Биотехнологические основы высокоэффективных препаративных форм дрожжей рода Saccharomyces

Мартыненко, Николай Николаевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биотехнологические основы высокоэффективных препаративных форм дрожжей рода Saccharomyces
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Биотехнологические основы высокоэффективных препаративных форм дрожжей рода Saccharomyces"

и«-»*"

11ц нр:ш:1Х рукописи

МАРТЫНЕНКО НИКОЛАЙ НИКОЛАЕВИЧ

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНЫХ ПРЕПАРАТИВНЫХ ФОРМ ДРОЖЖЕЙ РОДА ЗАССНАКОМУСЕБ

03.00.23. - «Биотехнология»

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук

003468180

Па правах рукописи

МАРТЫНЕНКО НИКОЛАЙ НИКОЛАЕВИЧ

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНЫХ ПРЕПАРАТИВНЫХ ФОРМ ДРОЖЖЕЙ РОДА ЗАССНАИОМУСЕЗ

03.00.23. - «Биотехнология»

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Работа выполнена на кафедре «Биотехнология» Московского Государственного Униперситета Пищевых Производств (ГОУ НПО МГУПН МОП РФ), в отделе «Биотехнология ферментных препаратов в пищевой промышленности» Всероссийского научно-исследовательского института пищевой биотехнологии (ГНУ ВНИИИБТ) РАСХН.

Научный консультант: Заслуженный деятель науки РФ

Доктор технических наук, профессор Римарева Любовь Вячеславовна

Официальные оппоненты: Заслуженный ветеринарный врач РФ,

Доктор биологических наук, профессор Албулов Алексей Иванович

Член-корреспопдент Российской Академии Наук Доктор биологических наук, профессор Черной Иван Юрьевич

Доктор технических наук, профессор Кривова Анна Юрьевна

Ведущая организация: ОАО Государственный научно-

исследовательский институт биосинтеза белковых веществ Федерального агентства по управлению Федеральным имуществом (ФГУП ГОСНИИ Сиптезбелок)

Защита диссертации состоится «15» мая 2009 г. В 10 часов на заседании Диссертационного совета Д.006.069.01 ГНУ Всероссийскою научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности РАСХН (ВНИИТИБП РАСХН) по адресу: 141142, Московская обл., Щелковский р-н, п/о Кашинцево, иос. Биокомбината.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ВНИИТИБП.

Отзыв на автореферат в двух экземплярах, замеренный печатью учреждения, просим присылать по адресу: 141142, Московская обл., Щелковский р-н, п/о Кашинцево, пос. Биокомбината. ВНИИТИБП, ученому секретарю Совета.

Афторефераг разослан « 14 » апреля 2009 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, Кандидат биологических наук

Фролов Ю.Д.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальноегь проблемы И условиях современного технически развитого общества, характеризующегося неблагоприятной экологической обстановкой, потребителем всё больше интересует, как питание может отразиться на их здоровье. Анализ информации о состоянии окружающей среды свидетельствует о том, что её загрязнение стало актуальной и очень сложной проблемой.

Несовершенство технологических процессов, отрицательное воздействие на окружающую среду привело к нерациональному использованию огромного количества сырья, изымаемого из природной среды и повышению себсетоимосш выпускаемой продукции в перерабатывающих отраслях ЛПК.

Разработка новых ресурсосберегающих технологий при использовании инновационных подходов, позволяющих увеличить объём производимой продукции при сохранения её высокого качества является актуальным решением современных задач всех отраслей пищевой промышленности, включая и винодельческое производство.

Повышение рентабельности производства и улучшение качества готовой продукции может быть обеспечено совершенствованием технологии использования дрожжей-сахаромицетов, играющих важнейшую роль в обеспечении ключевых биотехпологпчсских процессов. 13 связи с этим огромный практический интерес представляет возможность создания новых активных препаратинпых форм сухих и иммобилизованных дрожжей, используемых уже за рубежом в ряде технологий. Эти формы дрожжей отличаются от традиционной дрожжевой разводки легкостью и удобством использования, максимальным проявлением всех положительных качеств, новыми ценными свойствами.

Промышленная технология получения таких новых форм дрожжей в России ещё не разработана, полому исследования, проводимые в этом направлении, важны, актуальны и представляют несомненный интерес для усовершенствования отечественных биотехнологий, например, в винодельческом и спиртовом производствах.

Создание активных сухих дрожжей (АСД), использование которых дает возможность в любой момент времени получать необходимое количество активно бродящих дрожжей является особенно актуальным, так как значительно облегчит работу заводов, как в сезон, так и в период их запуска. С другой стороны, использование сухих дрожжей ускорит процесс брожения, увеличит выход продукта и улучшит его качество.

В плодово-ягодном виноделии за рубежом практически отсутствуют технологии АСД, а рекомендуемые для этой цели универсальные препараты не пригодны. Н России за последние 20-30 лет вообще не проводились работы по выделению и изучению рас дрожжей для производства плодовых вин.

Создание и организация производства высокоэффективных препаратов сухих дрожжей па основе отбора лучших отечественных рас дрожжей по их важнейшим физиологическим и биохимическим признакам, приспособленных к местным условиям и формирующим привычный вкус и аромат готового вина, является важной, актуальной и своевременной проблемой, выходом из создавшегося положения.

такие, как ликвидация процесса ремюажа в шампанском производстве, интенсификация брожения за счёт создания сверхвысоких концентраций дрожжей в сусле или виноматериале, биологическое кислотононижение вин, устранение педобродов, значи тельное улучшение органолептических показателей готовых вин.

Эффективных решений по использованию ИД в виноделии пока нет, хотя и встречаются некоторые данные по этому вопросу в зарубежной и отечественной литературе, поэтому актуальным является поиск такого носителя для иммобилизации, который был прочным, обладал хорошими массообмепными характеристиками, был бы инертен для вина и исключал бы выход дрожжей в вино в период брожения.

Использование ЛСД и ИД, безусловно, даёт возможность получения большого экономического эффекта для многих производств, основанных на биотехнологии дрожжей рода ВасЬаготусеБ. Научное обоснование биотехнологических процессов получения ИД и АСД позволит не только повысить эффективность бродильных производств, но и внести весомый научный вклад в развитие биотехнологической промышленности.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в разработке теоретических и экспериментальных основ создания высокоэффективных препаратов активных сухих и иммобилизованных форм отечественных винных и спиртовых рас дрожжей рода вассНаготусев. В задачи исследования входило:

- изучение основных культуральных, морфолого-физиологических, молскулярно-биологических, биохимических и технологических свойств селекционированных рас дрожжей;

- отбор рас дрожжей, наиболее устойчивых к сохранению бродильной активности, на основе которых возможно создание наиболее эффективных препаратов АСД и ИД для производства спирта, шампанских вин, белых и красных виноградных вин, сортовых плодовых вин повышенного качества, устранения недобродов;

- создание биотехнологии винных и спиртовых АСД и ИД;

- разработка способов подавления выхода иммобилизованных клеток дрожжей во время брожения из матрицы носителя для повышения эффективности их действия;

- разработка научных основ и технологии применения АСД и ИД в виноделии и спиртовом производстве;

- разработка эффективных способов реактивации и подготовки к брожению препаратов АСД и ИД;

- проведение промышленных испытаний созданных препаратов АСД и ИД на заводах отечественной винодельческой и спиртовой промышленное! ей. Рассматриваемые проблемы решались в соответствии с программой «Биотехнология» УНЦ РХТУ им. Менделеева «Влияние экологических факторов па качество пищевых продуктов и пищевых добавок на основе микробного синтеза и разработка более совершенных стандартов контроля качества этих продуктов»; с Межведомственной инновационной программой «Биотехнология для медицины и агропромышленного комплекса»; программы «Научные исследования высшей школы но приоритетным направлениям науки и техники»; проекта «Новые эффективные биотехнологические процессы микробного синтеза ферментов,

антибиотиков, бслково-жировых кормовых компонентов и других биологически активных соединений» предложенного ВНИИ Биотехнологии; программы Министерства образования РФ «Университеты России»; Федеральной пеленой программы «Интеграция пауки и высшего образования России».

Паучнаи ношгша работы. В представленной диссертационной работе разработаны биотехнологические основы высокоэффективных препаративных фор« дрожжей рода ЯасЬаготусс;, при этом теоретически обосновано и 'экспериментально установлено и доказано:

- па основе многоступенчатой селекции и новых экспериментальных данных по результатам сравнительных исследований выделенных штаммои дрожжей в. сегеу151ае показана перспективность 13 рас дрожжей, из которых 5 физиологически активных рас обладают высокой биосинтстической способностью по отношению к этанолу и наиболее важным метаболитам, характерииым для плодово-ягодного пшшделия;

- с использованием современных методов анализа изучены морфологические, физиологические, биохимические и молекулярно-биодогичсские особенности 62 важнейших отечественных селекционированных рас винных и спиртовых дрожжей, установлена их принадлежность к одному биологическому виду сегсуЫае, различающихся между собой но ряду признаков, обозначенных н определителе как вариабельные;

- впервые обнаружено 5 межвидовых г ибридов дрожжей Я.сегсу^йтае х Я. Ьауапия уаг.иуашш, построено генеалогическое древо штаммов изученных дрожжей;

- получены новые экспериментальные данные и подобраны условия сепарации и обезвоживания дрожжей па сушилке кипящего слоя, позволяющие сохранить до 90% живых 'клеток,' подобрана оптимальная композиция стабилизаторов для обезвоживания дрожжей;

- на основе установленных закономерностей впервые научно обоснована и разработана биотехнология подготовки сухих дрожжей к брожению, позволяющая сократить лаг-фазу развития дрожжевых клеток, интенсифицировать процесс брожения при одновременном улучшении качества продукта;

- исследованы кульгуральные и технологические свойства сухич винных и спиртовых дрожжей, определены их физиолого-биохимичсские параметры, используя различные методы оценки качества и хранения препаратов ЛСД;

- разработаны методы подготовки и хранения биокатализаторов к брожению для ИД;

- иследованы способы иммобилизации дрожжей, свойства и характеристики возможных носителей, свойства иммобилизованных дрожжей;

- впервые разработаны способы подавления выхода клеток иммобилизованных дрожжей в вино во время брожения.

Практнчсскаи значимость работы. Проведенные исследования явились основой для создания биотехнологии новых высокоэффективных препаратов активных сухих и иммобилизованных форм отечественных винных и спиртовых рас дрожжей рода бассИаготусей, усовершепстпования отечественной технологии винодельческого и спиртового производства. Использование сухих и иммобилизованных дрожжей позволяет ускорить процесс брожения, увеличить выход и улучшить качество готового продукта. Наряду с получением ценных продуктов, автором решены следующие ключевые вопросы;

- селекционированы и запатентованы две новые высокоэффективные расы дрожжей-сахаромицетов для производства спирта и направлены на патентование 5 рас для производства плодовых вин;

- разработана и запатентована новая высокопроизводительная и экономичная технология винных и спиртовых ЛСД, обеспечивающая получение продукции высокого качества;

- составлены ТИ и ТУ технологии винных и спиртовых дрожжей;

- разработана технология применения винных и спиртовых ЛСД, позволяющая значительно повысить эффективность данных препаратов;

- представленная технология успешно апробирована на Московском дрожжевом заводе, наработаны опытные партии перспективных рас дрожжей;

- подобраны условия реактивации ЛСД, позволяющие сохранить лаг-фазу развития сухих дрожжей, увеличить процент реактивируемых клеток на 10-15 % даже в неблагоприятных условиях, сократить время подготовки к брожению для шампанских ЛСД до 2-3 часов;

- определены факторы ингибирования ЛСД по время их хранения, а также реактивации и брожения, и изучен механизм их действия;

- подобраны наиболее перспективные флуорохромные красители для экспресс-контроля качества ЛСД с помощью люминисцентной микроскопии, сопряженной с компьютерным анализом изображений;

- разработана и запатентована технология ИД для виноделия на основе криогеля ЛВС;

- проведены заводские испытания препаратов ЛСД и ИД и получены положительные результаты при использовании на винзаводах: ОЛО Агрофирма «Южная» (Краснодарский край), ОАО АПФ «Фанагория» (Краснодарский край), ОАО «Миллеровский винзавод» (Ростовская обл.), ОАО «Игристые Вина» (г. Санкт-Петербург), и спиртзаводе ЗАО «Ллтайросспиртпром» (г. Вийск, Алтайский край);

- проведены заводские испытания препаратов ИД при получении шампанских вин бутылочным способом на ОАО АПФ «Фанагория» (Краснодарский край).

Разработанные в результате исследований технологии винных и спиртовых АСД и ИД способствуют созданию высокоэффективной технологии шампанских, белых и красных виноградных вин, плодовых вин и технологии спирта.

Результаты исследований по селекции при отборе наиболее продуктивных рас дрожжей, обладающих более цепными свойствами, и изучению ключевых физиолого-биохимических, технологических и молекулярно-биологичееких особенностей важнейших рас дрожжей рода ЯассЬагошусея, будут востребованы при использовании последних в отечественной винодельческой и спиртовой промышленностях.

Разработанные в результате исследования технологии новых высокоэффективных препаратов сухих и иммобилизованных дрожжей позволят значительно упростить технологию дрожжей на заводах, облегчая и ускоряя работу •заводов, как в сезон, так и в период запуска, интенсифицировать процесс брожения, увеличат выход продукта и улучшат его качество.

специальности «Биотехнология» и «Технология виноделия», и монографии «Современные препаративные формы дрожжей для виноделия», курсовых и дипломных проектах и работах, а также на многих предприятиях винодельческого и спиртового производства.

Значимость работы подтверждена проведением заводских испытаний новых препаратов АС'Д и ИД па винодельческих и спиртовых заводах России, дипломами 1-ой степени но поминании «Биопрепараты и биологически активные добавки» на выставке-конкурсе Министерства образования РФ, Министерства промышленности, науки и технологий РФ, МГУПИ, Золотой медалыо агропромышленной выставки «Золотая осень-2008».

Основные положении, пыноспмыс на защиту:

- теоретические положения систематики, генетических особенностей и идентификации дрожжей рода ЗассЬагошуссз, критерии отбора важнейших винных и спиртов],IX дрожжей для получения препаратов ЛСД и ИД;

- селекционированные расы винных и спиртовых дрожжей, их морфолого-физиологичеекие, молскулярно-биологические, биохимические и технологические особенности;

- теоретическое и экспериментальное обоснование биотехнологии препаративных форм винных и спиртовых ЛСД и ИД;

- способ подавления выхода клеток иммобилизованных дрожжей в вино во время брожения;

- технологии применения ЛСД и ИД в виноделии и спиртовом производстве;

- эффективные способы реактивации и подготовки к брожению ЛСД и ИД;

- промышленные испытания новых препаратов ЛСД и ИД на заводах отечественной винодельческой и спиртовой промышленностей.

Личный вклад ангора. Автором на основе анализа научно-технической и патентной литературы теоретически обосновано направление исследований, сформулированы цель и задачи, разработана методология проведения исследований.

Автор лично планировал, организовывал проведение всех испытаний и внедрений, а также обобщал полученные результаты.

Под его руководством и при непосредственном участии определены критерии озбора важнейших винных и спиртовых дрожжей-сахаромицетов, получения препаратов ЛСД и И/1 для винодельческого и спиртового производств; исследованы и определены расы дрожжей для создания новых наиболее эффективных препаратов ЛСД и ИД для шампанских пин, белых и красных виноградных вин, производства спирта и сортовых плодовых вин; установлены морфолого-физиологические, молскулярно-биологические, биохимические и технологические особенности селекционированных дрожжей.

Автором теоретически обоснованы и экспериментально подтверждены биотехнологии винных и спиртовых АСД и ИД; под его непосредственным руководством и участии разработаны способы подавления выхода клеток иммобилизованных дрожжей во время брожения; технологии применения ЛСД и ИД в виноделии и спиртовом производстве, а также эффективные способы реактивации и подготовки к брожению ЛСД и ИД.

С участием автора и специалистов заводов проведены промышленные испытания новых препаратов АСД и ИД на заводах отечественной винодельческой и спиртовой промышленностей.

Личное участие автора подтверждается научно-технической и патентной документацией, актами промышленных испытаний.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались и обсуждались на российских и международных научно-технических конференциях и симпозиумах: «Пища. Экология. Человек» (МГ'УПП, май, 1999); «Молодые ученые - пищевым и перерабатывающим отраслям АПК (технологические аспекты производства)» (МГУПП, декабрь, 1999; декабрь 2000); «Biocatalysis-2000; Fundamentals and applications» (Moscow, MSU, 10-15 June, 2000); «Химия и биотехнология пищевых веществ. Экологически безопасные технологии на основе возобновляемых ресурсов» (Москва, РХТУ, сентябрь, 2000); «Bioencapsulation in Biomedical, Biotechnological and Industrial Applications» (Warsaw, 11-13 May, 2001); «Качество, безопасность и экология пищевых продуктов и производств. Прогресс в агроиндустрии» (Ялта, 21-25 мая 2001 г.); «Научно-технический прогресс в спиртовой и ликеро-водочной отрасли промышленности» (Москва, 19-20 апреля 2001 г); «Катализ в биотехнологии, химии и химических технологиях» (Тверь, 2002 г); «Химия и биотехнология биологически активных веществ, пищевых продуктов и добавок. Экологически безопасные технологии» (Тверь, 2002 г.); «Биотехнология; состояние и перспективы развития» (Москва, 2003 г); «Высокоэффективные пищевые технологии и технические средства для их реализации» (Москва, 2003); «Прогрессивные технологии и современное оборудование - важнейшие составляющие успеха экономического развития предприятий спиртовой и ликеро-водочной промышленности» (Москва, 23-24 апреля 2003 г); «Экологической науке - творчество молодых» (Гомель, 2003); «Ьиотехнология; состояние и перспективы развития», (Москва, 14-18 марта, 2005); «9-й Международной Путинской школе-конференции молодых ученых» (Пущипо, 18-22 апреля, 2005); XXII International Conference on Yeast Genetic and Molecular Biology (Bratislava, 7-12 August 2005); «10-й Международной Путинской школе-конференции молодых ученых» (Пущине, 18-22 апреля, 2006); XXV International Specialized Symposium on Yeasts 1SSY-25 (Helsinki. 2006); International Congress on Bioprocessing in Food Production (18-21 June 2006, Patras, Greece, 2006), международной научной конференции «Генетика и биотехнология XXI века. Фундаментальные и прикладные аспекты». Минск. 2008.

По,материалам выполненных исследований опубликовано 66 работ, общим объёмом 54 печатных листов, в том числе 38- в центральных изданиях, получено 6 патентов РФ, опубликована 1 монография.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 485 страницах, включающих 138 таблиц, 134 рисунка и состоит из введения, обзора литературы, объектов и методов исследований, 4 глав собственных исследований, выводов, списка литературы, включающего 435 источников, в том числе 267 иностранных, и приложения.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Во введении дано обоснование актуальности проблемы, сформулированы цель и задачи исследования, охарактеризована научная новизна, теоретическая и практ ическая значимость работы.

Глава 1.Обзор литературы. В литературном обзоре представлены сведения об основных изменениях систематики дрожжей рода Saccharomyces, приведена современная классификация рода Saccharomyces, которая основана на новой концепции генетического рода

дрожжей. Рассматриваются основные данные зарубежных и отечественных авторов, касающиеся молскулярно-биологических методов идентификации дрожжеей, представлены примеры и предложения по идентификации дрожжей рода Saccharomyces, используемых в плодово-ягодном виноделии. Освещены вопросы, касающиеся производственных рас дрожжей для получения различных плодово-ягодных вин, показаны технологические особенности каждой расы. Проведен анализ и обобщены данные о применении активных сухих и иммобилизованных дрожжей в виноделии, сделан обзор существующих методов культивирования, сутки и иммобилизации дрожжей. Обоснован вывод о необходимости поиска новых рас дрожжей для сбраживания плодово-ягодных вин, разработки новых технологий плодово-ягодного виноделия и производства спирта при использовании инновационных подходов,' позволяющих увеличить объёмы производимой продукции при сохранении её высокого качества, основываясь на использовании абсолютно сухих и иммобилизованных препаративных форм дрожжей. Анализ литературных данных позволил сформулировать цель и задачи данного исследования.

Экспериментальная часть.

Общая схема проведения эксперимента представлена на рисунке 1.

Глава 2. Материалы и методы исследований.

2.1. Объекты исследовании.

Объектами исследования были более 80 важнейших винных и спиртовых рас дрожжей рода Saccharomyces наиболее часто используемые в различных отраслях бродильных производств (виноградном и плодово-ягодном виноделии: шампанском, спиртовом производстве, пивоварении и хлебопечении), полученные из коллекций: Центральной коллекции Минсельхоза России («Чистые культуры дрожжей, применяемые при производстве пива, безалкогольных напитков и вина); коллекции микроорганизмов Института винограда и вина «Магарач» г. Ялта, Украина; кафедры «Биотехнология» МГУПП; коллекции микроорганизмов ВНИИ пищевой биотехнологии.

Для ПЦР-анализа в качестве контролен использовали моносноровыс культуры S.cerevisiae CBS 1171, S.bayanus CHS 380, S.pastorianus CBS 1538, S.uvarum BRM Y-l 146, S.paradoxis CBS 432 (CBS-Cenfraalbureau voor Schiininelcullures, Uti-echt, the Netherlands).

2.2. Методы исследовании.

В работе использовались основные общепринятые методы исследований и селекции, принятые в системе микробиологической промышленности.

Выделение ДНК из клеток дрожжей осуществляли с использованием лизисного буфера ¡Naumov et al., 1997]. Выделение хромосомной ДНК проводили по методике, описанной Д.Шварц и К.Кантор [Schwarz D.H. et al., 1984] с использованием ферментного препарата Novozym 234 (Novozymcs, Дания).

Амплификацию 5.8S - ITS, 1GS2 фрагментов рДНК, генов МГ.Т2 и АСТ1, митохондриального гена СОХ2, а также Г1ЦР с мнкросателлитным праймером (GTG)s и множественную ПЦР осуществляли на ДНК-амплификаторе «Терцик» («ДНК-технология», Россия) в режимах, описанных в литературе [Наумов Г.И. и др., 2003; Nguen H.V. et al.; Naumova E.S., 2003; Наумова E.C., 2006].

Продукты амплификации подвергали электрофорезу в 1%-ном агарозпом геле при 60-65В в 0,5хТВЕ в течение 2 часов.

Анализ полиморфизма длин рестриктазных фрагментов (ПДРФ-анализ) 5.8 SITS и IGS2 районов рДЫК осуществляли с помощью эндонуклеаз Нра\\, ПаеIII и Ми\, Вап\, соответственно ("Fermentas" Литва). Ресгриктазный анализ амплифицированпых генов MEL проводили с помощью эндонуклеаз /line II и Hind Ш ("Fermentas", Литва). ПДРФ-анализ фрагмента гена МЕТ2 проводили с помощью эндонуклеаз &oRI и Pst\ ("Fermentas", Литва), митохондриального гена СОХ2 - с помощью эндонуклеазы Pst\ ("Fermentas", Литва).

Разделение фрагментов рестрикции осуществляли в 1,6%-ном агарозном геле при 60 В в 0,5х ТВЕ в течение 3 ч.

Для разделения хромосомной ДНК использовали аппарат CHEF- DRTM III ("Bio-Rad", США). Образцы помещали в щели 1%-ного агарозного геля. Пульс-электрофорез проводили при 200В в течение 24 часов: 15 часов при времени переключения полей 60 с и 9 часов при времени переключения полей 90 с (охлаждение до 14°С).

Перенос хромосомных ДНК на нигроцел-нолозную мембрану проводили Саузерн-блотом [Маииатис Т.Н. и др., 1984]. В качестве зонда использовали //шс/Ш-фрагмент гена ARG4 длиной ЗОООп.н., изолированный из плазмиды pINAI. Метку вводили нерадиоактивным методом по инструкции фирмы "Roche Applied Science" (Германия) с использованием дигоксигенина DIG-ll-dUTP [Naumov G.I. et al.,199!]. Гибридизацию и проявление гибридизационных сигналов также проводили по инструкции этой же фирмы.

Гели окрашивали бромистым этидием и фотографировали в проходящем ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе «Vilber Lourmal» (Франция).

Филогенетические родственные связи изучаемых дрожжей-сахарамицетов устанавливали путем сравнения профилей ПЦР-продуктов, амплифицированпых с микросателлитпым праймером (GTG)5 Дендрограмму строили с помощью компьютерного пакета TREECON , используя Neighbor-Joining метод [Van de Peer Y.etal.,1994].

При изучении гибридов амплифицировапные фрагменты гена МЕ'П элюировали из геля с помощью набора "GeneClean Kif согласно протоколу фирмы-изготовителя ("Bio-101 Inc." США). Нуклеотидные последовательности фрагмента гена МЕТ2 размером в 330 п.н. определяли по двум цепям с помощью прямоп) секвснирования по методу Сэпгера на автоматическом секвенагоре ABl 373А ("Applied BioSystem, Англия). На основании сравнительного анализа полученных и уже известных нуклеогидных последовательностей участка гена МЕТ2 строили филогенетическое древо с помощью компьютерного пакета TREECON, используя алгоритм Neighbor-Joining с поправкой Jukes и Cantor.

Культивирование дрожжей проводили на установке ФК-20, а также дрожжерастильных аппаратах объемом 360; 1200 и 6300 литров, снабженных системой аэрации и мешалкой. Расход питательных веществ при культивировании дрожжей рассчитывали методами, принятым в дрожжевом производстве (Новаковская, 1990; Фараджева, 2002). Сушку дрожжей проводили на сушилке с кипящим слоем марки «Aeromatic» (Германия).

При выполнении аналитических исследований применялись общепринятые физико-химические, микробиологические и биохимические методы анализа, описанные в специальной научно-технической и отраслевой литературе.

Все исследования по световой микроскопии проводили на микроскопе Axioskop 40 FL Zeiss, увеличение объектива * 100. Система документирования:

цифровая камера AxioCam MRc, программа AxioVision 3.1. Фиксированные и нефиксированные клетки окрашивались различными красителями для выявления запасных веществ и органелл. Все методы окраски были адаптированы к изучаемому объекту.

Флуоресцентную микроскопию осуществляли на микроскопе МЛ-2 (JIOMO, Россия), оснащенном цифровой (¡ютокамерой DSC-S85 ("Sony", Япония). Источником света служила ртутная лампа ДРШ-250. Учет количества живых клеток проводили при помощи микроскопа Axioscop 40 PL Zeiss (блок светофильтров №02, О 365 им, IT 395 им, LP 420 им, объектив *40) и цифровой камеры AxioCam MRc, подключенной к компьютеру.

Электронную микроскопию осуществляли на микроскопе "Jeol" (JEM-IOOB). Подготовка образцов для электронной микроскопии - фиксация в растворе КМп04 и контрастирование по Рсйнольдсу. После резки на ультратоме поводили двойное окрашивание ультратонких срезов на металлических сеточках по Рейнольдсу (1 час в 4% урапилацетате, затем промывка в 3 сменах бидиетиллированной воды, окрашивание 30 минут в лимоннокислом свинце в присутствии кристаллов NaOH и снова промывка в 3 сменах бидиетиллированной воды).

Основные показатели соков и полученных виноматериалов определяли методами, принятыми на предприятиях винодельческой промышленности [Государственный контроль качества винодельческой промышленности, 2003].

Анализ основных ароматических компонентов осуществляли методами газовой хроматографии - масс - спектрометрии (ГХ-МС), газовой хроматографии -пламенно-ионизационным детектором (ГХ-ПИД), а также газожидкостпой хроматографии (ГЖХ). Исследование Сахаров, кислот и фенольных веществ осуществляли методом ВЭЖХ на хроматографе фирмы Agilent Technologies (модель 1100), детектор спектрофотомстрический на УФ-область. Количественное определение аминокислот в сусле и виноматериалах проводили по известным методикам [Бурьян, 1997; Меледина, 2002] на автомагическом анализаторе KL,a-3B фирмы «Hitachi» (Япония).

Получение биокатализатора на основе дрожжей, иммобилизованных в криогель ПВС (марка 16/1, «Acros», Бельгия), осуществляли двумя методами: 1) согласно методике, разработанной в лаборатории криохимии биополимеров ИНЭОС РАИ, используя криогрануляционную колонну, заполненную гидрофобной жидкостью; 2) суспензию клеток в растворе ПВС распределяли по различным формам, используя дозатор, и замораживали при -~20°С в воздушной среде, выдерживали в замороженном состоянии 14-1К ч, а затем размораживали при+2 + +80С

Жизнеспособность и метаболическую активность иммобилизованных клеток контролировали, определяя концентрацию внутриклеточного АТФ лшциферип-люциферазным методом, используя реагент фирмы «Люмтек» (Россия) и люминометр Microluminometr 3560 New Horizons Diagnostics Co (CILIA).

Микрофотографии гранул криогедя Г1ВС, получали, используя сканирующий электронный микроскоп Jeol JSM-S300LV (Япония) и световой микроскоп Intel Play QX3 (CILIA).

Полученные экспериментальные данные обрабатывались с применением методов математической статистики [Грачев Ю.П., 2005].

Общая схема проведении экспериментальных исследований представленной работы

Рис. 1

Результаты нх обсуждение

Глава 3. Селекция новых рас дрожжсн-сахаромнцстов.

Селекция дрожжей для плодово-ягодного виноделия проводилась путем ступенчатого скрининга дрожжей вида 8ассЬаготусех сегеуЫае, выделенных при исследовании дрожжевой микрофлоры плодов и ягод Западной Беларуси. Всего было изучено 481 ипамм дрожжей НассЬаготусех сегег'Ыас. Исследования бродильной активности, накопления спирта, органолептических показателей готового киноматериала, позволило установить 13 штаммов дрожжей, представляющих значительный интерес для использования в плодово-ягодном виноделии. При дальнейшем изучении биохимических свойств полученных 13-ти штаммов дрожжей при сбраживании яблочного и других соков были выделены пять винных штаммов, представляющих особенный интерес:

штамм ГН-4, рекомендуемый для сбраживания яблочного сусла, отличающийся высокой скоростью брожения и накоплением этанола, глицерина, эфиров, и обеспечивающий наиболее высокую дегустационную оценку полученным ииноматериалам. Этот штамм задепонирован в ВКПМ под номером У-

3098 н в данный момент находится на патентовании (Заявка на получение патента РФ №2003132274);

- штамм ГСЧ-1, рекомендуемый для получения яблочных и черносмородиновых внноматериалов с пониженным синтезом высших спиртов и ацетальдегнда, и отличающийся высокой бродильной активностью. Штамм задепонирован в ВКПМ под номером У-3100 и в данный момент находится на патентовании (Заявка на получение патента РФ №2003132276);

штамм Г'М-8, рекомендуемый для получения яблочных и малиновых виноматерпалов с повышенным содержанием спирта и наименьшим содержанием нежелательных летучих компонентов. Штамм задепонирован в ВКПМ под номером У-3097 н в данный момент находится на патентовании (Заявка на получение патента РФ №2003132293);

штамм ДЧК-1, рекомендуемый для получения черничных внноматериалов с высокими органолептичсскими показателями. Штамм задепонирован в ВКПМ под номером У-3096 и в данный момент находится на патентовании (Заявка на получение патента РФ №2003132275);

штамм ВЧР-3, рекомендуемый для получения черноплодно-рябиноных внноматериалов с высокими органолептичсскими показателями, отличающийся высокой скоростью брожения. Штамм задепонирован в ВКПМ под номером У-

3099 и в данный момент находится на патентовании (Заявка на получение патента РФ №2003132273).

