали в колбах Эрленмейера, объемом 750 мл, на качалках (220 об/мин) при температуре 24-25 "С в течении 48 часов. В колбы вносили 50-200 мл среды, в зависимости от требуемого количества посевного материала. Для засева посевной колбы использовали взвесь культуры в стерильной дистиллированной воде (5 мл) из одной пробирки. Ферментацию проводили в колбах Эрленмейера, объемом 750 мл, содержавших 50-200 мл среды в зависимости от цепей опыта. Состав среды аналогичен составу среды для выращивания посевного материала. Посевной материал вносили в количестве 5-10 % к объему среды.

Ферментацию проводили при непрерывном встряхивании на качалках (220 об/мин) при температуре 24-25 "С. Продолжительность культивирования 120 часов. Все опыты проводили в 3-4* кратной повторности. Пробы ферментационной массы для определения биохимических показателей процесса отбирали стерильно каждые 24 часа.

Значения рН культуральной жидкости устанавливали потенциометрически. Количество биомассы клеток продуцента определяли по оптической плотности разведенной в 100 раз культуральной жидкости при длине волны 560 нм на спектрофотометре СФ-26.

Содержание "нативного" (с клетками продуцента) полисахарида определяли гравиметрическим методом. Определенный объем культральной жидкости осаждали 96% этанолом, осадок отделяли фильтрацией под вакуумом, сушили при 40-60 °С в течении 24 часов и азвешивали.

Редуцирующие вещества определяли по реакции с динитросалициловой кислотой (Шапиро, 1976) или ортотоллуидиновым реактивом (Методы экспериментальной микологии, 1982). Концентрациюлонов NH4* реактивом Несслера (Методы общей бактериологии, 1984).

Лютелан выделяли из культуральной жидкости, предварительно разведенной

дистиллированной водой в 1,5-2 раза, в зависимости от вязкости ферментационной массы. Клетки продуцента осаждали центрифугированием при 6000 об/мин в течении 20 минут. Супернатант упаривали в 4-5 раз на вакуумном роторном выпарном аппарате (вакуум 0,6-0,8 ат, температура кипения 60-80 °С). Лютелан осаждали 2-2,5 объемами 96% этилового спирта при температуре 18-20 °С. Образовавшийся осадок отделяли декантацией и/или на центрифуге при 3000 об/мин в течении 10 минут. Осадок обезвоживали этанолом или ацетоном, растирали в фарфоровой ступке и сушили при 40-60 °С.

Полный кислотный гидролиз полисахарида проводили 2Н серной кислотой. Для этого 10 мг полисахарида с 0,5 мл 2Н Н2804 помещали в запаянную ампулу (объем ампулы 1 мл) и выдерживали 4 часа при 100 °С на водяной бане. Гидролизаг разбавляли 0,5 мл дистиллированной воды и нейтрализовали карбонатом бария до нейтральных значений рН (по индикаторной бумаге). Осадок сульфата бария отделяли при 3000 об/мин в течении 15 минут на центрифуге. Полученные смеси моносахаридов использовали для качественного и количественного определения индивидуальных моноз.

Качественный анализ смеси моносахаридов проводили методом восходящей тонкослойной хроматографии на пластиках вНирЬо! 50x120 мм. Система растворителей н-пропанол-вода=17:1 Использовали двукратное пропускание системы растворителей. Пятна моносахаров проявляли кислым фталатом анилина (Захарова, Косенко, 1982).

Количественный состав смеси монноз определяли бумажной хроматографией на бумаге РМ-11 в системе растворителей н-бутанол-уксусная кислота-вода=9:1:4; использовали трехкратное пропускание системы растворителей. Хроматограммы проявляли кислым фталатом анилина, пятна моносахаров элюировали 80% раствором этанола в 2Н соляной кислоте. Концентрацию моносахаридов определяли по оптической плотности раствора при 390 нм для маннозы и глюкуроновой кислоты и при 360 нм для ксилозы (Захарова, Косенко, 1982).

Содержание белка в образцах определяли по методу Варбурга и Кристиана по оптической плотности при 260 и 280 нм (Хансон, Филлипс, 1984).

Зольность определяли после сжигания навески полисахарида в фарфоровом тигле при температуре 500 °С в течении 6 часов.

Молекулярно-массовое распределение а образцах полисахаридов определяли гель-хроматографией на колонке (0,8x20 см) наполненной Сефарозой 4В. На колонку

аносили 0,3 мл 0,2-0,25 % раствора полисахарида. Скорость элюции составляла 5-8 л/ч. Элюент - дистиллированная вода. Свободный объем колонки определяли по НК. Фракции собирали по 0,5 мл. Определение полисахарида в них проводили по еакции с фенол-серной кислотой (Захарова, Косенко, 1982). Экстинкцию определяли а спектрофотометре СФ-26 при 490 нм. Так же использовали для гель-эоматограсфии систему 1Мсогс1. Предварительно поверяли возможность регистра-ии полисахарида детектором в ультрафиолетовой области.

Вязкость водных растворов полисахарида измеряли на вискозиметре Остваль-а с диаметром капилляра 0,99 мм, а так же на приборе Реотест с цилиндровым измерительным устройством "М", объемом 10 мл. Образцы для измерения вязкости ловили следующим образом: навеску полисахарида растворяли в дистиллирован-ой воде и осаждали взвешенные частицы на центрифуге (16 000 об/мин в течении 0 мин).

Для определение кривой растворимости лютелана навеску около 50 мг люте-ана помещали в предварительно взвешенную центрифужную пробирку, снаб-:енную пробкой, и заливали 5 мл выбранной смеси растворитель-осадитель. Смесь пробирке, периодически взбалтывая, оставляли стоять при комнатной температуре о следующего утра. Затем ее подвергали центрифугированию - 6000 об/мин в тече-ии 60 минут. Осадок промывали применяемой смесью растворитель-осадитель и ушили до постоянного веса при 60-50 °С.

Результаты и их обсуждение.

Влияние состава среды и условий культивирования на биосинтез лютелана.

Изучение влияния источников углерода и азота на синтез полисахарида куль-урсй Сг.Мео1из проводили, внося их вместо глюкозы и пептона в исходную среду олубева в количестве 50 и 2 г. соответственно. Результаты представлены в табли-ах 1 и 2, из которых следует, что синтез лютелана имеет место при использовании рактически всех испытанных источников питания, хотя и в различной степени. Также тмечено, образование полисахарида на средах с гидропизатом крахмала и подсол-ечным маспом, но в столь незначительном количестве, что это не представляло нтереса в связи с целями данной работы. Отмечена некоторая стимуляция синтеза ри использовании сред с дисахаридами в качестве единственных источников угле-ода. Повышение концентрации глюкозы в среде, в целом, увеличивало общий вы-од полимера, но при этом значительно снижался процент преобразования глюкозы ; биомассу и полисахарид. Наибольшее количество натавного лютелана отмечено

Таблица 1. Влияние источников углерода на биосинтез лютелана.

№ Источник углерода Биомасса Нативный полисахарид

г/л %от контроля г/л % от контроля

1 Галактоза 7,0±0,7 83,2 8,6±2,1 51,а .

2 Гидролизат 3,1±0,3 36,7 - -

крахмала

3 Глюкоза 8,4±1,3 100,0 16,в±1,3 100,0

4 Ксилоза б,7±1,8 79,4 9,1±0,1 55,1

5 Лактоза 3,3±1,2 39,0 6,3±0,6 37,9

6 Мальтоза 8,9±1,3 105,6 17,7±0,7 106,7

7 Маннит 11,4±0,8 135,1 25,8±0,3 155,9

8 Манноза 9,9±1,2 117,3 15,3±1,5 92,2

9 Натрия ацетат 0,8+0,4 9,8 10,4±0,5 63,0

10 Подсолнечное 3,6±0,7 42,6 - -

масло

11 Сахароза 7,2±0,2 84,3 20,7±1,8 124,8

12 Сорбит 7,0±1,3 83,2 10,1±0,4 60,7

Таблица 2. Влияние источников азота на биосинтез лютелана.

№г Источник азота Биомасса Нативный полисахарид

г/л % от контроля г/л % от контроля

1 Аммония 8,4±2,4 99,5 14,9:4:0,8 90,1

сульфат

2 Аммония 8,3±1,5 98,3 15,8±0,1 95,3

хлорид

3 Кукурузный 4,0±1,8 47,4 6,0±0.5 36,2

экстракт

4 Мочевина 11,9±2,9 141,0 17,6±1,1 106,9

5 Натрия 6,7±4,1 79,4 1,3±0,7 8,1

нитрат

6 Пептон 8,4±1,3 100,0 16,6±1,3 100,0

эи концентрации глюкозы в среде 80 г/л, самая высокая биосинтетическая актив-зсть при 20 г/л, при концентрациях глюкозы выше 80 г/л снижаются как прирост юмассы клеток и количество нативного полисахарида.

Среди источников азотного питания оптимальными для биосинтеза лютелана э(ли пептон и соли аммония, на которых количество образованного полимера фак-тески одинаково. Увеличение отношения С^ в среде, в целом, благоприятно ска->1валось на биосинтетической активности продуцента. Однако, следует отметить, го если начальная концентрация аммония сульфата в среде менее 0,5 г/л, то проводит значительное угнетение роста культуры и биосинтеза ею лютелана.

Входящие в состав среды микроэлементы и экстракт БВК (фактор роста) не-газывают существенного воздействия на количество образованного СгМео1из по-лсахарида. Исключением являются ионы магния, отсутствие в среде которых при-здит к снижению выхода целевого продукта на 30%. Повышение количества магния ,пьфата в среде сверх 0,3-0,5 г/л не приводит к стимуляции биосинтеза, очевидно, зны магния включаются в биосинтез лютелана в качестве кофакторов, не оказывая рямого действия на образование полимера.

Оптимальная рН среды для биосинтеза лютелана до стерилизации составляет ■7,2. Аэрация но оказывает существенного воздействия на биосинтез. Повышение эмпературы отрицательно сказывается как на росте культуры Сг.1и1ео1из, так и на Эразовании лютелана.

Оптимизация состава среды для биосинтеза лютелана. В качестве исходной пя оптимизации была взята среда Голубева. Для выбора факторов оптимизации ыл проведен отсеивающий эксперимент по методу случайного баланса, так же най-ены коэффициенты корреляции интересующих нас выходных параметров с кон-ентрациями всех компонентов среды. Обозначения факторов приведены в таблице . На основании этих данных в ппан эксперимента были включены концентрации иокозы, фосфора, аммония сульфата, а так же магния сульфата. Количество экс-эакта БВК было оставлено на том же уровне, что и в среде Голубева, остальные змпоненты были исключены как не имеющие существенного влияния на процесс.

Оптимизацию проводили в соответствии с планом для полного факторного ксперимента с уточнением положения точки оптимума рототабельным планирова-ием второго порядка. Расчет коэфициентов проводили с помощью програм-;ы31а{дгарЫсз 3.0. В качестве критерия оптимизации была выбрана обобщенная зункция желательности, составленная из количества нативного полисахарида в кон

Таблица 3. Обозначение и интервалы варьирования факторов.

Фактор Обозначение Центр плана г/л Интервал варьирования факторов

глюкоза Х1 60 20

(N44)2804 Х2 2,5 1

МдЭ04 ХЗ 0,5 0,2

КН2РО4 №2НР04 Х4 25 5

це процесса, отношения нативный полисахарид/биомасса (биосинтетическая активность продуцента) и отношения нативный полисахарид/ глюкоза (максимизация потребления глюкозы). Индивидуальные функции отклика процесса пересчитывали в частные функции желательности по формуле: £1=ехр(-ехр(Ь0+Ь1у)). Наилучшему и наихудшему значениям отклика в плане эксперимента присваивали значения 0,63 и 0,2 соответственно; исходя из этих значений рассчитывали коэффициенты Ь0и Ь,.

Обобщенную функцию желательности О находили как среднее геометрическое частных функций О = й2 с!з.

В результате расчета получено следующее уравнение регрессии: 0=0,0045х1+0,0193х4-0,00003х,г-0,00015х42-0.00007х1х4 Влияние всех остальных факторов оказалось не значимым. Уравнение регрессии адекватно экспериментальным данным (критерий Фишера Р=608,8) и может быть использовано для описания процесса биосинтеза полисахарида в исследованной области. Соответствующая поверхность отклика представлена на рисунке 1. С учетом уточненного количества фосфатов, превышение которого ведет к синтезу побочного продукта (20 г/л), предлагаем следующий состав среды как оптимальный для биосинтеза лютелана (г/л дистиллированной воды): глюкоза - 65, (1ЧН4)2804 - 2,5, Мдв04 ■ 7Н20- 0,5, КН2Р04 - 6,43, №2НР04 - 13,06, экстракт БВК - 0,6. Данная среда обеспечивает увеличение количества синтезированного культурой Сг.11йео(из лютелана на 50% при 10% снижении затрат на 1 г. полученного продукта.

Подлинность синтезируемого на оптимальной среде лютелана доказывали с помощью тонкослойной хроматографии гидролизованных образцов полимера и гель-хроматографии. По всем этим показателям (моносахаридный состав и размер молекулы) лютелан синтезируемый культурой на оптимизированной среде не отличается

фосфор ГЙ1

Рисунок 1. Поверхность отклика для обобщенной функции желательности.

1т контрольного, полученного на среде Голубева.

Математическое описание процесса биосинтеза. Составление математической подели процесса является одним из методов его оптимизации, так ках позволяет ди-«мично управлять процессом биосинтеза целевого продукта. Рост биомассы клеток Зг.1^ео1из описывали с помощью уравнение логистической кривой Ферхюльста

— =КХ(1-|ЗХ), где X - биомасса, Кир коэффициенты, определяющие параметры ей

ее накопления. Интерпретация их следующая: К - максимальная скорость роста в данных условиях, р - предельная емкость среды (соответствует предельной плотности популяции клеток при исчерпании всех ресурсов среды). Для определения коэффициентов использовали графо-аналитический метод (Бейли, Оллис, 1989). Коэффициент р: р=1/Хш5х, Х™х - максимальное количество биомассы во время стационарной фазы роста. В результате получено следующее уравнение: ЬХ

сК

• 0,071Х(1- О,102Х), соответствие уравнения экспериментальным данным показа-

но на рисунке 2. Описание скорости накопления полисахарида провели по уравнению

Людекинга-Пайрета:

с!Р с!Х

Л

а — + рХ. Коэффициенты уравнения интерпретировали сК

следующим образом: а - вклад вносимый в образование продукта растущими и р - не

д биомасса, модель д биомасса, опыт

—□— полисахарид, модель q полисахарид, опыт

Рисунок 2. Сопоставление опытных и расчетных данных по росту Cr.lufeolus и биосинтезу лютелана.

растущими клетками продуцента. Коэфффициенты модели находили так же графоаналитическим методом. Получены следующие уравнения: для нативного полисахарида - — = 3,12—-0.01Х; для чистого полисахарида - — = 1,79^--0,00015Х. Та-dt dt dt dt

ким образом синтез лютелана сопряжен с ростом биомассы клеток продуцента; более гого, при выходе культуры на стационарную фазу полисахарид деполимеризует-ся клетками Cr.luteolus. Деградация лютелана культурой ярко выражена при выращивании Cr.luteolus при дефиците глюкозы (начальная концентрация 5 г/л), полисахарид обнаружевается в культуральной жидкости на вторые сутки ферментации, в то время как на третьи сутки осадить его не удается. В связи с этим мы считаем целесообразным сократить время ферментации со 120 до 96 часов, соответствующих максимальному содержанию лютелана в культуральной жидкости.

Для целей математического моделирования возраст культуры (X) предложено выражать, исходя из следующего соотношения (Федосеев, 1977):

(X(t)dt

X.-1L

-, где X(t) - функция зависимости количества биомассы клеток от

времени, Х( - количество биомассы клеток во время I По этой модели, возростание биомассы связывается с появлением новых клеток, которые живут, не погибая (если

нет убыли их биомассы) до конца процесса; X - "средний кумулятивный возраст" культуры, и, благодаря интегральному характеру, отражает и предысторию развития популяции. Связь удельной скорости биосинтеза с возрастом клеток выражается формально с помощью уравнения второго порядка ч=0,0056+0,0048Х-0,00005Х2. График этой зависимости представлен на рисунке 3, и подтверждает вывод о том, что максимальная скорость синтеза лютелана наблюдается в экспоненциальной фазе роста продуцента. Для биосинтеза лютелана (как и прочих вторичных метаболитов) необходим предварительный синтез соответствующих ферментов, и поэтому, его образованию должен предшествовать некий временной интервал запаздывания. Иными словами, максимальная скорость образования лютелана должна приходиться на стационарную фазу роста продуцента (аналогично антибиотикам и другим веществам, относящимся к вторичным метаболитам). Однако, полученные нами данные не подтверждают обязательность этого правила; время синтеза клеткой любого метаболита оределяется условиями, в которых находится культура. Косвенно этот вывод подтверждается данными Ждан-Пушкиной (1994) о том, что путем ряда последовательных пересевов из экспоненциально растущей популяции, можно приблизить синтез вторичных метаболитов к началу фазы размножения культуры. Исходя из защитной функции полисахаридов (Блинов, 1984), возможность их синтеза растущими клетками продуцента является оправданным, особенно при наличии неблагоприятных условий для ее существования.

время, ч

Рисунок 3. Скорость синтеза лютелана в зависимости от возраста культуры.

-13—модель в эксперимент

рН

Рисунок 4. Влияние рН культуральной жидкости на скорость образования полисахарида.

-1

0.098 [Ч 0.094 0,09 0.086 0.082 0.078 0.074 0.07

5.2 5.8 6.4 7 7.6 8.2

рн

Рисунок 5. Изменение скорости роста культуры Сг.МеоШз в зависимости от рН.

Влияние рН среды на скорость биосинтеза полисахарида описывали уравнением второго порядка. Полученное в итоге уравнение имеет следующий вид: -2,513+0,845рН-0,061рНг (рисунок 4); рН 6,9 исходя из уравнения является отимапь-ным для удельной скорости биосинтеза зкзополисахарида. Скорость размножения культуры в исследованном диапазоне рН не имеет ярко выраженного оптимума, хотя также удовлетворительно описывается уравнением второго порядка ц— •0,019+0,ОЗЭрН-О.ООЗрН2 (рисунок 5); рН 5,6 является оптимальным для размножения культуры в данных условиях.

Реологические свойства лютелана. Релогическая характеристика водных рас-

творов полисахаридов являются важнейшим показателем при оценке возможностей их практического применения в различных областях хозяйства. Кроме того, высокая вязкость культуральных жидкостей при ферментации полисахаридов стоит в ряду главнейших проблем промышленного производства многих экзогликанов, начиная со стадии биосинтеза (ограничение тепло- и массопереноса, увеличение затрат мощности на перемешивание), заканчивая отделением биомассы, получением нативного раствора и его обработкой. В этой связи изучение реологических характеристик лю-телана представляется необходимым.

Параметром, характеризующим вязкостные характеристики полимера, является его предельное число вязкости [ц]. Для лютелана оно находится в пределах 3,4 -5,4 мл/г, в зависимости от условий культивирования продуцента и способов выделения образца. На рисунке 6 представлено изменение относительной вязкости водного раствора лютелана в зависимости от концентрации полисахарида. Из рисунка видно, что при увеличении концентрации полимера вязкость раствора быстро возрастала после концентрации 0,5% и достигала относительной вязкости 33,5 при содержании лютелана 1%. Плотные гели лютелана не формировались при использовании его даже в концентрации 2 %.

Большое значение для практических целей имеет изменение вязкости растворов полисахаридов при изменении рН. Влияние активности ионов водорода на реологические характеристики водного раствора лютелана изучали путем установки требуемого значения рН 0,2 % раствора полисахарида 2Н растворами Н2304 и №ОН. Результаты показаны на рисунке 7. Во всем исследованном диапазоне рН (1,5 -11,5) изменения вязкости не превышали 40% от максимального значения, а в диапазоне рН 4,5 - 10 вязкость растворов оставалась стабильной. Собственный рН раствора лютелана в дистиллированной воде, в зависимости от образца, колеблется от 6,3 до 6,9 единиц. Изменение вязкости раствора лютелана от температуры показано на рисунке 8. При повышении температуры относительная вязкость быстро снижалась от 2,7 при 20 °С до 1,43 при 75 °С.

Влияние различных солей одно и двух валентных катионов на вязкость водных растворов лютелана показано на рисунке 9. Как видно из рисунка присутствие различных солей не оказывало существенного влияния на вязкость раствора лютелана. Наибольшее снижение вязкости раствора лютелана происходило в 1М №С1 и составило 30%.

Вязкость растворов полисахаридов редко бывает ньютоновской. Не составляет

отесскт&льняя

ВЯЗКОСТЬ

С,: 0,9

кмцвитргция, */.

Рисунок 6. Изменение относительной вязкости водного раствора лютелана в зависимости от его концентрации, относительная

аягкоетк

2.5

■$11

рн

Рисунок 7. Изменение вязкости раствора лютелана от рН.

относительная вязкость

20 25 30 35 40 45 50 55 ео 65 70 75 60

температура

Рисунок 8. Влияние температуры на вязкость раствора лютелана.

относительная ^ вяжосп»

2,а 2.6 2.4 2.2 2 1.« 1,6 1.4 1.2 1

И И«С1

—*—иа

—•—МзС!2 —*—СаС12

концентрация, молъ/л

Рисунок 9. Влияние концентрации солей на вязкость раствора лютелана.

вязкость, сП 23

О 30 60 90 120 с_1

Рисунок 10. Вязкость раствора лютелана в зависимости от скорости сдвига, исключения из этого правила и лютелан. График зависимости вязкости 0,5 % раствора лютелана в дистиллированной воде от скорости сдвига представлен на рисунке 10, из которого видно, что растворы лютелана обладают псавдоппастичными свойствами, то есть с увеличением скорости сдвига вязкость их падает

Осаждение лютелана. Основным методом выделения полисахаридов из водных растворов является осаждение их органическими растворителями, смешивающимися с водой. В этой связи мы изучили растворимость лютелана в этаноле, ацетоне, н-пропаноле; данные представлены на рисунке 11 . Кривая растворимости полисахарида в этаноле имеет более крутой наклон, чем для двух других растворителей. Таким образом, по нашим данным, этанол более эффективный осадитель для

0.5

лютелана, чем ацетон и н-пропанол. В то же время для фракционирования лютелана по молекулярной массе целесообразнее использовать ацетон или н-пропанол, исходя из кривой растворимости, при этом удается разделить полимер на большее число фракций. При концентрации ацетона в воде 80% (по объему) лютелан не растворялся, но .очевидно, поглащал некоторое количество воды, так как образовывал геле-образную массу. При более высоких концентрация ацетона данное явление не отмечалось. При сушке центрифужных пробирок, после растворения полимера в ацетоне и н-пропаноле, на их стенках образовалась тонкая пленка полисахарида. При растворении лютелана в этаноле данный факт не отмечен.

На осаждение лютелана из культуральной жидкости оказывает существенное влияние рН (рисунке 12). Для данного полисахарида отмечено два оптимума рН для осаждения - при слабокислом 6,2 и сильно щелочных (рН>12) значениях рН.

Растворенный полисахарид. %

% освдителя

Рисунок 11. Растворимость лютелана в различных системах растворитель-осадитель. 1 - этанол, 2 - ацетон, 3 - н-пропанол.

Рисунок 12. Соотношение объемов этанола с раствором лютелана, требуемое для начала осаждения полисахарида при различных рН.

17

Выводы.

1. Cr.luteolus синтезирует внеклеточный гетерогликан - лютелан, используя для этого различные моно- и дисахариды, а так же сахароспирты без существенного изменения количества образуемого полисахарида. В сравнении с моносахаридами, дисахариды стимулируют синтез лютелана.

2. Соли аммония и пептон стимулируют рост культуры и образование лютелана, нитратный азот угнетает биосинтез экзогликана.

3. Среди изученных катионов наибольшее влияние на биосинтез лютелана оказывают ионы магния (кофактор), при отсутствии которых снижается количество синтезированного лютелана. Железо, марганец, кальция и факторы роста, входящие в состав экстракта БВК, больше активируют рост культуры, чем продукцию ею экзо-полисахарида.

4. На основании данных отсеивающего эксперимента в исследованной области значимое влияние на биосинтез лютелана имеют концентрации глюкозы и фосфора в исходной среде, остальные компоненты среды находятся в достаточном количестве.

5. Биосинтез лютелана в расчетные интервалы времени сопряжен с экспоненциальным ростом Cr.luteolus. Максимальное количество полисахарида накапливается к 96 часам ферментации продуцента. При более длительном культивировании дальнейший прирост полисахарида незначителен. С учетом экономической целесообразности предложено сократить время ферментации со 120 до 96 часов.

6. Среди изученных раствоителей - этанол, ацетон , н-пропанол наиболее эффективным осадителем лютелана является этиловый спирт. Оптимальный рН для осаждения 6,9.

7. Водные растворы лютелана обладают псевдопластичными реологическими свойствами; они стабильны по вязкостй в широком диапазоне рН, а так же при действии высоких концентраций солей одно- и двухвалентных катионов. Вязкость растворов лютелана экспоненциально снижается при повышении температуры.

8. Нами предлагается среда в качестве оптимальной для биосинтеза лютелана (г/л дистиллированной воды): глюкоза - 65,0, (NH4)2S04 - 2,5, MgS04 -7НгО- 0,5, КН2Р04 - 6,43, Na2HP04 - 13,06, экстракт БВК - 0,6; на данной среде выход полисахарида в 1,5 раза больше, чем на исходной среде Голубева.

9. Внесены необходимые дополнения к"лабораторному регламенту на получение лютсулана.

Список публикаций.

1. Григорьянц А.О., Блинов Н.П. Продукция экзогликана дрожжами Cryptococcus luteolus шт.228 на различных источниках питания. Тез. докл. Всероссийской научн. конф. "Химия и технология лекарственных веществ" 28-30 июня 1994 г. с.9.

2. Григорьянц А.О., Блинов Н.П. Влияние состава среды на рост и биосинтез экзогликана штаммом 228 Cryptococcus luteolus (Saito) Skinner. Микология и фитопатология, - 1994, т.28, вып.6, -с.28-31.

3. Григорьянц А.О. Оптимизация состава среды для биосинтез экзогликана штаммом 228 Cryptococcus luteolus (Saito) Skinner. Микология и фитопатология, -1995, т.29, выпД-с.27-3 /