Эволюционная генетика α-галактозидаз и β-фруктозидаз дрожжей рода Saccharomyces

Коршунова, Ирина Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Эволюционная генетика α-галактозидаз и β-фруктозидаз дрожжей рода Saccharomyces
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Эволюционная генетика α-галактозидаз и β-фруктозидаз дрожжей рода Saccharomyces"

На правах рукописи

Коршунова Ирина Викторовна

Эволюционная генетика а-галактозидаз и 0-фруктозидаз дрожжей рода Засскаготусез

Специальность 03.00.15 - Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 2005

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики, таксономии и экологии дрожжей (заведующий лабораторией, доктор биологических наук, профессор Г.И. Наумов) Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ФГУП ГосНИИ Генетика), г. Москва.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник Е.С. Наумова. Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, член-корр. РАН И.А. Захаров.

кандидат биологических наук, заведующий лабораторией биотехнологии

дрожжей ФГУП ГосНИИ Генетика C.B. Беневоленский.

Ведущая организация: кафедра молекулярной биологии

биологического факультета Московского Государственного Университета им.

М.В. Ломоносова.

Защита состоится «25» октября 2005г. в 1400 часов на заседании Диссертационного совета Д217.013.01 в ФГУП ГосНИИ Генетика по адресу: 117545, г. Москва, 1-й Дорожный проезд, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГУП ГосНИИ Генетика.

Автореферат разослан «/$>> 2005г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат биологических наук Щербакова В.И.

2ûOé- » /i93f

P/f/P&Y

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae стали первым эукариотическим организмом, геном которого был полностью секвенирован (GofFeau et al., 1996). К настоящему времени в компьютерных базах данных имеются полные последовательности геномов видов S. bayanus, S. paradoxus, S. mikatae и S. kudriavzevii. Однако в проектах по секвенированию полных геномов были использованы генетические линии одного происхождения, у которых могут отсутствовать многие ядерные и цитоплазматические детерминанты и, следовательно, информация, полученная таким путем, имеет ограниченный характер. Кроме того, известен значительный полиморфизм размеров хромосом, особенно у культурных штаммов дрожжей-сахаромицетов, свидетельствующий о больших вставках и делециях генетического материала. Изучая природное разнообразие дрожжей и, в частности, генетический полиморфизм биохимических и физиологических признаков у природных и промышленных штаммов, можно получать ценную информацию о разных уровнях организации генетического материала.

Сравнительный анализ геномов дрожжей S. cerevisiae, S. bayanus, S. paradoxus и S. mikatae показал, что наиболее изменчивы теломерные районы хромосом (Kellis et al., 2003), содержащие гены ряда мультигенных семейств. К их числу относятся полимерные гены ферментации различных Сахаров: мальтозы (MAL), мелибиозы (MEL), сахарозы (SUC) и другие (Carlson, Botstein, 1983; Charron et al., 1989; Naumov et al., 1995).

Цель и задачи исследования. Цель работы - изучение молекулярного полиморфизма и эволюции а-галактозидазных и p-фруктозидазных генов дрожжей рода Saccharomyces. В связи с этим решались следующие основные задачи:

- Скрининг штаммов дрожжей Saccharomyces различного происхождения с целью обнаружения новых полимерных генов ферментации мелибиозы и сахарозы, а также их псевдогенов;

- Определение нуклеотидной последовательности гена SUC дрожжей S. cariocanus и сравнение всех известных (3-фруктозидаз дрожжей Saccharomyces;

- Идентификация новых а-галактозидазных генов и определение их

хромосомной локализации;

- Определение нуклеотидных последовательностей новых активных генов MEL и псевдогенов mef для изучения молекулярной эволюции теломерных районов дрожжевых хромосом;

- Сравнительный анализ последовательностей а-галактозидаз дрожжей и выявление их эволюционного родства.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые определена нуклеотидная последовательность p-фруктозидазного гена дрожжей S. cariocanus и проведен сравнительный анализ всех известных р-фруктозидаз дрожжей Saccharomyces. Показана их высокая консервативность. Скрининг штаммов Saccharomyces, изолированных в разных регионах мира, позволил обнаружить два новых активных гена MEL и семь псевдогенов («молчащие» гены). Генетические линии эндемичных МеГ-штаммов S. cerevisiae могут быть использованы в фундаментальных исследованиях и селекционных программах с дрожжами-сахаромицетами. Клонированы и секвенированы а-галактозидазные гены у типовых культур вида S. bayanus и гибридного таксона S. pastorianus, два активных дивергентных гена MEL и три псевдогена mef у дрожжей S. cerevisiae, а также псевдоген mef у гибридного штамма ГСЧ-11. Филогенетический анализ показал, что а-галактозидазный ген гибридных пивных дрожжей S. pastorianus происходит от вида S. bayanus, а не от S. cerevisiae. Обнаружено, что эволюция а-галактозидазных и (З-фруктозидазных генов у дрожжей Saccharomyces шла неодинаково. Р-Фруктозидазные гены коэволюционировали с рибосомальной ДНК, тогда как а-галактозидазные гены подвергались горизонтальному переносу между отдельными видами.

Апробация работы. Основные положения работы были представлены на 21-м Международном Специализированном Симпозиуме по Дрожжам «Биохимия, Генетика, Биотехнология и Экология Непромышленных Дрожжей» (2001, Львов, Украина); 20-й Международной Конференции по Генетике и Молекулярной Биологии Дрожжей (2001, Прага, Чехия); 22-м Международном Специализированном Симпозиуме по Дрожжам (2002, Южная Африка); 1-м Международном Конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (2002, Москва) и на 30-м конгрессе FEBS (2005, Будапешт, Венгрия).

Публикации. По'теме диссертации опубликовано 4 статьи и 5 тезисов.

Объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, материалы и методы, экспериментальную часть и обсуждение, заключение и выводы. Материалы диссертации изложены на 143 страницах машинописного текста, содержат 18 рисунков и 4 таблицы. Список литературы включает 265 источников, в том числе 232 на иностранных языках.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. В работе было изучено более 60 штаммов дрожжей Saccharomyces, изолированных в разных регионах мира из природных источников и ферментационных процессов. Для проведения генно-инженерных манипуляций использовался штамм Escherichia coli TGl(Martin et al, 1987).

Полимеразную цепную реакцию осуществляли на ДНК-амплификаторе "Терцик™". Для амплификации генов SUC использовали праймеры нашего дизайна, позволяющие амплифицировать продукт длиной около 1600 п.н.: SD1 -5'-ATGCTTTTGCAAGCTTTC-3 ' и SR-5'-GGTCATGTTCACAGATCC-3 '. Для амплификации генов MEL использовали праймеры: DM 1-5'-TTCGCAGATGGGTTGGGACAA-3 ' и DM2-5'-

TAAGCTTGCTGGAACAGTTGTGTT-3', позволяющие амплифицировать продукт длиной около 1300 п.н.. ПЦР проводили в 30 мкл буфера (NH4)2S04, содержащего 2.5 мМ MgCh, по 0.1 мМ каждого dNTP, по 50 пмоль каждого праймера, 2.5 единицы Гад-полимеразы ("Синтол", Россия), 20-200 нг ДНК. Начальную денатурацию проводили при 94°С в течение 3 мин., затем 30 циклов в следующем режиме: денатурация при 94°С - 30 сек., отжиг праймеров при 56°С - 30 сек., синтез ДНК при 72°С - 60 сек., конечная достройка - 72°С, 10 мин.

Клонирование и секвенирование ПЦР-продуктов. Амплифицированный фрагмент ДНК нужного размера вырезали из агарозного геля в проходящем ультрафиолетовом свете. ПЦР-продукты элюировали из геля при помощи набора "GeneClean kit", согласно протоколу фирмы-изготовителя (Bio 101 Inc., США) и встраивали по тупым концам в вектор pTZ57R/T, линеаризированный по сайту Есо321 (изошизомер Eco RV). Трансформацию компетентных клеток Е. coli TGI проводили с использованием набора «InsT/Aclone™ PCR Product Cloning Kit" согласно протоколу фирмы-изготовителя (MBI Fermentas, Литва). Трансформанты со вставкой отбирали на агаризованной LB среде, содержащей 100 мкг/мл ампицилина, субстрат X-gal и индуктор IPTG. Последующее

субклонирование фрагментов ДНК проводили в векторе pUC19. Плазмидную ДНК из клеток Е. coli выделяли щелочным методом (Молекулярная клиническая диагностика, 1999). Нуклеотидные последовательности по двум цепям определяли секвенированием по методу Сэнгера на автоматических секвенаторах ABI 373А ("Applied Biosystems") и Beckman-Coulter.

Пульс-электрофорез хромосомных ДНК и Саузерн-гибридизация хромосом дрожжей. Приготовление препаратов хромосомных ДНК и их электрофоретическое разделение на аппарате CHEF-DR II фирмы "Bio-Rad" (США) проводили согласно Naumov et al. (1990). Перенос хромосомных ДНК на нитроцеллюлозную мембрану осуществляли капиллярным способом. В качестве зондов использовали ПЦР-фрагменты генов SUC2, MELI или MEL12. Для мечения ДНК применяли нерадиоактивную метку с использованием UTP, меченного дигоксигенином (dig-11-dUTP) из набора "DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I" ("Roche", Германия). Гибридизацию и проявление гибридизационных сигналов также проводили по инструкции фирмы-изготовителя ("Roche").

Филогенетический анализ. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей осуществлялось вручную, с использованием программы BioEdit. Установление филогенетических родственных связей исследуемых белков разных видов дрожжей и построение филогенетических древ проводили с использованием программ SEQBOOT, PROTDIST, NEIGHBOR и CONSENSE из пакета PHYLIP 3.52 (Felsenstein, 1993).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Сравнительный генетический анализ ß-фруктозидаз дрожжей Saccharomyces

С целью обнаружения новых ß-фруктозидазных и а-галактозидазных генов, мы провели скрининг дрожжей Saccharomyces, выделенных из ферментационных процессов и природных источников в разных регионах мира. Обнаружена уникальная популяция дрожжей S. cerevisiae из туземного сортового пива в Западной Африке. Штаммы этой популяции характеризуются наличием делеции, размером в три нуклеотида, в ITS 1-районе рДНК, которая отсутствует у других штаммов S. cerevisiae. В отличие от европейских пивных дрожжей, все африканские штаммы обладают только одним ß-фруктозидазным

геном - SUC2 и не имеют последовательностей RTM (гены, контролирующие устойчивость к токсичным компонентам мелассы) (рис 1). Исключением является штамм CBS 403, изолированный в начале прошлого века в Западной Африке из безалкогольного имбирного напитка, который, помимо гена SUC2, содержит два теломерных гена - SUC1 и SUC3, связанных с последовательностями RTM (рис. 1, дорожка 4). В то же время, типовая культура S cerevisiae CBS 1171, выделенная в Европе из верхового пивоварения, имеет семь инвертазных генов. SUCl, SUC2, SUC3 и четыре еще неизвестных гена, локализованных в хромосомах XIV, XI, III и VI (рис 1, дорожка 2). Полученные результаты свидетельствуют о различном происхождении европейских и африканских пивных дрожжей.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28

VI SUCÍ —1

и sua xi sua -н

V SUC1-* Äife . .

lx SUCl —

hi sua —ы # vi sua -и

Рисунок 1. Саузерн-гибридизация хромосомных ДНК африканских штаммов S cerevmae, изолированных из сортового пива в Западной Африке с зондом SIIC2 Дорожки 1, 3 - YNN 295 (хромосомный стандарт); 2 - CBS 1171,4- CBS 403, 5 -А6, 6- А7, 7 - А10, 8- А12, 9-А15, 10-А19, 11 - А22, 12 - В5, 13 В7, 14-В 16, 15-В20, 16-В24, 17-Cl, 18-С4, 19-С6,20 - СЮ, 21 - С11, 22 - С19, 23-С24, 24 - Г>1, 25 - D3, 26 - D9, 27 - DI 1,28 - D12

До настоящего времени остается неизвестной нуклеотидная последовательность гена SUC дрожжей S. cariocanus. Ген SUC2 дрожжей S. cerevisiae был клонирован и секвенирован (Taussing, Carlson, 1983), а нуклеотидные последовательности генов SUC видов S. paradoxus, S kudriavzevu, S mikatae и S. bay anus имеются в международных компьютерных базах данных Мы секвенировали Р-фруктозидазный ген дрожжей S. cariocanus (SUCc) и провели сравнительный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей всех известных Р-фруктозидаз дрожжей-сахаромицетов. Анализ спектра нуклеотидных замен в инвертазных генах показал значительное

преобладание транзиций типа С-Т, преимущественно в третьем положении кодона, что не вызывает изменения аминокислотной последовательности белка.

Аминокислотные последовательности всех изученных инвертаз имеют высокий уровень идентичности - 90-97%. Наиболее дивергентной оказалась последовательность SUCb дрожжей S bayanus, обладающая 90-91 % гомологией с остальными Р-фруктозидазами дрожжей Saccharomyces. На основании анализа аминокислотных последовательностей инвертаз было построено филогенетическое древо (рис. 2), на котором все виды рода Saccharomyces образуют отдельный кластер относительно внешней группы, представленной Р-фруктозидазами Kluyveromyces marxianus (INU) и Pichia anómala (INV1).

100

.SUCb-£ bayanus

-SUCk-S.kudriavzevii

-SUCm-S. mikatae

-10

snc2e5. cerevisiae SUC2 S. cerevisiae

■ INUkl KL marxianus •INVlpich P. anómala

Рисунок 2.

Филогенетический анализ аминокислотных последовательностей р-фруктозидаз дрожжей

Saccharomyces

S. kudríavzevii IFO 1802

■S. mikatae IFO 1816

■S. cerevisiae NRRL Y-2034

'—

■S. paradoxus CBS 432

Рисунок 3. Филогенетический анализ нуклеотидных

S.bayanus CBS380

последовательностей районов ITS1 дрожжей Saccharomyces.

Внутри кластера выделяется подгруппа, включающая последовательности SUC2, suc2°, SUC1 и SUC4 дрожжей S. cerevisiae, SUCp (S. paradoxus) и SUCc (5. cariocanus). Последовательность SUCb занимает на древе наиболее отдаленное положение.

Мы сравнили полученные результаты с данными филогенетического анализа внутреннего транскрибируемого спейсера ITS1 рДНК (рис. 3). По последовательностям района ITS1 рДНК шесть видов Saccharomyces можно разделить на две группы. В первую входят S cerevisiae, S paradoxus, S cariocanus, S. mikatae и S. kudriavzevii, а во вторую - штаммы S. bayanus.

На обоих деревьях (рис. 2 и 3) виды S. cerevisiae, S. paradoxus и S. cariocanus попадают в одну группу, a S. bayanus образует отдельную ветвь, являясь наиболее дивергентным в роде Saccharomyces.

Рестриктазный анализ а-галактозидазных генов дрожжей Saccharomyces

Скрининг штаммов дрожжей Saccharomyces различного происхождения позволил обнаружить а-галактозидазные гены у 16 штаммов, девять из которых были способны сбраживать мелибиозу, а семь обладют фенотипом МеГ. ПЦР-амплифицированные фрагменты генов MEL, размером около 1300 п.н., были изучены с помощью ферментативного расщепления эндонуклеазами Hincll, Pstl и HindlTL. По рестриктазным профилям с тремя эндонуклеазами все анализируемые штаммы разделились на три группы (таблица 1).

