Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Закономерности эксцизии транспозонов при действии излучений с разными физическими характеристиками

ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Закономерности эксцизии транспозонов при действии излучений с разными физическими характеристиками"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. М. В. ЛОМОНОСОВА

19-2004-171 На правах рукописи

ЖУРАВЕЛЬ Даниил Валерьевич

ЗАКОНОМЕРНОСТИ ЭКСЦИЗИИ ТРАНСПОЗОНОВ ПРИ ДЕЙСТВИИ ИЗЛУЧЕНИЙ С РАЗНЫМИ ФИЗИЧЕСКИМИ ХАРАКТЕРИСТИКАМИ

Специальность: 03.00.01 —радиобиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2004

Работа выполнена за время обучения в аспирантуре на кафедре биофизики Государственного университета природы, общества и человека «Дубна» в Отделении радиационных и радиобиологических исследований Объединенного института ядерных исследований.

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор Е.А. Красавин Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор В.Г. Петин, доктор биологических наук, профессор В. К. Мазурик. Ведущая организация: Государственный Научный Центр -

Институт медико-биологических проблем РАН, г. Москва

Защита состоится 23 декабря 2004 г., в _часов_минут

на заседании диссертационного совета Д.501.001.65 в Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119899, г. Москва, Воробьевы горы, биологический факультет, диссертационный совет Д.501.001.65.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ. Отзывы на автореферат просим высылать по вышеуказанному адресу на имя ученого секретаря диссертационного совета.

Автореферат разослан " _" _ 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор

биологических наук, профессор О.Р. Кольц

2006-4

2243

РШП1

Введение

Актуальность исследования

Изучение проблемы индуцированного мутагенеза у прокариот при действии ионизирующих излучений служит необходимым фундаментом для интерпретации сложных механизмов, лежащих в основе мутационных процессов у высших организмов С учетом этого, исследования закономерностей и механизмов мутагенного действия излучений с разной линейной передачей энергии (ЛПЭ) на бактериальные клетки представляются весьма актуальными (Е.А Красавин и С Козубек, 1991). Воздействие излучения индуцирует в бактериальных клетках Escherichia coli ряд процессов, сопряженных с функционированием SOS-системы ответа на повреждающее воздействие' индукцию некоторых про-фагов и колицинов, SOS-репарацию и SOS-мутагенез При действии на клетки ДНК-повреждающих факторов репликация ДНК происходит с большим количеством ошибок, вследствие снижения корректорских функций ДНК-полимеразы и, следовательно, становится причиной возникновения SOS-зависимых мутаций

К числу наименее изученных вопросов радиационной генетики прокариот относятся исследования закономерностей возникновения структурных мутаций' делеций, инсер-ций, и транслокаций Это связано как с методическими трудностями выявления таких изменений генетических структур, так и с относительно низкой частотой (по сравнению с генными мутациями) образования структурных мутаций. Закономерности индукции структурных мутаций у клеток прокариот излучениями с высокой ЛПЭ практически не изучены. В клетках Е. coli структурные мутации с высокой частотой возникают при транспозиции мобильных элементов. Транспозиция является специфичным SOS-мутагенным процессом, который индуцируется химическими мутагенами, ультрафиолетовым светом, а также ионизирующей радиацией.

Показано, что точная эксцизия транспозонов является SOS-индуцибельным процессом, который происходит по «мишенному механизму». Стрессовые состояния бактериальной клетки, индуцирующие SOS-репарацию ДНК и мутагенез, прямо влияют на частоту транспозиции мобильных элементов. Корреляция SOS-мутагенеза и активности мобильных элементов позволила разработать оригинальный подход к изучению индуци-бельных систем репарации ДНК и мутационного процесса у прокариот с использованием генетических систем, сконструированных на основе транспозонов (Г И Алешкин и др., 1983).

Такой подход позволил определить влияние ключевых генов SOS-мутагенеза на индукцию точной эксцизии транспозона ТпЮ при действии УФ-излучения Показано, что точная эксцизия находится под контролем SOS-индуцибельных генов рекомбинационной

гас НАЦИОНАЛfettАЯ БИБЛИОТЕКА

¿мВЕЯГ

репарации ДНК ruv и recN (R Nagel et al, 1994; A Chan et al, 1994) При облучении клеток, несущих мутацию гесА эффективность УФ-индуцированной точной эксцизии резко снижается, так как ген является ключевым в реализации SOS-агъега (GI Aleshkin et al, 1998) Оказалось, что точная эксцизия, TnlO в системе 505-мутабильности происходит без участия транспозазы, поэтому консервативный механизм точной эксцизии в процессе транспозиции, которая происходит через внесение ступеньчатых двунитевых разрывов не позволял определить закономерности эксцизии при индуцирующем воздействии УФ-света Было продемонстрировано участие гесВС и recF-зависимых рекомбинационных процессов в индукции точной эксцизии транспозона TnlO (R Nagel, 1999) Точная эксцизия транспозона, происходящая в условиях индукции SOS-ответа является классическим делеционным процессом, который происходит при участии небольших палиндромных последовательностей Аналогичные закономерности были обнаружены в активных локусах с высоким выходом структурных перестроек, и в этом смысле точная эксцизия транспозона может служить модельной системой для определения закономерностей формирования де-леций

В экспериментах с ускоренными тяжелыми ионами (Е А Красавин и С Козубек, 1991) получен обширный материал по индукции прямых и обратных генных мутаций излучениями в широком диапазоне линейной передачи энергии (J1113) Было показано, что зависимость частоты мутирования клеток от дозы у-квантов и тяжелых заряженных частиц описывается линейно-квадратичной функцией, для которой квадратичная компонента зависимости определяется эффективностью экспрессии генов, контролирующих SOS-сгтвет Относительная биологическая эффективность (ОБЭ) частиц по критерию индукции мутаций увеличивается с ростом ЛПЭ и зависимость ОБЭ (ЛПЭ) описывается кривой с локальным максимумом при ЛПЭ * 20 кэВ/мкм Различие в положениях максимумов по критерию летального (~ 80-100 кэВ/мкм) и мутагенного эффектов облучения определяется разным характером событий, участвующих в формировании этих эффектов Летальный эффект вызван образованием двунитевых разрывов (ДР) ДНК, а мутагенный эффект -кластерными однонитевыми разрывами ДНК

В отличие от генных мутаций, структурные мутации у клеток прокариот формируются в результате возникновения ДР ДНК Соотношение выходов прямых двунитевых разрывов, как результат разрыва опозитных нитей при прохождении частицы и энзимати-ческих ДР ДНК, возникающих в процессе 50£-репарации может обуславливать специфику образования мутаций делеционного типа при действии излучений с разной ЛПЭ С учетом этих обстоятельств исследование эксцизии транспозонов при действии излучений широкого диапазона ЛПЭ может дать важную информацию об особенностях индукции

структурных мутаций у бактерий ионизирующим излучением с разными физическими характеристиками.

Цель и основные задачи исследования

Целью настоящего исследования является изучение закономерностей и механизмов 505-индуцибельной эксцизии транспозонов в клетках бактерии Escherichia coli при действии излучений с разными физическими характеристиками' ультрафиолетового света, у-излучения, и ускоренных тяжелых ионов с разной ЛПЭ Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие основные задачи:

1. Исследовать характер индукции точной эксцизии транспозонов разных классов при облучении УФ-свегом и определить роль структуры последовательности элемента в этом процессе.

2 Используя клетки, несущие мутации генов гес-семейства, определить зависимость индуцированной эксцизии транспозона ТпЮ от репарационного генотипа бактерий

3 Изучить закономерности индукции точной эксцизии транспозона ТпЮ при облучении ускоренными ионами, в диапазоне ЛПЭ от 20 до 200 кэВ/мкм в биологическом образце

4 Оценить генетическую эффективность ускоренных ионов по критерию точной эксцизии ТпЮ и по критерию летального действия на клетки Escherichia coli

5 Провести статистическое моделирование встраивания транспозона в новое положение и предложить механизм ¿'О^-индуцибельной точной эксцизии транспозона при действии излучений разного качества.

Научная новизна

Исследования закономерностей .S'tAS'-мутабильности клеток Escherichia coli при действии излучений с разными физическими характеристиками, с использованием в качестве тест-системы мобильные элементы позволяют предложить новый перспективный подход для изучения механизма возникновения структурных мутаций у бактерий. В настоящей работе впервые определены закономерности эксцизии транспозона ТпЮ при действии у-излучения Показано, что у-индуцированная эксцизия является ¿'О.У-мутагенным процессом, который контролируется генами геосемейства Впервые показана возможность индукции точной эксцизии транспозона ТпЮ ускоренными многозарядными ионами с разной ЛПЭ, изучены закономерности этого процесса Определены значения относительной биологической и генетической эффективности ускоренных ионов *Не и 12С по критериям летального действия и точной эксцизии транспозона ТпЮ Проведен ориги-

нальный статистический расчет мишенного встраивания транспозона ТпЮ в новое положение, исходя из функции вероятности распределения мишеней в геноме Escherichia coli, и построена модель, описывающая механизм точной эксцизии транспозона TnlO, как SOS-индуцируемого мишенного делеционного явления

Научно-практическая значимость работы

При решении ряда научно-практических задач радиационной генетики весьма важно иметь информацию не только о суммарном выходе различного рода мутаций в облученных клетках, но исключительный интерес представляют сравнительные данные о частоте образования как генных, так и структурных мутаций Эти задачи обусловлены необходимостью решения вопросов нормирования лучевых нагрузок от излучения разного качества на персонал, работающий в смешанных полях ионизирующих излучений, проблемами обеспечения радиационной безопасности экипажей при длительных космических полетах, другими важными практическим вопросами Полученные данные представляют несомненный научный интерес при интерпретации механизмов мутагенного влияния излучений широкого диапазона ЛПЭ на клетки с разным генотипом Результаты исследования могут быть использованы при разработке нормативных документов, связанных с обеспечением радиационной безопасности лиц, находящихся в условиях многокомпонентного радиационного воздействия

Положения и результаты, выносимые на защиту:

1 закономерности радиочувствительности бактерий Escherichia coli при действии излучений широкого диапазона ЛПЭ;

2 закономерности у-индуцированной эксцизии транспозона TnlO в клетках Escherichia coh с различным репарационным генотипом;

3 дозовые зависимости точной эксцизии транспозона ТпЮ при ультрафиолетовом облучении клеток с мутациями в разных локусах генов гес,

4 результаты исследования закономерностей точной эксцизии ТпЮ при облучении ускоренными тяжелыми ионами с разной ЛПЭ и определение относительной биологической эффективности ускоренных ионов по критерию летального действия и точной эксцизии TnlO-,

5 статистическое моделирование мишенного встраивания транспозона и модель точной эксцизии ТпЮ при облучении ускоренными ионами.

Структура работы:

Работа состоит из 4 глав, включающих обзор литературы, описание материалов и методов, изложение и обсуждение результатов исследования, содержит введение, выводы,

и список литературы, и имеет общий объем 100 страниц Экспериментальные и теоретические результаты наглядно представлены на 12 графиках и векторных диаграммах Математический аппарат, использованный при проведении исследований, содержит 17 формул Список литературы содержит 134 источника, из них «1/3 всех научных работ опубликованы в российских изданиях.

Апробаиия работы

Отдельные разделы работы проходили апробирование на различных российских и международных конференциях, неоднократно отмечены дипломами, удостоены почетной грамоты IV Съезда по радиационным исследованиям и поощрительной премии ОИЯИ для молодых специалистов Список тезисов, полнотекстных докладов и статей представлен в конце автореферата

Материалы и методы исследования

Источники излучения

Облучение клеток УФ-светом длиной волны 254 нм проводили при помощи бактерицидной лампы БД 30-1 мощностью дозы 0,5 Дж/м2 Облучение у-квантами l37Cs проведено на установке «Свет», которая позволяет проводить статическое облучение биологических объектов мощностью дозы 26 Гр/мин Эксперименты, в которых проводилось облучение ускоренными ионами 4Не и 12С с ЛПЭ 20, 50, 100, и 200 кэВ/мкм проведены на установке «Геном», расположенной на ускорителе У 200 в Лаборатории ядерных реакций им Г Н Флерова, ОИЯИ

Бактериальные штаммы

Бактериальные штаммы К coli, которые были использованы в работе для исследования точной эксцизии транспозонов, представляют собой генетическую систему для моделирования, структурных мутаций, возникающих при действии излучений с разными физическими характеристиками Штаммы AFT 228 (ArgA8l::TnlO), SP 256 (TyrA16::TnlO recN262), ENZ 280 (SfiAJ 1::Тп10 ArecAm), RDK 1541 (.RecOJ504::Tn5), ABU 57 (RecQ::Tn3) DB 5872 (CysC95::TnlO), GA 120 (Trp::Tnl) - были любезно предоставлены бактериальным музеем Отделения молекулярной и радиационной биофизики Петербургского института ядерной физики, ВНИИ «Генетика», а также Институтом иммунологии и микробиологии им. Н.Ф Гамалея.

Определение радиочувствительности

Для определения радиочувствительности клетки К coli выращивали в жидкой питательной среде LB (0,5 % дрожжевого экстракта, 1 % NaCl, 1 % триптона) в два этапа до

получения суспензии концентрацией Ю9 клеток/мл Затем осаждали центрифугированием при 4000 об/мин в течение 20 минут, супернатант сливали, осадок растворяли в солевом буфере М56 (11,4 г/л Na2HP04 • 2Н20, 2,7 г/л КН2Р04, 1 г/л (NHOjSC^, 100 мг/л MgSOi ' 7Н20, 7 мг/л CaN(V4H20, и 0,2 г/л D-глюкозы) без витаминов и микроэлементов Облучение бактериальных клеток у-излучением 137Cs проводили в стеклянных пробирках, а эксперименты с ускоренными тяжелыми ионами на специальном ядерном фильтре После облучения титр клеток, необходимый для получения 100-500 колоний высеивали на чашки с агаризованной средой, и проводили инкубацию в течение 16 ч Выживаемость определяли стандартно, как отношение числа выживших клеток к числу клеток в контроле Статистический размер вариации экспериментальных данных вычисляли как среднеквадратичное отклонение экспериментального значения при помощи программы «Sigma Plot 8 0» из пакета «Jandel Scientific» По кривой выживаемости определялось обратное значение дозы, при которой выживаемость падает в г раз (до 37 %), это значение и является радиочувствительностью бактериального штамма

Индукция транслокаиионных процессов

Индукцию точной эксцизии транспозонов УФ-светом проводили по стандартной методике (Gl. Aleshkin et al, 1998) Концентрированную суспензию клеток высеивали на чашки с минимальной средой М56, содержащей высокоочищенный агар Титр суспензии, необходимый для получения 100-500 колоний параллельно наносили на агаризованную среду LB Облучение клеток УФ-светом проводили на агаризованной среде при помощи бактерицидной лампы БД 30-1 После облучения чашки со средой LB инкубировали в термостате при 37 °С в течение 24 ч Инкубирование на минимальной питательной среде продолжали в течение 72 ч По числу колоний на среде LB определяли процент выживших клеток, а по числу колоний на чашках со средой М56 находили относительную частоту точной эксцизии транспозонов.

Для определения закономерности эксцизии ТпЮ при у-облучении жидкую суспензию клеток облучали in vitro при 0 "С, затем определяли процент реверсий признака устойчивости к тетрациклину и строили зависимость относительной частоты эксцизии транспозона.

Методика исследования закономерностей точной эксцизии транспозона ТпЮ при облучении ускоренными тяжелыми ионами была выбрана с учетом опыта исследований мутагенеза Е. coli на базовых установках ОИЯИ (Е А. Красавин, 1985) Приготовление клеточной суспензии DB 5872 описано ранее, облучение проводили на фильтрах с диаметром пор 0,3 мкм на установке «Геном» После облучения клетки стряхивали с фильтра в буфер М56, а затем высеивали на минимальную среду и iß-arap. Генотип использован-

ного штамма таков, что на минимальной среде клетка дает видимую колонию только в случае точной эксцизии ТпЮ из гена cysC Это позволило на пятый день инкубации чашек при 37 °С подсчитать число реверсий и определить относительную частоту точной эксцизии транспозона.

Результаты и обсуждение.

Радиочувствительность rec-мутантов Е. coli к у-излучению

Для определения радиочувствительности клеток к у-излучению были построены кривые выживаемости Е. coli дикого типа, а также клеток, несущих мутации генов recQ, recN, гесО, и гесА (Д В Журавель 2001, Д В. Журавель и А В Борейко, 2002 Ь) Как показано на рис 1, все зависимости выживаемости от дозы у-излучения имеют классический экспоненциальный характер Радиочувствительность клеток дикого типа (1-1) составляет 0,014 Гр'1 При этом угол наклона кривой выживания по отношению к оси ординат является максимальным Мутации в генах recQ и recN вызывают эквивалентное увеличение радиочувствительности бактерий (1-2,3) до значения 0,018 Гр'1. Но причины, по которым это происходит, являются различными Ген Е coli recQ кодирует АТФ-зависимую геликазу молекулярной массой 68,35 кДа, которая раскручивает молекулу ДНК в направлении 3'-5' и специфически стимулирует топоизомеразу Ш для окончательного соединения молекулы (N Inno et al, 1986) ДНК-геликазы играют важную роль в гомологичной рекомбинации и рекомбинационной репарации генных повреждений. При мутации recQ наблюдается увеличение частоты негомологичной рекомбинации на генотипе гесА' recBC' sbcBC ", что говорит о том, что функция этого белка заключается в экспрессии супрессора негомологичной рекомбинации Е. coli (К Hanada et al, 1997) Увеличение радиочувствительности у мутантов recQ позволяет сделать вывод о том, что процесс негомологичной рекомбинации проявляется при у-облучении, когда первичные повреждения ДНК приводят к двунитевым разрывам, которые являются горячими точками рекомбинационного процесса В отличие от recQ, характер экспрессии гена recN является чисто репаративным Продукт этого гена г; имеет молекулярную массу 62 кДа. Его отсутствие в клетке уменьшает минимальную ин-

дуцирующую дозу возникновения SOS-ответа и увеличивает эффект от этого процесса

Доза, Гр

Рис. 1. Зависимости выживаемости гес-мугантов от дозы у-излучения |37С5 Кривые выживаемости соответствуют следующим штаммам.

1 - дикий тип, 4 - мутанты гесО,

2 - мутанты гес0, 5-мутанты гесА.

3 - мутанты гесЫ,

при любом значении дозы (М Brenna-Valle, 1998) Мутация recN вызывает высокий инду-цибельный и конститутивный уровень продукта гена гесА Поэтому мутанты recN имеют значительно пониженную частоту супрессорной эксцизии транспозона ТпЮ (A Chan et al, 1994) При мутации в гене гесО (1-4) радиочувствительность возрастает до значения 0,020 ГрПродуктом этого гена является Z)e/-penpeccop, полипептид молекулярной массой 26 кДа, который имеет мононуклеотид-связывающий домен для супрессии формирования делеций с компенсаторными дупликациями на плазмиде (К Umezu et al, 1993) Биохимические характеристики полипептида гесО, определяющие его свойство связываться с однонитевой и двунитевой ДНК для ренатурации молекулы подтверждают участие гена в гомологичной рекомбинации Кроме того, гесО обеспечивает ассимиляцию однонитевых ДНК в гомологичную суперскрученную двойную спираль при участии гесА (Q Shan et al, 1997) Мутация гена гесО приводит к снижению SOS-ответа и уровня ин-дуцибельной репарации в бактериях (YH Liu et al, 1998) Значительное увеличение радиочувствительности до значения 0,048 Гр"' вызывается мутацией гена гесА (1-5) Продукт этого гена имеет сродство к однонитевой форме молекулы, возникающей в кластерах повреждений ДНК, и, как известно, является ключевым в репарации медленного типа (Е А Красавин, 1989) Ген гесА кодирует около 350 аминокислотных остатков в значительно консервативной последовательности белка RecA, который обнаружен во всех бактериальных геномах, в ДНК хлоропластов растений, и высших организмов (Н D Cerutti, 1992, АI Roca and М М Сох, 1997) Продукт гена гесА является многофункциональным белком, который принимает участие во многих биохимических реакциях, где в качестве субстрата выступает однонитевая форма ДНК Его белковая функция в гомологичной рекомбинации заключается в ДНК-зависимом расщеплении АТФ, запуске синапсиса, формировании гетеродуплексов и в обеспечении обмена нитей между гомологичными участками ДНК Важно, что RecA является протеазным кофактором, который осуществляет расщепление продукта гена lexA и еще некоторых фаговых репрессоров Инактивация LexA дерепрессирует более 20 генов, вовлеченных в SOS-ответ, в процессе которого осуществляется репарация ДНК, индуцируется SOS-зависимый мутагенез, реализуется задержка клеточного деления, а также происходит индукция профагов при появлении повреждений ДНК (W. Selbitschka, et al, 1991)

Закономерности у-индуиированной эксиизии при мутациях генов гесА и recN

Потеря резистентных признаков бактерии, содержащей транспозон, может с высокой частотой вызываться у-облучением В данном пункте представлены результаты экспериментов по исследованию зависимости относительной частоты эксцизии транспозона ТпЮ от дозы у-излучения 137 Cs (Д В Журавель и А В Борейко, 2002 а, Ь) Определены

закономерности эксцизии Tri 10 при «выключении» SOS-индуцибельных генов- гесА и recN Для клеток дикого типа определен фактор влияния условий, в которых проводится облучение и проведены параллели между эксцизией транспозона и SOS-индукцией при действии у-излучения.

Для того, чтобы определить возможную роль генов гес-семейства в эксцизии транспозонов при действии у-излучения были выбраны два штамма' SP 256 (TyrA16::TnlO recN262), и ENZ 280 (SfiAll АгесАзоб::Тп10) В качестве контроля были использованы клетки К coli дикого типа AFT 228 (ArgA8J::Tnl0) В соответствии с этим на рис 2 представлены три дозовые зависимости относительной частоты у-индуцированной эксцизии транспозона ТпЮ

Для клеток дикого типа на диапазоне доз от 0 до 600 Гр получена плавная кривая (2-1) с областью плато, которое наступает после дозы 500 Гр На диапазоне от 0 до 260 Грей дозовая зависимость апроксимируется параболлической функцией

^- = aD2 +bD + c (1),

N

Nlel

где —— - относительная частота эксцизии ТпЮ, N

D - доза ^-облучения,

постоянные- а = 1,1-10"4Гр'2, Ь = 7,210'3 Гр'!, с = 5,5 %.

На диапазоне от 260 до 650 Грей относительная частота эксцизии ТпЮ, как функция от дозы у-облучения апроксимируется тригонометрической функцией

^ = С • arctg(D - 260) - К (2),

N

где постоянные: С = 23,6 рад"1, К = 14,8 %.

При мутации гена recN происходит значительное уменьшение относительной частоты эксцизии транспозона (2-2) Зависимость в клетках с мутацией recN имеет область плато на диапазоне доз, который соответствует 1-10% выживаемости штамма, а затем она выходит на насыщение после 500 Гр В клетках, несущих мутацию гесА построение дозовых зависимостей возможно только до 250 Гр, когда выживаемость достигает порогового значения Ю-3 %, которое можно измерить. При определении частоты реверсий на данном диапазоне индукция эксцизии транспозона ТпЮ не обнаружена, за исключением

200 400 Доза, Гр

Рис. 2. Дозовые зависимости относительной частоты эксцизии транспозона ТпЮ

1 - клетки дикого типа, 2 - мутанты гесЫ, 3 - мутанты гесА

2-3 % флуктуаций (2-3) Дисперсия контрольных точек не позволяет сделать вывод о влиянии генов гесА и recN, на спонтанную эксцизию транспозона, но можно сделать вывод о том, что эффект у-индуцированной эксцизии транспозонов является гесА-зависимым, также как и эффект точной эксцизии ТпЮ

Точная эксиизия ТпЮ при облучении УФ-светом.

УФ-свет индуцирует в клетках Escherichia coli ряд ÄAS'-индуцибельных процессов, к которым можно отнести точную эксцизию транспозонов. Точная эксцизия является делеционным событием, которое определяется структурой ДНК Для выяснения роли структуры последовательности элемента были определены дозовые зависимости относительной частоты

50 100 150 200 250 Доза, Дж/м2

точной эксцизии транспозонов Тп1 и ТпЮ Рис. 3. Лотовые зависимости выживаемости Е coli и

относительной частоты точной эксцизии (Е Ю Козлова и др , 2003) На рис 3 транспозонов ТпЮ и 7л/ при облучении УФ-светом

1 - выживаемость, 2 - точная эксщпия ТпЮ.

представлен график дозовои зависимости з _ точная эксцизия 7л/.

выживаемости и относительной частоты точной эксцизии транспозонов Тп1 и ТпЮ Зависимость выживаемости (3-1), построенная полулогарифмическом масштабе имеет характерную форму кривой с плечом в диапазоне от 0 до 100 Дж/м2 При дальнейшем увеличении дозы зависимость становится линейной. Относительная частота точной эксцизии транспозона Тп1 из гена, отвечающего за метаболизм триптофана (3-3), и зависимость относительной частоты точной эксцизии ТпЮ из гена cysC95 (3-2) имеют форму плавно возрастающих кривых с насыщением Максимальное значение относительной частоты точной эксцизии ТпЮ, индуцированной ультрафиолетом, составляет 10"6, а максимальное значение относительной частоты точной эксцизии транспозона Тп1 в тех же условиях значительно ниже, и составляет 5-10-8. Этот факт может быть объяснен на основе существующих отличий в последовательностях транспозонов Тп1 и ТпЮ Последовательность транспозона ТпЮ фланкирована инвертированными элементами IS10, которые имеют большой размер Транспозон Тп1 не содержит протяженных фланкирующих элементов и поэтому частота комплементарных ошибок между прямыми повторами для ТпЮ выше, чем для Тп1 Явления точной эксцизии и встраивания элемента Тп1 изучены достаточно слабо и, скорее всего этот процесс происходит по немишенному механизму В отличие от него, короткие концевые палиндромные последовательности элемента ТпЮ определяют эффективную точную эксцизию и возможность мишенного встраивания в локусы, содержащие последовательность NGCTNAGCN

Точная эксцизня транспозона ТпЮ, индуцированная воздействием УФ-света представляет собой SOS-мутагенный процесс, который в Е. coli происходит под контролем генов гесА и recN Получены дозовые зависимости относительной частоты точной эксцизии транспозона ТпЮ для штамма SP 256 (TyrA16::TnI0 recN262\ содержащего точечную мутацию гена recN и для штамма ENZ 280 (SfiAl 1::ТпЮАгесАзо^, с делегированной последовательностью гена гесА Построение зависимостей проведено на диапазоне доз УФ-облучения от 0 до 100 Дж/м2, который соответствует характерному диапазону выживаемости клеток, несущих делецию гена гесА Как видно на рис 4, в этом диапазоне зависимость относительной частоты точной эксцизии ТпЮ у клеток дикого типа является линейной (4-1) Это означает, что относительная частота точной эксцизии ТпЮ может быть описана экспоненциальной функцией от дозы УФ-света При наличии мутации в гене recN относительная частота плавно растет с увеличением дозы (4-2) и выходит на плато при дозах, когда процентная выживаемость клеток падает на 5 порядков до 4-10"2 % Мутация в гене гесА приводит к тому, что эффект индукции точной эксцизии транспозона проявляется весьма незначительно (4-3), Все зависимости проходят через одну начальную точку, это показывает, что мутации в генах гесА и recN не оказывают заметного влияния на частоту спонтанной эксцизии транспозона ТпЮ Аналогичные результаты были получены при исследовании де-леций между прямыми повторами на плазмиде в гес-дефицитных штаммах (X Bi and L Liu, 1996) Для спонтанной и УФ-индуцированной (дозами до 25 Дж/м2) точной эксцизии транспозона ТпЮ число ревертантов, несущих транспозон в новом положении не превышает 1 % Следовательно, точная эксцизия происходит с полной или частичной потерей последовательности элемента в несколько этапов

Точная эксцизии ТпЮ при облучении ускоренными ионами с разной ЛПЭ

Эксперименты по изучению закономерностей точной эксцизии транспозона ТпЮ при облучении ускоренными ионами с разной ЛПЭ были проведены впервые (Д В Журавель, 2004) На первом этапе по кривым выживаемости бактериального штамма Е coli DB 5872, которые изображены на рис 5, были определены обратные значения дозы Do при которых выживаемость падает в е раз (до 37 %) Максимальное значение радиочувствительности клеток 0,027 + 0,006 Гр'1 выявлено при облучении ионами гелия *Не

40

Дта,Дж/м2 Рис. 4. Зависимости относительной частоты точной эксцизии транспозона ТпЮ при облучении УФ-светом В левом углу отображена диаграмма максимальных значений

1 - дикий тип, 2 - мутант гесК

3 - мутант гесА

(5-4), для которых ЛПЭ в биологическом образце составляет 100 кэВ/мкм Ионы гелия с ЛПЭ 20 кэВ/мкм имеют меньшее значение радиочувствительности, равное 0,018 ± 0,004 Гр"' (5-2) При облучении ионами углерода |2С с ЛПЭ 200 кэВ/мкм (5-1) получена минимальная радиочувствительность, равная 0,015 ± 0,006 Гр'1,

100

*

Ö 10

W

г

л 0,1

fjj 10~2

m

10J

4,

1 3i

4

200 100 зоо Доза, Г р

400

это значение лишь незначительно превышает Рис.5. Лотовые зависимости выживаемости бактерий при облучении ускорен-радиочувствительность Е. coli при у-облучении ными ионами с разной ЛПЭ 137 1-'2С, 200 юВ/мкм, 3 - "Не, 50 кэВ/мкм,

Cs Отношение радиочувствительности клеток 2 - 4Не, 20 юв/мкм, 4 - ''Не, 100 юВ/мкм

при облучении ускоренными ионами с данной ЛПЭ к радиочувствительности при у-облучении определяет относительную биологическую эффективность ионов (Е А Красавин, 1989) С ростом ЛПЭ от 20 кэВ/мкм ОБЭ увеличивается и достигает своего максимального значения 1,9+ 0,5 при облучении ионами гелия 4Не с ЛПЭ 100 кэВ/мкм Дальнейшее увеличение ЛПЭ должно приводить к падению величины ОБЭ, так при облучении ионами углерода 12С с ЛПЭ 200 кэВ/мкм получено значение ОБЭ, равное 1,1 ±0,4

На втором этапе были получены данные для определения закономерностей точной эксцизии транспозона ТпЮ. При помощи дозовых зависимостей, построенных на рис 6, определена эффективность ускоренных ионов с разными значениями ЛПЭ - обратное значение дозы, при котором частота точной эксцизии возрастает на один порядок (С Козубек, 1985) Частота формирования делеций, вызванных точной эксцизией мобильного элемента, в трех случаях из четырех является прямой в полулогарифмическом масштабе координатных осей (6-1,2,3) Следовательно, зависимость относительной частоты точной эксцизии транспозона ТпЮ является степенной функцией. Для кривых, полученных при облучении ускоренными ионами гелия 4Не с ЛПЭ' 20, 50 и 100 кэВ/мкм можно ввести общий вид функции зависимости мутагенного эффекта:

200 100 300 Доза, Гр

400

Рис. 6. Дозовые зависимости относительной частоты точной эксцизии транспозона ТпЮ при облучении ускоренными ионами с разной ЛПЭ 1 - 4Не, 20 кэВ/мкм, 2 - 4Не, 50 юв/мкм, 3 - 'Не, 100 кэВ/мкм, 4-|2С, 200 кэВ/мкм Пунктирной линией показана нормировка по у-нзлучению

N

(3),

где отношение числа реверсий к общему числу выживших клеток N / Nr является относительной частотой точной эксцизии транспозона ТпЮ Степенным аргументом этой функции является доза, которая вместе с линейными коэффициентами входит в показатель таким образом, чтобы он оказался безразмерной отрицательной величиной из диапазона от Ю~10 до 10"4 Максимальную генетическую эффективность, которая в данном случае определена по критерию точной эксцизии ТпЮ имеют ускоренные ионы *Не с ЛПЭ 20 и 50 кэВ/мкм (7-2)

Относительная биологическая эффективность, определенная по критерию летального действия на клетки Е. coli имеет максимум при облучении ускоренными ионами гелия 4Не с ЛПЭ 100 кэВ/мкм В отличие от нее, максимум зависимости ОБЭ, определенной по критерию точной эксцизии транспозона ТпЮ приходится на диапазон ЛПЭ от 20 до 40 кэВ/мкм Как было показано на рис 5, с ростом ЛПЭ от 20 кэВ/мкм угол наклона прямых уменьшается, следовательно, выход летальных повреждений растет и достигает максимума при облучении ускоренными ионами *Не с ЛПЭ 100 кэВ/мкм С дальнейшим ростом ЛПЭ количество летальных повреждений, приходящихся на единицу дозы тяжелых заряженных частиц снижается Это обстоятельство приводит к тому, что ОБЭ является функцией второго рода (7-1), имеющей локальный максимум при ЛПЭ = 100 кэВ/мкм Изменение ОБЭ связано с увеличением выхода прямых двунитевых разрывов ДНК (Е А Красавин, 1989), которые являются основным летальным повреждением в клетках Е. cob Максимум ОБЭ (7-2), который измерялся по критерию эффективности точной эксцизии ТпЮ, сдвинут в область меньших ЛПЭ При этом диапазон, на котором он находится' 20-40 кэВ/мкм, соответствует максимальному выходу кластерных повреждений одной нити ДНК (Е А Красавин, С Козубек, 1991) которые формируются медленными ¿»-электронами трека тяжелой заряженной частицы и приводят к формированию генных мутаций Максимальное значение выхода таких повреждений, как показано, реализуется при ЛПЭ » 40-50 кэВ/мкм (V. Michalik, 1992)

Статистическое моделирование мишенного встраивания транспозона

В результате исследований, выполненных в конце прошлого столетия, когда был полностью изучен геном кишечной палочки Escherichia coli, стало возможным проведение различных статистических расчетов с использованием полной нуклеотидной последовательности ДНК этого вида бактерий Опираясь на то, что встраивание транспозона являет-

Рис. 7. Зависимости ОБЭ от ЛПЭ излучений.

