Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование фрагментов хлоропластной ДНК Pisum Sativum и Arabidopsis Thaliana, имеющих гомологию с ядерной ДНК в клетках некоторых видов двудольных растений

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Исследование фрагментов хлоропластной ДНК Pisum Sativum и Arabidopsis Thaliana, имеющих гомологию с ядерной ДНК в клетках некоторых видов двудольных растений"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ОБЩЕП ГЕНЕТИКИ ИМ. Н. И. ВАВИЛОВА

РГ8 ОД

- л mn o.-j,' пРавах рукописи

УДК 577.216.9

Котлярова Екатерина Геннадьевна

ИССЛЕДОВАНИЕ ФРАГМЕНТОВ ХЛОРОПЛАСТНОЙ ДНК PISUM SATIVUM И ARABIDOPSIS THALIANA, ИМЕЮЩИХ ГОМОЛОГИЮ С ЯДЕРНОЙ ДНК В КЛЕТКАХ НЕКОТОРЫХ ВИДОВ ДВУДОЛЬНЫХ РАСТЕНИЙ

03.011.15 — генетика

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ЛЮСКВА— 1993

Работа выполнена в лаборатории изменчивости генома Института общей генетики им. Н. 'И. Вавилова РАН.

Научный руководитель — доктор биологических наук, проф. В. А. Тарасов.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук М. Д. Кирнос; кандидат биологических наук В. Н. Поздняков.

в час. мин. на заседании специализированного Ученого совета Д 002.49.01. при Институте общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН по адресу: 117809 ГСП-1 Москва В-333, ул. Губкина, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИОГен РАН.

Ведущее учреждение — Институт молекулярной генетики РАН

Защита диссертации состоится**?«^ 1993 г.

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

' Г. Н. Полухина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Уникальность растительной клетки заключается в том, что она имеет три генома, различавшихся по структурно-функциональной организации. Тем не менее, несмотря на то, что каждый из трех вышеуказанных геномов представляет собой автономно реплицирующиеся структуры, в процессе жизни клетки их функции в известной степени скоординированы. Более того, в случае, например, фотосинтеза и морфогенеза хлоропластов ряд функций детерминируется генами, локализованными в хлоропластах, тогда как другие функции определяются ядерными генами. Известен и другой тип такого взаимодействия, а именно непосредственно на уровне геномов. Хотя механизмы такого взаимодействия не выяснены, сам факт существования этого явления зарегистрирован во многих случаях.

До сих пор остается неясным, произошло ли формирование геномов различных органелл в результате эволюции и дифференцировки древней эукариотической клетки или современная растительная клетка произошла в результате слияния первоначально автономно живущих и функционирующих клеток различных типов. В последнем случае мы имеем дело с так называемой "эндосимбиотической" гипотезой происхождения хлороп-ластов и митохондрий.

Тот факт, что в случае хлоропластов их морфогенез и обеспечение фотосинтеза контролируются как генами хлоропластов, так и генами ядра, мог бы, казалось, свидетельствовать в пользу первой из указанных возможностей. Однако, существование процесса переноса, генетической информации между геномами различных органелл растительной клетки, и, в частности, процесса передачи генетической информации от генома хлоропластов к ядерному геному, может свидетельствовать в пользу гипотезы симбиотического происхождения хлоропластов.

Хотя в пользу существования такого рода взаимодействия между ядерным геномом и геномом хлоропластов свидетельствует ряд фактов и, в первую очередь, существование так называемой "смешанной" ДНК, т.е. наличие участков гомологии в пределах ядерного и хлоропластного геномов, механизм возникновения "смешанной" ДНК остается в настоящее время неясным. В этом плане выделение и исследование нуклеотидных последовательностей "смешанной" ДНК может пролить свет на механизм ее происхождения.

Цель и задачи исследования. Основная цель данной работы связана с клонированием и исследованием структурной организации фрагмента хлДНК, имеющего гомологию с ДНК хромосом растительной клетки. В связи с вышеизложенным в диссертационной работе было запланировано решение следующих задач:

- клонирование фрагментов "смешанной" ДНК из генома хлоропластов гороха и арабидопсис;

- определение их наличия и копийности в ядерном геноме различных видов ceM.Fabaceae и A. thai lana;

- определение нуклеотидной последовательности этих фрагментов и сравнительный анализ их нуклеотидного состава в клетках гороха, арабидопсис и табака;

- разработка метода использования этого фрагмента для экспресс определения наличия длинных инвертированных повторов в генбме хлоропластов различных видов высших растений.

Научная новизна.Впервые установлено, что в "смешанную" ДНК могут входить полностью или частично гены rpsi9, rplE и спейсер между ними. Причем последний присутствует в геноме хлоропластов гороха и арабидопсис, и основная часть его отсутствует в геноме хлоропластов табака.

Показано, что эта последовательность расположена на границе между инвертированным повтором и большой однокопийной областью в геноме хлоропластов и содержит многочисленные короткие дупликации в прямой и обратной ориентациях, а также шпилькообразную структуру.

Проведенный блот-гибридизационный анализ этого фрагмента поз-

волил установить, что. в случае пяти из шести изученных видов, за исключением чечевицы, этот фрагмент имеет область гомологии с ядерной ДНК, причем, если у вики и нута, так же как у гороха и араби-допсис, имеется одна область, то в случае чины наблюдаются три области гомологии.

Практическая ценность. В настоящее время известно, что основное различие в структуре хлоропластного генома различных видов высших растений связано с наличием либо отсутствием длинного инвертированного повтора. Использование традиционных методов определения наличия Ш представляет собой длительную и трудоемкую процедуру. Проведенная локализация клонированного и исследованного нами фрагмента и установление того факта, что он расположен на границе между инвертированным повтором и большой однокопийной областью, а также отсутствие в его структуре сайтов узнавания наиболее распространенных крупнощепяпш рестриктаз, кроме ЕсоКУ, позволили на его основе разработать экономичный экспресс метод определения наличия длинного инвертированного повтора в клетках различных видов высших растений.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на 1 Всесоюзном симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений" СПушино. 1991), межлабораторном семинаре "Молекулярные и клеточные основы генетических процессов" ИОГен РАН (Москва. 1993).

Объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения и выводов. Список литературы включает 189 наименований отечественных и зарубежных авторов. Материалы диссертации изложены на 126 страницах машинописного текста, содержат 26 рисунков и 3 таблицы.

- 4 -МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Растительный материал. В работе использовались растения гороха Pisum sativum сорт Таловец 60, вики Vicia sativa сорт Льговская 60, чины Lathyrus sativus сорт Степная 21, чечевицы Lens esculenta сорт Степная 244, нута Cicer arietinum сорт Волгоградский 5 из коллекции НИИ с/х ЦЧП им. В. В.Докучаева, а также семена арабидопсис Arabidopsis thaliana зкотип Columbia из коллекции ИОГен РАН.

Штаммы бактерий и плазмиды. Штаммы E.coli: JM 83, EclOOO, HfrC. В работе использовали вектор E.coli pUC19 (Арг).

Среды и реактивы. Для культивирования бактериальных клеток использовали среду LB СМаниатис и др.,1984). В работе использовали отечественные и импортные реактивы.

Выделение и очистку ДНК плазмид из E.coli проводили по стандартным методикам (Маниатис и др.,1984).

Трансформация клеток E.coli плазмидной ДНК проводилась по методике, предложенной Кушнером (Маниатис и др.,1984).

Конъюгацию бактерий проводили по методике, описанной у Гловера (Гловер.1988).

Рестрикцию и лигирование ДНК проводили в условиях, рекомендуемых изготовителем ферментов.

Электрофорез ДНК проводили в трис-.боратном буфере в течение 4-16 часов в горизонтальной пластине агарозного геля.

Блоттинг-гибридизацию проводили по методике, . описанной у Сау-зерна (Southern,1975).

Ядерную ДНК гороха, чины,' чечевицы, нута и вики выделяли из корешков 4-суточных проростков, а ядДНК арабидопсис - из каллусов по методу Кислева и Рубинштейна (Kislev. Rubenstein, 1980). Хлороп-ластную ДНК всех видов получали из листьев 3-недельных растений но методу Палмера (Palmer, 1982) в модификации.

Секвенирование прововодилось как методом Максама-Гилберта в модификации Чувпило-Кравченко (Чувпило, Кравченко, 1983), так и ме-

тодом Сэнгера (Senger, 1977). Анализ нуклеотидной последовательности проводился с помощью пакета программ DNASIS на ПЭВМ IBM PC/XT.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Клонирование последовательностей хлДНК P.sativum,гомологичных ядДНК

Для поиска фрагмента хлДНК, гомологичного ядДНК, был сконструирован на базе плазмиды pUC19 банк хлДНК P.sativum, гидролизованной HindiП-рестриктазой. Проведенный рестрикционный анализ ДНК плазмид из клеток полученных клонов показал, что все они содержат дополнительный Hindi П-фрагмент.

Как выявили опыты по дот-гибридизации ДНК плазмид полученных клонов с 32Р-меченой ДНК хлоропластов гороха, 142 клона показали гибридизационный сигнал и, соответственно, рекомбинантные плазмилы клеток этих клонов имели вставки хлоропластной ДНК.

Для выявления рекомбинантных плазмид, несущих фрагменты хлДНК, имеющих гомологию с ядДНК, были проведены аналогичные эксперименты по дот-гибридизации ДНК этих рекомбинантных плазмид с 32Р-меченой ядерной ДНК P.sativum.

Это позволило отобрать шесть плазмид, дающих сигнал максимальной интенсивности как с хлоропластной ДНК, так и с ядерной ДНК. Для дальнейшего анализа из этих шести плазмид была выбрана плазмида i'pPscH25), содержащая фрагмент хлДНК P. sativum размером 0.7 тпн, т.к. это давало возможность сравнительно просто провести секвениро-вание этого фрагмента

Для подтверждения того, что эта плазмида действительно несет фрагмент хлДНК, гомологичный ядДНК, была проведена блот-гибридизация, которая показала наличие сигнала с ядерной ДНК, гидролизованной рестриктазой Hindi 11, при использовании в качестве зонла 0.7

- б -

тпн фрагмента. Хлоропластная природа 0.7 тпн фрагмента подтверждена в многочисленных опытах по блот-гибридизации ДНК этого фрагмента с ДНК хлоропластов не только гороха, но и других видов использованных в работе растений.

2. Локализация 0.7 тпн фрагмента хлДНК P.sativum при помощи рестрикционного картирования

В настоящее время достаточно полно изучена организация хлДНК ряда видов высших растений, в. том числе P.sativum (Palmer, Thompson,'1981) и Nicotiana tabacum (Sugiura et al,, 1986). Это обстоятельство позволило локализовать клонированный нами 0.7 тпн фрагмент хлДНК P.sativum в прёделах существующей физической карты генома хлоропластов.

На первом этапе была проведена блот-гибридизация хлДНК P.sativum, гидролизованной крупнощепящими рестрйктазами HindiII, Kpnl, PstI, PvuII, XhoI.Smal и SphI, с 32Р-меченой ДНК плазмиды pPscH25. Сопоставление числа и молекулярного веса гибридизующихся фрагментов с рестрикционной картой хлДНК P. sativum показало, что исследуемый фрагмент расположен либо в области, содержащей ген atpA, либо в области локализации гена гр!2.

Для уточнения места локализации фрагмента использовалась хорошо охарактеризованная клонотека хлДНК N. tabacum. Из нее были отобраны клоны рТВа'13 и рТВа25, в которых содержатся вставки, несущие гены гр!2 и atpA, соответственно.

Результаты блот-гибридизации ДНК плазмид pTBaiS и рТВа25, гид-ролизованных BamHI, с 32Р-меченой ДНК плазмиды pPscH25 позволили установить наличие гомологии между ДНК исследуемого 0.7 тпн фрагмента хлДНК и ДНК плазмиды pTBaiS, но не рТВа25. Это указывает на наличие в составе плазмиды pPscH25 гена гр!2, кодирующего белок большой субъединииы рибосом ÍL2) хлоропластов.

- 7 -

3. Гомология между хлоролластной и ядерной ДНК у некоторых видов двудольных растений

В случае ceM.Chenopodiaceae показано, что фрагмент ДНК хлороп-ластов шпината размером 7.7 тлн представлен в ядДНК не только шпината, но и других видов этого семейства, а именно, Beta vulgaris, Chenopodium quinoa, Enchylaena tomentosa, Chenopodium album и Atriplex cinerae fAyliffe et al.,1988).

Нами исследовано в этом плане пять видов ceM.Fabaceae, а также A.thailana. Оказалось, что если использовать в качестве зонда 32Р-меченый 0.7 тпн фрагмент хлДНК P. sativum, то наблюдается четкий гибридизационный сигнал при проведении блот-гибридизации этого зонда с ядДНК пяти из шести изученных видов.

ЯдДНК P.sativum дает сигнал на уровне 2.3 тпн, у V.sativa и A.thaliana такой сигнал находится на уровне 3.3 тпн, а у C.arietinum - на уровне 6.8 тпн. ДНК L.sat 1 vus, в отличие от других видов ceM.Fabaceae, дает три гибридизационных сигнала: 2.7, 2.8 и 3.0 тпн и только в случае ДНК L.escuienta не обнаружено ни одного сигнала.

Таким образом, полученные данные показывают, что явление "смешанной" ДНК достаточно широко распространено как для ceM.Chenopodiaceae, так и для ceM.Fabaceae. Из изученных объектов только в одном случае ('L.escuienta') исследуемый фрагмент не представлен в составе ядДНК. В клетках других изученных видов исследуемый 0.7 тпн фрагмент показал наличие гомологии как с ядерной, так и с хлоропластной ДНК; и различия между видами касались лишь степени гомологии, числа и размеров гомологичных фрагментов. Последние свидетельствуют о том, что "смешанная" ДНК в составе ядДНК находится в различном окружении.

Изучаемый фрагмент ДНК является высококонсервативной структурой, так как в хлДНК даже у таких филогенетически удаленных видов, как P.sativum и A.thaliana, он имеет высокую степень гомологии и представлен фрагментами сходного размера.

Анализ видов ceM.Fabaceae по числу и размерам гомологичных хлДНК последовательностей в составе ядДНК дает возможность предположить, что процесс обмена генетической информации между хлороплас-тами и ядром является относительно недавним событием, произошедшим после эволюционного разделения этих видов.

4. Клонирование последовательности хлДНК A.thaliana, гомологичной 0.7 тпн фрагменту хлДНК P.sativum

Для клонирования фрагмента хлДНК A.thaliana, гомологичного 0.7 тпн фрагменту хлДНК P.sativum, хлоропластную ДНК A.thaliana обрабатывали рестриктазой HindiII. При блот-гибридизации, когда в качестве зонда использовался 0.7 тпн фрагмент хлДНК P.sativum, хлДНК A.thaliana дает гибридизационный сигнал на том же уровне, как и в случае хлДНК P. sativum. Это обстоятельство позволило при проведении клонирования интересующего нас фрагмента хлДНК A.thaliana создать частичную клонотеку путем выделения из агарозного геля после электрофореза фракции хлДНК размером примерно 0.7 тпн. Клонирование проводили в векторе pUC19 с помощью ДНК лигазы фага Т4. Идентификацию интересующих нас рекомбинантных плазмид проводили путем блот-гибри-дизации с Э2Р-меченым 0.7 тпн фрагментом хлДНК P. sativum. Таким образом, была получена плазмида, обозначенная рК?, которая несла фрагмент хлДНК A.thaliana размером -0.7 тпн, гомологичный 0.7 тпн фрагменту хлДНК P.sativum.

5.' Секвенирование 0.7 тпн фрагментов хлДНК A.thaliana и P.sativum

5.1. Стратегия секвенирования ДНК: использование транспозонов

Задача определения нуклеотидной последовательности протяженных

фрагментов ДНК, т.е. фрагментов, размер которых превышает максимально возможную длину прочтения информации с разделяющего акрила-мидного геля, требует дополнительных манипуляций с ДНК и сводится в настоящее время к получению и секвенированию набора коротких перекрывающихся субфрагментов, суммарная нуклеотидная последовательность которых охватывает всю последовательность первых.

Успех при получении такого набора перекрывающихся субфрагментов связан с наличием либо отсутствием в пределах анализируемой последовательности ДНК удобных сайтов рестрикции. Для привнесения таких сайтов могут быть использованы специальные приемы, в частности, инсерционный мутагенез с помощью транспозонов.

Одним из наиболее удобных транспозонов, используемых в настоящее время при проведении секвенирования, являе7ся транспозон TnlOOO (Liu et ai., 1987).

5.2. Получение инсерций транспозона TnlOOO в клонированном 0.7 тпн фрагменте хлДНК A.thaliana

5.2.1. Получение трансконъюгантов

Для получения инсерций был использован метод мобилизации не-конъюгативной плазмиды рК7, опосредованной хромосомой HfrC штамма E.coii.

Плазмида рК7 представляет собой плазмиду pUCla, в полилинкер которой встроен 0.7 тпн фрагмент хлДНК A.thaliana. Штамм HfrC ГрК71 подращивался до плотности 1-3 х, 108 и скрещивался с реципиентным штаммом EclOOO (Nalr, Strr, Rifr) в течение 1-1.5 часа при 37°С. Конъюгационную смесь высевали на полноценную среду, содержащую на-лидиксовую кислоту, рифампииин и ампициллин.

Эффективность конъюгации определялась по частоте передачи в реципиентные клетки маркера устойчивости к ампициллину. В результате было получено 12 клонов трансконъюгантов, из которых были выделены плазмидные ДНК, у которых определяли их электрофоретическую

подвижность в 0.7% агарозном геле. Оказалось, что все они обладали меньшей электрофоретической подвижностью по сравнению с плазмидой рК7.

Известно, что в процессе перемещения некоторых транспозонов, в частности, транспозонов ампициллинового ряда (в том числе и транс-позона TnlOOO.), возникают коинтеграты, состоящие из донорного и ре-ципиентного репликонов и двух копий транспозона в прямой ориентации. Именно с этим обстоятельством связана мобилизация некониога-тивной плазмиды к конъюгативному переносу с помощью конъюгативного репликона. После резолвации коинтегративной структуры в реципиент-ных клетках реципиентный репликон несет копию транспозона и именно с этим связано увеличение молекулярной массы неконъюгативной плазмиды, переносимой в ходе конъюгации.

5.2.2. Определение локализации и ориентации вставок транспозона TnlOOO

Возможные варианты встраивания транспозона в плазмвду рК7: в 0.7 тпн Hindi II фрагмент хлДНК A.thaliana (в двух ориентациях) или в оставшуюся часть плазмиды CpUClQ).

Очевидно, что если ДНК плазмиды обработать эндонуклеазой HinduI, то в случае встраивания транспозона TnlOOO в хлДНК-вставку (0.7 тпн) плазмиды рК7 не будет образовываться фрагмент размером 0.7 тпн, в отличие от случая интактной плазмиды рК7.

Проведенный рестрикционный анализ ДНК плазмид из клеток полученных трансконъюгантов показал, что в трех случаях (Тк-1, Тк-2 и Тк-3.) транспозон встроился в 0.7 тпн фрагмент хлДНК.

Определение положения границ и ориентации транспозона TnlOOO в хлДНК-вставке проводили по отношению к сайту рестрикции Sstl.

На основании проведеных экспериментов по определению локализации и ориентации транспозона TnlOOO в хлДНК-вставке плазмиды рК7 получена карта 0.7 тпн фрагмента хлДНК A.thaliana с указанием мест локализации транспозона TnlOOO (рис.1).

- 11 -

S E S E E S

H(r)

S N H(l)

\ / \ / \ / V \/ \/

R

230 380

420

500

Рис.1. Схема 0.7 тпн фрагмента хлДНК A.thaliana c.

указанием встраивания транспозонов TnlOOO. H-HindIII, S - SstI, Е - EcoRl, N - HincII, R - EcoRV. 1 и r -левая и правая границу фрагмента. Цифрами указаны координаты в пн.

ЩЦ - 0.7 тпн фрагменты хлДНК. A.thaliana

SSi - транспозон TnlOOO

5.3. Получение SstI-SstI фрагментов

После выделения ДНК из клеток трансконъюгантов Тк1 и Тк2, ее обработки рестри^тазой SstI и проведения электрофореза!к 0.7% ага-розном геле, фрагменты размером 500 пн (Тк1) и 350 пн |Тк2) выделяли из геля методом "замораживания-оттаивания". Получ'"4'ме фрагменты клонировали с использованием ДНК лигазы фага Т4 в полфшнкер плаз-миды pUC19 по сайту рестрикции SstI. Рестрикционный анализ плазмид-ной ДНК, обработанной эндонуклеазой SstI, из клеток отобранных вариантов показал, что плазмиды содержали интересующие нас фрагменты.

Очевидно, что фрагмент SstI-SstI из Тк1 и Тк2 может быть клонирован в pUC19 в двух ориентадиях. Для идентификации плазмиды с необходимой ориетавдей вставки выделенную ДНК рекомбинантных плаз-мид обрабатывали рестриктазами EcoRI, SstI и HindiII. При обработке рекомбинантной плазмиды со вставкой в интересующей нас ориентации рестриктазой HindIII образуется фрагмент с молекулярной массой, приблизительно равной молекулярной массе линеаризованной' плазмиды, т.к. происходит вырезание всего 80 пн. В противном случае (другая ориентация) образовывался бы Hind 111 фрагмент приблизительно того же размера, что и SstI фрагмент. Анализ двух рекомбинантных плазмид

показал, что в обоих проанализированных случаях мы имели встраивание транспозона в нужной нам ориентации. Эти плазмиды имеют Sstl-SstI фрагменты размером 500 пн и 350 пн и получили название pKD25 и рЗЗ, соответственно.

5.4. Клонирование SstI-HindIII субфрагмента 0.7 тпн фрагмента хлДНК A. thai lana из транскониоганта ТкЗ

В связи с тем, что ориентация транспозона TnlOOO в плазмиде клеток трансконъюганта ТкЗ противоположна по сравнению' С таковой в плазмидах из клеток трансконъюгантов Тк1 и Тк2, получение еще одного субфрагмента свелось к простой операции. После электрофореза в 0.7Х агарозном геле плазмидной ДНК из клеток ТкЗ, .обработанной рестриктазой SstI, и выделения из геля фрагмента размером 3.0 тпн, его дотировали самого на себя с помощью ДНК лигазы фага Т4. Полученные в результате плазмиды имеют делению Sstl-Sstl фрагмента размером 400 пн, расположенного в левой части анализируемого нами фрагмента. Полученная рекомбинантная плазмида названа р58. Она несет правую часть 0.7 тпн фрагмента хлДНК размером ~300 пн.

5.5. Завершение субклонирования 0.7 тпн фрагмента хлДНК A. thaliana

Секвенирование 300 пн фрагмента хлДНК A.thaliana плазмиды р58 и последующий анализ нуклеотидной последовательности этого фрагмента определили наличие сайта рестрикции для EcoRV, расположенного на расстоянии 200 пн от правой границы 0.7 тпн фрагмента хлДНК.

Это обстоятельство позволило клонировать два фрагмента HindIII-EcoRV и EcoRV-HindIII размером 500 и 200 пн, соответсвенно, в составе плазмид рЛЗ и рМ1.

В результате, полученный набор субфрагментов позволяет полностью перекрыть анализируемую последовательность 0.7 тпн HindiII фрагмента хлДНК A.thaliana (табл.1).

- 13 -

Таблица 1. Набор субфрагментов 0.7 тпн Hindi II фрагмента хлДНК A.thaliana

субфрагменты источник ориентация субфрагментов в реципиент-ной плазмиде

донорная плазмида реципиентная плазмида

Sstl-Sstl из клеток Тк1 PKD25 II

Sstl-SstI из клеток Тк2 рЗЗ 11

.Sstl-HindlII(p) из клеток ТкЗ р58 I

EcoRV-HindllI(p) рК7 рМ1 I

Hind III(l)-EcoRV рК7 рЛЗ II

I - ориентация субфрагментов в исходной плазмиде

II - ориентация, противоположная по отношению к исходной.

5.6. Компьютерный анализ нуклеотидной последовательности 0.7 тпн Hindi II фрагмента хлоро-пластов A.thaliana и P.sativum

В дальнейшем, с совершенствованием метода секвенирования, удалось избежать субклонирования 0.7 тпн HindIII фрагмента P.sativum при определении его нуклеотидной последовательности.

Анализ нуклеотидной последовательности проводился с помощью пакета программ DNASIS на ПЭВМ IBM PC/XT, использовалась полная нуклеотидная последовательность хлДНК табака N.tabacum банка данных нуклеотидных последовательностей SenBank.

Нуклеотидные последовательности изученных фрагментов хлДНК гороха и арабидопсис приведены на рис.2. Сравнение последовательностей с последовательностью хлДНК табака показало, что обе они представляют собой фрагмент ДНК, включающий в себя часть гена гр12 белка L2 большой субъединицы рибосомы хлоропластов, часть гена rpsl9 белка S19 малой субъединицы рибосомы хлоропластов и спейсер между этими генами. Обе последовательности являются А/Т богатыми: содержание А/Т во фрагменте хлДНК гороха составляет 63%, арабидопсис -

N.tab. ?? ? AA ? I ' ? ' I 50

A.tha. A6¿TTCTTTÁ TTTTTCTTAA TAAATGATTG GCTACAAAAG GATTTTTTAT

P.sat. Á rpsl9 С 2Г T

N.tab. A (p AC ÇC TT J T T T* 100

A.tha. TCGTGAACGÎ GTCATACTT^ ATTATT¿¿TC CTATAAJAAC ТААААА^Щ

P. sat. 1 Ö?T T {TÉ 5 МЗ

N.tab. 150

A.tha. дтттеттс TCTTATATTC Í^AATTCT^M АТАТАБААТС TCTAAAAA^A

P. sat. ? TT ЬаМШТГШТА * '

N.tab. * А 200

A.tha. GMAAJGÇTA TAATGTCOjiA SI¿A¿TTGCT ATTTTCTTTT GTMAGACGA P.sat. A 1 "" AT * ¿ ° " rpl2, ezon2 '

N.tab. JfT Q ?? ?■????????? * 250

A.tha. AGAAACAAAT TcÎaTTTTAT CTÁcGCTTÁo GCT¿áACTAT TTACTACGGC

P.sat.

¥T

N. tab. . TA Ç A Ç 300

A.tha. SACGAASAAT CAAATTATCA CTATATTOTT C6TTTTTCT¿ GTTCTTCTTÇ

P.sat. * •Û ?C =T? -

N.tab. A ? ????????] I? GT 350

A.tha. CAAGTGCÍ5GA TAACCCCAAT ¿TCTTCAATG GgCGGTXÀfes GTTTTTTT6T

i. f f-1 Ii и 11111— it i t-

P.sat. 'A A ? ??????A?? A? ? G.

N.tab. A ÇQ T G T ф 400

P.sat. А

A.tha. "gCAATTGGC^ tffCCCTTCAC CACCCCCATG lsGAT|GTC^ GCAGGGTTCA

N.tab. ? TAT ß ^A Ç ^ G 450

A.tha. ' TAGACCCCTC ТТАСТАСлф CGCTTGCCTC GCCAACGTTT AGCTCCSTCC P.sat. ~Af G . ,0

N.tab. A.tha. P.sat.

Ç ÇA? ? T ? ■ G 500

TAGCGGGAAC TTTTCTGGTT TACCCCÇAAC ATTCCCTACT TGTCCAACTG ? a"¿ÓÁ « ? : б4"'*

N.tab. A.tha. P. sat.

N.tab. A.tha. P. sat.

N.tab. A.tha. P. sat.

N.tab. A.tha. P. sat.

N. tab. P. sat.

Рис.2.

С - 650

TTGCTGASCA STTTTTipGAT ATCAAACGGA CCTCGCCASA A6GTAATTTT "•—¿Г T T"

G ? IT AATGTiGCTS 1

С С 600

ATTTACCTTC TTTTOCAATC ASTTTCGCTA CAGCACCCGC = 6 , ,

6 650

TGCTCTASCT AATTGTCCAC CCTTTCCAAG TGTTATTTCT ATGTTATGTA

rpl2, exon2

J ?

ST AACGC

670 ?

TGBCCGTSCT AACGCATATC. I

6 ? GG GGTTGAAGTAG ATTCTTCTTT TTGATCATTC

740

AAAACCCCTT CCCAAACTQ TACAAGCTT.

Нуклеотидная последовательность 0,7 тпн-HindIII фрагмента хлДНК A.thaliana. Показаны мутационные изменения по отношению к этой последовательности у N.tabacum и P.sativum. Вертикальной линией показаны нуклеотидные замены, вертикальными стрелками - инсерции, знаками "?" - делеции. Звездочками обозначены границы последовательности, отсутствующей в N.tabacum. Непрерывной линией обозначены последовательности генов rpsl9 и гр12. Указаны последовательности Шайн-Даль-гарно, "-10", "-35" для гена rps 19. Полиндромы, прямые и обратные повторы подчеркнуты и пронумерованы.

61%. Особенно велико содержание А'/Т пар в спейсере: для арабидопсис оно составляет 77%, для гороха - 85%.

Сходство между нуклеотидными последовательностями визуализировалось с помощью точечной матрицу с размером окна 10 и уровнем сходства 0.8 в модели фиксированного выравнивания (Gibbs et al.,1970). С помощью метода-точечных матриц показано, что нуклео-тидные последовательности фрагментов арабидопсис и гороха гомологичны на всем своем протяжении, в то время как из нуклеотидной последовательности хлДНК табака делетирована часть спейсера между генами гр12 и rpsl9 размером около 100 пн. Эта последовательность отсутствует также в спейсере между генами rpsl9 и гр12 в хлДНК шпината (Zurawskl et al., 1984), пшеницы (Bowman et al., 1988) и сои (Splelmann et al., 1988). В ее состав входит структура, способная образовывать шпильку с размером "стебля" 10 пн и петлей размером 24 пн в случае арабидопсис и с размером "стебля" 9 пн и петлей 26 пн в случае гороха.

Сравнение нуклеотидных последовательностей изучаемых фрагментов арабидопсис и гороха между собой и с нуклеотидной последовательностью соответствующего участка хлДНК табака показало, что уровень гомологии разнится для кодирующих и некодирующих участков ДНК и изменяется при сравнении хлДНК различных видов (табл.2).

Видно, что уровень гомологии у сравниваемых видов существенно различается в кодирующих и некодируюшда участках. Это совпадает с литературными данными о разной скорости дивергенции для разных типов последовательностей ДНК (Dyer, 1984). Показано, что последовательности, кодирующие белки, более высококонсервативны, чем те участки генов, которые транскрибируются в 5'- и 3'-нетранслируемые ■ последовательности мРНК. Разные гены характеризуются различной степенью консерватизма их первичной структуры. В некоторых случаях консерватизм нуклеотидной последовательности генов очень высок, и обнаруживается гомология между хлДНК и ДНК прокариот. В этом случае хлоропластные гены можно идентифицировать с помощью бактериальных ДНК -зондов.

Таблица 2. Уровень гомологии между нуклеотидными последовательностями кодирующих и некодирующих участков фрагментов хлДНК А. ЬЬаПапа, Р.заЫтт и N. tabacш>.

1 | Сравниваемые 1 1 IЧисло ну- | 1 Число | Длина сравни- 1 Гомо- |

I растения Iклеотидных| инсерций/| ваемых после- логия,|

|замен | ( | делеций 1 довательностей X 1

1 1 I ¡А.ЫнПапа- 1 1 1 1

I § | Р. Баи тот I Ч 1 1 18 " ( 1 | 27 | 499 91 |

| ^ |АЛЬаНапа- I 1 1 1

| § |ЛЛаЬасшп 1 34 | 1 1 45 1 499 84 |

I Ц1 IP.sat.ivum-| о |ИЛаЬасит 1 I I 1 1 1

1 32 | 1 | 35 | 559 81 . |

1 1 I § |А.№а11апа- 1 1 1 1

| § ¡Р.защити 1 Р" 1 1 11 1 19 | 117 74 |

1 ^ 1 I а |АЛЬаПапа-I Ш |МЛаЬасит I 1 1 1

1 9 1 4 1 43 70 |

1 п, 1

1 & 1 I о |Р.заиушп- ! 1 1 1

I § ^ЛаЬасиш 1 1 1 ? 1 1 1 7 I | 43 70 | 1

Секвенированные последовательности содержат ряд особенностей первичной структуры - прямых повторов (фрагмент хлДНК арабидопсис: 5 - размером 8 пн, 4 - размером 9 пн и 1 - размером 10 пн, фрагмент хлДНК гороха: 9 - размером 8 пн, 4 - размером 9 пн, 1- размером 11 пн), палиндромов, шпилькообразных структур, способных играть роль в возникновении рекомбинационных событий, которыми должна была сопровождаться передача фрагментов хлоропластной ДНК в состав ядерного генома. Следует отметить, что изученные фрагменты хлоропластной ДНК локализуются на границе инвертированного повтора и большой одноко-пийной области в большинстве высших растений. В хлоропластной гено-

ме гороха именно этот участок был вовлечен в рекомбинационные события, приведшие к потере одного из инвертированных повторов. Это косвенным образом подтверждает предположение о наличии в районе локализации генов гр12 и rpsl9 "горячей" точки рекомбинации.

Сравнение нуклеотидной последовательности в районе спейсера у гороха и арабидопсис, с одной стороны, и у табака, с другой, позволяет высказать предположение о причинах, приведших к возникновению делеции у табака и других видов, таких как шпинат, соя, пшеница и т.д.(Zura*ski et al., 1984; Bowman et al., 1988; Splelmann et al., 1988). Для этого попытаемся реконструировать структуру этого района хлоропластного генома у предшественника табака. На рис. 3 (А,Б) представлена предполагаемая последовательность анализируемого участка ДНК в геноме хлоропластов предшественника. Причем нуклео-тидный состав прилегающих к делеции областей соответствует таковому у табака, тогда как нуклеотидный состав делетированной области представлен данными, полученными у арабидопсис (рис.3,А) и гороха (рис.3,Б). На рис.3 (В и Г) показаны данные по нуклеотидной последовательности этого района, соответственно, у арабидопсис (рис.3,В) и гороха (рис.3,Г).

Видно, что правая граница для всех четырех случаев имеет один и тот же нуклеотидный состав, а именно Т-блок из 9 нуклеотидов с заменой одного нуклеотида Т на С. Левая граница имеет существенные различия. В случае предшественника также имеется довольно протяженный Т-блок из 13 нуклеотидов и также на границе делеции замена одного нуклеотида Т на А; и отсутствие такого блока у гороха и арабидопсис.

Не исключено, что наличие Т-блоков. на границах делеции у предполагаемого предшественника явилось причиной этой делеции. Хотя, как мы уже говорили, наличие многочисленных прямых и обратных, повторов из А- и Т-блоков может обеспечить самые разнообразные структурные преобразования, и возникшая делеция может быть результатом цепи последовательных рекомбинационных событий.

АААБГТААП ТТОПСТСТТ ЛТАТТССШ ТСТАААДТДТ

ЛТССТАТЛАТ аТСССЖТАА АПОСТАГП ■ ТСТТТТ6ТДА

А. ТТТТТТ.ТТТТ 7АТААСТААА УХШТСТСТА ААААААША

ААА

б. ттхттттт тллтстллл

ТТААМТЛАА АТЛТАШТС

СТТТТСТТТТ СТААААА

/ШСТТуМТТ ттттстстта

ТСТААААААА Ш\АМТША

ТАГТТТАГАГ ТТСЛААПТГ тлдгстслгл стлмггсст

В. ТТССТССТАТ АЛШСШЛ ЛАКГТАИТ ТТ6ТТСТСП АТАГГССШ ТСТААААТЛГ

АвААТСТСТА ААААААША АТССТАТААТ (ШХСШТМ ШвСТДПТ ТСТТТТбТАА

Г. ТТССТСТТАТ ААГТТвТААА ААШГТААГТ ТТТТСТСТТА ТАГТТТАГАГ ТГСАААГГТТ ТТААААТАЛА АТАТАШ1АТС ТСТААААААА вААААТСАТА ТААГ6ТСАГА аТЛАШССТ

СТТТТСТТТТ 6ТААА

<

Рис.3. Нуклеотидная последовательность участка спейсера между генами грз19 и гр!2 предполагаемого предшественника (А и Б), арабидопсис (В) и гороха (Г). Жирным шрифтом выделена последовательность делетированной области у табака, взятая из арабидопсис (А) и гороха СБ). Сплошной линией подчеркнуты Т-блоки на правой границе фрагментов. Пунктирной линией подчеркнуты Т-блоки на левой границе фрагментов.

#

6. Способ определения наличия инвертированных повторов в хлоропластном геноме высших растений

Известно, что структура хлоропластной ДНК, характерная для большинства изученных видов растений, имеет два длинных инвертированных повтора (1Ю порядка 24 тпн (хотя этот размер может колебаться от 10 до 76 тпн при переходе от одного вида растения к другому), разделенных малой и большой однокопийными областями. Однако, у некоторых видов, таких как, например, некоторые представители се-

мейств бобовых (Polmer et al.,1987; Milligan, 1989) и хвойных (Strauss et al., 1988), один из повторов отсутствует.

В настоящее время не ясно, насколько широко распространено это явление (потери одного из IR) в растительном мире, поскольку использование традиционных методов изучения генома хлоропластов, и, в частности, выявление IR, представляет собой достаточно длительную и трудоемкую процедуру.

Тот факт, что, согласно литературным данным, гены гр12 и rpsl9 локализуются в хлоропластном геноме в месте сочленения IR и LSC в случае наличия в виде IR (Sugiura et al.,1986; Palmer et al.,1988), либо в случае P.sativum, V. faba и С. arietinum вблизи точки вероятной потери IR (Palmer et al.,1988; Kenneth,1988; Chu, Tewari,1981), с одной стороны, и фрагменты этих генов (гр12 и rpsl9) присутствуют в составе клонированного нами 0.7 тпн фрагмента хлДНК арабидопсис, с другой, позволил нам разработать метод, облегчающий процедуру определения наличия либо отсутствия 1R в хлоропластах различных видов растений.

Анализ нуклеотидной последовательности показал, что 0.7 тпн фрагмент хлДНК A. thai lana имеет внутренний сайт узнавания крупноще-пящей рестриктазы EcoRV и не содержит сайтов узнавания наиболее распространенных крупнощепящих рестриктаз, представленных в пакете программ DNASIS.

В связи с этим, в качестве предлагаемого зонда мы использовали не 0.7 тпн фрагмент, а его часть размером 380 пн (pKD25), выделенную из клеток транскониоганта Тк1, которая не содержит сайта рестрикции для EcoRV, но содержит фрагменты ДНК генов гр12 и rpsl9.

В результате, если гидролизовать крупнощепящей рестриктазой хлДНК какого-либо вида растений, то в случае наличия IR это приведет к образованию двух рестриктных фрагментов различной длины, содержащих гены гр12 и rpsl9, поскольку один сайт рестрикции расположен в пределах инвертированного повтора, а второй - в пределах большой однокопийной области. В случае отсутствия повтора образуется лишь один такой фрагмент. Таким образом, Использование в качест-

ве зонда ДНК плазмиды pKD25 в экспериментах по блот-гибридизации по Саузерну позволяет по наличию одной или двух зон гибридизации судить об отсутствии или наличии, соответственно, длинного инвертированного повтора в геноме хлоропластов клеток исследуемого вида растений.

Как уже говорилось, по литературным сведениям, хлДНК P.sativum и C.arietinum не имеет IR. И, действительно, при блот-гибридизации гидролизованной рестриктазой EcoRV хлДНК P.sativum и C.arietinum с 32Р-меченой ДНК плазмиды pKD-25 наблюдается один гибридизационный сигнал. С другой стороны, компьютерный анализ нуклеотидной последовательности Hicotiana tabacum обнаруживает два рестрикционных фрагмента EcoRV, гомологичных фрагменту из плазмиды pKD-25, размером 5915 пн и 974 пн.

В наших экспериментах была изучена на предмет наличия IR хлДНК A.thaliana, L.sativus.V.sativa и L.esculenta. По одному гибридиза-ционному сигналу показывают хлДНК L.sativus и L.esculenta. Хлороп-ластная ДНК V. sativa и A.thaliana имеет две зоны гибридизации.

По результатам экспериментов можно сделать вывод, что хлороп-ластный геном L.sativus и L.esculenta не имеет инвертированных повторов, как и в случае P.sativum и C.arietinum. Из изученных видов инвертированные повторы обнаружены в хлоропластных геномах V. sativa и A.thaliana. Вероятно, для ceM.Fabaceae потеря инвертированного повтора не является уникальным событием: она произошла у четырех из пяти изученных нами представителей этого семейства.

Все виды ceM.Fabaceae,рассмотренные нами, относятся к трибе Vicieae, причем инвертированные повторы обнаружены лишь у V. sativa. Считается, что отсутствие в хлДНК IR является результатом его потери в процессе эволюции в ходе рекомбинационных событий. Следовательно, можно предположить, что потеря инвертированного повтора у представителей трибы Vicieae произошла после выделения этой трибы, и филогенетически V. sativa является предшественником таких видов, как P.sativum, L.sativus, C.arietinum и L.esculenta.

- 22 -ВЫВОДЫ

1. Обнаружены и клонированы 0.7 тпн фрагменты хлДНК гороха и арабидопсис, имеющие гомологию с ядДНК этих двух видов растений.

2. Показано, что исследованные фрагменты локализуются в геноме хлоропластов на границе между инвертированным повтором и большой однокопийной областью.

3. Определение нуклеотидных последовательностей 0.7 тпн фрагментов хлДНК гороха и арабидопсис и сравнение их с аналогичной последовательностью у хлоропластов табака позволило установить, что они содержат часть гена грз19, часть гена гр12 и спейсер между ними.

4. Обнаружено, что нуклеотидные последоваельности исследованных 0.7 тпн фрагментов из хлоропластов гороха и арабидопсис содержат шпилькообразную структуру, а также многочисленные прямые и обратные повторы ДНК, расположенные в основном в пределах слейсера.

5. Показано, что ядерная ДНК пяти из шести изученных видов, кроме чечевицы, имеет область гомологии с исследованным 0.7 тпн фрагментом ДНК хлоропластов гороха.

6. Установлено, что число и месторасположение участков гомологии в пределах ядерного генома меняется при переходе от одного вида к другому.

7. Разработан экспресс метод определения наличия инвертированных повторов в хлоропластной геноме высших растений.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Денисенко Ю.В., Котлярова Е.Г., Огаркова O.A., Тарасов В.А. Гомология между ядерной и хлоропластной ДНК двудольных растений// Тезисы I Всесоюзного симпозиума " Новые методы биотехнологии растений " (Пущино 1991)

2. Котлярова Е.Г., Денисенко Ю.В., Огаркова O.A., Тарасов В.А. Гомология между хлоропластной и ядерной ДНК различных видов ceM.Fabaceae и Arabldopsls thai lana// Генетика. 1992. Т.28. N.9. С.5-10.

3. Денисенко Ю.В., Котлярова Е.Г., Тарасов В.А. Способ определения наличия инвертированных повторов в хлоропластном геноме высших растений// Генетика. 1992. Т.28. N.9. С.11-16.

4. Котлярова Е.Г., Денисенко Ю.В., Тарасов В.А. Анализ нуклео-тидных последовательностей 0.7.тпн фрагментов хлоропластной ДНК Arabidopsis thaliana и Pisum sativunV/Генетика. 1993 (в печати).