К первой группе были отнесены штаммы, а-галактозидазные гены которых не отличаются по рестриктазным картам от гена MEL1 дрожжей 5. cerevisiae. Вторая группа включает в себя штаммы Ш-11/12, JI-80-4, ГСЧ-5, ГСЧ-8 и ГСЧ-11 и типовые культуры пивных дрожжей S bayanus и S pastorianus Внутри данной группы выделяется подгруппа, представленная штаммами ГСЧ-5, ГСЧ-8 и ГСЧ-11. ПЦР-амплифицированные гены MEL этих штаммов имеют один из двух Hincll-сайтов, свойственных а-галактозидазным генам S cerevisiae. Такой же рестриктазный профиль имеют гены MELx штамма CBS 1513 (типовая культура дрожжей S. carlsbergensis) и MELm штамма CBS 1503 (типовая культура S. monacensis). Третья группа представлена штаммом CBS 4734 и тремя дериватами штамма CBS 2888, обладающими генами MEL12, MEL13 и MEL14. Эти гены имеют только Psfl-сайт рестрикции, образуя фрагменты размером 250 и 1050 п.н. Ни в одну из выделенных нами групп не попал штамм

CBS 403, а-галактозидазный ген которого не резался ни одной из трех используемых эндонуклеаз.

Таблица 1. Рестриктазный анализ а-галактозидазных генов MEL.

Исследуемые штаммы дрожжей и гены MEL Фенотип Размеры рестриктазных фрагментов

Hincll Pstl Hindlll

C.B. 11* (MELI) Mel+ 160+340+800 1300 1300

M104-5В (mell04a°) МеГ 160+340+800 1300 1300

M104-5D (imell04b МеГ 160+340+800 1300 1300

YO 495 Mel+ 160+340+800 1300 1300

YO 504 Mel+ 160+340+800 1300 1300

YO 614 МеГ 160+340+800 1300 1300

CBS 2451 МеГ 160+340+800 1300 1300

CBS 7961 МеГ 160+340+800 1300 1300

CBS 7962 МеГ 160+340+800 1300 1300

Харьковская-39 МеГ 160+340+800 1300 1300

BB-2 МеГ 160+340+800 1300 1300

CRO-1A* СMEL12) МеГ 1300 250+1050 1300

CRO-1C (MEL13) МеГ 1300 250+1050 1300

CRO-8A {MELI 4) МеГ 1300 250+1050 1300

№134 (MELI5) МеГ 1300 250+1050 1300

CBS 4734 (MEL4734) МеГ 1300 250+1050 1300

CBS 380 (MELb) МеГ 1300 1300 850+450

NCYC 686* (MELu) МеГ 1300 1300 850+450

CBS 1538 (MELpt) МеГ 1300 1300 850+450

Ш-11/12 МеГ 1300 1300 850+450

Л 80-4 МеГ 1300 1300 850+450

CBS 1513* (MELx) МеГ 1140+160 1300 850+450

CBS 1503* (MELm) МеГ 1140+160 1300 850+450

ГСЧ-5 МеГ 1140+160 1300 850+450

ГСЧ-8 МеГ 1140+160 1300 850+450

ГСЧ-11 (melb0) Mel- 1140+160 1300 850+450

CBS 403 (mel40f) Mel' 1300 1300 1300

* - штаммы, используемые в качестве контрольных. CRO-1A, CRO-1C и CRO-8A -дериваты штамма CBS 2888; М 104-5В и М 104-5D - сегреганты гибрида М 104 х Х2180-1А; CBS 403 = ВКМ Y-407.

а-Галактозидазные гены MEL дрожжей Saccharomyces cerevisiae

Рестриктазный анализ показал, что а-галактозидазные гены девяти штаммов S. cerevisiae не отличаются от генов MEL1-MEL11. Особый интерес представляет неспособный сбраживать мелибиозу штамм М 104, который, согласно Саузерн-гибридизации с зондом MEL1, содержит два "молчащих" а-

галактозидазных гена, локализованных в дуплетах хромосом VII/XV и XVI/XIII.

При скрещивании штамма М 104 с гаплоидным тестером Х2180-1А (МеГ), в нашей лаборатории были получены сегреганты М 104-5В и М 104-5D, несущие по одному а-галактозидазному гену. Фрагменты а-галактозидазных генов сегрегантов штамма М 104 нами были амплифицированы, а затем клонированы и секвенированы. Полученные нуклеотидные последовательности сравнили со всеми известными генами MEL дрожжей Saccharomyces Оказалось, что оба гена на 99% сходны с геном MEL6 дрожжей S. cerevisiae, тогда как их гомология с другими мелибиозными генами дрожжей-сахаромицетов ниже, и не превышает 94%. В 691 положении нуклеотидной последовательности обоих а-галактозидазных генов был обнаружен стоп-кодон TGA, который, по-видимому, и является причиной инактивации этих генов.

а-Галактозидазы дрожжей S. hayan us и S. pastorianus

Во вторую группу, выделенную нами на основании рестриктазного анализа а-галактозидазных генов, попали дрожжи S bayanus и 5 pastorianus. ПЦР-амплифицированные фрагменты ДНК, соответствующие активным гена!: ME Lb штамма S. bayanus CBS 380 и MELpt штамма S. pastorianus CBS 1538 и "молчащему" гену melb0 гибридного штамма S cerevisiae х S1 bayanus var. uvarum ГСЧ-11, были клонированы и секвенированы. На основании полученных нуклеотидных последовательностей генов MELb, MELpt и псевдогена melb0 были определены аминокислотные последовательности соответствующих белков. Последовательности MELb и MELpt оказались идентичны на 95.2%, MELpt и melb0 - на 95%, а последовательности MELb и melb0 отличались только пятью аминокислотными остатками (99% сходства). По-видимому, псевдоген melb0 представляет собой нефункциональный аллель гена MELb дрожжей S. bayanus. Аминокислотные последовательности MELb и MELpt имеют очень высокое сходство с MELu (соответственно 99.0% и 95.2%) и MELx (94.9% и 99.0%). Их сходство с белком MELI S cerevisiae составляет, соответственно, 83.7% и 82.5%, с MELp - 84.4% и 83.9%, с MELj - 87 5% и 88.2%.

Мы провели филогенетический анализ выравненных аминокислотных последовательностей исследованных а-галактозидаз дрожжей (рис. 4). На

дендрограмме, при анализе относительно внешней группы (MELr Zygotorulaspora mrakii), выделяются два кластера. В первый входят а-галактозидазы MELb, MELpt, MELu, MELx и выведенная последовательность melb0, а во второй - белки MEL S. cerevisiae. а-Галактозидаза MELp дрожжей S paradoxus примыкает к кластеру "S. cerevisiae", а белок MELj дрожжей S mikatae - к кластеру "5. bayanus/S. pastorianus'".

Рисунок 4. Филогенетический анализ аминокислотных последовательностей а-галакгозидаз дрожжей S cerevisiae, S. bayanus, S. mikatae, S paradoxus и S pastorianus. В качестве внешней группы использована а-галактозидаза дрожжей Zygotorulaspora mrakii.

Таким образом, идентичность генов MELb, и MELpt ближе к внутривидовому, чем к межвидовому уровню. Это свидетельствует о том, что а-галактозидазный ген гибридных пивных дрожжей S pastorianus происходит от S. bayanus, а не от S. cerevisiae. Высокое сходство нуклеотидных и аминокислотных последовательностей генов MELb и melb0 также указывает на происхождение а-галактозидазного гена гибридного штамма ГСЧ-11 от дрожжей S. bayanus.

Дивергентное семейство а-галактозидазных генов дрожжей 5. cerevisiae:

новый ген MEL1S

Мы заинтересовались штаммами Saccharomyces, выделенными из кукурузного теста в Гане, так как среди них часто встречались дрожжи, способные сбраживать мелибиозу (Hayford, Jespersen, 1999). Молекулярное кариотипорование и последующая Саузерн-гибридизация с зондом MEL1

показали, что все африканские штаммы содержат только по одному а-галактозидазному гену, локализованному в дуплете хромосом IV/XII (рис. 5 А, В)

В дуплете ДНК хромосом IV/XII локализовано два гена- MEL5 и MELI0, принадлежащих к семейству высокогомологичных генов MEL1-MELU (Naumov et al, 1990, 1991, 1996b) Однако слабая интенсивность гибридизации ДНК африканских штаммов с зондом MELI свидетельствует о сравнительно низком уровне гомологии их гена MEL с семейством генов MELI-MELII. Поэтому, есть основание считать, что мы обнаружили новый а-галактозидазный ген.

Рисунок 5. Пульс-

электрофорез хромосомных ДНК африканских штаммов 5 сегеушае (А) и Саузерн-гибридизация с зондом МЕЪ1 (В) Дорожки 1 - УТЧМ 295 (хромосомный стандарт), 2 - СВ8 4411 (контрольный штамм), 3 - 34, 4 -120,5 - 123,6- 127,7 - 128, 8 - 134, 9 - 146, 10- 148, 11 - 149, 12150, 13 - 153, 14 -154, 15 - 165, 16166, 17-11, 18-17-АЗ-5, 19-25-1-3, 2026-1-10,21 - 135, 22163

Известно дивергентное африканское семейство генов МЕЫ2-МЕЫ4, расположенных, соответственно, в хромосомах ГХ, XV и X (Наумов, Наумов, 1997а, б). Для установления родства нового гена (МЕЫ5) с африканским семейством была проведена гибридизация по Саузерну ПЦР-

д 1 2 34 S 6 7 8 9 Ю1112 13 14 1516П1819Э02122

XII 2200

^ 1О0

xv.vn JJÖ

XVI «во

XIII «5 II 8SO

XIV 800

х т

XI ТОО

V 630 VIII 580

IX 4(0

ш зто

VI 290 1 245

В 1 23 4 5 6 7 8 9 ЮЦ1213 1415 16Т7Й19 20 2122

MEL5.MELJ0 .Ц...... ^ . ... ........ ::

MEL3MEL6

MEL4

'/¿л,-

/ 7Л

яка®**

MEL7

амплифицированного гена MELI5 двух штаммов №34 и №134 с зондом MELI2 (рис 6, дорожки 5 и 6) Сопоставление интенсивностей гибридизационных сигналов позволило установить принадлежность гена MEL15 к африканскому семейству 1енов MEL12-MEL14 (дорожки 2-4). Как и следовало ожидать, ПЦР-фрагмент гена MELI штамма С В. 11 с зондом MELI2 гибридизировался очень слабо (рис 6, дорожка 1) Принадлежность гена MELI5 к африканскому семейству генов MEL подтверждается также рестриктазным анализом ПЦР-фрагменты длиной 1300 пн всех четырех африканских генов MEL12-MEL15 имеют идентичные рестриктазные карты, отличные от таковых генов MELI-MEL11.

1 2 3 4 5 6

Рисунок 6. Саузерн-гибридизация ПЦР-фрагментов генов MEL длиной 1300 пн. с зондом MEL12. Дорожки. 1 - MEL1 (С.В 11), 2 -MEL12 (CR0-1A), 3 - MEL13 (CR0-1С), 4 -MEL14 (CR0-8A), 5 -MEL15 (34 24), 6-MEL15 (134-7-1) В круглых скобках приводятся названия штаммов, содержащих соответствующие гены MEL

Нуклеотидные и аминокислотные последовательности дивергентных

генов MEL

Мы клонировали и секвенировали ПЦР-амплифицированный фрагмент гена MELI5 африканского штамма №134 На основании полученной пуклеотидной последовательности была определена аминокислотная последовательность соответствующего белка Оказалось, что аминокислотная последовательность MEL15 имеет 98% сходства с белком MEL12, 95% - с а-галактозидазой MELp дрожжей S paradoxus и только 86-88% - с белками MEL европейских дрожжей S. cerevisiae

Дивергентный а-галактозидазный ген имеется также у Ме1+-штамма CBS 4734, изолированного из сахарного тростника в Бразилии С помощью метода пульс-электрофореза хромосомных ДНК и последующей Саузерн-гибридизации с зондом MELI, мы установили, что ген MEL4734 локализован в хромосоме X (рис. 7). В этой же хромосоме у штамма S cerevisiae CBS 2888 расположен ген MELI4 (Наумов, Наумов, 19976). Слабая интенсивность гибридизационного сигнала хромосомной ДНК штамма CBS 4734 с пробой MELI свидетельствует о низком сходстве гена MEL4734 с европейскими генами

MELI -MELI I, что было подтверждено секвенированием ПЦР-амплифицированного фрагмента гена MEL4734 При сравнении аминокислотной последовательности соответствующего белка с ос-галактозидазами дрожжей S cerevisiae и 5 paradoxus наибольшее сходство наблюдалось между последовательностями MEL4734 и белками MEL12-MEL15 (97%), а также MET4734 и MELp (95%) Уровень идентичности белка MEL4734 и других а-галакгозидаз дрожжей Saccharomyces был более низкий - 83-85% Полученные данные свидетельствуют о том, что бразильский штамм CBS 4734 вероятно обладает геном MELI 4

Z Z

5 <

ю 6

ео «

и и

г-

и «а и

/"/т. i

Рисунок 7. Пульс-электрофорез хромосомных ДНК (А) и Саузерн-гибридизация с зондом MELI (В).

MEL4734

\ *

MEL12

У штамма CBS 403 дрожжей S. cerevisiae, изолированного в Африке из безалкогольного напитка, обнаружен "молчащий" а-галактозидазный ген (.те1403°), который по результатам рестриктазного анализа не попал ни в одну из трех групп Было проведено клонирование и секвенирование псевдогена те1403° Оказалось, что определенная аминокислотная последовательность гипотетического белка те1403° на 84-85% совпадает с белками MEL12-MEL15 дрожжей S. cerevisiae и MELp дрожжей S paradoxus Уровень идентичности mel403° с другими а-галактозидазами дрожжей-сахаромицетов был примерно одинаковым и составил 74-76% Таким образом, псевдоген те1403° - это, вероятно, еще один представитель африканского дивергентного семейства а-галактозидазных генов дрожжей S cerevisiae Довольно значительные отличия его нуклеотидной и гипотетической аминокислотной последовательности от

соответствующих последовательностей штаммов третьей группы могут объясняться многочисленными мутациями: последовательность те1403° содержит семь стоп-кодонов.

Сравнительный молекулярно-генетическнй анализ последовательностей а-галактозидаз дрожжей-аскомицетов

Мы провели филогенетический анализ выравненных аминокислотных последовательностей а-галактозидаз разных видов дрожжей, доступных через компьютерную базу данных GenBank (рис. 8). В качестве внешней группы была использована а-галактозидаза мукорового мицелиального гриба Umbelopsis vinacea (Mortierella vinaced) (Shibuya et al., 1995).

На филогенетическом древе при анализе относительно внешней группы выделяются два кластера. Первый включает а-галактозидазы дрожжей рода Saccharomyces и примыкающие к ним белки MELt (Torulaspora delbrueckii) и MELr (Zygotorulaspora mrakii).

