Клеточные механизмы мутагенеза и антимутагенеза

Павлов, Юрий Иванович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Клеточные механизмы мутагенеза и антимутагенеза
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Клеточные механизмы мутагенеза и антимутагенеза"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

РГ6 од

На пршш рукописи

3 и МАР 1993

ПАВЛОВ Юрий Иванович

КЛЕТОЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫ МУТАГЕНЕЗА И АНТИМУТАГЕНЕЗА: ИССЛЕДОВАНИЕ НА МОДЕЛЬНЫХ МИКРООРГАНИЗМАХ С ПОМОЩЬЮ СПЕЦИФИЧЕСКИХ МУТАГЕНОВ.

Специальность 03.00.15 - генетика

диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург

1998

Работа выполнена на кафедре генетики и селекции Санкт-Петербургского государственного университета

Научный консультант: доктор биологических наук

чл.кор. РАН, проф.

С.Г. Инге-Вечтомов

Официальные оппоненты: - доктор биологических наук

Т.Р. Сойдла

- доктор медицинских наук

В.В. Худолей

- доктор биологических наук

В.Н. Рыбчин

Ведущее учреждение: Петербургский институт

ядерной физики РАН

Защита диссертации состоится " 2 " апреля 1998 г. в/'час, на заседании Диссертационного совета Д 063.57.21 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук в Санкт-Петербургском Государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9, СПбГУ, кафедра генетики н селекции, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной научной библиотеке Санкт-Петербургского Государственного университета.

Автореферат разослан "2^" ^м^ЛЯ 1998 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

кандидат биологических наук Л. А. МАМОН

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Нарушение механизма точного воспроизведения генетического материала увеличивает частоту мутаций, что у человека выражается в возрастании частоты наследственных болезней и рака. Мутации возникают преимущественно в определенных сайтах генома, предрасположенных к мутированию, которые называют «горячими точками» мутагенеза. В нашей работе мы исследовали многоступенчатые механизмы появления мутаций и природу сайтов с аномально высоким уровнем мутабильяости.

Значительная часть спонтанных мутаций происходит при репликациии ДНК. Известно, что механизм обеспечения высокой точности репликации ДНК у Escherichia coli включает три последовательных этапа: выбор комплементарных матрице нуклеотидов ДНК-полнмеразой III, коррекцию ошибок с помощью 3'->5' экзонуклеазной активности s-субьединицы ДНК-полимеразы III и пострепликативную репарацию неспаренных оснований. Механизмы контроля точности репликации ДНК эукариот изучены значительно меньше. В частности, неясно, какие ДНК-полимеразы участвуют в репликации основной части генома эукариот; какую роль играют 3'—>5' экзонуклеазы, ассоциированные с репликативными ДНК-полимеразами, в контроле точности репликации хромосом; как организована репликация лидирующей и отстающей нитей ДНК. В работе мы разработали оригинальный подход к анализу этих проблем, применяя аналоги оснований в качестве специфического инструмента для выявления ошибок репликации, происходящих при репликации разных нитей ДНК.

Индуцированные мутации происходят при ошибках репарации и репликации, вызываемых нарушениями структуры ДНК. Важной задачей в настоящее время является расшифровка механизмов действия химических мутагенов, которые, как выяснилось, являются постоянно действующим фактором окружающей среды. Мы исследовали механизмы, защищающие ДНК и клетку от химических мутагенов, начиная с поступления/транспорта мутагена в клетку, метаболизма, до реакции с ДНК и действия систем репарации и репликации поврежденной ДНК при становлении мутации. Для этого мы изучили у дрожжей и бактерий действие мутагенов разного типа, создавая и используя специальные системы для анализа генетического контроля и специфичности мутагенеза.

Дрожжи Saccharomyces cerevisiae являются одним из наиболее удобных для генетических исследований эукариотическим объектом благодаря сравнительной простоте их организации и возможности комплексного использования в работе с ними генетических и молекулярно-биологических подходов. В то же время, сходство организации клеток дрожжей и высших эукариот делает дрожжи уникальной моделью для изучения механизмов, действующих в клетках всех эукариотических организмов. Применение дрожжей позволило исследовать механизмы возникновения мутаций не только у гаплоидных, но и у диплоидных клеток. Теоретические исследования механизмов мутагенеза в работе позволили создать и апробировать систему штаммов дрожжей-индикаторов генетически опасных факторов.

Задачи исследования.

Создание систем для анализа механизмов возникновения мутаций у прокариоти-ческих и эукариотических микроорганизмов. Изучение механизмов становления мутаций при ошибках репликации и репарации, клеточных систем защиты от мутагенов, особенностей мутагенеза в диплоидных эукариотических клетках. Создание штаммов дрожжей для регистрации генетически опасных факторов окружающей среды.

Положения, выносимые на защиту.

Возникновение мутаций при действии химических мутагенов у эукариот -многоступенчатый процесс, включающий: поступление в организм, превращения мутагена неспецифичсской системой метаболизма чужеродных соединений, транспорт/проникновение в клетки-мишени, превращения мутагена специфическими для него системами активации/дезактивации, реакции с основаниями ДНК или включение в ДНК, репарацию модифицированной ДНК и репликацию ДНК, содержащей или бреши, или необычные основания. Вероятность появления новой последовательности ДНК (мутации) зависит не только от типа модификации ДНК, но и от локального контекста ДНК вблизи сайта мутации, типа реплицирующейся нити (лидирующей или отстающей) и от функционаьного состояния аппарата репликации.

Научная новизна.

В работе для анализа механизмов мутагенеза использованы микроорганизмы: прокариоты - бактерии Е. coli и Salmonella typhimurium и эукариоты - дрожжи Saccharomyces cerevisiae и Pichia methanolica. Применены три основных подхода: а) исследование частоты индуцированных мутаций у мутантов по системам защиты от мутагенов или в системе микроорганизмы-индикаторк/клеточные экстракты печени животных и птиц; б) конструирование штаммов-детекторов мутаций, позволяющих определять тип и механизм возникновения мутаций, индуцированных мутагенами; в) использование сяециачыго подобранных мутагенов, различающихся по механизму действия (так, аналоги оснований вызывают мутации при ошибках репликации, УФ-свет -при ошибках репарации, пропиолактон - при ошибках и репарации, и репликации). В результате впервые:

♦ исследована метаболическая активация 2-аминофлуорена (2-АФ) и инактивация Л-метил-Л,,-нитро-Л'-ншрозогуаниднна в тесте дрожжи/микросомы. Показано, что мутагенная активность 6-Лг-гидроксиламинопурина (ГАП) не модифицируется препаратами микросом; микросомы печени курицы обладают более высокой активностью по превращению 2-АФ в мутаген, по сравнению с препаратами печени мышей

♦ установлено, что система эксцизионной репарации дрожжей предотвращает возникновение мутаций при действии метаболитов 2-АФ и 2-ацетил-АФ

♦ получены мутанты ham1 у дрожжей, сверхчувствительные к мутагенному действию аналога оснований ГАП; показано, что ген НАШ консервирован в эволюции - имеет гомологи у широкого спектра организмов, от кишечной палочки до человека, следовательно, играет важную роль в жизнедеятельности клетки; установлена локализация новых генов, отличающихся от гомолога гена НАМ1, контролирующих мутагенное и летальное действие аналогов оснований у бактерий

♦ показано, что мутагенное действие ГАП у дрожжей модифицируется генетическими блоками путей биосинтеза и реутилизации пуринов (мутации adel, ade2, adel2, aahl, aprtl). В результате получена возможность искусственно контролировать эффективность мутагенного действия ГАП на дрожжи

♦ установлено, что мутагенное действие аналога оснований ГАП у бактерий и дрожжей не зависит от общих систем репарации: эксцизионной, рекомбинационной, репарации неспаренных оснований; ГАП не является индуктором митотической рекомбинации у дрожжей

♦ показано, что и дТТФ, и дЦТФ включаются в ДНК напротив аналога оснований 6-.V-шдроксиламинопурина (ГАП) in vitro Кленовским фрагментом ДНК-полимеразы 1 при использовании олигонуклеотида-матрицы, содержащего данный аналог основания в определенном положении, причем дТТФ включался более эффективно, чем дЦТФ

♦ продемонстрировано, что аналог оснований 8-оксигуанин дезокситрифосфат (8-дОГТФ), присутствующий в ДПК-полимеразной реакции in vitro в эквимолнрной природным предшественникам концентрации, провоцирует ошибки ДНК-полимераз, корректируемые 3'->5'экзонуклеазой. Распределение ошибок репликации в присутствии 8-дОГТФ экстрактами культуры тканей человека практически одинаково в лидирующей и отстающей нитях ДНК

*■ изучены спектры мутаций индуцированных ГАП у бактерий и дрожжей методами секвенирования; продемонстрировано, что ГАП индуцирует в бактериальном гене Iac¡ и в дрожжевом гене URA3 транзиции ГЦ->АТ и AT—»ГЦ; горячими точками транзиций ГЦ-»AT являются последовательности ДНК типа «АГА» и, только у дрожжей, монотонные повторы нуклеотидов; мутации распределены асимметрично по цепям ДНК, что указывает на неодинаковую частоту ошибок репликации в присутствии аналога оснований при синтезе лидирующей и отстающей цепей ДНК

♦ ГАП применен для изучения механизмов контроля точности репликации у эукариот: при изучении ГАП-мутагенеза у штаммов дрожжей с отсутствующей экзонуклеазной активностью ДНК-полимераз е или 8 (мутации ро!2-4 и ро!3-01) показано, что пары ГАП с нормальными основаниями могут корректироваться при синтезе ДНК in vivo

♦ создана модель для изучения провоцируемых ГАП ошибок репликации при синтезе лидирующей и отстающей нитей ДНК у дрожжей и установлено, что ДНК-полимеразы эпсилон и дельта корректируют ошибки репликации на разных нитях ДНК, а индуцированные ГАП ошибки возникают существенно чаще на той цепи ДНК, коррекция которой осуществляется ДНК-полимеразой эпсилон

♦ ангамутаторные мутации в генах всех трех репликагивных полимераз резко снижают мутагенез на более мутабильной нити ДНК; следовательно, оптимальная работа репликативного комплекса необходима для возникновения "горячих точек" репликативного мутагенеза; мутагены, действующие при «ошибках репарации» -этилметаисульфонат и ультрафиолетовый свет, индуцируют мутации в обеих цепях с одинаковой частотой

♦ у диплоидов дрожжей пропяолактон индуцирует мутантов по двухступенчатому механизму «мутирование-рекомбинация», а ГАП - по механизму «возникновение мутаций в обеих копиях гена» с частотой, лишь на порядок меньшей, чем у гаплоидов.

Теоретическая и практическая ценность работы.

Полученные в нашей работе данные о механизмах, защищающих клетки от мутагенов, использованы для а) направленного получения организмов, устойчивых/чувствительных к мутагенам б) создания тестеров для оценки мутагенной активности факторов окружающей среды. Активация промутагенов препаратами печени курицы может быть эффективной альтернативой применению дорогостоящих препаратов печени крыс. Полученные данные могут быть использованы при прогнозировании генетических последствий действия мутагенов типа аналогов оснований. Данные об участии ДНК-полимераз S и е в коррекции ошибок при репликации разных нитей ДНК необходимо учитывать при создании моделей организации аппарата репликации ДНК и при изучении механизмов контроля точности репликации ДНК у эукариот. Данные о молекулярной специфичности действия ГАП открывают возможность использования этого мутагена для получения специфических мутаций в определенных последовательностях ДНК. Исследования механизмов мутирования диплоидных клеток дрожжей являются основой для понимания процессов мутагенеза и, возможно, канцерогенеза, в соматических клетках.

Набор интегративных плазмид с мутантными аллелями гена URA3, полученный в нашей работе, используется в лаборатории физиологической генетики БиНИИ СПбГУ для

конструирования миссенс- и нонсенс-мутаций в штаммах дрожжей любого генотипа. Система анализа мутаций по гену LYS2 применяется для изучения мутагенов и механизмов трансляционной супрессии в этой же лаборатории. Созданные нами штаммы-тестеры широко применяются в СНГ при проведении работ по экологической генетике (Институте микробиологии академии наук Молдовы, Кольском филиале РАН, кафедре микробиологии СПбГУ, Санкт-Петербургском институте усовершенствования врачей, Санкт-Петербургском медицинском университете им акад. И.П. Павлова, Пермском Медицинском институте и других).

Место проведения работы.

Основная часть работы выполнена в лаборатории физиологической генетики Биологического НИИ СПбГУ и на кафедре генетики и селекции СПбГУ. Часть экспериментов проведены в лабораториях молекулярной генетики NIEHS, США и молекулярной биологии Осахского университета, Япония. Экспериментальный материал получен непосредственно автором или студентами, аспирантами и соискателями под его руководством. Так, в работе принимали участие Ланге Е.К., Горбачева О.В., Носков В.Н., Куликов В.Н., Тарутина М.Г., Сарсенова С.Ж., Тюлякова Т.С., Чекуолене Ю.В., Трофимова М.В., Моисеева Е.В., ТарунинаО. В., Щербакова П.В., Суслов В.В., Штаак К., Тирлих М„ Пшеничное М. Р., Тран Туан Хиеп, Козьмин С.Г. Часть результатов получена в соавторстве с Н.Н.Хромовым-Борисовым, С.Г. Инге-Вечтомовым, Д.А. Гордениным, Ю.О. Черновым, К. Саснаускасом, И.И. Толсторуковым, Т.А.Карповой, Г.И. Сизоненко, Т.А. Бехтеревой, Т.А. Канкель, Д. Минник, P.M. Шаапер, К. Негиши, X. Хайацу, А. Сугино, Б-С. Оно, А. Матсуда, В.Д. Домкиным, A.M. Зехновым, И.Б. Рогозиным, В.В. Алениным, М.Г. Гецовой, Е.П. Гуськовым, М.Д. Тер-Аванесяном, Л.А. Алексеевич, Д. Читавичюсом, Г.А. Евдокимовой, А.Г. Мухлековым, М.Г. Самсоновой, Ю. Просцявичусом.

Апробация работы.

По результатам работы сделаны сообщения на конференциях : Всесоюзных симпозиумах «Молекулярные механизмы генетических процессов», 1979, 1987 и 1990; Всесоюзных съездах ВОГиС, 1983,1987; 14-th Annual Meeting of the European Environmental Society, 1984; на заседаниях секции генетических аспектов проблемы «Человек и Биосфера» при ГКНТ (1979-1989); на симпозиуме «Чувствительность организмов к мутагенным факторам и возникновение мутаций", Вильнюс, 1986; 6-th International Symposium on Genetics of Industrial Microorganisms GIM90, Strasbourg France, August 1990; Gordon Research conference (Mutagenesis), 1992; Environmental Mutagen Society Annual Meeting, Norfolk, Virginia, April, 1993; Gordon Research Conference (Genetic Toxicology), New Hampshire, USA, July 1993; Gordon Research Conference (Mutagenesis), New Hampshire, USA, June 1994; Yeast Genetics and Molecular Biology Meeting, University of Washington, Seattle, USA, August 1994; 1-м съезде Вавиловского Общества Генетиков и Селекционеров в Саратове в декабре 1994; Yeast Genetics and Molecular Biology Meeting, University of Wisconsin, Madison, USA, August, 1996; 5-th International Conference on Mechanisms of Antimutagenesis and Anticarcinogenesis, Okayama University, Japan, December 1996; Conference "Mechanisms of DNA Repair and Mutagenesis" the 100-th Anniversary of the Discovery of Polonium and Radium, Warsaw, October 1997; на семинарах кафедры генетики и селекции СПбГУ и лаборатории физиологической генетики БиНИИ СПбГУ.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 44 страницах, состоит из «Общей характеристики работы», раздела "Материалы и Методы", 7 глав, в которых изложены Результаты и их Обсуждение, Выводов и Списка опубликованных по теме работ (49), приведенных в хронологическом порядке. Ссылки на работы автора в тексте находятся в квадратных скобках с номерами из списка опубликованных работ; ссылки на основополагающие работы других авторов, необходимые для понимания логики исследований, находятся в круглых скобках, включают имена авторов и год публикации. Работа содержит 15 таблиц, 12 рисунков.

Список сокращений.

АМФ, АДФ, АТФ, дАДФ, дАТФ - аденозин moho-, ди-, три-, дезокснаденозинди- и три- фосфат, соответственно; 2-АФ и 2-ААФ - 2-амино- и 2-ацетиламинофлуорен, соответственно; АФРГ - аденинфосфорибозилгрансфераза; дТТФ и дЦТФ - дезокси-тимидин- и цитозинтрифосфат; ГАП, ГАПМФ, ГАПДФ, дГАПДФ и дГАПТФ - 6-Л-гидроксиламинопурин и его moho-, ди-, три, дезоксиди- и дезокситрифосфат; ИМФ -инозинмонофосфат; САМФ - сукцинил-АМФ; дОГТФ - 8-оксодезоксигуанозшггрифосфат; МННГ - Дометил- Аг'нитро-.У-нитрозогуанидин; ПРО - ß-пропиолактон; РНО - репарация неспаренных оснований; УФ - ультрафиолетовый свет; ЭМС - этилметансульфонат; PCNA - ядерный антиген пролиферирующихся клеток

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штаммы.

Генотипы основных штаммов Saccharomyces cerevisiae, использованных в качестве исходного материала, приведены в Таблице 1. Штамм ES63-17D содержит полную делецию гена URA3 в хромосоме V и плазмиду с дрожжевыми генами HIS3, LEU2 и URA3, интегрированную в локус HIS3 в хромосомеXV(Lee et al., 1988).

Для создания серии изогенных штамдв, различающиеся аллелями генов POLI, POL2, POL3, PMS1, URA3 хромосомные аллели соответствующих генов замещали мутантными аллелями с помощью интеграции в хромосому плазмид с мутантными аллелями и последующей эксцизии плазмид с аллелями дикого типа, а также методом "одношаговой замены" хромосомных аллелей мутантными аллелями, находящимися в составе рестрикционных фрагментов плазмидной ДНК (Morrison et al., 1993).

В работе использовали также ряд стандартных штаммов Salmonella typhimurium (тестеры Эймса) и штаммы Escherichia coli, несущие дефекты путей репарации и иные мутации, любезно предоставленные Д-ром Р. Шаапером (NIEHS, США).

Среды и условия культивирования.

Для бактерий использовали полную среду LB и минимальные среды на основе рецепта Фогеля-Боннера. Состав полной среды YAPD и минимальной среды MD для выращивания дрожжей описан Инге-Вечтомовым и Захаровым с соавторами (Инге-Вечтомов, 1971; Захаров и др., 1984). Селективные среды готовили на основе минимальной среды MD, добавляя витамины, микроэлементы и необходимые для роста ауксотрофных штаммов аминокислоты и азотистые основания. Среда для селекции мутантов по гену CAN1 содержала, кроме добавок, необходимых для роста штаммов, L-

Основные штаммы дрожжей, использованные в работе.

Таблица 1.

Обозначение Генотип

р2089-15В-П4 МАТа аЫе2-2089

П3288 МАТа ас!е2-916 + теПЗ-А1

МАТа айг2-951 \ys2A12 +

197/2с1 МАТа айе2-1 САШ

ът МАТа МАТа Ыэ7-1 Ш-А12 + ас!е2-475 НАМ] ас!е2-1 Иат!-1

та МАТа МАТа Ы$7-1 Ы2-А12 1т7-1 + айе2-475 кат! ас!е2-1 Ъат1-1

РУ2 МАТа МАТа Ых7-1 Ш-67 Ак7-/ 1у$2-68 аск2-475 С.АК1 ас1е2-475 сап1 гас! 1-5 НАШ

РУЗ МАТа МАТа М$7-1 Ш-67 Ыя?-! 1у$2-68 ас!е2-475 САЫ! а(1е2-475 сап1 га(11-5 га<1]-5

П3887 МАТа + ас/г 2-¡92 МАТа 1еи2 + + 1\'Я2 рко1 иа

186А-0327 МА Та 1уг11гр1 СЛХ!

53Г-Б327 МАТа 1гр1 ЫзЗ 1еи2-3,112 сап1

0328 МАТа + га/7 Гуг/ ¿Ж + Ш САМ

МАТа!еи2-3,1 ¡2 +• + ЛК92 ЫчЗ 1гр1 сап!

Б362 МАТа + га/7пт/+ 1гр1 САМ

МАТа 1еи2-3,112 + + 1уа2 Ы$3 1гр1 сап1

IV-10 МАТа + «а!7 м1 + 1гр1 + САЫ1

МАТа 1еи2-3,112 + + ЫвЗ 1т! + сап1

МА Та 1еи2-3,112 ^а\7 ш1 + МАТа 1еи2-3,112 + ¿752+ ИаЗ + ига4 + ига4 САМ сап1

Е863-170 МА Та ас!е2-1 iy.il-11гр5-48 ЫэЗ-11,15 [11133 1ЕУ2 ЦЛАЗ] 1ги2-3,112 игаЗЛ

Св379 МАТа а<1е5-11гр1-289 «.у7-2 1еи2-3,112 игаЗ-52

ХАМ8А МАТаро12-4 ас1е5-11гр1-289 кЬ7-21еи2-3,112 игаЗ-52

канаванин в концентрации 40 мг/л. Мутантов по гену LYS2 отбирали на среде с а-аминоадипиновой кислотой (Chatoo et al., 1979). Мутантов по гепу URA3 отбирали на среде с 5-фтороротовой кислотой (Boeke et al, 1984). В экспериментах с температуро-чувствительными штаммами дрожжей инкубацию проводили при 25°С, в остальных случаях - при 30°С.

Методы генной инженерии.

Стандартные методы генной инженерии, использованные в работе, описаны в руководстве Сэмбрука с соавторами (Sambrook et al, 1990). Трансформацию дрожжей проводили по методу Ито с соавторами (Ito et al, 1983). Секвенирование ДНК проводили методом терминаторов полимеразной реакции с модифицированной ДНК-полимеразой бактериофага Т7 (Tabor and Richardson, 1987), или с термостабильными лоимеразами Tet/z [22] или с Тад-полимеразой, как описано в руководстве фирмы «Promega». Для секвенирования продуктов цепной реакции ДНК-полимеразы фрагменты ДНК, наработанные в ходе реакции, очищали гель-электрофорезом и изолировали ДНК из геля модифицированным методом замораживания-оттаивания с использованием микрофильтров фирмы «Millipore» (Sambrook et al, 1990).

Для определения нуклеотидных последовательностей мутантных аллелей их клонировали in vivo методом «конверсии в брешь» или «интеграции-эксцизии» [см. 21], или амплифицировали in vitro с помощью цепной реакции ДНК-полимеразы.

Исследование синтеза ДНК in vitro в присутствии аналогов.

Для синтеза 30-членного олигонуклеотида 5'-АГСАГААТГ/у1/ГГЦАГАЦАТТАЦГААТГЦАЦА-3' применяли метод Нишио с соавт. (Nishio et al., 1992). Контрольный олигонуклеотид содержал «Г» вместо ГАП. Праймер 5 '-ТГТГЦАТТЦГТААТГТЦТГЦ-3' метили с 5' конца у-32Ф[АТФ], отжигали с матрицей и использовали в качестве субстрата для полимеразной реакции, продукты которой изучали с помощью гель-электрофореза (Bebenek et al., 1990). Дезоксинуклеозидтрифосфат 8-оксигуанина синтезировали по методу Мо и соавт. (Mo et а!., 1992). Определение точности репликации ДНК фага шр2 изолированными лолимеразами, или экстрактами клеток человека проводили, как описано Т. Канкель (Roberts and Kunkel, 1993).

Генетические методы.

В работе использованы стандартные методы генетики бактерий (Миллер, 1972) и дрожжей (Захаров и др., 1984, Winston et al., 1994).

Метаболическая активация промутагенов.

Полную активирующую смесь составляли, как описано Эймсом (Ames et al., 1973): 0,3 мл S9 фракции гомогенатов печени, 4 мМ НАДФ, 5 мМ глюкозо-6-фосфата, 8 мМ MgCl2, 33 мМ KC1 в 0,2 М фосфатном буфере. Неполная активирующая смесь не содержала НАДФ.Н генерирующей системы.

Мутагенез.

Опыты по мутагенезу у кишечной палочки проводили, как описано в руководстве Дж-. Миллера (1972) [см. 8,45].

Для индукции мутаций у дрожжей при действия ГАП культуры выращивали до стационарной фазы в жидкой среде YAPD, содержащей 50 или 100 мкг/мл ГАП, затем высевали на селективные среды и инкубировали 3-6 дней до появления колоний мутантов.

Для количественного измерения частоты индуцированных мутантов 6-18 независимых культур каждого штамма выращивали в жидкой среде YAPD, содержащей ГАП. После необходимых разведений клетки высевали на селективные среды для подсчета числа мутантов и на среду YAPD для определения числа жизнеспособных клеток в культуре.

Частоту мутантов в каждой культуре определяли по формуле f , где т - среднее

пк

число мутантов на чашке с селективной средой, п - среднее число колоний на чашке YAPD, к - коэффициент разведения. Для получения независимых мутантов бактерии выращивали в микроплате для титрования в LB с ГАП, затем клетки после 12 часов инкубации переносили квадратным репликатором на чашки с селективной средой, а дрожжи высевали специальным репликатором со 151 штырем на твердую среду YAPD, содержащую ГАП, и после двух суток инкубации переносили методом отпечатков на селективную среду. Мутантов отбирали по одному с каждого следа штыря репликатора, что гарантировало независимость их происхождения.

При проведении экспериментов по мутагенезу у диплоидов применяли модифицированную методику обработки клеток ГАП. Дрожжи выращиваи до середины логарифмической фазы роста, отмывали от среды и инкубировали с ГАП в жидкой полной среде в течение 2-х часов, что соответствует одному циклу репликации. Затем клетки отмывали от мутагена, инкубировали еще 4 часа и высевали на среды с селективной и полной средой, как описано ранее. Индукцию мутаций 2-АФ и 2-ацетил-АФ осуществляли так же, но с добавлением активирующей смеси и при повышенной (36° С) температуре инкубации.

Для определения частоты ревертантов, индуцированных ЭМС или пропиолактоном, дрожжи выращивали в жидкой среде YAPD до стационарной фазы, осаждали центрифугированием, ресуспендировали в стерильной воде в концентрации ~Ю8 клеток/мл и добавляли мутагены. Клетки инкубировали с мутагеном 1 час, осаждали центрифугированием, промывали водой и, после необходимых разведений, высевали на селективную среду для подсчета числа ревертантов и на среду YAPD для определения числа жизнеспособных клеток. Для измерения частоты ревертантов, индуцированных УФ-светом, дрожжи выращивали до стационарной фазы и после необходимых разведений высевали на селективную среду и среду YAPD. Перед инкубацией чашки облучали УФ-светом в дозе 60 S/m2. Частоты ревертантов, индуцированных ЭМС и УФ-светом, определяли по приведенной выше формуле.

Методы статистической обработки результатов.

Для оценки достоверности различий между выборками использовали непараметрические критерии Крускала - Уоллиса и Уилкоксона - Манна - Уитни. Стандартные отклонения и доверительные интервалы вычисляли стандартными методами, описанными в учебном пособии Глотова с соавторами (Глотов и др., 1982).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

ГЛАВА 1. АКТИВАЦИЯ И ИНАКТИВАЦИЯ МУТАГЕНОВ МИКРОСОМАМИ ПЕЧЕНИ ЖИВОТНЫХ И ПТИЦ.

Одной из первых стадий метаболизма мутагенов в организме человека и животных является микросомное окисление в клетках печени. Один из распространенных подходов

Число ревертактоа на чашку

| | - с активацией, полная активяшюиная система

Г-

" б" актвацни, неполная акгивационная система

Рисунок 1. Мутагенная активность ГАП, ГАЛ-рибозида и нитрозоморфолина в тесте сапьмонепла/микросомы с метаболической активацией и без нее (штамм Salmonella typhimurium ТА1535).

гяп

ГАП, I мкг ГАП-риб, 10 »кг шлроюморфолин S00 мкг

к исследованию метаболизма - тест Эймса, в котором для активации мутагенов используют препараты печени грызунов, а для детекции мутагенов - тестерные штаммы сальмонеллы. Эта система позволяет исследовать первую стадию превращений мутагенов в организме - неспецифический метаболизм чужеродных соединений. Применяя этот тест, мы показали, что мутагенная активность аналога оснований ГАП и его рибозида не модифицируется микросомными фракциями печени мышей в тех условиях, когда происходит метаболическая активация нитрозоморфолина [1] (Рисунок 1). Очевидно, цитохром Р-450 зависимые ферменты, локализованные на эндоплазматическом ретикулюме, не участвуют в метаболизме аналогов оснований в клетке (далее мы продемонстрируем, что в клетке существуют иные эффективные средства защиты от ГАП, Глава 2). Следовательно, стандартная система метаболической активации/деактивации, применяемая для изучения мутагенов в тесте Эймса, далеко не полностью моделирует метаболизм мутагенов.

Мы создали тестерные штаммы дрожжей, регистрирующие в селективных условиях мутагенное и рекомбиногенпое действия разнообразных мутагенов и адаптировали методику метаболической активации in vitro к данным штаммам [2-5]. В результате выянилось, что мутагенная активность циклофосфамида в примененных концентрациях полностью зависит от экзогенной метаболической активации и в тестах сальмонелла/микросомы, и - дрожжи/микросомы: препараты из печени животных, получавших индуктор микросомных ферментов, значительно превосходят контрольные по активности (Рисунок 2). При исследовании рекомбиногенного действия 2-аминофлуорсна мы столкнулись с особенностями дрожжевой системы, отличающими ее от системы с бактериями. Эффект 2-АФ проявляется на дрожжах по-разному в зависимости от метода выращивания культуры (Рисунок 3). 2-АФ являлся сильным рекомбицогеном только для клеток из логарифмической фазы роста из среды с глюкозой, но не галактозой, и был неактивен для стационарных клеток. В то же время, мы показали, что прямой мутаген, ЭМС, индуцировал рекомбинацию одинаково эффективно во всех грех типах клеток, а акридин-иприт, индуцирующий мутации более эффективно в логарифмических клетках, одинаково индуцировал рекомбинацию в логарифмических клетках из среды с глюкозой и галактозой. В чем же причина столь существенной разницы в рекомбиногенной активности 2-АФ? Мы предполагаем, что в клетках дрожжей, выросших до середины логарифмической фазы роста в среде с глюкозой, происходит дополнительная активация 2-аминофлуорена и его метаболитов эндогенными системами

Число рсвертантов на чашку

600 400 200 < 0

- тест сальмонелла/микросомы (штамм TAI 950), 500 мкг ЦФА на чашку [ , j - тест дрожжи/микросомы (штамм р2089), 3,8 мМ ЦФА

Рисунок 2. Сравнение эффективности метаболической активации циклофосфамида препаратами Э9 из печени контрольных (А) и индуцированных полихлорированными бифенилами (Б) мышей линии СВА.

ÜL

Контроль ЦФА ЦФА Контроль ЦФА ЦФА

активации дрожжей [5]. Известно, что именно в этих условиях в дрожжах наиболее выражен цитохром Р450-зависимый метаболизм (Callen and Philpot, 1977). Экзогенная активация являлась необходимой для проявления рекомбиногенной активности 2-АФ, причем степень активности препарата микросом в тесте с дрожжами коррелировала с ее активностью в тесте сальмонелла/микросомы. Так, мы исследовали метаболическую активацию препаратами печени курицы и показали, что они в целом более эффективны в обоих тестах, по сравнению с неиндуцированными и индуцированными препаратами печени мышей [7]. Тест дрожжи/микросомы является в этом случае перспективной моделью для изучения генетических эффектов промутагенов для тех тканей, которые подвергаются воздействию метаболитов промутагенов, генерируемых в печени и разносимых кровью по организму, где метаболизм промутагенов не столь интенсивен, как в печени. Использование же курицы в качестве источника активирующих ферментов позволяет повысить чувствительность теста и удешевить его.

Мы изучили в тесте дрожжи/микросомы мутагенное действие прямого мутагена, Дометил- Л^нитро-Л'-нитрозогуанидкна (МННГ), который может инактивироваться микросомными препаратами (Gentile et al., 1978). Результаты этих экспериментов приведены на Рисунке 4. Полная акгивационная система в 18 раз снижает действие МННГ, неполная - только в три раза, по сравнению с его действием в буфере. Следовательно, в инактивации этого алкшшрующего агента можно выделить компоненты,

Частота рекомбииантов на ' О5 выживших клеток

100

ЕЭ

□

ЕЭ

- среднее в кошроле без мутагена для всех типов культур дрожжей

- полная активирующая смесью и 0,22 мМ 2-АФ

- неполная активирующая смесь и 0,22 мМ 2-АФ

ей w¡

Рисунок 3. Рекомбиногенное действие 2-АФ в тесте дрожжи-микросомы (штамм П3288) на культуры, выросшие в разных условиях.

А - клетки из логарифмической фазы

в среде с глюкозой,

Б - клетки из логарифмической фазы

в среде с галактозой,

В - клетки из стационарной фазы

роста

К А Б В

как прямо связанные с активностью НАДФ.Н-зависимых микросомальных ферментов, так и независимые от них [4]. Инактивация МННГ микросомами указывает на необходимость рутинного применения метаболической системы при изучении с помощью микроорганизмов не только косвенных, но и прямых мутагенов, если на основе экспериментов предполагается предсказывать возможные генетические последствия действия этих мутагенов для животных. В результате проведенных исследований мы пришли к выводу о необходимости более подробного изучения внутриклеточного метаболизма ГАП (Глава 2). Разработанные методы применены в экспериментах но анализу мутагенной активности факторов среды. (Глава 7).

Частота ревертангов на J0 выжиешнх клеток

1000 <

500

ЕЯ - полная активирующая смесь ЕЗ - неполная активирующая смесь I I - инкубация в буфере

Рисунок 4. Мутагенная активность МННГ при инкубации в буфере и с Э9 фракциями печени мышей разного состава, (использована печень мышей СВАХС57В1/6).

2,5 5 10 2,5 5 10 2,5 5 позы МНКГ (мкг.мл)

ГЛАВА 2. ИССЛЕДОВАНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ МУТАГЕННОГО И ИНГИБИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ХИМИЧЕСКИХ МУТАГЕНОВ.

Общепринятой является классификация мутагенов по степени зависимости их действия от систем репарации клетки. Например, увеличение мутагенной активности исследуемого соединения у мутантов по системе эксцизионной репарации говорит о том, что продукты реакции мутагена с ДНК могут удаляться этой системой, а. отсутствие мутагенного эффекта у мутантов recA, итиС (Е. coli) или radö, rev3 (дрожжи) свидетельствует, что формирование мутаций происходит при участии системы мутагенной репарации. Мы исследовали генетический контроль действия ряда химических мутагенов, не изученных в этом отношении. Для этого мы не только изучили действие ряда мутагенов у мутантов по известным системам репарации, но и получили новые мутанты, чувствительные к мутагенам.

Бромистый этидий.

Мы получии штаммы дрожжей с повышенной чувствительностью к детергентам и показали, что они более чувствительны к индукции митохондриальных мутаций при помощи бромистого эгидия, по-видимому из-за изменения проницаемости клеток [11].

2-аминофлуорен и 2-ацетиламинофлуорен.

Мы изучили действие модельных канцерогенов 2-аминофлуорена и 2-ацетиламинофлуорена у дрожжей в условиях метаболической активации in vitro.

Таблица 2.

Зависимость генетических эффектов 2-АФ и 2-ААФ в условиях метаболической активации in vitro у дрожжей от системы эксцизионной репарации.

Канцероген/ мутаген доза мутагена мкг\мл или Дж/м2 штамм PV2 (RADl/radl-5): среднее число прототрофов на 106 выживших клеток: штамм PV3 (radl-5/radl-5): среднее число прототрофов на 106 выживших клеток:

по гисгидину (реверсии) по лизину (конверсия) по гистидину (реверсии) по лизину (конверсия)

2-АФ - 1,2+0,2 24±3 2,2±0,4 45±7

5 3,7+0,4 84+7 34,0±3,6 362±38

10 4,3+0,5 112+9 49,6±5,4 515±56

20 5,2+0,5 122+10 48,4+5,3 402±45

2-ААФ 5 1,3+0,2 39+4 27,1±3,3 338±40

10 1,9+0,3 50+5 33,1±4,0 419+49

20 2,9+0,4 65+7 38,5±4,7 463+55

УФ-свет - 2,3+0,3 21+3 5,4+0,7 66+10

25 5,6+0,5 97+8 24,7±4,1 657+99

Генетически опасными метаболитами этих химически схожих агентов являются Л'-окси-АФ и А-ацстокси-АЛФ, которые в разном соотношении генерируются при метаболизме обоих веществ. Мы выявили значительные эффекты мутаций по системе эксцизионной репарации [27], Таблица 2. Мы показали, что метаболиты 2-АФ и 2-ААФ индуцируют такие повреждения ДНК, которые устраняются системой эксцизионной репарации практически столь же эффективно, как и повреждения, вызванные ультрафиолетовым светом. Чувствительность штамма PV3, дефектного по эксцизионной репарации, возрастает на порядок по сравнению с контрольным штаммом PV2, по частоте индукции мутаций и в несколько раз - по индукции митотической конверсии. Интересным явилось наблюдение, что у штамма с интактной системой репарации 2-АФ проявляет большую, по сравнению с 2-ААФ, генетическую активность, а у штамма с дефектом репарации эффекты этих мутагенов практически одинаковы. Это можно объяснить предполагая, что 2-ААФ, метаболизируемый в нашей системе активации, генерирует больше аддуктов, репарируемых системой эксцизионной репарации, чем 2-АФ. Следовательно, индивидуальная чувствительность к канцерогенезу может определяться взаимодействием как минимум двух факторов: особенностей метаболизма мутагена и эффективности репаративных систем в клетке.

6-Л/-ГИДРОКСИЛЗМИНОПУРИН.

Особенно перспективным в настоящей работе нам представлялось изучить генетический контроль действия мутагена типа аналога оснований - ГАП, который является одним из немногих мутагенных аналогов, эффективных для эукариотических организмов (Хромов-Борисов, 1973). Детальная характеристика параметров его действия позволила бы использовать ГАП в качестве инструмента для изучения механизмов репликации [6, 17,41]. Суммарные результаты наших экспериментов приведены в Таблице 3.

В первой половине таблицы представлены данные, полученные при изучении действия ГАП у мутантов Salmonella typhimurium и Е. coli [8, 28,45,46,49]. Мутагенное и токсическое действие ГАП не зависит от общих систем репарации: эксцизионной

Таблица 3.

Генетический контроль мутагенного и токсического дейсвия б-Л'-гидроксиламипопурипа у бактерий и дрожжей._

Изменение чувствительности к мутагенному/токсическому действию у штамма с мутацией по сравнению со штаммами дикого типа:__

Резкое увеличение умеренное увеличение нет изменения снижение

a) Salmonella typhimurium AmrB-Ыо | | присутствие рКМ 101 |

б) Escherichia coli AuvrB-bio, mull mutDS (в минимальной среде), dnaQ49 (30°С) uvrA277, uvrBS, гесАЗб, итиСЗб, mutL, mutDS (в полной среде), dnaQ49(37°С) mulT, mutM, mutY dnaE9Il, dnaE915

в) Saccharomyces cei haml-I haml :LEU2 •evisiae ро12-4 (прямые мутации по генам САМ и URA3), ро13-01 (прямые мутации по гену САМ), aah!::URA3, ade2::URA3, ade!2-l radl-5, rad52::URA3 rad6:: URA3, rev3::LEU2, po/3-01 (прямые мутации по гену URA3), pms! ::LEU2, msh2::LEU2, hpt::URA3, ade6::HlS3 poll-I, pol2-l, pol2-3991, pol2-18, pol2-9, cdc2-2, texl, rfc2-l, pol30-6, aptl::URA3

(тгА277, т>гВ5), рекомбинационной и мутагенной (гесА56, итиСЗб) репарации. Мы интерпретируем эти данные как свидетельство того, что ГАП не формирует в ДНК аддукты, корректируемые этими системами. ГАП-мутагенез был также независим от репарации неспаренных оснований (РНО, мутация тшЬ). Следовательно, система этой пострепликативной репарации не узнает пары ГАП:Ц или ГАП;Т так эффективно, как пары неправильно спаренных природных оснований: мутации по РНО приводят у кишечной палочки к 100-кратпому возрастанию частоты спонтанных мутаций (БсИаярег, 1993), по-видимому из-за того, что содержащие ГАП пары незначительно отличаются от канонических пар по тем параметрам, которые оценивает система РНО. Эффект экзонуклеолитической коррекции (мутации ти/В5, (!па()49) был невелик и проявлялся только в тех условиях, когда система РНО не была насыщена неспаренными парами, возникшими спонтанно при отсутствии коррекции (рост в минимальной среде или при пониженной температуре). Очевидно, что ДНК-полимераза может корректировать ошибки, вызванные ГАП, но не очень эффективно. Известно, что предотвращение и устранение ошибок репликации может осуществляться на этапах подбора оснований, включения и элонгации после сформированной ошибочной пары. Антимутаторный эффект ряда аллелей гена ¿паЕ, кодирующего каталитическую субъединицу ДНК-полимеразы III является наиболее сильным доводом в пользу прямого участия релликативных ДНК полимераз в становлении ГАП-индуцированных мутаций. Предполагают, что мутации с{паЕ911 и йпаЕ915 дестабилизируют ДНК-полимеразу. Их

антимутаторный эффект можно объяснить следующим образом (Fialkowska and Schaaper, 1995). Дестабилизированная ДНК-полимераза может неэффективно проводить элонгацию после включения ГАП и диссоциировать. Увеличение времени жизни 3' конца новосинтезированой нити, заканчивающейся ГАП, увеличивает вероятность его удаления или ассоциированной корректирующей эндонуклеазой, или неспецифической экзонуклеазой. Таким образом, парадоксально, дефект полимеризации может приводить к увеличению точности синтеза ДНК.

Все перечисленные выше особенности генетического контроля действия ГАП у бактерий позволяют заключить, что он потенциально является одним из наиболее опасных мутагенов, который не инактивируется системой неспецифической деструкции мутагенов (Глава 1) и проявляет свое действие в клетках с интактными системами общей репарации и репликации. Однако, как мы выяснили в наших исследованиях, бактериальные клетки обладают мощными системами защиты от ГАП (Таблица 3). Сначала мы обнаружили, что штаммы сальмонеллы (тестеры Эймса), несущие делецию района uvrB-bio, сверхчувствительны к ГАП [В]. Эффект данной делеции на мутагенное действие другого аналога, 2-аминоГАП, был продемонстрирован ранее С. Janíon (1979). Таким же фенотипом обладали и штаммы кишечной палочки с делецией uvrB-bio [45]. Сверхчувствительность не связана с дефектом эксцизионной репарации, так как точковые мутации по генам uvrA277, uvrB5 не влияют на активность ГАП. Мы предположили, что делегированный район содержит гены, в норме защищающие от ГАП, и подтвердили это, получив точковую мутацию, приводящую к ГАП-сверхчувствительности, в одном из генов, картирующихся в данном районе бактериальной хромосомы в районе 18,7 минуты карты, который мы назвали mutl [46,49]. Возможно, эта мутация аллельна мутации тоеА, картирующейся в этом же районе. Ген тоеА контролирует синтез молибдоптерина -кофактора, необходимого для функционирования молибден-зависимых ферментов, каковыми у кишечной палочки являются, например, многие гены анаэробного метаболизма. В любом случае, выявленная нами система отлична от других, защищающих от аналогов, в частности, от системы защиты от 8-оксигуаяина (мутации по этой системе, mutT, mutM, mutY, не влияют на ГАП-мутагенез и чуствителыюсть, Табл. 3).

Мы изучили генетический контроль действия ГАП у эукариотического объекта -дрожжей S. cerevisiae [6, 8,12,16,2В, 38, 39,41-44,46-49] (Таблица 3). Так же, как и у бактерий, действие ГАП не зависело от общих систем репарации: эксцизионной (radl-5), рекомбинациониой (rad52::URA3), мутагенной (rad6::URA3, rev3::LEU2) и РНО (pmsl::LEU2, msh2::LEU2). Это согласуется с тем, что ГАП не являлся рекомбиногеном для дрожжей [1, 12], см. ниже. Так же, как и у бактерий, репликативные ДНК-полимеразы играли критическую роль в ГАП мутагенезе: он был усилен у мутантов с дефектами экзонуклеолитической коррекции. Эффект мутации ро12-4 (дефект экзонуклеазы, ассоциированной с полимеразой s) был более сильным, чем ро13-01 (такой же дефект полимеразы 5), как по абсолютному значению (Таблица 4), так и по широте проявления -наблюдался в двух использованных системах детекции прямых мутаций, тогда как эффект ро13-01 не проявлялся в гене URA3). Отметим, что эффект мутаций ро12-4 и ро!3-01 на ГАП-мутагенез был гораздо более четко выражен, чем у бактерий (см. выше). Это может быть объяснено тем, что у дрожжей каждая из мутаций по отдельности не исключает возможности экзонуклеолитической коррекции в целом (Morrison and Sugino, 1993), поэтому спонтанный мутагенез возрастает не настолько, чтобы была невозможной корректная оценка частоты мутаций, индуцированных ГАП, как это происходило при полной инактивации коррекции и насыщении РНО у бактерий.

Мутации, нарушающие собственно полимеразную активность всех трех репликативных ДНК-полимераз дрожжей (poll-/ нарушает взаимодействие ДНК-полимеразы а с праймазой, texl - температуро-чувствительная мутация в гене полимеразы

5, ро12-1 и pol2-3991 - инсерции гена URA3 и LEV2 в С-концевую часть гена полимеразы с, соответственно), будучи спонтанными мутаторами, приводили к сильному антимутаторному эффекту по отношению к ГАП-иидуцированному мутагенезу [47] (Табл. 3). Мы показали, что мутации по вспомогательным белкам ДНК-полимеразы (rfc2-l [37, 47] иро130-6 - температуро-чувствительные мутации по фактору репликации С и PCNA, соответственно) обладают аналогичным антиму гаторным эффектом. Следовательно, в норме, индуцированные ГАП мутации появляются при оптимальной работе репликацнонного комплекса.

Мутагенная активность ГАП контролируется общими системами метаболизма клетки, а также специфическими для него системами. Так, на активность ГАП влияли мутации по биосинтезу de novo и путям реутилизации пуринов [48] (Таблица 3). Резкое снижение ГАП-мутагенеза у мутантов aptl (по гену аденинфосфоркбозилтрансферазы, АФРТ) и отсутствие эффекта мутации hptl (по гену гуанин/ гипоксантинфосфорибозил-трансферазы) указывает на то, что АФРТ является основным ферментом, превращающим ГАП в соответствующий моиофосфат [46]. Так что, по крайней мере на уровне основания, ГАП опознается в клетке, как аналог адешша. Мутации по биосинтезу пуринов tie novo (см. Рис. 5) незначительно усиливали ГАП-мутагенез (ade2 - по гену АИР-карбоксилазы; и adel2 - по гену аденилосукцинат синтетазы) или не влияли на него (ade6 - по гену формилглицинамидриботяд амидотрансферазы). Вероятным механизмом этих эффектов являются, по-видимому, регуляторные воздействия этих мутаций.

Существенным было то, что мутанты по генам биосинтеза аденина de novo, блокирующие стадии до ИМФ, например ade2 и ade5, могут использовать ГАП в качестве источника аденина, а мутанты по гену аденилосукцинат синтетазы (adeI2), которые неспособны превращать ИМФ в АМФ (Рис. 5) и, соответственно, к росту на гипоксантине,

Таблица 4.

Частоты спонтанных и индуцированных ГАП мутантов Сапг и FOAr у штаммов ро12-4, pol3-01, pmsl и изогенного штамма дикого типа.

Мутаторная Частота мутантов Частота мутантов при Частота мутантов при

аллель без обработки ГАП дозе ГАП 50 мкг/мл дозе ГАП 100 мкг/мл

частота Сапг- мутантов (х 10"5)*

- 0.10 4.1 30.0

(штамм дикого (0.08-0.15) (3.2 - 5.3) (22.2-40.1)

типа)

ро12-4 0.86 24.9 125.6

(0.42- 1.30) (20.1 -33.4) (109.9-159.5)

poli-01 9.0 17.5 73.0

(4.4-11.4) (16.0-24.6) (62.3 - 98.0)

pmsl 3.3 НА 34.5 ■

(1.5-4.9) (31.3-41.0)

частота FOA-мутантов(х 10"6)**

- <0,1 9,0±1,7 56+11

(штамм дикого

типа)

ро12-4 6,0+0,8 40+0,4 215±15

ро13-0! 28+8 47±10 80+18

приведены медианные значения частот мутантов, измеренные а 9-19 независимых культурах, В скобках указан 95% доверительный интервал. НА - не анализировали.

**- приведены средние значения частот мутантов, измеренные в 3-4 независимых культурах

не растут и на ГАП. Это указывает на то, что одним из механизмов деструкции ГАП в клетке является аминогадролазная реакция, в результате которой ГАП превращается в гипоксантин. Действительно, мутации aahl (по гену аденин аминогидролазы) приводили к значительному увеличению ГАП-мугагенеза (Табл. 3).

К наиболее сильному увеличению ГАП-мутагенеза приводили мутации в гене НАМ1, первую из которых мы получили в 1986 шду у штамма 197/2d и показали, что она рецессивна и наследуется моногенно [12]. Биохимический дефект, к которому приводит эта мутация, пока не выяснен. Известно, что дизрупция гена HAMI не влияет на жизнеспособность дрожжей [42]. Мы клонировали этот ген, определили его нуклеотидную последовательность и попытались предсказать его функцию с помощью анализа гомологичных белков. В базе данных нуклеотидных последовательностей при поиске схожих открытых рамок считывания с помощью программы TBLASTN мы нашли 10 возможных гомологов НАМ1, 3 у эукариот, 7 у прокариот [46,49]. Ни один из них не имел выясненной функции. Гомолог E.coli находится на 67.5 минуте генетической карты, так что отличен от гена mull, также контролирующего ГАП-чувствительность. Консервированные районы располагались в схожих генах в колинеарном порядке. Это означает, что эволюция данного семейства белков находилась под жестким контролем отбора. В то же время, мы не обнаружили в данном семействе консенсусов белков, известных в базе данных PROSITE, следоватеьно, открытое нами семейство белков является новым. Консервирование семейства белков Haml указывает на то, что он играет важную роль в клетке. Пока неясно, участвует ли данный белок напрямую в защите клеток от эндогенно образующегося ГАП, или выполняет какую-то функцию в общем метаболизме.

АДЕНИН

— аденилосукцинат-синтетаза

биосинтез пуринов (Ade12)

de novo

ДАДФ

♦ - путь показан

только для дрожжей

ДНК

Рисунок 5. Метаболизм аденина у дрожжей и бактерий (Jones and Fink, 1982, Kornberg and Baker, 1992).

В скобках - названия генов или их продуктов у дрожжей-сахаромицетов.

Применение мутантов по гену НАМ1 позволило нам предоставить еще одно доказательство, что ГАП не индуцирует у дрожжей внутригенную митотическую рекомбинацию [12] (более ранние эксперименты см. [1]). Мы сконструировали изогенные диплоиды D275 и D278, гомозиготные и гетерозиготные по мутации haml-1, и несущие в гомозиготе хорошо ревертирующую под действием ГАП аллель his 7-1 и гетероаллельную комбинацию мутаций по гену ADE2 (см. Табл.1). Соответственно, при реверсиях к прототрофности по гистидину мы изучали индукцию мутаций, а при реверсиях к прототрофности по аденину - внутригенную митотическую рекомбинацию. Мы определили частоту индукции событий этих двух типов у штаммов D275 и D278 (Рисунок 6). Штамм D275 был сверхчувствителен к мутагенному действию ГАП, но не отличался от гетерозиготного штамма по мутированию под действием ЭМС. В то же время, штаммы не отличались по частоте индукции внутригенной рекомбинации, которую ГАП, в отличие от ЭМС, практически не индуцировал. Следовательно, мутагенный и рекомбиногенный эффект ГАП не коррелируют. Отметим, что неспособность к индукции митотической рекомбинации является необычной характеристикой ГАП, отличающей его от иных мутагенов, и согласуется данными об особенном генетическом контроле его действия (см. выше).

Приведенные в данной главе результаты позволяют представить цепь последовательных реакций, в результате которых экзогенный ГАП превращается в предмутагенный предшественник, включается в ДНК и индуцирует мутации (Рисунок 7). Белок Haml может, например, превращать ГАП или ГАПМФ в аденин или АМФ или неизвестное соединение (на Рис.7 эти гипотетическая стадии отмечены вопросом). Для того, чтобы возникла измененная последовательность ДНК, ГАП должен претерпеть множество изменений, каждое из которых последовательно приближает момент возникновения мутации. Это позитивные стадии ГАП-мутагенеза, его «мутагенная» составляющая. Чем эффективнее каждый из этапов, тем большим будет конечный мутагенный эффект. Однако, практически на каждой стадии мутагенный предшественник ГАП может быть необратимо инактивирован, это - негативные стадии в ГАП-мутагенезе, «антимутагенная» составляющая. Чем эффективнее они, тем слабее будет мутагенез. Мутации в генах «мутагенной» компоненты приводят к снижению ГАП-мутагенеза, а в генах «антимутагенной» составляющей - к его увеличению. Соотношение активности ферментов этих двух составляющих и будет определять мутагеный эффект ГАП. Универсальность мутагенного действия ГАП у самых разнообразных организмов указывает, что его мутагенный путь использует одни и те же консервированные в эволюции, взаимноотрегулированные стадии клеточного метаболизма. Использование более специфических механизмов будет делать мутаген более специфичным для определенных организмов. Так, близкий по структуре аналог - 2-аминоГАП, будучи мощным мутагеном у бактерий, практически не вызывает мутаций у дрожжей. Универсальный химический мутаген, следовательно, скорее исключение, чем правило.

ГЛАВА 3. МУТАЦИИ ПРИ РЕПЛИКАЦИИ ДНК IN VITRO В ПРИСУТСТВИИ АНАЛОГОВ ОСНОВАНИЙ.

Важную роль в настоящей работе играют аналоги оснований, позволяющие искусственно изменять точность репликации in vivo. Нам представлялось необходимым исследовать параметры действия аналогов оснований в наиболее простой системе, при синтезе ДНК in vitro, для того чтобы выяснить, каков принципиальный механизм их действия. Известно, что ГАГ1 в форме нуклеозвдтрифосфата может быть субстратом для ДНК-полимераз разного происхождения, заменяя в реакциях дАТФ, и, несколько хуже,

£редшинастота ревертантов His * на чашку Средняя частота ревертантов Ade* на чашку

730

500

250.

100 ,

JHHZ3L

2000

1500

1000

500

ГАП 250

ГАП

500

ЭМС 5000

ГАП

250

ГАП

500

ЭМС 5000

Рисунок 6. Индукция мутаций и внутригенной рекомбинации у диплоидов, гетерозиготных (белые столбики) и гомозиготных (серые столбики) по мутации ham1, при действии ГАП и ЭМС.

дГТФ (Abdul-Masih and Bessman, 1986). Мы решили исследовать, как происходит репликация ДНК, если в матрице присутствует ГАП [45] Для этого мы синтезировали олигонуклеотид с ГАП в определенном положении и исследовали, как Кленовский фрагмент ДНК-полимеразы I кишечной палочки подставляет предшественники напротив ГАП и контрольного «Г». Результаты приведены на Рисунке 8. Видно, что на контрольной матрице дЦТФ эффективно включается напротив двух гуанинов, давая полосу на два нуклеотида более тяжелую, чем в контроле, в то время как в этой же концентрации дТТФ практически не включается. При наличии всех четырех предшественников, синтез ДНК проходит до конца матрицы, более короткие фрагменты представляют незавершенный синтез, характерный для слабо процессивного фрагмента Кленова. На матрице, содержащей ГАП, включение дЦТФ происходит менее эффективно, чем на контрольной (концентрация предшественника увеличена на порядок), в то же время происходит включение дТТФ напротив ГАП с последующим неправильным включением дТТФ напротив «Г». Возможно, после первого «неправильного» включения ГАП точность полимеразы нарушается и для следующей пары. Результаты этого анализа показали, что и при нахождении в матричной нити ДНК ГАП проявляет свойства аналога оснований. Для исследования точности синтеза ДНК in vitro в присутствии аналогов, мы включали в реакции полимеризации 8-оксигуанозин дезокситрифосфат (дОГТФ), природный аналог оснований, образующийся в клетках при окислительном стрессе (Michaels and Miller, 1992). Мы выяснили, что дОГТФ в экви.молярной природным предшественникам концентрации существенно повышает частоту трансверсий АТ~>ЦГ при репликации векторной ДНК препаратами ДНК-полимераз или экстрактом клеток HeLa [36]. Это согласуется со способностью 8-ОГ образовывать пары с цитозином и, в «син»- конфор-мации, с аденином (см. Полтев и др., 1993, 1995). Частота индуцированных мутаций зависит от того, каким ферментом проводили реакции репликации, что указывает на активную роль ДНК-полимеразы при подборе комплементарных пар (Таблица 5). Наиболее склонной к совершению ошибок оказалась тсрмостабильная ДНК-полимераза

внеклеточный

ГЛП

гипоксантин

I пермеаза внутриклеточный

-ГАП-

аденин

аденин аминогпдролаза

ксантин океидаза АФРТ

ГАПМФ

ГАПДФ

рибоцукпеотид дифосфат редуктаза

дГАПДФ

нуклеотид дифосфат киназа

дГАПМФ

дГАПТФ

трифосфатаза

экзонуклеолитическзя коррекция

селекция предшественников ДНК-полимеразой

■ ГАП в составе ДНК

репликация ДНК-матриц с ГАП. репарация

ИЗМЕНЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ДНК

Рисунок 7. Гипотетический путь индукции мутаций при действии ГАП. Подчеркнуты стадии, непосредственно изученные в настоящей работе [42, 48, 49].

ТЛ, лишенная экзонуклеазной активности, наиболее точными, как и следовало ожидать, были экстракты клеток человека. Несколько неожиданной явилась высокая частота ошибок, совершаемых митохондриальной полимеразой у, поскольку именно в митохондриях наиболее интенсивен окислительный метаболизм. Можно предполагать, что механизм защиты митохондриальной ДНК от ОГТФ основан не на конечной,

Рисунок 8. Синтез ДНК in vitro на ГАП-содержащем олигонуклеотиде в качестве матрицы.

«К» - субстрат без полимеразы «дЦ» - полимеризация с 0,1 цМ дЦТФ в качестве предшественника (дЦ* - с 1цМ дЦТФ) «дТ» - полимеризация с 0,1 рМ дТТФ в качестве предшественника «все» - полимеризация со всеми четырьмя дезоксинукпеозид трифосфатами в качестве предшественников (20 рМ)

К дЦ дТ все К дЦ" дТ все контрольный олиг-д олигонуклеотад с ГАП

Таблица 5.

Ошибки синтеза ДНК in vitro в присутствии дОГТФ._

Препарат полимеразы или экстракт частота мутантов (х JO"1) транзиций AT—>ЦГ среди проанализированных мутантов частота ошибок АТ~>ЦГ (х 104) **

Кленовский фрагмент ДНК 340 17/20 19

полимеразы I, дикий тип

то же, Ехо" * 500 17/19 30

ДНК-полимераза фага Т4, 22 15/32 0,6

дикий тип

то же, Ехо" 120 16/47 2,7

полимераза ТА 1100 20/20 73

полимераза у 560 20/20 37

экстракт НеЬа 23 13/27 0,5

*- фермент, лишенный корректорской активности, ассоциированной с ДНК-полимеразой ** - частота этих ошибок при синтезе без 8-дОГТФ менее 0,01 (х 1С4)

полимеразной стадии, а осуществляется на более ранних ступенях мутагенного пути 8-ОГ. При сравнении ферментов, способных к коррекции, и их мутантных форм без этой активности, мы выяснили, что включающийся напротив «А» 8-ОГ может быть субстратом экзонуклеазной реакции, что особенно отчетливо видно для полимеразы фага Т4, обладающей мощной корректирующей активностью (уровень специфических ошибок в 4,5 раза больше дтя полимеразы, лишенной экзонуклеазы).

Так как ОГМФ образует строго определенные пары, тип индуцируемой им мутации однозначно указывает на то, в какую нить ДНК произошло его включение. Мы изучили частоту индуцированных дОГТФ ошибок в лидирующей и отстающей нитях ДНК, при репликации векторов, в которых ориджин репликации SV40 расположен по разные стороны от гена-мишени lacZa, экстрактами клеток HeLa (Таблица 6). Оказалось, что, в среднем, частота ошибок практически одинакова для обеих цепей, хотя в некоторых сайтах мутации возникали значительно чаще на отстающей цепи, а некоторых - на лидирующей [40]. Следовательно, аппарат репликации клеток человека в условиях in vitro реплицирует разные нити ДНК с одинаковой точностью.

Таблица 6.

Индуцированные дОГТФ ошибки АТ-->ЦГ на лидирующей и отстающей нитях ДНК при репликации in vitro ._________

Вектор, нить Количество сайтов, где детектируются мутации* Количество выявленных мутаций Частота ошибок (х Ю-")**

ориджин слева:

+ нить (отстающая) 25 11 32

- нить (лидирующая) 28 26 68

ориджин справа:

+ «ить (лидирующая) 28 23 52

- нить (отстающая) 31 45 91

* - в векторе, где ориджин расположен справа, выявляемость мутаций выше, чем в векторе, где ориджин расположен слева

** - частота других ошибок как минимум на порядок ниже, чем АТ—>ЦГ

ГЛАВА 4. АНАЛИЗ СПЕЦИФИЧНОСТИ МУТАГЕНЕЗА IN VIVO.

Системы для определения специфичности мутагенеза.

Изучение нуклеотидных последовательностей мутантных аллелей, возникших при действии мутагенов - один из основных подходов к расшифровке механизма действия этих мутагенов. Современными требованиями к системе анализа специфичности мутагенов in vivo являются:

О наличие простого селективного метода отбора мутантов О возможность быстрого генетического анализа мутантов

О оптимальный для определения нуклеотидных последовательностей размер гена (это требование должно бьггь увязано с требованием иметь достаточно большой ген для того, чтобы иметь определенное разнообразие нуклеотидных последовательностей) У бактерий одной из наиболее распространенных моделей является ген lacl кишечной палочки (Schaaper, 1993). Длина этого гена - 1100 н.п., поэтому анализ мутантов ограничивают только определением последовательности доминантных мутаций типа которые возникают в части гена, соответствующей N-терминальному району белка-репрессо-ра. Это сокращает размер ДНК-мншени до -240 н.п. Эта часть гена кодирует разнообразные функциональные сайты, изменения которых при заменах пар оснований (реже - при сдвигах рамки считывания) приводят к доминантным мутациям. У дрожжей-сахаромицетов для определения специфичности мутагенов применяют мутационные системы генов CYC1, HIS4, SUP4-0, URA3, CAN1 (Sherman, Fink, von Borstel, Kunz, Tishkoff, 1983-1996), LYS2 [18, 24,25, 29].

Специфичность мутагенного действия ГАП у бактерий и дрожжей.

Мы исследовали нуклеотидные последовательности мутаций, индуцированных ГАП в гене lacl кишечной палочки [45] (Рисунок 9) и в гене URA3 дрожжей [31] (Таблица 7). Так как ГАП является аналогом пуринов, его включение происходит напротив пиримидинов, следовательно, он маркирует нить, в которую происходит его включение, как и 8-ОГ (см. Главу 3), поэтому при анализе индуцированных им мутаций можно определить, с одинаковой ли частотой происходят индуцированные ГАП ошибки на лидирующей и отстающей нитях ДНК. У бактерий ГАП индуцировал премущественно транзиции обоих направлений с примерно равной эффективностью, у дрожжей преобладали транзиции ГЦ--> AT. По крайней мере для этого типа транзиций наблюдается

Мутации, индуцированные ГАП в гене URA3.

Таблица 7

Мутантная Номер Последовательность ДНК в Замена аллель_нуклеотида_районе мутации1_аминокислоты

Транзиции GC -> AT

ига 3-27 98 ААС TTG TGT GCT TCA Cys Туг

ига3-36 155 GCA TTA GGT CCC AAA Gl у -> Asp

иха3-35 268 СТС TTC GAA GAC AGA Glu Lys

игаЗ-2 271 TTC GAA GAC AGA AAA Asp -» Asn

игаЗ-6 271 TTC GAA GAC AGA AAA Asp -У Asn

игаЗ-7 271 TTC GAA GAC AGA AAA Asp -> Asn

игаЗ-18 271 TTC GAA GAC AGA AAA Asp -> Asn

игаЗ-28 271 TTC GAA GAC AGA AAA Asp Asn

игаЗ-15 345 GCA GAA TGG GCA GAC Trp -> опал

ига3-31 345 GCA GAA TGG GCA GAC Trp опал

ига3-43 437 CCT AGA GGC CTT TTG CT t— 'C —> Asp

игаЗ-5 591 TAC GAT TGG TTG ATT Trp -> опал

игаЗ-16 591 TAC GAT TGG TTG ATT Trp -> опал

игаЗ-40 591 TAC GAT TGG TTG ATT Trp опал

игаЗ-4 605 ATG АСА CCC GGT GTG Pro —> Lea

игаЗ-З 701 ATT GTT GGA AGA GGA Gly -> Glu

ига3-23 701 ATT GTT GGA AGA GGA Gly -> Glu

ига 3-19 706 GGA AGA GGA СТА TTT Gly -> Arg

ига 3-32 706 GGA AGA GGA СТА TTT Gly Arg

игаЗ-21 768 GCA GGC TGG GAA GCA Trp опал

ига 3-25 768 GCA GGC TGG GAA GCA Trp опал

Транзиции AT -> GC

urаЗ-29 257 TAC AAT TTT TTA CTC Phe Ser

ura3-24 278 GAC AGA AAA TTT GCT Lys -> Arg

ига3-33 281 AGA AAA TTT GCT GAC Phe -> Ser

ига 3-22 440 AGA GGC CTT T TG ATG Leu —» Pro

игаЗ-26 710 AGA GGA СТА TTT GCA Leu -> Pro

Трансверсии ОС -> ТА

игаЗ-1 93 CAA АСА AAC TTG TGT Asn -> Lys

игаЗ-20 93 CAA АСА AAC TTG TGT Asn -> Lys

ига3-34 340 ATA GCA GAA TGG GCA Glu охр

' Приведена последовательность аллели дикого типа, подчеркнута точка мутации.

сильная разница по частоте индукции мутаций в разных нитях ДНК. У бактерий в 6 возможных сайтах была обнаружена лишь одна мутация Г~>А, зато в 16 возможных сайтах мы нашли 26 замен Ц-->Т, Замены ГЦ-->АТ были распределены асимметрично по отношению к кодирующей и транскрибируемой нитям ДНК и у дрожжей: 20 из 21 транзиций являлись результатом замены пурина в кодирующей нити. Мы предполагаем, что аппарат репликации обладает асимметричностью в точности репликации нитей ДНК, что может быть связано с различными структурными требованиями к репликации относительно коротких фрагментов Оказаки на отстающей цепи (что может сильнее

Рисунок 9. Изменения нуклеотидной

последовательности гена /ас/ кишечной палочки, индуцированные ГАП.

проявляться у эукариот, где размер фрагмента в 10 раз меньше, чем у бактерий, в связи с необходимостью снятия нукпеосом в вилке репликации) и процессивным синтезом на лидирующей цепи.

Особенностью спектра мутаций, индуцированных ГАП, явилось наличие «горячих точек» мутагенеза, выявляемых в обеих системах, но особенно отчетливо заметных у дрожжей - около четверти всех транзиций ГЦ— >АТ являлись заменами «Г» в положении 271. Интересно отметить, что последовательность, окружающая эту точку, похожа на последовательность высокомутабильного сайта 75 в гене lacl, в котором мы локализовали б мутаций. Мотив ААГА(ГДД)А(ГЦ)А (подчеркнут мутирующий нуклеотид) общий для обоих сайтов, не может с высокой вероятностью встретиться по случайным причинам (Р < 0.05). Поскольку другие А-богатые мотивы в генах lacl и URA3 не являлись «горячими точками» мутагенеза, можно предположить, что именно ядро последовательности ААГА является наиболее ГАП-мутабнльным мотивом. Действительно, ни в одном из генов подобная последовательность больше ни разу не встретилась. Среди транзиций в гене URA3, возникших вне горячей точки, около 85% произошли в монотонных повторах ГЦ или AT пар, преимущественно в середине или 3' положении повтора пуринов. Низкая частота встречаемости замен 5' концевого нуклеотида повтора не может быть объяснена невозможностью выявить такие замены в данной системе селекции. По крайней мере нонсенс-мутации, возникающие главным образом за счет транзиций СС->АТ в триптофановых кодонах TGG, могут являться результатом замен как второго, так и третьего нуклеотида кодона, однако, замены были обнаружены только в третьем положении. Корреляции с монотонными повторами для ГАП-индуцированных мутаций у бактерий обнаружено не было. Следовательно, изучение данного типа мутаций может быть перспективным для понимания различий в контроле точности репликации у прокариот и эукариот.

Наличие «горячих точек» ГАП-мутагенеза может объяснять уникальную генную специфичность ГАП. Известно, что при получении красных аденинзависимых мутантов у дрожжей спонтанно, или при действии стандартных мутагенов, например УФ-света или ЭМС, соотношение мутантов по генам ade2/adel варьирует от 3:1 до 10: 1, при соотношении физических размеров генов 2: 1 (Ivanov et al., 1986). Соотношение мутантов adel/adel, индуцированных у дрожжей-сахаромицетов при действии ГАП - более чем

С т

GTG ААА ССА STA ACG ТТА TAG aia GTC ССА GAG TAT GCC GGT

30 <0 so 60 70

Г S

С Т G С

С Т G С Т

С CT G с G Т

С CT G с ТА G Т

GTC ТСТ TAT CAG ACC GTT тсс CGC GTG GTS ААС CAG GCC AGC

80 90 100 110

CT -а С

САС GTT ТСТ GCG AAA ACG ссс GAA ААА GTG GAA GCG аса ATG

120 130 НО 150

С ттт С

С тттт С

С ттт с

С С т т с

С CG г т с

GCG GAG CTG ААТ ТАС ATT ссс ААС ССС GTG GCA САА САА CTG

160 170 180 190

SOS

GCG GGC AAA CAG TCG TTG CTG ATT

200 210 220

40:1. Поскольку у другого вида дрожжей - Pichia methanolica, в генах ade! и ade2 (гомологичных соответсвенно adc2 и adel сахаромицетов) соотношение ГАП-индуцированных мутаций не асимметрично [14], можно предполагать, что в гене ADE2, дрожжей-сахаромицетов есть особые «сверхгорячие» точки ГАП-мутагенеза, однако при анализе нуклеотидных последовательностей обоих гомологичных генов [32] мы не нашли тех последовательности, которые являлись уже известными «горячими точками» ГАП- мутагенеза.

Мы создали также систему анализа мутаций в гене L YS2, включающую анализ фенотипов мутаций, изучение их супрессируемости, рекомбинационное картирование и секвенирование, и показали, что при индукции мутаций в нем мутагенами, вызывающими замены пар оснований, наиболее распространенным классом мутаций являются нонсенс-мутации [23, 24, 25, 30] (Таблица 8). Это делает данный ген перспективной моделью для изучения механизмов трансляционной супрессии. В то же время, тот факт, что в гене выявляются преимущественно мутации типа «нонсенс» свидетельствует, что замены типа «миссенс» с данной системе проявляются редко, что делает ее менее применимой для анализа мутагенов, вызывающих замены пар оснований, так как не все типы замен пар оснований приводят к нонсенс-мутациям. С другой стороны, ген LYS2 чрезвычайно удобен для анализа мутаций типа сдвиг рамки считывания и делений, вызванных эксцизией транспозоноа [18,29].

Таблица 8.

Характеристика природы индуцированных ГАП и ПРО мутаций fys2 на основании подавления их доминантными кодон-специфичными нонсенс-супрессорами.

Штамм вариант количество мутантов, супрессируемых нонсенс-супрессорами типов: всего супрессиру емых (%) всего мутантов

1 (охр) II (опал) III (амбер)

12T-D327 спонтанные 17 4 5 20(30,2) 68

ГАП 10 27 11 48 (40,3) 71

ПРО 9 29 27 65 (61,3) 97

139-D326 спонтанные 18 6 6 30 (43,5) 77

ГАП 7 42 11 60 (34,5) 92

ПРО 11 27 12 50 (54,3) 87

Всего 72 135 72 279 492

ГЛАВА 5. РОЛЬ РЕПЛИКАТИВНЫХ ПОЛИМЕРАЗ И ЭКЗОНУКЛЕАЗНОЙ КОРРЕКЦИИ В ИНДУЦИРОВАННОМ ГАП МУТАГЕНЕЗЕ НА ЛИДИРУЮЩЕЙ И ОТСТАЮЩЕЙ ЦЕПЯХ ДНК.

Роль экзонуклеолитической коррекции полимераз е и 5. Для изучения роли ДНК-полимераз е и 5 в коррекции ошибок репликации, индуцированных включением ГАП при синтезе лидирующей и отстающей нитей ДНК, мы скояструированли систему штаммов, позволяющих анализировать эффекты мутаций ро!2-4 и ро13-01 на частоту возникновения реверсий миссенс-мутаций в гене ПЯАЗ [41,43]. Мы использовали две аллели, игаЗ-24 и игаЗ-29, ревертирующие за счет транзиций ГЦ-*АТ, опосредованных включением ГАП в кодирующую (игаЗ-24) или транскрибируемую (игаЗ-

29) нити ДНК, и две аллели, игаЗ-4 и игаЗ-2, ревертирующие за счет транзиций ЛТ->ГЦ, опосредованных включением ГАП в кодирующую (игаЗ-2) или транскрибируемую (игаЗ-4) нити (см. Таблица 7). Схема возникновения индуцированных ГАП реверсий двух принципиальных типов этих мутаций изображена на Рисунке 10.

Для того чтобы убедиться, что реверсии возникают в результате специфических траязиций, восстанавливающих последовательность ДНК гена URA3 дикого типа, мы определили иуклеотидные последовательности аллелей гена URA3 более чем у 90 независимых ревертантов Ura+, включая спонтанные и индуцированные ГАП ревертанты, полученные у штаммов ро12-4,ро13-01 и штамма дикого типа. Все проверенные ревертанты мутантов игаЗ-24 (24 ревсртанта), игаЗ-4 (21 ревертант) и игаЗ-2 (12 ревертантов) содержали последовательность гена VRA3 дикого типа, то есть возникли в результате истинных обратных мутаций. Ревертанты штаммов иг а 3-20 возникали за счет двух типов замен: транзиций ЦГ—>ТА, восстанавливающих последовательность гена дикого типа, и трансверсий ЦГ-»АТ в том же сайте. Доля трансвсрсий была выше среди спонтанных реверсий (7 из 17 реверсий), чем среди индуцированных ГАП (2 из 17 реверсий), в соответствии с наблюдением, что ГАП индуцирует преимущественно транзиции.

Анализ влияния мутаций ро12-4 и ро!3-01 на частоту индуцированных ГАП реверсий выявил два класса аллелей игаЗ (Таблица 9). Частота индуцированных ГАП реверсий мутаций игаЗ-24 и игаЗ-4 была увеличена у штамма ро12-4, в то время как у штамма ро13-01 частота этих реверсий не отличалась от частоты реверсий у штамма РоГ. Частота реверсий мутаций игаЗ-29 и игаЗ-2, наоборот, была увеличена у штаммаpol3-0J, а значительного эффекта мутации ро12-4 на эти типы реверсий не обнаружено, за исключением реверсий мутации игаЗ-2 при дозе ГАП 50 мкг/мл. В этом случае выявлено слабое, но статистически достоверное увеличение реверсий и у штамма ро12-4.

Повышенная частота реверсий у штаммов с нарушением корректорской функции одной из ДНК-полимераз свидетельствует о том, что ошибки репликации, приводящие к реверсиям, корректируются этой ДНК-лолимераэой у штаммов дикого типа. Следовательно, реверсии мутаций игаЗ-24 и игаЗ-29, возникающие за счет одного и того типа транзиций, ГЦ—>Л'Г, являются результатом ошибок репликации, корректируемых разными ДНК- полимеразами: Pole в случае игаЗ-24 и Ро15 в случае игаЗ-29. Ошибки репликации, приводящие к реверсиям мутаций шаЗ-4 и игаЗ-2 за счет транзиций АТ->ГЦ, также корректируются разными ДНК-полимеразами: Pols в случае игаЗ-4 и PolS в случае игаЗ-2. Мы предположили, что роли Pole и PolS в предотвращении каждого конкретного типа реверсий определяются тем, в какую нить ДНК происходит включение ГАП при возникновении этих реверсий.

Для подтверждения этого предположения мутантные аллели игаЗ-24, игаЗ-29, игаЗ-4 и игаЗ-2 были встроены в хромосому III в двух ориентациях на расстоянии ~4,4 т. п. н. от активного ориджина репликации ARS306. Это позволило изучить влияние мутаций ро12-4 и ро13-01 на возникновение ошибок репликации, опосредованных включением ГАП при синтезе лидирующей или отстающей нити в одном и том же контексте ДНК (Рисунок 11 А и Б для мутации игаЗ-24). Ориентацию гена URA3, в которой 5" конец кодирующей нити ДНК расположен ближе к ARS306, обозначали LR, а противоположную ориентацию -RL. Влияние мутаций ро!2-4 и ро13-01 на частоты возникновения ревертантов Ura+ у штаммов с ориентацией мутантных аллелей LR, практически не отличалось от влияния этих мутаций на ревертирование мутаций игаЗ при естественном положении мутантных аллелей в хромосоме V: частоты реверсий мутаций игаЗ-24 и игаЗ-4 были увеличены

А.

игаЗ-29

-Иг-

ЛШ-

-РАП-

в.

игаЗ-4

-й-

-РАД-

-¥-- --Ц--

<-А- «-f-

ЦГ-> ТА ТА -->ЦГ

Рисунок 10. Механизм возникновения индуцированных ГАП реверсий миссенс-мутаций в гене URA3. Тонкие и жирные линии обозначают транскрибируемую и кодирующие нити ДНК, соответственно.

А. Включение ГАП. Б. Репликация содержащей ГАП матрицы. В. Фиксация реверсии

у штаммаро12-4), а частоты реверсий мутаций игаЗ-29 и игаЗ-2 увеличены у штамма ро13-0/(см. данные Рис. 11 А для мутации игаЗ-24). У штаммов с ориентацией аллелей игаЗ, обозначаемой RL, специфичность эффектов мутаций ро12-4 и ро13-01 была полностью противоположна той, что наблюдали в случае ориентации LR: реверсии мутаций игаЗ-24 (Рис.11 Б) и игаЗ-4 были увеличены у мутантовро13-01 и почти не изменены у мутантов ро12-4. Частоты реверсий мутаций игаЗ-29 и игаЗ-2, наоборот, были увеличены у мутантов ро12-4.

Способность ГАП образовывать комплементарные пары только с цитозином или тимином позволяет в принципе определить, в какую нить ДНК происходит включение ГАП при возникновении каждого типа реверсий. Однако, коррекция неспаренностей за счет экзонуклеазной активности ДНК-полимераз может происходить как на этапе включения ГАП в ДНК, так и во время репликации содержащей ГАП матрицы (Рисунок 10), поэтому нить, в которой происходит коррекция ошибки, не может быть идентифицирована однозначно. Есть две возможности. Если ГАП по способности образовывать комплементарные пары с другими основаниями in vivo имеет большее сходство с аденином, чем с гуанином, то, вероятно, ДНК-полимеразы преимущественно включают ГАП напротив "Т" и корректируют "неправильную" пару ГАП'Ц. Если,

Таблица 9.

Частоты спонтанных я индуцированных ГАП ревертантов Ura+ у штаммов ро12-4,ро13-01 и изогенных штаммов дикого типа.

Аллель Тип

Мутаторная

Частота Ura^ ревертантов при дозе ГАП*

URA3 реверсии аллель 0 мкг/мл, х10'6 50 мкг/мл, х10 100 мкг/мл, xl О"6

игаЗ-24 ГЦ- + AT - <0.02 18.2 38.3

ро12-4 0.076 (16.9-20.1) 72.7 (29.1 -40.1) 151.0

ро13-01 (0.018-0.081) 0.027 (0.021 -0.029) (57.6-92.1) 14.6 (12.7 -18.4) (124.0-182.1) 22.4 (10.2-28.3)

игаЗ-29 ЦГ- * ТА - 0.020 7.7 13.9

ро12-4 (0.013 - 0.024) 0.77 (7.2-8.8) 6.3 (10.7-17.7) 12.2

ро13-01 (0.36-1.13) 2.1 1.5-17.0) (5.0 - 8.6) 32.0 (29.2-40.1) (8.2-24.5) 42.5 (17.5 - 147.0)

игаЗ-4 ТА -> ЦГ - <0.02 6.2 12,0

ро12-4 <0.02 (5.4-7.1) 25.7 (10.4-15.5) 43.8

ро13-01 0.12 (0.07-0.23) (23.3 - 28.6) 5.6 (4.5 - 6.8) (30.9- 103.0) 9.8 (8.1 -21.5)

игаЗ-2 AT - *ГЦ - <0.01 0.53 2.0

ро12-4 <0.01 (0.45 - 0.57) 1.10 (1.5-2.3) 2.7

ро!3-01 <0.01 (0.85- 1.35) 4.2 (3.6 - 4.6) (2.1-6.7) 7.4 (4.8 - 8.9)

* - Приведены медианные значения частот ревертантов, измеренных в восьми независимых культурах. В скобках указаны 95% доверительные интервалы.

наоборот, ГАП используется в большинстве случаев как аналог гуанина, то ДНК-полимеразы должны узнавать и корректировать "неправильную" пару ГАП-Т.

Если преимущественно корректируется пара ГАП-Ц, то в случае транзиций ГЦ-» AT наблюдаемый эффект мутаций ро!2-4 и ро13-01 характеризует роль Pole и Ро15 в коррекции ошибок на этапе включения ГАП, а в случае транзиций AT—»ГЦ - на этапе репликации содержащей ГАП матрицы. Реверсии мутации игаЗ-24 происходят в результате включения ГАП напротив Ц при синтезе лидирующей нити ДНК в случае ориентации аллели, обозначаемой LR, и при синтезе отстающей нити ДНК в случае ориентации RL. Влияние мутаций ро12-4 и ро!3-01 на ревертирование игаЗ-24 свидетельствует, что коррекция пары ГАП-Ц осуществляется Pole в ориентации LR и PolS в ориентации RL. В случае реверсий мутации игаЗ-29 ГАП включается при синтезе отстающей нити ДНК и вырезается за счет 3'-*5' экзонуклеазной активности Ро18 в ориентации LR, а в ориентации RL ГАП включается при синтезе лидирующей нити ДНК, и коррекция пары ГАП-Ц осуществляется Рок. При возникновении реверсий мутации игаЗ-4 в ориентации LR включение ГАП напротив Т происходит при синтезе отстающей нити ДНК, но мы выявляем коррекцию пары ГАП-Ц, осуществляемую Pols в следующем

А.

ARS306

Б.

ARS306

игаЗ-24

частота индуцированных ГАП ревертантов на 10 выживших клеток 4000 -- 280

3000 2000 1000

210 140 -70 _

w.t. pott-4 pol3-01

w.t. pol2-4 pol3-01

Рисунок 11. 3'—>5' экзонуклеазы ДНК-полимераз 8 и e корректируют индуцированные ГАП ошибки при репликации разных нитей ДНК. В верхней части рисунки изображена вилка репликации и показаны места включения ГАП при реверсии мутации игаЗ-24 в разных ориентациях относильно ориджина рекпликации (LR и RL). В нижней части приведены частоты индуцированных ревертантов у штамма дикого типа и у штаммов с дефектами экзонуклеолитической коррекции в тех же ориентациях.

цикле репликации при синтезе лидирующей нити, когда напротив ГАП включается Ц. В случае ориентации RL аллели ura3-4 ГАП включается при синтезе лидирующей нити, но коррекция ошибки осуществляется PoIS при синтезе отстающей нити ДНК. Если следовать той же логике, в случае реверсий мутации игаЗ-2 пара ГАПС корректируется Ро15 при синтезе отстающей нити ДНК (ориентация LR) и Pols при синтезе лидирующей нити ДНК (ориентация RL). Таким образом, если пара ГАП С является предпочтительным субстратом для действия 3'-»5' экзонукпеаз, полученные нами результаты свидетельствуют, что Pols и Ро15 корректируют индуцированные ГАП ошибки при синтезе лидирующей и отстающей нитей ДНК, соответственно. Противоположное предположение о преимущественной коррекции пары ГАП-Т приводит к выводу, что Ро)§ корректирует ошибки в лидирующей нити ДНК, а Pols - в отстающей нити. В настоящее время этот вопрос открыт. Однозначным выводом является лишь то, что коррекция двумя

полимеразами осуществляется па разных нитях. Это может не обязательно означать, что эти ДНК-полимеразы не только корректируют, но и синтезируют ДНК на разных нитях ДНК, так как известно, экзонуклеазы ассоциированные с одной полимеразой, могут устранять ошибки, сделанные другой полимеразой (Perrino and Loeb, 1990, Morrison and Sugino, 1994).

Частота индуцированных ГАП мутаций в лидирующей и отстающей нитях ДНК.

Мы показали, что индуцированные ГАП ошибки возникают с разной частотой при репликации лидирующей и отстающей нитей ДНК: ГАП индуцирует реверсии мутаций игаЗ-24, игаЗ-29 и игаЗ-4 в 5-10 раз чаще в той ориентации мутантной аллели, в которой ошибки репликации, приводящие к реверсии, корректируются Pole (Таблица 10). В то же время частоты реверсий, индуцированных ЭМС и УФ-светом, действие которых не опосредовано ошибками репликации, не зависят от ориентации мутантной аллели. Следовательно, изменение ориентации аллели не влияет на вероятность возникновения или выявления ревертангов Ura+ посредством какого-либо механизма, не связанного с репликацией ДНК, и зависимость частоты индуцированных ГАП реверсий от ориентации аллели игаЗ отражает различия в контроле точности репликации лидирующей и отстающей нитей ДНК. Это согласуется с наблюдением, что 92% индуцированных ГАП прямых мутаций в гене URA3 являлись результатом ошибок репликации в одной нити ДНК.

Мутации, нарушающие полимеразную активность ДНК-лолимераз а, 8 и е снижают частоту индуцированных ГАП мутаций в "горячих точках" мутагенеза.

Реверсии мутаций игаЗ-24 и игаЗ-29 являются результатом замен "Г' в последовательности АГА, которая соответствует последовательности горячей точки, обнаруженной при анализе прямых мутаций игаЗ. Высокая частота ревертарования

Таблица 10.

Частоты спонтанных и индуцированных ГАП, ЭМС и УФ-светом ревертантов Ura+ у штаммов с разными ориентациями аллелей URA3.

Аллель Мутаген' Частота индуцированных ревертантов*, х10"

URA3 Ориентация LR Ориентация RL

игаЗ-24 ГАП 388 ±8 (6) 53+7(6)

ЭМС 352 + 64(6) 325 ±22 (6)

УФ-свет 185+40 (3) 123 ±35(3)

игаЗ-29 ГАП 119 + 29(6) 1030 ±78 (6)

ЭМС 291 ±57(6) 166 ±30 (6)

УФ-свет 40 ±5(3) 46 ±11(3)

игаЗ-4 ГАП 109 ± 11 (6) 23 ± 8 (6)

УФ-свет 26 ±6(3) 32 ± 9 (3)

* -Приведены средние значения частот индуцированных ревертантов ± стандартное отклонение. В скобках указано число независимых измерений. Частоты спонтанных ревертантов во всех экспериментах не превышали 2x10'®.

' Доза ГАП составляла 100 мкг/мл. Частоты ревертантов, индуцированных ЭМС и УФ-светом измерены, как описано в разделе "Материалы и методы".

мутаций игаЗ-24 и игаЗ-29 наблюдается только в том случае, когда мотив АГА находится в составе лидирующей нити ДНК (ориентация LR для аллели игаЗ-24 и ориентация RL для аллели игаЗ-29). Изменение ориентации аллели, сопровождающееся перемещением мотива АГА в отстающую нить ДНК, приводит к снижению частоты реверсий в 7-11 раз (Таблицы 10,11).

Мутации pol2-3991,pol3t и poll-1 снижают частоты реверсий преимущественно в той ориентации, в которой реверсии возникают на порядок чаще, так, например, частота реверсий игаЗ-24 в ориентации LR снижается почти на порядок у мутантаро12-3991, но не изменяется в ориентации RL [47] (Таблица 11). В результате у мутантов с дефектами ДНК-полимераз разница между частотами реверсий в двух ориентациях становится значительно меньше, чем у штаммов дикого типа, или полностью исчезает. Мутация ро12-3991 нарушает взаимодействие каталитического полипептида Pols с другими субъединицами этой полимеразы (Morrison and Sugirió, 1993). Мутация poll-1 нарушает стабильность комплекса каталитической субъединицы Pola с ДНК-праймазой (Lucchini et al, 1990). Биохимический дефект, вызываемый мутацией pol3l, не исследован. Сходство эффектов мутаций в генах разных ДНК-полимераз на индуцированный ГАП мутагенез позволяет предположить, что все эти мутации вызывают один и тот же функциональный дефект аппарата репликации, например, изменения стабильности или процессивности реплисомы, который снижает вероятность включения ГАП или использования содержащих ГАП праймеров для реакции полимеризации. Итак, мы показали, что появление «горячих точек» мутагенеза обусловлено оптимальным, закрепленным в эволюции функционированием аппарата репликации; нарушения репликативного комплекса «сглаживают» спектры распределения мутаций. Имеет ли это эволюционное значение, пока неясно.

Таблица 11.

Частоты спонтанных и индуцированных ГАП реверсий мутации игаЗ-24 у штаммов РоР, pol2-3991, pol3t и pol 1-1*._

Ориентация LR_Ориентация RL

Аллели генов ДНК-полимераз Частота ревертантов без обработки ГАП (х 10"8) Частота ревертантов при дозе ГАП 100 мкг/мл (х 10"8) Частота ревертантов без обработки ГАП (х 108) Частота ревертантов при дозе ГАП 100 мкг/мл (х 10'8)

POL2+ <2 318 (213 -339) <1 33.1 (20.2 - 56.7)

ро12-3991 <4 49.1 (24.8 - 74.7) <3 27.3 (21.2-37.5)

poll-1 <6 7,8 (6,5 - 32,7) <2 5,3 (4,3-8,1)

POL3 + <2 565 (484 - 687) <1 63.6 (47.6 - 79.4)

pol3t <1 122 (112-158) <2 43.9 (29.2-62.1)

* - Приведены медианные значения частот ревертантов, измеренные в девяти независимых культурах. В скобках указаны 95% доверительные интервалы.

ГЛАВА 6. МУТАГЕНЕЗ У ДИПЛОИДОВ И ГАПЛОИДОВ ДРОЖЖЕЙ.

Мутации при возникновении в половых клетках многоклеточных организмов приводят к возникновению наследственных заболеваний, а при возникновении в соматических клетках - к возникновению злокачественных опухолей и иных опасных заболеваний. Традиционым является изучение мутагенеза у гаплодных клеток. Это обусловлено историческими и техническими причинами: первые способы учета мутаций были разработаны для половых клеток дрозофилы, а затем надолго основным объектом мутационных исследований стали гаплоидные микроорганизмы. Очевидно, изучение возникновения мутантов у диплоидных клеток является важной и актуальной задачей. Большинство мутаций - рецессивны. Следовательно, они проявляются у гаплоидов и, находясь в гетерозиготе, не проявляются у диплоидов. Можно было бы ожидать, что мутанты у диплоидов будут возникать гораздо реже, чем у гаплоидов. Однако, частота спонтанных, и индуцированных УФ-светом и у-излучением мутантов у диплоидов дрожжей лишь на порядок ниже, чем у гаплоидов (Инге-Вечтомов и др., 1980, Горденин и Инге-Вечтомов, 1981, Чернов и др., 1985). Высокая частота определяется двухступенчаым механизмом возникновения мутантов - мутирования одной копии гена н выходом ее в гомозиготу при митогической рекомбинации, которую чрезвычайно эффективно индуцируют физические мутагены.

Дрожжи-сахаромицеты являются удобной моделью для изучения мутагенеза у диплоидов, так как диплоиды (и полиплоиды) митотически стабильны. Мы изучили механизмы возникновения мутантов у дрожжей разной плоидности при действии химических мутагенов - алкилирующего агента пропиолактона и аналога оснований ГАП [15,19,20,28]. Результаты приведены в Таблице 12. Оба мутагена являются сильными мутагенами у гаплоидов, увеличивая частоту мутантов по сравнению со спонтанной более чем на два порядка. У гомозиготных по гену LYS2 диплоидов частота индуцированных пропиолактоном мутантов более чем на два порядка ниже, чем у гаплоидов, а частота индуцированных ГАП мутантов - лишь на порядок ниже. Кроме того, мы выяснили, что ГАП индуцировал, а отличие от ПРО, мутантов даже у тетраплоида. Частота индуцированной гомозиготизации !ys2 у гетерозиготного дишгоида - на порядок более частое событие, чем мутирование у гаплоида. Пропиолактон более эффективен, чем ГАП, в индукции этих событий. Для того, чтобы понять механизм индукции мутантов у диплоида и тетраплоида, мы провели их генетический анализ. Диплоид D328 и тетраплоид IV-10 маркированы по II хромосоме (см. Табл 1), мы ожидали два типа мутантов (Рисунок 12):

- при возникновении по механизму «мутирование-кроссинговер» мутанты Lys" будут а) гомоаллельными по LYS2 и б) в значительной пропорции - гомозиготными по фланговому маркеру lyrl

• при возникновении мутантов по механизму «независимое мутирование гомологов» мутанты Lys" будут а) гетероаллельными по LYS2 и б) гетерозиготными по фланговому маркеру.

Результаты этого анализа представлены в Таблице 13. Оказалось, что мутанты, индуцированные ПРО, в основной массе слабо ревертируют при действии УФ-света, но зато их появление часто сопровождается гомозиготизацией флангового маркера (частота около 30%, что и следует ожидать при митотической гомозиготизации - ведь гомозигот по нормальной аллели TYR1 мы не выявляем. Мутанты, индуцированные ГАП, являются в

Таблица 12.

Индукция мутантов по гену у штаммов дрожжей разной плоидности при действии ГАП и пропиолактона.

Мутаген штамм плоид- экспе- выжи- частота 95%

и доза ность, римент ваемость индуциро- доверитель-

(мкг/мл) аллели (%) ванных ный

гена мутаций интервал

** (Х10"*)

пропио- 186А- 1 п, + 1 36 200 79-321

лактон, D327

2 46 378 223 - 533

53P-D327 1 и, + 1 31 411 276 - 546

2 35 493 297 - 689

D328 2 п, +/+ 1 54 1,1 0,6 - 1,5

2 54 1,1 0,6 - 1,6

D362 2 п, +/- 1 57 4580 2650 - 6510

2 59 3330 2030 - 4630

ГАП, 100 186А- 1 п, + 1 87 207 140 - 274

D327

2 95 468 351 -585

53T-D327 1 п, + 1 95 497 376-618

2 86 197 166-228

D328 2 п, +/+ 1 103 29 21-37

2 97 17 13-20

D362 2 п, +/- 1 103 1950 1340-2560

2 102 2260 1700 - 2760

Примечание

* - (+)- аллель дикого типа, (-) -мутантная аллель

** - спонтанная частота мутантов у гаплоидов -1СГ"\ у гомозиготных по гену ЬУБ2 диплоидов -менее чем 10"8, у гетерозиготных по гену ¿1Ж? дипломов - 10"4

основном часто ревертирующими и остаются по-прежнему гетерозиготными по фланговому маркеру. Высокая частота ревертирования может быть связана с тем, что в диплоиде появились две разные аллели гена £Т52, и прототрофы появляются за счет внутригенной митотической рекомбинации. Для того, чтобы доказать это, мы провели дополнительный более точный анализ мутантов, индуцированных ГАП у диплоидов. Мы выводили в гомозиготу каждую из мутаций компаунда и картировали ее с помощью системы делеционного внутригеиного картированния. Этот анализ показал, что 87% мутантов, индуцированных у штамма Б238, являются гомоаллельными, но, как минимум, 80% мутантов, индуцированных ГАП, являются гетероаллельными. Следовательно, ПРО индуцирует мутантов у диплоидов по механизму «мутирование-рекомбинация», а ГАП -по механизму «независимое мутирование двух гомологов». Расчетная частота появления индуцированных ПРО мутантов составляет около 2 X 10 ~6 , что практически совпадает с экспериментально полученной частотой возникновения мутантов у диплоида. Для ГАП расчетная частота независимого появления двух мутаций у В238 должна равняться

О LYS2 1 ' 1 tyrl - 1 l

LYS2 TYR1

о 1 ' 1 1

мутировапие-кроссипговео^-'—"" независимое

мутирование

гомологичных

генов

lys2-x tyrl lys 2-х tyrl

О г П "1 -1-1 (~) | Q | | | |

lys2-x 1 tyrl lys2-y TYR1

С) 1 ш 1 1 1 n i a i i i

ИЛИ

lys2-x TYR1

О г П 1 . 1 \

lys2-x TYR1

п г а 1 1 .. . 1

Рисунок 12. Механизмы появления мутантов с рецессивным фенотипом у

диплоидов.

произведению частот мутирования исходных гаплоидных штаммов и составит около 0,1 X 10'6, что более чем на два порядка меньше, чем частота, реально наблюдаемая в эксперименте. В чем разрешение этого очевидного парадокса? Мы предположили, что частота выявления ГАП-индуцированных мутантов у гаплоида не отражает истинную частоту их появления. Дтя того, чтобы оценить частоту индукции мутантов в одной копии гена LYS2 у диплоида, мы исследовали природу Lys- клонов, индуцированных ГАП у гетерозиготного по гену LYS2 диплоида D362. Оказалось, 85% из них гетероаллельны (проверено 196 клонов), то есть возникли не при митотической гомозиготизации рецессивной аллели, а при возникновении новой мутации. Следовательно, частота мутирования одной копии генаЛУХ2 у диплоидов - около 2 X 10 "3. Расчетная частота одновременного мутирования обоих гомологов - в этом случае - 4 X 10"6, что ближе к экспериментальной частоте. Эти эксперименты подтвердили ранее сделанный вывод о том, что ГАП не индуцирует митотическую рекомбинацию у дрожжей (см. Глава 2), уже для случая межгенной рекомбинации. Для того, чтобы подтвердить необходимость диплодного состояния для высокой частоты возникновения мутантов при действии ГАП, мы сконструировали гаплоид с дупликацией гена LYS2 и показати, у него мутанты Lys" практически не возникают, тогда как у диплоида с тремя копиями LYS2 ГАГ1-мутабильность существенная, такая же, как и у триплоида.

Каковы же причины пониженной ГАП-мутабиьности гаплоидов? Мы предполагаем, что большую часть индуцированных у них мутантов мы не выявляем, так как ГАП индуцирует, помимо мутаций в гене LYS2, мутации в жизненноважных генах дрожжей. Это приводит к гибели мутантных гаплоидных клеток. У диплоидов данные дополнительные мутации находятся в гетерозиготном состоянии и не приводят к гибели клетки. Для проверки этого преположения мы провели тетрадный анализ обработанных ГАП клонов диплоидного штамма. Результаты экспериментов по оценке выживания

Таблица 13.

Генетический анализ мутантов по гену ЬУ52 индуцированных ГАП и ПРО у диплоида и тетраплоида..

штамм, всего нечет чет- количество четких мутантов с мутантов с

мутаген мутан- -ких ких мутантов с гомозиготи- гомозиготи-

тов индексом зацией tyrl зацией не

ревер гаровашя * сцепленных

с LYS2

маркеров

0-20 20-50 >50

D328, 153 41 112 89 10 13 48 3

ПРО

D328, 215 83 132 20 14 98 4 4

ГАП

IV-10, 236 176 99 21 23 55 12 9

ГАП_

Примечание

*- среднее число УФ-индуцированных (25 Дж/м2) ревертаптов на штрих

гаплоидных аскоспор (фертильности гибрида) представлены в Таблице 14. В контроле все 20 проанализированных тетрад обладали фертильностью более 20%. Из 29 мутантов, полученных при действии ПРО, лишь один был с резко сниженной фертильностью. Практически все ГАП-мутангы обладали фертильностью, близкой нулю, тогда как немутанты, но обработанные ГАП, обладали промежуточной фертильностью. Следовательно, геном диплоидных ГАП-мутантов действительно насыщен рецессивными мутациями. То, что иемутацтные клетки обладают более высокой фертильностью, по срвнению с мутантными, свидетельствует о том, что мутанты происходят из фракции клеток с повышенной ГАП-мутабильносгью.

Таблица 14.

Сравнение фертильности мутантных по гену LYS2 и немутантных клонов диплоида П3887, полученных в контроле и после обработки ГАП и ПРО._

Тип клонов, число клонов с фертильностью :

мутаген 0 - 25% 25 - 50% > 50%

контроль (без обработки) 0 0 20

немутантные 15 5 24

клоны, ГАП

мутанты Lys" ГАП 38 5 0

мутанты Lys' ПРО 1 11 17

Особенностью сверхвысокого фона мутабильносги при репликации, следовательно, является резкое различие в оцениваемой мутабильности гаплоидных и диплоидных клеток. Вслед за нами к подобным выводам пришли исследователи мутаторных штаммов дрожжей с нарушениями репарации неспаренных оснований и экзонуклеолитической коррекции (Morrison et а)., 1993, Morrison and Sugino, 1994). Оказалось, что некоторые комбинации мутаций но репликации можно получить только у

дипломов, ввиду нежизнеспособности гаплоидов со сверхвысоким уровнем мутабильности.

Известно, что ГАП вызывает неопластическую трансформацию клеток млекопитающих в культуре. Следовательно, этот агент может быть применен для анализа механизмов канцерогенеза при нарушении точности репликации.

Уникальные свойства ГАП могут облегчить создание коллекции мутантов тех видов дрожжей, для которых известны только диплоидные штаммы, особенно в том случае, когда они имеют гомеологичные хромосомы, между которыми затруднена рекомбинация, или у видов, где гомологичная рекомбинация происходит не так часто, как у дрожжей-сахаромицетов [33].

ГЛАВА 7. ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ РЕГИСТРАЦИИ МУТАГЕНОВ НА ОСНОВЕ ШТАММОВ ДРОЖЖЕЙ.

На основании теоретических разработок, описанных выше мы сконструировали штаммы дрожжей для выявления мутагенов в среде обитания человека [1, 2,11, 10, 34, 35]. Наиболее общими тестерами являются штаммы р2089 (для детекции индукцни точковых мутаций), П3288 (для детекции агантов, индуцирующих митотическую рекомбинацию), и более универсальные штаммы РУ2 и РУЗ, позволяющие детектировать одновременно индукцию точковых мутаций разных типов, внутригенную и межгенную митотическую рекомбинацию, возникновение митохондриальных мутантов.

Таблица 15.

Исследование мутагенной активности контрольных мутагенов, канцерогенов, немутагенных с тестс Эймса, и неканцерогенов с помощью тестерных штаммов дрожжей РУ2 и РУЗ.

группа мутагенов

мутагены

отношение числа тестов с позитивным ответом к общему числу проведенных тестов

процент выявления

позитивные ПРО, диэпоксиоктан, контроли ICR-170, ЭМС, ГАП, 2-АФ,

циклофоефамид

PV2

РУЗ

119/181

123/181

канцерогены, не выявляемые в стандартном тесте с

сальмонеллой

гексаметил фосфорамид, сафрол, о-толуидин, бензол,

диэтилгексилфтапат, акрилолнитрил, фенобарбитал, диэтилстибэстрол

PV2

14/110

РУЗ

10/100

неканцерогены капролактам, бензоин

PV2 РУЗ

5/38 3/38

13 7

Эти штаммы отличаются по способности к эксцизионной репарации. Кроме того, мы создали ряд более специфических тестерных штаммов, например, чувствительных к детергентам, с измененной оболочкой клетки [11]. Результаты нашей работы [10] по оценке генетической активности канцерогенов, не выявляемых в тесте Эймса, проведенной в рамках Международной программы ВОЗ, приведены в Таблице 15. В первой строке приведены результаты тестов с контрольными мутагенами. Дрожжевая система обладала высокой специфичностью выявления мутагенов (более 60% позитивных ответов). В то же время, дрожжевые тестерные штаммы не реагировали на химические соединения, проявляющие свои биологические эффекты (включая канцерогенную активность) иным, нежели действие на ДНК, способом - процент позитивных результатов снижался до десяти в остальных группах проверенных соединений.

Наши штаммы апробированы в работах по изучению мутагенной активности разнообразных факторов окружающей среды: загрязненная металлами почва (Си, Ni, Со, Zn, Ре20з, AI2O3, MnO, V2O5, CR2O3) промплощадок горнообогатительных заводов была токсичной, но не мутагенной [26], стимулятор роста лентехнин был также немутагенен [9], гипербарическая оксигенация (6 атм. кислорода в течение 1-22 часов) приводила к существенному возрастанию частоты митотической рекомбинации [13].

ВЫВОДЫ

Создана система для анализа молекулярных механизмов мутагенеза и антимутагенеза у прокариотических и эукариотических микроорганизмов. Изучены механизмы становления мутаций при ошибках репликации и при ошибках репарации, клеточные системы защиты от мутагенов, особенности мутагенеза в эукариотических клетках:

1. Исследованы сравнительные параметры метаболической активации и инактивации мутагенов in vitro в системе микросомы печени мыши или курицы/сальмонелла или дрожжи; изучен генетический контроль мутагеного действия 2-АФ и 2-ААФ в условиях метаболической активации - показано, что генетические эффекты этих мутагенов зависят от состояния системы эксцизионной репарации и стадии роста дрожжевых культур; препараты макросом инактивируют МННГ и не влияют на мутагенное действие ГАП.

2. Получены и охарактеризованы мутанты дрожжей, сверхчувствительные к мутагенному действию аналога оснований ГАП; показано, что ген НАМ1, контролирующий ГАП-мутабильность, консервирован в эволюции и имеет гомологи у широкого спектра организмов, от кишечной палочки до человека.

3. При изучении генетического контроля мутагенного действия аналога оснований ГАП проанализирован путь последовательных реакций, приводящих к возникновению мутаций при действии ГАП; в результате получена возможность контролировать эффективность мутагенного действия ГАП на дрожжи и бактерии; при помощи такого подхода показано, что ГАП, в отличие от большинства мутагенов, не является у дрожжей индуктором митотической рекомбинации.

4. Исследованы параметры репликации ДНК in vitro в присутствии аналогов: показано, что ГАП проявляет амбивалентные кодирующие свойства при синтезе ДНК Кленовским фрагментом ДНК-полимеразы 1 при использовании олигонуклеотида-матрицы, содержащего данный аналог основания в определенной позиции; выяснено, что аналог оснований 8-оксодезоксигуанозин трифосфат (8-дОГТФ), присутствующий в ДНК-полимеразной реакции in vitro в количестве, эквимолярном концентрации природных предшественников, провоцирует ошибки ДНК-полимераз, корректируемые экзонуклеазной активностью этих полимераз; распределение мутаций в результате

ошибок репликации ДНК в присутствии 8-дОГТФ экстрактами культуры тканей человека в целом одинаково в (+) и (-) цепях вектора.

5. Изучена молекулярная специфичность мутагенного действия ГАП у бактерий и дрожжей; продемонстрировано, «по ГАП индуцирует в бактериальном гене lad ив дрожжевом гене URA3 транзиции ГЦ—>АТ и АТ->ГЦ, горячими точками транзиций ГЦ->АТ являются последовательности ДНК типа «АГА» и, только у дрожжей, монотонные повторы нуклеотидов; индуцированные ГАП мутации асимметрично распределены в транскрибируемой и нетранскрибируемой нитях ДНК.

6. ГАП применен для изучения механизмов репликации у эукариот: при изучении ГАП-мутагенеза у штаммов дрожжей с отсутствующей экзонуклеазной активностью ДНК-полимераз е или 8 показано, что пары ГАП с нормальными основаниями могут корректироваться при синтезе ДНК in vivo; создана модель для изучения провоцируемых ГАП ошибок репликации при синтезе лидирующей и отстающей нитей ДНК у дрожжей и установлено, что ДНК-полимеразы s и 8 корректируют провоцируемые аналогом ошибки репликации на разных нитях ДНК; индуцированные ГАП ошибки возникают существенно чаще на той цепи ДНК, коррекция которой осуществляется ДНК-полимеразой эпсилон.

7. Показано, что «горячие точки» ГАП-мутагенеза исчезают при инверсии гена-мишени в хромосоме, следовательно, их возникновение определено способом репликации определенной нити ДНК; актимутаторные мутации в генах всех трех репликативных ДНК-полимераз дрожжей оказывают свой эффект за счет резкого снижения мутагенеза только в этих точках и только на одной нити. Следовательно, оптимальная работа репликативного комплекса определяет возникновение "горячих точек" репликативного мутагенеза.

8. У диплоидов дрожжей индуцированные мутанты с рецессивным фенотипом появляются лишь на порядок-два реже, чем у гаплоидов. Пропиолактон индуцирует таких мутантов по двухступенчатому механизму «мутирование-рекомбинация», а ГАП по механизму «возникновение мутаций в обеих копиях гена», при этом геном диплоидных клеток оказывается насыщенным рецессивными летальными мутациями в гетерозиготном состоянии.

9. Созданы и апробированы штаммы дрожей для регистрации мутагенов и для детекции мутагенов среди канцерогенных факторов и в сложных смесях.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Павлов Ю.И, Ланге Е.Л., Хромов-Борисов H.H. Изучение генетической активности 6-гидроксиламинопурина и его рибозида на штаммах Salmonella typhimurium и Saccharomyces cerevisiae. В сб:"Исследования биологического действия факторов, загрязняющих водоемы", 1979. Из-ство Иркутского университета, с. 11-30.

2. Павлов Ю.И, Хромов-Борисов Н.Н.Метаболическая активация промутагенов в тесте дрожжи-микросомы. Сообщение 1. Подбор и конструирование штаммов и методы их проверки. Генетика, 1981, 17(8), с. 1406-1413.

3. Pavlov Y.I., Khromov-Borisov N.N., Inge-Vechtomov S.G. 2-Fluoreneamine - indirect mutagen for Saccharomyces cerevisiae. Mutat. Res., 1981, v.91, p.221-224.

4. Павлов Ю.И., Хромов-Борисов Н.Н. Инактивация М-метил-М'-нитро-М-нитрозогуанидина в тесте дрожжи - микросомы печени мыши. Генетика, 1982, т.18 (2), с.313-315.

5. Павлов Ю.И, Хромов-Борисов Н.Н. Метаболическая активация промутагенов в тесте дрожжи - микросомы. Сообщение 2. Активация циклофосфамида и 2-аминофлуорсна. Генетика, 1983,19, (3), с. 362-374.

6. Павлов Ю.И, Хромов-Борисов Н.Н.Генетический контроль мутагенного и рекомбиногенного действвия аналогов оснований у дрожжей. В сб. "Молекулярные механизмы генетических процессов", 1983, с.165-166.

7. Pavlov Y.I., Khromov-Borisov N.N., Shevchenko L.P., Alekseevitch L.A., Inge-Vechtomov S.G. Comparisons of the promutagen-activating capacity of S9 liver preparations from mouse and chicken using in vitro tests with Salmonella and yeast. Mutation Res. 1984, v. 140, p.75-79.

8. Павлов Ю.И, Хромов-Борисов Н.Н.Генетическая активность аналогов оснований у бактерий Salmonella typhimurium, Escherichia coli и дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Генетика, 1984, т.20 (8), с.1270-1278.

9. Алексеевич Л.Н., Павлов Ю.И., Шевченко Л.П., Галынкин В.А., Трофимов В.А., Мухленов А.Г. Изучение генетической активности природного биостимулятора лентехнина. В кн: Получение и применение стимуляторов роста", ЛТИ им.Ленсовета, 1984, с. 98-103.

10. Inge-Vechtomov S.G., Pavlov Y.I.,Noskov V.N., KarpovaT.S., Repnevskaya M.V., Khromov-Borisov N.N., Chekuolene J., Chitavichus D. Tests for genetic activity in the yeast Saccharomyces cerevisiae: study of forward and reverse mutation, mitotic recombination and illegitimate mating induction. Progress in Mutation Res. Elsevier, Amsterdam. J.Ashby and F.J. de Serres Eds. 1985, v.S, p.243-253.

11. Сарсенова С.Ж., Шигаева M.X., Павлов Ю.И. Получение и характеристики штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae с повышенной чувствительностью к детергентам. Генетика, 1986, Г.22(7), с. 1104-1111.

12. Павлов Ю.И. Мутанты дрожжей Saccharomyces cerevisiae, сверхчувствительные к мутагенному действию б-Л'-гидроксиламинопурина. Генетика, 1986, т.22 (9), с.2235-2243.

13. Гуськов Е.П., Павлов Ю.И., Тер-Аванесяк М.Д., Чистяков В.А. Влияние гипербарической оксигенации на выживаемость, мутагенез и рекомбиногенез одноклеточных организмов. Цитология и генетика, 1987, т.21(1). с.10-14.

14. Pavlov Y.I., Toulyakova T.S. 6-N-hydroxylaminopurine - a potent mutagen for Pichiapinus. In: "Genetics ofNonconventional yeasts". Proc. 12-th International Specialized Symposia on yeasts. Weimar. GDR. 1987. p.20.

15. Павлов Ю.И.Сгруктурная организация генома и возникновение мутаций. В сб. "Тезисы 5-го съезда ВОГиС. Москва. 1987, т.6, с.58.

16. Pavlov Y.I., Moiseeva E.V., Noskov V.N. RAD52 gene disruption in a 6-N-hydroxylammopurine supermutable strains (hamI) of Saccharomyces cerevisiae. Yeast, Suppl., 1988. v.4. s.263.

17. Pavlov Y.I., Noskov V.N., Khromov-Borisov N.N. Base analogue mutagenesis in уeast. Genome (Suppl). 1988, v.30, p.139.

18. Gordenin D.A., Trofimova M.V., Shaburova O.N., Pavlov Y.I.,ChernoffY.O., Chekuolene J., Proscyavichus Yo., Sasnauskas K., Janulaitis A. Precise excision of bacterial transposon Tn5 in yeast. Mol.Gen.Genet. 1988, v.213, p.388-393.

19. Павлов Ю.И., Носков B.H., Чернов Ю.О., Горденин Д.А. Изучение мутабилыюсти гена £ KS2 у диплоидов дрожжей-сахаромицетов. Сообщение 2. Возникновение мутантов, индуцированных б-М-гидроксил&минопурином и проииолактоном. Генетика, 1988. т.24(10), с.1752-1760.

20. Павлов Ю.И., Носков В.Н., Тюлякова Т.С., Инге-Вечтомов С.Г. Способ получения мутантов по гену LYS2 у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Авторское свидетельство SU1449585 А1 от 29.04.87.

21. Павлов Ю.И., Тарунина О.В. Дрожжи как модель для изучения мутагенов. Биологический журн. Армении, 1989, т.42 (9-10), с.903-909.

22. Bechtereva Т. A., Pavlov Y.I., Kramarov V.M., Migunova В., Kiselev O.I. DNA sequencing with thermostable Tet DNA polymerase from Thermus thermophilus. Nucleic Acid Res., 1989, v. 17 (24), pi0507.

23. Сизоненко Г.И., Чернов Ю.О., Куликов B.H., Карпова Т.С.Дашкин П.К., Павлов Ю.И., Бехтерева Т.А., СахароваЕ.В., Тиходеев О.Н., Инге-Вечтомов С.Г. Новый класс охр-супрессоров у дрожжей-сахаромицетов: мутация в гене глутаминовой тРНК. ДАН СССР, 1990, т.ЗЮ(б), с.1480 - 1484.

24. Носков В.Н., Тарутина М.Г., Павлов Ю.И., Куликов В.Н., Трофимова М.В., Горбачева А.В., Чернов Ю.О., Саснаускас К., Нейстат М.А., Толсторуков И.И.. Горденин Д.А. Разработка системы внутригенного картирования для молекулярно-генетического анализа мутаций в гене LYS2 у дрожжей-сахаромицетов. Генетика, 1990, т.26 (7), с.1161-1168.

25. Носков В.Н., Тарутина М.Г., Чернов Ю.О., Горденин Д.А., Павлов Ю.И. Генетический анализ спонтанных и индуцированных 6-№тидроксиламинопурином мутантов Adp+ у дрожжей-сахаромицетов. Генетика, 1990, т.26 (7), с.1169-1177.

26. Евдокимова Г.А., Мозгова Н.П., Павлов Ю.И. Выявление генетической активности загрязненных металлами почв в тестах с микроорганизмами. В сб:"структура и

функции наземных и водных экосистем Севера в условиях антропогенного загрязнения". АН СССР" 1990, с.59-70.

27. Пшеничнов М.Р., Павлов Ю.И. Генетическая активность 2-аминофлуорена и 2-

ацетиламинофлуорена у штаммов дрожжей-сахаромицетов в условиях метаболической активации in vitro: влияние мутации radt-5. Генетика, 1991, т.27(8), с.1336-1341.

28. Pavlov Y.I., Noskov V.N., Lange E.K., Moiseeva E.V., Pshenichnov M.R., and Khromov-

BorisovN.N. The genetic activity of ift -hydroxyadenine and 2-amino -hydroxyadenine in Escherichia coli, Salmonella typhimurium and Saccharomyces cerevisiae. Mutation Res. 1991. v.253. p.33-46.

29. Gordenin D.A., Malkova A.L., Peterzen A., Kulikov V.N., Pavlov Y.I., Perkins E., and Resnick M.A.. Transposon Tn5 excision in yeast: influence of DNA polymerase a, 8 and e and DNA repair genes. Proc. Natl. Acad. Sci., 1992, v.89, p.3785-3789.

30. Chernoff Y.O., Ptushkina M.Y., Samsonova M.G., Sizonenko G.I., Pavlov Y.I., Ter-Avanesyan M.D., and Inge-Vechtomov S.G. Conservative system for dosage-dependent modulation of translational fidelity in eukaiyotes. Biochimie, 1992, v.74, p.455-461.

31. Shcherbakova P., and Pavlov Y.I. Mutagenic specificity of the base analog 6-N-hydroxylaminopurine in the URA3 gene of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Mutagenesis, 1993, V.8, no.5, p.417-421.

32. Tran Tuan Hiep, Kulikov V.N., Noskov V.N., Sizonenko G.I., Chernoff Y.O. and Pavlov Y.I. The 5-Aminoimidazole-Carboxylase Structural gene of the methytrophic yeast Pichia methanolica: cloning, sequencing and homology analysis.Km«, 1993, v. 9, p.1251-1257.

33. Tran Tuan Hiep, Noskov V. N., and Pavlov Y.I.. Transformation in the methylotrophic yeast Pichia methanolica utilizing homologous ADE1 and heterologous Saccharomyces cerevisiae ADE2 and LEU2 genes as genetic markers. Yeast, 1993, v.9, p.l 189-1198.

34. Инге-Вечтомов С.Г., Шварцман П.Я., Павлов Ю.И. Проблема генетической

безопасности и ее решение в Ленинградском регионе. В сб. Биотестирование в решении экологических проблем. РАН, С-Петербург, 1991, с.7- 16.

35. Павлов Ю.И., Репневская М.В., Носков В.Н., Инге-Вечтомов С.Г.. Дрожжи-сахаромицеты как тест-обьект для выясления и изучения мутагенов. В сб: Наследственность человека и окружающая среда, Наука, 1992, вып.2, с.151-167.

36. Pavlov Y.I., Minnick D.T., Izuta S., and Kunkel T.A. Replication fidelity in vitro with 8-oxo-deoxyguanosine triphosphate. Biochemistry, 1994, v.33 (15), p.4695-4701.

37. Noskov V.N., Maki S., Kawasaki Y., Leem S-H., Ono B-I., Araki H., Pavlov Y., and Sugino A. The RFC2 gene encoding a subunit of replication factor C of Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acid. Res., 1994, v.22 (9), p. 1527-1535.

38. Shcherbakova P., and Pavlov Y.I. Base analog б-Л-hydroxylaminopurine mutagenesis in yeast: the role of exonucleolytic proofreading. In: 1994 Yeast Genetics and Molecular Biology Meeting, University of Washington, Seattle, August 16-21, p.197.

39. Павлов Ю.И., Куликов B.H., Козьмин С.Г., Носков В.H. Генетический контроль и специфичность неточной репликации у дрожжей при действии аналогов оснований. Генетика, 1994, т.ЗО, приложение, с.116.

40. Minnick D., Pavlov Y.I., and Kunkel T.A. The fidelity of the human leading and lagging strand DNA replication apparatus with 8-oxodeoxyguanosine triphosphate. Nucleic Acid Res., 1994, v.22 (25), p.5658-5664.

41. Shcherbakova, P.V., and Pavlov Y.I. Base analog 6-jV-hydroxylaminopurine as a tool to study DNA replication. J. Cell. Biochemistry, 1995, Suppl. 21, p.302.

42. Noskov, V.N., Staak K., Shcherbakova P.V., Kozmin S.G., Negishi K., Ono B-C., Hayatsu H.and Pavlov Y.I. HAM1, the gene controlling 6-.V-hydroxylaminopurine sensitivity and mutagenesis in the Saccharomyces cerevisiae. Yeast, 1996, v.12, p. 17-29.

43. Shcherbakova, P. and Pavlov Y.I. 3'->5' exonucleases of DNA polymerases s and 8 correct base analog induced DNA replication errors on opposite DNA strands in Saccharomyces cerevisiae. Genetics, 1996, v.142, p. 717-726.

44. Shcherbakova P.V., Noskov V.N., Pshenichnov M.R., and Pavlov Y.l. Base analog 6-N-hydroxylaminopurine mutagenesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae is controlled by replicative DNA polymerases. Mutation Res., 1996, v.369, p.33-44.

45. Pavlov, Y.I., Suslov V.V., ShcherbakovaP.V., Kunkel T.A., Ono A., Matsuda A., and Schaaper R. Base analog jV^-hydroxylaminopurine mutagenesis in Escherichia coli : molecular specificity and genetic control. Mutation Res.,1996, v. 357, p.1-15.

46. Kozmin, Stanislav G., Roel M. Schaaper, Polina V.Shcherbakova, and Youri I.Pavlov Multiple pathways protecting bacteria and yeast from the mutagenic effect of a base analog 6-A'-hy droxy ] am in opuri ne (1996). In: 5-th International Conference on Mechanisms of Antimutagenesis and Anticarcinogenesis, Okayama, December 2-6, 1996, p. 29.

47. Shcherbakova, Polina V., Vladimir Noskov, and Youri I.Pavlov (1996) Mutations in the Yeast DNA Replisome Component Genes Exert an Antimutator Effect on the Base Analog Induced Replication Errors. In: 5-th International Conference on Mechanisms of Antimutagenesis and Anticarcinogenesis, Okayama, December 2-6, 1996, p. 97.

48. Козьмин, С.Г., Домкин, В.Д., Зехнов, A.M., Павлов, Ю.И. Изучение генетического контроля метаболизма мутагенного аналога оснований б-Л'-гидроксиламинопурина у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Генетика, 1997, т.ЗЗ (5), с. 591-598.

49. Pavlov, Y.I. Mutagenic pathways of the base analog, б-Л'-hydroxylaminopurine, in bacteria and yeast. In: Abstracts of the Conference "Mechanisms of DNA Repair and Mutagenesis" on the 100-th Anniversary of the Discovery of Polonium and Radium, Warsaw, 1997, October 811, p.26.

СОДЕРЖАНИЕ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ............................................................................................................3

Актуальность темы..............................................................................................................................................3

Задачи исследования..........................................................................................................................................3

Положения, выносимые на защиту..................................................................................................................4

Научная новизна..................................................................................................................................................4

Теоретическая и практическая ценность работы..........................................................................................5

Место проведения работы...................................................................................................................................6

Апробация работы.................................................................................................................................................6

Структура и овьем диссертации........................................................................................................................7

Список сокращений.............................................................................................................................................7

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ....................................................................................................................................7

Штаммы..................................................................................................................................................................7

Среды и условия культивирования...................................................................................................................7

Методы генной инженерии.................................................................................................................................9

Исследование синтеза ДНК in vitro в присутствии аналогов..................................................................9

Генетические методы..........................................................................................................................................9

Метаболическая активация промутагенов....................................................................................................9

Мутагенез...............................................................................................................................................................9

Методы статистической обработки результатов.........................................................................................10

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.....................................................................................................................10

ГЛАВА 1. АКТИВАЦИЯ И ИНАКТИВАЦИЯ МУТАГЕНОВ МИКРОСОМАМИ ПЕЧЕНИ ЖИВОТНЫХ И ПТИЦ..........................................................................................................................................10

ГЛАВА 2. ИССЛЕДОВАНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ МУТАГЕННОГО И ИНГИБИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ХИМИЧЕСКИХ МУТАГЕНОВ..........................................................13

Бромистый этидий..............................................................................................................................................13

2-аминофлуорен и 2-ацетиламинофлуорен...................................................................................................13

6-л-ги дроксиламинопурин...............................................................................................................................14

ГЛАВА 3. МУТАЦИИ ПРИ РЕПЛИКАЦИИ ДНК IN VITRO В ПРИСУТСТВИИ АНАЛОГОВ ОСНОВАНИЙ.........................................................................................................................................................19

ГЛАВА 4. АНАЛИЗ СПЕЦИФИЧНОСТИ МУТАГЕНЕЗА IN VIVO............................................................23

Системы для определения специфичности мутагенеза.............................................................................23

Специфичность мутагенного действия ГАП у бактерий и дрожжей.......................................................23

ГЛАВА 5. РОЛЬ РЕПЛИКАТИВНЫХ ПОЛИМЕРАЗ И ЭКЗОНУКЛЕАЗНОЙ КОРРЕКЦИИ В ИНДУЦИРОВАННОМ ГАП МУТАГЕНЕЗЕ НА ЛИДИРУЮЩЕЙ И ОТСТАЮЩЕЙ ЦЕПЯХ ДНК. .26

Роль экзонуклеолитической коррекции полимер a3 е и 5...........................................................................26

Частота индуцированных ГАП мутаций в лидирующей и отстающей нитях ДНК.............................31

Мутации, нарушающие полимеразную активность ДНК-полимер аз а, 8 и е снижают частоту индуцированных ГАП мутаций в "горячих точках" мутагенеза.............................................................31

ГЛАВА 6. МУТАГЕНЕЗ У ДИПЛОИДОВ И ГАПЛОИДОВ ДРОЖЖЕЙ...................................................33

ГЛАВА 7. ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ РЕГИСТРАЦИИ МУТАГЕНОВ НА ОСНОВЕ ШТАММОВ ДРОЖЖЕЙ..............................................................................................................................................................37

ВЫВОДЫ..................................................................................................................................................................38

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ................................................................................39

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Павлов, Юрий Иванович, Санкт-Петербург

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

резидиум ВАГ: России 1

ПАВЛОВ Юрий Иванович у

(решение от " У "

КЛЕТОЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫ МУТАГЕНЕЗА

....../) ¿-С--СР у

^сАНТИМУТАГЕНЕЗА: ирелЕДОв

СПЕЦИФИЧЕСКИХ МУТАГЕНОВ.

Специальность 03.00.15 - генетика

диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург 1998

й £/ /

/ и

/ь/

Работа выполнена на кафедре генетики и селекции Санкт-Петербургского государственного университета

Научный консультант:

доктор биологических наук чл.кор. РАН, проф.

С.Г. Инге-Вечтомов

Официальные оппоненты:

- доктор биологических наук

Т.Р. Сойдла

- доктор медицинских наук

В.В. Худолей

- доктор биологических наук

В.Н. Рыбчин

Ведущее учреждение:

Петербургский т- -да г ядерной физики Р.

Защита диссертации состоится" 2 " an}»."" Диссертационного совета Д 063.57.21 по защита л?:- - «лсание

степени доктора биологических наук в Санкт-Петербургском Государствен» университете по адресу: 199034, Саякг-П" Утерстооп наб., 7/9, . (У,

кафедра генетики и селекции, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакештка ■ нейтральной научной библиотеке Санкт-Петербургского Государственного университета.

Автореферат разослан " " c-kx-(гк-ь-'-Л998 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета канди дат биологических наук

" 5 " ч .. (О С)

Л. А. МАМОН

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Значительная часть спонтанных мутаций происходит при репликациии ДНК. Известно, что механизм обеспечения высокой точности репликации ДНК у Escherichia coli включает три последовательных этапа: выбор комплементарных матрице нуклеотидов ДНК-полимеразой III, коррекцию ошибок с помощью 3'-»5" экзонуклеазной активности s-субъединицы ДНК-полимеразы III и пострепликативную репарацию неспаренных оснований. Механизмы контроля точности репликации ДНК эукариот изучены значительно меньше. В частности, неясно, какие ДНК-полимеразы участвуют в репликации основной части генома эукариот; какую роль играют 3'—>5' экзонуклеазы, ассоциированные с репликативными ДНК-полимеразами, в контроле точности репликации хромосом; как организована репликация лидирующей и отстающей нитей ДНК. В работе мы разработали оригинальный подход к анализу этих проблем, применяя аналоги оснований в качестве специфического инструмента для выявления ошибок репликации, происходящих при репликации разных нитей ДНК.

Дрожжи Saccharomyces cerevisiae являются одним из наиболее удобных для генетических исследований эукариотическим объектом благодаря сравнительной простоте их организации и возможности комплексного использования в работе с ними генетических и молекулярно-биологических подходов. В то же время, сходство л-?гшшзации клеток дрожжей и высших эукариот делает дрожжи уникальной моделью для :, тения механизмов, действующих в клетках всех эукариотических организмов. „-^Применение дрожжей позволило исследовать механизмы возникновения мутаций не < только у гаплоидных, но и у диплоидных клеток. Теоретические исследования | механизмов мутагенеза в работе позволили создать и апробировать систему штаммов «дрожжей-индикаторов генетически опасных факторов.

Задачи исследования.

5 Создание систем для анализа механизмов возникновения мутаций у прокариоти-¿чгских и эукариотических микроорганизмов. Изучение механизмов становления мутаций - ¿при ошибках репликации и репарации, клеточных систем защиты от мутагенов, особенностей мутагенеза в диплоидных эукариотических клетках. Создание штаммов дрожжей ,, для регистрации генетически опасных факторов окружающей среды.

Положения, выносимые на защиту.

Возникновение мутаций при действии химических мутагенов у эукариот -многоступенчатый процесс, включающий: поступление в организм, превращения мутагена неспецифической системой метаболизма чужеродных соединений, транспорт/проникновение в клетки-мишени, превращения мутагена специфическими для него системами активации/дезактивации, реакции с основаниями ДНК или включение в ДНК, репарацию модифицированной ДНК и репликацию ДНК, содержащей или бреши, или необычные основания. Вероятность появления новой последовательности ДНК (мутации) зависит не только от типа модификации ДНК, но и от локального контекста ДНК вблизи сайта мутации, типа реплицирующейся нити (лидирующей или отстающей) и от функционаьного состояния аппарата репликации.

Научная новизна.

В работе для анализа механизмов мутагенеза использованы микроорганизмы: прокариоты - бактерии Е. coli и Salmonella typhimurium и эукариоты - дрожжи Saccharomyces cerevisiae и Pichia methanolica. Применены три основных подхода: а) исследование частоты индуцированных мутаций у мутантов по системам защиты от мутагенов или в системе микроорганизмы-индикаторы/клеточные экстракты печени животных и птиц; б) конструирование штаммов-детекторов мутаций, позволяющих определять тип и механизм возникновения мутаций, индуцированных мутагенами; в) использование специально подобранных мутагенов, различающихся по механизму действия (так, аналоги оснований вызывают мутации при ошибках репликации, УФ-свет -при ошибках репарации, пропиолактон - при ошибках и репарации, и репликации). В результате впервые:

♦ исследована метаболическая активация 2-аминофлуорена (2-АФ) и инактивация N-метил-А''-нитро-Л'-нитрозогуанидина в тесте дрожжи/микросомы. Показано, что мутагенная активность 6-Л^-гидроксиламинопурина (ГАП) не модифицируется препаратами микросом; микросомы печени курицы обладают более высокой активностью по превращению 2-АФ в мутаген, по сравнению с препаратами печени мышей

♦ получены мутанты haml у дрожжей, сверхчувствительные к мутагенному действию аналога оснований ГАП; показано, что ген НАМ1 консервирован в эволюции - имеет гомологи у широкого спектра организмов, от кишечной палочки до человека, следовательно, играет важную роль в жизнедеятельности клетки; установлена локализация новых генов, отличающихся от гомолога гена НАМ1, контролирующих мутагенное и летальное действие аналогов оснований у бактерий

♦ показано, что и дТТФ, и дЦТФ включаются в ДНК напротив аналога оснований 6-N-гидроксиламинопурина (ГАП) in vitro Кленовским фрагментом ДНК-полимеразы 1 при использовании олигонуклеотида-матрицы, содержащего данный аналог основания в определенном положении, причем дТТФ включался более эффективно, чем дЦТФ

♦ продемонстрировано, что аналог оснований 8-оксигуанин дезокситрифосфат (8-дОГТФ), присутствующий в ДНК-полимеразной реакции in viíro в эквимолярной природным предшественникам концентрации, провоцирует ошибки ДНК-полимераз, корректируемые 3'->5'экзонуклеазой. Распределение ошибок репликации в присутствии 8-дОГТФ экстрактами культуры тканей человека практически одинаково в лидирующей и отстающей нитях ДНК

♦ изучены спектры мутаций индуцированных ГАП у бактерий и дрожжей методами секвенирования; продемонстрировано, что ГАП индуцирует в бактериальном гене lacl и в дрожжевом гене URA3 транзиции ГЦ-» АТ и АТ~»ГЦ; горячими точками транзиций ГЦ—> АТ являются последовательности ДНК типа «АГА» и, только у дрожжей, монотонные повторы нуклеотидов; мутации распределены асимметрично по цепям ДНК, что указывает на неодинаковую частоту ошибок репликации в присутствии аналога оснований при синтезе лидирующей и отстающей цепей ДНК

♦ ГАП применен для изучения механизмов контроля точности репликации у эукариот: при изучении ГАП-мутагенеза у штаммов дрожжей с отсутствующей экзонуклеазной активностью ДНК-полимераз е или 5 (мутации ро12-4 и ро13-01) показано, что пары ГАП с нормальными основаниями могут корректироваться при синтезе ДНК in vivo

» ангимутаторные мутации в генах всех трех репликативных полимераз резко снижают мутагенез на более мутабильной нити ДНК; следовательно, оптимальная работа репликативного комплекса необходима для возникновения "горячих точек" , репликативного мутагенеза; мутагены, действующие при «ошибках репарации» -этилметансульфонат и ультрафиолетовый свет, индуцируют мутации в обеих цепях с одинаковой частотой

♦ у диплоидов дрожжей пропиолактон индуцирует мутантов по двухступенчатому механизму «мутирование-рекомбинация», а ГАП - по механизму «возникновение мутаций в обеих копиях гена» с частотой, лишь на порядок меньшей, чем у гаплоидов.

Теоретическая и практическая ценность работы.

Полученные в нашей работе данные о механизмах, защищающих клетки от мутагенов, использованы для а) направленного получения организмов, устойчивых/чувствительных к мутагенам б) создания тестеров для оценки мутагенной активности факторов окружающей среды. Активация промутагенов препаратами печени курицы может быть эффективной альтернативой применению дорогостоящих препаратов печени крыс. Полученные данные могут быть использованы при прогнозировании генетических последствий действия мутагенов типа аналогов оснований. Данные об участии ДНК-полимераз 8 и s в коррекции ошибок при репликации разных нитей ДНК необходимо учитывать при создании моделей организации аппарата репликации ДНК и при изучении механизмов контроля точности репликации ДНК у эукариот. Данные о молекулярной специфичности действия ГАП открывают возможность использования этого мутагена для получения специфических мутаций в определенных последовательностях ДНК. Исследования механизмов мутирования диплоидных клеток дрожжей являются основой для понимания процессов мутагенеза и, возможно, канцерогенеза, в соматических клетках.

Место проведения работы.

Основная часть работы выполнена в лаборатории физиологической генетики Биологического НИИ СПбГУ и на кафедре генетики и селекции СПбГУ. Часть экспериментов проведены в лабораториях молекулярной генетики NIEHS, США и молекулярной биологии Осакского университета, Япония. Экспериментальный материал получен непосредственно автором или студентами, аспирантами и соискателями под его руководством. Так, в работе принимали участие Ланге Е.К., Горбачева О.В., Носков В.Н., Куликов В.Н., Тарутина М.Г., Сарсенова С.Ж., Тюлякова Т.С., Чекуолене Ю.В., Трофимова М.В., Моисеева Е.В., Тарунина О. В., Щербакова П.В., Суслов В.В., Штаак К., Тирлих М., Пшеничное М. Р., Тран Туан Хиеп, Козьмин С.Г. Часть результатов получена в соавторстве с Н.Н.Хромовым-Борисовым, С.Г. Инге-Вечтомовым, Д.А. Гордениным, Ю.О. Черновым, К. Саснаускасом, И.И. Толсторуковым, Т.А.Карповой, Г.И. Сизоненко, Т.А. Бехтеревой, Т.А. Канкель, Д. Минник, P.M. Шаапер, К. Негаши, X. Хайацу, А. Сугино, Б-С. Оно, А. Матсуда, В.Д. Домкиным, A.M. Зехновым, И.Б. Рогозиным, В.В. Алениным, М.Г. Гецовой, Е.П. Гуськовым, М.Д. Тер-Аванесяном, JI.A. Алексеевич, Д. Читавичюсом, Г.А. Евдокимовой, А.Г. Мухленовым, М.Г. Самсоновой, Ю. Просцявичусом.

Апробация работы.

По результатам работы сделаны сообщения на конференциях : Всесоюзных симпозиумах «Молекулярные механизмы генетических процессов», 1979, 1987 и 1990; Всесоюзных съездах ВОГиС, 1983, 1987; 14-th Annual Meeting of the European Environmental Society, 1984; на заседаниях секции генетических аспектов проблемы «Человек и Биосфера» при ГКНТ (1979-1989); на симпозиуме «Чувствительность организмов к мутагенным факторам и возникновение мутаций", Вильнюс, 1986; 6-th International Symposium on Genetics of Industrial Microorganisms GIM90, Strasbourg France, August 1990; Gordon Research conference (Mutagenesis), 1992; Environmental Mutagen Society Annual Meeting, Norfolk, Virginia, April, 1993; Gordon Research Conference (Genetic Toxicology), New Hampshire, USA, July 1993; Gordon Research Conference (Mutagenesis), New Hampshire, USA, June 1994; Yeast Genetics and Molecular Biology Meeting, University of Washington, Seattle, USA, August 1994; 1-м съезде Вавиловского Общества Генетиков и Селекционеров в Саратове в декабре 1994; Yeast Genetics and Molecular Biology Meeting, University of Wisconsin, Madison, USA, August, 1996; 5-th International Conference on Mechanisms of Antimutagenesis and Anticarcinogenesis, Okayama University, Japan, December 1996; Conference "Mechanisms of DNA Repair and Mutagenesis" the 100-th Anniversary of the Discovery of Polonium and Radium, Warsaw, October 1997; на семинарах кафедры генетики и селекции СПбГУ и лаборатории физиологической генетики БиНИИ СПбГУ.

Структура и объем диссертации.

Список сокращений.

АМФ, АДФ, АТФ, дАДФ, дАТФ - аденозин моно-, ди-, три-, дезоксиаденозинди- и три- фосфат, соответственно; 2-АФ и 2-ААФ - 2-амино- и 2-ацетиламинофлуорен, соответственно; АФРТ - аденинфосфорибозилтрансфераза; дТТФ и дЦТФ - дезокси-тимидин- и цитозинтрифосфат; ГАП, ГАПМФ, ГАПДФ, дГАПДФ и дГАПТФ - 6-N-гидроксиламинопурин и его моно-, ди-, три, дезоксиди- и дезокситрифосфат; ИМФ -инозинмонофосфат; САМФ - сукцинил-АМФ; дОГТФ - 8-оксодезоксигуанозинтрифосфат; МННГ - ¿V-метил- Л"нитро-./У-нитрозогуанидин; ПРО - [3-пропиолактон; РНО - репарация яеспаренных оснований; УФ - ультрафиолетовый свет; ЭМС - этилметансульфонат; PCNA - ядерный антиген пролиферирующихся клеток

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штаммы.

Генотипы основных штаммов Sacckaromyces cerevisiae, использованных в качестве исходного материала, приведены в Таблице 1. Штамм ES63-17D содержит полную делецию гена URA3 в хромосоме К и плазмиду с дрожжевыми генами И ¡S3, LEU2 и URA3, интегрированную в локус HIS3 в хромосоме XV (Lee et al., 1988).

Для создания серии изогенных штамов, различающиеся аллелями генов POL1, POL2, POL3, PMS1, URA3 хромосомные аллели соответствующих генов замещали мутантными аллелями с помощью интеграции в хромосому плазмид с мутантными аллелями и последующей эксцизии плазмид с аллелями дикого типа, а также методом "одношаговой замены" хромосомных аллелей мутантными аллелями, находящимися в составе рестрикционн

Информация о работе

Павлов, Юрий Иванович
доктора биологических наук
Санкт-Петербург, 1998
ВАК 03.00.15

Диссертация

Клеточные механизмы мутагенеза и антимутагенеза - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Клеточные механизмы мутагенеза и антимутагенеза ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Клеточные механизмы мутагенеза и антимутагенеза"

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Павлов, Юрий Иванович, Санкт-Петербург

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Клеточные механизмы мутагенеза и антимутагенеза
ВАК РФ 03.00.15, Генетика