Среди спиртовых рас дрожжей были выделены дрожжи расы 985Т и 987-0 обладающие повышенной устойчивостью к повышенным температурам и обладающие осмофильпыми свойствами (данные представлены в таблице 1).

- штамм 985-Т, энергично сбраживающий концентрированное зерновое сусло (СВ-22-26%) при температуре 38-39°С. Штамм задепонирован 'в ВКПМ нод номером У-З137 и запатентован (Патент РФ №2331667);

- шгамм 987-0, энергично сбраживающий высококонцентрировалное зерновое сусло (СВ-32%) при температуре 30-32°С. Штамм задепонирован в ВКПМ под номером У-3136 и запатен тован (Патент РФ №2331666).

При сравнении полученных штаммов с наиболее широко используемыми культурами спиртовых дрожжей было покатано, что наилучшим вариантом для условия интенсивного спиртового производства является штамм 985-Т, обладающими как термотолсраитными, так и осмофильными свойствами и сбраживающими сусло с накоплением наибольшего количества спирта и минимального количества побочных метаболитов за короткое время. Штамм 985-Т является наилучшей исходной культурой для создания препаратов сухих спиртовых дрожжей,

Таблица 1.

Характеристика бродильной активности и синтеза побочных метаболитов различных спиртовых рас дрожжей.__

Раса дрожжей Время брожения Содержание побочных метаболитов в готовой бражке, мг/дм3

24 часа 48 часов 56 часов

РВ,г /100 мл спирт, % об. РВг /100 мл спирт, % об. РВ г/100 мл спирт, % об.

985-Т 6,10 7,5 1.80 10,0 0,35 10,6 3806

987-0 6,50 7,3 1.80 10,0 0,70 10,3 4138

\-l\l 6,90 7,0 4,60 8,3 1,40 10,0 4704

У-1986 6,60 7,2 2,00 9,8 1,0 10,2 4809

К-81 10,15 5,0 5,50 7,8 1,90 9.8 6150

ХП-Т 8,35 6,1 4,00 8,5 1.90 9,8 6340

Г-660 8,70 5,9 4,55 8,3 2,30 J 9,5 6460

985 6,65 7,2 2,30 9,6 1,50 10,0 4360

ВПУ-408 8,20 6,2 3,85 8,6 1,80 9,9 4990

Глава 4. Видовая идентификация важнейших отечественных винных и спиртовых ряс дрожжей ЯассЬаготусея.

Следующим этапом работы было проведение видовой идентификации важнейших отечественных винных и спиртовых рас дрожжей ЗассЬаготусев., гак как за последние годы систематика дрожжей рода БассИаготусез подверглась многократным пересмотрам и изменениям. Используя современные физиолого-биохимические и молекулярно-биологические методы, проведена идентификация 62 важнейших селекционированных нами рас дрожжей, используемых в спиртовой и винодельческой промышлености до вида согласно последнему определителю дрожжей [КшШпап, 1998]

Проведено физиологическое тестирование рас дрожжей, в результате изучения морфологических признаков стандартными методами установлено, что большинство исследуемых дрожжей относятся к роду Засскагатусея и но определению [\/аи§Ьап-МаПпн А. е!.а1., 1998] к биологическому виду 8. сеге\>тае, способные сбраживать сахарозу и раффинозу; не сбраживать лактозу, трегалозу; ассимилируть глюкозу, сахарозу, мальтозу трегалозу, раффинозу, этанол; не

ассимилировать рибозу, личин, манит, этиламин; расти при 35 "С; не расти на среде е 0,1% содержанием антибиотика на среде, не содержащей витаминов.

Одновременно были выявлены отклонения от стандартного описания для вида S cerevisiae, штаммы BU-l, 1 СЧ-5, ГСЧ-8, ДЧК-1, Феодосия 1-19, 47-К, 985-Т проявили способность к слабому сбраживанию трегалозы, свойственную дрожжам вида S. bariiettii; штамм Харьковская-39 ассимилирует рибозу, что характерно для видов .V ceistellii и S. dairenensis; штамм 985-Т усваивает рибозу и лизин; штамм У-717 слабо ассимилирует рибозу и лизин; штамм ВВ-2 ассимилирует этиламин и слабо ассимилирует лизни, что характерно для представителей вида S. kluyveri; штамм «Я » вырос на среде, содержащей 0,1% ан тибиотика (ннклогексимида), что характерно для штаммов вида S. exiguous; все штаммы, выделенные в Беларуси, дали слабый рост на лизине, характерный для S. kluyveri, S.unisporus, S.spenserorum и отдельных штаммов S. ircmsvactlensis. Довольно вариабельным признаком оказалось сбраживание галактозы - все расы дрожжей разделились по нему на две большие группы.

Ассимиляционные тесты, которые были расширены до 38 источников углерода, так называемый «пестрый ряд», показали, что все исследуемые штаммы ассимилируют глюкозу, сахарозу, мальтозу, трегалозу, раффинозу, галактозу (кроме рас Корнет и Яблочная Анис-6, давшие на ней слабый рост) и этанол. Все штаммы не ассимилируют сорбозу, рампозу, ксилозу, L- и D-арабинозу, мелибнозу, лактозу, целлобиоэу, арбутин, салицин, инулин, глюкозамип, эритрит, рибит, маннит, дульцит, инозит, 5-кетоглюконат, лимонную кислоту. Однако некоторые штаммы S. cerevisiae отличаются ог стандартного описания. К ним относятся:

- ВВ-2, отличающийся способностью расти на среде с этндамипом, характерной для вида S. kluyveri. Но не сбраживают мальтозу и мелибиозу и ассимилируют маннит.

- Вишня-18, Сидровая-101, Шампанская 11/12, ГМ-15, ГМ-17, Штейнберг-92, Кокур-3, 47-К растущие на глицерине, что характерно для вида S. bayanus, ко все без исключения исследуемые штаммы не растут на безвптаминной среде;

- штамм Я, который вырос на среде с 0,1 % антибиотика, что свойственно S. exiguous. Однако, эти дрожжи, в отличие от штамма Я, сбраживают трегалозу, не сбраживают мальтозу, и не растут при 37°С;

- штаммы 985-Т и Y-717 ассимилируют рибозу и лизин. Ни один из видов рода Saccharomyces не проявляет этих двух физиологических свойств одновременно. Ассимиляция рибозы характерна для дрожжей S. caste/Hi и S.dnirenensis, но они не сбраживают сахарозу, мальтозу и раффинозу, а рост на среде с лизином одновременно со способностью сбраживать сахарозу и раффинозу характерен для вида S. kluyveri. Но дрожжи этого вида, в не сбраживают мальтозу, что характерно для 62 исследуемых штаммов.

Таким образом, по результатам бродильных и ассимиляционных тестов все исследуемые штаммы относятся к биологическому виду S. cerevisiae. Отличия между отдельными штаммами по способности сбраживать отдельные сахара, попадают в разряд вариабельных признаков. Остальные расхождения между отдельными штаммами находятся в пределах, допустимых для ассимиляционного спектра, определяющего вид.

Далее определяли максимальные температуры роста каждого штамма на твердой питательной среде с содержанием СВ 7%. Диапазон температур 28-53°С.

Первый просмотр проводился через 3 дня после высева культур, второй - еще через 3-4 дня Максимальной температурой роста дрожжевых штаммов считается промежуточная между самой высокой, при которой рост не проявляется в течение 7 дней и предыдущей более низкой температурой. Было выявлено 4 группы дрожжей, обладающих максимальной температурой роста:

1. При температуре 35-37°С - Корнет; Харьковская-39, Шампанская 11/12. Груша-7, Груша-10. Крыжовниковая-48, Брусничная-7, Яблочная-17, Земляничная Виктория-14, Малиновая Ленинградская, Малиновая-10, Черносмородиковая-5, Рислинг.

2. При температуре 44-46°С - ГСЧ-8, ГСЧ-И, VM-8, ГМ-15, ДЧК-1, 8ЧР-3, Вишня-18, Яблочная -7. Сидропая-101, Феодосия 1-19, Кокур-3, 47-К, Я, Яблочная Диис-6, 1<-17, Минская-120, Шампань ПЯ-16. Москва-30, Сдива-23, Крыжовииковая-27. Черносмородиновая-7, Смородиновая-22, Вишня-6, Вишня-ЗЗ, Земляничная-4, Слива-21, Земляничная-9, Холодостойкая-21, Киевская, Бордо-20, Ленинградская, Магарач-125, Магарач 17-35, Ашхабадская-3, Каберне-5, Бсрегово-1, Ркацители-6.

3. При 46-49°С - ВВ-1, ВВ-2, ГВ-1, ГСЧ-1, ГСЧ-5, ГМ-17, Штейнберг-92.

4. При температуре 49-53°С - 985-Т, У-717.

Полученные данные учитывались при выборе штаммов дрожжей для культивирования и обезвоживания с целью получении препаратов АСВД.

Молекулярно-биологическое исследование штаммов дрожжей проводилось путем изучения амшзифированных 5.8S-ITS и IGS2 фрагментов рДНК исследуемых дрожжей показало, что размеры их одинаковы у всех изученных и тестерных штаммов и составляют соответственно примерно 850 и 1300 п.н., что подтверждает их принадлежность к роду Saccharomyces.

Проведён ПДРФ-анализ амплифицированных 5.8S-ITS фрагментов рДНК всех исследуемых штаммов дрожжей, с использованием эндонуклеаз Нра\\ и НаеIII показано, что все они имеют' идентичные профили с двумя фрагментами размером примерно 730 и 120 п.н., т.е. среди них отсутствуют дрожжи видов S. paradoxus,

5.mikatae, S. cariocanus. По сходству Нае HI рестриктазных профилей все изученные дрожжи разделились на 2 группы. В первую группу вошло подавляющее большинство изученных штаммов, и ее представители характеризуются наличием четырех Haelll- фрагментов размером примерно 320, 230, ! 70 и 130 п.н. (рис.2, дорожки 3 и 10-18).

Ч I : Л П ' И »III! Dil Ii III Г15 4

1'ис. 2. Рестриктазиый анализ амплифицированных 5 8S-TTS-

фрагментов рДНК штаммов Savcharomycex с помощью ждонуклеачы НаеШ.Дорожки: 1- S. paxtoriama CBS 1538; 2 - S. buytmus var, bayetnus CBS 380; 3-S. cerevisiue CBS 117!, 4 - .4. bayanus var. warum RKM Y-5146; S. cerevisiae x .S'. bayanus var. warum: 5 -ГСЧ-5, 6 - ГСЧ-8* 17 - ГСЧ-11,8- Л-80-4,9 - Шампанская-И/12; S. cerevisiue: 10 - Корнет, 11 - Штейнберг-92, 12 -Харьковская-39, 13-301. 14-261, 15- 125, 16-ГВ-1, 17-ГВ-4, 18-ГСЧ-1. М

Рис.2

маркер молекулярных весов (п.н.) "100 bp DNA Ladder" ("Fermetitas", Литва)

Аналогичную картину имеет- Hcielt! рестриктазный профиль типового штамма S. cerevisiae CBS 117!. Во вторую группу вошли пять штаммов - ГСЧ-5. ГСЧ-8, ГСЧ-11, Шампанская-11/12, J1-80-4. обладающие уникальными //¿»«.'///-профилями 5.8S-I1 S участка рДНК (рис.2, дорожки 5-9 соответственно). Штаммы этой группы имеют сложные паттерны, в которых объединены три фрагмента, характерные для S. bayanus (около 490, 230 и 130 п.н.) и четыре фрагмента, характерные для S. cerevisiae (около 320, 230, 170 и 130 п.н.). Аналогично разделяются исследуемые штаммы дрожжей по результатам ПДРФ-анализа амплифицированных IGS2 фрагментов рДНК, проведенного с использованием эндонуклеаз А/и/ и BanI.

Таким образом, проведенный нами ПДРФ-анализ показал, что большинство изученных штаммов относятся к виду S. cerevisiae и только пять штаммов (ГСЧ-5, ГСЧ-8, ГСЧ-11, Шампанская-11/12, jl-80-4), представляют собой гибриды S.cerevisiaexS. bayanus var. uvarum.

Проведённый кариотипический анализ подтвердил, что большинство штаммов относятся к виду S. cerevisiae. Хромосомные ДНК этих штаммов были разделены на 11-14 полос. Согласно интенсивности свечения окрашенных полос некоторые из них содержат более одной хромосомы. Некоторые спиртовые (985-Т. У-717). а также изученные пиниые и пекарские штаммы дрожжей обладают сложным кариотипом, насчитывающим более 16 хромосомных полос. Дтя этих штаммов характерно наличие четырех хромосомных полос размером штаммы ГСЧ-5. ГСЧ-8 и ГСЧ-11 по кариотипам не отличались от штамма ГСЧ-1, также изолированного с ягод черной смородины и отнесенного нами по рестрикгазным профилям к S. cerevisiae (рис. ЗА, дорожки 5-8).

А I г 3 4 i «> 7 Н <> 10 С 1 12

Рис.3. Пульс-электрофореч хромосомных ДНК дрожжей Savcharomyces (А) и Саузери-гибридизация с зондом ARCH (В). Дорожки: I- Л", cerevisiae YNN 295 (хромосомный стандарт); 2- S. bayanus var. uvarum ВКМ Y-l 146; 3 - ,1 pastoriamis CBS 1538; a cerevisiae x S bayanus var. uvarum; A

- Шампанская-11/12, 5 - ГСЧ-5, 6 - ГСЧ-8, 7

- ГСЧ-11, 9 - Л-80-4; S. cerevisiae: 8 -ГСЧ1.10-301, 11 - 985-Т, 12- У-717.

Штамм Шампанская-11/12 по своему кариогипу существенно отличается от большинства штаммов и стандарта YNN 295; у него имеется хромосомная полоса

размером около 1300 п.п., характерная для дрожжей S. bayamis и S. pastorianus (рис. ЗА, дорожки 2-4), по своему кариотипу этот штамм напоминает гибридные дрожжи S. pastorianus. Два других сбраживающих мелибио'зу штамма ВВ-2 и Харьковская-39 имеют кариотипы, типичные для вида 5'. cerevisiae.

Гибридизация по Cay зерну выявила только по Одной гибридизацинной полосе у всех изученных штаммов (рис. ЗВ), за исключением штамма Шампанская 11/12, у которой маркер характерен для дрожжей S.bayanus и S.pastorianus, тогда, как у остальных штаммов, включая четыре гибрида (Г'СЧ-5. ГСЧ-8, ГСЧ-11, Л-80-4) в положении, характерном для S. cerevisiae (рис. ЗВ, дорожки 1, 5-12).

Множественная ПНР с двумя парами праймеров, специфичных для S. cerevisiae и S. bayanus, также подтвердила видовую принадлежность исследуемых дрожжей. У 50 исследованных нами штаммов винных дрожжей амплифицировался только один фрагмент размером около 1700 п.н., характерный для дрожжей S. cerevisiae (рис. 5. дорожки 2-10). Для штаммов Шампанская-П/12, ГСЧ-5, ГСЧ-8, ГСЧ-11. Л-80-4, характерно два фрагмента размером около 1700 пл. и 330 п.н., что соответствует, видам S. cerevisiae и S. bayanus (рис. 5, дорожки 11-17), что подтверждает их гибридную природу.

Внутривидовой полиморфизм дрожжей S. cerevisiae изучали с;помощью полимеразной цепной реакции с микросателлитиым праймером (GTG)3. Большинство анализируемых штаммов S. cerevisiae имеют ПЦР-арофшш с мажорными фрагментами размером около 750, 670, 450 и 350 п.н. На основании сходства паттернов с праймером (GTG)5 была построена дендрограмма, представленная на рис. 4. Изученные штаммы сформировали отдельный кластер относительно тест-штамма S. bayanus var. uvarum ВК'М Y-l 146. изолированного с ягод винограда. Внутри этого кластера выделяются несколько групп, объединяющих штаммы с более сходными ПЦР-профилями. Наиболее многочисленную группу, составили штаммы, выделенные из соков и с поверхности ягод плодово-ягодных растений. Внутри этой группы можно выделить три подгруппы, одна из которых представлена в основном штаммами, выделенными из малинового и грушевого соков. Вторую подгруппу сформировали штаммы, изолированные из земляничного сока, а также из соков ягод кустарниковых растений (смородина и крыжовник). Третья подгруппа включает плодово-ягодные штаммы, выделенные в различных районах Белоруссии. Часть шампанских и винных дрожжей сгруппированы на дендрограмме вместе.

Состав геномов обнаруженных нами гибридных штаммов cerevisiae '< S. bayanus var. uvarum - ГСЧ-5, ГСЧ-8, ГС'Ч-11, Л-80-4 и Шампанская-11/12С был подробно изучен с помощью Саузерн-гибридизации, ПДРФ-анализа и ссквепирования ядерного гена МЕТ2 и ПДРФ-анализа мигохондриального гена СОХ2. На рис. 6 и 7 указаны результаты ПДРФ-анализа соответственно ядерного гена МЕТ2 и мигохондриального гена СОХ2. Полученные данные свидетельствуют О том, что гибриды ГСЧ-5, ГСЧ-8, ГСЧ-11 и Л-80-4 содержат более полный геном дрожжей S. cerevisiae, включая митохондриальную ДНК. и частичный геном S. bayanus var. uvarum. В то время как гибрид S. cerevisiae х bayanus var. uvarum (штамм Шампанская 11/12), наоборот, содержит более полный геном S. bayanus var. uvarum и частичный геном S. cerevisiae.

Таким образом, подавляющее большинство винных и спиртовых штаммов дрожжей России. Украины и Беларуси принадлежат к биологическому виду S. cerevisiae. Дрожжи [шда S. bayamis var. uvarum среди исследованных

отечественных штаммов дрожжей нами не обнаружены, однако установлено, что среди них, особенно в Беларуси, могут встречаться гибриды 5'. сеге\ч'х1ае х Ьауапи.'; уаг. т'иппп, впервые выделенные нами из естественной среды.

Рис.4 Дендрограмма родства штаммов Saccharomyces, основанная на матрице различий по ПЦР-профилям с микросателлитным праймером (GTO)s. В качестве внешней группы использован штамм Я hayanus var uvaruiи ВКМ Y 4 146 Данные обработаны по программе Neighbor-Joming из компьютерного пакета TREECON

M-I _ Вишня 6 Ябл.7 ВЧР-3

«й? ГМ-15 ГМ-8

BB-I . Кишмя 18

-U?.K

i-Мяссянлрй 3

1—( Tí мл .9

Шт-« Я4л.А.а

Ktvcyp

}

Плодово-ягодные i

Плодово-ягодные II

Плодово-ягодные III

(Шшнанск! ишшыс

S.bayanits var.iivtmini

М I П 4 S í 7 П 191! 1213 Н 1516 П

Рис.5. Идентификация дрожжей S. cerevisiae, S. bayanus и их межвидовых гибридов с помощью множественной (muhiplex) ПЦР, Дпрожкы: S. bayanus var. uvarum: / - RKM Y-ll-46; S. cerevisiae: 2 - HKM Y-502; 3 - 1Х Ч-1; -i -DH-I; 5 - НИлтиая-П; (> Крыжовииковия-27; 7 - С.'ш«ч-23; 8 -Киевская; 9 - Магприч 125; 10 -Холодостойкая 21; S, cerevisiae * S. bayanus var. uvarum: 11 - Шамгшнекая-II 12; 12 - IX41-5; 13 ■ использован штамм S. bayanus var. uvarum BKM Y-l 146. Данные обработаны по программе Neighbor-Joimng ю компьютерного пакета '¡ПЕНСОМ

Рис. 6 Рестриктазиый анализ гена Mli'í'2 штаммов Saccharomyees с использованием эндонуклеаз НсоШ (Л) и ГШ (Ь).

Дорожки: X cerevisiac: I - ВКМ Y-502; 10-ГСЧ U 11 -Сидровая 101,12- К 17, 13 -Крыжовниковая-27; 14- Вишневая-6; Брусмичная-7; .V. bayanm var. itvurttm: 2 -ВКМ Y-I 146; S. hayamts var. buyamis: 3 -CBS 380; S. paslorianm: 4 - CBS 1538; S. cerevrsiae x S bayanus var. uvarura: 5 -1 СЧ-5; 6 - Г'СЧ-8; 7 - ГСЧ-11.8- Jl-80-4; 9 - Шампанская-11/12 M - маркер молекулярных весов (п.н.) "100 bp DNA 1,adder" ("Fermentas").

Рис. 7. Ресгриктазный анализ амплифицированного фрагмента

митохондриальмого гена СОХ2 дрожжей Saccharomyces с использованием эидонукяеазы I'xtl.

Дорожки: I - X cewvisiae ВКМ V-502; 2-5. hayamts var. iivanim ВКМ Y-! 146; 3 - V. bayanus var. hayumis CBS 380; 4-S. pastor/anus CBS 1538; S. cerevisiac x S. bayanus var uvunim: 5 - 1СЧ-5; 6 -ГСЧ-8; 7 - ГСЧ-11; 8 - Ji-80-4; 9 - Шамианская-11/12. M - маркер молекулярных весов (п.н.) "100 bp DNA Ladder" ("Fermentas", Литва).

Глава 4. Исследование физиоло! «-биохимических особенностей винных штаммов дрожжей рода васеваготусез.

Исследования проводились с 10 штаммами дрожжей, отобранными нами из нескольких десятков штаммов в результате предварительных испытаний по следующим показателям; бродильной активности, синтезу ароматических веществ, влиянию на качественный и количественный состав органических кислот, фенодьных соединений.

Дрожжи для получения красных виноградных вин.

Бродильная активность. Исследована динамика потребления глюкозы и фруктозы и накопление спирта выбранными расами дрожжей, что позволило отобрать штаммы Бордо-20 и Берегово-! (т), накапливающие наибольшее количество спирта. Установлено также, что среди исследованных дрожжей нет штаммов-фруктофилов - все они быстрее сбраживают глюкозу, а фруктоза остается основным компонентом несброженных Сахаров.

Синтез ароматических веществ. Значительное внимание уделено исследованию закономерностей синтеза ароматических веществ штаммами дрожжей. Установлены штаммы 47-К и Берегово-1 (т), у которых не наблюдается

резкого увеличения содержания высших спиртов в конце брожения, что, по-видимому, обусловлено большей устойчивостью их клеток к автолизу. Накопление многоатомных спиртов исследованными штаммами происходило постепенно в ходе всего брожения, достигая максимума на 12-15 сутки, что несколько отличается от имеющихся в литературе данных (ШЬсго-Оауоп, 2000). При этом наибольшим накоплением глицерина отличаются штаммы 47-К и Каберне-5. Накопление ацетальдегида, а также этилацетата и других сложных эфиров подчиняется закономерностям, описанным в литературе (Скурихин, 1988). Наилучшим эфирообразованием отличаются штаммы Феодосия 1-19(т), Каберне-5, а также Ашхабадская-3 и Бордо-20, а наименьшим накоплением ацетальдегида -Ашхабадская-3 и 47-К. Отмечена также отрицательная корреляция между накоплением С6-Сю жирных кислот и бродильной активностью изученных дрожжей.

Влияние на качественный и количественный состав органических кислот.

Что касается органических кислот, то наибольший практический интерес представляет яблочная кислота, повышенное содержание которой является одной из проблем отечественного виноделия. В результате проведенных исследований отобран штамм Берегово-1, который способен усваивать до 17% яблочной кислоты, и может использоваться для частичного кислотопонижения сусла во время его сбраживания. Установлено, что в наибольшей степени содержание яблочной кислоты снижается в самом конце брожения.

Винная кислота дрожжами используется очень мало - максимально установленное снижение - 7-9% при использовании штамма Феодосия 1-19 (т). Содержание лимонной кислоты резко снижается в самом начале брожения, достигая минимума на 10-13 сутки, после чего начинает понемногу возрастать. Отобраны штаммы Феодосия 1-19 (т), Ашхабадская-3 и Берегово-1 (т) способствующие максимальному снижению лимонной кислоты в вине. Содержание янтарной кислоты быстро возрастает с начала брожения, достигая максимума на 10-13 сутки, однако в самом конце брожения ее содержание резко снижается. Содержание пировиноградной кислоты возрастает с самого начала брожения, достигая максимума на 7-8 сутки, после чего оно постепенно снижается. Молочная и уксусная кислоты активно накапливались с начала брожения, однако содержание их было в норме во всех вариантах.

Влиннне дрожжей на состав фенольных соединений представляет особый интерес, так как в литературе практически отсутствуют данные по этому вопросу.

Установлено, что в начале процесса брожения доминируют процессы экстракции фенольных веществ (в основном мономерных форм и антоцианов). Особенно это выражено при использовании штаммов Бордо-20, 47-К и Ашхабадская-3, что, по-видимому, обусловлено более высокой активностью в указанных штаммах экстрацеллюлярных ферментов. К концу брожения, наряду с отмиранием клеток дрожжей и осветлением виноматериала, которые сопровождаются снижением концентрации полифенольных соединений и антоцианов в среднем на 30%, резко возрастает интенсивность процесса трансформации полифенольных соединений, о чем свидетельствует возрастание содержания проантоцианидинов. Установлено, что повышенные дозировки 802 способствуют не только ускорению перехода полифенольных соединений во время мацерации, но и сохранению их на стадии осветления виноматериала.

Изучено поведение отдельных групп фенольных веществ во время брожения. Катехины в процессе брожения слабо подвергаются трансформации, их концентрация, увеличивается во время мацерации и снижается на стадии осветления. В большей степени подвержен трансформациям эпикатехин, в то время как катехин и эпикатехингаллат только накапливаются. Антоциановые пигменты подвергаются изменениям, почти не изменяя своего пропорционального соотношения. Нами идентифицированы два новых антоциановых пигмента образующиеся в процессе брожения - это продукту конденсации мадьвидин-3* ршедзида р пиррвицрградной кислотой (вцтцсин А) и с п-кумаровой кислотой (витисин В)- Содержание ¡сафтаровой и коутвровой кислот непрерывно и плавно снижается во время брожения, а галловой •. наоборот возрастает, очевидно, за счет кислотного гидролиза эпикатехингаллата входящего в структуру полимерных процианидинов. Концентрация кверцетина также возрастает к концу процесса брожения, что связано с улучшением его растворимости при повышении содержания спирта в виноматериале. Вещества группы стильбенов, в частности ресвератрол и его гликозид пицеид, обнаружены не были.

Таким образом, исходя из полученных данных, для получения высококачественных красных вин рекомендовано использовать штаммы Бордо-20 и Каберне-5, а для сбраживания высококислотных красных суеел - Берегово-1.

Дрожжи для получения белых виноградных, вин.

Бродильная активность. Отобраны штаммы Кокур-3, Ленинградская и Магарач-17-35, накапливающие наибольшее количество спирта. Исследование динамики сбраживания Сахаров показало, что, хотя фруктоза более активно потребляется в самом начале брожения, она все же остается основным компонентом несброженных Сахаров в вине.

Синтез ароматических веществ. Установлено, что синтез ароматических веществ изученными дрожжами в целом подчиняется закономерностям, описанным в литературе. При этом наиболее благоприятными ароматическими свойствами характеризуются дрожжи Кокур-3, отличающиеся максимальным синтезом сложных эфиров, и 47-К, накапливавшие наименьшее количество высших спиртов и ацетальдегида. В отличие от красных вин, отрицательной корреляции между накоплением С(1-С]() жирных кислот и бродильной активностью не обнаружено. Так, дрожжи Кокур-3, накапливавшие наибольшее их количество, обладали высокой активностью брожения.

Влияние на качественный и количественный состав органических кислот. При изучении закономерностей превращения органических кислот в ходе брожения было установлено, что содержание яблочной кислоты возрастает в первые 4 суток, а затем плавно снижается. В наибольшей степени снижение яблочной кислоты наблюдается при сбраживании дрожжами Ленинградская, что может быть использовано для кислотононижения сусла.

Винная кислота потребляется в белых винах значительно больше, чем в красных. При этом максимально способствуют ее сохранению штаммы Феодосия 1-19 и Холодостойкая-21. При их использовании концентрация винной кислоты в вине на 0,6-0,8 г/л выше, чем при использовании других штаммов. Лимонную кислоту максимально потребляют Феодосия 1-19, Холодостойкая-21 и Ркацители-6. Янтарная кислота непрерывно накапливается в течение всего процесса брожения, наименьшим накоплением характеризуется дрожжи Ркацетели-6,

Магарач 17-35 и Кокур-3, наибольшим 47-К. Содержание молочной и уксусной кислоты было в норме во всех вариантах.

Влияние на качественный и количественный состав фенольных веществ. Характер изменений концентрации полифенольных веществ в процессе сбраживания сусла сходен для всех использованных дрожжей. При этом прослеживается резкий прирост концентрации фенолов на третьи сутки и плавное снижение ее весь последующий период. Резкое повышение концентрации полифенольных соединений обусловлено их высвобождением из твердых частиц под действием экстрацеллюлярных ферментов дрожжей. В наибольшей степени это выражено для штаммов Магарач 17-35, Ленинградская, Кокур-3 и Массандра-3. Снижение концентрации фенолов свиде7ельствует о приросте биомассы и меньшим влиянием процессов окисления на формирование полифенольных соединений вина. Наименее окисленные виноматериалы были получены с использованием дрожжей Ркацетели-6, Рислинг Анапский и 47-К.

Состав комплекса полифенолов белого вина, исследованный нами методами ВЭЖХ, представлен на таблице 2.

Показано, что в сусло на первых этапах брожения переходят из твердых частичек в основном только процианидины, далее в процессе брожения концентрация большинства полифенольных соединений снижается. Наиболее подверженными окислительным и конденсационным процессам являются катехии и процианидины. Эпикатехин и эпикатехингаллат менее подвержены трансформации в процессе брожения. Производные оксикоричных кислот в процессе брожения мало подвержены трансформации. Незначительно возрастает концентрация кофейной кислоты образующейся при гидролизе кафтаровой кислоты, концентрация которой несколько снижается на ранних этапах брожения. Концентрация тирозола в процессе брожения возрастает, что объясняется выделением этого компонента в процессе автолиза отмирающих клеток дрожжей.

Таблица 2.

Содержание полифенольных соединений в внноматерналах Рислинг полученных с

Галловая 1 Тирозол | 5 Катехин го со Эпикатехин гч га Эпикатехин-| штат гО) . Кафтаровая 1 Кутаровая Кофейная п-Кумаровая

47-К 1 29 49 8,5 12 12 29 3 .4,8 33 3 8 0,3

Кокур-3 0,3 25 43 5 11 12 31 3 4 33 4 8 0,3

Ленинградская 0,3 25 53 5,6 И 14 41 2,9 4,2 31 3,5 7,9 0,3

Магарач-125 0,3 19 49 8 12 12 30 2,9 4,3 34 3,6 8,4 0,3

Магарач-17-35 0,3 25 45 7,7 10 12 30 2,9 4,5 34 3,9 8,4 0,3

Массандра-3 0,5 20 49 9,5 16 12 37 2,9 5 32 3,4 8,1 0,3

Рислинг Анапский 0,3 18 50 4,8 11 12 28 2,9 4,5 32 3,3 8,1 0,3

Ркацители-6 0,3 18 50 5,6 11 13 32 3,2 4,5 32 3,4 7,9 0,4

Феодосия-1-19 0,1 23 47 11 20 10 31 2,1 4,3 34 2,7 6.3 0,4

Холодостойкая-21 0,1 17 38 9,3 18 10 31 2,4 4,5 33 2,7 6.3 0.4

Сопоставляя результаты анализов комплекса полифенольных соединений белых виноматериалов можно выделить штаммы Ленинградская и Ркацители-6, с наименьшей окислительной активностью, обеспечивающие получение виноматериалов с более высоким содержанием легко окисляемых полифенольных

соединений, в то время как дрожжи Холодостойкая-21 и Кокур-3 в наибольшей степени трансформируют полифенольные соединения в процессе брожения.

На основании полученных данных и результатов дегустации виноматериалов рекомендуется использовать для получения высококачественных белых вин штаммы 47-ЬС и Кокур-3. Штамм Ленинградская рекомендуется для переработки высококислотных белых сусел.

Дрожжи для получения игристых вин.

Исследования проводились с 11 штаммами дрожжей, предназначенных для получения шампанских вин. Изучение их бродильной активности позволило отобрать штаммы Харьковская-39, Корнет и Шампанская-39, наиболее активно проводящие шампанизацию вина и накопившие максимальное количество спирта. Изучение ароматических свойств данных штаммов и органолептической оценки шампанских вин показало, что наилучшими являются дрожжи Харьковская-39, обеспечивающие накопление наименьшего количества высших спиртов, и наибольшего количества высших спиртов, и наибольшего - глицерина, а также обеспечивающего получение шампанского с максимальной дегустационной оценкой, что позволяет рекомендовать эти дрожжи как наиболее перспективные для создания препаративных форм.

Дрожжи для получения плодовых вин

Развитие плодово-ягодного виноделия в России на основе отечественных рас дрожжей является очень важной и актуальной проблемой, так как многие вопросы плодово-ягодного виноделия до сих пор не изученны.

В работе использовали яблочные, грушевые, вишневые, черничные, голубичные, черноплоднорябииовые, черносмородиновые, красносмородиновые, брусничные, клюквенные, малиновые и клубничные виноматериалы и 50 рас дрожжей селекционированных в России, Украине, Беларуси для получения плодовых вин.

Для получения высокачественных плодово-ягодных виноматериалов отбирались культуры дрожжей максимально полно сбраживающие сахара сусла (сахарозу, глюкозу и фруктозу), накапливающие наибольшее количество спирта, полиолов, фенилэтанола, сложных эфиров, терпеновых и других веществ, определяющих сортовой аромат виц, и наименьшее количество ацетальдегида, метанола, высших спиртов, жирных кислот и производных фурфурола - все эти соединения определяют вкус и аромат вина. Значительное внимание также уделялось способности дрожжей максимально полно сохранять наиболее полезные для здоровья человека компоненты плодовых вин - аскорбиновую и эллаговую кислоты, а также флавонолы. Исследовался также количественный и качественный состав аминокислот и изменение их содержания в процессе брожения.

На основе комплексного исследования ключевых биохимических и технологических свойств важнейших рас дрожжей для плодово-ягодного виноделия установлено, что лучшими являются следующие штаммы дрожжей: для получения яблочных виноматериалов - ГВ-4 и Сидровая - 101; грушевых - ГВ-4 и груша - 10; вишневых — Вишня-6 и Вишня-18; черноплодно-рябиновых - Вишня-18 и Москва-30; черничных - Вишня-18 и ДЧК-1; голубичных - Вишня-18 и Москва-30; черносмородиновых -Вишня 18 и Москва-30; красносмородиновых -Москва-30; малиновых - Москва-30 и Г'СЧ-1; клюквенных-ГВ-4; брусничных -Брусничная 7 и ГВ-4; клубничных-Вишня-18 и Земляничная-9.

Глава 5. Технология препаратов винных и спиртовых ЛСД на основе мелассы, как основного сырья для культивирования дрожжей.

Эта часть работы посвящена разработке технологии получения препаратов винных и спиртовых ДСД на основе определенных ранее лучших рас дрожжей и использования их в виноделии (АСВД) и спиртовом производстве (АССД).

При создании отечественных АСВД и АССД при культивировании дрожжей была использована меласса, в качестве основного субстрата. Меласса является довольно необычным субстратом для культивирования этих дрожжей. Поэтому необходимо было скорректировать такие параметры культивирования, как концентрация питательных веществ, температура и рН среды.

На первом этапе исследований определяли возможность роста винных и спиртовых дрожжей на концентрированных мелассных субстратах, так как эти дрожжи менее осмофильно стойкие. Культивирование винных и спиртовых дрожжей на мелассных средах концентрацией СВ от 2% до 17% показало, что в данных условиях они хорошо накапливают биомассу. Установлено, что наиболее экономически выгодным для винных дрожжей является, использование мелассных срсд с до СВ 14%, а для спиртовых дрожжей 985-Т-среды с СВ до 17%.

На следующем этапе исследований были определены наиболее оптимальные для культивирования вшмых и спиртовых дрожжей значения температуры и рН. Показано, что температурный оптимум роста винных дрожжей находится от 27 до 33°С; шампанских - при 27 °С, и спиртовых - при 35°С. Учитывая необходимость применения повышенных температур при получении сухих дрожжей, для стимуляции синтеза трегалозы, можно рекомендовать выращивание шампанских дрожжей в диапазоне температур 27-30°С; винных - 30-33°С; спиртовых - 33-35°С. При температуре 35°С растут все дрожжи, что особенно важно при получении АСД шампанских рас - Харьковская 39.

Культивирование при рН 3,0 позволяет снизить риск инфицирования всего технологического процесса, но при этом снижается накопление биомассы, поэтому оптимальным рН среды культивирования для получения винных и спиртовых АСД признан диапазон рН 3,8-4,2.

На практике для получения дрожжей реально используется 2 способа культивирования: периодический и приточный. Первоначально нами было отдано предпочтение периодическому способу, так как он позволяет вести процесс в асептических условиях.

Получение АСД при культивировании периодическим способом.

Разработку технологии препаратов АСД для винодельческого и спиртового производства начали с шампанских дрожжей раса Харьковская-39, поскольку, с одной стороны, к этим дрожжам предъявляются более высокие требования, такие, как чистота брожения и вкус готового вина, а, с другой стороны, они являются значительно менее термостойкими и осмофильноустойчивыми, чем расы дрожжей для других отраслей виноделия и спиртовые дрожжи.

Была разработана технологическая схема производства сухих винных дрожжей, которая предусматривала следующие стадии: 1) Приготовление посевного материала (3 этапа):

О пересев из пробирки в колбу со 100 мл солодового сусла (СВ=10%); П рассев содержимого колбы в б таких же колб, со 100 мл. солодового сусла (СВ=10-12%);

□ засев инокулятора общим объемом 10 литров (рабочим - 8 литров), оснащенного системой аэрации содержимым из этих 6 колб. Среда культивирования: смесь мелассы и сусла 1:1 - СВ = 12-14%, КН2Р04 - 480 мг; (КН4)2804 - 15 г; М^БС^ - 48 мг; рН довести серной кислотой до 4,2, дрожжевой автолизат - 80 мл; пеногаситель (Лапрол 3003) - 2 мл. Длительность каждой из этих 3 лабораторных стадий - 16-18 часов. Культивирование ведут при температуре 27. ОС.

2) После окончания культивирования содержимое инокулятора переносят в дрожжерастильный аппарат общим объемом 360 л с объемом среды 250-280 л концентрацией СВ 10%. Соли азота и фосфора вносятся из расчета содержания азота - 4,9%, фосфора - 3,4%, сульфат аммония - 0,523 кг; диаммонийфосфат -0,198 кг. Дополнительно вносят также источники калия - КС1 - 0,16 кг, а также микроэлементы, биотин и пантотеновую кислоту. Культивирование проводят в анаэробных условиях в течение 24 часов. Полученную биомассу дрожжей - 3 кг переводят в дрожжерастильный аппарат общим объемом 1200 литров с объемом среды 950 литров с концентрацией СВ 11%. Источники азота и фосфора вносили из расчета содержания азота - 4,2%; фосфора - 2,9%; сульфат аммония - 2,685 кг; диаммонийфосфат - 1,013 кг. Культивирование проводили при очень слабой аэрации 25 м3 воздуха на 1 м3 среды в час в течение 11 часов. При этом ожидается получение 21 кг биомассы дрожжей. Температуру на стадиях ЧК следовало поддерживать на уровне 27 ПС.

Товарную стадию предполагалось проводить в дрожжерастильном аппарате общим объемом 6300 литров, в который добавляют мелассу из расчета концентрации СВ=11%, доводят общий объем среды до 4500 литров. При этом рассчитывали получить 120 кг дрожжей. Соли азота и фосфора вносились из расчета содержания в дрожжах азота - 2,2%, фосфора - 0,9% (оптимальные концентрации при получении сухих дрожжей) - диаммоншфосфата - 2,097 кг; сульфата аммония - 10,676 кг. Дополнительно предполагалось вносить 3,5 кг КС1, микроэлементы, биотин и пантотеновую кислоту. Культивирование предполагалось вести 24 часа, при аэрации 1 л воздуха /1 л среды в минуту.

В ходе проведения культивирования выяснилось, что шампанские дрожжи обладают несколько большей удельной скоростью роста, чем это предполагалось. Так в ЧК-1 она составляла 0,147 против 0,112 расчетных, в ЧК-2 - 0,149 против 0,108 расчетных, и на товарной стадии - 0,133 против 0,108. Известно, что выход дрожжей при такой же технологии составляет около 25%, а выход шампанских дрожжей в наших опытах был в 1,5 раза меньшим, что вероятнее всего объясняется несколько иным обменом веществ у шампанских дрожжей. Далее полученную биомассу сепарировали, промывали водой, фильтровали под вакуумом, гранулировали и отправляли на сушку.

Сушка винных дрожжей. Анализ данных литературы показал, что наиболее перспективными видами сушки являются лиофильная и сушка в кипящем слое. Однако, оборудование для лиофильной сушки очень дорогое, сложное в эксплуатации: процесс сушки на нем очень длительный и малопроизводительный, поэтому ни один дрожжевой завод не использует лиофильную сушку. В связи с

-5ТМ11 ПЛО цллпоплпоиип ГГПЛ1)Л»»ИПиЛ1 (ГО Л1И1ШНЬ"А ичтпптогл ^ПЛЙ // А ЧЛЛМОТМЬ'«

85% клеток. Наиболее оптимальными при этом были режимы, обозначенные в таблице под номерами 3 и 4.

Испытания полученных препаратов. Исследования, проведенные на аппарате Варбурга и представленные в таблице 4, показали, что, несмотря на довольно высокое количество мертвых клеток, полученные препараты шампанских АСД обладают значительной дыхательной и бродильной активностью.

Шампанизация вина в бутылках показала, что все опытные препараты сухих дрожжей даже превосходят по сбраживающей способности и сухие дрожжи ЗессоГегт производства Дании, и дрожжевую разводку, о чем свидетельствует более высокое содержание спирта (в среднем на 0,3-0,4%), и повышенное давление ССЬ в шампанском, полученном с использованием наших препаратов.

Интересно, что количество физиологически активных клеток в опытных вариантах в конце шампанизации было несколько выше, чем в контроле - несмотря на то, что первоначальное количество живых клеток в них было намного меньше. Общее содержание альдегидов в опытных вариантах было несколько выше, чем в контроле, что свидетельствует об их большей окисленности. Несколько снижалась в опытных вариантах титруемая кислотность, и увеличивалось содержание общей БОа. По результатам дегустации лучшим был признан опытный вариант №4, полученный с использованием дрожжей, высушенных по режиму №4. Учитывая также и то, что шампанское, полученное с этими дрожжами, имело и ряд других положительных характеристик - высокое содержание спирта, давление углекислоты, количество жизнеспособных клеток и низкое содержание альдегидов - нами рекомендуется использовать для сушки шампанских дрожжей режим №4.

Таблица 3

Режимы пысушивания шампанских дрожжей расы «Харьковекяя-39»

Время высушивания, Заданная т 1 11ХОЙ Тпыхол Влажность, Мертвые

мив. температура, ГС Ш, % клетки.

.0-7 ' : ' 56 20-57 26-30

7-12 48 57-50 30-38

1 12-17 42 50-43 38-38 8,62 85%

17-22 38 43-39 38-37

22-27 36 38-37 37-36

0-4 48 25-48 27-27

4-8 46 48-46 27-27

8-12 42 46-43 27-28

2 12-15 38 43-40 28-30

15-20 36 40-36 30-33 7,44 75%

20-25 33 36-32 33-32

25-30 30 32-30 32-31

30-37 32 30-32 31-30

0-4 50 30-50 30-30

- 4-8 46 50-47 30-30

3 8-12 40 47-42 30-35 8,46 70%

12-20 36 42-37 35-35

20-35 32 37-32 35-32

0-5 50 25-51 27-39

5-18 48 51-49 39-39

4 8-12 40 49-42 39-39 . 7,58 70%

12-20 36 42-37 39-32

20-30 32 37-34 32-32

0-5 52 23-52 25-28

5 5-8 48 52-50 28-38 8,02 80%

8-12 42 50-44 38-38

12-25 36 44-37 38-35

Таблица 4.

Активости дыхания и брожения шампанских дрожжей расы Харьковская-39, _высушенных в различных режимах._

Варианты Бродильная активность (мкл С02) Дыхательная активность (мкл Ог)

Вариант-1 31,2 35,4

Варна нт-2 39,6 58,7

Вариант-? 61,2 69,6

Вариант-4 70,8 89,7

Вариант-5 26,4 24,8

Препарата Зеш^егт 23,8 22,5

Контроль Харьковская-39 90,5 107,4

Примечание: №№ вариантов соответствуют М№ режймов сушки

Однако, несмотря на хорошие технологические показатели полученных АСД, высокий % мертвых клеток в них следует считать недопустимым. Это показывает, что культивирование винных дрожжей периодическим способом не дает возможности подготовить их к сушке и поэтому не может быть использовано для получения качественных АСВД. В связи с этим было решено культивировать винные и спиртовые дрожжи прочным способом.

Получение шампанских, винных и спиртовых АСД приточным способом культивирования.

Режим приточного культивирования (его товарная стадия) был отработан на установке ФК-20. Работу проводили с расами шампанских дрожжей Харьковская 39 и Корнет; винных дрожжей Кокур-3 и Вишня-18; спиртовых дрожжей 985-Т.

Поскольку какие-либо сведения по приточному культивированию винных или спиртовых дрожжей в литературе отсутствуют, то режим внесения мелассы был разработан нами эмпирически в расчете на удельную скорость роста 0,090. Было также предложено поднимать в конце культивирования рН среды с 4,2 до 5,8-6,2 для стимуляции синтеза трегалозы. Кроме того, был исследован температурный режим выращивания дрожжей. При этом сравнивались два режима; первый предусматривал выращивание дрожжей при оптимальной температуре и подъем температуры за 2 часа до окончания культивирования до 34-35 ОС. Другой режим культивирования предусматривал более высокую температуру 32-34°С для всех рас дрожжей и поднятие её до 35°С в конце культивирования. Спиртовые дрожжи культивировали только при 1=33°С с дальнейшим подъемом до 36-38°С.

Выход дрожжей Харьковская 39 и Корнет снижался при повышении температуры до 65,5% по сравнению с 72,2% при их оптимальной температуре роста, дрожжи Кокур-3 до 60% по сравнении 69,37% соответственно; Вишня-18 до 60% по сравнению с 69,37% при оптимальных температурах культивирования.

Далее проводили сушку дрожжей по режиму 4, подобранному для сушки дрожжей, культивированных периодическим способом. Результаты свидетельствуют о том, что культивирование дрожжей приточным способом обеспечивает значительно большую выживаемость их при сушке, особенно при культивировании их при повышенных температурах, где выживаемость дрожжей при сушке была на 19,3-24,7% выше, чем при культивировании при температуре, оптимальной для роста.

Кроме того, нами была изучена возможность повышения выживаемости дрожжей путем их обработки композицией поверхносто-активных веществ,

используемых при сушке хлебопекарных дрожжей. Композиция состояла из глицеридов стеариновой кислоты, лимонной кислоты и этиленпшколь стеарата, добавлялась в количестве 0,3-1,0% к сухому весу дрожжей в виде водной эмульсии с СВ 5-25% и выдерживалась 20-30 минут. Данные по влиянию эмульгатора на выживаемость дрожжей во время сушки представлены в таблице 5. Как видно из таблицы процент мертвых клеток при концентрации эмульгатора 0,3 % к сухому весу составлял в среднем 26%, дальнейшее увеличение эмульгатора малоэффективно и кроме того снижаются оргаполентические показатели готового вина.

Таблица 5

Н.шшшс концентрации эмульгатора па выживаемость шампанских и винных

дрожжей во прсии сушки (% мертвых клеток).

Раса дрожжей Концентрация эмульгатора, %

0,1 0,2 ^ 0,3 0,4 0,5 0,6

Харьковская-34 38,2 32,3 29,3 29,4 30,1 26,2

Кокур-3 35,4 28.3 25,8 27,1 2.6,8 ■23,Г

Вншня-18 38,2 34.4 29,3 30,2 30,0 28,2

985-Т 37,1 33,4 25,6 27,3 26,2 26,6

Установлено также (таблица 6), что режим подачи азота и фосфора при культивировании дрожжей играет важную роль в обеспечении получения их, устойчивых к сушке. Наилучшим вариантом является внесение 15% источников азота и фосфора в складку, а остальное количество - равными частями на протяжении всего процесса культивирования за исключением последних 3 часов. Данный режим притока азота и фосфора практически не оказывает аффекта на выход биомассы дрожжей, по значительно повышает устойчивость дрожжей к сушке.

Таблица 6

Сушка пшшьп и спиртовых дрожжей, выращенных с непрерывным

Раса Влажность, % Доля мертвых клеток, %'

Харьковская-39 7,26 26,2

Вишня-! 8 7,13 25,0

П 1" \А со с* 7,72 19,5

Промышленные испытания разрабатываемой технологии ДСВД и АССД проводили в экспериментальном цехе Московского дрожжевого завода ООО «Дербенсвка-2», оборудованного дрожжерастильными аппаратами объёмом 360 дм3, 1200 дм3 и 6300 дм3, а также сушилкой кипящего слоя «Асгота(ю>. Режимы культивирования разрабатывались с учетом производственных возможностей предприятия. Разработанная технология АСВД и АССД предполагает культивирование дрожжей в 4 стадии:

1. лабораторная (в 3 этапа) аналогично описанной ранее для культивирования дрожжей периодическим способом;

2. стадия ЧК-1 - проводится в аппарате объемом 360 дм3 по технологическому режиму, приведенному в таблице 7;

3. стадия ЧК-2 - проводится в аппарате объемом 1200 дм3 по технологическому режиму, приведенному в таблице 8;

4. товарная стадия - проводится при повышенной температуре, подобранной для каждой расы дрожжей в предварительных исследованиях, но схеме с использованием сразу двух аппаратов объемом

по 6300 дм3. При этом биомасса дрожжей предварительно наращивается в одном аппарате, а затем половина полученной биомассы используется в качестве засевного материала для другого аппарата и затем культивирование ведут еще 10-12 часов уже в двух аппаратах.

В качестве примеров, в таблицах 9,10 и 11 приведены технологические режимы культивирования, разработанные соответственно для дрожжей ЗассЬаготусм сеге\'Ыае рас Харьковская-39, Кокур-3 и 985-Т.

Таблица 7.

Технологический режим культивирования винных и спиртовых дрожжей на стадии ЧК-1.

Время Масса загружаемых материалов Уап Концентрация Т рН Аэрация

задами парата дрожжей С13

час кг 1 м г/дм' % ед.

0 Меласса, М46 (раствор 700 кг М4«м'> -52,2 <75 л> 0,23 16 31 4.3-4,8

Д и а м м о н и йфосфат -0,15 Слабая

Сернокислый аммоний -0,05 непрерывн

Калий хлористый -0,18 ая

Биотин, мг -8,3

Пантотенат кальция, г -2,61

Микроэлементы, табл. -1

Вода -155

Серная кислота, см' -250

Стерилизация питательной среды подачей острого пара в аэрационную систему: при давлении Р 1,8 кгс/см" в течение т = 0,5-1,0 ч

0 Ч;!сс<{!1ыс дрожжи (8 дм1- 200 г. биомассы) 0,25 0,4 14-15 28-33 4,5-5,0 Слабая непрерывн

14-16 Конечные дрожжи - 2,8-4,0 кг 0,25 16 4-4,5 28-33 4,3-4,6 ая

Таблица 8

Технологический режим культивирования виинмх и спиртовых дрожжей па стадии Ч1С-2.

Время Масса загружаемых материалов Уап Концентрация т рН Аэрация

дрожжей СВ

час кг м* г/дм' % "С ед.

0 Меласса, М46 (раствор -113.4 700кгМ46/м') (162 д) 0,5 16 33 4,3-4,8 Слабая непрерывн ая

Диаммонийфосфат -0,6

Сернокислый аммоний -1,02

Калий хлористый -0,4

Биотин, мг -18,1

Пантотенаг кальция, г -5,67

Микроэлементы, табл. -3

Вода -338

Серная кислота, смя -650

Стерилизация питательной среды подачей острого пара в аэрационную систему: при давлении Р=1,8 кгс/смг в течение т = 0,5-1,0 ч

0 Засечные дрожжи (2,8- -2,0 4,0 кг - 0,25 м') 0,75 2,9 14-15 12-13 4,5-5,0 Слабая непрерывн ая

14-16 Конечные дрожжи - 21-30,0 кг 0,75 42,9 4-4,5 28-33 4,3-4,6

Таблица 9.

Ирошнодствсшюс культивирование шампанских дрожжей Харьковская-39.

______Товарная стадия. Аппарат Т-1__________

13рол»я брожения Меласса СА ДЛФ КС1 Набор Т св рП Ф.ч Накопление Г»ио-масса

ч л кг кг кг м' "С % ед мл г/л кг

Р. 17 1,91 0,67 0,38 2,0 33 4,2

11/6 16 1,12 0,28 - 3759 33 2,1 4,2 1,8 9,2 34,5

1 19 33 4,2

2 23 1,61 0,39 - 4190 33 2,1 4,25 2,0 8,4 35,2

3 20 4190 33 11,6 48,6

4 20 2,06 0,51 0,93 4190 33 22 4,3 2,2 12,8 53,6

5 25 33 14,7

6 25 2,5 0,6 - 4344 33 2,5 4,3 3,0 15,2 66,0

7 25 33 17,6

8 41 3,58 0,89 - 4498 33 2,8 4,4 2,8 20,4 91,8

9 45 - 33 20,4

10 25 — — 5268 33 2,8 34,2 3,4 16,8 88,5

11 35 1,5 0,7 0,57 2804 33 3,0 4.2 3,2 27,6 77,4

12 40 33 4,2

13 40 1,5 0,4 3112 33 3,5 4,3 3,0 35,2 109,5

14 40 33 4,4

15 45 — 0,9 3266 33 3,6 4,6 3,0 40,0 ' 130,6

16 45 33 4,6

17 45 0,9 1,2 3574 33 3,6 4,6 2,0 40,0 142,9

18 20 3605 33 3,6 4,6 1,2 43,2 144,2

19 20 33,5 4.7 45,0 162,2

20 40 3882 34 3,8 5,0 0,8 43,2 167,7

21 34,5 5,2 0,6

22 4036 35 3,9 5.4 0,4 48,4 195,3

Производственное культивиропамие шампанских дрожжей Харьковскаи-39. Товарная стадия. Аппарат 1-2

Время брожения Меласса СА ДЛФ ко Набор Т св рН Ф.ч. Накопление Биомасса

ч л кг кг кг °С % ед т/л кг

р. 25 - 0,9 0,57 32

Н/б 35 0,5 0,7 2837 33 .3,0 4,2 3,2 31,2 . 88,5

1 40 0,5 33 4.2

2 40 0,5 0,4 Н 2961 33 3,5 4,2 3,4 30,4 90,0

3 40 0,5 1,2 33 4,2

4 45 0,5 - 3270 33 3,8 4,2 3,4 37,6 123,0

5 45 0,5 33 4,2

6 45 0,9 3580 33 3,5 4,15 2,0 44,4~~1 158,9

7 25 3611 33 3,8 4,3 1,4 46,4 167,5

8 25 33,5 4,7 49,5 178,7

9 40 4013 34 3,8 5,0 0,8 44,0 176,6

10 дображивание 34,5 5,2

II | 4137 3S 3,9 5,4 0,4 45,6 188,6

Таблица 10.

Производственное культивирование винных дрожжей Кокур-3. _______ Товарная стадия. Аппарат Т-1._____

Время брожения Меласса СА ДАФ КС1 1 Мор Т св рн Ф.ч Накопление Биомасса

ч дм кг кг кг м' "С % ед мл г/дм' кг

Р. 17 1,91 0,67 0,38 2,0 33 4,2

Н/б 16 М2 0,28 — 3759 33 2,1 4,2 1,8 10,0 37,59

1 19 33 4,2

2 23 1,61 0,39 — 4190 33 2,1 4,25 2,0 9,3 38,97

3 20 4190 33

А 20 2,06 0,51 0,93 4190 33 2,2 4,3 2,0 13,4 56,15

5 25 33

6 25 2,5 0,6 - 4344 33 2,5 4,3 1,7 15,9 69,07

7 25 33

8 41 3,58 0,89 - 4498 33 2,8 4,4 1,8 22,5 101,21

9 45 - 33

10 25 — — 5268 33 2,8 4,2 21,8 114,84

II 35 1,5 0,7 0,57 33 3,0 4,2 2,2

12 40 3112 33 4,2 29,3 91,18

13 40 1,5 0,4 33 3,5 4,3 2,0

14 40 3266 33 4,4 37,0 120,84

15 45 — - 1,2 33 3,8 4,6 2,0

16 45 3574 33 4,6 43,5 155,47

17 45 0,9 33 3,8 4,6 2,0

18 20 3605 33 3,8 4,6 1,2 48,2 173,76

19 20 33,5 4,7

20 40 0,9 3882 34 3,9 5,0 0,7 49.9 193,71

21 34,5 5,2 0,5

22 4036 35 4,0 5,4 0,2 52,3 211,08

Производственное культивирование вншшх дрожжей Ко>сур-3. Товарная стадия. Аппарат Т-2.

Время брожения меласса СА ДАФ КС1 Набор Т СВ рН Ф.ч. Накопление Биомасса

ч л кг кг кг м °С % ед г/л кг

Р. 25 - 0,9 0,57 32

И/б 35 0,5 0,7 2837 33 3,0 4,2 2,4 32,0 90,78

1 40 0,5 33 4,2

2 40 0,5 0,4 2961 33 3,6 4,2 2,4 36,2 107,19

3 40 0,5 33 4,2

4 45 0,5 1,2 3270 33 3,9 4,2 1,6 38,9 127,20

5 45 0,5 33 4,2

6 45 0,9 3580 33 3,8 4,15 1.4 47,9 171,48

7 25 361Р 33 3,8 4,3 1,2 51,6 186,33

8 25 33 4,7

9 40 4013 34 3,9 5,0 0,8 49,3 197,84

10 дображивани 35 5,2 0,5

11 1111 "137 35 4,0 5,4 0,4 52,8 218,43

Таблица 11.

Произведетвенное культивирование спиртовых дрожжей 985-Т. Топярная стадия. Аппарат 1-1.

Время брожения Меласса СЛ ДАФ КС] Набор Т св рН Ф.ч Накоп ление Ниомасса

ч дм кг кг кг »' "С % Ед. мл г/дм' кг

!'. 17 1,91 0,67 0,38 2,0 33 4,2

Н/6 16 1,12 0,28 - 3759 33 2,1 4,2 1,8 10,7 37,59

I 19 33 4,2

2 23 1,61 0,39 4190 33 2,1 4,25 2,0 10,9 38,97

3 20 4190 33

4 20 2,06 0,51 0,93 4190 33 2,2 4,3 2,0 14,2 56,15

5 25 33

6 25 2,5 0,6 - ' 4.144 33 2,5 4,3 1,7 17,1 69,07

7 25 33

8 41 3,58 0,89 4498 33 2,8 4,4 1,8 24,9 101,21

9 45 - 33

10 25 - - 5268 33 2,8 34,2 22,3 114,84

11 35 1,5 0,7 0,57 33 3,0 4,2 2,2

12 40 ЗН2 33 4,2 31,3 91.18

13 40 1,5 0,4 33 3,5 4,3 2,0

14 40 3266 33 4,4 39,3 120,84

15 45 - - 1,2 33 3,8 4,6 2,0

16 45 3574 33 4,6 45,7 155,47

17 45 0,9 33 3,8 4,6 2,0

18 20 3605 33 3,8 4,6 1,2 51,3 173,76

19 20 34 4,7

20 40 0,9 3882 35 3,9 5,0 0,7 57,8 193,71

21 36 5,2 0,5

22 4236 38 4,0 5,4 0,2 57,9 224,08

Производственное культивирование спиртовых дрожжей 985-Т. Товарная стадия. Аппарат Т-1.

Время брожения меласса СА ДАФ ш Набо Р т СВ рН Ф.ч Накопление зиомасса

ч л кг кг кг м' '.1С % ед г/л кг

Р. 25 - 0,9 0,57 32

Н/б 35 0,5 0,7 2837 33 3,0 4.2 2,4 32,7 90,78

1 40 0,5 33 4,2

2 40 0,5 0,4 2961 33 3,6 4,2 2,4 38,1 107,19

3 40 0,5 33 4,2

4 45 0,5 1,2 3270 33 ■4,9 4,2 1,6 40,3 127,20

5 45 0,5 33 4,2

6 45 0,9 3580 33 3,8 4,15 1,4 49,8 171,48

7 25 3611 33 3,8 4,3 1,2 53,8 186,33

8 25 33 4,7

9 40 4013 34 3,9 5,0 0,8 54,2 ¡97,84

10 дображивание 35 5,2 0,5

11 4337 35 4,0 5,4 0,4 56,9 225,6

Схема с одновременным задействованием двух товарных аппаратов позволяет эффективнее использовать имеющиеся производственные мощности. Как показывают данные таблиц 9-11, разработанный нами режим культивирования позволяет получить 384-450 кг биомассы дрожжей (СВ=25%) с двух дрожжерастильпых аппаратов объемом по 6,3 м1 каждый при задействовании их в течение 22 и 11 часов.

Химический анализ полученных винных и спиртовых ЛСД показал, что содержание трегалозы в них 14,7%, что свидетельствует о стойкости их к высушиванию и длительному храпению. Содержание живых клеток - в пределах 75-80%, содержание азота и фосфора 1,7% и 0,97% соответственно, влажность -7,6%, посторонней микрофлоры не более 0,01% от общего количества клеток, в том числе диких дрожжей <0,005, бактерий <0,02%.

Полученные препараты АСВД полностью отвечают требованиям, предъявляемым МОВВ к препаратам активных сухих дрожжей.

Исследование качества сухих винных и спиртовых дрожжей.

Изучены различные методы оценки жизнеспособности АСВД и АССД. Особое внимание было уделено усовершенствованию методов флуоресцентной микроскопии. В этой связи был проведен различных флуорохромов, позволяющих эффективно и избирательно проводить дифференциальную окраску поврежденных и интактных клеток сухих дрожжей. Установлено, что наиболее перспективными являются бромид эгндня (3,8 диамино-5-этил-6-фенилфенаптридиниум, бромид) и ДАГ1И (4,6-диамвдипо-2-фенилиндол, дилактат). Витальная окраска этими двумя флуорохромами, имеющими разный цвет флуоресценции, с одной стороны позволяет достоверно определять поврежденные клетки дрожжей, а с другой - дает возможность применять компьютерные методы обработки и анализа изображений, основанные на избирательности по цвету, что значительно ускоряет и упрощает количественный анализ, по сравнению с традиционными методами.

Исследованы также методы храпения полученных препаратов ЛСД. Установлено, что оптимально хранить сухие дрожжи в вакуумной упаковке при температуре 4-6°С. В этих условиях падение активности полученных препаратов составляет около 1% в месяц. Показано, что при разгерметизации упаковки жизнеспособность дрожжей падает с 70% до 5% за 2 месяца, даже при хранении их при оптимальной температуре.

Разработка методов высокоэффект ивной подготовки ЛСНД и АССД,

В ходе исследований по данной теме была впервые разработана и научно обоснована технология подготовки сухих дрожжей к брожению. При этом были изучены цитологические и физиолого-биохимичсские особенности сухих дрожжей при различных способах восстановления их активности, показавшие что:

- на первых этапах реактивации сухие дрожжи крайне чувствительны к различным ингибиторам, наибольшее значение среди которых имеют этиловый спирт и низкое значение pH (<2,5) среды. Исследованы механизмы действия данных ингибиторов. В то же время установлено, что высокое содержание Сахаров в среде реактивации (до 20%) ингибирующего действия практически не оказывает;

- предварительная ре гид ратания сухих дрожжей, рекомендуемая многими исследователями, крайне слабо влияет на ход их дальнейшего восстановления жизнеспособности и практически является бесполезной;

- на восстановление активности сухих дрожжей большое значение имеет присутствие в среде углеводов, среди которых наибольшим стимулирующим

действием обладай' сахароза в концентрации 10%, и источников азота, лучшими из которых являются соли аммония. Нско'1 орым стимулирующим действием обладает также витамин I?,, однако его следует использовать очень осторожно, поскольку при использовании его повышенных дозировок наблюдается обратный эффект - ухудшение физиологической активное™ клеток и нарушение их структуры;

- особенный интерес для быстрого восстановления активности дрожжей представляют комплексные активаторы брожения, созданные на основе солси аммония, витамина В| и микроэлементов, наиболее эффективным из которых был признан коммерческий препарат «Суперактиватор ДЧ» (производство компании «Dal Cin», Италия).

- лучшим вариантом подготовки сухих дрожжей к брожению является непосредственное их внесение, содержащую 10% сахарозы, и 0,3 г/л комплексного активатора «Суперактиватор ДЧ» с выдержкой в ней в течение 2-3 часов при температуре 35°С. Принципиально важным является то, чтобы для ее приготовления не использовались виномагериалы или другие спиртосодержащие жидкости. Данный способ подготовки позволяет дрожжам восстановить структуру их клеток и подготовить их к дальнейшему контакту со спиртом, что особенно важно для сухих шампанских дрожжей.

- разработанный метод позволяет не только интенсифицировать процесс брожения, но и улучшить качество готового продукта за счет большего накопления спирта, глицерина и других важных веществ.

Фнзполого-бнохнмичсскис особенности сухих Ш111НЫХ дрожжей

Исследования в этом направлении особенно интересны, поскольку, несмотря на большое количество работ, посвященных сухим винным дрожжам, в литературе практически отсутствуют работы, где сравнивались бы препараты винных ЛСД и культуры исходных дрожжей, на основе которых они были созданы.

Паши исследования показывают, что высушенные дрожжи обладают целым рядом особенностей но сравнению с обычными дрожжами:

- они характеризуются меньшей удельной бродильной активностью, но при этом более активно размножаются, что приводит к накоплению большего количества клеток;

- высушенные дрожжи обеспечивают более глубокое выбраживапие Сахаров, накапливая больше спирта и С02, последнее особенно ценно при производстве шампанских вин.

- при использовании высушенных дрожжей происходит увеличение содержания в вине как желательных (глицерин, фенилэтанол), так и нежелательных его компонентов (изоиентанол, уксусная кислота, и ацетальдегид). Влияние же на синтез большинства других ароматических компонентов процесса высушивания является неоднозначным и зависит от расы дрожжей;

- высушенные дрожжи способствуют повышенной экстракции фепольных веществ, а частности, антоцианов, во время сбраживания красных виноградных и плодовых вин и положительно влияют на интенсивность окраски полученных виноматериалов.

В целом, применение сухих дрожжей в наших исследованиях благоприятно сказывалось на качестве вигг и виноматериалов, обеспечив ему в производственных испытаниях более высокую дегустационную оценку, по сравнению с обычными дрожжами, что подтверждается актами испытаний с випзаводов России.

Глава 6. Разработка биотехнологии иммобилизованных дрожжей в виноделии.

Иммобилизованная форма дрожжей в виноделии представляет значительный практический интерес, но дает возможность решать достаточно серьёзные проблемы в аспекте повышения рентабельности производства при значительном улучшении качества продукта.

Целью настоящей части работы является получение иммобилизованных винных дрожжей и изучение возможности их использования в виноделии.

Первым этапом работы была иммобилизация дрожжей в криогаш ПВС, включающая стадии накопления биомассы, приготовление растворов ПВС, замораживание суспензии клеток в растворе полимера и оттаивание гранул, что представляет довольно сложньй процесс, с точки зрения многочисленности факторов, влияющих на характеристики биокатализатора

В работе необходимо было подобрать такие условия иммобилизации дрожжей в криогель ПВС, при которых обеспечивалась бы максимальная жизнеспособность дрожжей в процессе формирования биокатализатора с последующей максимальной метаболической активностью иммобилизованных клеток в бродильных процессах.

Для этого в работе были использованы клетки дрожжей 8ас1)атгошусе5 еегеу1з1ае- Шампанская-39, выращенные традиционным способом (па виноматериале, рН 3,0) и выращенные в других условиях на традиционной среде роста на виноматериале, но со значениями рН 5.0 и 7,0, при разной температуре: !5°С, 20°С, 30°С, а также на питательной полусинтетической среде (рН 5,6), часто применяемой для культивирования дрожжей.

С увеличением температуры культивирования от 15°Сдо 30°С удельная скорость рост дрожжей на виноматериале увеличивалась практически пропорционально, примерно в 1,5 чем при культивировании на полусинтетической среде, рН не влияло на удельную скорость роста и на накопление биомассы дрожжей. Выход влажной биомассы клеток на винной среде составляло 7г/дм\ а па нолусинтетической -15г/дм*.

Далее проверялось влияние условий культивирования клеток, изменение состава среды, температура и длительность процесса на бродильную активность дрожжей.

Бродильная активность дрожжей, выращенных на полусинтетической среде, практически не отличается от активности дрожжей, выращенных на виноматериале, однако по биохимическим характеристикам имеются существенные отличия. Удельная концентрация трегалозы в дрожжевых клетках, выращенных на полусинтетической среде почти на 120 % выше, чем на виноматериале, что свидетельствует о лучшей подготовке дрожжей к стрессовой ситуации, возникающей при их иммобилизации, гак как трегалоза сохраняет целостность клетки при неблагоприятных условиях культивирования.

Уровень внутриклеточного ЛТФ в дрожжевых клетках, выращенных на полусинтетической среде, был также высокий, причем максимум величины удельной концентрации А'ГФ был в конце логарифмической фазы роста.

Анализ жирнокислотиого состава липндов биомассы дрожжей показал, что уровень ненасыщснности жирных кислот в клетках, выращенных при 20°С в два раза выше, чем в клетках, выращенных при 30°С. Высокий общий уровень ненасыщенное™ мембранных линидов гарантирует поддержание проницаемости и

Ч'скучисти мембран, что обеспечивает адаптацию микроорганизмов к воздействию низких температур, что очень важно для криоиммобилизации клеток, поэтому 1= 20°С принята как оптимальная для культивирования дрожжей перед иммобилизацией в криогель ПВС.

Разработаны подходы к созданию высокоэффективного биокагализатора на основе нммобилизированных клеток дрожжей. Для иммобилизации были взяты дрожжевые клетки, выращенные в аэробных условиях на подусинтетической среде при температуре 20°С до конца логарифмической фазы роста. Концентрация клеток в биокатализаторе составляла 2 масс. %. Полученный биокатализатор использовали в процессе шампанизации вина в бутылках.

Для оценки эффективности функционирования подученного биокатализатора использовали иммобилизованные клетки дрожжей, выращенные по вышеописанной методике на виноматериале. Контролем в работе были свободные клетки. Исходная концентрация дрожжевых клеток во всех исследуемых вариантах была одинаковой - 1x1 О*1 кл/мл. Определяли бродильную активность биокатализаторов и свободных клеток в бутылках в процессе шампанизации вина. Показано, что клетки, выращенные на полусиптетической среде, обладают более высокой бродильной активностью по сравнению с клетками, выращенными на виноматериале, независимо от того, в свободном или иммобилизованном виде они использовались для шампанизации вина.

Ьыли проанализированы основные химические характеристики шампанского, получено после 4-х недель брожения. Наблюдается сходство их как для шампанскою, полученного с использованием свободных клеток, так и с использованием нммобилизированных клеток дрожжей, правда лучшая метаболическая активность нммобилизированных клеток лучше, чем свободных (более низкая концентрация остаточного сахара и несколько выше.концентрация этанола), уровень концентрации АТФ выше в два раза.

Таким образом, независимо от типа питательной среды, использованной для наращивания биомассы дрожжей, характеристики иммобилизованных клеток, а именно, бродильная активность и концентрация внутриклеточного АТФ, были лучше по сравнению со свободными клетками. Этот факт подтвердил преимущества использования клеток, иммобилизованных в криогель ПВС. для производства шампанских вин бутылочным способом перед свободными клетками. Одной из важных характеристик шампанского является концентрация свободных клеток дрожжей в продукте. Проблема накопления свободных клеток в среде брожения при использовании иммобилизованных биокатализаторов является серьезным препятствием для широкого применения иммобилизованных клеток дрожжей.

В связи с этим встает вопрос о подавлении роста клеток в процессе шампанизации. Для этого одну часть гранул биокатализатора обрабатывали (1| -фактором в концентрации 0,001%, другую 10%-м раствором этилового спирта, третью часть выдерживали и среде, насыщенной С02 в течении трех часов. Уровень жизнеспособности клеток определяли по концентрации внутриклеточного АТФ. Удельная концентрация АТФ в этих иммобилизованных клетках после воздействия различных факторов снизилась в 2 - 4 раза, тогда как в дрожжевых клетках, выращенных на контрольной среде (виноматериале рН 3,0) -в 6-И 5 раз, что свидетельствует о более высокой резистентности клеток, выращенных на полусинтет ической среде.

Гранулы биокатализаторов, обработанные различными ингибиторами роста клеток, помещали в бутылки с киноматериалом для исследования метаболической акт ивности иммобилизованных клеток.

В процессе шампанизации вина измерягш давление углекислого газа, накапливающегося в бутылках, и отбирали пробы для подсчета свободных клеток, и определяли концентрацию внутриклеточного А'ГФ в иммобилизованных клетках.

По окончании брожения в бутылках с шампанским давление углекислого газа было равным 0,4-0,45 МПа практически во всех представленных образцах.

Наибольшее количество свободных клеток в готовом шампанском (0,6 млн кл/мл) наблюдалось в пробах с необработанным биокатализатором. В шампанском, приготовленном с помощью обработанных иммобилизованных дрожжей, количество свободных клеток было ниже в 3-6 раз. Наименьшая концентрация свободных клеток наблюдалась в шампанском с использованием иммобилизованных клеток в среде, насыщенной СОг.Однако известно, что концентрация свободных клеток в готовом шампанском после ремюажа должна составлять не более 7х103 клеток/мл, в то время как в полученных образцах шампанского концентрация клеток была в 10-100 раз выше нормы что свидетельствует недостаточности длительности экспонирования гранул биокатализатора (3 ч); а также концентрации этанола, ф-фактора и СО?, необходимых для полного подавления роста иммобилизованных дрожжевых клеток.

Обработка биокатализаторов различными ингибиторами болеё -эффективна для иммобилизированных клеток, выращенных на виносодержащих средах, что связано, по-видимому, с более низким уровнем жизнеспособности клеток, выращенными на виноматериале, чем на полусинтетической среде. Одним из эффективных вариантов подавления роста клеток в процессе шампанизации вина, может быть признана экспонирование гранул иммобилизованного биокатализатора в среде, насыщенной С02.

Разработанный нами ранее (Мартынснко, 2001, 2004) метод включения клеток дрожжей в криогель ПВС предполагал формирование гранул биокатализатора в среде петролейного эфира, нежелательной для применения па производстве из-за своей пожароопасноеги, а также токсичности для клеток. В связи с этим было решено изменить условия иммобилизации и проводить ее на воздухе. Такой подход был апробирован впервые.

С помощью электронной микроскопии было покачано, что макропоры носителя, полученного формированием на воздухе, имели больший размер до 50 мкм, чем поры носителя, сформированного в среде гидрофобного растворителя, что должно было способствовать улучшению массообменных процессов внутри гранул.

Концентрация полимера в составе получаемого биокатализатора была в интервале от 10 до 17% с целью получения механически прочной матрицы с хорошими массообменными характерист иками. Большая концентрация клеток обеспечивает более высокие скорости процесса брожения, при этом органолепт ические показатели готовой продукции существенно зависят от концентрации клеток, участвующих в процессе брожения (1^ег-Ве1а!г, 2004). В связи с этим концентрацию клеток в биокатализаторе варьировали от 2 до 10 % (масс).

Как видно из таблицы 12 при дополнительном исследовании характеристик получаемого шампанскою было установлено, что 10% концентрации клеток дрожжей и составе иммобилизованного препарата является лучшей.

Таблица 12.

Характеристики шампанского, приготовленного в бутылках, с применением _дрожжей, иммобилизированиых в криогсль Г1ВС____

Исходная концентрация клеток в бжжаталиэаторе,% Давление Ш2, кПа Свободные клетки, кл/мл вина Сахароза, г/л Спирт, об % Дегустационная оценка

2а 26 106 450 500 540 (3,5±0,3)х105 (3,1±0,3)х103 (З,4£0,4)х103 1,6 1,4 1,1 11,30 11,60 11,85 п/и 8,70 8,75

Свободные клетки 430 (1,04:0,!)х107 1,8 11,0 8,60

а-Бнокаталиэатор, полученный по ранее разработанной методике, б-Виокаталичагор, полученный по методике, разработанной п данной работе.

Анализ содержания основных ароматических веществ в шампанском, полученном с помощью свободных и иммобилизированиых дрожжей (таблица 13), отражается на качестве готовою продукта - метанол, пропанол, изобутанол, уксусная кислота, были ниже па 10-17 % по сравнению с шампанским, приготовленным с помощью свободных дрожжей.

Таблица 13.

Содержание различных ароматических веществ в шампанском, приготовленном с

использованием свободных иммобилизированиых клеток дрожжей.

Шампанское

Вещества, мг/л Исходный виноматериал Свободные И м моб ил изиропа! тыс

дрожжи дрожжи

Уксусный альдегид 673,7 549,1 500

Эгилакетат 20,2 21,4 22,6

Метанол . 22.4 24,71 14,11

Пропанол 9,8 9,8 8,0

Изобутанол 17,3 17,8 16.3

Изоамиловыйспирт 141,2 122,6 107,4

Уксусная кислота 1207,9 838,2 688,2

Бутиленгликоль 1445,5 843 679

Фенил этиловый спирт 152,1 126,5 81,9

Глицерин 16174,5 13603,8 12300

Исследование стабильности биокатализатора при многократном его использовании в процессе шампанизации вина в бутылках, а также стабильности биокаталитических характеристик иммобилизованных клеток после их длительного хранения в замороженном виде позволило установить, что расчетный

период полуинактивации полученного биокатализатора составляет 360 еут, период полуинактивации при хранении ~6,5 лет.

Было исследовано влияние концентрации иммобилизованного биокатализатора в среде на скорость сбражииания виномахериала в бутылках. Конечный уровень давления С02 во всех образцах независимо от исходной концентрации иммобилизованных клеток был практически одинаковым (—500 кПа) после 28 сут брожения. Однако, максимальная удельная скорость накопления этанола в сбраживаемом вине была установлена при введении в среду 18 г/л бнокатализатора.

Полученный иммобилизированный биокатализатор использовали в технологии получения вин резервуарным периодическим способом, предусматривающем проведение процесса без перемешивания в герметичных металлических резервуарах. В качестве ферментационной среды использовали виноматериал, такой же, как при шампанизации вина в бутылках. Вторичное брожение проводили в течение 24 су ток при 15°С, одни и те же иммобилизованные клетки использовали в течение 3 циклов сбраживания. Загрузка реактора биокатализатором оставляла 18 г/дм3 Использование этой концентрации позполило далее установить, что при проведении непрерывной шампанизации вина продуктивность 1 г биокатализатора составляет 120 см7сут за исследованный период времени, что в 4 раз больше, чем при шампанизации вина в бутылках (30 см /сут). При этом качество шампанского, получаемого в непрерывном режиме, по основным характеристикам практически не отличаюсь от шампанского, приготовленного в бутылках с использованием того же биокатализатора.

Разработанный биокатализатор был использован в технолог ии получения различных видов вин, а именно, при получении белых и красных столовых вин при использовании свободных и иммобилизованных клеток дрожжей.

В работе было проведено сбраживание виноградного сока иммобилизованных в криогель ПВС клетками дрожжей, была изучена кинетика роста винных дрожжей. Полученная дрожжевая биомасса была иммобилизована по способу, разработанному для шампанских дрожжей.

Выло показано, что концентрации спирта и сахарозы в полученном вине, приготовленном с использованием как иммобилизованных, гак и свободных клеток разных штаммов винных дрожжей, практически одинаковы, немногим большая концентрация спирта и меньше сахаров отмечалась в пробах с вином, приготовленным с помощью иммобилизованных дрожжей.

Анализ основных органических кислот в полученных винах не показал существенных отличий при использовании, как свободных, гак и иммобилизованных клеток. Однако анализ ароматических компонентов полученного вина позволил установить, что, концентрации высших спиртон (пропанола, изобутанола, изоамилового спирта), метанола, и этилацетата, высокие концентрации которых нежелательны для вина, были меньше в 1,5-150 раз в вине, полученном с использованием иммобилизованных винных дрожжей по сравнению с вином, приготовленным при использовании тех же свободных клеток в свободном состоянии

Дегустация образцов белых столовых вин, полученных с использованием свободных и иммобилизованных клеток винных дрожжей, показала преимущество использования иммобилизованных клеток в иммобилизованном виде. Образцы вина, полученного с использованием иммобилизованных клеток дрожжей штаммов

«47К». «Кокур-3» и «Ленинградская», были оценены как образцы очень хорошего качества с развитыми сортовыми особенностями в букете и слаженным гармоничным вкусом.

Аналогичные результаты были получены и при использовании разработанного биокатализатора в технологии получения красных вин. Органолсптичсская оценка была ныше у образцов вина, полученною при использовании иммобилизованных клеток. Вина характеризовались хорошим качеством с развитым, характерным для красных столовых вин, богатым букетом и слаженным вкусом.

Учитывая то, что иммобилизованные дрожжи значительно устойчивее к воздействию различных ингибирующих веществ, чем свободные клетки, было решено испытать их для устранения винных недобродон и для биологического кнелотопонижения вина.

Было показано, что в результате дображивания випоматериалов с использованием иммобилизованного биокатализатора концентрация этанола может быть увеличена на 6-28% от исходного уровня.

Также было апробировано использование иммобилизованных в криогель ГШС клеток дрожжей для кнелотопонижения вина, получаемого из виноградного и крыжовникового соков. Было установлено, что в результате сцирто-яблочпо-молочиокислого сбраживания соков с применением разработанного биокатализатора, получается вино с концентрацией этанола 45-86 г/дм1 пониженным содержанием яблочной кислоты на 18-23% от исходного уровня.

ВЫВОДЫ

1. Проведён скрининг 481 расы дрожжей вида ЯаесИаготусеа, выделенные в Западной Белоруси. Отобрано и рекомендовано 13 рас дрожжей для получения плодовых вин, из которых 5 рас имеют особо ценные свойства и представляют значительный интерес для производства, и 2 расы для спиртового производства.

2. Изучены и селекционированы 62 важнейшие отечественные расы винных и спиртовых дрожжей. Установлена их принадлежность к одному биологическому виду БассЬаготусев сегеуЫае на основании стандартных физиологических тестов, обозначены. их различия между собой по ряду признаков в определители как вариабельные.. Впервые изучены молекулярпо-бнологичсские их особенности современными методами анализа генома, даны морфологические и фшиолого-биохимические характеристики, построено генеалогическое древо штаммов и обнаружено среди них 5 межвидовых гибридов дрожжей В.сегсу^ае х 8. Ьауапдо Уаг.иуагиш.

3. Определены максимальные температуры роста исследуемых дрожжей и установлено, что они лежат в диапазоне 28-53 °С. Выявлены 4 группы дрожжей, которые растут при разных температурах: при 1=35-37НС; при I = 44-46°С; при 1=46-49"С; при 1=49-53(|С.

4. Отобраны 14 штаммов винных дрожжей рода ЗассИаготусез, имеющие наилучшие физиолого-биохимические особенности, для получения АСД и дальнейшего их использования при производстве красных и белых випоматериалов, игристых и плодовых вин, а, именно: для красных виноградных вин-Каберне-5; белых виноградных вин-Кокур-3 и 47-К; шампанских вин резервуарным и бутылочным способом - Харьковская-39; плодово-ягодных вин:

яблочных - ГВ-4 и Сидровая-101: грушевых-Г'В-4 и Груша-10; вишнёвых - Вишня-6 и Вишня-18; черноплолнорябииовых - Вишня-18 и Москва-30; черничных -Вишня-18 и ДЧК-1; голубичных - Вишня-18 и Москва-30 ; черносмородиновых -Вишня 18 и Москва-30; красносмородиновых-Москва-30; малиновых- Москва-30 и ГСЧ-1; клюквенных-ГВ-4; брусничных- Брусничпая-7 и ГВ-4; клубпичных-Вишня-18 и Земляничная-9.

4. Определены оптимальные составы сред, условия и режимы культивирования дрожжей для получения биомассы для дальнейшего высушивания и иммобилизации.

5. Разработана высокоэффективная технология винных и спиртовых АСД, обеспечивающая получение продукта высокого качества. Созданная технологиия предусматривает использования мелассы как основное сырьё при культивировании дрожжей, предназначенных для получения АСД, промывку на сепараторе и сушку в кипящем слое, использование стабилизаторов. Составлены ТИ и ТУ, проведена апробация её на ООО «Дербенёвка-2» Московского дрожжевого завода и наработаны опытные партии дрожжей.

6. Изучены различные методы обезвоживания винных и спиртовых дрожжей. Подобрана оптимальная композиция стабилизаторов для обезвоживания на сушилке кипящего слоя дрожжей, выращенных па мелассе, повышающая выживаемость дрожжей на 40-50% по сравнению с необработанным контролем.

7. Изучены физиолого-биохимические свойства сухих винных и спиртовых дрожжей и условия их хранения. Показана их способносность сбраживать сахара и накапливать практически те же метаболиты, что и обычные дрожжи. Хранение их следует осуществлять в вакуумной упаковке при 4-6°С, при этом падение активности составляет 1% в месяц. При разгерметизации упаковки жизнеспособность дрожжей падает до 5% за 2 месяца.

8. Проведены заводские испытания полученных препаратов АСД на винзаводах ОАО Агрофирма «Южная» (Краснодарский край), ОАО АПФ «Фапагория» (Краснодарский край), ОАО «Миллеровекий винзавод» (Ростовская обл.), ОАО «Игристые вина» (г. Санкт-Петербург) и спиртзаводе ЗАО «Алтайросспиртпром» (Алтайский край). Отмечены высокие технологические показатели АСД-активное проведение брожения, высокий выход спирта, получение продукции с высокими органолепт ическими показателями.

9. Разработана технология получения биокатализатора на основе иммобилизованных в криогель ПВС клеток дрожжей 8.сеге\'1'зте Шампанская-39, выращенных на полусинготической среде, для использования в технологии шампанизации вина.

10. Показана возможность многократного использования биокатализатора на основе иммобилизованных клеток дрожжей в процессе шампанизации вина классическим бутылочным и резервуарным периодическим и непрерывным методами, обеспечивающими получение качественного продукта.

11. Определена возможность использования разработанного иммобилизованного биокатализатора в технологии получения виноградных вин по красному и белому методам, для устранения винных недобродов с исходно высокой концентрацией этанола (10,5-13,5 об.%), для биологического кислотопонижения вина.

12. Проведены заводские испытания препаратов ИД для получения шампанских вин бутылочным методом на ОАО АПФ «Фапагория» (Краснодарский край), для получения красных и белых вин на винзаводах ОАО АПФ «Фапагория»

(Краснодарский край), ОАО «Миллеровскнй випзавод» (Ростовская обл.). Средняя дегустационная оценка вин - 7,80 - 7,95.

Осиошюс содержание диссертации опубликовано в следующих работах. Монография:

!.Мартыпенко 11.11. Современные препаративные формы дрожжей для виноделия. М.: Росеельхозиздат. 2006. 278 с. Патенты РФ:

2. Туликова T.B., Джафаров А.Ф., Вакулин П.П., Гагарин М.А., Гагарин А.М., Мартыненко 1Ш. Способ получения дрожжей для производства игристых вин. Патент РФ №2180912 от 27.04.2001 г.

3. Маргыненко Н.Н., Грачева И.М., Эль-Регистап Г.И., Зубов А.Л., Лозинский В.И. Способ получения биокатализатора для производства спиртосодержащих игристых напитков // Патент РФ №2239658. 2004. ВИ №31.

4. Коновалова Е.Ю., Мартыненко П.П., Астафьев Е.И., Нугмапова 'Г.А., Эль-Регисган Г.И. Способ получения сухих активных дрожжей для пищевой промышленности. Патент РФ № 2218393 от 10.12.2003 г. БИ.ЖМ.

5. Римарева Л.В., Оверченко М.В., Игнатова ИЛ., Мартыненко ПЛ., Коновалова ЕЛО. Применение штамма Saccharomyccs ccrevisiac ВКПМ Y-3136 в качестве средства, снижающего образование побочных метаболитов в процессе получения спирта. Патент РФ №2331666. От 30.11. 2005 г. Опубликовано 20.08. 2008 г. ВИ №23. .

6. Римарева Л.В., Оверченко М.Б., Игнатова И.Н., Мартыненко ПЛ., Коновалова F..IO. Применение штамма Saccharomyces ccrevisiac ВКПМ Y-3I37 в качестве средства, снижающего образование побочных метаболитов в процессе получения спирта. Патент РФ №2331667. От 30.11. 2005 г. Опубликовано 20.08. 2008 г. ВИ №23.

7. Ефременко ЕЛ., Степанов И.А., Мартыненко 11.11., Грачева И.М. Способ получения иммобилизованною биокатали за гора и биокатализатор для производства спиртосодержащих напитков. Патент РФ №2322499. Опубликовано 20.04. 2008 г. ВИ №8.

Статьи и тезисы международных конференции:

8. Мартыненко Н.Н. Использование иммобилизованных дрожжей в процессах шампанизации вин // Тезисы докладов третьей международной научно-технической конференции «Пища. Экология. Человек». М. МГУПП. 1999. С. 63.

9. Мартыненко ПЛ., Акопова Н.А., Корнеясева Е.В., Эль-Регистан Г.И. Регулирование метаболизма шампанских дрожжей ауторегуляторпыми факторами dt // Тез. докл. научно-технической конференции «Молодые ученые - пищевым и перерабатывающим отраслям АПК (технологические аспекты производства)». С. 57-58. М. МГУПП, 1999.

10. Мартыненко ПЛ., Саришвили П.Г., Милкии Д.Б., Шигщчев Е.С. Применение иммобилизованных дрожжей в производстве шампанского классическим (бутылочным) способом // Тез. докл. научно-технической конференции «Молодые ученые - пищевым и перерабатывающим отраслям АПК (технологические аспекты производства)». С. 58. М. МГУПП, 1998.

11. Martinenko N.N., Zubov A.L., Sarishvili N.G., Kl-Registan G.I., Lozinsky V.l. PVA-cryogel - entrapped yeast cells for the bottle-fermented production of champagne-type

wines // Proceedings International conference "Biocatalysis-2000: Fundamentals & applications". Moscow, Moscow State Universsity, 2000.

12. Мартынепко H.H., Милкин Д.Б., Шипачев E.C. Получение бутылочного шампанского с использованием дрожжей, иммобилизованных в криогелях ПВС' и новый подход к проблеме выхода клеток из матрицы носителя // Тезисы докладов Международной конференции молодых ученых «Молодые ученые -- пищевым и перерабатывающим отраслям ЛПК (технологические аспекты производства). М.: МГУПП, 2000. С. 73-74.

13. Мартынепко H.H., Жолудева М.В. Получение активных сухих дрожжей для производства шампанского // Тезисы докладов Международной конференции молодых ученых «Молодые ученые - пищевым и перерабатывающим отраслям АПК (технологические аспекты производства). М.: МГ'УПП, 2000. - С. 75-77.

14. Мартынепко H.H., Милкин Д.Б., Шипачев B.C. Применение дрожжей, иммобилизованных в криогелях для получения шампанского бутылочным способом II Тез. докл. Международной конференции молодых ученых «Химия и биотехнология пищевых веществ. Экологически безопасные технологии на основе возобновляемых природных ресурсов». М. РХТУ, 2000. С. 70-71.

15. Martincnko N.N., Zubov A.L., Gracheva 1.М., Sarischvili N.G., El-Registan G.I., Lozinsky V.l. The production of sparkling wines by "Champenoise'' method with using PVA-cryogel entrapped yeast cells and the new approach to the problem of cell leakage from the currier // Proceedings IX International BRG Workshop and 62-th ICB Seminar "Bioencapsulation in Biomedical, Bioteehnological and Industrial Applications" Warsaw, May 11-13.2001. IM3-16.

16. Мартынепко H.H., Милкин Д.Б., Шипачев E.C. Получение бутылочного шампанского с использованием дрожжей, иммобилизованных в криогелях ПВС, и новый подход к проблеме выхода клеток из матрицы носителя // В сборнике научных трудов «Качество, безопасность и экология пищевых продуктов и производств. Прогресс в агроиндустрии». М. МГУГ1П. 2001. С.73-74.

17. Мартынепко H.H., Жолудева М.В. Получение активных сухих дрожжей для производства шампанского // В сборнике научных трудов «Качество, безопасность и экология пищевых продуктов и производств. Прогресс в агроиндустрии». М. МГУПП. 2001. С.75-77.

18. Гусева Т.Н., Радина Н.В., Мартынепко H.H. Промышленный опыт применения ферментных препаратов компании «Эндэ Индустриал Корпорэйшн» // Ликероводочное производство и виноделие. 2001. JSü 1. С.4-6.

19. Гусева Т.Н., Радина II.В., Мартынепко H.H. Опыт применения ферментных препаратов компании «Эндэ Индустриал Корпорэйшн» при производстве спирта // Научно-технический прогресс в спиртовой и ликероводочной отрасли промышленности. М.: Пищевая промышленность. 2001. С.83-93.

20. Шипачев Е.С., Мартынепко H.H. Технологические аспекты производства активных сухих винных дрожжей (АСВД) // Материалы Всероссийской заочной конференции «Катализ в биотехнологии, химии и химических технологиях». Вып.4. Тверь: ТГТУ. 2002. С. 63-66.

21. Степанов H.A., Мартынепко H.H., Ефременко E.H. Оптимизация условий получения активного биокатализатора для шампанизации вин на основе дрожжевых клеток, иммобилизованных в криогель поливинилового спирта // Материалы Международной конференции молодых ученых «От фундаментальной пауки - к новым технологиям. Химия и биотехнология биологически активных

веществ, пищевых продуктов и добавок. Экологически безопасные технологии» Тверь: ТГТУ. 2002. Вып. 2. С. 100-102.

22. Мартыненко H.H., Грачева И.М. Иммобилизованные шампанские дрожжи. Физиолого-биохимичсские особенности и участие в шампанизации вин (обзор) // Прикладная биохимия и микробиология. 2003. Т. 39. №5. С. 501-508.

23. Мартыненко H.H.. Грачева И.М., Саришвили Н.Г., Зубов Л.Л., Эль-Регистап Г.И., Лозинский В.И. Иммобилизация шампанских дрожжей включением в криогель ПВС, предотвращение выхода клеток из матрицы носителя II Прикладная биохимия и микробиология. 2004. Т. 40. №2. С.186-193.

24. Мартыненко H.H. Совершенствование ремюажа. Характеристика процесса. Оклеивающие вещества, механические приспособления, агломерирующие дрожжи // Виноделие и виноградарство. 2003. №2. С.22-23.

25. Мартыненко H.H. Совершенствование ремюажа (иммобилизованные дрожжи) // Виноделие и виноградарство. 2003. №3. С.14-16.

26. Мартыненко H.H., Хасикова A.A., Гагарин A.M., Бакулип В.П., Кононова О.Н., Гагарин М.А. Новые активные дрожжи для шампанского на основе отечественных рас // Виноделие и виноградарство. 2003. №4. С.14-16.

27. Мартыненко H.H., Хасикова A.A., Гагарин A.M., Бакулин В.П., Кононова О.Н.. Гагарин М.А. Повышение качества шампанского путем применения сухих дрожжей // Виноделие и виноградарство. 2003. №6. С.22-23.

28. Мартыненко H.H. Активные сухие винные дрожжи. Технологические аспекты производства и практического использования // Индустрия напитков. 2003. №1. С.34-37.

29. Мартыненко H.H. Активные сухие винные дрожжи. Характеристика важнейших препаратов АСВДII Индустрия напитков. 2003. №2. С.38-40.

30. Мартыненко H.H., Гусева Т.И. Актуальные вопросы ведения дрожжей в современном спиртовом производстве /7 Индустрия напитков. 2003. №4. С.40-42.

31. Гусева Т.И., Мартыненко H.H., Колднн Э.Н., Орлова Н.В. Производство высококачественного спирта с использованием ферментных препаратов и сухих дрожжей // В сб. Прогрессивные технологии и современное оборудование -важнейшие составляющие успеха экономического развития предприятий спиртовой и ликероводочной промышленности. М.: Пищевая промышленность. 2003. С. 59-74.

32. Мартыненко H.H., Садовская И. М. Исследование дрожжевой микро- флоры ягод в западных районах Беларуси // В сб. «Актуальные вопросы пищевой промышленности» Вып.!. М. МГУПП. 2003. С.64-66.

33. Ефременко E.H., Степанов H.A., Мартыненко H.H., Грачева И.М. Биокатализатор на основе иммобилизованных клеток дрожжей для шампанизации вина // Материалы 11 Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». М.: РХТУ. 2003. 4.1. С. 234.

34. [I¡иначе» Е.С., Мартыненко ГШ. Современные препараты АСД для шампанского производства и их практ ическое использование // В сб. «Актуальные вопросы пищевой промышленности» Вып.1. М. МГУПП. 2003. С.59-63.

35. Жолудева М.В., Мартыненко H.H., Колесник И. М., Кремлев ЕЛ I. Исследование новых штаммов дрожжей для плодово-ягодного виноделия // В сб. «Актуальные вопросы пищевой промышленности» Вып.1. М. МГУПП. 2003. С.67-69.

36. Мартыненко H.H., Шипачев Е.С., Грачева И.М. Современные аспекты получения и применения сухих винных дрожжей // Сборник научных трудов

Всероссийской научно-технической конференции-выставки «Высокоэффективные пищевые технологии и технические средства для их реализации» М: МГУПП. 2003. С. 180-182.

37. Колесник И.М., Крсмлсв H.H., Мартыненко H.H. Влияние условий культивирования на интенсивность размножения культур сахаромицетов // Материалы И Региональной научно-пракгической конференции "Экологической науке - творчество молодых". Гомель. 2003. С. 43-44.

38. Мартыненко H.H., Жолудева М.В., Шипачев Е.С., Грачева И.М. Исследование новых культур дрожжей для вторичного виноделия // В сб. «Актуальные вопросы пищевой промышленности» Вып.1. М. МГУПП. 2003. С.69-72.

39. Мартыненко H.H., Шипачев B.C., Грачева И.М. Проблемы реактивации сухих шампанских дрожжей // В сб. «Актуальные вопросы пищевой промышленности» Вып.1. М. МГУПП. 2003. С.72-76.

40. Мартыненко H.H., Жолудева М.В., Грачева И.М., Колесник И.М. Поиск перспективных штаммов для плодово-ягодного виноделия в Западной Беларуси. 1. Характеристика культур, выделенных из винограда // Хранение и переработка сельхозсырья. 2003. №12. С.91-93.

41. Гусева Т.И., Мартыненко H.H. Новые технологии в производстве спирта // Индустрия напитков. 2003. №6. С. 38-39.

42. Колесник U.M., Мартыненко H.H., Грачева И.М. Исследование дрожжевой микрофлоры год в Западной Беларуси и поиск новых штаммов для плодово-ягодного виноделия // Хранение и переработка сельхозсырья. 2004. №1. С.27-28.

43. Мартыненко H.H., Грачева И.М., Колесник И.М. Поиск перспективных штаммов для плодово-ягодного виноделия в Западной Беларуси. 2. Культуры из ягод черной смородины // Храпение и переработка сельхозсырья. 2004. №1. С.32-34.

44. Мартыненко H.H. Активные сухие винные дрожжи. История создания и становление // Виноделие и виноградарство. 2004. JYal. С.18-21.

45. Мартыненко H.H. Ароматические особенности сухих шампанских дрожжей // Хранение и переработка сельхозсырья. 2004. Х«3. С.39-42.

46. Мартыненко H.H. Активные сухие винные дрожжи. Промышленное производство и практическое применение // Виноделие и виноградарство. 2004. №2. С. 20-22.

47. Колесник И.М., Жолудева М.В., Мартыненко H.H., Грачева И.М. Новые штаммы для плодово-ягодного виноделия. Сахаромицеты из ягод черной смородины Западной Беларуси // Виноделие и виноградарство. 2004. КаЗ. С.15-17.

48. Гусева Т.И., Калинина O.A., Мартыненко H.H. Использование дрожжевой подкормки Ист Лайф Экстра в спиртовом производстве // Производство спирта и ликероводочных изделий. 2004. №3. С. 15-16.

49. Наумова Е.С., Жолудева М.В., Мартыненко H.H., Наумов Г.И. Молекулирно-генстическая дифференциация культурных дрожжей Saccharomyces . // Микробиология. 2005. Т.74. №2. С. 215-223.

50. Мартыненко H.H., Грачева И.М., Колесник И.М. Поиск перспективных штаммов для плодово-ягодного виноделия в Западной Беларуси. 3. Характеристика сахаромицетов из ягод малины // Хранение и переработка сельхозсырья. 2005. .№6. С.48-50.

51. Степанов H.A., Ефременко E.H., Мартыненко H.H., Грачева И.М. Биокаталитическая система на основе иммобилизованных дрожжей для

шампанизации вина // 3-й Международный конгресс 'биотехнология: состояние и перспективы развит ия", Москва, 14-18 марта, 2005, с. 214.

52. Степанов U.A., Маргынепко П.Н., Ефремепко С.Н. Иммобилизованный биокагализатор с улучшенными характеристиками для получения игристых вин // 9-я Международная Путинская школа-конференция молодых ученых. Пущино. 1822 апреля, 2005. с. 364.

53. Маргынепко 1I.H. Образование ароматических веществ иммобилизованными дрожжами при шампанизации вина // Хранение и переработка еельхозсырья. 2005. №10. С.32-34.

54. Мартыпепко II.П., Верченое В.В., Римарева Л.В, Новые подходы к получению препаратов сухих винных и спиртовых дрожжей // Храпение и переработка ссльхозсырья. 2005. №11. С.33-35.

55. Naumova E.S., Ivannikova Y.V., Martynenko N.N., Naumov G.l. Comparative analysis of genomes of cultured Saccharomyces yeasts // Yeast. 2005. V.22. A!> SI. P.33.

56. Маргынепко H.I I., Верчепов В.В., Римарева Jl.В. Влияние углеводного состава среды на реактивацию сухих винных и спиртовых дрожжей // Производство спирта и ликероводочных изделий. 2006. №1. С. 34-35.

57. Степанов П.А., Мартыпепко Н.Н., Ефременко Е.Н. Иммобилизация дрожжей в криогель поливинилового спирта - эффективный подход к улучшению биотехнологии получения вина // 10-я Международная Путинская школа-конференция молодых ученых. Пущино. 17-21 апреля, 2006, с. 397.

58. Степанов Н.А., Маргынепко Н.Н., Грачева И.М., Ефременко Е.Н. Применение иммобилизованных клеток дрожжей для производства спиртосодержащих напитков // Известия вузов. Пищевая технология. 2006. №6. С. 45-47.

59. Колесник И.М., Маргынепко Н.Н. Дрожжевая флора яблок и Западном регионе Беларуси // Материалы международной конференции "Современное состояние и перспективы развит ия микробиологии и биотехнологии» 1-2 июня 2006 г. Минск-Раков". Минск. Изд-во БелПищепром. 2006. С. 76-77.

60. Naumov G.I., Naumova E.S., Martynenko N.N. Comparative genomics of Saccharomyces yeasts from red berry and grape wincmaking /7 Proceedings of XXV International Specialized Symposium on Yeasts 1SSY-25 ''Systems biology of yeasts from models to applications". Helsinki. VTT. 2006. P.84.

61. Stepanov N.A., Martincnko N.N., Efremenko E.N., Multipurpose biocatalyst for production of alcoholic beverages // Proceedings of International Congress on Bioprocessing in Food Production. 18-21 June 2006. Patras, Greccc. 2006. P.173.

62. Efremenko E., Slepanov N., Martinenko N.. Gracheva I. Cultivation conditions preferable for yeast cells to be immobilized into polyvinyl alcohol) and used in bottled sparkling wine production // Chemical Industry & Chemical Engineering Quarterly.

2006. V.12. №1. P. 18-23.

63. Иванникова 10.В., Наумова E.C., Мартыненко Н.Н., Наумов Г. И. Характеристика генома дрожжей Saccharomyces плодово-ягодного виноделия // Микробиология. 2007. №2. С.

64. Мартыненко Н.И., Верчепов В.В., Римарева JI.B. Решение проблем реактивации сухих спиртовых дрожжей// Производство спирта и ликероводочных изделий.

2007. №2. С.14-16.

65. Наумова Е.С., Мартыпепко Н.Н., Наумов Г.И. Сравнительная геиомика дрожжей Saccharomyces // Материалы международной научной конференции

«Генетика и биотехнология XXI века. Фундаментальные и прикладные аспекты». Минск. Изд. Центр БГУ. 2008. С. 255-256.

66. Наумова П.С.. Мартыиенко H.H., Наумов Г.И. Молекулярная диагностика винных дрожжей гибридного происхождения: Saccharomyces cerevisiac х Saccharomyces kudriavzevii// Биотехнология. 2009. №2. С. 20-25.

Мяртынепко Николай Николаевич

(¿иотсхиолошчсскис основы высокоэффективных препаративных форм дрожжей рода Saeeharomyees

Резюме

В диссертации научно обоснована п экспериментально покатана перспективность создания сухих и иммобилизованных препаратов дрожжей (ЛСД и ИД) и использования их в винодельческом и спиртовом производствах. Проведен скрининг 481 расы дрожжей, отобраны 13 рас дрожжей, используемых в винном и плодово-ягодном виноделии, среди них указаны 5 лучших винных 2 спиртовых рас. Изучены их морфолошчсскис и физиологические признаки, а также определены основные физико-химические показатели, проведена дифференциация штаммов современными молекулярпо-бнологическнми методами анализа генома с применением техники ПЦР-аиализа, молекулярного кариотнпирования и Саузен-гибридизацип, Определены максимальные температуры роста дрожжевых шгаммов и выяснены наиболее термостабильные из них, что позволяет рекомендовать их к дальнейшему исследованию по получению препаратов АСД и ИД. Получены препараты ЛСД и ИД с целью их дальнейшего использования в виноделии. Опробирование производство АСД и ИД на Московском дрожжевом заводе ООО «Дербеневка» и использование их на винзаводах.

Summary

In the thesis is scientifically substantiated and experimentally shown the prospect of the creation of the dry and immobilized preparations of yeasts (ADY and IY). and it application in the winemaking and potable alcohol industry. Screening 481 of race of yeast(s) is carried out, 13 races of yeast(s), utilized in the grape and fruit winemaking, are selected, 5 best wine 2 alcohol races are indicated among llicm. Their morphological and physiological signs arc studied, and basic physical chemistry indices are also determined, is carricd out the differentiation of strains by (he contemporary molecular - biological methods of the analysis of genome with the application of PTSR- analysis, molecular kariotipirovaniya and Sauzen-gibridizatsii technique. Maximum temperatures of an increase in the yeasl strains are determined arid are explained most thermostable of them which makes it possible to recommend them to further study on obtaining of preparations ASD and UD. Are obtained preparations ASD and UD for the purpose of their further used in the wine and potable alcoholmaking. Tasted and organized production ADY and IY at company "Derbenevka" of the Moscow yeast plant and their use at the w ineries.

Отпечатано в типографии ООО «Мещера» Московская обл., г. Щёлково, ул. Свирская, д.8а зак. № 104, тир. 120 экз.

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Мартыненко, Николай Николаевич

1. ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. СИСТЕМАТИКА, ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ ДРОЖЖЕЙ РОДА SACCHAROMYCES.

1.1.1.История появления и становления дрожжей.

1.1.2. Систематика дрожжей рода SACCHAROMYCES ME YEN EXREESS.

1.1.3. Виды-двойники'в комплексе SACCHAROMYCES SENSU STRICTO.

1.1.4. Генетическая концепция рода дрожжей SACCHAROMYCES.

1.1.5. Идентификация дрожжевых культур.

1.2. ХАРАКТЕРИСТИКА ВАЖНЕЙШИХ ВИННЫХ И СПИРТОВЫХ РАС ДРОЖЖЕЙ РОДА SACCHAROMYCES.

1.2.1. Отечественные расы дрожжей для виноградного виноделия.

1.2.2. Отечественные шампанские расы дрожжей.

1.2.3. Дрожжи для плодово-ягодного виноделия.:.

1.2.3.1. Отечественные расы дрожжей для производства яблочных вин.

1.2.3.2. Дрожжи зарубежной селекции для производства яблочных вин.

1.2.3.3. Отечественные расы дрожжей для производства вин из других плодов и ягод.

1.2.3.4. Расы зарубежной селекции для производства вин из других плодов и ягод.

1.2.3.5. Современные критерии отбора дрожжей для производства плодово-ягодных вин.

1.2.4. Отечественные спиртовые расы дрожжей.

1.3. АСД ВИННЫХ И СПИРТОВЫХ РАС ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES CEREVISIAE.

1.3.1. Технология препаратов АСВД.

1.3.1.1. Исходные культуры дрожжей.

1.3.1.2. Сырьё для культивирования винных дрожжей.

1.3.1.3. Культивирование дрожжей.

1.3.2. Физиология термостойкости дрожжей.

1.3.3. Морфологические и физиолого-биохимические изменения, происходящие при высушивании дрожжей.

1.3.3.1. Морфологические изменения.

1.3.3.2! Биохимические изменения.

1.3.4. Обезвоживание винных дрожжей.

1.3.5. Оценка качества препаратов винных АСД.

1.3.6. Подготовка сухих дрожжей к брожению.

1.4. ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ ВИННЫЕ ДРОЖЖИ.:.

1.4.1. Методы иммобилизации винных дрожжей.

1.4.2. Использование иммобилизованных дрожжей при производстве шампанских вин.1.

1.4.3. Использование иммобилизованных дрожжей при производстве виноградных вин.

1.4.4. Применение иммобилизованных дрожжевых клеток для биологического кислотопонижения вин.

1.4.5. Применение иммобилизованных клеток дрожжей для возобновления вялотекущего или остановившегося брожения и устранения недобродов.

1.4.6. Иммобилизованные дрожжи в плодово-ягодном виноделии.

1.4.7. Стабильность препаратов иммобилизованных клеток дрожжей при хранении.

1.4.8. Криогель поливинилового спирта - носитель для иммобилизации клеток.

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. МАТЕРИАЛЫ.

2.2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.2.1 .Хранение культур дрожжей.

2.2.2. Культивирование клеток дрожжей и накопление биомассы.

2.2.3. Видовая идентификация дрожжей БассЬаготусез.

2.2.4. Молекулярно-биологические методы исследования дрожжей 8ассЬагошусе8.

2.2.4.1. ПЦР и анализ продуктов.

2.2.4.2. Пульс-элекгрофорез.

2.2.4.3. Молекулярное кариотипирование и Саузерн-гибридизация.

2.2.4.4. Определение родства между штаммами.

2.2.4.5. Определение множественной ПЦР.

2.2.4.6. Молекулярный анализ штаммов & сегеушяе с помощью микросателлитного праймера (ОТО)5.

2.2.4.7. Секвенирование и филогенетический анализ.

2.2.4.8. ПДРФ-анализ амплифицированного фрагмента митохондриального гена СОХ2.

2.2.5. Оптимизация режимов культивирования.

2.2.6. Культивирование дрожжей в промышленных условиях.

2.2.7. Определение качества сухих дрожжей.

2.2.8. Определение биохимических характеристик дрожжевых клеток.

2.2.9. Постановка процесса брожения при исследовании биохимических и технологических свойств различных рас винных дрожжей, а также препаратов винных АСД и ИД.:.

2.2.10. Аналитические и микробиологические исследования во время брожения, а также методы исследования готовых вин и виноматериалов.

2.2.11. Электронная, флуоресцентная и световая микроскопия клеток дрожжей и образцов биокатализаторов, созданных на основе ИД.

2.2.12. Иммобилизация клеток дрожжей в криогель ПВС.

2.2.13. Определение кинетических параметров роста свободных клеток и брожения, катализируемого свободными и иммобилизованными клетками.

2.2.14. Определение периодов полуинактивации биокатализатора.

2.2.15. Обработка гранул биокатализатора с целью подавления функции размножения у иммобилизованных клеток дрожжей.

2.2.16. Определение сухого веса биомассы дрожжей и биокатализатора.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ.

ГЛАВА 3. СЕЛЕКЦИЯ НОВЫХ РАС ДРОЖЖЕЙ

САХАРОМИЦЕТОВ.

3.1 .СЕЛЕКЦИЯ ДРОЖЖЕЙ ДЛЯ ПЛОДОВО-ЯГОДНОГО ВИНОДЕЛИЯ.

3.1.1. Скрининг и выделение новых рас дрожжей.

3.1.2. Изучение бродильной активности наиболее активных штаммов дрожжей, выделенных с ягодных субстратов.

3.1.2.1.Определение скорости и глубины сбраживания плодово-ягодных субстратов.

3.1.2. 2. Накопление этанола.

3.1.2. 3. Накопление ароматических веществ в готовых виноматериалах.

3.2. СЕЛЕКЦИЯ НОВЫХ РАС ДРОЖЖЕЙ ДЛЯ

СПИРТОВОГО ПРОИЗВОДСТВА.

ГЛАВА 4. ВИДОВАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВАЖНЕЙШИХ ОТЕЧЕСТВЕННЫХ ВИННЫХ И СПИРТОВЫХ РАС ДРОЖЖЕЙ РОДА SACCHAROMYCES.

4.1. ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ ТЕСТИРОВАНИЕ РАС ДРОЖЖЕЙ.

4.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАКСИМАЛЬНЫХ ТЕМПЕРАТУР РОСТА ДРОЖЖЕЙ.

4.3. МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ РАС ДРОЖЖЕЙ.

4.3.1. ПДРФ-анализ некодирующих участков рДНК.

4.3.1.1. ЦДРФ-анализ амплифицированных 5.8S-ITS фрагментов рДНК.

4.3.1.2. ПДРФ-анализ амплифицированных IGS2 фрагментов рДНК.

4.3.2. Молекулярное кариотипирование.

4.3.3. ПЦР с микросателлитным праймером (GTG)5.

4.3.4. Молекулярно-биологический анализ дрожжей, выделенных с поверхности ягод и из ферментационных процессов России,

Белоруссии и Украины.

4.3.4.1. Видовая идентификация штаммов.

4.3.4.2. Внутривидовой полиморфизм дрожжей S. cerevisiae.

4.3.4.3. Генетическая конституция гибридов S. cerevisiae х S. bayanus var. warum.

4.3.4.4. ПДРФ-анализ и секвенирование ядерного гена МЕТ2.

4.3.4.5. Митохондриальный геном гибридных штаммов.

4.4. ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИХ И

ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЕЙ ВИННЫХ ДРОЖЖЕЙ

РОДА SACCHAROMYCES И ИХ СЕЛЕКЦИЯ.

4.4.1. Дрожжи для получения красных виноградных вин.

4.4.1.1. Бродильная активность дрожжей.

4.4.1.2. Синтез ароматических веществ.

4.4.1.3. Влияние на качественный и количественный состав органических кислот.

4.4.1.4. Влияние дрожжей на накопление фенольных соединений при сбраживании сусла по красному способу.

4.4.2. Дрожжи для получения белых виноградных вин.

4.4.2.1. Бродильная активность дрожжей.

4.4.2.2. Синтез ароматических веществ.

4.4.2.3. Влияние на качественный и количественный состав органических кислот.

4.4.2.4. Влияние на качественный и количественный состав фенольных соединений.

4.4.3. Дрожжи для получения шампанских вин.

4.4.4. Дрожжи для плодово-ягодного виноделия.

4.4.4.1. Дрожжи для получения яблочных виноматериалов.

4.4.4.2. Дрожжи для получения грушевых виноматериалов.

4.4.4.3. Дрожжи для получения вишневых виноматериалов.

4.4.4.4. Дрожжи для получения черничных виноматериалов.

4.4.4.5. Дрожжи для получения голубичных виноматериалов.

4.4.4.6. Дрожжи для получения черноплоднорябиновых виноматериалов.

4.4.4.7. Дрожжи для получения черносмородиновых виноматериалов.

4.4.4.8. Дрожжи для получения красносмородиновых виноматериалов.

4.4.4.9. Дрожжи для получения брусничных виноматериалов.'.

4.4.4.10. Дрожжи для получения клюквенных виноматериалов.

4.4.4.11. Дрожжи для получения малиновых виноматериалов.

4.4.4.12. Дрожжи для получения клубничных виноматериалов.

ГЛАВА 5. ТЕХНОЛОГИЯ ПРЕПАРАТОВ ВИННЫХ

И СПИРТОВЫХ АСД

5.1. ОПТИМАЛЬНЫЕ УСЛОВИЯ РОСТА ВИННЫХ И СПИРТОВЫХ ДРОЖЖЕЙ НА МЕЛАССЕ.:.,.

5.2. ВЛИЯНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ПИТАТЕЛЬНЫХ ВЕЩЕСТВ В СРЕДЕ

НА РОСТ ВИННЫХ И СПИРТОВЫХ ДРОЖЖЕЙ.:.

5.3: ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРА ТУРЫ НА РОСТ ВИННЫХ И

СПИРТОВЫХ ДРОЖЖЕЙ.

5:4. ВЛИЯНИЕ pH СРЕДЫ НА НАКОПЛЕНИЕ БИОМАССЫ ВИННЫХ И

СПИРТОВЫХ РАС ДРОЖЖЕЙ;.;.:.

5.5.1ЮЛУЧЕНИЕ ВИН11ЫХ Й СПИРТОВЫХ АСД ПРИ ' КУЛЬТИВИРОВАНИИ ПЕРИОДИЧЕСКИМ СПОСОБОМ!.

5.5.1. Культивирование дрожжей; предназначенных для сушки:.

5.5.2. Сушка шампанских дрожжей.vv.

5.5.3. Результаты испытаний полученных препаратов.

5.6. ПОЛУЧЕНИЕ ШАМПАНСКИХ, ВИННЫХ И СПИРТОВЫХ АСД • ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ ПРИТОЧНЫМ СПОСОБОМ.

5.6.1. Культивирование дрожжей приточным способом.— :.

5.6.2. Сушка дрожжей, выращенных приточным способом.

5.6.3. Культивирование дрожжей при, непрерывной подаче азотистого и фосфорного питания.

5.6.4. Результаты промышленных испытаний.!.

5.7. ИССЛЕДОВАНИЕ КАЧЕСТВА СУХИХ ВИННЫХ И СПИРТОВЫХ ДРОЖЖЕЙ.:.:.:.

5.7.1. Исследование методов оценки жизнеспособности клеток в препаратах винных и спиртовых АСД:.

5.8. ПРИМЕНЕНИЕ СУХИХ ВИННЫХ И СПИРТОВЫХ ДРОЖЖЕЙ И ИХ

ФИЗИ0Л01 О-БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ.:.

5.8.1. Разработка.методов высокоэффективной подготовки винных и спиртовых АСД.:.

5.8.1. Г. Реактивация сухих винных и спиртовых дрожжей:.

5.8.1.2. Особенности реактивации сухих спиртовых дрожжей.

5.8.1.3. Особенности подготовки шампанских АСД.

5.8.2. Физиолого-биохимические особенности сухих винных и спиртовых дрожжей.

ГЛАВА 6. РАЗРАБОТКА БИОТЕХНОЛОГИИ

ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ДРОЖЖЕЙ В ВИНОДЕЛИИ.

6.1. РАЗРАБОТКА СПОСОБА ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОГО БИОКАТАЛИЗАТОРА НА ОСНОВЕ ДРОЖЖЕВЫХ КЛЕТОК, ИММОБИЛИЗОВАННЫХ В КРИОГЕЛЬ ПВС И ИЗУЧЕНИЕ ЕГО ХАРАКТЕРИСТИК.

6.1.1. Выбор условий подготовки клеток дрожжей к иммобилизации.

6.1.2. Разработка подходов к созданию, высокоэффективного биокатализатора на основе иммобилизованных клеток дрожжей.

6.1.3. Исследование различных способов подавления роста клеток в процессе шампанизации вина при использовании иммобилизованных дрожжей.

6.1.3.1. Оптимизация процесса формирования биокатализатора.

6.1.4. Применение разработанного биокатализатора в процессе шампанизации вина и исследование свойств биокатализатора.

6.1.4.1. Получение игристых вин бутылочным способом.

6.1.4.2. Исследование возможности многократного использования биокатализатора на основе иммобилизованных клеток дрожжей в процессе бутылочной шампанизации вина.

6.1.4.3. Получение шампанского резервуарным периодическим и непрерывным способом.

6.1.5. Исследование свойств разработанного биокатализатора.

6.1.5.1. Стабильность биокатализатора при хранении.

6.1.5.2. Влияние формы биокатализатора на его метаболическую активность.

6.1.6. Применение разработанного биокатализатора в технологии получения различных видов вин.

6.1.6.1. Получение белых столовых вин при использовании свободных и иммобилизованных клеток дрожжей.

6.1.6.2. Применение разработанного биокатализатора в технологии приготовления красных столовых вин.

6.1.6.3. Применение иммобилизованных в криогель ПВС клеток дрожжей для устранения недобродов.

6.1.6.4. Применение иммобилизованных в криогель ПВС клеток дрожжей для биологического кислотопонижения вин.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биотехнологические основы высокоэффективных препаративных форм дрожжей рода Saccharomyces"

Актуальность проблемы В условиях современного технически развитого общества, характеризующегося неблагоприятной экологической обстановкой, потребителей всё больше интересует, как питание может отразиться на их здоровье. Анализ информации о состоянии окружающей среды свидетельствует о том, что её загрязнение стало актуальной и очень сложной проблемой.

Несовершенство технологических процессов, отрицательное воздействие на окружающую среду привело к нерациональному использованию огромного количества сырья, изымаемого из природной среды и повышению себестоимости выпускаемой продукции в перерабатывающих отраслях АПК.

Разработка новых ресурсосберегающих технологий при использовании инновационных подходов, позволяющих увеличить объём производимой продукции при сохранении её высокого качества является актуальным решением современных задач всех отраслей пищевой промышленности, включая и винодельческое производство.

Повышение рентабельности производства и улучшение качества готовой продукции может быть обеспечено совершенствованием технологии использования дрожжей-сахаромицетов, играющих важнейшую роль в обеспечении ключевых биотехнологических процессов. В связи с этим огромный практический интерес представляет возможность создания новых активных препаративных форм сухих и иммобилизованных дрожжей, используемых уже за рубежом в ряде технологий. Эти формы дрожжей отличаются от традиционной дрожжевой разводки легкостью и удобством использования, максимальным проявлением всех положительных качеств, новыми ценными свойствами.

Промышленная технология получения таких новых форм дрожжей в России ещё не разработана, поэтому исследования, проводимые в этом направлении, важны, актуальны и представляют несомненный интерес для усовершенствования отечественных биотехнологий, например, в винодельческом и спиртовом производствах.

В плодово-ягодном виноделии за рубежом практически отсутствуют технологии АСД, а рекомендуемые для этой цели универсальные препараты не пригодны. В России за последние 20-30 лет вообще не проводились работы по выделению и изучению рас дрожжей для производства плодовых вин.

Создание и организация производства высокоэффективных препаратов сухих дрожжей на основе отбора лучших отечественных рас дрожжей по их важнейшим физиологическим и биохимическим признакам, приспособленных к местным условиям и формирующим привычный вкус и аромат готового вина, является важной, актуальной и своевременной проблемой, выходом из создавшегося положения.

Помимо препаратов АСД немаловажное значение имеет и использование иммобилизованных дрожжей (ИД). Сейчас их применение пока ограничено, но создание и использование ИД позволяет решать серьёзные и уникальные задачи, такие, как ликвидация процесса ремюажа в шампанском производстве, интенсификация брожения за счёт создания сверхвысоких концентраций дрожжей в сусле или виноматериале, биологическое кислотопонижение вин, устранение недобродов, значительное улучшение органолептических показателей готовых вин.

Эффективных решений по использованию ИД в виноделии пока нет, хотя и встречаются некоторые данные по этому вопросу в зарубежной и отечественной литературе, поэтому актуальным является поиск такого носителя, для иммобилизации, который был прочным, обладал хорошими массообменными характеристиками, был бы инертен для вина и исключал бы выход дрожжей в вино в период брожения.

Использование АСД и ИД, безусловно, даёт возможность получения большого экономического эффекта для многих производств, основанных на биотехнологии дрожжей рода 8асЬаготусез. Научное обоснование биотехнологических процессов получения ИД и АСД позволит не только повысить эффективность бродильных производств, но и внести весомый научный вклад в развитие биотехнологической промышленности.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в разработке теоретических и экспериментальных основ создания высокоэффективных препаратов активных сухих и иммобилизованных форм отечественных винных и спиртовых рас дрожжей рода БассЬагошусез. В задачи исследования входило:

- на основе селекционных работ осуществление скрининга активных рас винных дрожжей по их бродильной активности, ароматическим и другим технологически важным физиолого-биохимическим особенностям; изучение основных культуральных, морфологических, физиолого-биохимических, биохимических и технологических свойств отобранных штаммов; улучшение морфолого-физиологических, молекулярно-биологических, биохимических и технологических свойств селекционированных рас дрожжей;

- создание биотехнологии винных и спиртовых АСД и ИД;

- разработка научных основ и технологии применения АСД и ИД в виноделии и спиртовом производстве;

- разработка эффективных способов реактивации и подготовки к брожению препаратов АСД и ИД;

- проведение промышленных испытаний созданных препаратов АСД и ИД на заводах отечественной винодельческой и спиртовой промышленностей; Рассматриваемые проблемы решались в соответствии с программой «Биотехнология» УНЦ РХТУ им. Менделеева «Влияние экологических факторов на качество пищевых продуктов и пищевых добавок на основе микробного синтеза и разработка более совершенных стандартов контроля качества этих продуктов»; с

Межведомственной инновационной программой «Биотехнология для медицины и агропромышленного комплекса»; программы «Научные исследования высшей школы по приоритетным направлениям науки и техники»; проекта «Новые эффективные биотехнологические процессы микробного синтеза ферментов, антибиотиков, белково-жировых кормовых компонентов и других биологически активных соединений» предложенного ВНИИ Биотехнологии; программы Министерства образования РФ «Университеты России»; Федеральной целевой программы «Интеграция науки и высшего образования России».

Научная новизна работы. В представленной диссертационной работе разработаны биотехнологические основы высокоэффективных препаративных форм дрожжей рода Sacharomyces, при этом теоретически обосновано и экспериментально установлено и доказано:

- на основе многоступенчатой селекции и новых экспериментальных данных по результатам сравнительных исследований выделенных штаммов дрожжей S. cerevisiae показана перспективность 13 рас дрожжей, из которых 5 физиологически активных рас обладают высокой биосинтетической способностью по отношению к этанолу и наиболее важным метаболитам, характериным для плодово-ягодного виноделия;

- с использованием современных методов анализа изучены морфологические, физиологические, биохимические и молекулярно-биологические особенности 62 важнейших отечественных селекционированных рас винных и спиртовых дрожжей, установлена их принадлежность к одному биологическому виду S. cerevisiae, различающихся между собой по ряду признаков, обозначенных в определителе как вариабельные;

- впервые обнаружено 5 межвидовых гибридов дрожжей S.cerevisiae х S. bay anus var.uvarum, построено генеалогическое древо штаммов изученных дрожжей;

- получены новые экспериментальные данные и подобраны условия сепарации и обезвоживания дрожжей на сушилке кипящего слоя, позволяющие сохранить до 90% живых клеток, подобрана оптимальная композиция стабилизаторов для обезвоживания дрожжей;

- исследованы культуральные и технологические свойства сухих винных и спиртовых дрожжей, определены их физиолого-биохимические параметры, используя различные методы оценки качества и хранения препаратов АСД;

- разработаны методы подготовки и хранения биокатализаторов к брожению для ИД;

- впервые разработаны способы подавления выхода клеток иммобилизованных дрожжей в вино во время брожения.

Практическая значимость работы. Проведенные исследования явились основой для создания биотехнологии новых высокоэффективных препаратов активных сухих и иммобилизованных форм отечественных винных и спиртовых рас дрожжей рода Saccharomyces, усовершенствования отечественной технологии винодельческого и спиртового производства. Использование сухих и иммобилизованных дрожжей позволяет ускорить процесс брожения, увеличить выход и улучшить качество готового продукта. Наряду с получением ценных продуктов, автором решены следующие ключевые вопросы:

- разработана и запатентована новая высокопроизводительная и экономичная технология винных и спиртовых АСД, обеспечивающая получение продукции высокого качества;

- составлены ТИ и ТУ технологии винных и спиртовых дрожжей;

- разработана технология применения винных и спиртовых АСД, позволяющая значительно повысить эффективность данных препаратов;

- подобраны условия реактивации АСД, позволяющие сохранить лаг-фазу развития сухих дрожжей, увеличить процент реактивируемых клеток на 10-15 % даже в неблагоприятных условиях, сократить время подготовки к брожению для шампанских АСД до 2-3 часов;

- определены факторы ингибирования АСД во время их хранения, а также реактивации и брожения, и изучен механизм их действия;

- подобраны наиболее перспективные флуорохромные красители для экспресс-контроля качества АСД с помощью люминисцентной микроскопии, сопряженной с компьютерным анализом изображений;

- разработана и запатентована технология ИД для виноделия на основе криогеля ПВС;

- проведены заводские испытания препаратов АСД и ИД и получены положительные результаты при использовании на винзаводах: ОАО Агрофирма «Южная» (Краснодарский край), ОАО АПФ «Фанагория» (Краснодарский край), ОАО «Миллеровский винзавод» (Ростовская обл.), ОАО «Игристые Вина» (г. Санкт-Петербург), и спиртзаводе ЗАО «Алтайросспиртпром» (г. Бийск, Алтайский край);

Результаты исследований по селекции при отборе наиболее продуктивных рас дрожжей, обладающих более ценными свойствами, и изучению ключевых физиолого-биохимических, технологических и молекулярно-биологических особенностей важнейших рас дрожжей рода БассЬаготусез, будут востребованы при использовании последних в отечественной винодельческой и спиртовой промышленностях.

Разработанные в результате исследования технологии новых высокоэффективных препаратов сухих и иммобилизованных дрожжей позволят значительно упростить технологию дрожжей на заводах, облегчая и ускоряя работу заводов, как в сезон, так и в период запуска, интенсифицировать процесс брожения, увеличат выход продукта и улучшат его качество.

Теоретические и прикладные положения работы нашли конкретное воплощение при формировании курса лекций и проведении практических занятий в Московском Государственном Университете пищевых производств, изложены в методических указаниях для студентов высших учебных заведений по специальности «Биотехнология» и «Технология виноделия», в монографии «Современные препаративные формы дрожжей для виноделия», курсовых и дипломных проектах и работах, а также на многих предприятиях винодельческого и спиртового производства.

Значимость работы подтверждена проведением заводских испытаний новых препаратов АСД и ИД на винодельческих и спиртовых заводах России, дипломами 1-ой степени по номинации «Биопрепараты и биологически активные добавки» на выставке-конкурсе Министерства образования РФ, Министерства промышленности, науки и технологий РФ, МГУГТГТ, Золотой медалью агропромышленной выставки «Золотая осень-2008».

Основные положения, выносимые на защиту: теоретические положения систематики, генетических особенностей и идентификации дрожжей рода БассЬаготусез, критерии отбора важнейших винных и спиртовых дрожжей для получения препаратов АСД и ИД;

- селекционированные расы винных и спиртовых дрожжей, их морфолого-физиологические, молекулярно-биологические, биохимические и технологические особенности;

- теоретическое и экспериментальное обоснование биотехнологии препаративных форм винных и спиртовых АСД и ИД;

- способ подавления выхода клеток иммобилизованных дрожжей в вино во время брожения;

- технологии применения АСД и ИД в виноделии и спиртовом производстве;

- эффективные способы реактивации и подготовки к брожению АСД и ИД;

- промышленные испытания новых препаратов АСД и ИД на заводах отечественной винодельческой и спиртовой промышленностей.

Личный вклад автора. Автором на основе анализа научно-технической и патентной литературы теоретически обосновано направление исследований, сформулированы цель и задачи, разработана методология проведения исследований.

Под его руководством и при непосредственном участии определены критерии отбора важнейших винных и спиртовых дрожжей-сахаромицетов, получения препаратов АСД и ИД для винодельческого и спиртового производств; исследованы и определены расы дрожжей для создания новых наиболее эффективных препаратов АСД и ИД для шампанских вин, белых и красных виноградных вин, производства спирта и сортовых плодовых вин; установлены морфолого-физиологические, молекулярно-биологические, биохимические и технологические особенности селекционированных дрожжей.

ИД в виноделии и спиртовом производстве, а также эффективные способы реактивации и подготовки к брожению АСД и ИД.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались и обсуждались на российских и международных научно-технических конференциях и симпозиумах: «Пища. Экология. Человек» (МГУ 1111, май, 1999); «Молодые ученые - пищевым и перерабатывающим отраслям АПК (технологические аспекты производства)» (МГУПП, декабрь, 1999; декабрь 2000); «Biocatalysis-2000: Fundamentals and applications» (Moscow, MSU, 10-15 June, 2000); «Химия и биотехнология пищевых веществ. Экологически безопасные технологии на основе возобновляемых ресурсов» (Москва, РХТУ, сентябрь, 2000); «Bioencapsulation in Biomedical, Biotechnological and Industrial Applications» (Warsaw, 11-13 May, 2001); «Качество, безопасность и экология пищевых продуктов и производств. Прогресс в агроиндустрии» (Ялта, 21-25 мая 2001 г.); «Научно-технический прогресс в спиртовой и ликеро-водочной отрасли промышленности» (Москва, 19-20 апреля 2001 г); «Катализ в биотехнологии, химии и химических технологиях» (Тверь, 2002 г); «Химия и биотехнология биологически активных веществ, пищевых продуктов и добавок. Экологически безопасные технологии» (Тверь, 2002 г.); «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2003 г); «Высокоэффективные пищевые технологии и технические средства для их реализации» (Москва, 2003); «Прогрессивные технологии и современное оборудование - важнейшие составляющие успеха экономического развития предприятий спиртовой и ликеро-водочной промышленности» (Москва, 23-24 апреля 2003 г); «Экологической науке - творчество молодых» (Гомель, 2003); «Биотехнология: состояние и перспективы развития», (Москва, 14-18 марта, 2005); «9-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых» (Пущино, 18-22 апреля, 2005); XXII International Conference on Yeast Genetic and Molecular Biology (Bratislava, 7-12 August 2005); «10-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых» (Пущино, 18-22 апреля, 2006); XXV International Specialized Symposium on Yeasts ISSY-25 (Helsinki, 2006); International Congress on Bioprocessing in Food Production (18-21 June ■ 2006, Patras, Greece, 2006), международной научной конференции «Генетика и биотехнология XXI века. Фундаментальные и прикладные аспекты». Минск. 2008.

По материалам выполненных исследований опубликовано 66 работ, общим объёмом 54 печатных листов, в том числе 38 - в центральных изданиях, получено 6 патентов РФ, опубликована 1 монография.

Объем и структура работы. Диссертация* изложена на 485 страницах, включающих 138 таблиц, 134 рисунка и состоит из введения, обзора, литературы, объектов и методов исследований, 4 глав собственных исследований, выводов, списка литературы, включающего 435 источников, в том числе 267 иностранных, и приложения.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Мартыненко, Николай Николаевич

выводы

1. Проведён скрининг 481 расы дрожжей вида Saccharomyces, выделенные в Западной Белоруси. Отобрано и рекомендовано 13 рас дрожжей для получения плодовых вин, из которых 5 рас имеют особо ценные свойства и представляют значительный интерес для производства, и 2 расы для спиртового производства.

2. Изучены и селекционированы 62 важнейшие отечественные расы винных и спиртовых дрожжей. Установлена их принадлежность к одному биологическому виду Saccharomyces cerevisiae на основании стандартных физиологических тестов, обозначены их различия между собой по ряду признаков в определители как вариабельные. Впервые изучены молекулярно-биологические их особенности современными методами анализа генома, даны морфологические и физиолого-биохимические характеристики, построено генеалогическое древо штаммов и обнаружено среди них 5 межвидовых гибридов дрожжей S.cerevisiae х S. bay anus Var.Uvarum.

3. Определены максимальные температуры роста исследуемых дрожжей и установлено, что они лежат в диапазоне 28-53 °С. Выявлены 4 группы дрожжей, которые растут при разных температурах: при t=35-37°C; при t = 44-46°С; при t=46-49°С; при t=49-53°C.

4. Отобраны 13 штаммов винных дрожжей рода Saccharomyces, имеющие наилучшие физиолого-биохимические особенности, для получения АСД и дальнейшего их использования при производстве красных и белых виноматериалов, игристых и плодовых вин, а, именно: для красных виноградных вин-Каберне-5; белых виноградных вин-Кокур-3 и 47-К; шампанских вин резервуарным и бутылочным способом — Харьковская-39; плодово-ягодных вин: яблочных - ГВ-4 и Сидровая-101; грушевых-ГВ-4 и Груша-10; вишнёвых - Вишня-6 и Вишня-18; черноплоднорябиновых - Вишня-18 и Москва-30; черничных - Вишня-18 и ДЧК-1; голубичных - Вишня-18 и Москва-30 ; черносмородиновых -Вишня 18 и Москва-30; красносмородиновых-Москва-30; малиновых- Москва-30 и ГСЧ-1; клюквенных-ГВ-4; брусничных- Брусничная-7 и ГВ-4; клубничных- Вишня-18 и Земляничная-9.

5. Разработана высокоэффективная технология винных и спиртовых АСД^, обеспечивающая получение продукта высокого качества. Созданная технологиия предусматривает использования мелассы как основное сырьё при культивировании дрожжей, предназначенных для получения АСД, промывку на сепараторе и сушку в кипящем слое, использование стабилизаторов. Составлены ТИ и ТУ, проведена апробация её на ООО «Дербенёвка-2» Московского дрожжевого завода и наработаны опытные партии дрожжей.

6. Изучены различные методы обезвоживания винных и спиртовых дрожжей. Подобрана оптимальная композиция стабилизаторов для обезвоживания на сушилке кипящего слоя дрожжей, выращенных на мелассе, повышающая выживаемость дрожжей на 40-50% по сравнению с необработанным контролем.

8. Проведены заводские испытания полученных препаратов АСД на винзаводах ООО «Крона» (Нижегородская обл.), ОАО АПФ «Фанагория» (Краснодарский край), ОАО «Миллеровский винзавод» (Ростовская обл.), ОАО «Корнет» (г. Москва) и спиртзаводе ОАО «Золотой Алтай» (Алтайский край). Отмечены высокие технологические показатели АСД - активное проведение брожения, высокий выход спирта, получение продукции с высокими органолептическими показателями.

9. Разработана технология получения биокатализатора на основе иммобилизованных в криогель ПВС клеток дрожжей 8.сегеУ1з1ае Шампанская-39, выращенных на полусинтетической среде, для использования в технологии шампанизации вина.

12. Проведены заводские испытания препаратов ИД для получения шампанских вин бутылочным методом на ОАО АПФ «Фанагория» (Краснодарский край) и ОАО «Корнет» (г. Москва), для получения красных и белых вин на винзаводах ОАО АПФ «Фанагория» (Краснодарский край), ОАО «Миллеровский винзавод» (Ростовская обл.), ООО «Ливадия» (г. Ялта, Украина). Средняя дегустационная оценка вин - 7,80 -7,95.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Мартыненко, Николай Николаевич, Щёлково

1. Абрамов Ш.А., Котенко С.Ц., Халилова ЭЛ., Исламова Ф.И., Омаров М. Способ получения сушеных дрожжей // Патент РФ №2151795. С 12 №1/16. 2000. БИ№18.

2. Абрамов Ш.А., Котенко С.Ц., Сосунов М.И. Штамм дрожжей Saccharomyces vini раса «Дербентская яблочная» для производства плодово-яблочных вин // Патент РФ №2036230. 1995. БИ. №15.

3. Абрамов Ш.А., Котенко С.Ц., Халилова Э.А., Исламова Ф.И., Даунова СМ. Морфофизиологические изменения дрожжей при лиофильной сушке в зависимости от состава питательной среды // Хранение и переработка сельхозсырья. 2000. №4. С. 35-37.

4. Авакянц С.П. Игристые вина. М: Агропромиздат. 1986. 272 с.

5. Авакянц С.П., Белоусова И. Д. Новое в производстве игристых вин за рубежом. ЦНИИТЭИпищепром. 1985. №3. 18 с.

6. Агеева Н.М. Физико-химические и биотехнологические основы повышения качества и устойчивости вин к помутнениям. Автореферат. .Д.т.н. Краснодар. КубГТУ. 2001. 48 с.

7. Александрова М., Ильяшенко Н.Дрикунова JL, Кудряшов В. Влияние способов асептирования на микробиологическую чистоту сусла из топинамбура //Известия вузов. Пищевая технология. 2001. №5-6. С. 52-53.

8. Александрова М., Ильяшенко Н.,Крикунова JL,Кудряшов В. Влияние способов асептирования сусла из топинамбура на физиологическое состояние спиртовых дрожжей.// Известия вузов. Пищевая технология. 2002. №2-3. С.35-36.

9. Антипов С.Т., Кретов И.Т., Шахов C.B., Бляхман Д.А. Рациональная организация сушки хлебопекарных дрожжей с использованием рециркуляции отработанного сушильного агента // Хранение и переработка сельхозсырья. 2000. № 4. С. 47-49.

10. Антохи М. Получение сухих активных дрожжей для виноделия //Национальный институт винограда и вина. Кишинев. 19986. 8 с. Деп. в МолдНИИТЭИ. 30.12.98. №1620-М-98.

11. Артемова Э., Рейтблат Б.Б., Жирова В.В. Влияние активных сухих дрожжей и исходного сырья на качество виноматериалов // Производство ликероводочных изделий и виноделие. 2003. С.7-9.

12. Бабьева И.П., Голубев В.И. Методы выделения и идентификации дрожжей. М.: Пищевая промышленность. 1979. 120 с.

13. Бабич В.В., Белькина B.C. Использование активных сухих дрожжей в виноделии // Садоводство, виноградарство и виноделие Молдавии. 1984. №7. С. 49-50.

14. Багатурия Н.Ш., Едиберидзе Э.Г. Исследование ароматических веществ яблочного и ткемалевого соков и влияние на них кислотопонижающих рас дрожжей // Хранение и переработка сельхозсырья. 2001. №12. С.38-41.

15. Балаганов П. Химия сидра. Химический состав яблок, яблочного сусла и сидра // Индустрия напитков. 2004. №5. С. 20-25.

16. Бачурина Г.П. Биоконверсия гидролизатов растительного сырья в этанол иммобилизованными бактериями Zymomonas mobilis. Дис. канд. биол. наук. М.: МГУ. 1988. 152 с.

17. Беличенко А.М., Оганесянц JT.A. Тенденции развития индустрии напитков // Пиво и напитки. 2001. №4. С. 14-17.

18. Бери Д. Биология дрожжей. М.: Мир. 1985. 96 с.

19. Бурьян Н.И., Кишковская С.А., Манафова С.М., Вентыня Э.Ю. Морфология клеток винных дрожжей при обезвоживании // Виноградарство и Виноделие СССР. 1984. №6. С. 49.

20. Бурьян II. И. Микробиология виноделия. Ялта.: Магарач. 2002. 433 с.

21. Бурьян Н.И.Практическая микробиология виноделия. Симферополь:Таврида. 2003. 560 с.

22. Бускене Л. Основные биологические и хозяйственные признаки и свойства сортов малины // Итоги и перспективы ягодоводства. Минск. 1999. С. 27-31.

23. Валуйко Г.Г., Бурьян Н.И., Кишковская С.А. Использование активных сухих дрожжей при производстве вин // Виноделие и Виноградарство СССР. 1982. №8. С. 55.

24. Валуйко Г.Г. Технология виноградных вин. Симферополь. Таврида. 2001. 624 с.

25. Валуйко Г.Г., Домарецкий В.А., Загоруйко В.А. ТехнологияАвина. Киев. Центр учебной литературы. 2003. 604 с.

26. Васильева Н., Римарева Л., Двадцатова Е., Окованцева М, Широкова Г. Сбраживание крахмалсодержащего сырья анаэробными бактериями рода Zymomonas // Производство спирта и ликероводочных изделий. 2001. №.1, С. 18-20.

27. Воробьева Г., Глухих С, Максимова Г., Римарева Л. Интенсификация производства спирта на основе применения композиционных биологических стимуляторов // Производство спирта и ликероводочных изделий. 2003. №.2. С. 14-15.

28. Воронцова Н., Чередниченко В., Абрамова И., Воробьева Т. Влияние ферментативной активности засевных спиртовых дрожжей на биосинтез этанола // Производство спирта и ликероводочных изделий 2001. №2. С. 18.

29. Воробьева Г., Максимова Г., Глухих С, Римарева Л. Технология интенсификации производства спирта с применением композиционных биостимумяторов // Производство спирта и ликероводочных изделий. 2004. №.2. С. 16-18.

30. Востриков С., Мальцева О., Кончакова Е., Федорова Е. Процесс сбраживания осветленного зернового сусла на этанол с применением рециркуляции дрожжей // Известия вузов. Пищевая технология. 1999. №.4. С. 50-52.

31. Востриков С., Мальцева О., Федорова Е. Динамика накопления примесей этилового спирта при сбраживании различных видов сусла // Известия вузов. Пищевая технология. 1999. №.1. С.19-21.

32. Востриков С., Мальцева О., Шуваева О., Сербулов Ю. Оптимизация процесса ферментации осветленного зернового сусла дрожжами Saccharomyces cerevisiae // Производство спирта и ликероводочных изделий. 2000. № 1. С.21.

33. Востриков С., Мальцева О., Шуваева Г., Сербулов Ю. Оптимизация процесса ферментации осветленного зернового сусла дрожжами Saccharomyces cerevisiae // Хранение и переработка сельхозсырья. 2000. №.12. С. 31-33.

34. Востриков С., Гурбий Г., Горшков Е. Влияние температуры на образование побочных продуктов при сбраживании осветленного зернового сусла // Известия вузов. Пищевая технология. 2001. №.1. С.36-38.

35. Вудворд Дж. Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы. М.: Мир. 1988. 215 с.

36. Гарабедян .М., Сакова М., Андонова Г. Производство на бели вина с имобилизирани дрожди. Ч. 2. Технология за производство бели вина с имобилизирани дрожди // Лозарство и Винарство. 1993. Г. 42 №5. С. 6-7.

37. Гарабедян М., Спиров Н., Цветанов О. Производствено изпитване на активни сухи дрожди // Лозарство и Винарство. 1983. Г.32. №10. С.19-23.

38. Горина В.А., Бурьян Н.И., Палик З.П. Использование иммобилизованных дрожжей в производстве шампанского бутылочным способом // Виноградарство и Виноделие СССР. 1990. №6. С. 60-66.

39. Горина В.А. Особенности использования иммобилизованных дрожжей в производстве игристых вин бутылочным способом // Виноградарство и Виноделие «Магарач». 2000. №3. С. 22-24.

40. Горун Е.Г. Переработка черноплодной рябины в консервной промышленности. М.: ВНИИТЭИагропром. 1990. 23 с.

41. Горшков Е., Востриков С, Гурбий Г. Оптимизация процесса получения концентрированного зернового сусла// Вестник ВГТА. 2001. № 6. С. 103-105.

42. Грязнова М.Н. Мембранотропный ауторегуляторный фактор dl и его роль в образовании покоящихся форм почвенных микроорганизмов. Автореферат.канд. техн.наук. М. 1987. 18 с.

43. Гугучкина Т.И., Агеева Н.М., Барре Ж., .Стаценко Л.А. Активные сухие дрожжи Института Энологии в Шампани // Виноделие и виноградарство. 2003. №4. С. 25-26.

44. Гудковский В.А. Антиокислительные (целебные) свойства плодов и ягод и прогрессивные методы их хранения // Хранение и переработка сельхозсырья. 2001. №4. С.13-19.

45. Гунькина Н., Фараджева Е. Исследование физико-химических свойств глюкоамилазы дрожжей Saccharomyces cerevisiae У-717 // Хранение и переработка сельхозсырья. 2001. №.7. С. 33-35.

46. Гунькина Н., Фараджева Е. Применение дрожжей Saccharomyces cerevisiae У-717 в производстве этилового спирта // Производство спирта и ликероводочных изделий. 2002. №.3. С. 14-15.

47. Дамберг Б.Э. Особенности метаболизма трегалозы в дрожжах Saccharomyces cerevisiae // В «Торможение жизнедеятельности клеток» под ред. Бекера М.Е. Рига. Зинатне. 1987. С. 100-107.

48. Ежов В.Н., Горина В.А., Согоян К.Р. Получение красных игристых вин бутылочным способом с использованием иммобилизованных дрожжей // Виноград и Вино России. 1997. №3. С. 17-18.

49. Кадиева А.Т. Разработка интенсивной технологии этанола на основе целенаправленного применения мультиэнзимных систем и новых рас дрожжей // Дис. канд. техн. наук. М.: ВНИИПБТ. 2003. 208 с.

50. Каприльянц А.С., Скрынин В.И., Эль-Регистан Г.И. Изменение структурного состояния мембраны М. lysodeikticus под влиянием ауторегуляторных бактериальных факторов dl // Прикладная биохимия и микробиология. 1985. Т.21. №.3. С. 378-381.

51. Качмазов Г., Сатцаева И., Дзампаева 3. Метод отбора наиболее активной культуры дрожжей // Производство спирта и ликероводочных изделий. 2004. № 1. С. 2 8.

52. Качмазов Г., Сатцаева И., Гуляева Е., Дзампаева 3. Выбор наиболее активной культуры дрожжей новым манометрическим методом // Производство спирта и ликероводочных изделий. 2004. №2. С.39.

53. Квасников Е.И. Микробиологические процессы в виноделии. Некоторые актуальные аспекты // Прикладная биохимия и микробиология. 1995. Т.31. №2. С.149-154.

54. Кислая JI.B., Маринченко В.А., Чупов В.В., и др. Сбраживание сусла иммобилизованными дрожжами в непрерывном потоке // Известия вузов. Пищевая технология. 1988. №6. С.86.

55. Кишковская С.А., Бурьян Н.И., Манафова С.М. Эффективность применения активных сухих дрожжей в производстве хереса и шампанского // Виноделие и виноградарство СССР.1981. №7. С.57-58.

56. Кишковская С.А., Бурьян Н.И. Получение активных сухих дрожжей Шизосахаромицетов и использование их в виноделии // Виноделие и виноградарство СССР.1982. №1. С. 15-16.

57. Кишковская С.А., Бурьян Н.И., Бабакина Э.Л., Абдуллабекова Д.А. Получение и применение препаратов сухих дрожжей рода Шизосахаромицев в виноделии. Ялта ИВиВ «Магарач». 1987. 23 с.

58. Кишковская С.А. Дрожжи рода Schizosaccharomyces и их роль в технологии виноделия // Итоги Науки и Техники. ВИНИТИ. Серия «Химия и технология пищевых продуктов». 1992. №8. 76 с.

59. Кишковская С.А., Иванова Е.В., Пикарь H.A. и др. Яблочнокислое брожение в жемчужных винах, вызываемое иммобилизованными в нем дрожжами Schizosaccharomyces acidodevoratus // Виноград и вино России. 1999. №4. С. 23.

60. Кишковский З.Н., Яковенко Н.И. Использование иммобилизованных микроорганизмов в технологии вин. Обз. инф. Сер. 15. ЦНИИНТЭИпищепром. 1991. №5. С. 1-30.

61. Кобелева И.Б., Осташенкова Н.В., Траубенберг С.Е., Попадич Н. Изучение условий активации сушеных хлебопекарных дрожжей // Ферментная и спиртовая промышленность. 1987. №5. С. 25-27.

62. Козляк E.H., Якимов М.М., Уткин И.Б. Физико-химические основы иммобилизации клеток методом сорбции (обзор) // Прикладная биохимия и микробиология. 1991.Т.27. № 6. С.788-803.

63. Косюра В.Т., Донченко JI.B., Надыкта В.Д. Основы виноделия. М.: ДеЛи принт. 2004. 440 с.

64. Кочева Е., Спасов X., Бамбалов Г. Селекция дрожжей для производства белых вин // Известия Вузов. Пищевая Технология. 1999. №1. С. 45-48.

65. Кощеенко К.А. Живые иммобилизованные клетки как биокатализаторы процессов трансформации и синтеза органических соединений // Прикладная биохимия и микробиология. 1981. Т. 17. №4. С. 477-493. '

66. Краллиш И.Л., Дамберг Б.Э. Энергетические показатели дрожжей Saccharomyces cerevisiae в процессе аэробного и анаэробного обезвоживания // Известия АН Латвийской ССР. 1987. №8. С. 87-90.

67. Кретов И.Т., Парфенопуло М.Г., Бляхман Д.А. Повышение ,эфффективности вакуум-сублимационной сушки хлебопекарных дрожжей // Вестник Воронежской Государственной Технологической Академии. 1999. № 4. С. 147-148.

68. Кузмичева И., Плотникова В., Гриц Н., Леонтьев В. Влияние иммобилизации на метаболизм дрожжей // Прикладная биохимия и микробиология. 1998. Т. 34. № 3. С. 251255.

69. Литовченко A.M., Тюрин С.Т. Справочник по плодово-ягодному виноделию. Днепропетровск: Сич. 2002. 510 с.

70. Лозинский В.И., Вакула A.B., Зубов А.Л. Применение криогелей поливинилового спирта в биотехнологии. IV. Обзор литературных данных // Биотехнология. 1992. №4. С. 5-14.

71. Лозинский В.И. Криогели на основе природных и синтетических полимеров: получение, свойства и области применения // Успехи химии. 2002. Т.71. №6. С. 559-584.

72. Лукерченко В., Рыбаков Ю. Моделирование процессов осахаривания и брожения в производстве этанола // Хранение и переработка сельхозсырья. 2001. №.3. С. 19-22.

73. Любченков П.П., Любченков А.П., Камчатный В.И., Узунов Ю.И. Производство шампанского в условиях ОАО АФ «Фанагория» // Виноделие и виноградарство. 2003. №4. С. 28-29.

74. Любченкова H.A., Любченков П.П. Особенности применения сухих гранулированных дрожжей ЮС-18-2007 в шампанском производстве // Виноделие и виноградарство. 2004. №6. С. 10-13.

75. Манафова С.М. Разработка технологии получения сухих винных дрожжей и применение их при производстве столовых вин. Дисс.к.т.н. Ялта. ИВиВ «Магарач». 1984. 201 с.

76. Меледина Т.В., Гудь И.В. Влияние условий реактивации на репаративные процессы в клетках активных сухих дрожжей // Вестник Международной академии холода. 1998. №3-4. С. 18-19.

77. Меледина Т.В. Научное обоснование и разработка высокоэффективных технологий дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Дис. доктора техн.наук. С-Пб. С-ПбГУНиПТ. 2002. 485 с.

78. Методы технохимического контроля в виноделии. Под ред. Гержиковой В.Г. Симферополь. Таврида. 2002. 260 с.

79. Мехузла H.A., Панасюк А.Л. Плодово-ягодные вина. М.: Легкая и пищевая промышленность. 1984. 240 с.

80. Моисеенко В., Дячкина А., Грачева О. Образование высших спиртов в ходе метаболизма дрожжей Saccharomyces cerevisiae // Производство спирта и ликероводочных изделий. 2004. №.1. С. 11-13.

81. Мулюкин А.Л., Козлова А.Н., Карпелянц A.C. Обнаружение и изучение динамики накопления ауторегуляторного фактора d-1 в культуральной жидкости и клетках Micrococcus luteus //Микробиология. 1996. Т. 65. Вып. 1. С. 20-25.

82. Мулюкин А.Л., Луста К.А., Грязнова М.Н. и др. Образование покоящихся форм в автолизирующихся суспензиях микроорганизмов // Микробиология. 1997. Т. 66. №1. С. 4249.

83. Наумов Г.И. Дифференциация генофонда культурных дрожжей Saccharomyces: восемь групп культиваров// ДАН СССР. 1989. Т. 306. С. 1253-1256.

84. Наумов Г.И., Наумова Е.С., Саришвили Н.Г. и др. Физиолого-таксономическое изучение дрожжей при производстве шампанского непрерывным способом // Доклады ВАСХНИЛ. 1989. №12. С. 34-36.

85. Наумов Г.И., Кондратьева В.И., Ефремов Б.Д. Генетические основы классификации и идентификации дрожжей (1968-1988). М.:ВНИИГенетика. 1989. 164 с.

86. Наумов Г.И., Наумова Е.С., Саришвили Н.Г.и др. Создание генетических линий шамцанских штаммов Saccharomyces cerevisiae // Доклады ВАСХНИЛ. 1990. №5. С. 39-41.

