Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности Cryptococcus luteolus (Saito) Skinner с связи с продукцией лютелана

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Особенности Cryptococcus luteolus (Saito) Skinner с связи с продукцией лютелана"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И МЕДИЦИНСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ХИМИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи

Григорьянц Александр Олегович

ОСОБЕННОСТИ CRYPTOCOCCUS LUTEOLUS (SAITO) SKINNER В СВЯЗИ С

ПРОДУКЦИЕЙ ЛЮТЕЛАНА 03.00.07 - микробиология )f)

%

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург, 1995

Работа выполнена на кафедре микробиологии Санкт-Петербургского химико-фармацевтического института (ректор - проф. Г.П.Яковлев)

Научный руководитель: доктор биологических наук, з.д.н. РФ, академик СПбИА, профессор Н.П.Елинов.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Ведущая организация: Санкт-Петербургский государственный технологический институт - техн. университет, кафедра технологии микробиологического синтеза.

циализированного Совета К-084.63.01 Санкт-Петербургского химико-фармацевти-чиского института (197376, Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова, 14,).

С диссертацией можно ознакомиться: в научной библиотеке СПХФИ

Яковлева Елена Павловна; кандидат биологических наук Меледина Татьяна Викторовна

Защита состоится *

1996 г. часов на заседании спе-

Автореферат разослан 1996 г.

Ученный секретарь специализированного совета: кандидат биологических наук

Н.В.Кириллова

Общая характеристика работы.

Данная работа является продолжением исследований, проводимых на кафед->е микробиологии Санкт-Петербургского химико-фармацевтического института по «учению биосинтеза, химического строения и биологической активности дрожжевых шеклеточных полисахаридов.

Актуальность проблемы. Экзогликаны, продуцируемые различными группами микроорганизмов, в настоящее время широко используются в качестве вспомогательных веществ в фармацевтической, косметической, пищевой, нефтедобывающей промышленности, а так же в медецине в качестве профилактических и лечебных средств. Для этих целей представляют определенный интерес гетерогликаны, образуемые криптококками - сапрофитными базидиомицетовыми дрожжами. Водные растворы гетерогликанов обладают сравнительно высокой вязкостью, что делает их перспективными в качестве загустителей кремов, мазей, стабилизаторов эмульсий и суспензий. Кроме того, они не токсичны, проявляют иммуномодулирующие, антивирусные и детоксицирующие свойства. Наличие карбоксильных групп открывает широкие возможности для использования их в качестве ковапентно связянных носителей для низкомолекулярных лекарственных веществ, а так же для химической модификации этих полимеров.

Сапрофитные криптококки в аноморфном состоянии достаточно стабильны при выращивании и хранении в лабораторных условиях. Однако, их физиологические особенности и продуктивность по экзогликанам (при различных параметрах выращивания продуцентов) остаются мало исследованными.

Проблема "Микробные полисахариды" в приложении к криптококковым гете-рогликанам актуальна для более глубокого изучения биологии базидиомицетовых дрожжевых организмов, для синтеза и технологии получения полимерных углеводов в приложении к интересам в областях фармации и медицины.

Цель данной работы заключалась в изучении оптимальных условий для биосинтеза лютелана - внеклеточного полисахарида образуемого культурой Сг.11Лео1из мтамм 228. По предварительным данным, этот штамм способен накопливать в куль-турапьной жидкости значительное количество экзогликана.

Задачи исследования: 1. Исследовать биосинтез лютелана в зависимости от качества и количества различных источников питания; 2. Изучить влияние физико-химических факторов на процесс биосинтеза полимера; 3. Провести оптимизацию процесса биосинтеза экзогликана; 4. Изучить реологические характеристики лютела-

на.

Научная новизна и практическая значимость. Изучено влияние вида и концентрации источников углеродного и азотного питания на образование полисахарида Cr.luteolus - доказано, что лютелан синтезируется культурой в питательных средах со всеми избранными веществами. Однако, дисахариды стимулируют биосинтез, а гид* ролизат крахмала и нитратный азот угнетают образование лютелана. Повышение содержания глюкозы в среде сопровождается увеличением количества полисахарида, но эффективность процесса (по глюкозе) снижается.