В кластере "Saccharomyces" со 100%-ной поддержкой выделяются три подгруппы. Одна из них включает белки MEL дрожжей S cerevisiae, вторая -дивергентные а-галактозидазы африканских дрожжей S cerevisiae, белок MEL штамма CBS 4734, изолированного в Бразилии и а-галактозидазу MELp дрожжей S. paradoxus, а третья - а-галактозидазы дрожжей S bay anus, S uvarum, S. pastorianus и S. carlsbergensis, а также белок melb0 гибридного штамма ГСЧ-11. Кроме того, к последней подгруппе тесно примыкает а-галактозидаза MELj дрожжей S. mikatae.

Второй кластер объединяет а-галактозидазы различных штаммов дрожжей Lachancea kluyveri (синоним Saccharomyces kluyveri), большинство из которых обладают высоким сходством - 98-99%. Наиболее дивергентными являются белки MEL штаммов IFO 1811 и IFO 10847, уровень их сходства с остальными а-галактозидазами L. kluyveri не превышает 90%. Следует отметить, что указанные два штамма являются наиболее дивергентными и по последовательностям внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1 и ITS2 (Oda, Fujisawa, 2001). Отдельную ветвь на филогенетическом древе занимает а галактозидаза MELz дрожжей Lachancea cidri, аминокислотная последовательность которой совпадает с белком MELI дрожжей S. cerevisiae только на 69%.

t #

IlOO

JST

1U0

100

IlOO

, MELj

ГПЯГ

. melb0* ■ MELx . MELpt*

. MELu Л .MELb*

100

^hzE

.MELp, .me!403 *

-MEL4734*

ЧЕ

. MEL12

199

MEL15*

I_meI104b *

-meI104a°*

100

Г96

. 1VTEL6 MEL2 •MELI

MELt Torulaspora delbrueckii ■ MELr Zygotorulaspora mrakii r^—L

100

I100

.NRRLY-1265 .IF01685

-IF01892

CBS6546 ■NBRC10955

■ CBS4566

l j?

100

■IF01811

"IFO10847

IF010848

ciiriM

/ f V

"MELz Lachancea cidri

"" Magnaporthe grisea

■ Schizosaccharomyces pombe

■ Debaryomyces hansenii

, Umbelopsis vinacea

Рисунок 8. Дендрограмма, построенная на основании фрагментов аминокислотных последовательностей а-галактозидаз дрожжей. Звездочкой отмечены белки, аминокислотные последовательности которых были определены в настоящей работе. Приведены индексы бутстрепа > 50%.

Тем не менее, последовательность MELz входит в одну группу с кластерами "Saccharomyces" и "Lachancea kluyverf (значение индекса бутстрепа- 100%).

Еще более дивергентными являются а-галактозидазы дрожжей Schizosaccharomyces pombe и Debaryomyces hansenii, а также соответствующий белок гриба Magnaporthe grísea Аминокислотные последовательности этих а-галактозидаз сильно отличаются от белков MEL дрожжей-сахаромицетов. Тем не менее, при анализе последовательностей а-галактозидаз с помощью программы BLAST и использования в качестве исходных последовательностей белков MEL дрожжей Saccharomyces, они всегда выявляются как белки-гомологи непосредственно за дрожжевыми мелибиазами. Следует отметить, что указанные виды, так же как и дрожжи Saccharomyces, относятся к классу Ascomycetes, в отличие от выбранного нами в качестве внешней группы гриба Umbelopsis vinacea, относящегося к классу Zygomycetes.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

У дрожжей Saccharomyces имеется ряд мультигенных семейств, локализованных в теломерных участках хромосом. Среди них - семейства генов SUC и MEL, контролирующие, соответственно, ферментацию сахарозы и мелибиозы. Семейство Р-фруктозидазных генов SUC представлено шестью структурными генами (SUC1-SUC5 и SUC7). Все они, за исключением SUC2, локализованы в теломерных районах хромосом (Carlson et al., 1985). Активный ген SUC2 или его молчащая копия, псевдоген suc2°, обнаружены во всех изученных штаммах S cerevisiae (Carlson, Botstein, 1983; Naumov et al., 1996c). Для изучения эволюции полимерных Р-фруктозидазных генов дрожжей Saccharomyces нами был клонирован и секвенирован ген SUC у вида 5" cariocanus и проведен сравнительный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей всех известных Р-фруктозидаз дрожжей этого рода. Среди нуклеотидных замен, наблюдаемых в кодирующей области генов SUC, преобладают транзиции типа С-Т, большинство из которых находятся в третьем положении кодона и не вызывают изменений в структуре белка. Такой спектр нуклеотидных замен может быть обусловлен действием отбора, направленного на консервацию аминокислотной последовательности Р-фруктозидаз. Обнаружено, что p-фруктозидазы дрожжей Saccharomyces идентичны на 90-

97%. Наиболее дивергентным является белок SUC дрожжей S. bayanus Этот вид является самым дивергентным в роде Saccharomyces и по результатам филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей внутреннего транскрибируемого спейсера ITS1 рДНК. Следует отметить одинаковую топологию филогенетических деревьев, построенных на основании последовательностей ß-фруктозидаз и ITSl-района рДНК. Это указывает на коэволюцию ß-фруктозидазных и рибосомальных генов дрожжей Saccharomyces.

В отличие от способности ферментировать сахарозу, признак ферментации мелибиозы характерен только для видов S. bayanus и S. mikatae, а также для гибридного таксона S. pastoricmus, тогда как среди штаммов S. cerevisiae и S. paradoxus Ме1+-изоляты встречаются редко (Naumov et al., 1996b; Naumova et al, 1996b). Сравнительное изучение дрожжей Saccharomyces различного географического происхождения позволило выявить три группы штаммов, а-галактозидазные гены которых отличаются по рестриктазным картам. Одна из выделенных групп объединяет дрожжи 5. bayanus и S. pastorianus, гены MEL которых характеризуются наличием Яг'жЛИ-сайта рестрикции. Вид S. bayanus представлен двумя частично генетически изолированными разновидностями S. bayanus var. bayanus и S. bayanus var. uvarum (Наумов, 2000). Пивные дрожжи низового брожения S. pastorianus (синоним S. carlsbergensis) имеют гибридное происхождение и содержат части геномов двух видов: S. cerevisiae и S. bayanus (Casey and Pedersen, 1988; Hansen and Kielland-Brandt, 1994; Tamai et al., 1998; Yamagishi and Ogata, 1999). Сравнение нуклеотидных последовательностей секвенированных нами а-галактозидазных генов типовых культур S. bayanus (MELb) и S. pastorianus (MELpt) выявило их высокое сходство с генами S bayanus var. uvarum (MELu) и S. carlsbergensis (MELx) (93.6-99.3%). Гены MEL1-MEL11 дрожжей S cerevisiae совпадают на 94.8-100%, a гены MEL видов-двойников S. cerevisiae, S. paradoxus, S. mikatae и S. bayanus - только на 82%. Таким образом, идентичность генов MELb, MELu, MELpt и MELx ближе к внутривидовому, чем к межвидовому уровню. Полученные данные свидетельствуют о том, что а-галактозидазный ген гибридных дрожжей S. pastorianus происходит от S bayanus, а не от S. cerevisiae. На это указывает и одинаковая хромосомная локализация а-галактозидазных генов у дрожжей S. bayanus и S. pastorianus: т

правом плече хромосомы X (Naumov et al. 1994; Naumova et al., 1996b; Fisher et al., 2000). Следует отметить, что ген MELp S. paradoxus также расположен в хромосоме X (Naumova et al., 1996b). В правом плече хромосомы X расположен и один из генов MEL дрожжей S. cerevisiae - MEL9 (Naumov et al., 1995). По-видимому, хромосома X содержит предковый а-галактозидазный ген. Мы установили, что "молчащий" ген melb0 гибридного штамма S. cerevisiae х S. bayanus var. uvarum ГСЧ-11 имеет очень высокое сходство с а-галактозидазным геном дрожжей S. bayanus, и, очевидно, также происходит от дрожжей 5 bayanus, а не от 5. cerevisiae.

Согласно литературным данным, сбраживающие мелибиозу винные штаммы дрожжей, как правило, относятся к биологическому виду S. bayanus и редко - к S. cerevisiae (Naumov et al., 1996b). Причем, все идентифицированные до настоящего времени гены MEL винных дрожжей S. cerevisiae, независимо от места их выделения, относятся к европейскому семейству а-галактозидазных генов. Изученные нами гены MEL южноафриканских винных штаммов S cerevisiae также являются представителями семейства MELI-MELI 1.

Как правило, штаммы МеГ дрожжей S cerevisiae не обладают даже "молчащей" последовательностью а-галактозидазного гена. Нами впервые изучены два псевдогена у неспособного сбраживать мелибиозу винного штамма М 104. Обе "молчащие" последовательности на 99% совпадают с генами MEL6 и MEL8 дрожжей S. cerevisiae-, их идентичность с другими мелибиозными генами дрожжей-сахаромицетов составляет менее 94%. В 691 положении нуклеотидной последовательности обоих а-галактозидазных псевдогенов была обнаружена трансверсия G-T в первом положении кодона глицина GGA, приводящая к образованию стоп-кодона TGA. По-видимому, это и является причиной инактивации указанных генов.

Помимо европейского семейства генов MELI-MELI 1, у дрожжей S cerevisiae известно дивергентное семейство генов MEL12-MEL14 (Наумов, Наумов, 1997а, б). Новым геном MELI5 этого семейства обладают-штаммы S cerevisiae, выделенные из кукурузного теста в Гане Очевидно, что эндемичные африканские дрожжи S cerevisiae, в отличие от европейских штаммов, обладают своим пулом существенно дивергировавших генов MEL. Аминокислотные последовательности белков MEL12-MEL15 идентичны на 9698%, а их сходство с а-галактозидазами MEL1-MEL11 составляет 86-88%.

Среди представителей дивергентного семейства а-галактозидазных генов дрожжей S. cerevisiae обнаружен псевдоген те1403° у штамма CBS 403, изолированного в Африке из безалкогольного имбирного напитка. Аминокислотная последовательность ше1403°, определенная на основании последовательности псевдогена, на 84-85% совпадает с белками MEL12-MEL15 дрожжей S. cerevisiae, а уровень идентичности ше1403 с другими а-галактозидазами дрожжей-сахаромицетов приблизительно одинаков и находится в пределах 74-76%. Еще один представитель дивергентного семейства а-галактозидазных генов дрожжей 5 cerevisiae, обнаружен в Бразилии у штамма CBS 4734, изолированного из сахарного тростника. Выведенная аминокислотная последовательность белка MEL4734 на 97% идентична а-галактозидазам MEL12-MEL15 дрожжей S. cerevisiae и только на 83-85% - остальным белкам MEL дрожжей Saccharomyces.

Мы провели филогенетический анализ выравненных аминокислотных последовательностей а-галактозидаз разных видов аскомицетовых дрожжей. На филогенетическом древе при анализе относительно внешней группы выделяются два кластера: первый, включающий а-галактозидазы дрожжей рода Saccharomyces, а также относительно близкие им белки MELt (Torulaspora delbrueckif) и MELr (Zygotorulaspora mrakii), и второй, объединяющий а-галактозидазы различных штаммов дрожжей Lachancea kluyveri. Кластер "Saccharomyces", в свою очередь, содержит три подгруппы: первую, представленную белками MEL европейских штаммов S. cerevisiae-, вторую, включающую дивергентные а-галактозидазы дрожжей S. cerevisiae и белок MELp дрожжей S. paradoxus-, третью, объединяющую а-галактозидазы дрожжей S. bayanus и S. pastorianus. Кроме того, с последней подгруппой тесно связан белок MELj дрожжей S mikatae.

Нами установлено, что дивергентные гены MEL дрожжей S. cerevisiae (MEL12-MEL15, MEL4734 и те1403°) имеют высокий уровень идентичности с геном MELp дрожжей S. paradoxus: 85-95%. Среди дрожжей S paradoxus известно только три штамма, содержащих гены MEL (Naumov et al., 1996а; 1998). а-Галактозидазный ген одного из них (MELp) был клонирован и секвенирован (Naumova et al., 1996b). Можно предположить, что в свое время имела место интрогрессия между дрожжами S. cerevisiae и S. paradoxus. В результате этого в геном S. cerevisiae мог попасть чужой ген MEL. Его

транслокация в теломерные районы различных хромосом и привела к образованию семейства генов MEL12-MEL15. На процесс интрогрессии генетического материала внутри рода Saccharomyces указывает существование естественных межвидовых гибридов дрожжей данного рода (Masneuf et al., 1998; Naumov et al., 2000b) и возможность получения стабильных ' жизнеспособных межвидовых гибридов в лабораторных условиях (Naumov, 1987,1996). Кроме того, ранее было отмечено наличие теломерных генов SUC и Y'-последовательностей дрожжей S cerevisiae в геноме ряда штаммов S bayanus, что, очевидно, также является результатом интрогрессии между этими видами (Naumov et al., 1992).

Мы сравнили значения коэффициента, выражающего соотношение транзиций к трансверсиям, у генов MEL разных видов дрожжей Saccharomyces Только во внутривидовых комбинациях генов MELl, MEL2 и MEL6 соотношение транзиций и трансверсий составляло от 2.42 до 4.11, что соответствует уровню межвидовой (между S. cerevisiae и S. paradoxus) дивергенции генов NAM2, ARG4 и MRS J (Delorme et al., 1988; Herbert et al., 1988, 1992; Adjiri et al., 1994). В случае генов MELu, MELb, MELpt и MELx данный коэффициент варьировал от 2.00 до 2.33, а самые низкие значение коэффициента, не превышающие 1.90, были отмечены при сравнении этих двух групп генов между собой, а также с генами MELj и MELp. Пониженное соотношение транзиций к трансверсиям, отмеченное для генов MEL, может свидетельствовать о более ранней их дивергенции по сравнению с генами NAM2, ARG4 и MRS1. Еще одним возможным объяснением может служить повышенная частота мутирования а-галактозидазных генов, обусловленная их локализацией в теломерных районах хромосом, которые, как известно, являются горячими точками внутри- и межхромосомных рекомбинационных событий.

Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что эволюция а-галактозидазных и p-фруктозидазных генов у дрожжей Saccharomyces шла ( ~ неодинаково. Р-Фруктозидазные гены коэволюционировали с рибосомальной ДНК, тогда как а-галактозидазные гены оказались более дивергентными В процессе их эволюции, очевидно, произошел горизонтальный перенос гена MEL между видами S cerevisiae и S. paradoxus.

выводы

1. Проведено секвенирование гена SUCc дрожжей Saccharomyces cariocanus. Обнаружена высокая консервативность нуклеотидных и аминокислотных последовательностей p-фруктозидаз дрожжей рода Saccharomyces. Все исследованные белки идентичны на 90-97%. Наиболее дивергентной является Р-фруктозидаза S bayanus

2. Впервые секвенированы два а-галактозидазных псевдогена те1104а0 и tnell04b°y неспособного сбраживать мелибиозу штамма S. cerevisiae M 104. Трансверсия G69i-T69i в первом положении кодона глицина GGA, приводящая к образованию стоп-кодона, является причиной инактивации этих генов.

3. У африканских шгаммов S cerevisiae идентифицирован и секвенирован новый ген MEL15, относящийся к дивергентному семейству генов MEL12-MEL14. Аминокислотные последовательности белков MEL12-MEL15 идентичны на 96-98%, а их сходство с белками европейского семейства MEL1-MEL11 составляет 86-88%.

4. Сравнение нуклеотидных и аминокислотных последовательностей показало, что уровень сходства африканских генов MEL дрожжей S cerevisiae и гена MELp дрожжей S. paradoxus соответствует внутривидовому. Это свидетельствует о горизонтальном переносе а-галактозидазных генов между дрожжами S. cerevisiae и S. paradoxus.

5. Обнаружено высокое сходство (93.6-99.3%) нуклеотидных последовательностей генов MEL дрожжей S. bayanus {MELb, MELu) и S pastorianus (MELpt, MELx), сопоставимое с внутривидовым уровнем идентичности генов MEL1-MEL11 дрожжей 5. cerevisiae. Показано, что а-галактозидазный ген гибридных дрожжей 5 pastorianus происходит от вида S. bayanus, а не от S. cerevisiae.

6. Установлено, что эволюция а-галактозидазных и p-фруктозидазных генов у дрожжей Saccharomyces шла неодинаково. Р-Фруктозидазные гены коэволюционировали с рибосомальной ДНК, тогда как а-галактозидазные гены эволюционировали независимо.

Список опубликованных работ по теме диссертации:

1.Naumova E.S., Korshunova I.V., Jespersen L., Naumov G.I. Molecular genetic identification of Saccharomyces sensu stricto strains from African sorghum beer // FEMS Yeast Research. 2003. V.3. №2. P. 177-184.

2. Наумов Г.И., Наумова E.C., Коршунова И.В., Якобсен М. Сравнительная

генетика дрожжей: Новый альфа-галактозидазный ген MEL15 // Генетика, 2002. Т.38. №10. С.1330-1336.

3. Наумова Е.С., Кори1унова И.В., Наумов Г.И. Молекулярный анализ а-

галактозидазных генов MEL дрожжей Saccharomyces sensu stricto // Молекулярная биология. 2003. Т. 37. №5. С. 825-833.

4. Коршунова И.В., Наумова Е.С., Наумов Г.И. Сравнительный молекулярно-

генетический анализ Р-фруктозидаз дрожжей рода Saccharomyces Молекулярная биология. 2005. Т. 39. №3. С. 413-419.

5. Naumova E.S., Naumov G.I., Naumoff D.G., Korshunova I.V., Jakobsen M.

Introgression between non-conventional Saccharomyces paradoxus species and S cerevisiae: alfa-galactosidase genes MEL\2-MEL\5 II Abstracts of 21st Iternational Specialized Symposium on Yeasts (ISSY 2001) "Biochemistry, Genetics, Biotechnology and Ecology of Non-conventional Yeasts (NCY)", August 21-25, 2001, Lviv, Ukraine, P.57.

6. Naumov G.I., Naumova E.S., Korshunova I.V., Jacobsen M. Superfamily of alfa-

galactosidase genes of Saccharomyces cerevisiae: the new divergent African genes MEL12-MEL15 II Book of abstracts. The Twentieth International Conference on Yeast Genetics and Molecular Biology. Prague, Czech Republic, August 26-31, 2001. Yeast, 2001, V. 18, № SI, P. 320.

7. Naumova E.S., Korshunova I.V., Jespersen I.., Naumov G.I. Molecular genetic

identification of Saccharomyces strains isolated from African sorghum beer // Abstracts of 22nd International Specialised Symposium on Yeasts (ISSY 2002) "Yeast Fermentations and other Yeast Bioprocesses", March 25-28, 2002, Pilanesberg National Park, South Africa, P.26.

8. Наумов Г.И., Наумова E.C., Наумов Д.Г., Коршунова И.В., Якобсен М.

Мобильные альфа-галактозидазные гены ферментации мелибиозы у дрожжей Saccharomyces II Материалы 1-го Международного Конгресса "Биотехнология -состояние и перспективы развития", 14-18 октября 2002, Москва, Россия, С. 186.

9. Korshunova I. V., Naumova Е. S., Naumov G. I. Molecular analysis of the p-

fructosidases in yeast Saccharomyces II Abstracts of 30th FEBS Congress - 9lh IUBMB Conference, Budapest, Hungary, 2-7 July 2005. FEBS Journal 272(S1), A2-038P.

Г- ->

Принято к исполнению 06/09/2005 Исполнено 07/09/2005

Заказ № Ю17 Тираж 100 экз

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Варшавское ш, 36 (095) 975-78-56 (095) 747-64-70 www autoreferat ru

»Í8305

РНБ Русский фонд

2006^4 18435

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Коршунова, Ирина Викторовна

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. КЛАССИФИКАЦИЯ ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES SENSU

STRICTO

1.1. Краткая история классификации

1.1.1. Генетический анализ

1.1.2. Молекулярно-биологическая классификация

1.1.3. Современная таксономия рода Saccharomyces

1.2. Таксономические особенности видов рода Saccharomyces

1.2.1. Saccharomyces cerevisiae

1.2.2. Saccharomyces paradoxus

1.2.3. Saccharomyces bay anus

1.2.4. Saccharomycespastorianus

ГЛАВА 2. ДИВЕРГЕНЦИЯ ГЕНОМОВ ДРОЖЖЕЙ РОДА SACCHAROMYCES

2.1. Роль крупных хромосомных перестроек в процессах видообразования дрожжей

2.2. Генные дупликации и их роль в эволюции дрожжей Saccharomyces

2.3. Полиплоидия и межвидовая гибридизация

2.4. Сравнительный анализ генов и геномов

2.5. Теломеры дрожжей Saccharomyces

ГЛАВА 3. ГЕНЕТИКА ФЕРМЕНТАЦИИ САХАРОВ

3.1. Полимерные гены ферментации мальтозы

3.2. Полимерные гены, контролирующие ферментацию а-метилглюкозида и растворимого крахмала

3.3. Полимерные гены SUC ферментации сахарозы дрожжей Saccharomyces

3.4. Полимерные гены MEL ферментации мелибиозы дрожжей Saccharomyces

3.4.1. Семейство полимерных генов MEL дрожжей S. cerevisiae

3.4.2. а-Галактозидазные гены MEL видов-двойииков дрожжей

S. cerevisiae и гибридного таксона S. pastorianus

3.4.3. Регуляция а-галактозидазных генов MEL

3.4.4. Гены MEL других родов дрожжей 54 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ И ОБСУЖДЕНИЕ

ГЛАВА 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

4.1. Объекты исследования

4.2. ПЦР-анализ

4.3. Методы генной инженерии

4.4. Пульс-электрофорез хромосомных ДНК и Саузерн-гибридизация хромосом дрожжей

4.5. Филогенетический анализ

ГЛАВА 5. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ р-ФРУКТОЗИДАЗ ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES

5.1. Гены SUC африканских штаммов дрожжей S. cerevisiac

5.2. Сравнение нуклеотидных последовательностей (З-фруктозидазных генов SUC

5.3. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей

3-фруктозидаз

ГЛАВА 6. РЕСТРИКТАЗНЫЙ АНАЛИЗ а-ГАЛАКТОЗИДАЗНЫХ ГЕНОВ

ДРОЖЖЕЙ SA CCHAROmCES

ГЛАВА 7. ЕВРОПЕЙСКОЕ СЕМЕЙСТВО а-ГАЛАКТОЗИДАЗНЫХ ГЕНОВ

MEL ДРОЖЖЕЙ S. cerevisiae

ГЛАВА 8. а-ГАЛАКТОЗИДАЗНЫЕ ГЕНЫ ДРОЖЖЕЙ S. bayamis и

S. pastorianus

8.1. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов MELb, rnelb0 и MELpt

8.2. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей агалактозидаз MELb и MELpt

ГЛАВА 9. ДИВЕРГЕНТНОЕ СЕМЕЙСТВО а-ГАЛАКТОЗИДАЗНЫХ

ГЕНОВ ДРОЖЖЕЙ S. cerevisiae

9.1. Обнаружение и идентификация нового гена MEL

9.2. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности дивергентных генов MEL

9.3. Сравнительный молекулярно-генетический анализ последовательностей а-галактозидаз дрожжей-аскомицетов

Введение Диссертация по биологии, на тему "Эволюционная генетика α-галактозидаз и β-фруктозидаз дрожжей рода Saccharomyces"

Естественный генофонд дрожжей представляет собой большой потенциал для фундаментальных и прикладных исследований. Изучая природное разнообразие дрожжей и, в частности, генетический полиморфизм биохимических и физиологических признаков у природных и промышленных штаммов, можно получать ценную информацию о разных уровнях организации генетического материала.

Дрожжи Saccharomyces cerevisiae стали первым эукариотическим организмом, геном которого был полностью секвенирован (Goffeau et al., 1996). Это создало основу для изучения геномов остальных пяти видов рода Saccharomyces: S. bayanus, S. cariocanus, S. kudriavzevii, S. mikatae и S. paradoxus. К настоящему времени в компьютерных базах данных имеются полные последовательности геномов видов S. bayanus, S. paradoxus, S. mikatae и S. kudriavzevii. Однако в проектах по секвенированию полных геномов было использовано лишь по одной генетической линии каждого вида, у которых могут отсутствовать многие ядерные и цитоплазматические детерминанты, представленные у других штаммов того же вида и, следовательно, информация, полученная таким путем, имеет ограниченный характер. Кроме того, известен значительный полиморфизм размеров хромосом, особенно у культурных штаммов дрожжей-сахаромицетов, свидетельствующий о больших вставках и делециях генетического материала.

Сравнительный анализ геномов дрожжей S. cerevisiae, S. bayanus, S. paradoxus и S. mikatae показал, что наиболее изменчивы теломерные районы хромосом (Kellis et al., 2003), содержащие гены ряда мультигенных семейств. К их числу относятся полимерные гены ферментации различных Сахаров: мальтозы (гены MAL), мелибиозы (MEL), сахарозы (SUC) и другие (Carlson, Botstein, 1983; Charron et al., 1989; Naumov et al., 1995d).

К настоящему времени у дрожжей S. cerevisiae идентифицировано шесть Р-фруктозидазных генов (SUC1-SUC5 и SUC7). Анализ' физической структуры различных локусов SUC показал, что все гены SUC, за исключением SUC2, локализованы в теломерных районах хромосом (Carlson et al., 1985). Ген SUC2 - единственный Р-фруктозидазный ген, расположенный не в теломерном районе хромосомы (Mortimer-et al., 1992). Интересно отметить, что ген SUC2 имеется у всех штаммов дрожжей cerevisiae, хотя у некоторых из них он представлен нефункциональным мутантным аллелем suc2° (Carlson, Botstein, 1983; Naumov et al., 1996c). [5-Фруктозидазные гены остальных видов рода Saccharomyces практически не изучены, а у дрожжей S. cariocanus даже не определена его нуклеотидная последовательность. Более того, эволюция p-фруктозидаз в рамках рода Saccharomyces еще никем не анализировалась.

Признак ферментации мелибиозы в целом не характерен для дрожжей S. cerevisiae, и большинство штаммов этого вида не имеют даже "молчащих" последовательностей генов MEL (Naumov et al., 1991; Turakainen et al, 1993b). К их числу относятся лабораторные линии, одна из которых была использована для секвенирования генома дрожжей S. cerevisiae. Известны популяции S. cerevisiae, обитающие в специфических субстратах (желудочно-кишечном тракте млекопитающих и отходах производства оливкового масла), в которых происходит накопление полимерных генов MEL (Naumov et al.,1995e). К настоящему времени у дрожжей S. cerevisiae идентифицировано одиннадцать а-галактозидазных генов MEL1-MEL11, расположенных в теломерных районах различных хромосом. Все штаммы, содержащие эти гены, имеют европейское происхождение. Редкие штаммы, сбраживающие мелибиозу, были выявлены среди винных и клинических изолятов (Naumov et al., 1996b).

Дивергентные гены MEL12-MEL14, обладающие низким уровнем гомологии с представителями европейского семейства MEL1-MEL11, обнаружены в Африке (Наумов, Наумов, 1997а). Африканские гены, также как и гены европейского семейства, были картированы в теломерных районах хромосом (Наумов, Наумов, 19976). Происхождение африканского семейства генов дрожжей S. cerevisiae продолжает оставаться неясным.

Гены ферментации мелибиозы (MEL) и сахарозы (SUC) дрожжей Saccharomyces представляют уникальную генетическую систему, позволяющую изучать быструю микроэволюцию дрожжевого генома как на уровне хромосом, так и на уровне генов.

Целью данной работы является изучение молекулярного полиморфизма и эволюции а-галактозидазных и Р-фруктозидазных генов дрожжей рода Saccharomyces.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Коршунова, Ирина Викторовна

выводы

1 Проведено секвенирование гена SUCc дрожжей Saccharomyces cariocanus. Обнаружена высокая консервативность нуклеотидных и аминокислотных последовательностей Р-фруктозидаз дрожжей рода Saccharomyces. Все исследованные белки идентичны на 90-97%. Наиболее дивергентной является p-фруктозидаза S. bayanus.

2 Впервые секвенированы два а-галактозидазных псевдогена те1104а° и mell04b° у неспособного сбраживать мелибиозу штамма S. cerevisiae М 104. Трансверсия G69i-T69i в первом положении кодона глицина GGA, приводящая к образованию стоп-кодона, является причиной инактивации этих генов.

3 У африканских штаммов S. cerevisiae идентифицирован и секвенирован новый ген MEL15, относящийся к дивергентному семейству генов MEL12-MEL14. Аминокислотные последовательности белков MEL12-MEL15 идентичны на 96-98%, а их сходство с белками европейского семейства MEL1-MEL11 составляет 86-88%.

4 Сравнение нуклеотидных и аминокислотных последовательностей показало, что уровень сходства африканских генов MEL дрожжей S. cerevisiae и гена MELp дрожжей S. paradoxus соответствует внутривидовому. Это свидетельствует о горизонтальном переносе а-галактозидазных генов между дрожжами S. cerevisiae и S. paradoxus.

5 Обнаружено высокое сходство (93.6-99.3%) нуклеотидных последовательностей генов MEL дрожжей S. bayanus (MELb, MELu) и S. pastorianus (MELpt, MELx), сопоставимое с внутривидовым уровнем идентичности генов MEL1-MEL11 дрожжей S. cerevisiae. Показано, что а- галактозидазный ген гибридных дрожжей S. pastorianus происходит от вида S. bayanus, а не от S. cerevisiae.

6 Установлено, что эволюция а-галактозидазных и Р-фруктозидазных генов у дрожжей Saccharomyces шла неодинаково. Р-Фруктозидазные гены коэволюционировали с рибосомальной ДНК, тогда как а-галактоз ид аз ные гены эволюционировали независимо.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

У дрожжей Saccharomyces имеется ряд мультигениых семейств, локализованных в теломерных участках хромосом. Среди них - семейства генов SUC и MEL, контролирующие, соответственно, ферментацию сахарозы и мелибиозы.

Семейство p-фруктозидазных генов SUC представлено шестью структурными генами (SUC1-SUC5 и SUC7). Все они, за исключением SUC2, локализованы в теломерных районах хромосом (Carlson et al., 1985). Активный ген SUC2 или его молчащая копия, псевдоген suc2°, обнаружены во всех изученных штаммах S. cerevisiae (Carlson, Botstein, 1983; Naumov et al., 1996c). Для изучения эволюции полимерных Р-фруктозидазных генов дрожжей Saccharomyces нами был клонирован и секвенирован ген SUC у вида S. cariocanus и проведен сравнительный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей всех известных р-фруктозидаз дрожжей этого рода. Среди нуклеотидных замен, наблюдаемых в кодирующей области генов SUC, преобладают транзиции типа С-Т, большинство из которых находятся в третьем положении кодона и не вызывают изменений в структуре белка. Такой спектр нуклеотидных замен может быть обусловлен действием отбора, направленного на консервацию аминокислотной последовательности Р-фруктозидаз. Обнаружено, что Р~ фрукгозидазы дрожжей Saccharomyces идентичны на 90-97%. Наиболее дивергентным является белок SUC дрожжей S. bayanus. Этот вид является самым дивергентным в роде Saccharomyces и по результатам филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей внутреннего транскрибируемого спейсера ITS1 рДНК. Следует отметить одинаковую топологию филогенетических деревьев, построенных на основании последовательностей Р-фруктозидаз и ITS 1-района рДНК. Это указывает на коэволюцию Р-фруктозидазных и рибосомальных генов дрожжей Saccharomyces.

Сравнительное изучение дрожжей Saccharomyces различного географического происхождения позволило выявить три группы штаммов, а-галактозидазные гены которых имеют различные рестриктазные карты. Одна из выделенных групп объединяет дрожжи S. bayanus и S. pastorianus, гены MEL которых характеризуются наличием 77//кЛН-сайта рестрикции. Вид S. bayanus представлен двумя частично генетически изолированными разновидностями S. bayanus var. bayanus и S. bayanus var. uvarum (Наумов, 2000). Пивные дрожжи низового брожения S. pastorianus (синоним S. carlsbergensis) имеют гибридное происхождение и содержат части геномов двух видов: S. cerevisiae и S. bayanus (Casey and Pedersen, 1988; Hansen and Kielland-Brandt, 1994; Tamai et al., 1998; Yamagishi and Ogata, 1999). Сравнение нуклеотидных последовательностей секвенированных нами а-галактозидазных генов типовых культур S. bayanus {MELb) и S. pastorianus {MELpt) выявило их высокое сходство с генами S. bayanus var. uvarum {MELu) и S. carlsbergensis {MELx) (93.6-99.3%). Гены MELI-MELI 1 дрожжей S. cerevisiae совпадают на 94.8-100%, а гены MEL видов-двойников S. cerevisiae, S. paradoxus, S. mikatae и S. bayanus — только на 82%. Таким образом, идентичность генов MELb, MELu, MELpt и MELx ближе к внутривидовому, чем к межвидовому уровню. Полученные данные свидетельствуют о том, что а-галактозидазный ген гибридных дрожжей S. pastorianus происходит от S. bayanus, а не от S. cerevisiae. На это указывает и одинаковая хромосомная локализация а-галактозидазных генов у дрожжей S. bayanus и S. pastorianus: в правом плече хромосомы X (Naumov et al. 1994; Naumova et al., 1996b; Fisher et al., 2000). Следует отметить, что ген MELp S. paradoxus также расположен в хромосоме X (Naumova et al., 1996b). В правом плече хромосомы X расположен и один из генов MEL дрожжей S. cerevisiae — MEL9 (Naumov et al., 1995). По-видимому, хромосома X содержит предковый а-галактозидазный ген. Мы установили, что молчащий" ген melb0 гибридного штамма S. cerevisiae х S. bayanus var. uvarum ГСЧ-11 имеет очень высокое сходство с а-галактозидазным геном дрожжей S. bayanus, и, очевидно, также происходит от дрожжей S. bayanus, а не от S. cerevisiae.

Согласно литературным данным, сбраживающие мелибиозу винные штаммы дрожжей, как правило, относятся к биологическому виду S. bayanus и редко - к S. cerevisiae (Naumov et al., 1996b). Причем, все идентифицированные до настоящего времени гены MEL винных дрожжей S. cerevisiae, независимо от места их выделения, относятся к европейскому семейству а-галактозидазных генов. Изученные нами гены MEL южноафриканских винных штаммов S. cerevisiae также являются представителями семейства MEL1-MEL11.

Как правило, штаммы Mel" дрожжей S. cerevisiae не обладают даже "молчащей" последовательностью а-галактозидазного гена. Нами впервые изучены два псевдогена у неспособного сбраживать мелибиозу винного штамма М 104. Обе "молчащие" последовательности на 99% совпадают с генами MEL6 и MEL8 дрожжей S. cerevisiae; их идентичность с другими мелибиозными генами дрожжей-сахаромицетов составляет менее 94%. В 691 положении нуклеотидной последовательности обоих а-галактозидазных псевдогснов была обнаружена трансверсия G-T в первом положении кодона глицина GGA, приводящая к образованию стоп-кодона TGA. По-видимому, это и является причиной инактивации указанных генов.

Помимо европейского семейства генов MEL1-MEL11, у дрожжей S. cerevisiae обнаружено дивергентное семейство генов MEL12-MEL14 (Наумов, Наумов, 1997а, б). Новым геном MEL15 этого семейства обладают штаммы S. cerevisiae, выделенные из кукурузного теста в Гане. Очевидно, что эндемичные африканские дрожжи S. cerevisiae, в отличие от европейских штаммов, обладают своим пулом существенно дивергировавших генов MEL. Аминокислотные последовательности белков MEL12-MEL15 идентичны на 96-98%, а их сходство с а-галактозидазами MEL1-MEL11 составляет 86-88%.

Среди представителей дивергентного семейства а-галактозидазных генов дрожжей S. cerevisiae обнаружен псевдоген те1403° у штамма CBS 403, изолированного в Африке из безалкогольного имбирного напитка. Аминокислотная последовательность mel403°, определенная на основании последовательности псевдогена, на 84-85% совпадает с белками MEL12-MEL15 дрожжей S. cerevisiae, а уровень идентичности те1403° с другими а-галактозидазами дрожжей-сахаромицетов приблизительно одинаков и находится в пределах 74-76%. Еще один представитель дивергентного семейства а-галактозидазных генов дрожжей S. cerevisiae, обнаружен в Бразилии у штамма CBS 4734, изолированного из сахарного тростника. Выведенная аминокислотная последовательность белка MEL4734 на 97% идентична а-галактозидазам MEL12-MEL15 дрожжей S. cerevisiae и только на 83-85% - остальным белкам MEL дрожжей Saccharomyces.

Мы провели филогенетический анализ выравненных аминокислотных последовательностей а-галактозидаз разных видов аскомицетовых дрожжей. На филогенетическом древе при анализе относительно внешней группы выделяются два кластера: первый, включающий а-галактозидазы дрожжей рода Saccharomyces, а также относительно близкие им белки MELt (Torulaspora delbrueckii) и MELr (Zygotorulaspora mrakii), и второй, объединяющий а-галактозидазы различных штаммов дрожжей Lachancea kluyveri. Кластер "Saccharomyces", в свою очередь, содержит три подгруппы: первую, представленную белками MEL европейских штаммов S. cerevisiae', вторую, включающую дивергентные а-галактозидазы дрожжей S. cerevisiae и белок MELp дрожжей S. paradoxus', третью, объединяющую а-галактозидазы дрожжей S. bayanus и S. pastorianus. Кроме того, с последней подгруппой тесно связан белок MELj дрожжей S. mikatae.

Нами установлено, что дивергентные гены MEL дрожжей S. cerevisiae {MEL12-MEL15, MEL4734 и те1403°) имеют высокий уровень идентичности с геном MELp дрожжей S. paradoxus: 85-95%. Среди дрожжей S. paradoxus известно только три штамма, содержащих гены MEL (Naumov et al., 1996a; 1998). а-Галактозидазный ген одного из них {MELp) был клонирован и секвенирован (Naumova et al., 1996b). Можно предположить, что в свое время имела место шггрогрессия между дрожжами S. cerevisiae и S. paradoxus. В результате этого в геном S. cerevisiae мог попасть чужой ген MEL. Его транслокация в теломерные районы различных хромосом и привела к образованию семейства генов MEL12-MEL15. На процесс интрогрессии генетического материала внутри рода Saccharomyces указывает существование естественных межвидовых гибридов дрожжей данного рода (Masneuf et al., 1998; Naumov et al., 2000b) и возможность получения стабильных жизнеспособных межвидовых гибридов в лабораторных условиях (Naumov, 1987, 1996). Кроме того, ранее было отмечено наличие теломерных генов SUC и Y'-последовательностей дрожжей S. cerevisiae в геноме ряда штаммов S. bayanus, что, очевидно, также является результатом интрогрессии между этими видами (Naumov et al., 1992).

Дивергенция между видами S. cerevisiae и S. paradoxus (синоним S. douglasii) была ранее изучена на нуклеотидном уровне при анализе генов NAM2, ARG4 и MRS1 (Delorme et al., 1988; Herbert et al., 1988, 1992; Adjiri et al., 1994). В результате статистической обработки полученных данных, авторы пришли к выводу что, значительное преобладание транзиций над трансверсиями (примерно в три раза) свидетельствует о недавней дивергенции исследуемых видов. Мы сравнили значения коэффициента, выражающего соотношение транзиций к трансверсиям, у генов MEL разных видов дрожжей Saccharomyces. Только во внутривидовых комбинациях генов MELl, MEL2 и MEL6 соотношение транзиций и трансверсий составляло от 2.42 до 4.11, что соответствует уровню межвидовой (между S. cerevisiae и S. paradoxus) дивергенции генов NAM2, ARG4 и MRS1. В случае генов MELu, MELb, MELpt и MELx данный коэффициент варьировал от 2.00 до 2.33, а самые низкие значения коэффициента, не превышающие 1.90, были отмечены при сравнении этих двух групп генов между собой, а также с генами MELJ и MELp. Пониженное соотношение транзиций к трансверсиям, отмеченное для генов MEL, может свидетельствовать о более ранней их дивергенции по сравнению с генами NAM2, ARG4 и MRS1. Еще одним возможным объяснением может служить иовыше!тая частота мутирования а-галактозидазных генов, обусловленная их локализацией в теломерных районах хромосом, которые, как известно, являются горячими трчками внутри- и межхромосомных рекомбинационных событий.

Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что эволюция а-галактозидазных и Р-фруктозидазных генов у дрожжей Saccharomyces шла неодинаково. Р-Фруктозидазные гены коэволюционировали с рибосомальной ДНК, тогда как а-галактозидазные гены оказались более дивергентными. В процессе их эволюции, очевидно, произошел горизонтальный перенос гена MEL между видами S. cerevisiae и S. paradoxus.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Коршунова, Ирина Викторовна, Москва

1. Бачинская А.А. История развития и культуры нового дрожжевогогрибка — Saccharomyces paradoxus II Журн. микробиол. 1914. Т. 1. № 3/5. С. 231-247.

2. Башкирова Е.В. Генетика ферментации а-метилглюкозида у дрожжей Saccharomyces cerevisiae И Автореферат диссертации на соиск. уч. степени канд. биол. наук. Москва. 1986.

3. Булат С.А., Мироненко Н.В. Идентификация микромицетов на основе видоспецифичных ПЦР паттернов // Выделение, идентификация и хранение микромицетов и других микроорганизмов. Вильнюс. 1990. С. 25-27.

4. Видершайн ГЛ. Биохимические основы гликозидозов / М.: Изд-во "Медицина". 1980.288с.

5. Захаров И.А., Мацелюх Б.П. Генетические карты микроорганизмов. Справочное пособие / Киев: Изд-во "Наукова Думка". 1986. 250с.

6. Козлов Д.Г., Сурина Е.П., Ефремов Б.Д., Вейко В.П., Беневоленский С.В. Корегуляция альтернативных транскриптов гена STA2 дрожжей Saccharomyces cerevisiae И Генетика. 2002. Т.38. №10. С. 1324-1329.

7. Кудрявцев В.И. Систематика дрожжей. / М.: Изд-во АН СССР. 1954. 427с.

8. Молекулярная клиническая диагностика. Методы, под ред. С. Херрингтона и Дж. Макги / М.: Изд-во "Мир". 1999. 558с.

9. Наумов Г.И. Сравнительная генетика дрожжей. Сообщение XVI. Гены сбраживания мальтозы у дрожжей Saccharomyces carlsbergensis NCYC 74 // Генетика. 1976. Т.12. №11. С. 87-100.

10. Наумов Г.И. Генетическая дифференциация и экология дрожжей Saccharomyces paradoxus Batschinskaia // ДАН. 1986. Т. 291. №3. С. 754-757.

11. Наумов Г.И. Идентификация полимерных генов ферментации мелибиозы у дрожжей Saccharomyces cerevisiae II ДАН. 1989. Т. 304. №6. С. 1475-1477.

12. Наумов Г.И. Естественное разнообразие дрожжей — неисчерпаемый генофонд для фундаментальных и прикладных разработок // Успехи совр. биол. 1997. Т. 117. вып. 2. С. 185-195.

13. Наумов Г.И. Дивергентная популяция дрожжей Saccharomyces paradoxus на Гавайях: вид in statu nascendi // ДАН. 1999. Т. 364. №2. С. 281-283.

14. Наумов Г.И. Новая разновидность Saccharomyces bayanus var. uvarum comb, nov., установленная генетическим анализом // Микробиология. 2000. Т. 69. №3. С. 410-414.

15. Наумов Г.И., Юркевич В.В. Изменчивость биохимических признаков, используемых в таксономии дрожжей Saccharomyces II Успехи совр. биол. 1970. Т. 70. вып. 3(6). С. 315-125.

16. Наумов Г.И., Кондратьева В.И., Наумова Т.И., Гудкова Н.К. Генетические основы классификации дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Изучение выживаемости аскоспор гибридов // Журнал общей биологии. 1983. Т. XLIV. №5. С. 648-660.

17. Наумов Г.И., Башкирова Е.В. К идентификации а-метилглюкозидных генов у дрожжей Saccharomyces cerevisiae II ДАН. 1984a. Т. 279. №6. С. 1496-1499.

18. Наумов Г.И., Башкирова Е.В. Сравнительная генетика дрожжей. Сообщение XXII. Детерминация сбраживания а-метилглюкозида мальтозными генами MAL 6е2 и malx у дериватов штамма Saccharomyces cerevisiae N.C.Y.C. 74 // Генетика. 19846. Т.20. №9. С. 1472-1479.

19. Наумов Г.И., Никоненко Т.А. Дивергенция геномов культурных и диких дрожжей Saccharomyces sensu stricto: четыре вида-двойника // ДАН. 1987. Т. 294. №2. С. 476-479.

20. Наумов Г.И., Никоненко Т.А. Восточная Азия — вероятная родина культурных дрожжей Saccharomyces cerevisiae II Изв. СО АН СССР. 1988. №20. вып. 3. С. 97-101.

21. Наумов Г.И., Наумова Е.С. Saccharomyces douglasii nom. nud. — синоним S. paradoxus согласно гибридологическому анализу // ДАН. 1990. Т. 311. №4. С. 975-977.

22. Наумов Г.И., Корхола М., Наумова Е.С., Бериташвили Д.Р., Ланто Р. Молекулярное кариотипирование биологических видов Saccharomyces cerevisiae, S. paradoxus и S. bayanus II ДАН. 1990. Т. 311. №5. С. 12421246.

23. Наумов Г.И., Наумова Е.С. Дикая популяция Saccharomyces cerevisiae обнаруженная в Сибири // Микробиология. 1991. Т. 60. вып. 3. С. 537540.

24. Наумов Г.И., Наумов Д.Г., Луис Э.Д. Локализация семейства а-галактозидазных генов MEL в правых и левых теломерах дрожжей // ДАН. 1995. Т. 341. №1. С. 134-136.

25. Наумов Г.И., Наумов Д.Г. Генетическое картирование нового дивергентного семейства а-галактозидазных генов MEL у дрожжей Saccharomyces cerevisiae II Биотехнология. 1997а. №1. С. 26-28.

26. Наумов Г.И., Наумов Д.Г. Суперсемейство а-галактозидазных генов MEL у дрожжей Saccharomyces cerevisiae II ДАН. 19976. Т. 353. №3. С. 426-429.

27. Наумов Д.Г. Филогенетический анализ а-галактозидаз семейства GH27 // Молекулярная биология. 2004. Т. 38. №3. С. 463-476.

28. Наумов Д.Г., Дорошенко В.Г. Р-Фруктозидазы: новое суперсемейство гликозил-гидролаз // Молекулярная биология. 1998. Т. 32. №5. С. 902907.

29. Наумова Е.С., Наумов Г.И., Майклз К.А., Бериташвили Д.Р. Идентификация хромосомных ДНК у дрожжей Saccharomyces bayanus и S. pastorianus И ДАН. 1991. Т. 316. №3. С. 744-746.

30. Наумова Е.С., Наумов Г.И., Корхола М. Молекулярные кариотипы различных генетических линий дрожжей Saccharomyces cerevisiae II Биотехнология. 1993. №4. С. 2-5.

31. Наумова Е.С., Жолудева М.В., Мартыненко Н.Н., Наумов Г.И. Молекулярно-генетическая дифференциация культурных дрожжей Saccharomyces II Микробиология. 2005. Т. 74. №2. С. 179-187.

32. Прайд Ф.Е., Лыоис Э.Д. Теломеры Saccharomyces cerevisiae II Биохимия. 1997. Т. 62. Вып. 11. С. 1442-1452.

33. Adjiri A., Chanet R., Mezard C., Fabre F. Sequence comparison of the ARGA chromosomal regions from the two related yeasts, Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces douglasii /I Yeast. 1994. V. 10, P. 309-317.

34. Andersen Т.Н., Hoffmann L., Grifone R., Nilsson-Tillgren Т., Kielland

35. Brandt M.C. Brewing yeast genetics // In Yeast Physiology. A New Era of

36. Opportunity. EBC Monograph 28. Nurnberg. Fachverlag. Hans Carl. 1999. pp. 140-147.

37. Azumi M., Goto-Yamamoto N. AFLP analysis of type strains and laboratory and industrial strains of Saccharomyces sensu stricto and its application to phenetic clustering II Yeast. 2001. V. 18. P. 1145-1154.

38. Barnett J.A. The utilization of disaceharides and some other sugars by yeasts // Adv. Carbhydr. Chcm. Biochem. 1981. V. 39. P. 347-404.

39. Barnett J.A., Payne R.W., Yarrow D. Yeasts: Characteristics and Identification / 2nd edn. Cambridge: Cambridge University Press. 1990.

40. Bicknell J.N., Douglas H.C. Nucleic acid homologies among species of Saccharomyces II J. Bacteriol. 1970. V.l 01. P. 505-512.

41. Bignell G.R., Evans I.H. Localization of glucoamylase genes of Saccharomyces cerevisiae by pulsed field gel electrophoresis // Ant. van Lceuwenhoek. 1990. V. 58. № 1. P. 49-55.

42. Bishop D.F., Kornreich R., Desnick R.J. Structural organization of the human a-galactosidase A gene: further evidence for the absence of 3'-untranslated region // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. V. 85. P. 39033907.

43. Bon E., Neuveglise C., Casaregola S., Artiguenave F., Wincker P., Aigle M., Durrens P. Genomic exploration of the hemiascomycetous yeasts: 5. Saccharomyces bayanus var. uvarum IIFEBS Lett. 2000. V. 487. P. 37-41.

44. Carle G.F., Olson M. V. Separation of chromosomal DNA molecules from yeast by orthogonal-ficld-altemation gel electrophoresis // Nucl. Acids Res. 1984. V. 12. P. 5647-5664.

45. Carle G.F., Olson M. V. An electrophoretic karyotype for yeast // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. V. 82. P. 3756-3760.

46. Carlson M., Botstein D. Two differentially regulated mRNAs with different 5'ends encode secreted and intracellular forms of yeast invertase // Cell. 1982. V. 28. P. 145-154.

47. Carlson M., Botstein D. Organization of the SUC gene family in Saccharomyces II Mol. Cell. Biol. 1983. V. 3. No. 3. P. 351-359.

48. Carlson M., Celenza J.L., Eng F.J. Evolution of the dispersed SUC gene family of Saccharomyces by rearrangements of chromosome telomeres // Mol. Cell. Biol. 1985. V. 5. No. 11. P. 2894-2902.

49. Casaregola S., Nguyen H.-V., Lapathitis G., Kotyk A., Gaillardin C. Analysis of the constitution of the beer yeast genome by PCR, sequencing and subtelomeric sequence hybridization // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2001. V. 51. P. 1607-1618.

50. Casey G.P. Molecular and genetic analysis of chromosome X in Saccharomyces carlsbergensis II Carlsberg Res. Commun. 1986. V. 51. P. 343-362.

51. Casey G.P., Pedersen M.B. DNA sequence polymorphisms in the genus Saccharomyces. V. Cloning and characterization of a LEU1 gene from S. carlsbergensis II Carlsberg Res. Commun. 1988. V. 53. P. 209-219.

52. Charron M.J., Dubin R.A., Michels C.A. Structural and functional analysis of the MALI locus of Saccharomyces cerevisiae II Mol. Cell. Biol. 1986. V. 6. P. 3891-3899.

53. Charron M.J., Read E., Haut S.R., Michels C.A. Molecular evolution of the telomere-associated MAL loci of Saccharomyces II Genetics. 1989. V. 122. P. 307-316.

54. Chow Т., Goldenthal M.J., Cohen J.D., Hegde M., Marmur J. Identification and physical characterization of yeast maltase structural genes // Mol. Gen. Genet. 1983. V. 191. P. 366-371.

55. Chow T.H.C., Sollitti P., Marmur J. Structure of the multigene family of MAL loci in Saccharomyces II Mol. Gen. Genet. 1989. V. 217. P. 60-69.

56. Cohen J.D., Goldenthal M.J., Chow Т., Buchferer В., Marmur J. Organization of the MAL loci of Saccharomyces. Physical identification and functional characterization of three genes at the MAL6 loci // Mol. Gen. Genet. 1985. V. 200. P. 1-8.

57. Delneri D., Colson I., Grammenoudi S., Roberts I.N., Louis E.J., Oliver S.G. Engineering evolution to study speciation in yeasts // Nature. 2003. V. 422. P. 68-72.

58. Denayrolles M., de Villechenon E.P., Lonvaud-Funel A., Aigle M. Incidence of SUC-RTM telomeric repeated genes in brewing and wild wine strains of Saccharomyces II Curr. Genet. 1997. V. 31. P. 457-461.

59. Dey P.M., Pridham J.B. Biochemistry of a-galactosidases // In Meister A. (eds.): Advances in enzymology and related areas of molecular biology. Interscience publishers, a division of John Wiley & Sons, New York, London, Sydney, Toronto, 1972.

60. Duarte F.L., Pais C., Spencer-Martins I., Leao C. Distinctive electrophoretic iosoenzyme profiles in Saccharomyces sensu stricto // Int. J. Syst. Bacterid.- 1999. V. 49. P. 1907-1913.

61. Edwards-Ingram L.C., Gent M.E., Hoyle D.C., Hayes A., Stateva L.I., Oliver S.G. Comparative genomic hybridization provides new insights into the molecular taxonomy of the Saccharomyces sensu stricto complex // Genome Res. 2004. V. 14. P. 1043-1051/

62. Enzyme nomenclature. Recommendations (1984) of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry / Orlando: Acad. Press. 1984. 176-204,306-324.

63. Felsenstein J. PHYLIP (Phylogenetic Inference Package), version 3,5c. / Department of Genetics, University of Washington, Seattle. 1993.

64. Fernandes-Espinar M.T., Barrio E., Querol A. Analysis of the genetic variability in the species of the Saccharomyces sensu stricto complex // Yeast. 2003. V. 20. P. 1213-1226.

65. Fischer G., James S.A., Roberts I.N., Oliver S.G., Louis E.S. Chromosomal evolution in Saccharomyces II Nature. 2000. V. 405. P. 451-454.

66. Fischer G., Neuveglise C., Durrens P., Gaillardin C., Dujon B. Evolution of gene order in the genomes of two related yeast species // Genome Res. 2001. V. 11. P. 2009-2019.

67. Fujii Т., Yoshimoto H., Nagasawa N., Bogaki Т., Tamai Y., Hamachi M. Nucleotide sequences of alcohol acetyltransferase genes from lager brewing yeast, Saccharomyces carlsbergensis И Yeast. 1996. V. 12. P. 593-598.

68. Fujimoto Z., Kaneko S., Momma M., Kobayashi H., Mizuno H. Crystal structure of rice a-galactosidase complexcd with D-galactose // J. Biol. Chem. 2003. V. 272. No. 22. P. 20313-20318.

69. Hall T.A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. // Nucl. Acids Symp. Ser. 1999. V.41.P. 95-98.

70. Hansen E.C. Undersogelser over alkoholgjaersvampenes fysiologi og morfologi. II. Om askosporedannelsen hos slaegten Saccharomyces II Medd. Carlsberg Lab. 1883. V. 2. P. 29-86.

71. Hansen E.C. Recherches sur la physiologie et la morphologie des ferments alcooliques // C.R. Trav. Lab. Carlsberg. 1888. V. 2. P. 143-167.

72. Hansen E.C. Grundlinien zur Systematik der Saccharomyceten II Zcntralbl. Bakteriol. Parasitenk. 1904. Abt II. B. 12. S. 529-538.

73. Hansen E.C. Recherches sur la physiologie et la morphologie des ferments alcooliques. XIII. Nouvelles etudes sur des levures de brasserie afermentation basse // Compte. Rend. Trav. Lab. Carlsberg. 1908. 7: 179217.

74. Hansen J., Kielland-Brandt M.C. Saccharomyces carlsbergensis contains two functional MET2 alleles similar to homologues from S. cerevisiae and S. monacensis II Gene. 1994. V. 140. P. 33-40.

75. Haupt W., Alps H. Uber die Vergarung der Melibiose durch Saccharomyces-S\amme /I Archiv. fur Mikrobiol. 1963. B.45. S. 179-187.

76. Hayford A.E., Jespersen L. Characterization of Saccharomyces cerevisiae strains from spontaneosly fermented maize dough by profiles of assimilation, chromosome polymorphism, PCR and MAL genotyping // J.Appl.Microbiol. 1999. V. 86. P. 284-294.

77. Henrissat B. A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities//Вiochem. J. 1991. V. 208. P. 309-316.

78. Herbert C.J., Macadre С., Becan A-M., Lazowska J., Slonimski P.P. The MRS\ gene of S. douglasii: co-evolution of mitochondrial introns and specific splicing proteins encoded by nuclear genes. // Gene Expr. 1992. V. 2. P. 203-214.

79. Hohmann S., Gozalbo D. Structural analysis of the 5' regions of yeast SUC genes revealed analogous palindromes in SUC, MAL and GAL // Mol. Gen. Genet. 1988. V. 211. P. 446-454.

80. Hohmann S., Gozalbo D. Comparison of the nucleotide sequences of a yeast gene family. I. Distribution and spectrum of spontaneous base substitutions II Mutation Res. 1989. V. 215. P. 79-87.

81. Hohmann S., Zimmermann F.K. Cloning and expression on a multicopy vector of five invertase genes of Saccharomyces cerevisiae II Curr. Genet. 1986. V. 11. P. 217-225.

82. Huffman J.L., Molina F.I., Jong S.-C. Authentication of ATCC strains in the Saccharomyces cerevisiae complex by PCR fingerprinting // Experimental Mycology. 1992. V. 16. P. 316-319.

83. Hunter N., Chambers S.R., Louis E.J., Borts R.H. The mismatch repair system contributes to meiotic sterility in an interspecific yeast hybrid // The EMBO Journal. 1996. V. 15. №7. P. 1726-1733.

84. Garman S.C., Hannick L., Zhu A., Garboczi D.N. The 1.9 A structure of a-N-acetylgalactosaminidase: molecular basis of glycosidase deficiency diseases // Structure. 2002. V. 10. P. 425-434.

85. Garman S.C., Garboczi D.N. The molecular defect leading to Fabry disease: structure of human a-galactosidase // J. Mol. Biol. 2004. V. 337. P. 319-335.

86. Gilliand R.B. The raffinose fermentation of Saccharomyces pastorianus and Saccharomyces bayanus II Ant. van Leeuwenhoek. 1969. V. 20. P. 286-294.

87. Gouliamova D.E., Henncbert G.L. Phylogenetic relationships in the Saccharomyces cerevisiae complex of species // Mycotaxon. 1998. V. LXVI. P. 337-353.

88. Gozalbo D., Hohmann S. Comparison of the nucleotide sequences of a yeast gene family. II. Analysis of spontaneous deletions and insertions // Mutation Res. 1989a. V.215.P. 89-94.

89. Gozalbo D., Hohmann S. The naturally occurring silent invertase structural gene suc2° contains an amber stop codon that is occasionally read through //- Mol. Gen. Genet. 1989b. V. 216. P. 511-516.

90. Gozalbo D., del Castillo Agudo L. Differential expression of SUC genes: A question of bases // FEMS Microbiol. Reviews. 1994. V. 15. P. 1-7.

91. Greig D., Borts R-H., Louis E.J., Travisano M. Epistasis and hybrid srerility in Saccharomyces И Proc. R. Soc. Lond. 2002a. V. 269. P. 1167-1171.

92. Grcig D., Louis E.J., Borts R.H., Travisano M. Hybrid speciation in experimental populations of yeast // Science. 2002b. V. 289. P. 1773-1775.

93. Greig D., Travisano M., Louis E.J., Borts R.H. A role for the mismatch repair system during incipient speciation in Saccharomyces II J. Evol. Biol. 2003. V. 18. P. 429-437.

94. Guilliermond A. Monographic des levures rapportees d'Afrique Occidentale par la mission Chevalier// Ann. Sci. Nat. 9 Ser. Bot. 1914. V. 19. P. 1-32.

95. Jayadeva Bhat P., Murthy T.V.S. Transcriptional control of the GAL/MEL regulon of yeast Saccharomyces cerevisiae: mechanism of galactose-mediated signal transduction // Molecular Microbiol. 2001. V. 40(5). P. 1059-1066.

96. Joscpa S., Guillamon J.M., Cano J. PCR differentiation of Saccharomyces cerevisiae from Saccharomyces bayanus / Saccharomyces pastorianus using specific primers // FEMS Microbiol. Lett. 2000. V. 193. P. 255-259.

97. Joubert R., Brignon P., Lehmann C., Monribot C., Gendre F., Boucherie H. Two-dimensional gel analysis of the proteome of lager brewing yeasts // Yeast. 2000. V. 16. P. 511-522.

98. Kaneko Y., Banno I. Reexamination of Saccharomyces bayanus strains by DNA-DNA hybridization and electrophoretic karyotyping // IFO Res. Comm. 1991. V. 15. P. 30-41.

99. Kellis M., Patterson N., Endrizzi M., Birren В., Lander E.S. Sequencing and comparison of yeast species to identify genes and regulatory elements // Nature. 2003. V. 423. P. 241-254.

100. Kew O.M., Douglas H.C. Genetic co-regulation of the galactose and melibiose utilization in Saccharomyces II J. Bacteriol. 1976. V. 125. No. 1. P. 33-41.

101. Kielland-Brandt M.C., Nilsson-Tillgren Т., Gjermansen C., Holmberg S., Pedersen M.B. Genetics of brewing yeasts // In Rose, A.H., Wheals, A.E., Harrison, J.S. (eds.): The Yeast, Second Edition. Academic Press. London. 1995. V. 6. P. 223-254.

102. Kurtzman C.P. Molecular taxonomy of the fungi // In Bennett, J.W. & Lasure L.L. (eds.): Gene manipulations in fungi. Academic Press. New York. 1985.

103. Kurtzman C.P. Systematics and taxonomy of yeasts // In Ernst, J.F., Schmidt A. (eds.): Dimorphism in human pathogenic and apathogenic yeasts. Contrib. Microbiol. Basel. Karger. 2000. V. 5. P. 1-14.

104. Kurtzman C.P., Fell J.M. The Yeasts a Taxonomic Study. / Amsterdam: Elsevier Science Publ. 1998. 1055p.

105. Kurtzman C.P., Robnett C.J. Identification and phylogeny of ascomycetous yeasts from analysis of nuclear large subunit (25S) ribosomal DNA partial sequences // Ant. van Leeuwenhoek. 1998. V. 73. P. 331-371.

106. Kurtzman C.P., Robnett C.J. Phylogenetic relationships among yeasts of the "Saccharomyces complex" determined from multigene sequence analyses // FEMS Yeast Res. 2003. V. 3. P. 417-432.

107. Lalo D., Stettler S., Mariotte S., Slonimski P.P., Thuriaux P. Two yeast chromosomes are related by a fossil duplication of their centromeric regions // C. R. Acad. Sci. Paris, Sciences de la vie/Life sciences. 1993. V. 316. P. 367-373.

108. Lambrechts M.G., Pretorius I.S., Marmur J., Sollitti P. The SI, S2 and SGA\ ancestral genes for the STA glucoamylase genes all map to chromosome IX in Saccharomyces cerevisiae II Yeast. 1995. V. 11. № 8. P. 783-787.

109. Langkjasr R.B., Cliften P.F., Johnston M., Piskur J. Yeast genome duplication was followed by asynchronous differentiation of duplicated genes //Nature. 2003. V. 421. P. 848-852.

110. Li G.-Y., Tian G.-L., Slonimski P.P., Herbert C.J. The CBP2 gene from

111. Saccharomyces douglasii is a functional homologue of the Saccharomycescerevisiae gene and is essential for respiratory growth in the presence of a wild-type (intron-containing) mitochondrial genome // Mol. Gen. Genet. 1996. V. 250. P. 316-322.

112. Liljestrom P. The nucleotide sequence of the MELI gene // Nucl. Acids Res. . 1985. V. 13. No. 20. P. 7257-7268.

113. Liljestrom P.L., Liljestrom P. Nucleotide sequence of the melA gene, coding for a-galactosidase in Escherichia coli K-12 // Nucl. Acids Res. 1987. V. 15. P. 2213-2220.

114. Lodder J., Kreger-van Rij N.J.W. The Yeast, a Taxonomic Study. / North-Holland publishing company, Amsterdam. 1952.

115. Louis E.J., Borts R.H. Л complete set of marked telomeres in Saccharomyces cerevisiae for physical mapping and cloning // Genetics. 1995. V. 139. P. 125-136.

116. Louis E.J., Haber J.E. The subtelomeric Y'repeat family in Saccharomyces cerevisiae: An experimental system for repeated sequence evolution // Genetics. 1990a. V. 124. P. 533-545.

117. Louis E.J., Haber J.E. Mitotic recombination among subtelomeric Y'repeats in Saccharomyces cerevisiae II Genetics. 1990b. V. 124. P. 547-559.

118. Louis E.J., Haber J.E. Evolutionarily recent transfer of a group I mitochondrial intron to telomere regions in Saccharomyces cerevisiae II Curr. Genet. 1991. V. 20. P. 411-415.

119. Louis E.J., Haber J.E. The structure and evolution of subtelomeric Y'repeats in Saccharomyces cerevisiae II Genetics. 1992. V. 131. P. 559-574.

120. Louis E.J., Naumova E.S., Lee A., Naumov G., Haber J.E. The chromosome end in yeast: its mosaic nature and influence on recombinational dynamics // Genetics. 1994. V. 136. P. 789-802.

121. Margolles-Clark E., Tenkanen M., Luonteri E., Penttila M. Three a-galactosidase genes of Trichoderma reesei cloned by expression in yeast // Eur. J. Biochem. 1996. V. 240. P. 104-111.

122. Marinoni G., Manuel M., Petersen R.F., Hvidtfcldt J., Sulo P., Piskur J. Horizontal transfer of genetic material among Saccharomyces yeasts // J.

123. Bacterid. 1999. V. 181. №20. P. 6488-6496.

124. Martin I., Debarbouille M., Ferrari E., Klicr A., Rapoport G. Characterization of the levanase gene of Bacillus subtilis which shows homology to yeast invertase. Mol. Gen. Genet. 1987. V.208. P. 177-184.

125. Masncuf L, Aigle M., Dubourdieu D. Development of a polymerase chain reaction / restriction fragment length polymorphism method for

126. Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces bayanus identification in ecology// FEMS Microbiol. Lett. 1996. V. 138. P. 239-244.

127. Masneuf I., Hansen J., Groth C., Piskur J., Dubourdieu D. New hybrids between Saccharomyces sensu stricto yeast species found among wine and cider production strains // Appl. Environ. Microbiol. 1998. V. 64. P. 38873892.

128. Mayr E. Systematics and the origin of species / New York: Columbia University Press. 1942.

129. Meng G., Fiitterer K. Structural framework of fructosyl transfer in Bacillus subtilis levansucrase // Nat Struct Biol. 2003. V. 10 №11. P. 935-941.

130. Meyen J., Jahresbericht iiber die Resultate der Arbeiten im Felde der physiologischen Botanik von der Jahrc // Arch. Naturgesch. zweiter Band. 1838. V. 4. P. 1-186.

131. Michels C.A., Needleman R.B. The dispersed, repeated family of MAL loci in Saccharomyces spp. // J. Bacteriol. 1984. V. 157. P. 949-952.

132. Molina F.I., Jong Sh.-Ch., Huffman J.L. PCR amplification of the 3'-extemal transcribed and itergenic spacers of the ribosomal DNA repeat unit in three species of Saccharomyces II FEMS Microbiol. Lett. 1993. V. 108. P. 259-264.

133. Molnar O., Messner R., Prillinger H., Stahl U., Slavikova E. Genotypic identification of Saccharomyces species using random amplified polymorphic DNA analysis // System. Appl. Microbiol. 1995. V. 18. P. 136145.

134. Montrocher R., Verner M.-C., Briolay J., Gautier C., Marmeisse R. Phylogenetic analysis of Saccharomyces cerevisiae group based onpolymorphisms of rDNA spacer sequences // Int. J. Syst. Bacterid. 1998. V. 48. P. 295-303.

135. Mortimer R.K., Contopoulou C.R., King J.S. Genetic and physical maps of Saccharomyces cerevisiae, edition 11 // Yeast. 1992. V. 8. P. 817-902.

136. Nau J.J., Summers K.R., Galbraith A.M., Bullard S.A., Malone R.E. Isolation of early meiotic recombination genes analogous to S. cerevisiae REC\№ from the yeasts S. paradoxus and S. pastorianus II Curr. Genet. 1997. V.31.P. 7-14.

137. Naumoff D.G. P-Fructosidase superfamily: homology with some a-L-arabinases and P-D-xylosidases // Prot. Struct. Funct. Genet. 2001. V.42. P.66-76.

138. Naumov G.I. Genetic identification of biological species in the Saccharomyces sensu stricto complex // J. Indust. Microbiol. 1996. V. 17. P. 295-302.

139. Naumov G., Turakainen H., Naumova E., Aho S., Korhola M. A new family of polymorphic genes in Saccharomyces cerevisiae: a-galactosidase genes MELl-MELl И Mol. Gen. Genet. 1990. V. 224. P. 119-128.

140. Naumov G., Naumova E., Turakainen H., Suominen P., Korhola M. Polymeric genes MEL&, MEL9 and MEL10 new members of a-galactosidase gene family in Saccharomyces cerevisiae I I Curr. Genet. 1991. V. 20. P. 269-276.

141. Naumov G.I., Naumova E.S., Lantto R.A., Louis E.J., Korhola M. Genetic homology between Saccharomyces cerevisiae and its sibling species S. paradoxus and S. bayanus: electrophoretic karyotypes // Yeast. 1992. V. 8. P. 599-612.

142. Naumov G.I., Naumova E.S., Korhola M., Azbukina Z.M., Gaillardin C. Genetic and karyotypic identification of Saccharomyces yeasts from Far East Asia // Cryptogam. Mycol. 1993a. V. 14. P. 85-93.

143. Naumov G.I., Naumova E.S., Sancho E.D., Korhola M. Taxogenetics of the Sacharomyces sensu stricto yeasts from Western and South Africa // Cryptogam. Mycol. 1993b?. V. 4. P. 263-270.

144. Naumov G.I., Naumova E.S., Gaillardin C., Turakainen H., Korhola M. Identification of new chromosomes of Saccharomyces bayanus using gene probes from S. cerevisiae II Hereditas. 1994a. V. 120. P. 121-126.

145. Naumov G.I., Naumova E.S., Michels C.A. Genetic variation of the repeated MAL loci in natural populations of Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces paradoxus II Genetics. 1994b. V. 136. P. 803-812.

146. Naumov G.I., Naumova E.S., Korhola M. Karyotypic relationships among species of Saccharomyces sensu lato: S. castellii, S. dairensis, S. unisporus and S. servazziill Syst. Appl. Microbiol. 1995a. V. 18. P. 103-108.

147. Naumov G.I., Naumova E.S., Hagler A.N., Mendon9a-Hagler L.C., Louis E.J. A new genetically isolated population of the Saccharomyces sensu stricto complex from Brazil // Ant. van Leeuwenhoek. 1995b. V. 67. P. 351355.

148. Naumov G.I., Naumova E.S., Louis E.J. Two new genetically isolated populations of the Saccharomyces sensu stricto complex from Japan // J. Gen. Appl. Microbiol. 1995c. V. 41. P. 499-505.

149. Naumov G.I., Naumova E.S., Louis E.J. Genetic mapping of the a-galactosidase MEL gene family on right and left telomeres of Saccharomyces cerevisiae // Yeast. 1995d. V. 11. P. 481-483.

150. Naumov G.I., Naumova E.S., Korhola M.P. Chromosomal polymorphism of MEL genes in some populations of Saccharomyces cerevisiae II FEMS Microbiol. Lett. 1995e. V. 127. P. 41-45.

151. Naumov G.I., Naumova E.S., Sancho E.D. Genetic reidentification of Saccharomyces strains associated with black knot disease of trees in Ontarioand Drosophila species in California // Can. J. Microbiol. 1996a. V. 42. P. 335-339.

152. Naumov G.I., Naumova E.S., Turakainen H., Korhola M.P. Identification of the a-galactosidase MEL genes in some populations of Saccharomyces cerevisiae: a new gene MELX 1 // Genet. Res. Camb. 1996b. V. 67. P. 101108.

153. Naumov G.I., Naumova E.S., Sancho E. D., Korhola M.P. Polymeric SUC genes in natural populations of Saccharomyces cerevisiae // FEMS Microbiol. Lett. 1996c. V. 135. P. 31-35.

154. Naumov G.I., Naumova E.S., Sniegowski P.D. Differentiation of European and Far East Asian populations of Saccharomyces paradoxus by allozyme analysis // Int. J. System. Bacterid. 1997a. V. 47. P. 341-344.

155. Naumov G.I., Naumova E.S., Querol A. Genetic study of natural introgression supports delimitation of biological species in the Saccharomyces sensu stricto complex // System. Appl. Microbiol. 1997b. V. 20. P. 595-601.

156. Naumov G.I., Naumova E.S., Sniegowski P.D. Saccharomyces paradoxus and Saccharomyces cerevisiae are associated with exudates of North American oaks // Can. J. Microbiol. 1998. V. 44. P. 1045-1050.

157. Naumov G.I., Naumova E.S., Masneuf I., Aigle M., Kondratieva V.I., Dubourdieu D. Natural polyploidization of some cultured yeast Saccharomyces sensu stricto: auto- and allotetraploidy // System. Appl. Microbiol. 2000b. V. 23. P. 442-449.

158. Naumova E.S., Naumov G.I., Korhola M. Use of molecular karyotyping for differentiation of species in the heterogeneous taxon Saccharomyces exiguus Hi. Gen. Appl. Microbiol. 1996a. V. 42. P. 307-314.

159. Naumova E.S., Turakainen H., Naumov G.I., Korhola M. Superfamily of a-galactosidase MEL genes of the Saccharomyces sensu stricto species complex//Mol. Gen. Genet. 1996b. V. 253. P. 111-117.

160. Naumova E.S., Naumov G.I., Molina F.I. Genetic variation among European strains of Saccharomyces paradoxus: results from DNA fingerprinting // Syst. Appl. Microbiol. 2000. V. 23. P. 86-92.

161. Naumova E.S., Bulat S.A., Mironenko N.V., Naumov G.I. Differentiation of six sibling species in the Saccharomyces sensu stricto complex by multilocus enzyme electrophoresis and UP-PCR analysis // Ant. van Leeuvvenhoek. 2003. V. 83. P. 155-166.

162. Needleman R. Control of maltase synthesis in yeast // Mol. Microbiol. 1991. V. 5. № 9. P. 2079-2084.

163. Nehlin J.O., Carlberg M., Ronne H. Control of yeast GAL genes by M1G1 repressor: a transcriptional cascade in the glucose response // EMBO J. 1991. V. 10. No. 11. P. 3373-3377.

164. Ness F., Aigle M. RTM\: A member of a new family of telomeric repeated genes in yeast // Genetics. 1995. V. 140. P. 945-956.

165. Nilsson-Tillgren T.J., Petersen J.G.L., Holmberg S., Kielland-Brandt M.C. Transfer of chromosome III during kar mediated cytoduction in yeast // Carlsberg Res. Commun. 1980. V. 45. P. 113-117.

166. Nilsson-Tillgren Т., Gjermansen C., Holmberg S., Petersen J.G.L., Kielland-Brandt M.C. Analysis of chromosome V and the ILV1 gene from Saccharomyces carlsbergensis II Carlsberg Res. Commun. 1986. V. 51. P. 309-326.

167. Oda Y., Tonomura K. a-Galactosidase from the yeast Torulaspora delbrueckii IFO 1255 // J. Appl. Bacterid. 1996. V. 80. P. 203-208.

168. Oda Y., Yabuki M., Tonomura K., Fukunaga M. A phylogenetic analysis of Saccharomyces species by the sequence of 18S-28S rRNA spacer regions // Yeast. 1997. V. 13. P. 1243-1250.

169. Oda Y., Yabuki M., Tonomura K., Fukunaga M. Sequence analysis of 18S-28S rRNA spacer regions from Saccharomyces kunashirensis, S. martiniae, S. rosinii and S. transvaalensis II Curr. Microbiol. 1999. V. 38. P. 61-63.

170. Oda Y., Fukunaga M. Isolation and characterization of MELt gene from Torulaspora delbrueckii IFO 1255 //Yeast. 1999. V. 15. P. 1797-1801.

171. Oda Y., Fujisawa T. Nucleotide sequence of a-galactosidase MEL gene from Zygosaccharomyces mrakii II Curr. Microbiol. 2000. V. 41. P. 220222.

172. Oda Y., Fujisawa T. Intraspecific divergence of Saccharomyces kluyveri as revealed by the nucleotide sequences of 18S-28S rRNA spacer regions and a-galactosidase MEL genes // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2001. V. 65. P. 164-166.

173. Parets-Soler A. Base substitutions in the 5' non-coding regions of two naturally occurring yeast invertase structural SUC genes cause strongdifferences in specific invertase activities // Curr. Genet. 1989. V. 15. P. 299-301.

174. Pedersen M.B. DNA sequence polymorphisms in the genus Saccharomyces. III. Restriction endonuclease fragment patterns of chromosomal regions in brewing and other yeast strains // Carlsberg Res. Commun. 1986. V. 51. P. 163-183.

175. Peterson S.W., Kurtzman C.P. Ribosomal RNA sequence divergence among sibling species of yeasts // Syst. Appl. Microbiol. 1991. V. 14. P. 124-129.

176. Petersen J.G.L., Nilsson-Tillgren Т., Kielland-Brandt M.C., Gjermansen C., Holmberg S. Structural heterozygosis at genes JLV2 and JLV5 in Saccharomyces carlsbergensis И Curr. Genet. 1987. V. 12. P. 167-174.

177. Piskur J., Langkjaer R.B. Yeast genome sequencing: the power of comparative genomics //Mol. Microbiol. 2004. V. 52. №2. P. 381-389.

178. Pons Т., Olmea O., Chinea G., Beldarrain A., Marquez G., Acosta N., Rodriguez L., Valencia A. Structural model for family 32 of glycosyle-hydrolase enzymes // Prot. Struct. Funct. Genet. 1998. V. 33. P. 383-395.

179. Pons Т., Naumoff D.G., Martmez-Fleites C., Hernandez L. Three acidic residues are at the active site of P-propeller architecture in glycoside hydrolase families 32, 43, 62 and 68 // Prot. Struct. Funct. Genet. 2004. V. 54. P. 424-432.

180. Pretorius I.S., Chow Т., Marmur J. Identification and physical characterization of yeast glucoamylase structural genes // Mol. Gen. Genet. 1986. V. 203. P. 36-41.

181. Pretorius I.S., Marmur J. Localization of yeast glucoamylase genes by PFGE and OFAGE// Curr. Genet. 1988. V. 14. №1. P. 9-13.

182. Pretorius I.S., Lambrechts M.G., Marmur J. The glucoamylase multigene family in Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus'. an overview // Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 1991. V. 26. № 1. P. 53-76.

183. Price C.W., Fuson G.B., Phaff H.J. Genome comparison in yeast systematics: delimitation of species within the genera Schwanniomyces,

184. Saccharomyces, Debaryomyces and Pichia // Microbiol. Rev. 1978. V. 24. P. 161-193.

185. Pryde F.E., Huckle T.C., Louis E.J. Sequence analysis of the right end of chromosome XV in Saccharomyces cerevisiae: an insight into the structural and functional significance of sub-telomeric repeat sequences // Yeast. 1995. V. 11. P. 371-382.

186. Rainieri S., Zambonelli C., Hallsworth J.E., Pulvirenti A., Giudici P. Saccharomyces uvarum, a distinct group within Saccharomyces sensu stricto //FEMS Microbiol. Lett. 1999. V. 177. P. 177-185.

187. Ragnini A., Grisanti P., Rinaldi Т., Frontali L., Palleschi C. Mitochondrial genome of Saccharomyces douglasii: genes coding for components of the protein synthetic apparatus // Curr. Genet. 1991. V. 19. P. 169-174.

188. Reess M., Botanische Untersuchungen liber die Alkoholgarhungspilze / 1870. Felix, Leipzig.

189. Reddy V.A., Maley F. Identification of an active-site residue in yeast invertase by affinity labeling and site-directed mutagenesis // J. Biol. Chem. 1990. V. 265. No. 19. P. 10817-10820.

190. Reddy A., Maley F. Studies on identifying the catalytic role of Glu-204 in the active site of yeast invertase // J. Biol. Chem. 1996. V. 271. No. 24. P. 13953-13958.

191. Roberts C., Ganesan A.T., Haupt W. Genetics of melibiose fermentation in Saccharomyces italicus var. melibiosi // Heredity. 1959. V. 13. P. 499-517.

192. Ruohola H., Liljestrom P.L., Torkkeli Т., Кори H., Lehtinen P., Kalkkinen N., Korhola M. Expression and regulation of the yeast MELl gene // FEMS Microbiol. Lett. 1986. V. 34. P. 1779-185.

193. Ryu S.-L., Murooka Y., Kaneko Y. Genomic reorganization between two sibling yeast species, Saccharomyces bayanus and Saccharomyces cerevisiae II Yeast. 1996. V. 12. P. 757-764.

194. Ryu S.-L., Mikata K., Murooka Y., Kaneko Y. A simple PCR method for distinguishing Saccharomyces cerevisiae from its sibling species by amplification of the RPL2 region // J. of Fermentation and Bioengineering. 1998a. V. 86. P. 249-252.

195. Ryu S.-L., Murooka Y., Kaneko Y. Reciprocal translocation at duplicated RPL2 loci might cause speciation of Saccharomyces bayanus and Saccharomyces cerevisiae II Curr. Genet. 1998b. V. 33. P. 345-351.

196. Sarokin L., Carlson M. Comparison of two yeast invertase genes: conservation of the upstream regulatory region // Nucl. Acids Res. 1985. V. 13. No. 17. P. 6089-6103.

197. Sarokin L., Carlson M. Short repeated elements in the upstream regulatory region of the SUC2 gene of Saccharomyces cerevisiae II Mol. Cell. Biol. 1986. V. 6. No. 7. P. 2324-2333.

198. Scheda R., Yarrow D. The instability of physiological properties used as criteria in the taxonomy of yeasts // Arch. Mikrobiol. 1966. V. 55. P. 209225.

199. Scheda R., Yarrow D. Variation in the fermentation pattern of some Saccharomyces species //Arch. Mikrobiol. 1968. V. 61. P. 310-316.

200. Shibuya H, Kobayashi H, Kasamo K, Kusakabe I. Nucleotide sequence of alpha-galactosidase cDNA from Mortierella vinacea // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1995. V. 59. P. 1345-1348.

201. Schonberger O., Knox C., Bibi E., Pines O. Split invertase polypeptides form functional complexes in the yeast periplasm in vivo II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 9612-9617.

202. Smole Mozina S., Dlauchy D., Deak Т., Raspor P. Identification of Saccharomyces sensu stricto and Torulaspora yeasts by PCR ribotyping // Letters in Appl. Microbiol. 1997. V. 24. P. 311-315.

203. Spfrek M., Yang J., Groth C., Petersen R.F., Langkjasr R.B., Naumova E.S., Sulo P., Naumov G.I., Piskur J. High-rate evolution of Saccharomyces sensu lato chromosomes // FEMS Yeast Res. 2003. V. 3. P. 363-373.

204. Stelling-Dekker N.M. Die Hefesammlung des "Centraalbureau voor Schimmelcultures", Beitrage zu einer Monographic der Hefearten I. Teil, die sporogenen Hefen // Verh. K. Ned. Akad. Wet. Afd. Natuurk., Sect. II. 1931. V. 28. P. 1-547.

205. Sumner-Smith M., Bozzato R.P., Skipper N., Davies R.W., Hopper J.E. Analysis of the inducible MELX gene of Saccharomyces carlsbergensis and its secreted product, alpha-galactosidase (melibiase) // Gene. 1985. V. 36. P. 333-340.

206. Tamai Y., Momma Т., Yoshimoto H., Kaneko Y. Co-existence of two types of chromosome in the bottom fermenting yeast, Saccharomyces pastorianus II Yeast. 1998. V. 14. P. 923-933.

207. Tamaki H., Genetic studies of ability to ferment starch in Saccharomyces: gene polymorphism // Mol. Gen. Genet. 1978. V. 164. P. 205-209.

208. Taussing R., Carlson M. Nucleotide sequence of SUC2 gene for invertase //

209. Nucleic Acids Res. 1983. V. 11. P. 1943-1954.

210. Torchia Т.Е., Hopper J.E. Genetic and molecular analysis of the GAL3 gene in the expression of the galactose/melibiose regulon of Saccharomyces cerevisiae //Genetics. 1986. V. 113. P. 229-246.

211. Tubb R.S., Liljestrom P.L. A colony-colour method which differentiates a-galactosidase-positive strains of yeast // J. Inst. Brew. 1986. V. 92. P. 588590.

212. Turakainen H., Korhola M., Aho S. Cloning, sequence and chromosomal location of a MEL gene from Saccharomyces carlsbergensis NCYC396 // Gene. 1991. V. 101. P. 97-104.

213. Turakainen H., Naumov G., Naumova E., Korhola M. Physical mapping of the MEL gene family in Saccharomyces cerevisiae II Curr. Genet. 1993a. V. 24. P. 461-464.

214. Turakainen H., Aho S., Korhola M. MEL gene polymorphism in the genus Saccharomyces II Appl. Environ. Microbiol. 1993b. V. 59. No. 8. P. 26222630.

215. Turakainen H., Kristo P., Korhola M. Consideration of the evolution of the Saccharomyces cerevisiae MEL gene family on the basis of the nucleotide sequences of the genes and their flanking regions // Yeast. 1994a V. 10. P. 1559-1568.

216. Turakainen H., Hankaanpaa M., Korhola M., Aho S. Characterization of MEL genes in the genus Zygosaccharomyces II Yeast. 1994b. V. 10. P. 733745.

217. Valente P., Ramos J.P., Leoncini O. Sequencing as a tool in yeast molecular taxonomy // Can. J. Microbiol. 1999. V. 45. P. 949-958.

218. Vaughan Martini A., Kurtzman C.P. Deoxyribonucleic acid relatedness among species of the genus Saccharomyces sensu stricto // Int. J. Syst. Bacteriol. 1985. V. 35. P. 508-511.

219. Vaughan Martini A., Martini A. Three newly delimited species of Saccharomyces sensu stricto // Antonie van Leeuwenhoek. 1987. V. 53. P. 77-84.

220. Vaughan Martini A. Saccharomyces paradoxus comb, nov., a newly separated species of the Saccharomyces sensu stricto complex based upon nDNA/nDNA homologies // System. Appl. Microbiol. 1989. V. 12. P. 179182.

221. Vaughan Martini A., Martini A., Cardinali G. Electrophorctic karyotyping as a taxonomic tool in the genus Saccharomyces // Ant. van Leeuwenhoek. 1993. V. 62. P. 145-156.

222. Vaughan Martini A. Saccharomyces barnetti and Saccharomyces spencerorum: two new species of Saccharomyces sensu lato (van der Walt) // Ant. van Leeuwenhoek. 1995. V. 68. P. 111-118.

223. Williams J.G.K., Kubelic A.R., Livak K.J., Rafaski J.A., Tingey S.V. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers // Nucl. Acid Res. 1990. V. 18. P. 6531-6535.

224. Willstatter R. Uber Saccharase. Untersuchungen iiber Enzyme. Bd. 1. Berlin. 1928.

225. Winge O., Laustsen O. On 14 new yeast types, produced by hybridization // C. R. Trav. Lab. Carlsberg Ser. Physiol. 1939. V. 22. P. 337-355.

226. Wolfe K.H., Shields D.C. Molecular evidence for an ancient duplication of the entire yeast genome //Nature. 1997. V. 387. P. 708-713.

227. Wong S., Butler G., Wolfe K.H. Gene order evolution and paleopolyploidy in hemiascomyccte yeasts // PNAS. 2002. V. 99. №14. P. 9272-9277.

228. Xie Q., Jimenez A. Cloning and molecular analysis of two different JLV5 genes from a brewing strain of Saccharomyces cerevisiae II Curr. Genet. 1994. V. 26. P. 398-402.

229. Yamada Y., Mikata K., Banno I. Reidentification of 121 strains of the genus Saccharomyces II Bull JFCC. 1993. V. 9. P. 95-119. (in Japanese).

230. Yamagishi H., Ogata T. Chromosomal structures of bottom fermenting yeasts // System. Appl. Microbiol. 1999. V. 22. P. 341-353.

231. Yamane S., Karashima H., Matsuzaki H., Hatano Т., Fukui S. Isolation of centromeric DNA from Saccharomyces bayanus И J. Gen. Appl. Microbiol. 1999. V. 45. P. 89-92.

232. Yamashita I., Maemura Т., Hatano Т., Fukui S. Polymorphic extracellular glucoamylase genes and their evolutionary origin in the yeast Saccharomyces diastaticus И J. Bacteriol. 1985a. V. 161. №2. P. 574-582.

233. Yamashita I., Suzuki K., Fukui S. Nucleotide sequence of the extracellular glucoamylase gene STA\ in the the yeast Saccharomyces diastaticus II J. Bacteriol. 1985b. V. 161. №2. P. 567-573.

234. Yamashita I., Nakamura M., Fukui S. Gene fusion is a possible mechanism underlying the evolution of STA\ 11 J. Bacteriol. 1987. V. 169. №5. P. 21422149.N

235. Yarrow D. Genus 22. Saccharomyces Meyen ex Reess. // In Kreger-van Rij, N. J. W. (Ed.), The Yeasts, a Taxonomic Study, 3rd edn. Elsevier Science Publishers, Amsterdam, pp. 379-395.

236. Zakian V.A. Structure, function, and replication of Saccharomyces cerevisiae telomeres//Ann. Rev. Genet. 1996. V. 30. P. 141-172.

237. Zhu Л., Goldstein J. Cloning and functional expression of a cDNA encoding coffee bean a-galactosidase // Gene (Amst.). 1994. V. 140. P. 227-231.

Информация о работе

Коршунова, Ирина Викторовна
кандидата биологических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.15

Диссертация

Эволюционная генетика α-галактозидаз и β-фруктозидаз дрожжей рода Saccharomyces - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы