Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы ревертирования инсерционных мутаций бактериальных транспозонов Tn5, Tn9, IS1 у дрожжей-сахаромицетов

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Механизмы ревертирования инсерционных мутаций бактериальных транспозонов Tn5, Tn9, IS1 у дрожжей-сахаромицетов"

Государственный комитет России по науке, технической политике и высшей школе Санкт-Петербургский государственный университет

На правах рукописи УДК 547.962.32

ЗАШЕВА Диана Иорданова

МЕХАНИЗМЫ РЕЕЕРТИРОВАНИЯ ИНСЕРВДОННЬК МУТАЦИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ТРАНСП030Н0В Гп5, Тп9, 1Э1 У ДРОЖЖЕЯ-САХАРОМНЦЕТОВ

03.00.15 - генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1992

Работа выполнена на кафедре генетики и селекции Санкт-Петербургского университета

Научный руководитель: старший научный сотрудник,

кандидат биологических наук Д.А.ГОРДЕНИН

Официальные оппоненты: ,

доктор биологических.наук Т.Р.СОйДЛА

кандидат биологических наух Н.Н.ХРОЫОВ-БОРИСОВ

Ведущее учреждение: Научно-исследовательские институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (Москва).

Зашита состоится -Ел 1992 г. в ш. час. на

заседании специализированного Совета Д 063.57.21 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности "Генетика" при Санкт-Петербургском государственном университете (Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9, ауд. N /

С диссертацией. можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан чуУ?" 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук л Л.А.МАМОН

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одна из важнейших характеристик геномов всех организмов - структурная изменчивость, являющаяся .результатом различных рекомбинационнчх процессов. На сегодняшний день наименее изученным из ргкомбинационных процессов является незаконная рекомбинация, которая обладает наибольшими потенциями для перестроек генетического материала, в лаборатории физиологической генетики Санкт-Петербургского Университета была создана экспериментальная система для изучения эукариоти-ческой незаконной рекомбинации коротких (9 и.о.) повторов при точном вырезании бактериального транспозона Тп5. Показано, что в генетический контроль этой рекомбинации вовлечены структурные гены всех трех репликативиых ДНК-полимераз. Таким образом, получено подтверждение гипотетического механизма возникновения делеций за счет проскальзывания и ошибочного спаривания при репликации. Этот механизм предполагает зависимость возникновения делеций от от структура делетируемой ДНК, в первую очередь от наличия длинных инвертированных повторов (ДОН).

Задачи работа. В задачу нашей работы входило сравнительное изучение ревертирования вставок бактериальных транспозонов Тп5 и Тп9 и К1 в дроажево!.: гене Ш2 в составе эписомной пла-змвды. Все три транспозона вызывают дупликацию 9 п.о. "хозяйской" ДНК на границах вставки. Тп5 имеет на концах ДИП (1535 п.о.); на концах Тп9 присутствуют длинные прямые повторы 1Э1 (768 п.о.); на концах 351 есть только несовершенные короткие (23 п.о.) инвертированные повторы.

Научная новизна: Мы провели сравнительное изучение частот и генетического контроля частот вырезания различных инсерций

-г -

?п5, Тп9 и 131 из дрожжевого гена ЬУ32.

Во-перзых, в результате нашей работы мы продемонстрировали явление точного вырезания бактериальных транспозонов Тп9 и 1Б1 у дрожжей,

Во-Еторкх, показали, что точное вырезание этих транспозонов, в отличие от вырезания Тп5, не подвержено влиянию мутации ролЗ (структурный ген полимеразы-дельта).

В-третьих, показали, что все три типа вставок могут ре-вертироЕать без вырезания транспсзона. При этом реверсии Тп9 и 1Б1 сопровоздаются структурными перестройками плазмиды, содержащей ген с инсерцисй, а реверси: некоторых вставок Тп5 происходят за счет супрессорных мутаций без нарушения структуры плазмиды.

Теоретическая и практическая ценность работы: Перечисленные закономерности и факты были обнаружены наш впервые. Они имеют большое значение для понимания генетического контроля незаконной рекомбинации коротких повторов, для совершенствования модельных экспериментальных систем, использувдих вставки бактериальных транспозонов у дрожжей. Супрессорныо мутации, подавляющие вставки около б тысяч п.о. при полном сохранении структуры вставки, являются новым классом супрессоров и, возможно, их дальнейшее изучение приведет к обнаружению принципиально новых деталей процесса экспрессии генов.

Полученные наш результаты и выводы, следующие из работы, могут быть использованы в лабораториях, изучающие структурную стабильность эукариотических геномов, молекулярные механизмы рекомбинации, а также при чтении курсов "Молекулярная генетика" и "Генетика микроорганизмов".

Апробация работы. По результатам работы сделаны сообщения на 15-м Международном специализированном симпозиуме по дрожжам (Рига, 1991 г.) и на семинаре Отдела генетики и кафедры генетики Санкт-Петербургского государственного университета.

Структура диссертации. Диссертация изложена на ИЧ страницах, она включает 1Ъ рисунок, 10 таблиц, список литературы из {1% наименований. Работа состоит из введения, обзора литературных данных, материалов и методов исследований, обсуадения результатов и выводов.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

В качестве исходных использованы штаммы дрозюкей: 2Г-Д252 МАТа Lys2-29 Leu2-3,112 МзЗ

2АВ-Х4-2Г-Д252 МАТа trp1::URA3 Lys2-29 Leu2-2 hrp1::HIS3 ЭБ-Д338 МАТа Lys2-22,25 Ieu2-3,(i2 hls3

МЗ-ЗБ-ДЗЗ8 МАТа Lys2-22,25 Leu2-3,112 hls3 pol3-t

Ьуз+-РОЬ+-ДМ МАТа Ieu2-2-trp1-01 ura3 POL1, LYS* Lys+-pol3t-J3JA МАТа Leu2-2 trp1-01 ura3 pol3t LYS+ FOI*-ДМ МАТа Leu2-2 trp1-01 ura3 P0L+ LYS2::Tn5-13

pol3-t-OT МАТа Leu2-2 trpl-ôl ura3 pol3t IYS2::Tn5-13

В работе использовали двухмаркерную челночную плазмиду рШ2 и ее варианты с инсерциями. Длина плазмида - 15,3 т.п.о. Плазмида содержит дрожжевые гены LYS2 (6,9 т.п.о.) и LEU2 (2,2 т.п.о.), фрагмент бактериальной плазмида рВН322 (3,6 т.п.о.) и фрагмент дрожжевой эписомы 2 мкм ДНК с дрожжевым репликатором

(2,6 т.п.О.).

Плазмида рШ2::Тп5-1, рШ2::Тп5-2; рШ2: :Тп5-3,

рШ2::Тп5-4, pLL12::Tn5-11f pLL12: :Тп5-12, рШ2::Тп5-13,

PLL12: :Тп5-14, рШ2::Тп5-15 содержат инсерцки бактериального

транспозона Тп5 в гене LYS2 (Горденин и др., I33G); плазмида

pLLlli-.r^i-at

рШ2: :Тп9-21, рШ2: :Тп9-22; рШ2::Гп9-23; рШ2::Тп9-25; рШ2::Тп9-2б; рШ2::Тп9-27; рП.12::Тп9-28 содержат инсерции бактериального транспозона Тп9 в гене LY52, полученные в результате транспозиции Тп9 с хромосомы E.coll на плазмиду рШ2 и предварительно картированные в структурной области гена EÏS2 накети коллегами по совместной работе - А.Атабекян, А.Зильбер-глейдтом и И.Горышинкм (ЛИЯФ). Плазмида pLLl2::ISl-25 и pLLl2::IS1-27 содержат инсерции элемента IS1 в гене LYS2 и получены наш в результате кроссинговера между прямыми повторами IS1 s соответствующих инсерциях Тп9. Плазмида рЪЫ 2-Ins32 содержит инсарцию дрожжевого транспозона Ту1 (Чернов, Горденин, 1987).

С помощью конверсионного переноса с плазмида на хромосому на основе штаммов LYS+-P0L+-®1 и LïS+-pol3-t-,5M были получены штаммы, содержащие.инсерции Тп9-2Т и IS1-27 в хромосомной аллели гена LYS2. Расположение всех инсерции Тп5 и Тп9, использованных в работе, приведено на рисунке I.

Рис.1. Инсерции Тп5 (5,7 т.п.о.), Тп9 (2,7 т.п.о.) и Ту1 (6,0 т.п.о.) в плазмидном гене ЬУ32. рестрикционная карта гена 1Ж2 (двойная линия), расположение и направление транскрипта (волнистая линия) даны по (Е1Ъе1, Рп111р-зеп, Т983, 1984). Расстояния №5-1,2,3,4 от первого В?Ы1 сай^а соответственно 0,5; 0,9; 2,1; 2,3 т.п.о. Пять инсетший Тп5 находятся в ВшпН1-Х1ю1-районе гена Ш2 (СогйепШ ег а1., 1988). Расстояния Тп9-21,22,24,25,26,28 от первого ВзШ-сайта соответственно 0,4; 1,2; 1 1.6; 2,5; §,2 Юз. Инсерция Тп9-27 находится в ЕагаН1-Хйо1 районе гена 1X52 в 17 п.о. от ВашН1 сайта. Рестрикциокныэ сайты: Н, ЕсоМ; С, Вя1П; х, ХГ:о1; В, ВаиНХ; Н, ШгДШ; Р, Рз«. Мнсерция Ту1 находится 0,32 т.п.о. от сайта ЕсоМ.

Ми определили нукпоотидную последовательность на конца* вставки 181-27 (а, следовательно, и Тп9-27) (рисунок 2). Вставка находится почти в центре гена И32 и окружена дупликацией 9 п.о. гена ЬУ32, прилегающих к вставке.

1.452

ВатН1

Ию1

ТЛССААТСААСТОАрСОШТА^ТАТАСаСТТТААСТСЬоТАС^

АТСатСИ'СЛС1)Ж1тП:0АГАТС,ССАААИ'САС-ЬСАТСа 375 п.о. / Л 1 !

ХЙ01---

ТАССААТСААСТОА

АТССТТАОТТСАСТ!

ивг^в«?

ВагаН!

I

ЗССААЛТАфтАТАСасТМААСТС^СТАС^

У-ТГтгЬАТАТСОСМАТТСАОМАТСО I I

I I

Рис.2. Нуклеотидная последовательность на границах инсерции ИЙ2::131-27. Показаны также участки гена ЬУ32-одиночной прерывистой линией, и Е>1-двойной прерывистой линией. Сайт-мишонь (9 п.о.) обведен четырехугольником.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Схема вксшщмэнта (рис.3). Для получения реверсий инсер-циП 1У32::Тп5, ЬУБ2::Тп9 и 1У32::131 использовали штаммы 2Г-

- г -

Д252 (МАГ a Lys 2-29, Leu2-3,112hls3); ЗБ-ДЗЭ8 (MAT a lys 2-• 22,25 Ieu2-3,H2hls3). Выбор штаммов определялся следующими причинами: оба штамма содержат делеции гена LYS2, 2Г-Д252 -полную, а штамм ЗБ-Д338 -почти полную делецию. Это позволяет проще выявлять реверсии к Lya* в результате вырезания транспо-зонов Тп5, Тп9 и IS1 из плазмидного гена LYS2, так как исключает реверсии хромосомной аллели.

Мутация 1еи2 позволяет поддерживать нестабильную эписом-ную плазмиду на среде без лейцина и определять стабильность плазмиды после реверсии Lys*. Это необходимо для выявления ин-тегрантов, а также для выявления клонов, потерявших плазмиду при определении хромосомной или шгазмидной локализации реверсий.

Штамм 2Г-Д252 изогенен штамму 2АВ-Х4-2Г-Д252 МАТа trpl::üra3 Lys2-29 beu2-2 hls3 hprt::HIS3). Это позволило определить влияние гиперрекомбинационной мутации hpri на частоту вырезания транспозонов Тп9 и ist.

Штамм ЗБ-ДЗЗа изогенен штамму МЗ-ЭБ-Д338ШГ а 1ув2-22, 25 Leu2~3, 112 his 3 pol3-t). Сравнивая частота эксцизии транспозонов Тп9 и IS1 в обоих иташах, можно определить влияние мутации po!3-t на вырезание Тп9 и ist.

Рис.3. Схема эксперимента

После выявления плазмидной локализации реверсии мы делали структурный анализ ревертантных плазкид.

Для этого выделяли ДНК из полученных и охарактеризованных ревертантов этой ДНК трансформировали бактерии E.coll НВ101. Проверяли батериальные трансформанты по плазмидному маркеру (устойчивость к тетрациклину) и по маркеру трапспозона (устойчивость к хлорамфениколу). Из бактерий Еыделяли ДНК и проводили рестрикционный анализ для установления структуры ревертантных плазмид. Для . регертантов инсерцют LYS2::Tn9-27 и LYS2::IS1~27 проводили определение последовательности ДНК.

В случае, когда в ревертантах обнаруживали плазмиду с перестройками, важно было убедиться, что имеем дело с ревертант-кой плазмидой. Поэтому проводили повторную трансформацию дрожжей, т.е. трансформировали клоны ревертантов, потерявших плаз-миду. а также исходный штамм исходными и собствегшт,м ревер-тантными плазмидами.

Изложенный якспериментальный подход позволил выяснить ряд вопросов о вырезании Тп5, Тп9 и IS1 у дрожжей.

Частота точного вырезания Тп5 у дрожжей не зависит от положения вставки Тп5 в генэ IYS2. Источником повышенной частоты реверсий Тп5-2 и Тп5-15 являвтся ядорные супрэссорные мутации. Данные о частоте ревертирозания различных вставок LYS2::Tn5 приведены в таблице I. Анализ плазмид и ретрансфор-мация дрозжей-ревертантов по схеме, приведенной на рис.3, доказали. что большинство (49 из 68 проанализированных) рэзерта-нтов часторевертирующих инсерций LYS2::Тп5-2 и -15 произошли за счет супрессорсз с внеплазмидной локализацией. Скредавания с безсупрессорными итаммами показали, что мы тлеем дело с ре-

цессивными ядерными супрессорами. -

ТаОлица I: Частоты ревертирования инсерции ЬУ32::Тп5 в плазми-де рЫ.12.

Штамм /хромосомная аллель гена 11(52/ Инсерция ЫВ2::Тп5 в плазмиде Частота ревертирования (Ю-0)

2Г-Д252

/1ув2-29/ Тп5-1 0.6 (0,25+1,17)

Тп5-2 18,2 (14+22,4)

Тп5-3 1.2 (0,78+1,8)

ТП5-4 2.0 (1,5+2,7)

ГП5-11 3.5 (2,8+4,3)

ГП5-12 1.5 (1,2*1,9)

ТП5-13 2.06(1,7+2,5)

ТП5-14 1.7 (1,2+2,2)

Тпй-15 10 <8,4+11,6)

Примечание: Приведены средние ¿лечения частот ревертирования и 95% доверительный интервал (в скобках).

Суцрессорные мутации оказались специфичны только для ин-серций Тп5-2 и -15 и не подавляли другие вставки Тп5 и вставки Тп9, 35.1 и Ту1 (таблица 2).

Супрессорные мутации, подавляющие большие (около 6т.п.о.) вставки в кодирующих областях генов у дронхей, в литературе не описаны. Выяснение механизма скпрессаи мокет дать новые важные данные о процессах реализации генетической информации.

Таблица 2. Специфичность супрессорных мутаций по отношению к мутациям-инсерциям Тп5, Тп9 и 1Б1.

Проверяемая Супрессорные ревертанты, полученные на фоне инсешии

инсерция ТП5-15 ТП5-2

в ЬУ82 3.2 6.1 1.2 1.5 3.17 8.54

Тп5-1 - - - - - -

Й5-2 + + + + ■ + +

ТП5-3 - - - - -

Тп5-4 - - - - -

Ш5-11 - - - - - -

Й15-12 - - - - - -

Тп5—13 - - - - - -

Т115-14 - - - - - -

Тп5-15 + + +/- +/- +/-

ТП9-27 - -

ТП9-25 - -

131-27 - -

ТУ1-32 - -

Проверяли рост трансформантов рЬЬ12 с соответствующей инсерцией на среде без лизина. "+" - реет на среде без лизина, неотличимый от дикого типа; "+/-" - сслаблэнный рост на среде боз лизина; - отсутствие роста на среде без лизина.

Таблица 3. Сравнение частот ревертирования инсерций LYS2::Tn9, LYS2: :131 и И52::Тп5-13 у штаммов POL* и pol3-t;

HPR+ и hprl.

Штамм, температура Частота реве в гене ртировакия-инсерции LYS2 (х10~8)

ТП9-25 IS1-25 Тпб-13 ТП9-27 IS1-27

2Г-Д252 30°С 3 6 (где-* 4,43) 13,9 (10,1 + 17,7) 2,06 (1,86+ 2.16) 0,03 (0,03+ 0,19) 0,33 (0,14+ 0,42)

2АВ-Х4 30°С 17 (10+ 24) 0.1 (0,04+ 0,28) 0,7 (0,48+ 0,55)

зв-дзза 30°С 4,0-41 0,7 (0,13+ 1.35) 1.7 (1,1 + 2,3) 0,07 (0,02+ 0,17) 0.2 (0,10 0,34)

МЗ-ЗБ-Д338 30°С 0,6 (0.44* 1,01) 0.3 (0.24+ 0,36) 32 (18,4+ 45,6) 0,08 (0,03+ 0,24) 0,2 (0,13+ 0,35)

20°С 0,4 (0,23+ 0,66) 0,5 (0,28+ 0,76) 1,7 (1,3+ 2,6) 0,08 (0,02+ 0,21) 0,3 (0,09+ 0,35)

Примечание: Приведены средние значешя частот ревертирования и доверительные интервалы (в скобках). Частота ревертирования инсердаи ЬУ32::Тп9-25 в штамме ЗБ-ДЗЗВ сильно варьирует по клонам. В таблице указаны границы варьирования этой частота. Штамм МЗ-ЗБ-ДЗЗЗ - мутант ро13-1; штамм 2АВ-Х4-2Г-Д252 - мутант Ьрг1.

Вставки Тг.9 и 1Э1 в гене 1Л32 у дрокжей могут ревертиро-вать за счет точного вырезания. Вставкит«9-Ъ'ц 131-25 в плаз-мидяом гене ЬУБ2 ревэртировали с повышенной частотой (табл.З). У большинства реввртантов были обнаружены сложные перестройки в плазмяде и (или) сохранение инсерции (данные приведены в диссертации). Частоты ревертирования остальных семи встэбок Тп9 (см. рис.1) оказались сходными и были, приблизительно, равны частоте ревертирования Тп9-27 и 181-27 (таблица 3, дан-

ные приведены только для Тп9-27 и IS1-27. Большинство - 21 из 23 ревертантов, проанализированных у редкоревертирующих инсзр-ционных мутантов, имело структуру, неотличимую в рестрихцион-ном анализе от исходной глазмиды pLL12.

У двух плазмид, возникших в результате реверсии Тп9-27 и у семи плазмид, возникших в результате реверсии IS1-27, была определена нукЛеотидная последовательность в районе инсерции. Во всех случаях реверсии произошли за счет точного вырезания. Мы предполагаем, что .точное вырезание является основным механизмом реверсий у всех семи редкоревертирущих вставок LYS2::Тп9. Все эти инсерции ревертируют в 10 и Солее раз реже, чем инсерции IYS2::Tn5. Не обнаружено сайт-специфичности частот точного вырезания, поскольку обе инсерции LYS2::Тп9-?5 и LY52::ISí-25, ревертирующю с повышенной чаететой, ревертируют. не в результате вырезания, а за счет перостроек плазмид (LYS2::Tn9~25) или без вырезания (LYS2::IS1-25).

