Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Рестрикционный анализ хлоропластного генома растений CICER ARIETINUM и локализация гена PSB А

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Рестрикционный анализ хлоропластного генома растений CICER ARIETINUM и локализация гена PSB А"

РГ6 ОД АКАДЕМИЯ НАУК АЗЕРБАЙДЖАНА „ ИНСТИТУТ БОТАНИКИ

На прав-ах рукописи

МАМЕДОВ АЛАМДАР ЧАРКЕЗ оглм

УДК 195.525.2

РЕСТРИКЦИОННЫЙ АНАЛИЗ ХЛОРОПЛАСТНОГО ГЕНОМА РАСТЕНИЙ CICER ARIETINUM 1/1 ЛОКАЛИЗАЦИЯ ГЕНА PSB А

03.00.12 — Физиология растений 03.00.03 — Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на свискание ученой степени кандидата биологических наук

Баку — 19Э4

Работа выполнена в лаборатории генетической инженерии Института ботаники АН Азербайджанской Республики

Научный руководитель:

академик Дж. А. АЛИЕВ

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор МЕРТВЕЦОВ Н. П.,

кандидат химических наук АЗИЗОВ М. М.

Ведущая организация; Сектор микробиологии АН Азербайджанской Республики

Защита диссертации состоится « . » . 1994 г.

на заседании специализированного совета Д 004- 12.01 в Институте ботаники АН Азербайджанской Республики.

Адрес: 370073, Баку, Патамдартскос шоссе, 40.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института ботаники АН Азербайджанской Республики.

Автореферат разослан « » . . 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета

АШЗСЫйНЕгГЬ проблема» Ваяонегога качекулярно-гвнетичесгагя: основ организации фотосзстзгачысного аппарата и механизмов ©го функционирования является одной из актуальных задач современной биологии. Рьлкшв этой задачи шпссредэтшнно связано о изучением моле«уля{:ной оришизации генома хлоропластов.

В последние годы активно исследуется струкгурда-функци-оналшая организация хлоропластных геномов различных растений. К настоящему времени полностью секвенированы хлоропластные ДНК табака, печеночника, риса (ЕМпогак! еЬ а1. ,1386; ОЬушпа е! а1. ,1986; Шга/Ьаика е1 я1. ,1989), идентифицированы первичны© структуры ряда хпоролластных генов у других объектов, получаны важные результаты о мотикиамзх регуляции експресока хпоропла-стных генов. Однако, в иолом полная картина генететкюкой рэгу-ляции формирование и функционирование фотосинтетичэского аппарата далеко от ясности.

Из семейства бобовых (ГаЬасеае) в етом отношении наиболее подробно изучены соя,горох и фасоль. В то ю время хлоропласт-ный геном нута, относящегося к этому семейству и широко распространенного в Азербайджане, практически не изучен в этом ' ношении, хотя биохимия и биофюикг. фотссикгатичвского аппарата этого растения довольно подробно изучет; .. Поэтому «исследования структурно-фунгшиогальной организации ллоропластного генома нута представляют интерес как для выявлашш особенностей организации и функционирования фотостнтетечзского ¿шара-а самого нута, тле: и для сравнительного анализа хторошкеппас ДНК различных вздоз та сомэйстта бобохал: с цэлыа изучения их филогенеза.

Цель а 5ШШмк шзпаЕШйза. Ланнзя работа проводилась и рамках проводит: в 'Ьютиту-гэ «зтокккл /Л ЛзорЗ. Республики исакадаваний колекулгфггой стттгегсгэдйи хлороцлзстного Гено.'з ЕВШИХ растений.

Конкретными задании работы язлялгязь:

- выдалокгэ, рэстри'гцйонкый анализ и опрадалангаэ молекулярной шха .хлороилаотной ДШС С. аг1еИтга;

- ссоджэ геномной библиотеки хлоропластов С. ег1еИпда,локализация гена риЬ А на хл.ДНК нуга о использованием известного гена рзЬ А шанзха в качветва зонда;

_ Э -

- физическоэ картирование района хл.ДНК нута о генои psb А и субклонирование фрагментов этого района,включвххцих ген psb А (частично и полностью);

- сравнительный рестрикционньй анализ хлорошвотной ДНК разных видов семейства бобовых.

Научная новизна и тактическая ценность шботы. Впервые ио-следоЕана колекул.чрно-структурная организация хлоропгастного генома С. arietinum. Модифицирован метод Неггтапп-е- вьиелания хлоропластных ДНК. В результате этой модификают существенно возросла эффективность (быстрота и выход хл.ДНК) метода. Проведан хестрикционный анализ и определена молекулярная касса хл. ДНК нута. Суммарно клонированы Вага HI и Pst I фрвшэягы в плезмиде pBR 323 и создана геномная библиотека хл. ДНК С. ari-' etinum. Локализован ген psb А горбишад-связывагацего белка с мол.весом 32кДа ФС II во Вшп НЕ фрагментах (6.0 т.п.н.) и затем. бш субклонированы все рогмантьг, включаыдае ген psb А (полнаяъы и частично) в плазмаду pUC 19 для последующего определения полной нуклеотидной последовательности. Наконец,путем сравнительного рестрикиионного анализа хлороплвстных ДНК разных видов семейства ГаЬасеае выявлено,что рестрикиюнньгэ карты хл.ДНК разных видов резко отличаются.

