Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование цианобактериальных генов фотосинтеза, имеющих локализацию в хлоропластном и ядерном геноме высших растений

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Исследование цианобактериальных генов фотосинтеза, имеющих локализацию в хлоропластном и ядерном геноме высших растений"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ ОБПЕЙ ГЕНЕТИКИ им. Н. 1!. ВАВИЛОВА

О п

' Ка правах рукописи УДК: 582.232.7: 581.132: 577.113: 579.254

•ЛЫСЕНКО Елена Сергеевна

ИССЛЕДОВАНИЕ ВДАНОБАКТЕРИАЛЪНЬК ГЕНОВ ФОТОСИНТЕЗА, УМЕЮЩИХ ЛОКАЛИЗАЦИЮ В ХЛОРОПЛАСТНОМ И ЯДЕРНОМ ГЕНОМЕ ВЫСШИХ

РАСТЕНИЙ.

03.00.15 - Генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученей степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 1993

Работа выполнена б лаборатории изменчивости генома Института оОаей генетики им.Н.И.Вавилова РАН и на кафедре генетики и. селекции Биологического факультета Московского государственного университета гавани Ы.В.Ломоносова.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор биологических-наук, профессор

В.А.Тарасов

ОФЩШЬНБЕ ОППОНЕЙШ:

доктор оиологаеских наук кандидат биологических наук

С.А.Гостимский В.З.Незаметдановг

ВЕШАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Защита состоится "—г. в часов на заседании специализированного Ученого совета Д002.4Э.01 при Институте обшей геввтики им.Н.И.Вавилова по адресу: 117309, ГСП-1, Москва, В-333, ул.Губкинз, д.З.

С диссертацией мои» ознакомиться в библиотеке Института общей генетики им.Н.И.Ваныова РАН.

" огсткй

Автореферат разослан "—<*-" огсткбря 1993 года

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

Г.Н.Полухина

Сведение.

Актуальность темы Рапшчтпе современных методов

исследования rc.noi-¡n, от/лчел колс:сулпркзе клонирование, определение кунлеотиднмх послелоогтельигетой, создание k-.иформсционних бикнеп дзкиих нуклеоткс'-Ж к амкнокксяотг.цч последовательностей , улучшение тохники гкбрпдкзации ДНК и т.д.. пояггол-лло нспользо^ат.з в качестве объонтов исснеюил.кив гзкоки самых разнообразных ы-.дов ?у- и прокариот. Это, в свою очередь, позволила перейти н раальному экспериментальному исследованию молекулярно-гокетвчреяих с.мгв таких фумдг?!ентпльик.-; лзланий :: процессов, как морфогонег, патог&неэ и другие, D тон числе и процесс фотосинтеза. Как явлэкие фотосинтез известен достаточно давно, и его исследование вылилось □ формирование целого научного нз^разлекия. Сднано до последнего времени чгреэвычзйно мяло било известно об организации системы его генетического контроля. Положение стало суиественным образом изменяться л:тпь в последние десять лет, в течение моторах было проведено клонирование и исследование ядерных генов, включенных в контроль фотосинтеза iTittgen et al.,1986), а также прозгдеяо секвестрование хлоропластних генсмоо рядг видов, 1аких пая табак Nicotisna tabacum (Shinozaki et si. ,1985), печеночлта мох Marchantía polyitiorpha (Ohayma Ы al.,1388: Umtirono fct al-, 1933; Fukuzawtt et al..1988) и рис Ory-a sativa (Hiraisuka et el..1983). Несмотря на существенный прогресс, достигнутый в последние годы", мы еце далеки от понимания всех особенностей организации га::ов, включенных в коыроль фотосинтеза. Р пероуг очзродн это относится v. фотосистеме I, а также к особенностям теистического контроля процесса фотосинтеза у разных видов рзстеввЗ, зунсрисгических водорослей и ци.анобантерий. В силзи г зти~ прэдолх.*ают оставаться актуальными исследования по выявлению ранее меиэЕестннх геней, включенных н процесс фстосинтезг, сравнение их структурно-функциональной органииацг.и у рззныг видов растений и микроорганизмов.

Одним из способов поиска и пылелекзй растительных генов, Функции ноторых неизвестны, в том числе я "оотосинтетччесних".

мажет быть использование в качестве гибридизационмих зондов клонированных генов иианобяктерий. Такой подход основан , во-первых, на сходст&е процессов снсигсиного фотосинтеза и структуре фотосиктетвчесного аппарата у иианобакте^лй и высзих растений и, во-вторых, на информации о структуре и работе пигмент-Белковых комплексов фотосистем Г и II у цианобактерии БупосЬосуеНз РСС 6803. Для этого объекта показана генетическая трансформация !Сг1еог»е*а,ЗНеэ1акоу.1582), разработаны методы селекции фсгооннтетичесних мутантов и клонирован ряд фотосинтетичгсних гэнов. Использование в качестве гетерологичных зомлов н<юн*розанных генов цианэбантерчй дает возможность лдэнтифыцировать ыосые гены фотосинтез- в геноме высших растений.

Цель кссяевовакзя. Целью насто.чшеч работы является идентификация и исследование молекулярной организации ранее неизвестных геноэ цианобактерчи ЗупесЬосуя^Б РСС 6303, включенных в контроль фотосиктсза. При эточ решались следующие конкретные задачи;

1) Отбор иэ ряда клонироьанных фрагментов ДНК геномней клонотени цианобантеряи фрягцентов, номплемянтируюиих дефект по Фотосинтезу у разных групп мутантов л показаниях гонологию с ялерной, либо с хлсропиастной ДНК гороха Рхэиш б&^гшл или арабидопсис АгвЬ1с1ср51у 1ЬаНапа.

2) Ияентафикапвя в пределах фрагментов ДНЯ цианобактерии отобранных клонов участков гомологии с ядерной или хлоропластнэй ДНК растений.

3) Определение нуклеотидных последовательностей областей, имеющих гомологию с ядерной или хлоропластной ДНК растений.

4) Анализ . этих последовательностей с цель» идентификации гена, детерминирующих процесс фотосинтеза.

Научная новизна и прантичесиаг, ценность. Для фотосинтетического мутанта 013 цианобактерии ЗупесЬоеуе^в РСС 6803 показано, что функциональны?, аналог соответствующего гена у высших растений локализуется в ядерном, но не о хлоропластном геноме. В случае этого мутанта путем проведения определения нуклеотидной последовательности и последующего анализа участка фрагмента ДНЯ, поназавиего гомологию с ядерной ДНК гороха и

ар^Ойвопс.чс У! ро'.-станавливаюнего при трансформации способность '¡леток мутанта D13 расти фотпавтот рофно, установлено кагл-.чие ранее ноиииестного гама. особенностью которого являются его небольшие размеры. Он способен иодировать полипсптяя с молекулярной массой 7кД. Сам фант существования в структуре фотосинтетичесного аппарата сравнительно небольших по величине белков, кодируемых ядерной ДНК растений, помаззн относительно нравно ! Iliouchi at al. ,1989а; Ikeuchi e! al.,198Sb). В настоящее время в большинстве случаев их роль в структурно-функциональной организации фотогкнтетичесного аппарата неясна.

3 случае мутанта D21 цианобактерии понаэано, что в составе клонированного фрагмента ДНК, комплементируюяего генетическое нарушение в клетках мутанта и имеющего гомологию с хлоропластной ЛНК гсроха и арабидопсис, обнаружен ранее неизвестный ген, способный иодировать полипептид с молекулярной массой 26.5 кД. В банне данных аминокислотных последовательностей SWISS PROT за 1Э32 гол обнаружена группа белков, гомологичных данному■белку. Исследование его возможной функции показало, что он не участвует а нонтроле работы фотосистемы II, а, по-видимому, определяет правильность сборни и функционирования светособирапцнх антенн, либо участвует в регуляции сопряжения дыхачия и фотосинтеза на уровне работы фотосистемы I.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на зпседании кафедры генетики и селенции Биологического факультета МГУ и научном межлабораторном семинаре Института обпей генетики РАЧ.

Структура диссертации. Диссертация состоят кэ введения, обзора литературы, описания материален и методов исследования, изложения реэулыатор и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложэна на стр., содержат

рисунков и таблиц. Список литературы включает

наименований.

Материалы и методы. Штгммы. В работе использовали атгмны Escherichia coli СБОО (Fthil, tbrl , IjuBC lncYJ , tonA21 supE44) ЛШ522 (supF _ thi

д( lac-ргоЛВ !.. 4 hsd5( г-, е-) . ¡F' proAB, lac I* Z Л HI 5 1 ! П'.ОВер и др.. 1990), а такие штамм Е. coli, содержащий ненторну» плаямиду pacyc184 (CjcrTcr) из коллекции кафедры генетики и селенциь. МГУ. Была использована бактериологически чистая культура Syncchocystis sp. РСС 6S03 кз коллекции Пастеровского института.

Растительный материал был получен из семян гороха P. sativum сорт Ненчиновка 85, арабилэпсис A. thaliarm сорт Columbia из коллекции ИОГен РАН.

Бкдсленяе яласнпяной ДНК из Е. coli, обработку эндонуклеазакз рестрикции, ДНК Л1:гаэой, электрофоретичэсккй анализ к элацив фр^гментоа из агаргзы, обработку щелочноГ. фосфатазой , n«jpei;oc ДНК иг ягароаы на фяльгры, мечение препаратов ЯКК in vitro методом рассеянного праймирования провопили по общепринятым методикам (Мзииатчс и ср. ,1984).

Фсрмгнтзтивн)то обработку препаратов ДНК лроэодили ферментами полученными из HnO"Fenaentas " ( Vi lnus >.

Ejiot-гибридизации проводили по методу Джонсзна с соавт. в модификации (Johnson et si.,1994).

Выделение ДНК. Хромосомную ДНК Synechocystis РСС .6803 выдепяли по станаартноЗ католике с модификациями '.Van den Hondel. 1980). Хлоропластнув ДШ! зылелнли по методу Палмера (Palmer, 1982). Ядерную ДНК выделяли по методу Кислоза и Рубинштейна (Kislov, Rubinstein. 19301 в случае P. sativum из 3-х суточных корешков, а в случае A. thaliann из каллусов, любезно предоставленных Институтом Фотобиологии АН Бглоруси. Тотальная ДНК A. thalianà и P. sativun была выделена из целых растений с использованием детергента СТАВ по стандартной методике ( Гловер, 1988).

Нуклеотвдную последовательность определяли методом дидазокситерманирования в составе вектора М13шр18/19 по методу Сэнгерг (Songer et al, lS77;Tabor et al.. 1987). Реанции секвенирования проводили при помоэш набора "Синвенс 11" (НПО "Фермент", Вильнюс) по методике фирмы-изготовителя.

Пульс-электрофорез хромосомной ДНК Synechocystis РСС 6803 проводили по методике, предложенной П'алаком с соавт. (Шалак и др., 1992).

Концентрацию 0г;м в среде определяли с псяокы? электрода Кларкп нл пол-рографг LP-7 при температуре 05* С !Барский и

лр. , 1Мвй;.

Результаты и сбсухдемие.

i . Отбор фрагментов ДНИ, коиплементируксих ФС_фенотип

мутантпц цианобзктерии Synechocystis FCC 6803- по топологии с ДНК ьысиих растении.

Основой панной работы послужил набер плазмид, чосстж-тавлиЕаюиих при трансформации способность н

фотоавтотрофному госту у серии мутантов, понучевпых на кафгяре генетики и селэкции МГУ (Кокшарова и яр. ,1386; Еестанов и др., 1S8B). На первом этапе они были охарактеризованы методами дот- и блот-гибридизации по Саузерну на предмет наличия или отсутствия гомологии с ядерной или хлоропластной ДНК гороха Pisum sativuai и арабидопсис Arabidopsis thaliona. Б качестве радиоактивно меченых зондов были использовэьы ядарная и хлоропластная ДНК этих видов.

В результате были отобраны три фрагмэита ДНК цианобактерии в составе реномбинантных плазмид рЗЭ;рЗ 1;P162-I. восстанавливающих при трансформации способность фотоавтотрофиого роста у трех групп мутантов (таблица 1). Выло показано, что один фрагмент (p3ü) гибридиэоаался с ядерной ЛНК, а два других (р 31 и р1624) ги£рядизовались с хлоропластной £НК растений.

В cBHji". с тем, что размера исследускьв: фрагментов s составе

отобранных плазмид достаточно велики, представм*яось необходимым

провести бопее точную локализацию участков гояоичгии с ядерной и

хлоропластной ЛИК растений. Для этого такие был вег.ользозан метод 3°

блот-гибридизации с Р-мечеными ядерной и хлоропластной ДКК

горохз и арабидопсис. Полученные при обработке рестрицируюцими энлонунлеззами ВакН! и HindlH субфрагменти плазкяд рЗЭ; рЗ] ; pl 624 аналиэировлись на предмет наличия или отсутстоня гомологии с ядерной или хлоропластной ЛНК (рис. 1).

В случае фрагмента ЛНК цианобактеряа рЗЭ тра субфрагмента с размерами 2.3; 1.9 ч 2.0 тпн гийридиэовалг.сь с ядерной, ко не с хлоропластной ЛНК гороха и аррбидопсяс. При использовании суОирагментов размером 2.3 и 2.0 тпн в качестве "Р-меченых проо

Таблица 1.

Рекомбинакткие ппазмиды нлонотени_ Synechocystis РСС 680.1. трансформируйте " фотоавтотрофности ФС мутанты цианобактерий.

Pei-омби-нэнтния плаамида Раамер клоляр. фрагиект-а (?пн1 Трансформируемые к Оотоавтотрофиости СС" мутанты

Название Способ получения Селективный агент

рЗО 11.0 Э13 НГ X!

Р1Е24 9.0 D21 нг Я

р31 5.6 РК12

PR7 споят ПХМБ

РК1

РМВ1 НГ

Примечание: ОГ - метил-М'нитро-Л-нитроэогуанидин - парахлормгркурибензоат Я - диурон 3-/3, 4-дихлсрфанил/-1,1-ВК-метилмочевина

гибридизация наблюдалась с ВашН1-францией ядерно!« ДНК гороха с размером оу.ога 5.6 тпи. Субфрагмеит 1.9 тпн также давал слабый гибридазационккЯ сигнал с ядерной ДНК. В исходном фрагменте ДНИ рЗЗ анализяруемые суСШрагманты 2.3 и 2.0 тпн разделены последовательность*) около 1.5 тпн.

Из двух субфраг*ентов плазмиды р31, полученных в результате гидролиза эндонунлеазлми ВаюН1, HindIII, только один субфрагмент размером 2.75 тпи, имеющий внутренний сайт рестрикции Smal, гибр'.<дяэоаался с хлоропластной ДНК гороха и арабидопсис.

Аналогичные результаты о гомологии с хлоропластной ДНИ высших растений была получены для одного из четырех субфрагментов р1624. Размер гибрклззуюцегося субфрагмента составлял 2.5 тпн.

В результате для дальнейшего анализа были отобраны

еубфрагменти 2.0 тпн в составе плаэмг.ды рЗЗ; 2.75 тпн - в составе плазмидн рЭ1: 2.5 тпн - а составе плаэмчды р162а.

1 ) . Определение участков гомологии с хлоропластной ДН,'( растений плазниды р31 .

К моменту начала работы г.е 5или получены данные относительно нуклеотидной последовательности субфрагмнта размером 2.75 тпн в составе плазкчды р31 . показавшего гомологию с хлоропластной ДНК гороха и арлбияопеис. Однако в днльнейдем при гибридизации с хлоропластной клонотекой табака ^.гаЬасит показано, что этот Фрагмент гибридиэовался с клоном, содержащий в своем составе ген рбЬВ, кодирующий белок СР4? ФС11 I Ела некая и др., $989). Эти фанты, а также предварительные результаты, полученные на одном из промежуточных этапов в ходе выполнения работы, о том, что клонированная фрагмент нлизмидн рЗЗ имеет гоизяогию »е только с хлоропластной, но и с ядерной ЛНК, , поставили, вопрос о существовании нлаетера тесно сцепленных генов, участвующих в контроле фотосинтеза, в геноме цианобэктервВ. Имеющееся к этому моменту литературные данные свидетельствовали об отсутствии кластера фотосинтетических генов, внлэчаюяего ген рг&В, в геноме цианобактерий. В результате проверялось предположение о гуиествовании непосредственно зблизи гена рвЬВ фрагмента ДНК, гомологичного ядерной ЛНК растений. Однако дальнейший более :трогий и детальный анализ с асповьаованвем в качестве ■ибркдизационнчх зондов ролфрагментоз, пчяучек»ых и результате -идролиза участка ДНК размером .2.75 тпв р31 эядонуклеаэахи НшЛП, ВавН1, Зша1, подтвердил гйбркдвзаяоо с дапоровластной, но <е с ядерной гороха и арабндопгис. Ьт сциин вызол о

•омологи» субфрагмента 2.75 тпн в составе плазеиды р31 с слоропластной ДНК растений, обусловленной величием • гена рэЬВ в гоставе этого участка ДЯК цианоСак'.-ерзЯ, н отсутстпаи рядом 1ежапих последовательностей, гомологичных ядднк.

Дальнейооэ изучение' фрагментов цсавобактериальной ДНК 1Лазмид р39, р1624 было связано с сенвонврованием участков ДНК в |ределах этих фрагментов, поназаввих гомологию с хлоропластной ¡ли ядерной ДНК растений соответственно, и их анализ с целью

рЗЯ

1.5 2.3 1.9 1.2 2.0

В НИН и н н и в

JJJJ^unkLLLL 2.0 тпн

ORF15

В. Р31

2.85 2.75

тпн

В Н S Р В

v t......I »iLLL!. 5-6 тпн

Н SB

I II ^ ^

psbB

С. pl624

2.1 1.9 2.3 2.5

тпн

В К Н Н В

jjjjAmruiwiLiuiHi тттЬпдпаииы^:! ш ■■■■ Дц.4 3 0 тпн

н в

jjjjJaBEasnaosBiiLLLL 2.5 тпн

ORF242

Рисунон 1. Рестрпкционные карты фрагментов хромосомной ДНК

Synechocystis ТСС 6803, номплечвитируюаих ас фенотип мутантов,

из плазмид р39 (А): р31 (В); р1624 (С).

B-BamHI; P-Pvull: S-Smal: H-Hindlll; RI-HcoEI.

iii - ДНК pACYCI84. ets" - ДНК Synechocystis PCC 6803.

э

кдоитификации н них функционально значимых единиц.

TT"!. Днали:« области гомологии с ядерной ДНК растемий плагшилы р39.

Нан уже упоминалось, субфрагмент ДНК цкакобактерии размером 2. О тпн в составе плазмиды рЗВ имеет гомологию с ялерной ДНК растений и восстанавливает при трансформации способность плеток мутанта ШЗ расти фотоавто'грофно. Определение нунлеоткдной последовательности этого фрагмента проводеяось методом дидезоксктерминироаанчя по Сэнгеру I Sanger, ]Э77). Стратегии опытов по геквенированию представлена на рисунке 2.

Внутри Hi ndl I I-üaaHI фрагмента размером 2.0 тпн было обнаружено три сай-а HincII и один са?т Sphl. В результате секвенирования каждого из субфрагментов была определена непрерывная куклеотидняя последовательность длавой 2111 пн.

Рисунок г.(А), Стратегия сепвенироваии« HindiII-BamHI Фрагмента размером 2111 пн плаэмиди рЗЗ. Стремами обозначены направление и размеры сонвенированних участиэв. Звездочками обозначены олигонуклеотидные зонды.

HincII Hindi 11 Нра11

HincII HincII Sphl

3amHI

420

850

125 340

370

a.

*

Рисунок 2. ÍE) Фрагмент нумлеотилной последовательности,

включающей открытую рамку трансляции 0RF15. Подчеркнуты области -10 и -35 промоторного района и сайт инициации транскрипции-, "*"-стоп- кодом.

5 • CCACCCACGCCAGTTACTTCCCCCCCTGTCCCCGAATGTAAACCGCTACCGGTCCCTGTA 13С lio 150 160 170 180

3 • GGTCGGTGCCGTCAATCAAGCGGOCGACACGGCCTTAOATTTGCCGATCGCCAGGGACAT

« Г D Н Y

CACCTCTAACACTGGGTTATGATTACGGCCGCGCTGCATTAAAAAGTCGTTACCCTTGCG 190 200 210 220 230 240

GTGGAGATTGTGACCCAATACTAATCCCGGCCCGACGTAATTTTTCAGCAATGGGAACGC VELVPHHKRGRQMLFDNGKR

GGAGGATTGTCGGATCGGTGGTACCTTACGGTCTGGTTCGCOATACCAATTGCGAACCCG 250 260 270 280 290 300

CCTCCTAACAGCCTAGCCACCATGGAATGCCAGACCAAGCGGTATGGTTAACGCTTGGGC SSQRIPPVKRDPE GYWN RVR

GCCCTCCCCAACTGACC*rGTTrGGATACCTTCCrrlTTTCGGGAATTACACCTGTACCGTT 310 320 330 340 350 360

CGGCAGGGGTTGACTGGiCAAACCTATGGAAGGAAAAAGCCCTTAATCTGGACATGGCAA GEGVSRNPYRGKEPILGTGM

TAGAGGAGCCATAATTGTGGTAGCGGTTATAGACAGGTTTCAATTGGACCAATCGGTTAA 370 380 390 400 410 420

ATCTCCTCGGTATTAACACCATCGCCAATATCTGTCCAAAGTTAACCTGGTTAGCCAATT L P A M OEF15

41 -10 -35

Полученная нунлеотидная последовательность 2111 ли была проанализирована на компьютере (IBM PC/AT) с помоаьга пакзта программ "PCGENE". "PROSIS", "DNÁSIS". В результате было обнаружено несколько потенциальных рамок трансляции. Среди них не было найдено достаточно протяженных; все они способны кодировать полипептиды длиной 35-80 аминокислотных остатков. Анализ

функциональной значимости областей перед стартовыми колонами, т. е. промоторных участков и участнон свнзынании рибосом, позволил наделите, срели обнаруженных рамок олну ORF15. которая обладала в плане структурно-функциональном необходимыми консеисусными последовательностями, сходными с таковыми у E.coli (рис. 2Б). Структурная часть 0RFI5 сравнительно мала; она имеет длину 207 пн и способна иодировать полипептид длиной 63 аминокислотных остатнов и молекулярной уассой около 7 кД. Тем ие менее в литературе в последнее оремя появились даннке относительно ряда новых ни^номоленулярных бйлное (6.1 к Д.- 5кЯ; ■). 1 кД), входящих в состав фотосистемы II и кодируемых ядерными генами растений iIkeuchi et al.,1989а; Ik*uchi et al.,1999b). Причем только ДЛЛ белка 4.1 кД был обнаружен аналог в составе CCII цканобантерии Synechococcus vulcanus (Iksuchi et al.,1989c). Подобные белки изучены ене недостаточно, не выделены гены, кодируюиие их. В банке данных известных нунлеотидных последовательностей EMBL GENE BANK DATA BASE (19S2) не обнаружено последовательностей, гомологичных ORF15. В связи с этим можно полагать, что в случае ОйF15 мы имеем первый приыер клонирования гена, отвечающего за синтез одного из типов ниэномоленупярных белнов, конкретные функции которых неизвестны.

У. Анализ области гомология с хлсроплзстной ДНК плазмиды Р1В24 .

Плаэмида р1624 коипле!.:ентировала при трансформации дефект по фотосинтезу у мутанта Tí21 и имела гояологив с хлоропластной ДНК гороха и арабидопсис. В составе клонированного BamHí-фрагмента размером 3.0 тпн соойствами гомологии с хлоропластной ДНК обладал субфрагмент размером 2. 5 тпн. Более детальный анализ субфрагмента показал, что это свойство определяется участком 0.7 тпн, ограниченным сайтами HindIII-HincII. Данная область была выбрана для определения нунлеотидной последовательности. Внутри Hindi II-HincII Фрагмента был обнаружен сайт рестрикции Cfriol (рис. ЗА).

Рисунок 3 Л. Стратгтия секвеиированим участка Hindi II - Bamlil фрагмента ДНК цианобактерии, гомологичного хлоропластчой ДНК растений. Стрелками указаны направление и размеры сенвенированных участков.

Hindi 11 C10I НИ С101 BamHl

jjji

»ил

500

200

1J 00

700

<---« ORF24 2

,-------» OHF90

Для определения нуклеотидной последовательности методом дидезокситерминирования по Сэнгеру в фаговые вектора Ц13т?18 и М13тр19 были клонированы субфрагменты HindiII-Cfrl01 0.5 тпн; CfrlOI-llincII 0.2 тпн; CfrlOI-CfrlOI 1.3 тпн; Hincll-CfrIOI 1.1 тпн. В начале была определена непрерывная нуклеотидиая последовательность длиной 596 пн в составе фрагмента Hindlll-IIincII. Был проведен компьютерный анализ полученной последовательности на компьютере IBM PC/AT с помощью пакета программ "DNASIS", "PCGENE". "PBOSIS". В результате было обнаружено две вероятные рамни трансляции. ORF1 содержала часть рамки трансляции длиной 461 пн, способной кодировать полипептия в 154 аминокислотных остатка. Стартовый нодон лажал за пределами HincII сайта клонирования. Вторая рамка, ORF2, начиналась со стартового кодона GTG (Vul-tRNA) , заканчивалась за пределами ' клонированной последовательности, и не имела промотороподобных последовательностей. Размер кодируемого ORF2 полипептида составлял ЭО аминокислотных остатнов. Было продолжено секвенироеание данного участка иивнобактериальной ДНК с целью поиска начала рамки трансляции ORF1 и выяснения наличия или отсутствия промоторных районов.

Рисунок 3 Б. Нунлеотилная последовательность участка ДНК Н1п<1111-ВааЩ фрагмента р!624, аклгачагагаего ОЯР242. Сплошной линией подчеркнута промоторнан область -¡О и сяйт инициации транскрипции. Прерывистой линией полчерннут сайт связывания рибосом. "«" - стоп-молсн.

130 140 150 150 170 130

5' САСССГСТАЛАОСЛАТСССТТССССГАССССТТССССТТСССТААТААААССТТТАСТАА

190 200 210 220 230 240

тттсссссаасссстстостассстаааасссасттсптассттсссссстсаттттсст

250 260 270 280 290 300

лсттосаасстттсст1тсссса\аттсасаатпттстаатсасттстсссса\ааасс

"10 41 М Т Э А « К Р

ОНР242

310 320 330 340 350 360

ссттттттссссатстсатсгасааасггтссттасаааттс;саасссассссстсстссс vfspsdl.qtii.ei а т е а v ь а

370 330 330 400 410 420

ССССССОСССОАААТТТТТТССТСТСС^СТСААССТССААСАСАТАСАССАААААССССС АСА Е I КЭЗОУКУОд! ЧЕКОЙ

430 440 450 4 80 470 480

ОСССССАСАТТТССТТАСССААССССАТССССААССССААСССАТТАТТТТССАААТСАТ АС01.\'ТЕА0110АЕА1 I I. Е Г 1

490 500 510 520 530 540

ТАААСССССТТССССАСАССАТСССАТТТГССССаААСААТСАССССАСТТАаСАСАСаТ КНПСР0НА1ЬАЕЕ5а1}ЬС9\'

550 560 570 580 590 600

тп д.с а атсстттттсттссссс аттс КТССССТСС атссс а.сс ассаастттссссатас

Э N Р р' С VI А 10Р1_0СТТМГАНЗ

610 620 630 640 650 660

ctatcctgtgtcctctctttccattcgattactgatccaagacattcccacactgggcgt y г v S с v S ig l l i q d 1 p t v g V

670 680 690 . 700 710 720

agtttacaatccctttcgccaggaattatttcgggctgccaccagtttaggagccacatt vynpfkqe lfraatslgatl

730 740 750 760 770 . 780

aaatcgccggcccatccaagtatccaccaccgccagcttggataaaagtttactggtgac nijrp1 qvsttasldksllvt

790 800 810 820 830 840

gggttttgcctacgaccgagtgaaaacttiagataacaactatccagaattttgctatct gfa'ydrvktldnnypefcyl

850 860 870 880 890 900

cacccatctcacccaaggggtacggcgcagtggctcagcggcgatcgatcttcatcgatg thltqgvrrsgsaa idlhrc

- ORF 90 V A 4 R R s I F I D V

910 920 930 940 950 ( 900

tggcctgcggtcaaaggacggctattgggaaagggggattaatccctgggatatggccgg g lr sk dgyverg i np w.d ma g accqrtaigxggli'pgi.-vpg

970 980 990 1000 1010 1020

gctggcattgtcattgtgcggaaccagggggaatagtttccgcctatgattgttctcctc lals lcgsrgn sf.rl: « -vhchc'aeagg i v s a yd с s pl

1030 1040 1050 1060 1070 1080

tggatctaagcactgggcgcattctggccaccaatgggaaaattcaccaggaactgagcc dlstgrilatngkih qelsq

1090 П00 1110 1120 ИЗО 1140

AAGCCCTGGCGGCAACTCCCCAATGGTTCCAGCAGTACGCCGCCGCTÄGAGCACAAAAAA 3 •

alaatpqwfqqyaaauaqk

*3 результате была прочитана последовательность длиной 1140 пн и обнаружено начало ORF1 !рис. 3 Б). Данная рамка начинается с ATG (Met-¡.RNA) стартового нодоиг», иодирует полипептид размером ¿42 гминочислогных остатка, молекулярная масса предполагаемого бэл;:я соитаиляэт 26.47 кД. В дгльнейиам этз рамка сбоиняч^и-.гсь ORF242. Достаточно протяженные размера и анализ 5' фланкируюяих районов показал, что перед cteotcwm колонок этой репной находятся необходимые «¡оисенсуслыо последозательности, характерные для функционирующего гена. Сайт связывания с рибосомами (GAGAA) расположен на расстоянии 8 пн от старта инициации трансляции GRF242. Обнаружена область генсануклеотидов (TAGTTG), сходная с облас.ыо -10 проыоторнсгс района гена psb3 цианобантерий (Lanb'. НаиаКчогл. 1989), а возможный сайт инициации транскрипции CGT расположен на расстоянии 8 пн от области -10. Области г'енсенуи.1ео7идов, сходной с облестью -35 промоторов некоторых известных генов цианоСактернй, обнаружено не было. Отнлснрния в структуре и расположении консенсуеиых последовательностей, необходимых для эффэктиБНОй транскрипции ч трансляции, в нашем случае, так же как и в случае других генов цичн.обе.ктерий, находятся в пределах полиморфизма расположения л нучлеотидного состава промоторных участков и сайтов связывании рибосом, обнаруженных при сравнении их с наноничгскими последовательностями генов E.coli (Schneider et а].,19Э1).

Компьютерный анализ возможного белиоаогс продукта ORF242 был проведен с помощью пакета программ' "PCGETIE". "PR0SI3". Профиль гидрофэбнссти белка с молекулярной массой 2g.47 кЛ указывает на наличие как гидрофильных, так и гидрофобных областей. В анализируемой аминокислотной последовательности обнаружен участок со 112 по 12Э аминокислоты, способный пронизывать тклакоидную мембрану.

Было проведено сравнение аминонислотных последовательностей

ORF2-5 2 и ORF90 с Санном данних известных белноьих

последовательностей EMBL DATA ВАЗЕ за 1992 с помощью пакета программ "GENEBEE"(Brodsky at al.1991 J. Обнаружена аначительная степень совпадения аминокислотных последовательностей 0RF242 и группы белнов, в ноторую входят фермеНТЧ! i 4 i монофосфатаза млекопитающих, ферменты вероятно участвующие в кетабог.иэке хинонэв у грибов Aspergillus nidulans (GutG) и Neurospora crassa (Qa-X), а также белки CysQ E.coli и Salmonella typbimurium, ноторые предположительно могут контролировать пул з'-фосфоаденозид-б'-фосфосульфата. К этой же группе принадлежит супрессорный белок SuhB E.coli. Предполагается, что он влйяет на функционирование аппарата синтеза белка путем повышения активности белка GroE или каких-либо других белнов теплового шока и за счет этого супрессирует температурочувствительный рост мутантов ( Yano et al ...1990).

Сравнение аминокислотных последовательностей этих белков и продуктов генов SuhB. Qa-X. GutG выявило участии значительного совпадения. Процент наибольшей гомологии (43.3%) наблюдается между белком SuhB и ORF242. Размеры этих белнов тзняге близки 29.0 и 26.5 кЦ, соответственно. 0б;:зруже„с тскже совпадение участков последовательностей этих двух белнов в сходных струнтурных областях при анализе их вторичной структуры.

V. Возможная функциональная роль 0RF24 2 в геноме Synechocyst:s РСС 6803.

1. Определение копийностм последовательности ORF242 и ее

локализация в хромосоме аизнобактерии. При опредсгзнии копийнзсти

последовательности ORF242 фрагмент ДНК HindIII-HinclI размером 32

0.7 тпк метили Р и гибридизовали с хромосомной ДНК Synechocystis РОС G803, гидролазованной зндонунлеазами рестрикции ВаяН1: Hindi II; BemHI-HindlII. Полученные результаты показали, чтс во всех изученных случаях этот .фрагмент ДНК ,-ибридизовался липь с одной фракцией ДНК, ргзкеры которой соответствовали распределению сайтов рестрикции использованных эндонуклеаз в составе исходного Фрагмента длиной 9 тпн плаэмиди р1624. Таким образом можно сдельть выпед о ток, что HindiII-HincII субфрагмент представлен в геноме цианобактерии оцноГ. копией. Одновременно с

помоцью метола пульо-фореа^ а агароэном геле OIIF242 била локализспанз на нарте хромосому Syn^chocyntis ГСС 6803 (Ша^аи и др. , ¡992). Участок совпаве;1ил гибридиэуюцихся с OHF242 рестрикционных фрагментов Mlu¡ . Koti , Есо?2.1 хромосомной ДНК цианобактгри* составят около 40 тпн и содержал картированные ранее гены psbAl, рзоС.

2. Выяснение функциональной ¡jOJm послепгзательностй ORF242 с помощью инсерционього мутагенеза. Одним из способов, появившихся ь последнее время лля определения функциональной значимости клонированных генов, лвллется метод направленного инеерцио>;ного мутагенеза. При использовании этого метода в клонированную послеловстелы:о-ть вводится висерцид г помсиьи трпнспозонов или прямого члонкрозания г.о удобным сайтам, а затем путем гомологичной рекомбинации данная последовательность с инсерцяей включается в функциональный геном нлетэк. В данном случае влл определения фунн^ии ORF242 по сайту HincII, расположенному внутри стой рамки трансляции, был илонирозам ген аминоглияоэид 3'-фосфотрансферазы. Затек после трансформации по признаку устойчивости к канвмипику отобраны клетки цканобактерии, имевщиа Еставку в отсй области.

Оказалось, ч-, о полученные клетки цпанобгктернк не потеркг:/. способности к фотоавтотрофио^у росту. Более детальный анал1-& показал, что клетки мутантов отличаются от плеток диного типа по ряду параметров. Во-первых, результаты полученных спектров поглощения целых клеток при длинах полн от 3SC нм до 7Í0 чч указывают на уменьшение величина пика поглощения хлоройиллг а ía68q¡ в клетках мутантов по отношению и величине пика поглощения в клетках дикого типа (рис. 4).

Величин* пина поглощении финоинаиича tAg0(j) у мутанта больие величины пика поглощения хлорофилла а, в то время кан з плетках дикого тала величина пика поглощения фикоиианина меньше, чем хлорофилла а. В условиях хроматической адаптации при вирадивании клеток на красном свету у мутанта соотношение между пиками поглопения фикоцяанииа и хлорофилла более существенно, чем у клеток дикого типа, изменяется з сторону увеличения пика поглощения фикоцианина.

400 500 600 700 Длина волн»! (нм)

Длккз волны (ни)

Рисунок 4. Слехтры поглощения клеток мутанте (—) и дикого ■гида (---), внращэншх на обычном (А) и красном (Б) свету.

Do-s~nph?x, проверка состояния пигмент-белковых кэмпленсов ФС11 и ФС J с помосью измерения фотоиидуцированного газообмена кислорода поназала, что спорость виие-г.ония при постоянном фоновом освещении была выше у клпточ мутантов по сравнению с нпетками дичого типа. Наиболее заметные различия наблюдались при измерении газообмена в условиях фотоингибировяния темневого дыхания: выход кислорода в клетках мутанта был в даа раза ниже по сравнению с нормальными клетками (таблица 2).

Таблица 2. Фотохимические параметра клзтек диного типа и мутэчтов, полученных в результате инактивации OEF242,

SyrecJiocyct i s РСС СЗСЗ.

1/r N

фвк сил фвк сил фвк фид овк фил фвк фил

W.T 11. .2 0, .9 0, .17 0, .5 100 210 66 1 .8 39 37

КУ.-1 1 3 . . 8 1. 6 0 . . 24 0 . 26 100 1 05 58 С . ) 44

КХ-2 14 . . 3 2. 1 0 . .22 0 . .29 110 125 63 7 . . 2 47

Штамм V Y

ммоль 0о ммоль '

__________________ отн. сд

моль Хл с моль Хл

Примечание:

V - скорость обмйкэ насыщающей интенсивности езета 580-7С0 нм.

Y - газообмен кислорода на насыщающую вспышку длительностью 1.8 мне.

<р - максимальный относительный квантовый выход газообмена кислорода при лимитирующих ннтенсивностях света.

1/т - число оборотов в секунду реакции газообмена кислорода, рассчитанное делением V на Y.

N - число молекул хлорофилла в антенне ФС1 u OCII,

рассчитанное делением оптического сечения поглощения реакции ФВК и ФИД при >675 на сечение0 поглощение коленулы хлорофилла и клнтках цианобантерий (2.54 А").

20

/

С другой стороны параметры, характеризующие фотосистему И, такие как спектры низкотемпературной флуоресценции с характерннми максимумами эмиссии дл.". Оелнов ФСП и OCI IDzelzkalns. Bogorad, J Э88 ). а танке фотосинтетичесное выделение клслородэ на свету у мутанта не изменены. Эти данные свидетельствуют о том, что инактивацип ORF242 не затрагивает функцию OCII. Различия в вьаелении кислорода в условиях фотоингиОировакия и результаты предварительного анализа спектров исглоаения пигкектов клетон мутанта указывают на участие гена ORF242 в регуляции сопряжения дыхания и работы CCI, либо влияние на сборку и функционирование компонентов свотособнрасщих антенн, либо в более широком смысле на участие этого гена в адаптационных процессах в нлетках цианобактерий при изменении условий роста.

Выводы.

1. Локализованы в пределах клонированных фрагментов ДНК Sj-nechocystis РСС68СЗ, восстанавливающих способность к фотоавтотрофному росту клеток ФС мутантов, участки гомологии с хлоропластноГ; и ядерной ДНК гороха и арабидопсис.

2. Показано, что ген psbB У Synechocystis РСС6803 не сцеплен с генами, образующими кластер в хлоропластноч геноме растений, и не содержит тесно сцепленных последовательностей, гомологичных ядерной ДНК растений.

3. Установлено, что фрагмент ДНК цианобактерии 2.0 тпн плазмиды р39, восстанавливающей ФС+ фенотип мутанта D13, имеет гомологи» с ядерной ДНК растений, представлен в геноме Synechocystis PCCS803 одной копией, содержит отнрытую рамку трансляции 0KF15, обладающую промотороподобными участками и кодирующую полипептид с молекулярной массой 7 кД.

4. Установлено, что фрагмент ЯКК Synechocystis РСС6В03 2.5 тпн плазмиды р1в24, восстанавливающей ФС+ фенотип мутанта D21, имеет гомологию с хлоропластной ДНК растений, представлен е геноме цианобактерии одной копией, содержит открытую рамку трансляции ORF242, обладающую прог.оторными участками и сайтом связывания рибосом и способную кодировать полипептид с молекулярной массой 26. 5 кД.

5. Показано, что инсеримр о область рамки ORF242 приоодит к возникновению мутации, не эатрагиваюную функцию фотосистемы 11. а связанную с дефектом либо фотосистемы I, либо нарушающую соотношение пигментов синобилиссм.

6. Исполозуи метод пульс-злкетрофорезя было покасано, что последовательность OHF242 сцеплена с генами psbAl, psbG в пределах фрагмента размером 40 "тпн в геноме цианобактерии Synechocystis РСС68СЗ.

Основные результаты диссертации наложены в следующих публикациях:

1. Еланская И. В. , Ермановз С. С. , Сганбенсва Г. 3., Лысенко ¡1. С. Огарнова О. А. , Тарасов В. А. Клонирование генов, контролируюсь« Фотосинтез. Тезисы докл. VII Всероссийского симпозиума "Моленулярные механизмы генетических процессов-. Москва, 1990, с. 140.

2. Лысенко Е. С., Огарнова O.A., Тарасов В. А. Клонирование ядерного гена Arnbidopsis t ha И ana, включенного в контроль фотосистемы II. Тезисы докл. VII Всероссийского симпозиума "Молекулярное механизма генетических процессов". Москва, 1Э30, с. 1Б0.

3. Лысенко Е. С. , Огаркоиа О. А. , Тарасов В. А. Анализ фрагментов ДНК арабидопсис, гомологичных фотосинтетачесним генам из цианобактерии. Тезисы докл. II Всесоюзного съезда физиологов растений, Минск, 1990.

4. Лысенко Е. С. , Огарнова O.A., Тарасов В. А. Использование клонированных генов из цианобактбрий в качестве зондов при изучении фотосинтетичесного аппарата высших растений. Тезисы докл. 4й Всес. конференции молодых ученых по физиологии растительной клетки, Минск,1990, с. 10.

5. Лысенко Е. С. , Гапеева Т. Ф. , Ерманова С. D. , Еланская И. В. , Огарнова 0. А. , Тарасов В. А. Гомология клонированных фрагментов ДНК цианобактерии Synechocystis РСС6803 с хлоролластной и ядерной ДНК высших растений. Генетика, 1991, т. 27, Ni 4, с. 581-588.

6. Лысенко Е. С., Огарнова О. А., Тарасов В. А. Локализация генов фотосинтеза цианобактерии Synechocystis РСС 6803 в ядерном и хлоропластном геномах высших растений. Генетина, 1993, т. 29, Nr 2, с. 348-353.