Мутации, увеличивающие частоту точного вырезания Тг.5 у дрожжей. не влияют на вырезание Тп9 и IS1. Исследовали (табл.З) две мутации, увеличивающие частоту точного вырезания бактериального транспозона Тп5 у дрожжей - pol-3t - полимераз-ная мутация, повышающая частоту вырезания Тп5 в IG-I00 раз (Gordenln et al., 1990) и hpr1::HIS3 гена HPR1, кодирующего белок, схожий по аминокислотной последовательности с топоизо-меразой I (Aguilera, Klein, 1990). Применяемые методы позволяли зарегистрировать трех- и более кратное увеличение частот. 3 наших опытах мутация hpr1::HIS3 в 8,5 раза повышает частоту вырезания транспосона Тп5 из' состава гена LYS2 в плазмиде рШ 2: :Тп5-13. Мутация pol3-t приводит к увеличении частота

вырезания Тп5 из плазмиды рШ2::?п5-13 в 19 раз (при t=30°C).

Увеличения частот вырезания транспозонов Тп9 и IS1 у ро13-г-кутантов не обнаружено, как из состава плазмидаого гена LYS2, так и из хромосомного гена. У мутантов hprl токе не обнаружили увеличения частот вырезания транспозонов Тп9 и IS1.

Мутация hprl увеличивает частоту кроссингоЕера длинных прямых повторов. Вероятно, и частота IS1-IS1-рекомбинации на концах Тп9 такта увеличена, однако зто не приведет к увеличению частоты точного вырезания.

Наиболее интересен результат об отсутствии влияния pol2-t на вырезание Тп9 и IS1. pol3-t увеличивает до 100 раз у некоторых птаымов частоту вырезания Тп5, у которого есть длинные инвертированные повтора. Отсутствие влияния на вырезание IS1 и Тп9 указывает на особую роль длинных инвертированпх повторов в стимуляция рекомбинации коротких повторов. Это согласуется с предложенной моделью для объяснения влияния мутаций ро13 на эксцизию Тп5. Модель основывается на'гипотезе Моррисона с соавторами (MoiTlson ex al., 1990). Согласно этой гипотезе, продукт гена P0L3 завершает синтез отстающей нити. В норме репликация отстающей и лидирующей нити должны быть скоординированы. Остановка или замедление синтеза отстающей нити вследствие мутацаи в гене ЮХЗ приводит к образованна длинных учгстков однонитевой ДНК. Следовательно, увеличивается вероятность комплементарного действия последовательности инвертированных повторов 5п5 и формирование вторичной структуры типа "шпильки", которая стимулирует эксцизию транспозона в результате проскальзывания через эту структуру в процессе репликации.

У Тп9 отсутствуют длинные инвертированное повтори. Нали-

чке IS1 - прямых повторов не приводит к формированию стабильной Еторичной структуры типа "шпильки". Поэтому логично было ожидать, что влияния ро13-1;-мутации на вырезание бактериального- транспозона Тп9 не будет. Увеличение частоты точного Еыро-зания IS1 у ро13-1;-мутантов тоже не наблндали. Это, вероятно, связано с тем, что короткие несовершенные инвертированные повторы (23 п.о.) IS1-элемента слишком малы и структура типа "шильки", если и образуется, то затем быстро разрушается.

вывода

1. Реверсии инсерции LYS2::Tn9 и LYS2::IS1 происходят:

- За счет точного вырезания транспозона

- За счет сложных перестроек з ревертантных плазмидах.

2. Вырезание инсерции Тп9 и IS1 у дрожжей происходит в 10-100 раз реке, чем вырезание инсерции 'fn5.

3. Мутации, увеличивающие частоту вырезания Тп5 у дрожжей (ро13, hprl) не влияют на частоты вырезания IS1 и Тп9.

4. Обнаружен новый тип супрессоров у дрохкей - рецессивные ядерные мутации, избирательно подавляющие 2 инсерции бактериального транспозона Тг.5 в дрожжевом гене LYS2.

ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНА ПЕЧАТНАЯ РАБОТА Gordenln D., Zasheva D., ТгоПгг.ота M., Ptusî&ina H. Hovel suppression In yeast: Suppressors of Bacterial transposon Tn5 Insertions In tne yeast gene LYS2. 15th International Specialized Symposium on Yeasts - Riga, 1991, p.S1.