Публитсшми. По материалам диссертации опубликованы три статьи, результаты исследований гокладывались на конференции молодых ученых АН Азерб.ОСР (Баку, 1987), V съезде Всесоюзного общества генетиков и селекционеров (Москва, 1987), конференции молодых ученых АН Азерб.ОСР (Баку, 1988), II сьездг Всесоюзного общества физиологов (Минск, 1990), I Республиканской биохимической конференции (Баку, 1990), материалы были представлены на IX Международный конгресс по фотосинтезу (Нагоя - Япония, 1992), III съезд Российского общества физиологов растений (Санкт-Петербург, 1993).

Объем работы. Диссертация изложена на Ю5 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, посвященного структурной организации хлорошюстного генома, ено-паримэктальной чг.тти, обсуждения результатов, выводов я списка цитируемой литературы (153 ссылок).

РЕЗУЛЬТАТЫ И 08СУЗДЕШЕ

1. Модификация метода выделения ДНК хлорапластов высших раехэний

В настоящее время предложено множество методов по выделению ДНК хлоропластов Щетпагиг . В основе ю гдого метода

лежат следующие основные принципы: гомогенизация зеленых масс растений и выделение интаэтных хлоропластов из гомогенатов, устранение или уменьшение концентрации ядерной ДНК и удаление других оргЕнелл, освобоздение ДНК хлороплестоь из штактных хлорошястов со слешукщим удулелием не ДНК-ого материала. Эти три основные принципа по выделению хлорэпластной ДКК выполняются разными альтернативными способами в разных методах выделения генома хлоропластов. Все методы монно условно объединить в две группы: выделение ДНК хлоропластов из водных растворов и органической среда.

В данной работе мы использовали метод ныделения хлоропласт-ной ДНК из водных растворов с некоторыми модификациями ггобы добиться капаемого результата с наименьшими затратами реактивов и времени. Модифицированы аледгацие офчш метода. После гомогенизации зеленых листьев, прэгднуру центрифугирования в ступенчатом градиенте сахарозы заменили центрифугированием • 1500 об/млн в течение 5 мин. При центрифугировании гомогената, в осадок выпадают обломки клвток и тканей, хлоропласта остается в супарнатанте. Пост осяэузения хлоропластов .их промывали 3 раза буфером 1 и 2 раза буфером П (состав буферов см.стр. ). Кроме того,для разделения или очистки хлороплвстной ДНК от РЖ и примесей ядерной ДНК не кспэльзоьали процедуру центрифугиро-' вания в градиенте хлористого цезия. Эту процедуру заманили хроматографией в колонке о ультрагелем А-2. В результат© получили чистыэ, гомогенные ДЩ хлоропластов о выходом более 1 мг хл. ДНК на 1 кг зеленых масс за короткий срок в течение 2 суток. Основные преимущества етой модификации - быстрота .довольно высокий выход ДНК хлоропластов, по качеству практически на уступающей ДНК, очищенной в грздаентв хлористого цезия СвС1. Поеггому.шдафицированный нами катод является более аффективный и экономичным.

- б -

Модифицированным методом вьщвлшм хлоропластнда ДНК шпината и гороха,расщепляли ее вндонуклеазами рестрикции.анализировали электрофорезом в 0.7 х агарозном геле. Результаты показывают что ДНК хлоро пластов шпината и гороха являются гомогенными,на содержат примесей ядерной ДНК и распределение фрагментов в 0.7 х агарозном геле полностью соответствует картине (рис. 1),где хлоропластнш ДНК шпината и гороха получили центрифугированием в градиенте плотности хлористого цезия. Экспериментальные данные согласуются с литературными,что является подтверздением достоверности наших результатов.

2. Рестрикционные картирование и создание геномной библиотеки хлоропластной ДНК нута

Кокцег. {грировйинда, очищенные от при-ксей молекулы РНК и ДНК зшэроитстов растений куга расщепляли ферментами рестрикции Ваш Ш. Pst I, Hind III в отдельности, а татаэ в сочетаниях Ваш HI-Pst I, Вшл HI-Hind III, Hind III-Pst I. Eco фрагменты хлоропластной ДНК нута хорошо разделились в О.бх атрозном ге-лз в точение 1.6 ч (Рис. 2).

Мя 01фадаг(бния молшулярггьк bgoob рястрш-амолных фрагментов использовали известные маркеры, получеюлю при расщеплании ДНК фага X ферментами Hind III, EcoR I и Hind III-EcoR I. Uo-лзкуллркно веса отдельных фрагментов опрешашим, используя известную обратную пропорциональную зависимость махду скоростью продвикания фрагментов ДНК в агарозном пала и десятичным логарифмом молекулярных весов фрагментов. На основании етой зависимости был построен график с фрагментами маркеров. По этому графику определяли молекулярные веса всех фрагментов хлоропластной ДНК нута и результаты реотрикционного анализа в ncß-

JMJß 1.

Суммированием мсыккулярных веоов всех фрагмангов, полученных при расщеплении одним ферментом или в сочетании двух ферментов, прочитывали суммарный вес молекулы хлоропластной ДНК нута. Она приблизительно равна 120 т.п.н. или 79200 кДа. Молекулярный вес хлоропшотной ДНК нута приблизительно рашн ио-ле«уляргюму весу хлорошветной ДНК гороха, однако по чиолу фрагыаотов они различны.

А

В

м м

■о

с

к

н а

л и

СО

Iii

ы а

ö и

ы м н

■а

«

23130

9416 ел^

6557 &4&J

4361 • 1

\щ

23130

5

И - л i-

t;j£■;) 9416

6557

«61

Рис. Л. Элвятрофоретимвский анализ ресщххщиониьа фрагя&тов хл.ДН1: штинат (А) и гаросса (Ю б 0.7 г азораэная гс?.^. Сверху j/шзаны названия рзстрла<шз, оправа -разяэры ларн&рньа фраглвнт<с0 в п.н.

Дале© наш била создана геномная библиотека (рио. 3) хлорэ-пластной ДНК нута на основа Ват HI и Pst I фрагментов.

После трансформации были отобраны около 4J00 рекокбинатиых тхпазмид с вставками хлоропластной ДНК нута, кловдроьанные в сайте Ват HI. С каждого рэкомбинашгюго клона выделяли плвз-гадшуи ДНК, расщепляли фёршнтом рестрикции Ват НГ, анализировали электрофорезом в 0.7% агарозном гелэ и определяли повторяющиеся рекоггбшннтнш плазмиды. Мз них отобрали 72 рекоабп-нантные плазмиды, из которых 23 рекомбинантныэ плазивды содержат да одному фрагменту хл.ДНК.а оотапьшэ содержат по два и три фрагмента хл.ДНК.

■о ß •и

К

и Рч

23130 9416 6557

4361

2322 2027

ы и

M

к

РЧ

H

w

M

■a с *н

К

cri о

H

ы

M

■a Я

к

f-<

H

к

El c; В

ф

■ri h G

О

í< к а

И' i:

tí

' i' -' ' I .1

H

fcr«5 «»«к» VJ 1-1

■ ' tea

с * ~t ! /} kizt

V * И s

û f/1 П i-.'li • '

É ^ - •

ÊS3 ^

. . p-J • — & ^

re

о

-к

21226

7421 ,5804 <5643 ->4878

3520

рис. 2. Злэктрофоретичэасий a-ama ретрикционньа фраглэтюв хмэрогиаатой ДНК нуга б 0.6 2 сеорознй* aeje.

Сверху указаны шзбания реатгримгаз, справа и слеба - размеры лартрнл: фраглзнтоб в п.н.

- 8 -

Тс&лсцз l

Реетрикционнкй анализ хл.ДКС нута ездснуклаазэми Ван И, Pst I, Hiña III. а такие юс совместной комбинацией и определенене молекулярных масс (в пер нуклеогадах) фрагментов

Вага HI Ват HI + Ват Н£ + Hind Ш Pst I + Pst I

Pst I Hind III Hind III

15136 10471 87.10 16218 .13494 15849

11220 9550 7079 15136 12903 12022

10715 7943 6339 11220 11614 11749

8128 5559 6166 9772 10471 10715

5833 5540 5623 7762 10000 9772

57Ы 5012 4955 7586 7674 8710

5248 4893 4467 7079 7079 8318

5129 4731 3931 6531 5623 7079

5012 4677 3631 6166 4898 6607

4571 4624 3467 5957 4624 5012

4365 4571 3020 4677 4074 4786

4169 4266 ЗОЮ 4519 3981 4624

3981 4169 2951 4169 3383 4169

3715 4074 2884 ' 3715 3315 3802

3631 3846 2818 2884 2754 3162

3548 3631 2671 276' 2661 2899

3090 . 3467 2512 1950 2163

2344 3311 2399 12S0 1479

2042 2917 2291 1071 1445

Iß34 2238 2188 1349

1660 2188 2138 1230

1380 2039 20S9 1071

1318 1884 1995

1122 1660 1841

794 1531 1679

. 1396 1622

1380 1380

1288 1313

1122 1288

912 1230

794 1148

562 1034

475 955

•852

794

759

708

676

589

460

398

119194 120305 114072 122772 119286 120913

-0-

ja-*" »f

О

-О" -О'

W.o. 3. ОСиря cmpcnerwt получения яеиаю-юй бьблиапеш хлорапластюй ДИК нуга

Атрг - ахпицилхин х/спМчивоить» Теtr ~ тпетрскужсин цсг.оОмиКхлгь.

Вши.НГ фрагменты с молекулярным весом 15136 п.н., 11220 п.н. и 10?Iii п.н. не обнарузвны при анализе рькомбинантных клонов. По-ввдимону это связано с большим размером (>10 т.n.M./ ооот-.эегствувдкс фрагментов хлоропластной ДНК нута.

Рбстрикционшй анализ ракомбинантных плазмид показал, что из 16 Pst I фрагментов хлоропласгкой ДНК нута в ссхп'ав вакгора нам удалось клонировать 12 фрагментов.

В результате проладенных исслэгозаний составлена геномная библиотека, где вое ракоыбинактныа nimviw, содеркадаю в своем составе Ват Ы и Pao I фрагмент х^оропластной ДНК нуга были в отдельности пронуыерозаш о указанием молекулядоого веса фрагаанта.

- U3 -

г' ■■•

Воэ рекокбшшнгаш бакгер&зльшз гыюш хранятея в Sttf суго-рилизировзннам глицерина в морозильнике при тевшэршурэ -30°С в течение наакаяьйгх лет, не утрачивая гиБнесиособности. При необходимости, можно взять из библиотеки нунный вам рекомби-нантный клон и вадаиигь плазмидяую ДНК-.

Суммируя шхизлоазипее мсзяо.заключить, *ггс составленная библиотека генов полидаптидов фотосинтеггического аппарата растений нута содершгг большинство генов голипетггидов фотосинтеза, она монет послужить базсй при изучении струтлурной организации хлорошзастного гшома аута. Кроме того, открывается новые всшокности для дальней»: экспериментальных исследований, в частности локализация гонов, опредаланиэ физической карты, регуляция експрессяи и определение нувлэотидной последовательности хлоропластного генома.растений нута.

З.Юкжиротакио генов psb А и psb В шпината (Splnacea olerecea)

Для осуществления этой-работы наш было провешено создание библиотеки генов ДНК хлорспластов шпината, На рисунке 1 ггред— ставлены данные по електрофоретичвско.чу разделению Sal СХ гаентов хлоропластной ДЕК шпината з 0.7х агарозном ген... Мы лигирозали Sal GX фрагменты хлоропластной ДЕК шпината с глаэ-мвдной ДрК pBR 322, расщепленной чзстршциашой ендонуклеезой Sal GI по уникальному сайту . Получзнныа. рзгсокбидантныэ плезми-ды трансформировали в кальций компэтентнш клетки E.ooli пггамм НВ 101. Отбор рзкомбиншгтных клонов осуществляли высеиванием клэток на срэдэ о шотициллшсг.г и тэтрзцккликск,. цо фенотипу Jünp1"» Tet". Таким образом, c/roSps-n рэко^зЗянантныв молекулы,' содероздцэ Sal GI фрагаэига ялорэшпстной ЛНЧ шпината. Рестри-гпщонный анализ таких ретокбйнангкки: плакат показал, что они в свози состасэ содэрЕзт, в casisuhca, Sal GI фрагменты .Se -Su (9.0 - 0.7 т.п.н. см. рюз. i. 1.

. Для ююнирогания гена psb А использовала гибраднуи шшзмиду pS02, которая содершт фрагтант ллороплзстной ДНК шпината молекулярной кассой 9.0 т.п.н. Лоош обработки пгвзнщш р£Ш ферментом Sal GI ш вяшраваля этот фрагаеиг аз ашрооного геля» а затем ого репцеаляот феркзнгсм Sisal. В результате по-лучаш два фрагмента иапвкуляршй шсасаЗ. 7.5 т.п.в. и 1.5

т.п.н. В фрагменте молекулярной массой 1.5 т.п.н. оодариигоя ген psb А, кодирующий гербшдд-связьтавдий полипептвд размером 32 кДа. На следующем этапе фрагмент размером 1.6 т.п.н. литеровали с плазыидой рШ 19, расщепленной по сайгам Sma I - Sal Gl. Литерованной скесью трансфор»«фоьали кальций компетентные клетка бактерии E.coli штамма Jlí 109. Клетки высеивали на чашки с добавлением (5 мкг/мл) X-gal и 10 мМ IPIG. В результате получили гкбрздную плазмиду (называли рБО 32), «содержащую вставку размером 1,5 т.п.н. в составе вектора.

Для клонирования гена psb В иоаольаэваЛх сконструированную яшм пгбредцую плазмиду pSO 3, содержащую фрагмонт хлоропласт-ной ДНК ппЕката с калеку.пятиюй .массой б.О т.п.н. На первом втапо суб:слок;гровак1я подобрали условия шполцой рестрикции pSO 3 форгангом Ваш HI и апшровалн фрагмента размером Ь.6 т. п.н. к 6.1 т.п.н., идущие вмс?б,из агарсзного тля методом закоргаживачия - разчораяиваю-.ь . Нн агорам зтада отобранные фрагс-гчты ДНК рродесишли ферментом Sal Gl и ашсировали тем аэ г ют о дом фрагмэзг ргсморс-м 2.0 t.ií.í. &гот фрахмант содерзатт ирлый ген psb В и икеот розние лит&е концы.

Такой фрагмент клонирован в мультикопийной плазмиде pBR 322. Для ©того из ттлаз-'/дды pBR 322 о покоило рестриитаз Barn HI и Sal Gl удалая фрагминт входящий в состав гена Totr. Полученную расщепленную плазиияу лгамрэвали о фрагментом молекулярной массой 2.0 т.п.н. Отбор рькомбинангных клонов проводили по фенотипу Ашр", Tet®. Таким образом, сконструированная гибридная шпзмида (назвали pSO 47) содершт полную последовательность гена psb В.

Таким образом, каш было проведено субклонирование генов psb А и psb В в составе мультикопнйных плвзмид pUC 1У и pBR .322. Как уаэ отмечали, эти гены имеют высокую гомологию с аналогичными гонами других высших растений. Поэтому клонированныэ нами эта поалодоватолы:ости будут использованы как зонды для локализации генов рзЬ А и psb В ка генокно!: карге хлороплаотоа нута.

4.Локализация is кмэшровавха psb А хщршлзстноЯ ДНК нута

Хпоропластную ДНК нуга расщепляли ферментами эндонуклеазы Pst I, Sal GI, Ваш Ш и проводили электрофорез в 0.7% агароз-ном гелэ. Затем с помощью прибора для аоюктроалгидаи все Ваш НЕ, Sal GI, Pst I фрагменты хлоропластной ДНК переносили на нитроцеллюлозный фильтр.

Гкбриднуя плазмиду pSO 23, содарившую ген psb А хлоропластной ДНК шпината метили с помощью [у-эзР] - NTP методом ник-трансляции.

Анализируя гибридизационнуга картину заключили. что ген psb А локализован в одном га маленьких Ваш HI и Pst I фрагментов и в двух фрагментах Sal GI хшропластной ДНК нута. При определении молекулярных весов Вага HI и Pst I фрагмвнтов, в которых локализован ген psb А 32 кДа гербицвд-связывоющего белка, были затруднения. Потому, что в этих областях находились фрагменты, очень близкие по молекулярным весам и трудао было определить в каком из них локализован ген psb А. Поскольку ген рсь А. был локализован в фрагментах, молекулярные массы кс-^рых составляла около 6.0 - 7.0 т.п.н., да быmz увэрены з том, что эти Ваш КГ и Pst I фрагменты находится в библиотеке генов хпо-роплнстной ШС нута. Поэтому, для уточнения'. фрагмента, где локализован ген psb А, второй раз проводили гибридизацию с ДНК рзяокбикангных швзивд, содзтгэдгпс Вел Щ. фрагменты хлороплзо-тной ДНК нута. Из 72 рзвокбиваяпэя: плавкая ввдэляли рекокби-кантнуи ДНК, югкхйигаогзля в кгггрйдаллпг.зсной 'фильтр для гиб-рэдазсада. Чтоба еэ Скяо яобочггк casares цри гийщдазации, г"л расщезиип Sal 01 - Sral С1Э?Э м.) Оржквяв из плазмида-pSO S3. JEяе-го кокщт Sal GI - кзкаи при полгода

1у-зср] - ир п nomímnsaírísjasr'cit 3 результате олот-гее6-рздизацкя тггпгшсго Sal G1 - SasI чурзгкэяга о рэяемййваяиит шазяшея подучила тря радакаггетрг-^ягеяях сяшзж <г*кг. 4). РестрстшкошЕй енаякз psEswa&sasssr: пнзя?п{, юэторгэ дала ра-даоаЕХ'Огр^жгсгет еяпада, погасал, ото ■ они содззрзаля один и тот та Еза НЕ ®рдГГЗСТ-ЯП0рШД20ЕЕ»а 2SEK нута о колзкулярной ÍS20Cей 6,0 ?.п.з. пгетоку issfópsun одяу рзяаглйвгангаую плззми-ду рСА 7 го тггх: тл ерзшздаш в ®25ЕК22исяу каршрошнию 1яв НЕ ©рзгкзпта (5.0 т.п.п.) яяаропгастной аута. ■

- ±3 -

Риа. 4. Дап-бмт вибриОиааиуя ретявинанпных плззмиО рСА с ник г транслированным фрагзятая хл.ДНК гитмжисоОержщля ген рвЬ А.

Заа Н1

Рв»

г.в къ

Р»г I Вво Н1

1.5 УЬ 1.4 кЪ.

а1С1

О.ЗкЬ гсоЯХ

1.3 кЪ ! 1.0кЪ10.5

Н1л<ЗШ НШШ ЕсоЫ 0,1

рио. в. Реапршауиснная парта Ваш. Н1 фрэ&яеша (6 п.п.н.) хмэрспюатой ДНК нута, ас£-ржат&> ген рвЪ а.

Дл7 /¡изтвского картирования Зам Щ фрагмент (6.0 т.п.н.) подвергали гадролизу ендонуклаезами рвдтринц ии Hind ИХ» Sal CI, EooR I и Pst I, а танке их схзвместюй комбинацией. Орагмэ-нгы разделяли електрофоретичесзким методой в 0.7х агарозном геле. В качеотве маркеров для определения молекулярных масс ио-пользовали x/HInd III и x/Hlnd HI - EcoR I» После определения молшулярных масс фрагментов построили физическую каргу Bam HI фрагмента (6.0 т.п.н,) хлоропластной ДЕК нуть.где локализована нуклиотияная последовагольчосггь гена psb А гербицад-связнва-вдего 32 кДа белка фотосистема П. На рисунке 5 приведена физическая карга Ваш HI фрагмента хлороплвстной ДНК нута.

" 5. Сравнительный ре'л-рнкцношшй авалю ЛИС хлорелла стой различных видов (Rlcer arletimna, Pisum sativum. Glycine max.) семейетта (жбовях (ГаЬаоеав или Papilicmaceae)

В нашей Республике в осяюзвок раЗойирояаны и варвдаваюл»! три ооргга нута.высокорослый новый оорт нута яАзШВ-ЭМ',,вьюо-коурааайный и высокобелковый сорт "АзНИЮ-ЗЗУ и ТПедг гвлыа/*. Фвкотипидескиэ признаки оеыян и растений erar сортов мааду ообей отличаится. &ги сорта выведены в Аэорбайдванском научно-исолвдовательсйш институте Зеяледалия в овмет егих сортов лзобезво предоставлены сотрудниками отдала оалашдаи зернобобовых культур.

Как известно, ДНК хлоропластов растений наследуется ш материнской линии. Следовательно, иолвкулярно-стр^кгуриая орга-' низация ДДСхлороплвотоз различны* сортов аута Cloer arietinum долкна быть одинаковой.

Для выдалзмия ДНК хлоропласте® из различных сортов дута зеленые листья собирали на експвричвнтапыкж пола, гдэ ота ежрга вырасивспт в естественных условиях. Посла выделения ДНК хлоропластов из сортов нута их подвертя» рестрикцнонноиу анализу о послздунцим электрофорезом в 0.7* агароаиоа гаге в течение 16 ч. Скачала расщепляли хлороплвогнш ДИК сортов "Шарг гапыэ/* и "АзНИИЗ-004" ферментом Ваш HI. потом хлоропласт«*» ЧНК сортов "АзНИИЗ-ЭМ'' й "АзШЮ-ЭОЗ" ферментом Вшв HI.Pvu П, Xba I и Xho I. Результата елоктрофорегпгюского анализа понвдакы на рисунках 6 и 7, соответственно. Снимали дя юитограмму Фотопленки

- IS -

алектрофоразов. Результаты нашего анализе, показывают, что на уровне хлоропластных геномов различий мевду сортами нута не наблвдалось.

В отличие от нута молекулярная организация геномов других видов (например, Pisum sativum и Glycine max.) семейства Faba-сеае бобовых изучена более подробно. Классификацию растений Cicer arietinum, Pisum sativum и Glycino max. маяно описать следующем образом:

Тип: Angiospermae или Anthophitae - покрытосеменные или

цветковые растения

Класс: Dicotyledonae - двудольные

Ряд: Fabalss или Leguminosales. - бобовые

Семейства: УаЬасеае или Papilonaeeae - бобовш или

мотылковыэ

Род: Cicer Вид: arietinum - бараний нут или нут

Pisum sativum горох или зеленый горох

Glycine шах соя

Нами проведан сравнительный рестрикционный анализ глоуопт,-сткой ДНК трех ввдоз семейства бобовых-. Хлоропласт:-:^ ДНК Cicer arietinum, Pisum sativum выделяли по кодифищф:;.;анноку катоду и подвергли анализу фаршнтом Pst I. Результаты вткх г.:са-даримагггов показали, что Pst I фрзгкшты хлорспластной ДНК различных видов семейства бобовых отличаются (т-Лшца 2) как по' числу, таа и по разизру, Зтот факт однозначг-о покззш^ет, что молекулярная организация названных видов с^хзйствз. Fcbnoo-аа бобовых заметно, отличается друг от дауга, хотя коласуляржсз васа вазокоа раетаъий Cicer arietinum, п Pisua sativum приблизительно рал™ ( -ч120 т.п.н.). Нолакулярный see хлороплазтной ДНК растений Glycine тех. соотаапшг приблизительно 150-152 т.п.н. Получанааэ игъс: .дгазвк» еввдэгольствуютт об еффзгегкзкозги ^пользования рэстрксцввакаго анализа щи выяснения кзаавдэээй разницы разяаяшх раякшД.

Для рраиш&льажо еналзза разшроййЛ I фрагайгягоэ соя ш-шлвзовапв дштеф^щезз дуааыу.

Pua. б. Сравнительный анализ реарршалиснньа Iот HI фрагментов хл.ДНК разлмньи сорпюб нуга ГД 1рг гапысы" и "Лэ}Ш'г!-<304". Зюипрофарез проводили в 0.72 агаровноя 1.2 - нерасачэгиеняая хл.ДНК сортов пула. 3 - 2Л.МНК copru "Игрг гитыхГ 2 - ХЛ.ДНК сорт тЛзНИИ~304"

В последние года в литература появилось множество работ,под-тверздшцих данные предлолопшич. В егих работах с болышм успехом ааа&ловамв. эволюция и филогаизз рззкьос растений ка основе нуююотидной последовательности генов, участвувдих в фотосинтезе и кодирующихся в ялорошвотнои ГШО!». Используя ро-стрикционннй акшмз/ расщшлята форгют'см Вшъ Ш хг.ороплестную ДйК двух видов растений Pin из - сосш, японской чзрной сосны P.thunberffii и японской крехлюй сосны P.densiJTXora и проводили алеэтрофорэз а агарознсм геле. Анализируя результаты электрофореза, обнаружили разницу иззду шдама ка уровне хлоротлвстко-го генома. Очевидно.метод рестрпоэганного атпаза -очань висо-кочувствитаяви и рестрикционныэ образцы ялороплротнсй ДЩ различных видов можно гаяюльзовагь о цалыз изучения их фотогавзза.

:tv-;í. 30101 ..

. f - . • j- ] Xbai

- -I .. U . •-. V i^;.-: .- I..W J .

. . - ( X / EeoR I

1 iViö ' r-W' - rVr.-i- 1 rvult

г; ■•:>■ i ¡t¡ i> . : . i'm J f™

; • ; - ••. I X/ Hindin + ECOR

: ? l- '■'•-. - - 1 Ban HI

• : r i w 1

* -Г! X/ Hin« III

• ' 'L; '

¡.Г' J M

TaSMsup 2

Сравнение, молекулярного веса Pst С фрагментов хлорошшстной ДНК нута, гороха и сои

Молекулярные веса Pst I фрагментов хюроплвгтной ДНК

Cicor nriötinitm Pisum sativum Glycine пах.

нут горох соя

15.8 21.6 41.1

12.0 17.3 33.3

11.7 12.3 30.0

10.7 12.0 16.8

9.7 11.7 13.7

а.7 1Й.З 7.2

8.3 9.2 6.2

7.0 5.7 1.9

6.6 5.0 1.0

Ь.О 1.8

4.7 i.i

4.6

4.1

3.3

3.1

2.8

ВЫВОДЫ

1. ЗЛэгяХициронш.* метод выдашния хлороплыатной ДЕК вьазких рьдтений. з результат этой ждофцаасии оупэотэшно возросла эффетяиакосль (бдатрота и выход кл.ДНК) метода.

2. С пояодью фо^ксггов рестрикции Ват Щ, Pst I и Hind III ироаедас рестрыкииоюый анализ хлороилаотьой ДФС Cicsr arietinum и определека молекулярная дасса {"-120 т.я .к.).

3. Оээдана, гвкомяня библиотека хлорсшлыетои растений Cioer arietinum ;t локализован ген pab А на хл.ДНК нута с использование:* известною rem ¡шяннта в качестве зонда и составлена физичгсюм карта отого Ваш HI фрагиэнга (6.0 r.n.H.).

4. Пул.* ргог ¿сздйодоаго анализа улорсяхяаот-

ных ДНК разныг-; видов Flsam sativum и Glycine шах. семейства бобошх с хпоропласггной ДНК С.arietinum Енявлеио, что рост?, дшнокше карты :слоропластных ДНК разных видов резко отл-маотся и этот способ можно использовать при изучежгл колзкулярноГ» фглэгшетики растений.

Основные результаты диссэртадаи иглотаны в следующих публикациях:

1. Алиев Дк.А. .Нурадов А.З.,Юсифсо Т.Н.,Намедов А.Ч.,Абшюв Г.В. Изучение структурной организации хл.ДНК. Получение генои-ной библиотеки хл.ДНК шпината. - Известия АН Азэрб.ОСР. Озрия биологических наук,1386,)ä 4,стр. 3-7.

2. Пириев Н.И..Захрабекова Ш.М. .Лобанов А.Н. .Мамедов А.Ч., Авилов Г.В.,Юсифов Т.Н..Мурадов А.З. Конструирование систем для переноса и экспресии чужеродных генов в высшие растения. Труды конференции молодых ученых АН Азврб.ССР, 1387, стр. 159.

3. Казибекова Э.Г. .НУфадав А.З. г30сифав Т.Н. «Мамедсп Л.Ч., Абилов Г.В. Изучение структурной организации хл.ДНК пшеницу. Клонирование геноэ хл.ДНК. - V съезд Всесоюзного »общества генетиков и селекционеров им. Н.И.Вавилова, 1937, т.IV, ч.Зс стр. 170. Уосква.

4. Камедрв А.Ч. .Надеафав А.К. Локализация гена т-пЬ А кодирующего гврбицид-свьзыващий полипептид мол.мао.'...й 32 кДр. Cicer arietinum. - Конференция молодых ученых, посвященная 70 лет ВЛКСМ,1988,стр. 14.Ваку.

5. Алиев Дк.А. .Адамов В.А. ,Мш«?дсо А.Ч. . 1'острикционкий анализ и клонирование ДНК хлорошшстои нута Cici arietinum. -II съезд Всесоюзною общества физиологов, JLS90, стр.27. Швея:.

6. Иакэдор А.Ч. .Сулейыанопа З.Д. .Адаалоа В.А. Рестрикгазкая карта и клоиировашэ ДНК хпоропластов нута Cicer arietinum. -I Республиканская биохимическая конференция, 19S0, стр.83„

7. алиДев 4.Q. .Машадаз Э.Ч. .Ачалов В.А. Иохуд (Cicer arietinum) биткиоинин хлоропласт ДНТ-синин ajytuamsu, молекул^ар чэкишнин тз'Зини во клонлаадырылюшо - ЛзарбаЗчан ЕА Хвбэр-дари.биолокяЗа адатэри сэраЗасы, 1990,й 2,сэЬ.З-11.

8. Alijev J.A.„Mare«Jov A.Ch, „Suleymanova Z.D.,Ajalov V.A.

Restriction map and localisation of psb A gene in ohloroplast DNA of Cioer arietinum. - IX International Congress on Photosynthesis. Hagoya, Japan, 1992, Vol,34,И l.poster 455, pp.186.

9. Мамадрв А.Ч.,Алиев - Дж.А. .Аджалта В.А. Мембранные балки фотосинтеггического аппарата,кодируемые геномом хлоропластов. -Известия АН Азербайджана, серия биологических наук, 1992,Я 3-4, в печати.

10. Алиев Да.А..Адаалсв В.А.,Мамэдоа А.Ч.,Имаказ Г. ..Шахку-радрэ И.А. Рестрикционный анализ и каря-ирование ДНК хлоропласта Cicer arietinum. - Третий съезд Российгасого общества .физиологов растений, 1993, т.д.1, стр.4. Санкт-Петербург.

Мэмкедов Эдэадар Чэрвэз сгду "Cicer arietinum бигкига-нин хлоропласт кеномунун рестриксион анализи вя psb А кенкнин локализасхСасы"

X Y Л А с а

Сон иллэддэ кухтэдиф биткилэрин хлоропласт кеномларынын структур-фуннс!»:окал тура/луду ингенсмв еЗренинир. Бу вахта re-дер тугун, чи^ероту мвкары,д»,1у вэ дакэр бкгкилерин хлоропласт паиомпаршьш ¡»¡впк хэритвси тагамилэ m^JJoh едилмип зв хлоропласт кэиларинин ексцресоиJ аы шш paiwjecnja олунма механизм! паггында MyliyM нэтичелор альшмишдыр.

Елми ¡сгин мэ1Хйд,фотоошг1вгик впаратынш био-

кидасы ва биофизикаш Гергэрэфли ©Зренщмиш.АЕерба^чавда ке-ниш ¡JaJuraauia , пахлилшар фкжшэвиш вид олан шхуд биткипинин хлоропласт кшспунун моласул^ар биолохи^асыкы еЗрекмчкдир.

Бу мэгсэдла али биткилэрин хлоропласт ДЯТ аЗырмаг учуп му-тод модификасиЗа едалмиш вэ натичэде бу дагодан еффектлилией хеЗли аргышщыр. Идо дафэ олараг нохуд биткиоинин хлоропласт ДНТ-си еедауклеаза фермантлэри Bam HI, Pst I, Hind III ига тек-тек вэ бу фзрментлсрин м^рсталиф комбинася^апарывда раэтри-кшон анализ апаралкш вэ нохуд -биткиоинин хл.ДНХ-нин молекул чекиси музЗЗэн едалмищпяр <«i20 м.ч.н.). Нохуд биткиоинин хло-ропластларьшш деномунун китабханасы ¿араддашш. зс.-'д кими ио-панаг биткисинин psb А кениндон ист£вдэ ешэклэ нохуд биткисинин хл.ДНТ-де psb А кши локализаси^а едашрек молекул чзки-си.<б.О м.ч.н.> олан Ваш КС фрагыеягишн физики херятеси гу-рулуущдур. Пахла)шлар фосилэскшн мухтэлиф неаггэринин Pisum sativua вэ Glycine пах. хлоропласт кеноющи иохуд биткискнин хлоропласт кеному илэ. мухазисели рестриксион анализ едилэрэк муеЗЗэн олунмуподгр ии, дахлалылар фесигисинин кухтелиф ивзло-ринин хлоропласт ДНТ-нин рестрикт хэритеоя кескин такшцсэ ферглэнир вэ бу у су ¿дан биткилэрин мсше^ул^ар филокенезинин е^рвшлчосиндэ истифадо едилэ билор.

Mamedov Alamdur Charkez ogly

RESTRICTION ANALYSIS OF CHLOROPLAST GENOME OF CICER ARIETINUM AND LOCALIZATION OF PSB A GENE

SUMMARY

Structural-functional organization of chloroplast genomes of various plants as been actively studied lately. By the present time chloroplast DNAs from >bacco, liverwort and rice have been sequenced completely, primary structures of number of chloroplast genes have been identified in other objects and important ¡suits on the mechanisms of regulation of chloroplast genes expression have been btained.

The present work is devoted to the study of molecular organization of hloroplast genome of chick pea, widely glowing in Azerbaijan, which has not ecu studied in this respect, though biochemistry and biophysics of photosynthetic pparatus of this plant has been studied well enough.

A method of isolation of chloroplast DNA of higher plants was modified. As result of this modification the method effectiveness (rate and outcome of hloroplast DNA) increased significantly. Restriction analysis of chloroplast DNA rom Cicer arietinum was carried out by restriction enzymes Bam HI, Pst I and lind HI and molecular mass was determined (- 120 t.p.n.). Genome library of ;icer arietinum plants was created and psb A gene was localized on chick pea hloroplast DNA using well-known spinach psb A gene as a probe. Physical map f this Bam HI fragment was compiled (6.0 t.p.n.). By means of comparative cstriction analysis of chloroplast DNAs from different species of Pisum sativum nd Glycine max. of fabaceous family with chloroplast DNA from C.arietinum cstriction maps of chloroptast DNAs from various species were found to differ harply and this method could be used for the study of molecular phylogenetics of ilants.

- 23 -