87. Наумов Г.И. Естественное разнообразие дрожжей — неисчерпаемый генофонд для фундаментальных и прикладных исследований // Успехи современной биологии. 1997. Т.117. № 2. С. 185-195.

88. Наумов Г.И. Дивергентная популяция дрожжей Saccharomyces paradoxus на Гавайах: вид in statu nascendi //Доклады АН. 1999. Т.364. №2. С.281-283.

89. Наумов Г.И. Новая разновидность Saccharomyces bayanus var. Uvarum comb, nov. установленная генетическим анализом // Микробиология. 2000. Т.69.№3. С. 410-414.

90. Наумов Г.И., Газдиев Д.О., Наумова Е.С. Обнаружение биологического вида Saccharomyces bayanus в Дальневосточной Азии // Микробиология. 2003. Т.72. №6. С. 834839.

91. Наумова Е.С, Наумов Г.И., Корхола М. Молекулярные кариотипы различных генетических линий дрожжей Saccharomyces cerevisiae // Биотехнология. 1993. №4. С. 2-5.

92. Наумова Е.С, Черноокова Т.В., Скорикова Т.К. и др. Селекция шампанских дрожжей на основе межвидовой гибридизации Saccharomyces cerevisiae * S.bayanus // Биотехнология. 1993. №7. С. 8-13.

93. Нгуен Тхи Хьюнг, Шаненко Е.Ф., Попов М.П., Эль-Регистан Г.И. Действие ауторегуляторного фактора dl на накопление ферментов в рисовом солоде // Пиво и напитки. 1999. №1. С. 40-41.

94. Никифорова Т.А., Мушникова JI.H., Галкин А.В. Тросниковая меласса сырье для производства пищевой лимонной кислоты // Хранение и переработка сельхозсырья. 1995. №4. С. 30-31.

95. Оганесянц JI.A. Современные технологии и тенденции развития виноделия // Виноград и вино России. 2001. № 3. С. 4-6.

96. Орешкина. А., Новикова В., Полякова Г. Применение бактерий-кислотопонижателей в производстве шампанских виноматериалов // Виноделие и виноградарство СССР. 1983. №6. С. 16-19.

97. Палик З.П. Совершенствование технологии производства игристых вин бутылочным способом на основе использования иммобилизованных дрожжей. Дисс. канд. техн. наук. Ялта.: ИВиВ «Магарач». 1992. 180 с.

98. Панасюк A. JI. Производство плодовых вин в России // Виноград и вино России. 1992. № 1.С. 23-26.

99. Петрова Т., Маринченко JI. Иммобилизованные термотолерантные дрожжи в производстве спирта // Известия ВУЗов. Пищевая технология. 1988. №3. С. 40.

100. Писарницкий А.Ф., Гвелесиани Р.К., Поляков В.А. Моделирование аромата земляники // Известия Вузов. Пищевая технология. 1991. №11. С. 69-70.

101. Поляков В., Пыхова С, Мазур Н. и др. Использование препарата антисептического действия в производстве спирта // Производство спирта и ликероводочных изделий 2001. №3. С.30.

102. Поляков В., Оверченко М., Серба Е., Римарева JI. Влияние ферментативного комплекса Aspergillus oryzae 387 на степень гидролиза дрожжевой биомассы // Хранение и переработка сельхозсырья. 2001. №.8. С. 32-35.

103. Радина Н. Сравнительная характеристика сухих пивных дрожжей верхового брожения // Тезисы докладов Международной научно-теоретической конференции «Молодые ученые пищевым и перерабатывающим отраслям АПК». М.: МГАПП. 1997. С 13.

104. Разуваев В., Саркисян А. Опыт получения активных сухих дрожжей в процессе переработки винограда. Пищевая промышленность. Сер. Винодельческая промышленность. М.:ЦНИИНТЭИпищепром. 1988. №1. С.1- 28.

105. Рапопорт А.И., Мейсель M.JI. О люминисцентно-микроскопическом определении выживаемости дрожжевых организмов после обезвоживания // Микробиология. 1985. Т. 54. №1. С.66-68.

106. Рапопорт А.И., Берестенникова Н., Яновский К., Беккер М. Об изменениях формы и размеров дрожжевых клеток при их обезвоживании и последующей реактивации // Микробиология. 1986. Т. 55. №5. С. 881-882.

107. Рапопорт А.И., Бекер М.Е. О разрушении рибонуклеиновых кислот в дрожжевых клетках при их обезвоживании // Микробиология. 1986. Т.55. №5. С.855-857.

108. Рапопорт А.И., Бирюзова В.И., Светличная Т.П. Криофрактографическое исследование изменений вакуолей при обезвоживании клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae // Микробиология. 1986. Т. 55. № 6. С. 1030-1035.

109. Рапопорт А.И., Пузыревская О.М., Саубенова М.Г. Полиолы и устойчивость дрожжей к обезвоживанию //Микробиология. 1988. Т. 57. №2. С.329-332.

110. Рейтблат Б.Б. Научное обоснование и разработка технологии шампанизации вина на основе регулирования физиологии и метаболизма дрожжей. Автореф.дис.докт.техн.наук. М.:ВНИИПБиВП. 1997. 68 с.

111. Римарева J1.B. Новые расы дрожжей для повышения эффективности спиртового производства // Производство спирта и ликероводочных изделий. 2000. №.1. С. 18-20.

112. Римарева J1.B. Новые расы дрожжей для повышения эффективности спиртового производства // Современные прогрессивные технологии и оборудование в спиртовой и ликероводочной промышленности. М.: Пищепромиздат.2000. С. 63-73.

113. Римарева JI. , Оверченко М., Гернет А. Скрининг активных рас дрожжей с термотолерантными свойствами и осмофильными свойствами для интенсификации производства этанола // Пиво и напитки 2000. №. 1. С.34-36.

114. Римарева JL , Оверченко М. , Игнатова Н. и др. Рациональный выбор расы спиртовых дрожжей // Производство спирта и ликероводочных изделий. 2001. №.2. С. 19-21.

115. Римарева Л.В., Оверченко М.Б., Игнатова Н.И. Технологические аспекты использования сухих дрожжей в производстве спирта // Производство спирта и ликероводочных изделий. 2003. №1. С.15-16.

116. Рихванов Е.,Варакина Н., Русалева Т., и др. Изменение дыхания при действии теплового шока на дрожжи Saccharomyces cerevisiae // Микробиология. 2001. Т.70. № 4. С.531-535.

117. Родопуло А.К., Егоров И.А., Егофарова Р.Х. Липиды и жирные кислоты у винных дрожжей // Прикладная биохимия и микробиология. 1988. Т.24. №1. С.94-97.

118. Саришвили Н.Г. Технология красных сухих вин с использованием иммобилизованных дрожжей // Пищевая промышленность. 1990. №12. С.37-38.

119. Саришвили Н.Г., Панасюк А., Столярова Е. и др. Биосорбция тяжелых металлов дрожжами Saccharomyces vini // Прикладная биохимия и микробиология. 1992. Т.28. №3. С. 402-408.

120. Саришвили Н.Г., Панасюк А., Столярова Е. Использование иммобилизованных дрожжей в виноделии // Хранение и переработка сельхозсырья. 1996. № 3. С.40-44.

121. Саришвили Н.Г., Панасюк А., Кузьмина Е, и др. Совершенствование технологии белых выдержанных вин // Хранение и переработка сельхозсырья. 2000. № 10. С.26-28.

122. Саришвили Н.Г., Рейтблат Б.Б.Микробиологические основы технологии шампанизации вина. М.:Пищевая промышленность. 2000. 364 с.

123. Саришвили Н.Г., Панасюк А.,Кузьмина Е. и др. Новое в технологии красных выдержанных вин //Хранение и переработка сельхозсырья. 2001. № 3. С.7-8.

124. Семихатова Н.М., Чулина Е., Ожегова Е., Кочкина И. Технология производства сушеных дрожжей. М.: Пищевая Промышленность. 1976. 120 с.

125. Семихатова Н.М. Хлебопекарные дрожжи. М.: Пищевая промышленность. 1980. 200 с.

126. Синицын А.П., Райнина Е.И., Лозинский В.И., Спасов С.Д. Иммобилизованные клетки микроорганизмов. М.: Изд-во МГУ. 1994. 288 с.

127. Скорикова Т.К., Тюрина Л.В. Изменчивость фенотипа киллер у винных дрожжей // Виноделие и виноградарство. 1979. №7. С. 58.

128. Согоян K.P., Горина В. Альгинат натрия из черноморской бурой водоросли рода Cistofera как носитель иммобилизованных дрожжей для получения игристых вин бутылочным способом // Виноград и вино России. 1998. № 3. С. 17-19.

129. Справочник по виноделию. Под ред. Валуйко Г.Г., Косюры В.Т. Симферополь. Таврида. 2000. 624 с.

130. Таран Н, Антохи М., Палик 3., Дубовикова Т. Совершенствование технологических режимов производства сухих активных дрожжей для виноделия // Виноград и Вино России. 2000. Спец. выпуск. С. 66-67.

131. Тулякова Т.В. Производство хлебопекарных дрожжей в СССР и за рубежом. Серия 27. Хлебопекарная, макаронная, дрожжевая промышленность. Обзорная информация // М.: ЦНИИТЭИпищепром. 1985. Вып. 9 . 40 с.

132. Фараджева Е, Куршева Н., Савин С. Получение спирта из тритикале тонкого помола с оптимизацией процессов осахаривания и брожения // Известия вузов. Пищевая технология. 1995. №.5-6. С. 44-45.

133. Федорычева H.A. Биохимическая оценка сортов смородины в условиях Ульяновской области // Сборник научных трудов Ульяновского НИИСХ. 2001. Т.15. С. 68-73.

134. Федюнина Е., Шаненко Е. Влияние способов реактивации на интенсивность брожения // Тезисы докладов Международной научно-практической конференции «Молодые ученые -пищевым и перерабатывающим отраслям АПК». М. 1997. С. 12.

135. Феофилова Е.П.,Грязнова М.В., Садовова Н.В. Способность маннита и трегалозы повышать устойчивость мицелиальных грибов к температурным воздействиям // Прикладная биохимия и микробиология. 1989. Т.25. №5. С. 699-706.

136. Феофилова Е.П., Терешина В.М., Хохлова Н.С., Меморская А.С. О различных механизмах биохимической адаптации мицелиальных грибов к температурному стрессу: изменения в составе углеводов цитозоля // Микробиология. 2000. Т.69. № 5. С.606-611.

137. Филимонова М., Габдулина Г., Забарова И. Метод определения жизнеспособности клеток Serratia marcescens, иммобилизованных в криогель поливинилового спирта // Прикладная биохимия и микробиология. 1990. Т.26. №5. С.706-708.

138. Хилько J1.A., Причко Т.Г. Возделывание новых сортов малины на юге России // Садоводство и виноградарство. 2000. № 3. С. 11-13.

139. Черников В., Шаповаленко А., Дубинчук JL, Васильченко М. Использование сухих дрожжей в производстве шампанских и игристых вин на МКШВ // Виноград и вино России. 2000. №2. С. 28-29.

140. Швец В., Тодосийчук С. Исследование бродильной активности и метаболизма иммобилизованных дрожжей // Биотехнология. 1989. №3. С. 365.

141. Яровенко B.J1. Влияние объма молодых дрожжей и отделения зоны стареющих клеток на рост производительности батареи // Хранение и переработка сельхозсырья. 1994. №4. С.24-27.

142. Aasvany Akos. Eleszto stazterkulturak a boraszatban: uj torzvedelem, a forgalmazas szabalyozasa // Elcmez. IP. 1991. V. 45. №4. P. 126-128.

143. Ackermann J., Fischer M., Amado R. Changes in sugars, acids and amino acids during ripening and storage of apples // Journal of agricultural and food chemistry. 1992. V. 40. №7. P. 1131-1134.

144. Amore Т., Panchal C., Stewart G. Intracellular ethanol accumulation in Saccharomyces cerevisiae during fermentation //Applied and environmental microbiology. 1988. Y.54. №1. P.110-114.

145. Amsden В., Turner N. Diffusion characteristics of calcium alginate gels // Biotechnology and Bioengineering. 1999. V. 65. №.5. P .605-610.

146. Attfield P., Kletsas S., Veal D., Van Rooijen R., Bell P. Use of flow cytometry for monitor cell damage and predict fermentation activity of dried yeasts // Journal of Applied Microbiology. 2000. V.89. №2. P. 207-214.

147. Auzina L., Kruce R., Upite D., Bekers M. Apple juice fermentation by liquid and dry instant wine yeasts // Proceedings of the Latvian Academy of Sciences. 1996. V.50. №3. P. 130-132.

148. Bach H.P., Friedrich G. Hefenahrstoffe und Ruttelhilfen // Der Deutsche Weinbau. 1994. №15. S. 16-18.

149. Bach H. Agglomerierende Sekthefen // Das Deutsche Weinmagazin. 1996. №2. S. 18-21.

150. Bach H.P. Thiamin und Nahrsalze Hilfen fur die zweite Garung // Der Deutsche Weinbau. 1997. №5/7. S. 16-18.

151. Bakoyianis V., Kana K., Kalliafas A., Koutinas A. Low-temperature continuous wine making by kissiris-supported biocatalyst: volatile byproducts // Journal of agricultural and food chemistry. 1993. №41. P. 465-468.

152. Balcerek M., Szopa J., Chalat I. Fermentacia zacierow jablkowych z udzialem drozdy Schizosaccharomyces pombe and Saccharomyces cerevisiae (2) // Przemysl fermentacyiny i owocowo-warzywny. 2003. T.47. №4. S. 29-30.

153. Barbotin J.-N. Comportement physiologique et stabilité des cellules immobilisées // Biofutur. 1994. №3. P. 22, 24-27.

154. Bardi E.P., Koutinas A.A. Immobilization of yeasts on delignified cellulosic material for room temperature and low-temperature wine-making // Journal of agricultural and food chemistry. 1994. Vol. 42. №1. P.221-226.

155. Bardi E.P., Koutinas A. A., Psarianos K., Kanellaki M. Volatite by products formed in low-temperature wine-making by immobilized yeast cells // Process Biochemistry. 1996. V. 32. №7. P. 579-584.

156. Barini B. Yeast lyophilization for use in winemaking // Rivista viticolt. Enologia. 1956. V. 9. P. 173-181.

157. Barnett J.A. The taxonomy of the genus Saccharomyces Meyen ex Rees: a short review for non-taxonomists//Yeast. 1992. V.8. P. 1-23.

158. Bassapa S.C. Baker's yeast production, quality and utilization // In Biotechnology: food fermentation. Ed. V.K. Joshi. NewDehli. Asiate Publishers. 1999. P. 1113-1144.

159. Bauer V.H., Kleinheuz S. Technologische Kenngrossen von Trockenhefen // Die WeinWissenschaft. 1978. №. 33. S. 188-199.

160. Baumann-J.W. L'utilisation des levuresjseches jiaus l'élaboration des vins de diversa provenienza // Industrie delle conserve. 1986. V.61. № 1. P. 266-268.

161. Bazzarini R., Bigliardi D., Gherardi S. Caratterizzazione analitica di lamponi, mirtilli, more di rovo e ribes rosso di diversa provenienza //Industriedelle conserve. 1986. V.61. №1. P.22-28.

162. Beker M., Blumberg J., Ventina E., Rapoport A. Characteristics of cellular membranes at rehydration of dehydrated yeast Saccharomyces cerevisiae // European journal of applied microbiology and biotechnology. 1984. P.347-352.

163. Benaroudj N., Lee D., Goldberg A. Trehalose accumulation during cellular stress protects cells and cellular proteins from damage by oxygen radicals // Journal of biological chemistry. 2001. V.276. №26. P. 24261- 24267.

164. Berger R., Ruhleman I. Significance of the surface of immobilized Saccharomyces cerevisiae cells in ethanolic fermentation // Acta Biotechnology. 1988. V. 8. № 5. P. 395-400.

165. Bidan P., Maugenet S. Informations recentcs sur l'emploi fed levures seche actives. Leur influence sur la qualité des vins//Bulletin de O.I.V. 1981 .V.54.№601. P. 241-254.

166. Binder G. Reinzuchthefe im praktischen Einsatz // Das Deutsch Weinmagazin! 1998. № 16/17. S. 28-30.

167. Binder G. Wichtige Weichen fur die Weinausbau // Der Deutshe Weinbau. 1996. №16-17. S. 54-55.

168. Bizeau C, Quere J.-M., Michel A., Drilleau J.-F. Possibilité de modeliser la fermentation du cidre // Industie alimentaria et agronomy. 1992. V.109. № 1/2. P. 15-21.

169. Bont J.A. Physiology of immobilized cells. Amsterdam: Elsevier. 1990. 716 p.

170. Briegel K.; Fath K. Richtiger Hefeansatz zur zweiten Garung // Der Deutsche Weinbau. 1994. №6. S.18.

171. Bruinenberg P., Waslander G, Van Dijken J., Scheffers W. A Corparative radiorespirometric study of glucose metabolism in yeasts // Yeast. 1986. V.2. P. 117-121.

172. Buchter-Weisbrod H. Mineralstoffe pur: die Himbeere // Flussiges Obst. 2001. №6. S.320-321.

173. Bucke C. Cell immobilization in calcium alginate // Methods in Enzymology 1987. V. 135. P. 175-189.

174. Bugaewska A., Wzorek W. Wplyw wybrwnych aktywatorow I postaci uzutych drozdzy na fermentacje winiarska//Przemysl fermentacyiny i owocowo-warzywny. 1985. T.30. № 6. P.26-28.

175. Busova K., Magyar J. Effect of immobilized yeasts on the quality of bottle-fermented sparkling wine // Acta Alimentaria. 1994. V.23. №1. P. 9-23.

176. Busova K., Magyar J., Janky F., Csillag F. Inhibition of cell release in champagne production with immobilized yeast // Acta Alimentaria. 1993. Vol.22. №1. P.63.

177. Buzas Z., Daiimann K., Szajani B. Influence of pH on the growth and ethanol production of free and immobilized Saccharomyces cerevisiae cells // Biotechnology and Bioengineering. 1989. V.34. P. 882-884.

178. Caetano-Anolles G., Bassam B.J., Grcsshoff P.M. DNA amplification fingerprinting using very short arbitrary oligonucleotide primers // Biotechnology. 1991. V.9. P. 553-557.

179. Cantarelli C. The use of immobilized yeast in wine fermentation // Italian journal of food science. 1989. V.l. №3. P. 3-20.

180. Cantarelli C, Lanzarini G. Biotechnology applications in beverage production. London: Elsevier. 1989.257 p.

181. Capshew B. Perry the Other Cider // Zymurgy. 2001. №6. P. 36-39.

182. Castellari L., Giudici P., Grazia L., Passarelli P. Azione dei ceppi di Saccharomyccs critolcranti sul contenuto in acido malico dei vini // Industrie delle Bevande. 1992. V.21. №6. P.509-512.

183. Ciani M., Rosini G. Sparkling wine production by cell-recycle fermentation process (CRBF)// Biotechnology Letters. 1991. V.13. №7. P. 533-536.

184. Ciani M., Risini G. Vinificazioni industriali in "Purezza microbiologica": Partecipazione della coltura starter al processo fermentativo // Industrie delle Bevande. 1993. V. 22. №125. P.202-206.

185. Ciani M., Ferraro L. Enhanced glycerol content in wines made with immobilized Candida stellata cells // Applied and environmental microbiology. 1996. V. 62. №1. P. 128-132. .

186. Ciani M., Ferraro L. Combined use of immobilized Candida stellata cells and Saccharomyces cerevisiae to improve the quality of wines // Journal of Applied Microbiology. 1998. №85. P. 247254.

187. Cibis E., Zboromirska-Wnukiewicz B., Garncarek Z. and oth. Kinetic analysis of Saccharomyces cerevisiae cell immobilization onto ceramic supports // Polish journal of food and nutrition sciences. 2002. V.l P. 51-56.

188. Ciesarova Z., Domeny Z., Smogrovicova D., Patkova J., Sturdik. Comparison of ethanol tolerance of free and immobilized Saccharomyces uvarum yeasts // Folia Microbiologika. 1998. V. 43. №.1. P. 55-58.

189. Colagrande O. Evoluzione dell'enologia e ruolo della ricerea scientific // Industrie delle Bevande. 1988. V.17. P.l 13-122.

190. Colagrande O., Silva A., Fumi M. Recent application of biotechnology in wine production // Biotechnology Progress. 1994. №10. P. 2-18.

191. Crapisi A., Spettoli P., Zamorani A., Borin G. Prove di spumantizzazione in bottiglia di moscato bianco del Colli Euganei con lieviti immobilizatti // Industrie delle Bevande. 1990. V.19. №4. P.328-331.

192. Cuinier C, Gros C, Lacoste J., Puisais J. Comparaison de leveres seches actives utilisees en oenologie // Revue France Oenologie. 1985. V.25. №97. P. 41-46.

193. Czyzycki A., Lukawska-Pietrzak Z., Pogorelski E. Aronia czarnoowocowa -cennym surowcem winiarskim // Przemysl fermentacyiny i owocowo-warzywny. 1993. T.37. №4. S. 15-18.

194. Czyzowska A., Pogorelski E. Changes to polyphenols in the process of production of must and wines from blackcurrants and cherries. Part I. Total polyphenols and phenolic acids // European Food Research and Technology. 2002. V. 214. №2. P. 148-154.

195. Czyzowska A., Pogorelski E. Changes to polyphenols in the process of production of must and wines from blackcurrants and cherries. Part II. Anthocyans and flavanols // European Food Research and Technology. 2004. V. 218. №4. P. 355-359.

196. Debourg A., Van Nedervetelde. The use of dried yeast in the brewing industry // Proceeding of the 27th Congress of European Brewery Convention. Cannes. 1999. P. 751-760.

197. Delfini C., Formica J.V. Wine microbiology: science and technology. 2001. 496 p.

198. Dettweiler G., Berger R., Drawert F. Herstellung von Apfelsaft mit hoher Aromaqualitat // Flussiges Obst. 1992. B.59. №.12. S. 722-726.

199. Divies Ch., Cachon R., Cavin J., Prevost H. Theme 4: Immobilized cell technology in wine production // Critical reviews in biotechnology. 1994. V. 14. № 2. P. 135-153.

200. Duteurtre D., Ors P., Hennequin D. Point sür le development industriel des levures immobilisees en Champagne // Industrie delle Bevande. 1991. V. 20. №111. P.23-25.

201. Dziuba B., Babuchowski A., Niklewicz M. Effect of ethanol stress on lactobacilli // Polish journal of food and nutrition sciences. 2000. V.50. №4. P.41-47.

202. Eberhard K.Untersuchungen an Apfelweinen Vergleiche verscniedener Herstellungsverfahren. Teil 1 // Getränke-Industrie. 1992. B.46. № 5. S. 312-314, 316-318.

203. Ellinger W. Künftig noch genug Apfel für die Verarbeitung // Flussiges Obst. 1992. B.59. №8. S.495-501.

204. Endo H., Hayashi T., Nakayama J., Mukada Y., Watanabe E. Rapid determination of the number of viable yeast cells during fermentation by flow cytometry // Journal of Tokyo University of Fisheries. 1998. V. 85. №2. P.65-72.

205. Escot S., Feuillat M., Julien A., Charpentier C. Release of functional polysaccharides by wine yeast and their interection with wine polyphenols // Wine internet technical journal. 2002. №2. P. 17.

206. Esser K., Lemke P.A. The Mycota: A comprehensive treatise on fungi as experimental systems for basic and applied research. Vol. 3. Biochemistry and molecular biology. Berlin etc.: Springer. 1997. 449 p.

207. Fischer U., Milos C Garverhalten mikroverkapselter Hefen // Das Deutsche Weinmagazine. 2001. №1. S. 31-35.

208. Fraile P., Garrido J., Ancin C. Influence of a Saccharomyces cerevisiae selected strain in the volatile composition of rose wine. Evolution during fermentation // Journal of agricultural and food chemistry. 2000. V.48. P. 1789-1798.

209. Fuleki T., Pelayo E.s Palabay R. Carboxylic acid composition of varietal juices produced from fresh and stored apples // Journal of agricultural and food chemistry. 1995. V.43. №7. P. 598-607.

210. Fuleki T., Pelayo E., Palabay R. Sugar composition of varietal juices produced from fresh and stored apples // Journal of agricultural and food chemistry. 1994. V.42. №7. P. 1266-1275.

211. Fumi M.D., Trioli G., Silva A., Battistotti G., Ragg E., Faoro F. Studio del metabolismo dei lieviti immobilizzati mediante spettroscopia a risonanza magnetica nucleare // Industrie delle Bevande. 1990. V. 19. P. 394-401, 401-404.

212. Fumi M.D., Ragg E., Battistotti G., Colagrende O. Alginate immobilized Saccharomyces cerevisiae cell alterations during alcoholic fermentation // Italian journal of food science. 1994. V.3. №3. P. 325-338.

213. Gainvors A., Karam N., Lequart C, Belerbi A. Use of Saccharomyces cerevisiae for the clarification of fruit juices // Biotechnology letters. 1994. V.16. №12. P. 1329-1334.

214. Galazzo J., Bailey J. Growing Saccharomyces cerevisiae in calcium alginate beads induces cell alteratious which accelerate glucose conversion to ethanol //Biotechnology Bioengeneering. 1990. V.36. №4. P. 417-426.

215. Gilson Ch. D., Thomas A., Hawkes F. Gelling mechanism of alginate beads with and without immobilised yeast // Process biochemistry international. 1990. P. 104-108.

216. Gilson Ch. D., Thomas A. Calcium alginate bead manufacture: with and without immobilized yeast. Drop formation at a two fluid nozzle // Journal of chemical technology and biotechnology. 1995. V.62. № 3. P.227-232.

217. Godia F., Casas C, Sola S. Application of immobilized yeast cells to sparkling wine fermentation // Biotechnology Progress. 1991. №7. P. 468-470.

218. Goni D.T., Azpilicueta C.A. Use of nitrogen compounds in spontaneous and inoculated wine fermentations // Journal of agricultural and food chemistry. 1999. V.47. №10. P. 4018-4024.

219. Gorgens M., Entrop A. Kalkulationen zum Heidelbeeranbau // Obstbau. 2000. B.25. №12. S.668-672.

220. Grego J., Sajbidor J., Malik F., Krasny S. Uplyv imobilizacie na zlozenie lipidov vinnych kvasiniek pocas etanoloveho stresu // Kvasny Prumesl. 1994. V.40. №6. P. 169-171.

221. Groboillot A., Boadi D.K., Poncelet D., Neufeld R.J. Immobilization cells for application in the food industry//Critical Reviews in Biotechnology. 1994. V.14. №2. P.75-107.

222. Grossman M., Schneider I., Huehn T., Remise F., Dequin S. Effects of enhanced glycerol production on yeast activity and fermentation flavor // Bulletin de L'O.LV 2001. V.74. №843-844. P.348-364.

223. Gu Y., Qiao M., Zhou Q., Zhou Z., Chen G. Ilyperproduction of alcohol using yeast fermentation in highly concentrated molasses medium // Tsinghua science and technology. 2001. V.25. P. 223-225.

224. Häkkinen S.H., Torronen A.R. Content of flavonols and selected phenolic acids in strawberries and Vaccinium species: influence of cultivar, cultivation site and technique // Food rcscrch international. 2000. V.33. №6. P. 517-524.

225. Häkkinen S.H., Karenlampi S.O., Mykkanen, H.M., Torronen A.R. Influence of domestic processing and storage on flavonol contents in berries // Journal of agricultural and food chemistry. 2000. V.48. №7. P. 2960-2965.

226. Hardy G. Synthese des connaissances et de l'utilisation des levures agglomerantes en methode champenoise // Industrie delle Bevande. 1991. V.20. P.31-36

227. Heinonen I.M., Meyer A.S., Frankel E.N. Antioxidant activity of berry phenolics on human low-density lipoprotein and liposome oxidation // Journal of agricultural and food chemistry. 1998. V.46. №10. P. 41074112.

228. Heinonen I.M., Lehtonen P.J., Hopia A.I. Antioxidant activity in berry and fruit wines and liquors // Journal of agricultural and food chemistry. 1998. V.46. № 1. P.25-31.

229. Herrero M., Cuesta L, Garcia L., Diaz M. Changes in organic acids during malolactic fermentation at different temperatures in yeast-fermented apple juice // Journal of the institute of brewing. 1999. V. 105. №3. P. 191-195.

230. Herrero M., Garcia L., Diaz M. Organic acids in cider with simultaneous inoculation of yeast and malolactic bacteria: effect of different temperature // Journal of the institute of brewing. 1999. V.105. №4. P. 229-232.

231. Herrmann K. Uber die Gehalte der hauptsachlichen Pflanzenphenole im Obst // Flussiges Obst. 1992. B.59. № 2. S. 66-70.

232. Herrmann K. Die Aromastoffe des Obstes. Teil V: Beerenobst (ausser Erdbeeren) // ErwerbsObstbau. 1992. B.34. № 6. S. 168-172.

233. Herrmann K. Anthocyanine als Farbstoffe unserer Obstarten Erwerbsobstbau. 1997. B.39. №.1.S. 11-14.

234. Herrmann K. Inhaltsstoffe der Apfel // Industrie von Obst und Gemuseverwertung. 1998. B.83. №8. S. 234-241.

235. Herrmann K. Gesundheitliche Bedeutung von antioxidativen Flavonoiden und Hydroxyzimtsauren im Obst und in Fruchtsaften // Flussiges Obst. 1999. B.66. №10. S. 566-570.

236. Herrmann K. Ubersicht über die Aromastoffe von Äpfeln // Industrie von Obst-Gemuseverwertung. 1999. B.84. №4. S. 106-110.

237. Hilge B., Rehm HJ. Comparison of fermentation properties and specific enzyme activities of free and calcium alginate entrapped Saccharomyces cerevisiae // Applied Microbiology and Biotechnology. 1990. Vol.33. P. 54-58.

238. Hilge B., Rehm HJ. Vergleich des Stoffwechsels freier und immobilisierter Zellen von Saccharomyces cerevisiae // Forum mikrobiol. 1989. Bd. 12. № 1- 2. S. 58.

239. Hilge-Rotmann B., Rehm H. Comparison of fermentation properties and specific enzyme activities of free and calcium-alginate-entrapped Saccharomyces cerevisiae // Applied microbiology and biotechnology. 1990. V.33. P.54-58.

240. Hoffman S. Yeast stress responses. New-York etc.: Springer. 1997. 252 p.

241. Hronsky V., Domeny Z., Malik F. Tvorba prchavych zloziek vina v zavislosti od podmienok fermentacie // Vinohrad. 1998. №2. S. 38-40.

242. Huhn T., Grossmann M. Stress fur die Hefen // Der Deutsche Weinbau. 1997. № 18. S.24-28.

243. Hynes S.,Kjarsgaard D., Thomas K., Ingledew W. Use of virginiamycin to control the growth of lactic acid bacteria during alcohol fermentation // Entrez PubMed. 1997. V. 18. № 4. P.284-291.

244. Iconomopoulou M., Kanellaki M., Psarianos K., Routinas A. Delignifled cellulosic material supported biocatalyst as freeze-dried product in alcoholic fermentation // Journal of agricultural and food chemistry. 2000. №.48. P. 958-961.

245. Inlow D., Mc Rae, Ben-Bassat A. Fermentation of corn starch to ethanol with genetically engineered yeast // Biotechnology and bioengineering. 1988. V.32. P.227-230.

246. Ivanova V., Rychtera M., Beserova G. Vyuziti immobilizovanych bunek kvasinky Saccharomyces cerevisiae ke kontinualni vyrobe ethanoli. I. Perspektivy vynziti // Kvasny prumesl. 1989. № 2. P. 41-44.

247. Iversen C. K. Black currant nectar: effect of processing and storage on anthocyanin and ascorbic acid content// Journal of food science. 1999. V.64. №1. P. 37-41.

248. Iwahashi H., Nwaka S., Obuchi K., Komatsu Y. Evidence for the interplay between trehalose metabolism and Hsp 104 in yeast // Applied and environmental microbiology. 1998. V.64. №11. P.4614-4617.

249. Jiang J., Paterson A., Piggot J.R. Effect of pectoiytic enzyme treatment on antocyanins in raspberry juice // International journal of food science and technology. 1990. V.25. P.596-600.

250. Joekes L, Moran P., Rodrigues R., Tonella E., Cassiola F. Characterization of Saccharomyces cerevisiae immobilized onto chrysotile for ethanol production // Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 1998. № 73. P.54-58.

251. Joshi V.K., Sandhu D.K., Thakur N.S. Fruit-based alcoholic beverages // In Biotechnology: food fermentation. Eds. Joshi V.K., Pandey A. New Dehli Asiatech Publishers. 1999. Vol.2. P. 647-744.

252. Joshi V.K., Sandhu D.K. Quality evaluation of naturally fermented alcoholic beverages, microbiological examination of source of fermentation and ethanol productivity of the isolates // Acta Alimentaria. 2000. V.29. №4. P. 323-334.

253. Kavamura D. Breeding of yeast strain able to grow at 42C // Bioscince, biotechnology, biochemistry. 1999. V.63. №3. P.560-562.

254. Kourkoutas Y., Komaitis M., Koutinas A., Kanellaki V. Wine production using yeast immobilized on apple pieces at low and room temperature // Journal of agricultural and food chemistry. 2003. № 49. P. 1417-1425.

255. Kourkoutas Y., Kantllaki M., Koutinas A., Marchant R. Storage of immobilized yeasts cells fopr use in wine-making at ambient temperature //Journal of agricultural and food chemistry.2003. № 51. P.654-658.

256. Kourkoutas Y., Bekatorou A., Banat I., Routinas A. Immobilization technologies and support materials suitable in alcoholic beverages production: a review // Food Microbiology.2004. V.21. P.377-397.

257. Köwerich N., Bauer H., Bach H. Temperatur und Hefe wahrend der Sekt-Lagerzeit // Der Deutsche Weinbau. 1995. №21. S. 21-25.

258. Krallish I.L., Damberga B.E., Beker M.J. State of adenosine phosphates during dehydration of yeast // Applied microbiology and biotechnology. 1989. V.31. P. 194-199.

259. Krasny S., Malik F., Minarik E. Einsatz immobilisierter Zellen in der Weinbereitung. Verwendung immobilisierter Hefen bei der sekundären Garung // Die Wein-Wissenschaft. 1992. Bd.47. S. 53-55.

260. Krasny S., Malik F., Tiko P. Rast vinnych kvasinek imobilizovanych v alginatovom geli // Vinohrad. 2000. №5. S. 100-101.

261. Krasny S., Malik F., Tiko P. Imobilizovane kvasinky v primarnej fermentacii mustu // Vinohrad. 2000. №5. S.l 16-117.

262. Kreuz R. Die industrielle Herstellung von Trocken Reinzuchthefen fur die Weinbereitung // Der Deutsche Weinbau. 1991. Bd.46. №20. S. 785-787.

263. Kyselakova M, Veverka J. Controlled-temperature fermentation of grape must by active dry wine yeasts // Zahradnictvi. 2000. V.27. №1. P. 17-21.

264. Lallement A. Les levures incluses pour la prise de mousse // Revue oenologie technical vitivinia et oenologues. 1990. №58. P.29-31.

265. Lang X., Hill G., Macdonald D. Recycle bioreactor for bioethanol production from wheat starch I. Cold enzyme hydrolysis // Energy Sources. 2001. V.23. P.417-425.

266. Lang X., Macdonald D., Hill G. Recycle bioreactor for bioethanol production from wheat starch II. Fermentation and economics // Energy Sources. 2001. V.23. P.427-436.

267. Larsen M., Poll L. Odour thresholds of some important aroma compounds in raspberries // Zeitschrift Lebensmittel Untersuchungen und Forschungen. 1990. V. 191. №2. P. 129-131.

268. Larsen M, Poll L., Callesen O., Lewis M. Relations between the content of aroma compounds and the sensory evaluation of 10 raspberry Varieties (Rubus idaeus L) // Acta agriculture scandinavika. 1991. V.41. № 4. P. 447-454.

269. Laskowska J.; Czyzycki A.; Wlodarczyk M. Witamina C w procesie otrzymywania win z czanej porzecki // Przemysl fermentacyiny i owocowo-warzywny. 2001. T.45. № 4. S. 12-14.

270. Latrasse A., Rigaud J., Sarris J. L'Arôme du cassis (Ribes nigrum) odeur principale et notes secondaries // Science Alimentana. 1982. V.2. P. 145-162.

271. Leguerinel I, Mafrat P., Cleret J., Bourgeois C. Yeast strain and kinetic aspects of the formation of flavour components in cider // Journal of the institute of brewing. 1989. V.95. №6. P.405-409.

272. Lehmann H. Die Aroniabeere und ihre Verarbeitung // Flussiges Obst. 1990. B.57. № U.S. 746-752.

273. Leino M., Kallio H. Volatile compounds of blackcurrant juice and wine // Zeitschrift fur Lebensmitteluntersuchung und Forschung. 1993. V.196. P.410-414.

274. Li X. The use of chitosan to increase the stability of calcium alginate beads with entrapped yeast cells // Biotechnology and Applied Biochemistry. 1996. V.23. P. 269-272.

275. Lian W., Hsiao H., Chou C. Survival of bifidobacteria after spray-drying // International Journal of Food Microbiology. 2002. V.74. №1/2. P. 79-86.

276. Liu S.Q., Pilone G.J. An overview of formation and roles of acetaldehyde in winemaking with emphasis on microbiological implication // International journal of food science and technology. 2000. V.35. №1. P.49-61.

277. Loureiro V. Portuguese contribution on immobilized yeast cells for sparkling wine production // Industrie delle Bevande. 1990. V.19. №6. P.501-503, 506.

278. Lozinsky V.L, Plieva F.M. Poly (vinyl alcohol) cryogels employed as matrices for cell immobilization. 3. Overview of recent research and developments // Enzyme and microbial technology. 1998. V.23. P. 227-242.

279. Luna-Solano G., Saigado-Cervantes M., Garcia-Alvarado M., Rodriguez-Jimenes G. Improved viability of spray-dried brewers yeast by using starch (grits) and maltodextrin as processing aids // Journal of food process engineering. 2000. V.23. P.453-462.

280. Malik F., Smogrovicova D., Halama D., Pach L. Charakterisierung der Eigenschaften immobilisierter Weinhefen. 2. Untersuchungen zur Respiration immobilisierter Zellen // Mitteilungen Klosterneuburg. 1991. Bd.40. S. 209- 212.

281. Malik F., Pach L., Halama D., Vollek O., Pach L. Charakterisierung der Eigenschaften immobilisierten Weinhefen. Technologische Eigenschaften immobilisier Hefe // Mitteilungen Klosterneuburg. 1991. Bd. 41. S. 11-13.

282. Mallouchos A., Komaitis M., Kourkoutas Y., Kanellaki M. Evolution of volatile byproducts during wine fermentations using immobilized cells on grape skins // Journal of agricultural and food chemistry. 2003. №51. P.2402-2408.

283. Mallouchos A., Skandamis P., Loukatos P., Komaitis M., Koutinas A., Kanellaki M. Volatile compounds of wines produced by cells immobilized on grape skins // Journal of agricultural and food chemistry. 2003. №.51. P.3060-3066.

284. Mangas J.J., Rodriguez R., Suarez B., Picinelli A., Dapena E. Study of the phenolic profile of cider apple cultivars at maturity by multivariate techniques // Journal of agricultural and food chemistry. 1999. V.47. №10. P.4046-4052.

285. Masnef I., Hansen J., Groth C, Piskur J., Dubourdieu D. New hybrids between Saccharomyces Sensu Stricto yeast species found among wine and cider production strains // Applied and environmental microbiology. 1998. V.64. №10. P.3887-3892.

286. Miecznikowski A., Zielinski K. Wpiyw gestosci zacierow gorzelniczych na jakosce spirytusu surowego (2) // Przemysl fermentacyjny I owocowo-warzywny. 1997. V.6. P.25-27.

287. Michel A., Bizeau C, Drilleau J. Relation's metaboluques entre levure impliquees dans la fermentation du cidre // Belgian journal of food chemistry and biotechnology. 1990. V.45. №3. P. 98-104.

288. Mihaylova G., Ayazov A. An investigation of the effect of aroma-forming yeasts and enzymatic preparations with aview of strengthening the aroma of white wine // Bulgarian journal of agricultural science. 1997. V.3. №3. P.247-254.

289. Millard P., Roth B., Thi H., Yue S., Haugland R. Development of the FUN-1 family of fluorescent vacuole labeling and viability testing of yeasts // Applied and environmental microbiology. 1997. V.63. №7. P. 2897-2905.

290. Millies K.D. Schaumweinherstellung nach der "Methode Champenoise" mit Hilfe von immobilisierten Hefen // Getränkeindustrie. 1991. №4. S. 78-83.

291. Millies K.D. Versuche mit immobilisierten Hefen // Die Weinwirtschaft Technologie. 1991. Bd.37. №2. S. 18-22.

292. Modi D.R., Garg S.K., John B.N. Comparative behaviour of yeast strains for ethanolic fermentation of culled apple juice // Indian journal of experimental biology. 1998. V.36. №7. P. 728-731.

293. Morata A., Gomez-Cordoves M.C., Suberviola J., Bartolome B., Colomo B., Suarez J.A. Adsorption of antocyanins by yeast cell walls during the fermentation of red wines // Journal of agricultural and food chemistry. 2003. V.51. №11. P.4084-4088.

294. Mustafa A., McKinnon J., Christensen D. Chemical characterization and in situnutrient degrability of wet distillers grains derived from barley-based ethanol production //Animal feed science and technology. 2000. Y.83. P.301-311.

295. Narendranath N., Thomas K., Ingledew W. Urea hydrogen peroxyde reduces the numbers of Lactobacilli, nourishes yeast and leaves no residues in the ethanol fermentation // Applied and environmental microbiology. 2000. V.66. №10. P.4187- 4192.

296. Naumov G.I., Naumova E.S., Azbukina Z.M., Korhola M., Gallardin C. Genetic and karyotypic identification of Saccharomyces yeasts from Far East Asia // Crypt. Mycology. 1993. V.14. P.85-90.

297. Naumov G.I. Genetic identification of biological species in the Saccharomyces sensu stricto complex // Journal of industrial microbiology. 1996. V.17. P. 295-302.

298. Naumov G.I., Naumova E.S., Sniegowski P.D. Differentiation of European and Far East Asian populations of Saccharomyces paradoxus by allozyme analysis // International journal of systematic bacteriology. 1997. V.47. P. 341-344.

299. Naumov G.I., Naumova E.S., Sniegowski P.D. Saccharomyces paradoxus and Saccharomyces cerevisiae are associated with exudates of North American // Canadian journal of microbiology. 1998. V.44. P. 1045-1050.

300. Naumov G.I., Masneuf I., Naumova E.S., Aigle M., Dubordieu D. Association of Saccharomyces bayanus var. Uvarum with some french wines: genetic analysis of yeast populations //Researches of Microbiology. 2000. V.151. №8. P. 683-691.

301. Naumov G.I., Naumova E.S., Aigle M., Masneuf I., Belarbi A. Genetic reidentification of the pectinolytic yeast strains SCPP as a Saccharomyces bayanus var. uvarum // Applied microbiology and biotechnology. 2001. V.55. P. 108-111.

302. Naumov G.I., Nguyen H.V., Naumova E.S., Michel A., Aigle M., Gaillardin C. Genetic identification of Saccharomyces bayanus var. uvarum a cider fermenting yeast // International journal of food microbiology. 2001. V.65. P.163-171.

303. Naumova E.S., Naumov G.I., Molina F.I. Genetic variation among European strains of Saccharomyces paradoxus: results from DNA fingerprinting // Systematic and applied microbiology. 2000. V.23. P.86-92.

304. Naumova E.S., Korshunova I.V., Jespersen L., Naumov G.I. Molecular genetic identification of Saccharomyces sensu stricto strains from African sorghum beer // FEMS yeast research. 2003. V.3. P.177-184.

305. Nguyen H.V., Caggia C, Giudia P., Rainieri S., Zambonelli C. Saccharomyce uvarum, a proper species within Saccharomyces sensu stricto // FEMS microbiology letter. 2000. V.192. P. 191-196.

306. Nishinary K., Watase M., Williams P., Phillips G. Agarose gels: effects of sucrose, glucose, urea, and guanidine hydrochloride on the rheological and thermal properties// Food chemistry, 1990. V.38. P. 1181-1187.

307. Nishinary K., Watase M., Williams P., Phillips G. K-Carrageenan gels: effects of sucrose, glucose, urea, and guanidine bydrochlmide on the rheoiogioal and thermal properties // Food Chemistry, 1990. V.38. P. 1188-1193.

308. Norton S., D'Amore T. Physiological effects cell immobilization: applications for brewing // Enzyme microbiology and technology. 1994. V.16. P. 365-375.

309. Norton S., Vuillemard J. Food bioconversions and metabolite production using immobilized cell technology // Critical reviews in biotechnology. 1994. V.14. №2. P. 193-224.

310. Novak J., Cazrneki Z., Kaminski E. Bacterial and yeast by products in ethanol fermentation of glucose mtdium and rye mashes // Polish journal of food and nutrition sciences. 2000. V.9/50. №4. P.49-51.

311. O'Reilly A., Scott J. Use of ion-exchange sponge to immobilize yeast in high gravity apple based (cider) alcoholic fermentations // Biotechnology letters. 1993. V.15. №10. P. 1061-1066.

312. Panek A.D., Panek A.C. Metabolism and thermotolerance function of trehalose in Saccharomyces: a current perspective // Journal of biotechnology. 1990. V.14. P. 229-238.

313. Paterczyk J., Trzcinska M., Sieliwanowicz B. Changes in cell numbers and the ATP content in immobilized yeast cells during the continuous ethanol fermentation // Polish journal of food and nutrition sciences. 1992. V.l/42. №4. P.29-36.

314. Pawlak J. Kodeks praktyki i prgasizacja winiarstwa owocowego w Unii Europejskiej // Przemysi fermentacyiny i owocowo-warzywny. 2000. T.44. № 9. S.26-27.

315. Perez-Torrado R., Gimeno-Alcaniz J., Matallana E. Wine yeast strains engineered for glycogen overproduction display enljahced viability under glucose deprivation conditions // Applied and environmental microbiology. 2002. V.8. №7. P.3339-3344.

316. Picinelli A., Suarez B., Garcia L., Mangas J. Changes in phenolic contents during sparkling apple winemaking // American journal of enology and viticulture. 2000. V.51. №2. P. 144-149.

317. Pieper H., Bruchmann E., Kplb E. Technologie der Obstbrennerei.Stuttgart.: Ulmer. 1993. 415 S.

318. Pinhero R., Paliyath G. Antioxidant and calmodulin-inhibitory activities of phenolic components in fruit wines and its biotechnological implication // Food biotechnology. 2001. V.15. №3. P. 179-192.

319. Pisanelle A., Favati F., Crapisi A., Borin G., Spettoli E. The free amino acid content of bottle fermented Moskato Bianko sparkling wine by immobilized easts // Yeast. 1989. V.5. P.113-116.

320. Plesofsky-Vig N. The heat shock proteins and the stress response // In The Mycota. V.3. Biochemistry and molecular biology. Eds. Brambl. Marzluf. Berlin etc. Springer. 1996. P. 171189.

321. Plocharski W. Die Apfelbeere (Aronia melanocarpa, Elliot) als naturliche Rohmaterialquelle fur Anthocyan-Farbstoffe // Flussiges Obst. 1992. B.59. № 6. S.354-358.

322. Podgorska E., Udeh K.O. Analiza skladu cukrow i kwasow organicznyc w sokach i koncentratach jablkowych w roznych okresach kampanii przerobowej // Przemysl fermentacyiny i owocowo-warzywny. 2000. T.44. №3. S. 36-38.

323. Pogorzelski E., Koch M., Fajkowski J. Stymulatory fermentacji alkoholowej z osadowych drozdzy winiarskich // Przemys fermentacyiny i owocowo-warzywny. 2000. T.44. №1. S. 32-34.

324. Poirier I., Marechal P., Richard S., Gervais P. Saccharomyces cerevisiae viability is strongly dependant on rehydration kinetics and the temperature of dried cells // Journal of applied microbiology. 1999. V. 86. P. 87-92.

325. Prevost U., Cachon R., Cavin J.F., Divies Ch. Les microorganisms immobilises et 1'industrie alimentaire // Biofutur. 1994. №3. P. 42-45.

326. Quetsch K. Immobilisierte Biokatalysatoren fur die traditionelle Sektherstellung//Der Deutsche Weinbau. 1989. Bd.44. S. 1215-1219.

327. Quetsch K. Immobilisierte Biokatalysatoren for die traditionelle Sektherstellung // Der Deutsche Weinbau. 1990. Bd.45. S. 465-469.

328. Ramon-Portugal F., Strehaiano P., Silva S., Teixeire F. Enological applications of dry immobilized yeasts // X International Simposium on Yeasts 27August -1 September 2000. Arnhem. The Netherlands. P.367-368.

329. Ramon-Portugal F., Silva S., Taillander P., Strehaiano P. Immobilized yeasts: actual oenologic utilization / Wine internet technical journal 2003.

330. Razmkhab S., Lopez-Toledano A., Ortega J., Mayen M., Medina M. Adsortion of phenolic compounds and browning products in white wines by yeasts and their cell walls // Journal of Agricultural and food chemistry. 2002. V.50. №25. P.7432-7437.

331. Renner W. Extrakthefen. Ein Vergleich mit herkömmlichen Weinhefen // Der Winzer. 1997. №9. S. 31-33.

332. Roemer K. Das Zuckermuster verschiedener Obstarten. T. 3. Ribes-Arten (Ribes rubrum, R. nigrum, R. grossularia u.a.) Johannisbeeren und Stachelbeeren // Erwerbsobstbau. 1990. B. 32. №1. S. 7-12.

333. Rommel A., Wrolstad R.E. Composition of flavonols in red raspberry juice as influenced by cultivar, processing and environmental factors // Journal of agricultural and food chemistry. 1993. V.41. №11. P.1941-1950.

334. Rommel A., Wrolstad R.E. Ellagic acid content in red raspberry juice as influenced by cultivar, processing and environmental factors // Journal of agricultural and food chemistry. 1993. V.41. №11. P. 1951-1960.

335. Rommel A., Wrolstad R.E. Influence of acid and base hydrolysis on the phenolic composition of red raspberry juice // Journal of agricultural and food chemistry. 1993. V.41. №8. P.1237-1241.

336. Rosa J., Krugly G. Proby wykorzystania owocow aronii w produkcji czerwonych win owocowych // Przemysl fermentacyiny i owocowo-warzywny. 1987. T. 31. №7. S.25-26.

337. Salih A., Drilleau J., Cavin F., Divies C, Bourgeois C. A servey of microbiological aspects of cider making // Journal of the institute of brewing. 1998. V.94. P. 5-8.

338. Schols H.A., Veld P.H., van Deelen W., Voragen A.G. The effect of manufacturing method on the characteristics of apple juice // Zeitschrift fur die Lebensmittel Untersuchungen und Forschung. 1991. V.192. №2. S.14-148.

339. Skrede G., Wrolstad R.E., Durst R.W. Changes in antocyanins and polyphenolics during juice processing of highbüsh blueberries (Vaccinium corymbosum L.) // Journal of food science. 2000. Vol.65. №2. P.357-364.

340. Smith G., Van Ende H., Klis F. Differential regulation of cell wall biogenesis during, growth and development in yeast // Microbiology. 2001. V.147. P.787-794.

341. Smith M.A., Marley K.A., Seigier D., Singletary K.W., Meline B. Bioactive properties of wild blueberry fruits // Journal of food science. 2000. Vol. 65. №2. P.352-356.

342. Tcorbanov B., Mitchev G., Lazarova G., Popov D. Studies on the secondary fermentation of low-alcohol sparkling apple wine // American journal of enology and viticulture. 1993. V.44. №1. P. 93-98.

343. Thevelein J. Regulation of trehalose metabolism and its relevance to cell growth and function // In The Mycota. V.3. Biochemistry and Molecular Biology. Eds. Brambl. Marzluf. Berlin etc. Springer. 1996. P. 395-420.

344. Thomas K., Hynes S., Ingledev W. Effects of particulate materials and osmoprotectants on very-high-gravity ethanolic fermentation by Sacchromyces cerevisiae // Applied and environmental microbiology. 1994. V.60. №5. P.1519-1524.

345. Totsuka A., Takashima K., Nishioko Y., Takanishi T. Removal of sulphur compounds from wine by immobilized yeasts // American journal of enology and viticulture. 1990. Vol. 41. №2. P.188.

346. Trioli G., Fumi M.D., Dallavalle L. Trattamente del lievito immobilizato in alginato per la produzione dello spumante,classico // Industrie delle Bevande, 1990. V.19. P. 478-480.

347. Tuszynski T, Effect of metal ions on the selected characteristics of bakers yeast Saccharomyces cerevisiae // Polish journal of food and nutrition sciences. 2001. V. 10/51. №2. P. 11-18.

348. Vacca V., Leccis L., Fenu P., Pretti L., Farris A. Wine yeasts and resveratrol content // Biotechnology Letters. 1997. V.19. №6. P.497-498.

349. Valente P., Gouveia F.C., Lemos de G.A., Pimentel D., Elsas van J.D., Mendonca-Hagler L.C., Hagler A.N. PCR amplification for differentiation of Saccharomyces cultures // FEMS microbiology letter. 1996. V.137. P.253-256.

350. Van den Berg S., Demeyere K., Van Landschoot A. The use of dried brewing yeast for the bottle refermentation of beer // X International symposium on Yeasts. Rising power of yeast. 27 August 1 September 2000, Arnhem, Netherlands. P. 232-233.

351. Van Dijck P., Colavizza D., Smet P., Thevelein J. Differential importance of trehalose in stress resistance in fermenting and non-fermenting Saccharomyces cerevisiae cells // Applied and environmental microbiology. 1995. Vol.61. №1. P.109-115.

352. Vannini L., De Simone G., Norscia P., Romano P., Suzzi G. La produzione di acetaldeide come carattere di selezione in Saccharomyces cerevisia // Industrie delle Bevande. 1994. V.23. №5. P.414-417.

353. Vaughan-Martini A., Martini A., Saccharomyces Meyen ex Rees. In: The Yeasts. A taxonomic study. Ed.by Kurtzman C.P.& Fell J.W. 1998. P. 358-371.

354. Viola R., Brennan R.M., Davies H.V., Sommerville L. L-ascorbic acid accumulation in berries of Ribes nigrum L. // Journal of horticulture science biotechnology. 2000. V.75. №4. P. 409-412.

355. Vuorinen H.; Maatta K.; Torronen R. Content of the flavonols myricetin, quercetin, and kaempferol in Finnish berry wines // Journal of agricultural and food chemistry. 2000. V.48. № 7. P. 2675-2680.

356. Wang L., Xu Y., Zhao G., Li J. Rapid analysis of flavor volatiles in apple wine using headspace solid-phase microextraction // Journal of institute of brewing. 2004. V.110. №1. P.57-65.

357. Will F., Rechner A., Dietrich H. Phenolische Inhaltsstoffe und ihre antioxidative Wirkung in Fruchtweinen// Getranke-Industrie. 1999. Bd.53. № U.S.92-98.

358. Williner M.R., Pirovani M.E., Guermes D.R. Ellagic acid content in strawberries of different cultivars and ripening stages // Journal of scince of food and agricultural. 2003. V.83. №5. P.842-845.

359. Wzorek W., Bugajewska A., Bonin S., Mateusiak S. Badania nad ciagla fermentacja winiarska z wykorzystaniem drozdzy immobilizowanych na szkle piankowym // Przemysl fermentacyjny i owocowo-warzywny. 2000. T.44. №6. S.14-17.

360. Yokotsuka K., Otaki A., Naitoh A., Tanaka H. Controlled simultaneous deacidification and alcohol fermentation of a high-acid grape must using two immobilized yeasts,

361. Schizosaccharomyces pombe and Saecharomyces cerevisiae // American journal of enology and viticulture. 1993. V.44. №4. P. 371-377.

362. Yokotsuka K., Yajima M., Matsudo T. Production of bottle-fermented sparking wine using yeast immobilized in double-layer gel beads or strands // American journal of enology and viticulture. 1997. V.48. №.4. P.471- 481.

363. Zamorani A., Crasipi A., Borin G., Dell Eva M., Versini G., Spettoli P. The use of immobilized yeast in bottle fermented Moscato bianco sparkling wine // Yeast. 1989. V.5. №2. P. 63-68.

364. Zerajic S., Kuzmanova S., Vandeska E. Physical studies of yeast cell immobilization in two-layer calcium alginate gel beads. I. Mechanical characteristics // Department of food technology and biotechnology. 1990. V.39. №9. P.415-420.

365. Zerajic S., Kuzmanova S., Vandeska E.s Poposka F. Physical studies of yeast cell immobilization in two-layer calcium alginate gel beads. II. Diffusion characteristics // Department of food technology and biotechnology. 1990. V.39. №9. P.421-428.

366. Авторские свидетельства и патенты.

367. Дерканосов Н.И. Способ выращивания спиртовых дрожжей // А.с. СССР № 602542. С 12 N1/16. 1978. БИ №14.

368. Мавлани М.В., Гулямова Н.Х., Кадыров Ф.М., Максудов А.С. Штамм дрожжей Уз-Яс-1, используемый для сбраживания яблочного сока // Авторское свидетельство СССР. № 661015. 1977. БИ№ 17.

369. Мавлани М.В., Гулямова Н.Х., Кадыров Ф.М., Рахматуллаев Х.Р. Штамм дрожжей Уз-Яс-158, используемый для сбраживания яблочного сока при 30-32°С // Авторское свидетельство СССР. № 661016. 1977. БИ № 17.

370. Мосиашвили Г.А., Вашакмадзе Н.С., Мумладзе Л.М., Чхенкели Э.Н. Штамм дрожжей Saccharomyces vini раса Яблоко №1, используемый для получения плодово-ягодных вин // Авторское свидетельство СССР № 636261. 1978. C12N 1/16. БИ№ 45. 1978.

371. Науменко О., Головченко В., Янчевский В., Рудая В. Способ производства активных сушеных дрожжей //Авторское свидетельство СССР № 1751198. С 12 N1/18. 1992. БИ№28.

372. Олийничук С., Гончар С., Коваленко А., Левандовский Л., Шевченко В. Способ непрерывного культивирования засевных дрожжей при производстве спирта и хлебопекарных дрожжей // Авторское свидетельство СССР №1521766. С12 N1/18. 1989.

373. Орлова В., Орлова Е., Уваров Л., Евстигнеев А. Способ получения пищевых дрожжей рода Сахаромицетов // Патент РФ №2128702. С 12 №1/16. 1999. БИ №10.

374. Прида И.А., Узун Д., Прида Г., Лошак П., Деордица В. Способ ремюажа при производстве игристых вин. Авторское свидетельство СССР №1373726, С12 G 1/06, 1988. Б.И. №6.

375. Разуваев В., Валуйко Г., Саркисян А., Бурьян Н. Способ получения активных сухих дрожжей // Авторское свидетельство СССР №1346673. C12N1/00.198. БИ № 39.

376. Разуваев В., Саркисян А., Меледина Т. Способ производства сухих дрожжей// Авторское свидетельство СССР №1437391. С 12 N1/18. 1988. БИ №42418.

377. Скрыпник В.В., Николаевский В.А., Карлини Д.Я., Лиелпитере А.Я., Якобсон Ю.О. Штамм винных дрожжей Умань 8/16 — продуцент этилового спирта // Авторское свидетельство СССР №1254003.1986. БИ №32.

378. Субботин К., Цельнер М., Андреев А., Ащуулов С., Мискилев В. Способ производства пищевых дрожжей // Авторское свидетельство СССР № 1713928. С. 12 № 1/18. 1992. БИ № 7.

379. Фисейский В.Н. Способ производства шампанского // Авторское свидетельство СССР №67604, C12G1/06,1946.

380. Шакарова Ф.И., Федосцева Н.В. Штамм дрожжей Saccharomyces vini, используемый для производства.Советского Шампанского // Авторское свидетельство СССР. №1460076. 1989. C12G1/06. БИ№7. 1989.

381. Bidan P., Divies Ch., Dupuy P. Precede perfection de preparation de vins mousseux // Патент Франции № 2432045, С 12. G 1/06/1980.'

382. Charpentier M. Dehydrated polysaccharide gel containing microorganisms, a sugar and a polyol for producing fermented drinks // Патент США № 6033887, C12 N11/10, 2000.

383. Divies Ch., Lenzi P:, Beaujeu J., Herault F. Process of producing a dehydrated polysaccharide gel containing microorganisms for preparing fermented drinks // Патент США №5389532. C12 N11/10. 1995.

384. Ferrarini R. Semiautomatic apparatus for rehydration of yeasts and process for the rehydration thereof//European Patent Application. ЕР 1167514A1. C12M 1/26. 2002.

385. Grylls F., Rennie S., Kelly M. Processes, and apparatus for producing active dried yeast // Патент EPB №4081558. 426-62. 1978.

386. Grylls F., Rennie S., Kelly M. Processes for producing active dried yeast // Патент США №4188407. 426-62. 1980.

387. Hill F. Verfahren zur Herstellung immobilisierten Hefen fur die Sektgarung // Патент Германии № 3908997. C12 Gl/06. 1990.

388. Clein J. Vorlop K.D., Steinert HJ. Biokatalysator und Verfahren zu seiner Herstellung//Патент EPB №0173915. C12 N11/04. 1992.

389. Langejan A., Khoudokormoff B. Active dried baker's yeast // Патент США №4341871.435256. 1982.

390. Langejan A., Khoudokormoff B. High protein active dried baker's yeast // Патент США №3993783.426-18. 1976.427. Langejan A. Preparation of active dried baker's yeast // Патент США №3843800. 426-18. 1974.

391. Plomp P. Bakers yeast and a method producing it // Патент США №5916609. 426-62. 1999.

392. Pomper S., Cole G., Davis J. Active dried yeast // Патент США №4797365. 435-256. 1989.

393. Pomper S., Cole G., Scheinbach S. Rehydratable instant active dried yeast // Патент США №4764472.435-256. 1988.

394. Pomper S., Conn S., Arkerman E. Active dry yeast containing a sucrose diester // Патент США №3410693. 426-62. 1968.

395. Pomper S., Conn S., Arkerman E. Preparation of active dry yeast // Патент США №3448010. 195-74. 1969.

396. Raymond D. Active dried yeast composition // Патент США №3959494. 426-428. 1976.

397. Taylor R. Preparation of active dry yeast// Патент США №3885049 426.18. 1975.

398. Winfried H. Active Trockenhefe. Verfahrezun ihrer Herstellung // Патент Германии №2515029. С 12 С 11/32. 19.

Информация о работе

Мартыненко, Николай Николаевич
доктора биологических наук
Щёлково, 2009
ВАК 03.00.23

Диссертация

Биотехнологические основы высокоэффективных препаративных форм дрожжей рода Saccharomyces - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы