Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетический контроль метаболизма 6-гидроксиламинопурина у дрожжей Saccharomyces cerevisiae и бактерий Escherichia coli

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Козьмин, Станислав Геннадьевич

СПИСОК ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Аналог 6-гидроксиламинопурин.

1.1.1. Биологическая активность 6-гидроксиламинопурина.

1.1.2. Возможные способы образования ГАП in vivo.

1.1.3. Влияние систем репарации и репликации на чувствительность клетки к мутагенному действию 6-гидроксиламинопурина.

1.2. Метаболизм пуринов у Е. coli и S. cerevisiae.

1.2.1. Биосинтез пуринов de novo.

1.2.1.1. Сравнительная характеристика биосинтеза ИМФ de novo у Е. coli и S. cerevisiae.

1.2.1.2. Репрессия биосинтеза de novo экзогенными пуринами.

1.2.2. Биосинтез адениловых и гуаниловых нуклеотидов из ИМФ.

1.2.3. Ферменты, участвующие в утилизации и взаимопревращении пуринов.

1.2.4. Основные способы утилизации пуринов.

1.3. Постановка задачи.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Штаммы и плазмиды, использованные в работе.

2.1.1. Штаммы дрожжей.

2.1.2. Штаммы бактерий.

2.1.3. Бактериофаги.

2.1.4. Плазмиды.

2.1.4.1. Исходные плазмиды.

2.1.4.2. Плазмиды, полученные в ходе выполнения работы.

2.2. Среды и условия культивирования.

2.3. Аналоги оснований.

2.4. Генетические и микробиологические методы.

2.4.1. Дрожжи.

2.4.1.1. Стандартные генетические методики.

2.4.1.2. Качественный тест на индукцию прямых мутаций устойчивости к канаванину или адипату.

2.4.1.3. Определение частот спонтанных мутантов, устойчивых к канаванину.

2.4.1.4. Индукция промотора гена PHÖ5.

2.4.1.5. Проверка способности штаммов усваивать аналоги пуринов.

2.4.2. Бактерии.

2.4.2.1. Стандартные генетические методики.

2.4.2.2. Качественный тест на токсичное действие аналогов.

2.4.2.3. Оценка токсичного действия аналогов по количеству выживших клеток с помощью измерения оптических рассеяний культур.

2.4.2.4. Количественный тест на индукцию прямых мутаций в гене Rif.

2.4.2.5. Метод локального мутагенеза.

2.4.2.6. Тестирование штаммов на чувствительность к хлорату калия.

2.5. Молекулярно-генетические методы.

2.5.1. Стандартные молекулярно-генетические методы.

2.5.2. Проверка дизрупций гена НАМ1 блот-гибридизацией по Саузерну.

2.5.3. Амплификация гена НатА (о197). Амплификация и секвенирование му тантных аллелей гена Мое А.

2.6. Биохимические методы.

2.6.1. Приготовление проб для электрофореза белков.

2.6.2. Электрофорез белков.

2.6.3. Тестирование аденинаминогидролазы in vivo.

2.6.4. Приготовление дрожжевых экстрактов.

2.6.5. Тестирование аминогидролазной активности в клеточных экстрактах.

2.6.6. Тестирование 5'-нуклеотидазной активности в клеточных экстрактах.

2.7. Статистические методы.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Изучение метаболизма 6-гидроксиламинопурина и выяснение функции белка Hamlp.

3.1.1. Спонтанная мутабильность штаммов дрожжей с нулевой аллелью гена НАМ1.

3.1.2. Основной путь утилизации 6-замещенных аналогов аденина у дрожжей-сахаромицетов. Влияние мутации ham 1 на способность клетки усваивать аналоги аденина.

3.1.3. Дезаминирование in vivo аденина и 6-гидроксиламинопурина при участии дрожжевой аденинаминогидролазы у штаммов дикого типа и мутантов haml.

3.1.4. Влияние мутаций по генам утилизации пуринов на чувствительность дрожжевой клетки к мутагенному действию ГАП.

3.1.5. Сверхпродукция Hamlp в дрожжах. Поиск биохимической функции

Hamlp in vitro.

3.1.6. Сверхпродукция дрожжевого Hamlp в Е. coli.

3.1.7. Влияние сверхпродукции Ham 1 р на способность дрожжевой клетки утилизировать 6-гидроксиламинопурин.

3.1.8. Сверхпродукция бактериального гомолога Hamlp (HamA) в Е. coli.

3.2. Выяснение причины сверхчувствительности к аналогам оснований штаммов Е. coli, несущих делецию A(uvrB-bio).

3.2.1. Сверхчувствительность к аналогам, вызванная мутациями в гене МоеА.

3.2.2. Влияние мутаций по генам биосинтеза молибдоптерина на чувствительность бактериальной клетки к 6-гидроксиламинопурину.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Метаболизм 6-гидроксиламинопурина.

4.2. Предполагаемая роль белка Hamlp.

4.3. Роль молибдоптерин-зависимых оксидоредуктаз в детоксификации аналогов оснований.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Генетический контроль метаболизма 6-гидроксиламинопурина у дрожжей Saccharomyces cerevisiae и бактерий Escherichia coli"

Внутриклеточная генерация аналогов азотистых оснований - существенный источник возникновения спонтанных мутаций (Maki and Sekiguchi, 1992) и ошибок транскрипции (Taddei et al, 1997). Мутагенный и канцерогенный эффект многих физико-химических факторов связан с модификацией структуры азотистых оснований. Искусственные мутагенные аналоги оснований применяют для исследования клеточных систем репарации и репликации. Многие аналоги, например 6-меркаптопурины и 5-галогенпиримидины, нашли применение в химиотерапии раковых заболеваний и СПИД за счет их способности специфически ингибировать биосинтез нуклеотидов и воспроизведение нуклеиновых кислот.

Аналог аденина 6-гидроксиламинопурин (ГАП), впервые синтезированный в 1958 году (Giner-Sorolla and Bendich, 1958), рассматривали как потенциальный противораковый агент. Позднее был показан сильный мутагенный эффект ГАП для бактерий и фагов, грибов и высших эукариот. Индуцированный ГАП мутагенез у бактерий и дрожжей-сахаромицетов не зависит от эксцизионной, рекомбинационной и мутагенной систем репарации, а также от системы коррекции неправильно спаренных оснований. Мутации, нарушающие точность экзонуклеотической коррекции ДНК-полимеразы, приводят к умеренному повышению чувствительности клетки к мутагенному действию ГАП. Предполагают, что ГАП включается в клеточный метаболизм ферментами утилизации аденина и в форме дезоксирибонуклеотидтрифосфата участвует в репликации, провоцируя ошибки ДНК-полимеразы за счет способности аналога к неканоническому спариванию с цитозином. В настоящее время ГАП рассматривают как возможный внутриклеточный продукт окислительного стресса (Simandan et al, 1998) и микросомного окисления при участии цитохрома Р450 (Clement and Kunze, 1990).

При изучении генетического контроля индуцированного ГАП мутагенеза были описаны две мутации, приводящие к экстремальному фенотипу - сверхчувствительности к мутагенному и летальному действию ГАП. У бактерий Escherichia coli и Salmonella typhimurium к такому эффекту приводит делеция района, соответствующего 18-19 мин генетической карты, обозначаемая как A(uvrB-bio), а у дрожжей Saccharomyces cerevisiae -мутация haml-1 (см. Pavlov et al, 1996). Причина сверхчувствительности к ГАП бактериальных штаммов A(uvrB-bio) не известна. Сверхчувствительность дрожжевых мутантов haml-1 связывают с нарушением системы взаимопревращения- утилизации метаболитов аденина, поскольку гаплоидные штаммы с мутацией haml-1 и одновременно нарушенным биосинтезом пуринов de novo не способны расти на средах, содержащих ГАП в качестве единственного источника пуринов (Павлов, 1986). Гомологичные Hamlp белки существуют как у бактерий, так и у высших эукариот, включая человека. Функции белков семейства Hamlp не известны.

Основной целью нашей работы было выявление метаболических дефектов, приводящих к сверхчувствительности к ГАП в результате мутаций A(uvrB-bio) у бактерий и haml у дрожжей.

Результаты проведенных генетических экспериментов позволили нам заключить, что усвоение дрожжевой клеткой замещенных в шестом положении аналогов аденина происходит через превращение аналогов в инозинмонофосфат; основными способами утилизации ГАП являются дезаминирование аналога до гипоксантина аденин-аминогидролазой и фосфорибозилирование аденинфосфорибозилтрансферазой и, вероятно, гуанин-гипоксантинфосфорибозилтрансферазой.

Показано, что полная инактивация дрожжевого гена НАМ1 не влияет на спонтанную мутабильность в стандартных условиях культивирования и слабо повышает мутабильность в условиях глюкозной индукции цитохрома Р450. Мутация haml не влияет на способность клетки дезаминировать ГАП в гипоксантин. Результаты генетических экспериментов позволили охарактеризовать белок Hamlp как строго специфичную ГАП-редуктазу, катализирующую превращение ГАП-рибонуклеотида в адениловый рибонуклеотид. Мы установили сходство метаболических функций Hamlp и гомологичного белка Е. coli НашА.

Установлено, что причина сверхчувствительности к ГАП бактериальных штаммов с делецией A(uvrB-bio) заключается в нарушении биосинтеза молибдоптерина - кофактора оксидоредуктаз.

Мы полагаем перспективным применение ГАП для исследования метаболизма пуринов in vivo, поскольку уровень индуцированного ГАП мутагенеза - чувствительный индикатор состояния ферментов системы взаимопревращения-утилизации пуринов. Полученные нами данные о строгой специфичности к ГАП белков Hamlp и НатА могут интерпретироваться как подтверждение данных литературы о возможности образования ГАП in vivo, в связи с чем результаты нашего исследования могут быть важны для понимания молекулярных механизмов мутагенеза и канцерогенеза. Результаты, свидетельствующие о существенной роли молибденового кофактора для детоксификации широкого круга аналогов, необходимо учитывать при проверке мутагенной активности соединений в тесте Эймса, поскольку все используемые в тесте штаммы имеют дефект в биосинтезе этого кофактора.

Диссертационная работа выполнена в лаборатории физиологической генетики БиНИИ СПбГУ.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Козьмин, Станислав Геннадьевич

118 ВЫВОДЫ

1. Утилизация 6-гидроксиламинопурина (ГАП) в качестве источника пуринов происходит в дрожжевой клетке через превращение аналога в ИМФ при участии аденинаминогидролазы.

2. Фосфорибозилирование ГАП необходимо для проявления мутагенных свойств аналога.

3. Полная инактивация гена НАМ1 дрожжей-сахаромицетов не влияет на спонтанную мутабильность в стандартных условиях культивирования и слабо повышает мутабильность в условиях глюкозной индукции цитохрома Р450, что свидетельствует о незначительном вкладе микросомного окисления в генерацию эндогенного ГАП у данного объекта.

4. С использованием генетических методов показана исключительная роль ферментов класса оксидоредуктаз для инактивации аналогов оснований в бактериальной и дрожжевой клетке:

- эволюционно консервативные белки семейства Нат1р охарактеризованы как строго-специфичные ГАП-редуктазы.

- сверхчувствительность к ГАП и АГАП бактериальных штаммов с делецией А(тгВ-Ыо) связана с нарушением биосинтеза молибдоптерина, кофактора оксидоредуктаз. Нарушение биосинтеза молибденового кофактора снижает также устойчивость бактериальной клетки к токсичному действию ГАП-рибозида, гидроксиламина, 4-гидроксиламиноцитидина и 6-меркаптопурина.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Козьмин, Станислав Геннадьевич, Санкт-Петербург

1. Андрианова В.М., Инге-Вечтомов С.Г. Каталог(указатель) Петергофской генетической коллекции дрожжей Saccharomyces cerevisiae.-Я.: Изд.ЛГУ.-1988.-53с.

2. Глотов Н. В., Животовский Л. А., Хованов Н. В., Хромов-Борисов Н. Н. Биометрия. Учебное пособие.-Л.: Изд. ЛГУ.-1982.-264с.

3. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика.- М.: Мир.-1991 .-543с.

4. Инге-Вечтомов С.Г. Идентификация некоторых групп сцепления у Петергофских генетических линий дрожжей // Генетика.-1971.-Т.7, №9.-С.113-123.

5. Захаров И.А., Кожин С.А., Кожина Т.Н. Сборник методик по генетике дрожжей-сахаромицетов.- Л.: Наука.-1984.-144с.

6. Кочарян Ш.М., Кочарян A.M., Меликсетян Г.О., Акопян Ж.И. Мутанты Escherichia coli К12, усваивающие аденин по новому метаболическому пути // Генетика.-1982.-Т.18, №6.-С.906-915.

7. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии.- М.: Мир.-1984.-480С.

8. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике: Пер. с англ.-М.: Мир,-1976.-436с.

9. Павлов Ю.И., Носков В.Н., Чернов Ю.О., Горденин Д.А. Изучение мутабильности гена LYS2 у дрожжей-сахаромицетов. Сообщение 2. Возникновение мутантов, индуцированных б-Л^-гидроксиламинопурином и пропиолактоном //Генетика.-1988.-Т.24, №Ю.-С.1752-1760.

10. Павлов Ю.И. Мутанты дрожжей Saccharomyces cerevisiae, сверхчувствительные к мутагенному действию б-тУ-гидроксиламинопурина // Генетика.-1986.-Т.22.-С.2235-2243.

11. Павлов Ю.И, Хромов-Борисов Н.Н. Генетическая активность аналогов оснований у бактерий Salmonella typhimurium, Escherichia coli и дрожжей Saccharomyces cerevisiae II Генетика.- 1984.-T.20, №8.-C. 1270-1278.

12. Павлов Ю.И, Тарунина О.В. Дрожжи как модель для изучения мутагенов // Биол.журн.Армении.-1989.-Т.42, №9-10.-С.903-909.

13. Попова И.А., Погорелый П.А., Гаче М.В., Хромов-Борисов Н.Н. Создание генетически маркированных линий у аспорогенных дрожжей Candida tropicalis II Генетика.-1990.-Т.26.-С. 1551-1556.

14. Рыжова Т.А., Андрейчук Ю.В., Домкин В.Д. Аденилосукцинатсинтетаза дрожжей Saccharomyces cerevisiae: очистка и свойства // Биохимия.-1998.-Т.63, №6.-С.55-62.

15. Смолина B.C. Особенности регуляции биосинтеза пуриновых нуклеотидов у Saccharomyces cerevisiae, связанные со свойствами фермента 5-фосфорибозил-1-пирофосфатамидотрансферазы.-Автореф. дисс. канд. биол.наук.-Л.-1982.

16. Чернов Ю.О., Деркач И.Л., Дагкесманская А.Р., Тихомирова В.Л., Тер-Аванесян М.Д.,

17. Инге-Вечтомов С.Г. Нонсенс-супрессия при амплификации гена, кодирующего белковый фактор трансляции // Доклады АН СССР.-1988.-Т.301.-С. 1227-1229.

18. Хромов-Борисов Н.Н. Мутагенное действие б-УУ-гидроксиламинопурина на дрожжи Saccharomyces cerevisiae Н Тезисы конференции по генетики промышленных микроорганизмов, 10-14 декабря 1973 г.,- Цахкадзор: АН СССР, 1973.- С.42.

19. Abaibou Н., Pommier J., Benoit S., Giordano G., Mandrand-Berthelot M.A. Expression and characterisation of the Escherichia colifdo locus and a possible physiological role for aerobic formate dehydrogenase // J.Bacteriol.-1995.-V.177, №24.-P.7141-7149.

20. Abbondandolo A., Weyer A., Heslot H., Lambert M. Study of adenine aminohydrolase in the yeast Schizosaccharomycespombe II J.Bacteriol.-1971.-V.108.-P.959-963.

21. Abdul-Masih M.T., Bessman M.J. Biochemical studies on the mutagen 6-N-hydroxylaminopurine. Synthesis of the deoxynucleoside triphosphate and its incorporation into DNA in vitro // J.Biol.Chem.-1986.-V.261 .-P.2020-2026.

22. Aikens J., Dix T.A. Perhydroxyl radical (HOO ) initiated lipid peroxidation. The role of fatty acid hydroperoxides // J.Biol.Chem.-1991.-V.266, №23.-P. 15091-15098.

23. Alfonzo J.D., Crother T.R., Guetsova M.L., Daignan-Fornier В., Taylor M.W. APT1, but not APT2, codes for a functional adenine phosphoribosyltransferase in Saccharomyces cerevisiae И J.Bacteriol.- 1999.-V.181, №l.-P.347-352.

24. Altschul S.F., Madden T.L., Schaffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W., Lipman D.J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs// NucLAcids Res.-1997.-V.25.-P.3389-3402.

25. Ames B.N., Lee F.D., Durston W.E. An improved bacterial test system for the detection and classification of mutagens and carcinogens // Proc.Natl.Acad.Sci USA.-1973.-V.70, №3.-P.782-786.

26. Anderson J.M., Roth R. Adenosine utilization in cordycepin-sensitive mutants of Saccharomyces cerevisiae II J.Bacteriol.-1976.-V.128, №2.-P.689-691.

27. Babudri N., Salvini D., Pimpinelli S., Morpurgo G. The genetic activity of 6-Nhydroxylaminopurihe in Aspergillus nidulans II Mutat.Res.-1994.-V.321, №l-2.-P. 19-26.

28. Barrett E.L., Kwan H.S. Bacterial reduction of trimethylamine oxide//Annu. Rev.Microbiol.-1985.-V.39.-P. 131-149.

29. Benoit S., Abaibou H., Mandrand-Berthelot M.A. Topological analysis of the aerobic membrane-bound formate dehydrogenase of Escherichia coli 11 J.Bacteriol.-1998.- V.180, №24.-P.6625-6634.

30. Birnboim H.C., Doly Y. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant Plasmid DNA //Nucl.Acids Res.-1979.-V.7.-P.1513-1524.

31. Blasco F., Iobbi-Nivol C., Ratouchniak J., Bonnefoy V., Chippaux M. Nitrate reductases of Escherichia coli: sequence of the second nitrate reductase and comparison with that encoded by narGHJI opQton II Mol.Gen.Genet.-1990.-V.222, №1.-P. 104-111.

32. Bloch J.C., Sychrova H., Souciet J.L., Jund R., Chevallier M.R. Determination of a specific region of the purine-cytosine permease involved in the recognition of its substrates // Molecular Microbiol.-1992.-V.6.-P.2989-2997.

33. Booker S., Licht S., Broderick J., Stubbe J. Coenzyme B12-dependent ribonucleotide reductase: evidence for the participation of five cysteine residues in ribonucleotide reduction // Biochemistry.- 1994.-V.33, №42.-P.12676-12685.

34. Brockman H.E., de Serres F.J., Ong T.M., Hung C.Y. Two vV-hydroxylaminopurines are highly mutagenic in the ad-3 forward-mutation test in growing cultures of heterokaryon 12 of Neurospora crassa II Mutat.Res.-1987.-V. 177, № 1 .-P.61 -75.

35. Burridge P.W., Woods R.A., Henderson J.F. Purine metabolism in Saccharomyces cerevisiaell Can.J.Biochem.-1977.-V.55.-P.935-941.

36. Chevallier M.R., Jund R., Lacroute F. Characterization of cytosine permeation in Saccharomyces cerevisiae II J.Bacteriol.-1975.-V.122, №2.-P.629-641.

37. Choi K.Y., Zalkin H. Structural characterization and corepressor binding of the Escherichia coli purine repressor // J.Bacteriol.-1992.-V.174, №19.-P.6207-6214.

38. Cleary P.P., Campbell A. Deletion and complementation analysis of biotin gene cluster of Escherichia coli II J.Bacteriol.-1972.-V.l 12, №2.-P.830-839.

39. Clement B., Kunze T. The reduction of 6-jV-hydroxylaminopurine to adenine by xanthine oxidase // Biochem.Pharmacol.-1992.-V.44.-P.1501-1509.

40. Clement B., Kunze T. Hepatic microsomal //-hydroxylation of adenine to 6-N-hydroxylaminopurine // Biochem.Pharmacol.-1990.-V.39.-P.925-933.

41. Chattoo B.B., Sherman F., Azubalis D.A., Fjelstedd T.A. Mehnert D., Ogur M. Selection of lys2 mutants of the yeast Saccharomyces cerevisiae by the utilization of a-aminoadipate // Genetics.-1979.-V.93.-P.51-65.

42. Cooper T.G. Transport in Saccharomyces cerevisiae. In: The molecular biology of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Metabolism and gene expression. Edited by Strathern J.N., Jones E.W., Broach J.R.-CSHL Press.-1982.-P. 399-481.

43. Cox B.S., Parry J.M. The isolation, genetics and survival characteristics of ultraviolet lightsensitive mutants in yeast // Mutat.Res.-1968.-V.6, №1.-P.37-55.

44. Deeley M.C. Adenine deaminase and adenine utilization in Saccharomyces cerevisiae H ¿Bacterid.- 1992.-V.174, №10.-P.3102-3110.

45. Del Carratore R., Morichetti E., Cecchini E., Bronzetti G., Gallo E., Galeotti C.L. Expression of cytochrome P450 in yeast after different chemical treatments// Carcinogenesis.-1992.-V. 13, №11.-P.2175-2177.

46. Denis V., Daignan-Fornier B. Synthesis of glutamine, glycine and 10-formyltetrahydrofolate is coregulated with purine biosynthesis in Saccharomyces cerevisiae II Mol.Gen.Genet.-1998. -V.259, №3.-P.246-255.

47. Denis V., Boucherie H., Monribot C., Daignan-Fornier B. Role of the myb-like protein baslp in Saccharomyces cerevisiae: a proteome analysis //Mol.Microbiol.-1998.-V.30.-№3.-P.557-566.

48. Dorfman B.Z. The isolation of adenylosuccinate synthetase mutants in yeast by selection for constitutive behavior in pigmented strains // Genetics.-1969.-V.61, №2.-P.l-l 1.

49. Earhart C. Uptake and metabolism of iron and molybdenum. In: Escherichia coli and Salmonella, cellular and molecular biology. Edited by F. C. Neidhardt.-ASM press, Washington DC.-1996.-P. 1075-1090.

50. Freese E. The specific mutagenic effect of base analogues on phage T4 // J.Mol.Biol.-1959.-V.1.-P.87-105.

51. Freese E.B. The mutagenic effect of hydroxy laminopurine derivatives on phage T4// Mutat. Res.-1968.-V.5.-P.299-301.

52. Gardner H.W. Oxygen radical chemistry of polyunsaturated fatty acids// Free Radic.Biol. Med.-1989.-V.7, №l.-P.65-86.

53. Giner-Sorolla A., Bendich A. Synthesis and properties of some 6-substituted purines // J.Am.Chem.Soc.-1958.-V.80.-P.3932-3937.

54. Grove J., Tanapongpipat S., Thomas G., Griffiths L., Crooke H., Cole J. Escherichia coli

55. K-12 genes essential for the synthesis of c-type cytochromes and a third nitrate reductase located in the periplasm // Mol.Microbiol.-1996.-V.19, №3.-P.467-481.

56. Guansalus R.P. Control of electron flow in Escherichia coli: coordination transcription of respiratory pathway genes // J.Bacteriol.-1992.-V.174, №22.-P.7069-7074.

57. Guetsova M.L., Lecoq K., Daignan-Fornier B. The isolation and characterization of Saccharomyces cerevisiae mutants that constitutively express purine biosynthetic genes // Genetics.-1997.-V.147, №2.-P.383-97.

58. Hasona A., Ray R.M., Shanmugam K.T. Physiological and genetics analyses leading to identification of a biochemical role for the MoeA (molybdate metabolism) gene product in Escherichia coli // J.Bacteriol.-1998.-V.180, № 6.-P. 1466-1472.

59. Hove-Jensen B., Harlow K.W., King C.J., Switzer R.L. Phosphoribosylpyrophosphate synthetase of Escherichia coli. Properties of the purified enzyme and primary structure of theprs gene // J.Biol.Chem.-1986.-V.261, №15.-P.6765-6771.

60. Hove-Jensen B., Nygaard P. Role of guanosine kinase in the utilization of guanosine for nucleotide synthesis in Escherichia coli //J.Gen.Microbiol.-1989.-V.135(Pt5).-P.1263-1273.

61. Hruszkewycz A.M., Bergtold D.S. The 8-hydroxyguanine content of isolated mitochondria increases with lipid peroxidation // Mutat.Res.-1990.-V.244, №2.-P.123-128.

62. Huang M., Elledge S.J. Identification of RNR4, encoding a second essential small subunit of ribonucleotide reductase in Saccharomyces cerevisiae II Mol.Cell BioL-1997.-V.17,№10.~ P.6105-6113.

63. Inoue H., Nojima H., Okayama H. High efficiency transformation of Escherichia coli withplasmids // Gene.-1990.-V.96.-P.163-168.

64. Iobbi-Nivol C., Santini C.L., Blasco F., Giordano G. Purification and further characterisation of the second nitrate reductase of Escherichia coli K12 // Eur.J. Biochem.-1990.-V.188, №3.-P.679-687.

65. Iobbi-Nivol C., Pommier J., Simala-Grant J., Mejean V., Giordano G. High substrate specificity and induction characteristics of trimethylamine-N-oxide reductase of Escherichia coli II Biochim.Biophys.Acta.-1996.-V. 1294, №l.-P.77-82.

66. Itoh R. Purification and some properties of an IMP-specific 5'-nucleotidase from yeast // Biochem.J.-1994.-V.298(Pt 3).-P.593-598.

67. Iuchi S., Weiner L. Cellular and molecular physiology of Escherichia coli adaptation to aerobic enviroments // J.Biochem.-1996.-V.120, №6.-P.1055-1063.

68. Iwashima A., Kawasaki Y., Nosaka K., Nishimura H. Effect of thiamin on cordycepin sensitivity inSaccharomyces cerevisiae //FEBS Lett.-1992.-V.311, №l.-P.60-62.

69. Janion C. On the different response of Salmonella typhimurium hisG46 and TA1530 to mutagenic action of base analogs //Acta Biochim.Polon.-1979.-V.26.-P.171-177.

70. Janion C., Myszkowska K. Mutagenic and inhibitory properties of some new purine analogs on Salmonella typhimurium TA1530 // Mutat.Res.-1981.-V.91.-P.193-197.

71. Jones E.W., Fink G. Regulation of amino acid and nucleotide biosynthesis in yeast. In: Molecular biology of the yeast Saccharomyces. Metabolism and gene expression. Edited by Strathern J.N., Jones E.W., Broach J.R.-1982.-CSHL Press.-P. 181-299.

72. Kalle G.P., Gots J.S. Mechanism of resistance to 2,6-diaminopurine in Salmonella typhimurium //Biochim.Biophys.Acta.-1961.-V.51.-P.130-137.

73. Khromov-Borisov N.N. Chemical names: Galateas of mutation research (exemplified with mutagenic nucleic acid bases analogs // Mutation Res.-1997.-V.379.-P.95-103.

74. Kisker C., Schindelin H., Rees D.C. Molybdenum-cofactor-containing enzymes: structureand mechanism //Annu.Rev.Biochem.-1997.-V.66.-P.233-267.

75. Knaap A.G., Glickman B.W., Simons J.W. Effects of ethionine on the replicationai fidelity in V79 Chinese hamster cells // Mutat.Res.-1981.-V.82, №2.-P.355-363.

76. Kornberg A., Baker T.A. DNA replication.-W.H.Freeman and Company, New York.-1992.-931p.

77. Krenitsky T.A., Neil S.M., Elion G.B., Hitchings G.H. Adenine phosphoribosyltransferase from monkey liver. Specificity and properties// J.Biol.Chem.-1969.-V.244, №17.-P.4779-4784.

78. Kohara Y., Akiyama K, Isono K. The physical map of the whole E. coli chromosome: application of a new strategy for rapid analysis and sorting of a large genomic library // Cell. -1987.-V.50, №3.-P.495-508.

79. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature.-1970.-V.227.-P.680-685.

80. Lanzer M., Bujard H. Promoters largely determine the efficiency of repressor action// Proc.Natl.Acad Sci. USA.-1988.-V.85, №23.-P.8973-8977.

81. Lieberman I. Enzymatic synthesis of adenosine-5'- phosphate from inosine-5'-phosphate // J.Biol.Chem.-1956.-V.223, №1 .-P.327-339.

82. Lomax C.A., Woods R.A. Mutant of yeast sensitive to 2,6-diaminopurine // J.Bacteriol.-1969.-V.100, №2.-P.817-822.

83. Lomax C.A., Woods R.A. Prototrophic regulatory mutants of adenylosuccinate synthetase in yeast // Nat.New Biol.-1971.-V.229, №4.-P.l 16.

84. Lu Q., Zhang X., Almaula N., Mathews C.K., Inouye M. The gene for nucleoside diphosphate kinase functions as a mutator gene in Escherichia coli II J.Mol.Biol.-1995.-V.254, №3.-P.337-341.

85. Lupidi G., Marmocchi F., Falasca M., Venardi G., Cristalli G., Grifantini M., Whitehead E.,

86. Riva F. Adenosine deaminase from Saccharomyces cerevisiae: kinetics and interaction with transition and ground state inhibitors // Biochim.Biophys. Acta-1992.-V.1122, №3.-P.311-316,

87. Maki H., Sekiguchi M. MutT protein specifically hydrolyses a potent mutagenic substrate for DNA synthesis // Nature.-1992.-.-V.355, №6357.-P.273-275.

88. Marnett L.J. Peroxyl free radicals: potential mediators of tumor initiation and promotion // Carcinogenesis.-1987.-V.8, №10.-P. 1365-1373.

89. McElroy W.D. Adenase from yeast // Methods in Enzymology.-l963.-V.4.-P.203-207.

90. Metheringham R., Cole J.A. A reassessment of the genetic determinants, the effect of growth conditions and the availability of an electron donor on the nitrosating activity of Escherichia coli K-12 // Microbiology.-1997.-V.143 .-P.2647-2656.

91. Meyer S.L., Kvalnes-Krick K.L, Schramm V.L. Characterization of AMD, the AMP deaminase gene in yeast. Production of amd strain, cloning, nucleotide sequence, and properties of the protein // Biochemistry.-1989.-V.28.-P.8734-8743.

92. Merkler D.J., Schramm V.L. Catalytic mechanism of yeast adenosine 5-monophosphate deaminase. Zinc content, substrate specificity, pH studies, and solvent isotope effects // Biochemistry.-1993.-V.32, №22.-P.5792-5799.

93. Michaels M.L., Miller J.H. The GO system protects organisms from the mutagenic effect of the spontaneous lesion 8-hydroxyguanine (7,8-dihydro-8-oxoguanine)// J.Bacteriol.-1992.-V.174, №20.-P.6321-6325.

94. Miller R.L., Bieber A.L. Substrate binding specifity and properties of inosine monophosphate: pyrophosphate phosphoribosyltransferase (EC 2.4.2.8) from brewers yeast // Biochemistry.1969.-V.8.-P.603-608.

95. Munch-Petersen A., Jensen N. Analysis of the regulatory region of the Escherichia coli nupG gene, encoding a nucleoside-transport protein // Eur J.Biochem.-1990.-V.190, №3.-P.547-551.

96. Munch-Petersen A., Mygind B. Transport of nucleic acid precursors. In: Metabolism ofnucleotides, nucleosides, and nucleobases in microorganisms. Edited by Munch-Petersen A.-Academic Press, Inc., London.-1983.-P.259-305.

97. Noskov V.N. Mutagenicity of 5-bromouracil and N^-hydroxyadenine studied by yeast oligonucleotide transformation assay // Mutat.Res.-1994.-V.308.-P.43-51.

98. Nussbaum R.L., Caskey C.T. Purification and characterization of hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase from Saccharomyces cerevisiae // Biochemistry.-1981.-V.20, №16.-P.4584-4590.

99. Nygaard P. Utilisation of performed purine bases and nucleosides. In: Metabolism of nucleotides, nucleosides, and nucleobases in microorganisms. Edited by Munch-Petersen A.-Academic Press, Inc., London.-1983.-P.27-93.

100. Neuhard J., Nygaard P. Purines and pyrimidines. In: Escherichia coli and Salmonella, cellular and molecular biology. Edited by Neidhardt F.C.-ASM press, Washington DC.-1987.-P.445-473.

101. Pavlov Y.I., Toulyakova T.S. 6-iV-hydroxylaminopurine a potent mutagen for Pichiapinus. In: Genetics ofnonconventional yeasts. Proc. 12-th International Specialized Symposia on yeasts. Weimar, GDR.-1987.-P.20.

102. Pavlov Y.I., Noskov V.N., Lange E.K., Moiseeva E.V.,Pshenichnov M.R., Khromov-Borisov

103. N.N. The genetic activity of JV^-hydroxyadenine and 2-amino-iV^-hydroxyadenine in Escherichia coli, Salmonella typhimurium and Saccharomyces cerevisiae // Mutat.Res.-1991.-V.253.-P.33-46.

104. Pavlov Y.I., Suslov V.V., Shcherbakova P.V., Kunkel T.A., Ono A., Matsuda A., Schaaper R.M. Base analog N6-hydroxylaminopurine mutagenesis in Escherichia coli: genetic controland molecular specificity // Mutat.Res.-1996.-V.357,№l-2.-P.l-15.

105. Pinson B., Sagot I., Borne F., Gabrielsen O.S., Daignan-Fornier B. Mutations in the yeast Myb-like protein Baslp resulting in discrimination between promoters in vivo but not in vitro II Nucleic Acids Res.-1998.-V.26, №17.-P.3977-3985.

106. Pollock V.V., Barber M.J. Biotin sulfoxide reductase. Heterologous expression and characterisation of a functional molybdopterin guanine dinucleotide-containing enzyme // J.Biol.Chem.-1997.-V.272, №6.-P.3355-3362.

107. Porter N.A. Mechanisms for the autooxidation of polyunsaturated lipids // Acc.Chem.Res.-1986.-V.19.-P .262-268.

108. Pratt W.B., Ruddon R.W. The anticancer drugs.-Oxford University Press, New York.-1994.-352p.

109. Pryor W.A. Oxy-radicals and related species: their formation, lifetimes, and reactions // Annu.Rev.Physiol.-1986.-V.48.-P.657-667.

110. Rajagopalan K.V. Biosynthesis of the molybdenum cofactor. In -.Escherichia coli and Salmonella, cellular and molecular biology. Edited by Neidhardt F.C.-ASM press, Washington DC.-1996.-P.674-679.

111. Rodwell V.W. Structure, function and replication of informational macromolecules. Nucleotides. In: Harper's Biochemistry.-Appleton and Lange, Norwalk, Connecticut/San Mateo, California.-1988.-P.335-361.

112. Rose M.D., Winston F., Hieter P. Methods in yeast genetics.-CSHL Press.-1990.-198p.

113. Roush A.H., Saeed M. Adenine metabolism in Saccharomyces cerevisiae. Adenase from bakers yeast // Bichem.Biophys.Res.Comm.-1960.-V.2.-P.43-47.

114. Sahota A., Ranjekar P.K., Alfonzo J., Lewin A.S., Taylor M.W. Mutants of Saccharomyces cerevisiae deficient in adenine phosphoribosyltransferase // Mutat.Res.-1987.-V.180.-P.81-87. •

115. Schaaper R.M., Danforth B.N., Glickman B.W. Rapid repeated cloning of mutant lac repressor genes // Gene.-1985.-V.39, №2-3.-P. 181-9.

116. Shcherbakova P.V., Pavlov Y.I. Mutagenic specificity of the base analog 6-N-hydroxylaminopurine in the URA3 gene of the yeast Saccharomyces cerevisiae II Mutagenesis.-1993 .-V.8-P.417-421.

117. Shcherbakova P.V., Noskov V.N., Pshenichnov M.R., Pavlov Y.I. Base analog 6-N-hydroxylaminopurine mutagenesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae is controlled by replicative DNA polymerases // Mutat.Res.-1996.-V.369.-P.33-44.

118. Short S.A., Singer J.T. Studies on deo operon regulation in Escherichia coli: cloning and expression of the deoR structural gene // Gene.-1984.-V.31, №l-3.-P.205-211.

119. Simandan T., Sun J., Dix T.A. Oxidation of DNA bases, deoxyribonucleosides and homopolymers by peroxyl radicals// Biochem J.-1998.-V.335(Pt 2).-P.233-240.

120. Simon G., Mejean V., Jourlin C., Chippaux M., Pascal M.C. The torR gene of Escherichia coli encodes a responce regulator protein involved in the expression of the trimethylamine-iV-oxide reductase genes // J.Bacteriol.-1994.-V.176, №18.-P.5601-5606.

121. Smith J.L., Zaluzec E.J., Wery J.P., Niu L., Switzer R.L., Zalkin H., Satow Y. Structure of the allosteric regulatory enzyme of purine biosynthesis// Science.-1994.-V.264, №5164.-P.1427-1433.

122. Stark G. The effect of ionizing radiation on lipid membranes // Biochim.Biophys.Acta.199.h-V.1071, №2.-P.103-122.

123. Studier F.W., Moffatt, B.A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective highlevel expression of cloned genes // J.Mol.Biol.-1986.-V.189.-P.l 13-130

124. Taddei F., Hayakawa H., Bouton M., Cirinesi A., Matic I., Sekiguchi M., Radman M. Counteraction by MutT protein of transcriptional errors caused by oxidative damage// Science.-1997.-V.278, №5335.-P.128-130.

125. Tibbetts A.S., Appling D.R. Saccharomyces cerevisiae expresses two genes encoding isozymes of 5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide transformylase //Arch.Biochem.Biophys.-1997.-V.340, №2.-P. 195-200.

126. Venables W.A., Guest J.R. Transduction of nitrate reductase loci of Escherichia coli by phages P-l and lambda// Mol.Gen.Genet.-1968.-V.103, №2.-P. 127-140.

127. Von Borstel R.C. Measuring spontaneous mutation rates in yeast//Methods Cell Biol.-1978.-V.20.P.1-24.

128. Vogel H.J., Bonner D.M. Acetylornithinase of Escherichia coli: partial purification and some properties // J.Biol.Chem.-1956.-V.218.-P.97-106.

129. Weber E., Rodriguez C., Chevallier M.R., Jund R. The purine-cytosine permease of Saccharomyces cerevisiae: primary structure and deduced protein sequence of the FCY2 gene product // Mol.Microbiol.-1990.-V.4.-P.5 85-596.

130. Weiner J.H., Maclsaac D.P., Bishop R.E., Bilous P.T. Purification and properties of Escherichia coli dimethyl sulfoxide reductase, an iron-sulfur molybdoenzyme with broad substrate specifity // J.Bacteriol.-1988.-V.170, №4.-P.1505-1510.

131. Weiner J.H., Rothery R.A., Sambasivarao D., Trieber C.A. Molecular analysis ofdimethylsulfoxide reductase: a complex iron-sulfur molybdoenzyme of Escherichia coli II Biochim.Biophys.Acta.-1992.-V.l 102, №1.-P. 1-18.

132. Wilson H.R., Turnbough C.L. Jr. Role of the purine repressor in the regulation of pyrimidine gene expression in Escherichia coli K-12 // J.Bacteriol.-1990.-V.172, №6.-P.3208-3213.

133. Woods R.A., Roberts D.G., Freidman T., Jolly D., Filpula D. Hypoxanthine: Guanine phosphoribosyltransferase mutants in Saccharomyces cerevisiae II Mol.Gen.Genet.-1983.-V.191.-P.407-412.

134. Woods R.A., Roberts D.G., Stein D.S., Filpula D. Adenine phosphoribosyltransferase mutants in Saccharomyces cerevisiae// J. Gen. Microbiol.-1984.-V.130.-P.2629-2637.

135. Yuryev A., Corden J.L. A Saccharomyces cerevisiae gene encoding a potential adenine phosphoribosyltransferase// Yeast.-1994.-V.10, №5.-P.659-662.

136. Zalkin H., Dixon J. E. De novo purine nucleotide biosynthesis // Prog.Nucleic Acid Res.Mol.Biol.-1992.-V.42.-P.259-287.

137. Zalkin H., Nygaard P. Biosynthesis of purine nucleotides. In: Escherichia coli and Salmonella, cellular and molecular biology. Edited by Neidhardt F.C.-ASM press, Washington DC.-1996.-P.561-579.

138. Zhou Z., Elledge S.J. Isolation of crt mutants constitutive for transcription of the DNA damage inducible gene RNR3 in Saccharomyces cerevisiae II Genetics.-1992.-V.131,№4.-P.851-866.

139. Карты плазмид HLAM и pFL44-HAMl.н <иа»в <до х <кхю1. В <400)$ <850)s <з<Ш)с <saoo»1 <500)9 «00Ф Н <3800

140. Рестрикционные сайты: В ВатШ, Bg - Bgll, С - Clal, Н - Hindill, S - Sali, X - Xhol.

141. Карта плазмиды pBluescriptKS(-).

142. Обозначения: Ар маркер устойчивости к ампициллину, LacZ - ген Р-галактозидазы, orí -ориджин репликации.1. Карта плазмиды pET-15b.

143. Обозначения: CER участок клонирования/экспрессии (Cloning/Expressing Region), Ар -маркер устойчивости к ампициллину, ori - ориджин репликации.

144. Выравнивание аминокислотных последовательностей ксантиноксидаз и гипотетическихбелков Е. coli о752р, о956р, f732p.

145. MASGAKLTLVSRGTR----RTVRMDHTFFPGYRKTLLRPEEILLSIEIPYSKE-GEFFSA 419

146. MASGSKLTLISMEGK----RTVMMDEKFFTGYRKTIVKPEEVLLSVEIPYSKE-GEYFSA 446

147. TAAGARLEVASIVEGKISQRTVHMGTGFFTGYRRNVIEPQEVLLGIHFQKTTP-DQHWA 431

148. MPCSAVLNVYSTTNG—S-RQITIDENFFKGYRKTILEDDEVVISIKLPFSTN-DQYFKS 431

149. VATNTTLVARSLDKE----TEIPMTQ-FFRGYRSTALPPDAIISSLRIPTASEKGEYLRA 457

150. MIIHFTLNGAPQELTVNPGENVQK—LLFNM 291. Rattus1. Gallus1. Drosophixa1. Bombyx1. Emericella1. Rhodobactero752o956f 7321. Rattus1. Gallus1. Drosophixa1. Bombyx1. Emericella1. Rhodobactero752o956f732

151. GMHSVRNSDDGFGFAGSDAIIFN—GNIVNASLLIAAQLEKADIRTAESLGKWN81

152. Rattus EELLQSVCAGLAEELQLAPDAPGGMVEFRRTLTLSFFFKFYLTVLQKLGR—ADLEDMCG 536

153. Gallus EKLLQDACRLLAGEMDLSPSAPGGMVEFRRTLTLSFFFKFYLTVLQKLSKDQNGPNNLCE 565

154. Drosophüa HQLLERVAESLCGELPLAASAPGGMIAYRRALWSLIFKAYLAISSKLSEA---GIIAGD 547

155. Bombyx HETLSTVFHSLCEEFNLEFSVPGGMAEYRKSLCLSLFFKFYLNVKDKLDIS---NGES-S 544

156. Emericella PATLEGTMGALEQDFNLKFGVPGGMATYRKSLALGFFYRFYHDVLSQIEAR---SSDLDN 573

157. Rattus KLDPTFASATLLFQKDPPANVQLFQEVPKDQSEEDMVGRPLPHLAANMQASGEAVÏCDDI 596

158. Gallus PVPPNYISATELFHKDPIASTQLFQEVPRGQLVEDTVGRPLVHLSAAKQACGEA.VYCDDI 625

159. Drosophiia AIPPKERSGAELFHTPTLRSAQLFERVCSDQPVCDPIGRPEVHAAALKQATGEAIÏTDDI 607

160. Bombyx TRPPKLSCGDETRGEPS—SSQYFEIRNSGE—VDALGKPLPHASAMKHATGEAIXCDDL 600

161. Emericella S WAE IERAISTGEKDNEASAAYQQR---------VLGRAGPHLSALKQATGEAQYTDDI 624

162. Rattus PRYE-NELSLRLVTSTRAHAKITSIDTSEAKKVPGFVCFLTAEDVP—NSNATG-LFNDE 652

163. Gallus PHYE-NELYLTLVTSTQAHAKILSIDASEAQSVPGFVCFVSAKDVP—GSNITG-IANDE 681

164. Dr0SOphila PRMD-GELYLGFVLSTKPRAKITKLDASAALALEGVHAFFSHKDLTV-HENEVGPVFHDE 665

165. Bombyx PRID-GELFLTLVLSSESHAKIKSIDTTAALSIPGWAFFCAKDLEV-DRNIWGSIIKDE 658

166. Eme r i ce 11 a PAQK-NELYGCMVLSTKAHAKLLSVNTEAALEIPGVIDYVDHKDLPS PRANWWGAPNCDE 683