Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение и изучение некоторых гетерогликанов криптококков и их производных

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Получение и изучение некоторых гетерогликанов криптококков и их производных"

л

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ХДОИКО-МРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи Для служебного пользования Экз. № г.

ВОРОШНСКАЯ Светлана Леонидовна

УДК 576.852.29

ПОЛУЧЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ НЕКОТОРЫХ ГЕТЕРОГЛИКАНОВ КРИПТОКОККОВ И ИХ ПРОИЗВОДНЫХ

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1993

Работа выполнена на кафедре микробиологии Санкт-Петербургского химико-фармацевтического института /СПХФИ/

Научный руководитель - доктор биологических наук

Г.А.Витовская

Научный консультант - кандидат фармацевтических наук,

доцент А.А.Иозеп

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Г.Е.Аркадьева доктор химических наук, профессор Д.П.Севбо

Ведущая организация - Государственный институт для усовершенствования врачей, г.Санкт-Петербург

Защита состоится " Аи^МлЯ 1993 г. в /-3 часов минут на заседании специализированного совета К 084.63.01, Санкт-Петербургского химикб-фармацевтического института /197376, г.Санкт-Петербург, ул.проф.Попова, 14/.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института /197376, г.Санкт-Петербург, ул.проф.Попова, 4/6/.

Автореферат разослан " лиЫПи.СК^ 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

Н.В.Кириллова

ПОЛУЧЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ НЕКОТОРЫХ ГЕТЕРОГЛИКАНОВ КРИПТОКОККОВ И ИХ ПРОИЗВОДНЫХ

Актуальность темы. Продуцируемые микроорганизмами полисахариды используются в качестве вспомогательных веществ в фармацевтической, косметической, пищевой промышленности, а также в медицине - в виде профилактических и лечебных средств при некоторых патологических состояниях. Для таких целей большой интерес представляют высоковязкие биологически активные гетерогликаны, синтезируемые аспорогенными дрожжами рода Сгур-Ьососсиа . Они не токсичны, проявляют иммуномодулирующие и антивирусные свойства, детоксицируют определенные химиотерапевтические препараты, промышленные яды, перспективны для применения в качестве загустителей при разработке фармако-косметических кремов, суспензий, эмульсий. Учитывая особенности строения и свойства гетероглика-нов, содержащих карбоксильные группы, представляется заманчивой их химическая модификация в целях получения оригинальных фармакологически активных веществ. В настоящее время на пути к внедрению находится первый отечественный полисахаридный препарат ронасан, полученный химической модификацией гомогликана родэкс-мана. и обладающий гиполипидемическим и антиатеросклеротическим действием. Он разработан на кафедре микробиологии Санкт-Петербургского химико-фармацевтического института совместно с НИИЭМ РАМН и ПО "Белмедпрепараты" /Республика Беларусь/. Данная работа посвящена получению и исследованию производных гетерополиса-харидов дрожжей рода Сгур1;ососсиа

Ц§ЗЬ_и_задачи_исследования. Цель исследования заключалась в осуществлении биосинтеза криптококковых полисахаридов, изучении их свойств и получении их некоторых химических производных.

Для этого необходимо было решить следующие задачи:

- провести биосинтез гетерогликанов;

- доказать их подлинность;

- установить строение глюкуроноксиломаннана Сг. 1аигеггЫ1 ;

- получить и исследовать полусинтетические производные ге-терополисахаридов;

- на основе изучения физико-химических свойств и биологической активности определить возможные пути практического использования модифицированных гетерогликанов.

Научная новизна работы. Установлено строение крилана - основной фракции полисахарида, продуцируемого Сг. laurentü . Синтезированы сульфатированные производные лютелана и крилана и определено местоположение сульфогрупп в них. Предложены модифицированные методы сульфатирования. Доказана принципиальная возможность получения замещенных амидов уроновых кислот гетерогли-канов и их сульфатов. Получены и изучены соединения производных пурина - этадена и проксифеина, ионносвязанные с лютеланом, кри-ланои и их сульфатами.

Практическая значимость работы. Показано, что гетерополиса-хариды лютелан и крилан могут быть использованы в качестве исходных продуктов для получения фармакологически активных препаратов. Сульфаты лютелана и крилана способны связывать атерогенные липо-протеиды. Их образцы, содержащие 7-9& серы, по активности вдвое превышает гепарин. Разработан лабораторный регламент на получение сульфата лютелана - лютсулана. Показана эффективность соединений этадена с гетерогликанами и их сульфатами в сравнении с известными лекарственными средствами при лечении ран и ожогов у крыс, а также противоопухолевая активность соединений с прокси-феином.

Апробация работы. Результаты исследований доложены на Всесоюзных научных конференциях: "Современные направления развития биотехнологии" /Москва, 10-12 декабря 1991 г./, "Биологически активные соединения, синтез и использование" /Пенза, 28-29 сентября 1992 г./, на заседании Санкт-Петербургского научного общества микробиологов и эпидемиологов /1992 г./.

Публикации. Материалы диссертации опубликованы в двух сообщениях, одной статье.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов, библиографии и приложения. Работа изложена на -/¿У страницах, содержит ЛО таблиц, 4¿ рисунков. Библи- I ография включает источников, из них на иностранных языках.

- 3 -

Материалы и метода исследования

В работе использовали Cryptococcus luteolus IPO №0411 из коллекции Института ферментации г.Осака, Япония /продуцент лютелана/ и Cr. laurentii I8Q3-K из коллекции Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, г.Пущино /продуцент крилана/.

Для получения лютелана применяли питательную среду Голубе-ва /Голубев, 1972/. Ферментацию проводили в колбах Эрленмейера на 750 мл со 150 мл среды при 24°С и 220 об/мин в течение 5 суток. Полисахарид осаждали этанолом из освобожденной от клеток ферментационной массы и очищали диализом.

Крилан получали в соответствии с ранее разработанным лабораторным регламентом и фракционировали цетавлоном /Методы химии углеводов, 1967/. Содержание белка в полимерах определяли по методу Лоури / Lowry et al ., 1951/, О-ацетильных групп - по методу Хестрина / Hestrin., 1949/, относительную вязкость - с помощью вискозиметра Оствальда, оптическое вращение - на автоматическом поляриметре Perkin-Eimer -241 /Германия/.

Гель-хроматографию гликанов проводили на колонке /1х23/см с сефарозой 4В. Отбор фракций осуществляли на коллекторе фирмы lkb /Швеция/.

Для определения моносахаридного состава гликаны гидролизо-вали 2н. HgSO^ при Ю0°С в течение 4 часов и исследовали методом бумажной хроматографии на бумагеFN -II фирмы Filtrak в системе растворителей: н-бутанол:этанол:вода:аммиак /40:10: 49:1/.

Восстановление полисахаридов по карбоксильным группам проводили по методу Fasio et al., /1982/. Для определения строения глюкуроноксиломаннана использовали перйодатное окисление с последующим боргидридным восстановлением и полным кислотным гидролизом, метилирование по методу Хакомори исходного и восстановленного по карбоксильным группам крилана, а также серию деградаций /Захарова, Косенко, 1982/. Окисление ангидридом хромовой кислоты восстановленного глюкуроноксиломаннана после его аце-тилирования осуществляли методом Lindberg et al, /1979/. Продукты деградаций - основную цепь гетерогликана и альдоуроновые кислоты исследовали с помощью ^С-ЯМР-спектроскопии.

Смеси метилпроиэводных в виде ацетатов частичнометилирован-ных метилгликозидов анализировали ГЖХ при программировании температуры /120-220°/2°С/. Анализ проводили на хроматографе "Цвет-162" с использованием колонки /150,0х0,4/сы, наполненной хромато-ном Н-АИГ-ОМСБ С 3% ОУ-225.

Предварительную оценку вторичной структур полимеров проводили по методу сдаете е! а^ /1972/.

Сульфатирование гликанов вшолняли по методу, предложенному Бильдюкевичем и др., /1986/.

Ацилирование бензиламина этиловыми и метиловыми эфирами ге-терополисахаридов и их сульфатов осуществляли в этиловом спирте, продукты характеризовали с помощью ИК- и УФ-спектроскопии.

Соединения, содержащие этаден и проксифеин, получали при взаимодействии Н+-формы полимеров и их сульфатов с основаниями этадена и проксифеина. Препараты исследовали с помощью ИК-, УФ-и ПМР-спектроскопии.

Фармакологическую оценку соединений этадена с полисахаридами выполняли на моделях линейной кожной раны, плоскостной колено-мышечной раны и термических ожогов спины у крыс /Базарон, 1990/.

Спектры 13С-ЯМР, ПМР сняты на приборах Вгикег ас-200, вгикег схр-з с$Германия/, УФ-спектры - на спектрофотометре СФ-26, ИК-спектры суспензий веществ в вазелиновом масле - на спектрометре " Эресога 751К ".

Статистическую обработку данных проводили в соответствии с ГОСТ 11.004-74.

Результаты исследований

I. Изучение лютелана и крилана

Аспорогенные дрожжи базидиомицетового аффинитета сг. о1иэ и сг. 1аиге^и продуцируют сложные гетерогликаны, состоящие из двух фракций. Основная фракция включает манноэу, ксилозу и глюкуроновую кислоту /лютелан и крилан/. В состав минорной фракции входят манноза, ксилоза и галактоза. Содержание минорной фракции у лютелана не превышает 3%, тогда как у крилана составляет не менее 10$. Поэтому в дальнейшем использовали не фракци-

онированный лютелан{ исходный крилан очищали фракционированием цетавлоном. Характеристика полисахаридов приведена в табл.1.

Таблица I

Характеристика исходных гетерогликанов

Гликан Моносахаридный состав, Средний

Man Xyl GlcA Gal С. 0,25 /отн-выход,

Н20 Н20 г/ л

С.0,05

Лютелан 59 15 26 - -26,2° 3,3 6,0

С.0.,10

Крилан исходный 54 27 14 5 + 9,0° 5,0 7,0

Крилан 56 29 15 - +16,4° 4,2

Примечание. Содержание О-ацетильных групп, колебалось в лютелане от 6 до 13%, в исходном крилане от 0,5 до 1,556, в крилане после фракционирования - не выявлено.

Исходные полисахариды представляли собой порошки белого цвета без вкуса и запаха, растворимые в воде после предварительного набухания с образованием высоковязких растворов. При исследовании партий лптелана было установлено, что их стандартность существенно зависит от способа выделения полимера из нативного раствора. Наиболее сходными по критериям стандартности /вязкость, зольность, содержание примесей/ являлись партии полисахарида в натриевой форме, которые выделяли из нативного раствора после его подщела-чивания ИаОН до рН=8,0. Близкими свойствами обладал и крилан. Поэтому для получения производных предпочтительно было использовать полисахариды в натриевой форме.

Гетерогликаны криптококков - полимеры со скрытой регулярностью и, как и другие полисахариды, являются полидисперсными препаратами.

Строение лютелана установлено ранее /ВитОвская и др.,1988/: /-3/»<Шап /1~3/«*Шап /1-3/=<ВМап /1-ЗАШап /1-3/<*Шап /1-/

1Г ь к

Строение глюкуроноксиломаннана Сг. 1аиге^и 1803-К предстояло определить. Для этого получали относительно монодисперсную фракцию дополнительным фракционированием по молекулярным массам с помощью дробного осаждения этиловым спиртом. При структурном анализе использовали сочетание методов химии углеводов и ЯМР-епектро-скопии /схема приведена на рис.1/.

Так как при обработке крилана перйодатом натрия происходило сверхокисление, окислению подвергали восстановленный по карбоксильным группам полисахарид. При этом количество 1-3 гликозид-ных связей составляло 55,2%, 1-4 и/или 1-2 - 22,6%, 1-6 и/или нередуцирующих концевых групп - 22,2%; количество интактных к действию перйодата маннозных единиц коррелировало с содержанием маннозы в крилане.

Деградацией по Смиту была получена основная цепь полимера /кор/ и с помощью ^С-ЯМР-спектроскопии установлено, что она являлась о<-/1-3/-связанным маннаном /рис.1,1/. Аналогичный фрагмент был выделен из крилана при окислении ангидридом хромовой кислоты, что доказывало присоединение боковых цепей ^-связями.

После частичного кислотного гидролиза и последующей препаративной бумажной хроматографии был получен олигосахаридный фрагмент, строение которого определено С-ЯМР-спектроскопией и показано на рис.1 /П/. После сопоставления химических сдвигов углеродных атомов в ^С-ЯМР-спектре крилана с химическими сдвигами в спектрах маннана основной цепи, олигосахарида и с литературными данными для модельных соединений, а также результатов перйодатного окисления, метилирования, анализа фрагментов после различного рода деградаций мы сочли правомерным приписать элементарной структурной единице крилана возможное строение, приведенное на рисЛ Д/. Таким образом, крилан отличался от люте-лана соотношением остатков глюкуроновой кислоты и ксилозы в боковых цепях, а также характером связи ксилозы с маннозными единицами кора.

На основании комплексообразования полисахаридов с красителями /конго красный, акридиновый оранжевый/ было показано наличие упорядоченной структуры лютелана, исходного крилана и переход последнего в неупорядоченное состояние после его фракционирования цетавлоном.

К Р И Л А Н

\

\

полный перйодатное метилирование деградация гидролиз окисление по Смиту

ГЖХ

соотноше- соотношение ние моно- гликозидных сахаридов связей

ГЖХ

окисление частичный

хромовым кислотный

ангидридом гидролиз /1У/

13С-ЯМР-сп.

13

С-ЯЫР-сп.

соотношение метилпроиз-водных

строение основной цепи:

определение строение уЗ -связей олигоса-'боковых харида: цепей -¿Шап (1-3)-<Шап.

В

Р-»

13

С-ЯМР-сп.

1Ю1срА

-3) чШап (1 -3 )с*Л)Мап (1 -3) *БМап (1 -3 )«Шап (1 -

Ь

№С,1орА

ЙМу1

р

/III/

I

-О I

Рис Л. Схема структурного анализа крилана

2. Синтез и анализ модифицированных гетерогликанов

С£Льфата_гетерогликанов. Сульфатированию подвергали лютелан и крилан, процесс введения сульфогрупп контролировали с помощью ИК-спектроскопии. По сравнению с ИК-спектрами исходных полимеров в натриевой форме в ИК-спектрах производных появляется широкая полоса поглощения в области /1200-1300/см-^, которую можно отнести к сульфогруппам. Содержание серы определяли элементным анализом. При изменении концентрации реагентов и времени проведения реакции были получены образцы с содержанием серы 3,3-9,4%. По данным бумажной хроматографии /БХ/ сульфопроизводные, также как и исходные полимеры, содержали маннозу, ксилозу и глюкуроновую кислоту Сульфаты гликанов представляли собой белые или желтоватые поилки, растворимые в воде и ДМСО, не растворимые в этаноле и хлороформе. Их характеристика приведена в таблице 2.

Таблица 2

Характеристика сульфатированных лютелана и крилана

А" образца степень сульфати- рования ч растворимость в воде • , л ^отн. ■ Н2° зольность а /о С.0,25,Н. 1

I 2 3 4 5 6

Сульфаты лютелана С.0,1

I 0,64 растворим - 25,3 -24,0°

2 0,68 растворим 5,73 25,3 -16,7°

3 0,49 опалесцир. 1,38 21,5 -10,3°

4 0,40 растворим 2,02 24,4 -16,2°

5 0,38 опалесцир. 5,04 24,4 -20,4°

6 0,30 растворим 5,05 С.0,25 22,6 -20,2°

7 0,23 растворим 15,10 19,4 -27,8°

8 0,30 растворим 5,00 19,6 -23,6°

9 0,48 растворим 1,85 24,6 - 6,9°

Сульфаты крилана

1 0,44 не раствор. - 16,3 -

2 0,35 опалесцир. 5,55 17,2 +14,7°

3 0,20 опалесцир. 2,63 15,0 +15,3°

Продолжение табл.2

_____I__________2_______3_______4________5_______б________

4 0,43 растворим 3,12 21,8 +14,4°

5 0,44 растворим 1,33 22,3 +22,1°

Примечание. Сс - число сульфогрупп, приходящееся на моносахарид-ное звено полимера. При анализе гель-хроматографией сульфатов гетерогликанов было выяснено, что деструкция полимеров в ходе реакции зависит от условий ее проведения и увеличивается с уменьшение?* количества растворителя в реакции.

Местоположения сульфогрупп в анализируемых соединениях определяли с помощью С-ЯМР-спектроскопии сульфатов гетерогликанов и продуктов их деградации по Смиту /табл.3/.

Таблица 3

Значения химических сдвигов углеродных атомов <?<-манно-пиранозильных остатков продуктов деградации по Смиту гликанов и их сульфатов

№ Образец Химический сдвиг, м.д.

С-1 С-2 С-3 С-4 С-5 С-6

Кор лютелана 103.0 70.6 79.1 - 67.1 74.5 62.0

6 Кор- сульфата лютелана 102.9 70.5 79.1 66.9 74.3 61.8

100.6 76.3 72.2

7 Кор сульфата лютелана 102.9 70.5 78.9 66.9 74.3 61.8

100.8 76.8 71.9 73.5 70.5

Кор крилана 102.5 70.3 "8.9 66.9 74.2 61.8

2 Кор сульфата крилана 102.9 70.5 79.1 66.8 74.3 61.8

72.2 68.4

Примечание. Спектры сняты в б20 , при 25°С, значе ¡я химических сдвигов приведены относительно 4,4-диметил-4-силапен-тан-1-сульфоната натрия /г>23 /.

Поскольку анализ сульфатированных гликанов затруднен, были получены коры сульфопроизводных дютелана и крилана, которые представляли собой 1-3-связанные сульфатированные макнаны. При их исследовании было показано, что в ходе проведения реакции сульфо-

группы могут присоединяться по С^ и/или С^ углеродным атомам ман-нозных единиц основной цепи, незамещенных остатками ксилозы и глюкуроновой кислоты, а также в положение С^ маннозного звена.

Синтезированные соединения проявили активность в тесте связывания атерогенных липопротеидов, причем образцы с содержанием серы 7-9% оказались в два раза более эффективными по сравнению с гепарином.

На наиболее активное соединение - сульфат лютелана, названный лютсуланом, был разработан лабораторный технологический регламент.

Амиды уроновых кислот гет§рогликанов._Для оценки способности карбоксильных групп полисахаридов вступать в реакции синтеза замещенных амидов были синтезированы этиловые, метиловые эфиры ге-терогликанов и их сульфатов. С целью ацилирования бензиламина, взятого в качестве модельного соединения, были отобраны эфиры с наибольшей степенью этерификации карбоксильных групп /табл.4/.

Таблица 4

Результаты реакции эфиров гетерогликанов и их сульфатов

с бензиламином

Образец Содержание % этери- % прореа-

уроновых С_ фикации гировав-

кислот СООН-гр. ших эфи-

ров

Этиловый эфир лютелана 0,26 0,18 70 0,04 22

Этиловый эфир лютелана 0,26 0,22 85 0,02 9

Метиловый эфир сульфа-

та крилана 0,14 0,08 57 0,08 100

Примечание. Сэ - число сложноэфирных групп, приходящихся на мономерное звено полисахарида,

- содержание бензиламина в амидах, моль/моль полисахарида .

Таким образом, показана принципиальная возможность получения замещенных амидов гетерогликанов и их сульфатов.

_Со^инения_этадена_и_проксифеина_с_полисах фатами. Так как известно, что полисахариды обладают активирующим,

детоксицируицим и пролонгирующим действием в отношении низкомолекулярных лекарственных препаратов, мы получили ионносвязанные соединения гетерогликанов и их сульфатов с этаденом и прокси-феином.

Этаден и проксифеин - соединения пуринового ряда:

ш2

Ш-СН2-СН20Н'НВг*Н20

этаден

о рн

3

сн^ проксифеин

Этаден и проксифеин разработаны в СПХШ. Первый из них стимулирует процессы репарации путем активирования биосинтеза нуклеиновых кислот. Его промышленный выпуск осуществлен в 1985 году. Второй обладает противоопухолевым действием; завершены две фазы его клинических испытаний.

После получения соединений гетерогликанов с этими препаратами путем смешения водных растворов Н+-формы полисахаридов и их сульфатов с основаниями лекарственных веществ и последующего осаждения продуктов реакции этанолом контролировали факт и характер связывания эгадена и проксифеина с полимерными носителями. Данные представлены в табл.5,6.

Таблица 5

Данные ПМР-спектроскопии для этадена и его соединений с гетерогликанами и их сульфатами

Соединение Химический сдвиг, м.д.

С2Н

Этаден /основание/ 8,1

Этаден / соль / 8,3

Лютелан - этаден 8,3

Сульфат лютелвна - этаден 8,3

Сульфат крилана - этаден 8,3

Таблица 6

Данные ПМР-спектроскопии для проксифеина и его соединений с гетерогликанами и их сульфатами

Соединение Химический сдвиг, м.д.

H/CHg/g NCH2 C-CHg-C

Проксифеин /основание/ 2,5 2,6 2,1

Проксифеин /соль/ 3,1 3,5 2,5

Лютелан - проксифеин 3,0 3,4 2,4-

Сульфат лютелана - проксифеин 3,0 3,4 2,4

Крилан - проксифеин 3,0 3,4 2,4

Сульфат крилана - проксифеин 3,0 3,4 2,4

Примечание. В табл.5,6 спектры сняты в 1>20ПрИ 80°С, значения химических сдвигов приведены относительно с33 .

Сопоставляя полученные данные по химическим сдвигам протонов групп, чувствительных к солеобразованию /табл.5,6/, можно сделать вывод о существовании в полученных соединениях ионной связи.

Соединения гетерогликанов с этаденом и проксифеином представляли собой белые или слабожелтые аморфные вещества, физико-химические характеристики которых определялись полимером-носителем. Они лучше набухали в воде, чем исходные полимеры, в концентрациях выше 2% образовывали гели. Результаты изучения образцов приведены в табл.7.

Таблица 7

Характеристика соединений гетерогликанов и их сульфатов

с этаденом и проксифеином

Соединение Характеристика исходных Характеристика продук-

полимеров тов реакции

содержание % прореа-

уроновых сульфатных гировавших

кислот групп кислотных

групп

I 2 3 4 Ь

I. Соединения с этаденом лютелана 0,26 0,182 70

Продолжение табл.7.

I 2 3 4 5

сульфата лютелана 0,26 0,30 0,529 94

крилана 0,14 - 0,031 22

сульфата крилана 0,14 0,32 0,421 75

2. Соединения с проксифеином

лютелана 0,26 - 0,113 43

сульфата лютелана 0,26 0,30 0,478 85

крилана 0,14 - 0,054 38

сульфата крилана 0,14 0,44 0,186 33

Примечание. - содержание этадена и проксифеина в полученных соединениях, моль/моль полисахарида Содержание лекарственного вещества в некоторых образцах не соответствовало рассчитанному, исходя из количества кислотных групп в полимере. В случае соединений с проксифеином это можно объяснить гидролитической диссоциацией солей и вымыванием проксифеина при осаждении полученных соединений этанолом. В случае соединений с этаденом в процессе реакции могло наблюдаться неполное связывание, поскольку этаден представляет собой гораздо более слабое основание, чем проксифеин. Однако, содержание этих производных пурина в конечных продуктах составляло не менее 5%.

Соединения проксифеина с гетерогликанами и их сульфатами проявляли противоопухолевую активность, превышающую активность самого проксифеина.

3. Биологическая активность соединений этадена с гетерогликанами и их сульфатами При оценке биологической активности соединений этадена на моделях линейной кожной раны, плоскостной кожно-мьнпечной раны и термических ожогов спины у крыс было показано, что во всех этих тестах полученные препараты проявляли активность более высокую, либо близкую к активности препаратов сравнения. Следует отметить преимущества применения полисахаридных соединений этадена в виде гелей, которые легко впитывались, образовывали защитную пленку и не вызывали болезненных ощущений при обработке

ран. При тензиометрической оценке состояния линейных ран /табл.8/ можно было заключить, что использование соединений эта-дена с гетерогликанами приводило к увеличению прочности рубца в среднем в два раза по отношению к контролю. Это сравнимо с увеличением прочности рубца в случае лечения раствором этадена, эта-деновой мазью и линиментом бальзамическим по Вишневскому.

Таблица 8

Оценка биологической активности соединений этадена с гетерогликанами и их сульфатами на модели линейной кожной раны

Группа животных, препарат Число Данные тензиомет- Частота за-

живот- рии, г растения

ных ран первич-

ным натяже-

нием, %

Интактные крысы 15 295,3 + 36,2 13,3

Раствор этадена, 1% 10 512,0 + 43,3 50,0

Этаденовая мазь, 5% 6 650,0 + 41,9 33,3

Крилан - этаден 9 534,4 + 83,4 55,6

Лютелан - этаден 10 489,0 + 59,5 80,0

Сульфат лютелана - этаден 10 458,0 + 54,1 70,0

Линимент бальзамический по

Вишневскому 8 638,3 + 88,0 37,5

Примечание. Р^0,05

К преимуществам полисахаридных препарэтов этадена следует отнести увеличение частоты зарастания ран первичным натяжением по сравнению с другими препаратами, что дает хороший косметический эффект: у большинства животных рубец тонкий, эластичный, малозаметный.

Результаты, полученные в тесте линейной раны, были подтверждены данными по лечению экспериментальных плоскостных ран. В первой фазе течения раневого процесса наибольшую эффективность показал лютелан-этаден, а в стадии регенерации более эффективным было применение крилан-этадена.

Использование полисахаридных препаратов при лечении термических ожогов ША - 111В степени в значительной мере ограничивало деструктивные процессы в начальной стадии заболевания; Наблюдалась локализация воспалительного процесса в ране под струпом, после

контроль

раствор этадена, 1%

этаденовая мазь,

Ъ%

крилан - этаден

лютелан - этаден

сульфат лютелана - этаден

линимент бальзамический по Вишневскому

Рис.2. Оценка биологической активности соединений этадена с гетерогликанами и их сульфатами на модели ожогов спины у крыс в - отличия от контроля статистически значимы

отторжения которого регенеративные процессы /и, в частности, эпи-телизация/ были ускорены'. На рис.2 дана оценка влияния исследованных препаратов на относительный весовой коэффициент /ОБК/ поверхности ожоговых ран, рассчитанный по формуле:

ОБК -----— х ЮС$, где

Мо

Мд - масса выкройки, снятой в момент времени I

М0 - масса выкройки, снятая с раны в день ее нанесения.

Направленность действия всех полисахаридных препаратов эта-дена одинакова: они ограничивали расширение пораженной поверхности ожоговой раны на начальном этапе заболевания и ускоряли заживление ожогов в дальнейшем. Применение соединений этадена с гетерогликанами сокращало сроки течения болезни в среднем на 10 дней. Наибольшую активность проявил сульфат лютелана-этаден, при лечении которым отмечалось быстрое уменьшение поврежденной поверхности по сравнению с исходной площадью ожога, начиная с 27 суток. Аналогичные результаты были получены и при лечении ожогов линиментом бальзамическим по Вишневскому, но в этом случае значительно тяжелее протекала первая фаза болезни, иногда даже со смертельными исходами /как и в контроле/.

Более благоприятная динамика заживления ожоговых ран при использовании полисахаридных препаратов этадена по сравнению с раствором этадена и этаденовой мазью явилась свидетельством существенного вклада в конечный результат действия полисахаридных компонентов, что, возможно, связано с их иммуномодулирую-щими и пролонгирующими свойствами. Большая эффективность сульфат лютелана-этадена по сравнению с другими полисахаридными препаратами, по-видимому, объясняется наличием в нем сульфогрупп и большим содержанием этадена.

ВЫВОДЫ

I. Аспорогенные дрожжи базидисмицетового аффинитета -Сгур-Ьососсиз 11^ео1иэ и Сг. 1аигеп1;11 - продуцируют смеси экзогликанов, основными фракциями которых являются лютелан и крилан, обладающие приближенно сходной структурой.

2. Установлено строение крилана: к о<-/1»3/-связанным ман-нозным единицам основной цепи присоединены остатки у">-Р-глюкуро-новой кислоты в положение С^, а остатки ^-Ф-ксилозы в положения С2 и С4.

3. Изучены возможности химической модификации гетероглика-

нов:

а/ синтезированы сульфопроизводные лютелана и крилана; показано, что при проведении реакции сульфогруппы могут присоединяться по Cg и/или С^ углеродным атомам маннозных единиц основной цепи, незамещенных остатками ксилозы и глюкуроновой кислоты, а также в положение Cg маннозного звена;

б/ доказана принципиальная возможность получения замещенных амидов уроновых кислот гетерогликанов и их сульфатов;

в/ получены ионносвязанные соединения гетерогликанов и их сульфатов с этаденом /ранозаживлящее средство/ и проксифеином /противоопухолевое средство/, содержание которых в конечных продуктах составляет не менее

4. Установлено:

а/ сульфатированные производные гетерогликанов связывают атерогенные липопротеиды, причем образцы с содержанием серы 7-9% проявляют активность вдвое превышающую гепарин;

б/ соединения этадена с гетерогликанами и их сульфатами на моделях ран и ожогов у крыс проявляют более выраженный лечебный эффект, чем этаден;

в/ соединения проксифеина с полисахаридами обладают противоопухолевой активностью.

5. Разработан лабораторный регламент на получение сульфа-тированного лютелана - лютсулана.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Воротынская G.J1., Витовская Г.А., Ананьева Е.П., Торга-шев В.И., Иозеп A.A. Получение и исследование биологически активных дрожжевых полисахаридов и их производных // Современные направления развития биотехнологии. Тез.докл.Всесоюзн.конф. - М, 1991. - С. 96.

2. Воротынская C.JL, Витовская Г.А., Ананьева Е.П., Гир-пович М.З., Иозеп A.A. Получение и исследование свойств биологически активных дрожжевых гетерогликанов // Биологически ак-

тивные соединения, синтез и использование. Тез.докл.Всесоюзн. конф. - Пенза, 1992. - С. 44.

3. Воротынская С.Л., Витовская Г.А., Ананьева Е.П. Изучение свойств полисахарида, образуемого дрожжами Cryptococcus luteolus /Salto/ Skinner //МИКОЛОГИЯ И фитопатология. -1992. - Т.26, вып.5. - С. 367-371.

Выражав глубокую благодарность за помощь, оказанную при выполнении диссертационной работы с.н.с. Ы.З.Гиршовичу, с.н.с. Н.Ю.Фроловой, профессору Б.А.Ивину /СПХФИ/, профессору В.Е.Ры-женкову /НИИЭМ РАМН/.

Ротапринт ПКТИ С-ПСК, зак.1-сп., тир.100, 23.02.93.