- Показано, что для образования лютелана культура Cr.luteolus нуждается в ионах магния. Другие изученные микроэлементы (марганец, железо, кальций) влияют только на образование биомассы клеток продуцента.

- В изученном диапазоне концентраций наиболее значимыми факторами для биосинтеза лютелана являются («держание глюкозы, аммония сульфата, магния сульфата и неорганического фосфора в среде.

- Оптимизирован состав среды для образования лютелана. Разработана и предложена среда, обеспечивающая 50% увеличение количества нативного полисахарида, при 10% снижении его стоимости.

- Составлена математическая модель биосинтеза лютелана культурой Cr.luteolus, которая может быть использована для динамического управления процессом образования полисахарида.

- Изучены реологические характеристики водных растворов полисахарида в диапазоне концентраций 0,1 -1%.

Публикации: материалы данной диссертации опубликованы в 3 лестных работах.

Объем и структура работы: диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста. Содержит 23 таблицы и 30 рисунков. Список литературы 239 наименований.

Экспериментальная часть.

Объекты и методы исследования. В работе использовали штамм №228 Cr.luteolus (Saito) Skinner. Культура была получена из коллекции микроорганизмов кафедры микробиологии Санкт-Петербургского химико-формацевтического института. По морфологическим признакам она соответствует описанию, данному в работе (Голубев, 1980). Штамм 228 Cr.luteolus хранили в пробирках диаметром 20 мм, содержащих 5 мл скошенного сусло-агара при температуре +4 вС. Пересев его при

длительном хранении проводили 1 раз в 6 месяцев. Для получения посевного материала использовали культуру в пробирках на скошенном сусло-агаре после однократного пересева из пробирок длительного хранения и инкубирования в течении 2* суток при 24-25 °С в термостате. Посевной материал выращивали на среде следующего состава (г/л дистиллированной воды): глюкоза - 50,0, (NH^SCU - 2,0, КН2Р04-2Нг0 - 3,56, Na2HP04-2H20 - 7,22, MgS04-7H20 - 0,5, NaCf - 0,5, CaCI2-2H20 -0,001, MnCI2-4H20 - 0,0015, FeS04-7H20 - 0,01, дрожжевой экстракт - 0,4. Среду стерилизовали при 147,1 кПа в течении 30 минут, рН среды до стерилизации 6,9-7,1.

Посевной материал выращивали в колбах Эрленмейера, объемом 750 мл, на качалках (220 об/мин) при температуре 24-25 "С в течении 48 часов. В колбы вносили 50-200 мл среды, в зависимости от требуемого количества посевного материала. Для засева посевной колбы использовали взвесь культуры в стерильной дистиллированной воде (5 мл) из одной пробирки. Ферментацию проводили в колбах Эрленмейера, объемом 750 мл, содержавших 50-200 мл среды в зависимости от целей опыта. Состав среды аналогичен составу среды для выращивания посевного материала. Посевной материал вносили в количестве 5-10 % к объему среды.

Ферментацию проводили при непрерывном встряхивании на качалках (220 об/мин) при температуре 24-25 °С. Продолжительность культивирования 120 часов. Все опыты проводили в 3-4* кратной повторности. Пробы ферментационной массы для определения биохимических показателей процесса отбирали стерильно каждые 24 часа.

Значения рН культуральной жидкости устанавливали потенциометрически. Количество биомассы клеток продуцента определяли по оптической плотности разведенной в 100 раз культуральной жидкости при длине волны 560 нм на спектрофотометре СФ-26.

Содержание "нативного* (с клетками продуцента) полисахарида определяли гравиметрическим методом. Определенный объем культральной жидкости осаждали 96% этанолом, осадок отделяли фильтрацией под вакуумом, сушили при 40-60 °С в течении 24 часов и взвешивали.

Редуцирующие вещества определяли по реакции с динитросалициловой кислотой (Шапиро, 1976) или ортотоллуидиновым реактивом (Методы экспериментальной микологии, 1982). Концентрациюлонов NH«* реактивом Несслера (Методы общей бактериологии, 1984).

Лютелан выделяли из культуральной жидкости, предварительно разведенной

дистиллированной водой в 1,5-2 раза, в зависимости от вязкости ферментационной массы. Клетки продуцента осаждали центрифугированием при 6000 об/мин в течении 20 минут. Супернатант упаривали в 4-5 раз на вакуумном роторном выпарном аппарате (вакуум 0,6-0,8 ат, температура кипения 60-80 "С). Лютелан осаждали 2-2,5 объемами 96% этилового спирта при температуре 18-20 °С. Образовавшийся осадок отделяли декантацией и/или на центрифуге при 3000 об/мин в течении 10 минут. Осадок обезвоживали этанолом или ацетоном, растирали в фарфоровой ступке и сушили при 40-60 °С.

Полный кислотный гидролиз полисахарида проводили 2Н серной кислотой. Для этого 10 мг полисахарида с 0,5 мл 2Н НгЭО* помещали в запаянную ампулу (объем ампулы 1 мл) и выдерживали 4 часа при 100 °С на водяной бане. Гидролизат разбавляли 0,5 мл дистиллированной воды и нейтрализовали карбонатом бария до нейтральных значений рН (по индикаторной бумаге). Осадок сульфата бария отделяли при 3000 об/мин в течении 15 минут на центрифуге. Полученные смеси моносахаридов использовали для качественного и количественного определения индивидуальных моноз.

Качественный анализ смеси моносахаридов проводили методом восходящей тонкослойной хроматографии на пластиках ЭНирЬо! 50x120 мм. Система растворителей н-пропансл-вода=17:1 Использовали двукратное пропускание системы растворителей. Пятна моносахаров проявляли кислым фталатом анилина (Захарова, Косенко, 1982).

Количественный состав смеси монноз определяли бумажной хроматографией на бумаге РЫ-И в системе растворителей н-бутанол-уксусная кислота-вода=9:1:4; использовали трехкратное пропускание сивтемы растворителей. Хроматограммы проявляли кислым фталатом анилина, пятна моносахаров элюировали 80% раствором этанола в 2Н соляной кислоте. Концентрацию моносахаридов определяли по оптической плотности раствора при 390 нм для маннозы и глюкуроновой кислоты и при 360 нм для ксилозы (Захарова, Косенко, 1982).

Содержание белка в образцах определяли по методу Варбурга и Кристиана по оптической плотности при 260 и 280 нм (Хансон, Филлипс, 1984).

Зольность определяли после сжигания навески полисахарида в фарфоровом тигле при температуре 500 °С в течении 6 часов.

Молекулярно-массовое распределение в образцах полисахаридов определяли гель-хроматографией на колонке (0,8x20 см) наполненной Сефарозой 4В. На колонку

наносили 0,3 мл 0,2-0,25 % раствора полисахарида. Скорость элюции составляла 5-8 мл/Ч. Элюент - дистиллированная вода. Свободный объем колонки определяли по ДНК. Фракции собирали по 0,5 мл. Определение полисахарида в них проводили по реакции с фенол-серной кислотой (Захарова, Косенко, 1982). Экстинкцию определяли на спектрофотометре СФ-26 при 490 нм. Так же использовали для гель-хроматографии систему 1Мсогс1. Предварительно поверяли возможность регистрации полисахарида детектором в ультрафиолетовой области.

Вязкость водных растворов полисахарида измеряли на вискозиметре Оствальда с диаметром капилляра 0,99 мм, а так же на приборе Реотест с цилиндровым измерительным устройством "М", объемом 10 мл. Образцы для измерения вязкости готовили следующим образом: навеску полисахарида растворяли в дистиллированной воде и осаждали взвешенные частицы на центрифуге (16 000 об/мин в течении 40 мин).

Для определение кривой растворимости лютелана навеску около 50 мг люте-лана помещали в предварительно взвешенную центрифужную пробирку, снабженную пробкой, и заливали 5 мл выбранной смеси растворитель-осадитель. Смесь в пробирке, периодически взбалтывая, оставляли стоять при комнатной температуре до следующего утра. Затем ее подвергали центрифугированию - 6000 об/мин в течении 60 минут. Осадок промывали применяемой смесью растворитель-осадитель и сушили до постоянного веса при 60-80 °С.

Результаты и их обсуждение.

Влияние состава среды и условий культивирования на биосинтез лютелана.

Изучение влияния источников углерода и азота на синтез полисахарида культурой Сг.МеоЬз проводили, внося их вместо глюкозы и пептона в исходную среду Голубева в количестве 50 и 2 г. соответственно. Результаты представлены в таблицах 1 и 2, из которых следует, что синтез лютелана имеет место при использовании практически всех испытанных источников питания, хотя и в различной степени. Также отмечено, образование полисахарида на средах с гидролизатом крахмала и подсолнечным маслом, но в столь незначительном количестве, что это не представляло интереса в связи с целями данной работы. Отмечена некоторая стимуляция синтеза при использовании сред с дисахаридами в качестве единственных источников углерода. Повышение концентрации глюкозы в среде, в целом, увеличивало общий выход полимера, но при этом значительно снижался процент преобразования глюкозы в биомассу и полисахарид. Наибольшее количество нативного лютелана отмечено

Таблица 1. Влияние источников углерода на биосинтез лютелана.

№ Источник углерода Биомасса Нативный полисахарид

г/л %от контроля г/л % от контроля

1 Галактоза 7,0±0,7 83,2 8,6±2,1 51,8 .

2 Гидролизат 3,1±0,3 36,7 - -

крахмала

3 Глюкоза 8,4±1,3 100,0 16,6±1,3 100,0

4 Ксилоза 6,7±1,8 79,4 9,1±0,1 55,1

5 Лактоза 3,3±1,2 39,0 6,3±0,6 37,9

6 Мальтоза 8,9±1,3 105,6 17,7±0,7 106,7

7 Маннит 11,4±0,8 135,1 25,8±0,3 155,9

8 Манноза 9.9±1,2 117,3 15,3±1,5 92,2

9 Натрия ацетат 0,8±0,4 9,8 10,4±0,5 63,0

10 Подсолнечное 3,6±0,7 42,6 - -

масло

11 Сахароза 7,2±0,2 84,3 20,7±1,8 124,8

12 Сорбит 7,0±1,3 83,2 10,1±0,4 60,7

Таблица 2. Влияние источников азота на биосинтез лютелана.

№ Источник азота Биомасса Нативный полисахарид

г/л % от контроля г/л % от контроля

1 Аммония 8,4±2,4 99,5 14,9±0,8 90,1

сульфат

2 Аммония 8,3±1,5 98,3 15,8±0,1 95,3

хлорид

3 Кукурузный 4,0±1,8 47,4 6,0±0.5 36,2

экстракт

4 Мочевина 11,9±2,9 141,0 17,6±1,1 106,9

5 Натрия 6,7±4,1 79,4 1,3±0,7 8,1

нитрат

в Пептон 8,4±1,3 100,0 16,6±1,3 100,0

|ри концентрации глюкозы в среде 80 г/л, самая высокая биосинтетическая актив-юсть при 20 г/л, при концентрациях глюкозы выше 80 г/л снижаются как прирост ¡иомассы клеток и количество нативного полисахарида.

Среди источников азотного питания оптимальными для биосинтеза лютелана ¡ыли пептон и соли аммония, на которых количество образованного полимера фак-ически одинаково. Увеличение отношения С:М в среде, в целом, благоприятно ска-1Ывалось на биосинтетической активности продуцента. Однако, следует отметить, но если начальная концентрация аммония сульфата в среде менее 0,5 г/л, то проводит значительное угнетение роста культуры и биосинтеза ею лютелана.

Входящие в состав среды микроэлементы и экстракт БВК (фактор роста) не-зказывают существенного воздействия на количество образованного Сг.!и1ео!из полисахарида. Исключением являются ионы магния, отсутствие в среде которых при-50дит к снижению выхода целевого продукта на 30%. Повышение количества магния сульфата в среде сверх 0,3-0,5 г/л не приводит к стимуляции биосинтеза, очевидно, юны магния включаются в биосинтез лютелана в качестве кофакторов, не оказывая трямого действия на образование полимера.

Оптимальная рН среды для биосинтеза лютелана до стерилизации составляет 7-7,2. Аэрация не оказывает существенного воздействия на биосинтез. Повышение температуры отрицательно сказывается как на росте культуры СгМео1из, так и на эбразовании лютелана.

Оптимизация состава среды для биосинтеза лютелана. В качестве исходной для оптимизации была взята среда Голубева. Для выбора факторов оптимизации был проведен отсеивающий эксперимент по методу случайного баланса, так же найдены коэффициенты корреляции интересующих нас выходных параметров с концентрациями всех компонентов среды. Обозначения факторов приведены в таблице 3. На основании этих данных в план эксперимента были включены концентрации глюкозы, фосфора, аммония сульфата, а так же магния сульфата. Количество экстракта БВК было оставлено на том же уровне, что и в среде Голубева, остальные компоненты были исключены как не имеющие существенного влияния на процесс.

Оптимизацию проводили в соответствии с планом для полного факторного эксперимента с уточнением положения точки оптимума рототабельным планированием второго порядка. Расчет коэфициентов проводили с помощью програм-мь^фгарМсз 3.0. В качестве критерия оптимизации была выбрана обобщенная функция желательности, составленная из количества нативного полисахарида в кон

Таблица 3. Обозначение и интервалы варьирования факторов.

Фактор Обозначение Центр плана г/л Интервал варьирования факторов

глюкоза Х1 60 20

(NN4)2804 Х2 2.5 1

Мдв04 ХЗ 0,5 0,2

КН2РО4 №2НР04 Х4 25 5

це процесса, отношения нативный полисахарид/биомасса (биосинтетическая активность продуцента) и отношения нативный полисахарид/ глюкоза (максимизация потребления глюкозы). Индивидуальные функции отклика процесса пересчитывали в частные функции желательности по формуле: с!=ехр(-ехр(Ь0+Ь1у)). Наилучшему и наихудшему значениям отклика в плане эксперимента присваивали значения 0,63 и 0,2 соответственно; исходя из этих значений рассчитывали коэффициенты Ь0и Ь1а

Обобщенную функцию желательности й находили как среднее геометрическое частных функций О = -62 -63.

В результате расчета получено следующее уравнение регрессии: 0=0,0045Х,+0,0193X^-0,00003X^-0,0001 бХ^-О.ООООТХ^ Влияние всех остальных факторов оказалось не значимым. Уравнение регрессии адекватно экспериментальным данным (критерий Фишера Р=608,8) и может быть использовано для описания процесса биосинтеза полисахарида в исследованной области. Соответствующая поверхность отклика представлена на рисунке 1. С учетом уточненного количества фосфатов, превышение которого ведет к синтезу побочного продукта (20 г/л), предлагаем следующий состав среды как оптимальный для биосинтеза лютелана (г/л дистиллированной воды): глюкоза - 65, (ЫН4)2Э04 - 2,5, МдБО< • 7Н20- 0,5, КН2РО< - 6,43, №2НРОч -13,06, экстракт БВК - 0,6. Данная среда обеспечивает увеличение количества синтезированного культурой Сг.1и1ео1из лютелана на 50% при 10% снижении затрат на 1 г. полученного продукта.

Подлинность синтезируемого на оптимальной среде лютелана доказывали с помощью тонкослойной хроматографии гидролизованных образцов полимера и гель-хроматографии. По всем этим показателям (моносахаридный состав и размер молекулы) лютелан синтезируемый культурой на оптимизированной среде не отличается

Рисунок 1. Поверхность отклика для обобщенной функции желательности.

от контрольного, полученного на среде Голубева.

Математическое описание процесса биосинтеза. Составление математической

модели процесса является одним из методов его оптимизации, так как позволяет динамично упраалять процессом биосинтеза целевого продукта. Рост биомассы кпэток Сг.МеЫиз опксывали с помощью уравнение топчстич&ской кривой Ферхюльста (¡X

— = КХ(1-рХ), гдэ X - биомасса, К и В коэффициенты, определяющие параметры

ее накопления. Интерпретация их следующая: К - максимальная скорость роста в данных условиях, 0 - предельная емкость среды (соответствует предельной плотности популяции клеток при исчерпании всех ресурсов среды). Для определения коэффициентов использовали графо-аналитический метод (Еейли, Оллис, 1989). Коэффициент р: р=1/Хтзх, Хтах - максимальное количество биомассы во время стационарной фазы роста. В результате получено следующее уравнение:

■ = 0,071Х(1 -0.102Х), соответствие уравнений экспериментальным данным показано на рисунке 2. Списание скорости накопления полисахарида провели по уравнению ¿р г>Х

Людекинга-Пайрета: —- = а—+рх. Коэффициенты уравнения интерпретировали СП СГС

следующим образом: а - вклад вносимый в образование продукта растущими и р - не

—¿1— биомасса, модель д биомасса, опыт

—□—полисахарид, модель щ полисахарид, опыт

Рисунок 2. Сопоставление опытных и расчетных данных по росту Cr.luteolus и биосинтезу лютелана.

растущими клетками продуцента. Коэфффициенты модели находили так же графоаналитическим методом. Получены следующие уравнения: для нативного полисахарида - ^ = 3,12 — -0.01Х; для чистого полисахарида - 1,79—-0.00015Х. Та-dt dt dt dt

ким образом синтез лютелана сопряжен с ростом биомассы клеток продуцента; более того, при выходе культуры на стационарную фазу полисахарид деполимеризует-ся клетками Cr.luteolus. Деградация лютелана культурой ярко выражена при выращивании Cr.luteolus при дефиците глюкозы (начальная концентрация 5 г/л), полисахарид обнаружевается в культуральной жидкости на вторые сутки ферментации, в то время как на третьи сутки осадить его не удается. В связи с этим мы считаем целесообразным сократить время ферментации со 120 до 96 часов, соответствующих максимальному содержанию лютелана в культуральной жидкости.

Для целей математического моделирования возраст культуры (X) предложено выражать, исходя из следующего соотношения (Федосеев, 1977): t

JX(t)dt

Xt

-, где X(t) - функция зависимости количества биомассы клеток от

времени, Х( - количество биомассы клеток во время I По этой модели, возростание биомассы связывается с появлением новых клеток, которые живут, не погибая (если

нет убыли их биомассы) до конца процесса; X - "средний кумулятивный возраст" культуры, и, благодаря интегральному характеру, отражает и предысторию развития популяции. Связь удельной скорости биосинтеза с возрастом клеток выражается формально с помощью уравнения второго порядка ц=0,0056+0,0048Х-0,00005Х3. График этой зависимости представлен на рисунке 3, и подтверждает вывод о том, что максимальная скорость синтеза лютелана наблюдается в экспоненциальной фазе роста продуцента. Для биосинтеза лютелана (как и прочих вторичных метаболитов) необходим предварительный синтез соответствующих ферментов, и поэтому, его образованию должен предшествовать некий временной интервал запаздывания. Иными словами, максимальная скорость образования лютелана должна приходиться на стационарную фазу роста продуцента (аналогично антибиотикам и другим веществам, относящимся к вторичным метаболитам). Однако, полученные нами данные не подтверждают обязательность этого правила; время синтеза клеткой любого метаболита оредепяется условиями, в которых находится культура. Косвенно этот вывод подтверждается данными Ждан-Пушкиной (1994) о том, что путем ряда последовательных пересевов из экспоненциально растущей популяции, можно приблизить синтез вторичных метаболитов к началу фазы размножения культуры. Исходя из защитной функции полисахаридов (Блинов, 1984), возможность их синтеза растущими клетками продуцента является оправданным, особенно при наличии неблагоприятных условий для ее существования.

время, ч

Рисунок 3. Скорость синтеза лютелана в зависимости от возраста культуры.

0,5 -0,4 -0,3 -0,2 0,1 0

-модель яссперимент

5

6

7

8

рН

Рисунок 4. Влияние рН культуральной жидкости на скорость образования полисахарида.

-1

Рисунок 5. Изменение скорости роста культуры Сг.МеоШБ в зависимости от рН.

Влияние рН среды на скорость биосинтеза полисахарида описывали уравнением второго порядка. Полученное в итоге уравнение имеет следующий вид: qp=--2,513+0,845рН-0,061рН2 (рисунок 4); рН 6,9 исходя из уравнения является отималь-ным для удельной скорости биосинтеза зкзополисахарида. Скорость размножения культуры в исследованном диапазоне рН не имеет ярко выраженного оптимума, хотя также удовлетворительно описывается уравнением второго порядка ц— •0,019+0,039рН-0,003рН2 (рисунок 5); рН 5,6 является оптимальным для размножения культуры в данных условиях.

Реологические свойства лютелана. Релогическая характеристика водных рас-

—е-(—

———I

I—I—I—I

4

творов полисахаридов являются важнейшим показателем при оценке возможностей их практического применения в различных областях хозяйства. Кроме того, высокая вязкость культуральных жидкостей при ферментации полисахаридов стоит в ряду главнейших проблемпромышленного производства многих экзогликанов, начиная со стадии биосинтеза (ограничение тепло- и массопереноса, увеличение затрат мощности на перемешивание), заканчивая отделением биомассы, получением нативного раствора и его обработкой. В этой связи изучение реологических характеристик лю-телана представляется необходимым.

Параметром, характеризующим вязкостные характеристики полимера, является его предельное число вязкости (г\]. Для лютелана оно находится в пределах 3,4 -5,4 мл/г, в зависимости от условий культивирования продуцента и способов выделения образца. На рисунке 6 представлено изменение относительной вязкости водного раствора лютелана в зависимости от концентрации полисахарида. Из рисунка видно, что при увеличении концентрации полимера вязкость раствора быстро возрастала после концентрации 0,5% и достигала относительной вязкости 33,5 при содержании лютелана 1%. Плотные гели лютелана не формировались при использовании его даже в концентрации 2 %.

Большое значение для практических целей имеет изменение вязкости растворов полисахаридов при изменении рН. Влияние активности ионов водорода на реологические характеристики водного раствора лютелана изучали путем установки требуемого значения рН 0,2 % раствора полисахарида 2Н растворами H2SO4 и NaOH. Результаты показаны на рисунке 7. Во всем исследованном диапазоне рН (1,5 -11,5) изменения вязкости не превышали 40% от максимального значения, а в диапазоне рН 4,5-10 вязкость растворов оставалась стабильной. Собственный рН раствора лютелана в дистиллированной воде, в зависимости от образца, колеблется от 6,3 до 6,9 единиц. Изменение вязкости раствора лютелана от температуры показано на рисунке в. При повышении температуры относительная вязкость быстро снижалась от 2,7 при 20 "С до 1,43 при 75 °С.

Влияние различных солей одно и двух валентных катионов на вязкость водных растворов лютелана показано на рисунке 9. Как видно из рисунка присутствие различных солей не оказывало существенного влияния на вязкость раствора лютелана. Наибольшее снижение вязкости раствора лютелана происходило в 1М NaCI и составило 30%.

Вязкость растворов полисахаридов редко бывает ньютоновской. Не составляет

относительная ВЙЖОСТ*

40

35 -30

25 -■ 20 - ■ 15 • ■ 10 5 О

•ь-ь-

Л- 0.1 х 0.2

Рисунок 6. Изменение относительной вязкости водного раствора лютелана в зависимости от его концентрации.

относительная

вязкость

2.5 т

2 1.5

1 -•

0.5

10

рн

Рисунок 7. Изменение вязкости раствора лютелана от рН.

относительная

20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75

температура

1

Рисунок 8. Влияние температуры на вязкость раствора лютелана.

относительная 3 яямостъ

2.8 2,6 2,4 2.2 2 1.8 1,6 1.4 1.2 1

0.5

концентрация, моль/п

Рисунок 9. Влияние концентрации солей на вязкость раствора лютелана.

вязкость, сП 23

20

17

14

11

8

О 30 60 90 120 е..

Рисунок 10. Вязкость раствора лютелана в зависимости от скорости сдвига, исключение из этого правила и лютелан. График зависимости вязкости 0,5 % раствора лютелана в дистиллированной воде от скорости сдвига представлен на рисунке 10, из которого видно, что растворы лютелана обладают псевдопластичными свойствами, то есть с увеличением скорости сдвига вязкость их падает

Осаждение лютелана. Основным методом выделения полисахаридов из водных растворов является осаждение их органическими растворителями, смешивающимися с водой. В этой связи мы изучили растворимость лютелана в этаноле, ацетоне, н-пропаноле; данные представлены на рисунке 11 . Кривая растворимости полисахарида в этаноле имеет более крутой наклон, чем для двух других растворителей. Таким образом, по нашим данным, этанол более эффективный осадитель для

лютелана, чем ацетон и н-лропанол. В то же время для фракционирования лютелана по молекулярной массе целесообразнее использовать ацетон или н-лропанол, исходя из кривой растворимости, при этом удается разделить полимер на большее число фракций. При концентрации ацетона в воде 80% (по объему) лютелан не растворялся, но ,очевидно, поглащал некоторое количество воды, так как образовывал геле-образную массу. При более высоких концентрация ацетона данное явление не отмечалось. При сушке центрифужных пробирок, после растворения полимера в ацетоне и н-пропаноле, на их стенках образовалась тонкая пленка полисахарида. При растворении лютелана в этаноле данный факт не отмечен.

На осаждение лютелана из культуральной жидкости оказывает существенное влияние рН (рисунке 12). Для данного полисахарида отмечено два оптимума рН для осаждения - при слабокислом 6,2 и сильно щелочных (рН>12) значениях рН.

Растворенный полисахарид, %

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

% осадителя

Рисунок 11. Растворимость лютелана в различных системах растворитель-осадитель. 1 - этанол, 2 - ацетон, 3 - н-лропанол.

Рисунок 12. Соотношение объемов этанола с раствором лютелана, требуемое для начала осаждения полисахарида при различных рН.

17

Выводы.

1. Cr.luteolus синтезирует внеклеточный гетерогликан - лютелан, используя для этого различные моно- и дисахариды, а так же сахароспирты без существенного изменения количества образуемого полисахарида. В сравнении с моносахаридами, ди-сахариды стимулируют синтез лютелана.

2. Соли аммония и пептон стимулируют рост культуры и образование лютелана, нитратный азот угнетает биосинтез экзогликана.

3. Среди изученных катионов наибольшее влияние на биосинтез лютелана оказывают ионы магния (кофактор), при отсутствии которых снижается количество синтезированного лютелана. Железо, марганец, кальция и факторы роста, входящие в состав экстракта БВК, больше активируют рост культуры, чем продукцию ею зкзополисахарида.

4. На основании данных отсеивающего эксперимента в исследованной области значимое влияние на биосинтез лютелана имеют концентрации глюкозы и фосфора в исходной среде, остальные компоненты среды находятся в достаточном количестве.

5. Биосинтез лютелана в расчетные интервалы времени сопряжен с экспоненциальным ростом Cr.luteolus. Максимальное количество полисахарида накапливается к 96 часам ферментации продуцента. При более длительном культивировании дальнейший прирост полисахарида незначителен. С учетом экономической целесообразности предложено сократить время ферментации со 120 до 96 часов.

6. Среди изученных раствоителей - этанол, ацетон , н-пропанол наиболее эффективным осадителем лютелана является этиловый спирт. Оптимальный рН для осаждения 6,9.

7. Водные растворы лютелана обладают псевдопластичными реологическими

свойствами; они стабильны по вязкостй в широком диапазоне рН, а так же при действии высоких концентраций солей одно- и двухвалентных катионов. Вязкость растворов лютелана экспоненциально снижается при повышении температуры.

8. Нами предлагается среда в качестве оптимальной для биосинтеза лютелана (г/л дистиллированной воды): глюкоза - 65,0, (NH4)2S04 - 2,5, MgS04 -7Н20- 0,5, КН2Р04 - 6,43, Na2HP04 -13,06, экстракт БВК - 0,6; на данной сроде выход полисахарида в 1,5 раза больше, чем на исходной среде Голубева.

9. Внесены необходимые дополнения к лабораторному регламенту на получение лютсулана.

Список публикаций.

1. Григорьянц А.О., Блинов Н.П. Продукция экзогликана дрожжами Cryptococcus luteolus шт.228 на различных источниках питания. Тез. докл. Всероссийской научн. конф. "Химия и технология лекарственных веществ" 28-30 июня 1994 г. с.9.

2. Григорьянц А.О., Блинов Н.П. Влияние состава среды на рост и биосинтез экзогликана штаммом 228 Cryptococcus luteolus (Saito) Skinner. Микология и фитопатология, - 1994, т.28, вып.6, -с.28-31.

3. Григорьянц А.О. Оптимизация состава среды для биосинтез экзогликана штаммом 228 Cryptococcus luteolus (Saito) Skinner. Микология и фитопатология, -1995, т.29, вып. ,-с. .