1 - по критерию ле- 2 - по критерию тального действия точной эксцизии

ся сайт-специфическим, были проведены расчеты вероятности встраивания ТпЮ в разные положения на бактериальной хромосоме (Д В Журавель и Е Ю Козлова, 2003)

По данным, которые были опубликованы другими авторами (N Kleckner, 1979, D Е Berg, 1985) для встраивания ТпЮ необходима мишень, состоящая из 9 нуклеотидов-NGCTNAGCN, где N- произвольное основание. Если основания N одинаковы, то в геноме бактерии существует 4 вида последовательностей, которые могут быть потенциальной мишенью для встраивания транспозона Вероятность встретить любую из

Мишень ■к, N

AGCTAAGCA 7,22 3,2 2

TGCTTAGCT 13,07 4,9 4

GGCTGAGCG 19,4 19,4 18

CGCTCAGCC 48,59 16,07 16

способами через вероятности встретить отдельные в геномнай [юследовэтельвос™

нуклеотиды, или прямым программным поиском мишеней в полной последовательности генома К coli Найдем встречаемость нуклеотидных мишеней для встраивания ТпЮ первым способом, всякий раз используя результаты, полученные при помощи поисковой программы в качестве проверки результата.

Тривиальным подходом для оценки вероятности может служить формула вида:

Рластлласл = (Рл )" • (Ра f ' (Рс )' ' (Рт ) (4)

В результате можно получить математическое ожидание \i числа копий мишени в последовательности Е. coli, табл 1, вторая колонка Как видно расчетные значения значительно отличаются от полученных при помощи компьютерной программы, последняя колонка Это обстоятельство позволяет предположить наличие корреляции между нуклеотидами в соседних положениях Действительно, например, перемножение вероятностей дает значение 10,9 10"2 для «двойки» СС, а на самом деле вероятность встретить СС несколько меньше 3,9-10 2 Аналогичный эффект наблюдается еще для нескольких пар в соседних положениях Учитывая то, что число возможных соседних пар в 9-нуклеотидной мишени п-1=8, поправка на вероятность может изменить значение в несколько раз Формула вероятности должна быть в каждом случае скорректирована

_ Рлв '(Рас f •Per 'Рта 'Рал 'Pag 'Рсл

УластАласл ~ / \г / \2 / \2

(Рв) -(Рс) -(РлУ-Рт

(5)

и тогда математическое ожидание %i числа мишеней будет значительно приближено к тому, которое получено прямым программным поиском в полной последовательности генома Е. coli (табл. 1)

Встраивание транспозона в новое положение происходит только в том случае, когда ферментативный комплекс, в который входит транспозаза, распознает в новом поло-

жении 9-нуклеотидную мишень Будем полагать, что эффективность узнавания транспоза-зы такова, что фермент может допустить 1-2 нуклеотидные отклонения на концах последовательности мишени Тогда для проведения расчета вероятности встраивания мобильного элемента нужно использовать результаты поиска по всевозможным мишеням вида NGCTNAGCN, содержащим усеченные последовательности, и таким образом моделировать ситуацию концевого несоответствия На основании проведенного расчета для вероятности встретить данную 9-нуклеотидную последовательность с учетом возможных 1-2 нуклеотидных отклонений была рассчитана функция вероятности встраивания транспозо-на в новое положение

На рис 8 показан график распределения функции вероятности встраивания транс-позона ТпЮ в новое положение на бактериальной хромосоме Для определения функции вероятности встраивания транспозона было использовано распределение 1,9- нуклеотидных мишеней в полной последовательности генома Escherichia coli Транспозиция мобильного элемента в условиях SOS-индукции дозами УФ-света свыше 25 Дж/м2 отсутствует с детектируемой частотой, поэтому вероятность встраивания ТпЮ была нормирована по минимальному значению на Ю-10 при помощи функции ехр(и-9)2, где п -число нукпеотидов в мишени По приведенной диаграмме была определена наиболее вероятная мишень CGCTCAGC С учетом экспериментальных данных по индукции точной эксцизии транспозона ТпЮ при облучении УФ-светом и ускоренными ионами с разной ЛПЭ мишень должна быть комплементарно дополнена справа нуклеотидом гуанин Тогда данная последовательность будет являться палиндромной, что обеспечит точную эксцизию транспозона при облучении без смещения рамки считывания донорного гена Таким образом, проведенное статистическое моделирование дополняет результаты секвенирования активных локусов бактериальной хромосомы, где может происходить транспозиция мобильного элемента ТпЮ и одновременно дает основания для объяснения высокоэффективной точной эксцизии данного мобильного элемента при облучении ускоренными ионами *Не с ЛПЭ от 20 до 50 кэВ/мкм.

Число нуклеотндов

Рис. 8 График распределение функции вероятности встраивания транспозона ТпЮ в новое положение в форме пространственной диаграммы. По вертикальной оси отложена вероятность встраивания транспозона. В горизонтальной плоскости по числу нуклеотидов распределены возможные мишени для встраивания

SOS-индуцированный механизм точной эксиизии ТпЮ

При облучении УФ-светом в молекуле ДНК возникают первичные повреждения, преимущественно тиминовые димеры Возникновение повреждений запускает комплекс реакций SOS-cneen и эксцизионную репарацию ДНК, что приводит к формированию од-нонитевых шпилек в последовательности транспозона и завершается точной эксцизией элемента Именно такая схема была предложена для точной эксцизии ТпЮ при облучении небольшими дозами УФ-света (A Chan and R Nagel, 1997), и можно полагать, что во всем диапазоне доз, где может быть определена выживаемость, генетический механизм не меняется Точная эксцизия мобильного элемента может быть индуцирована плотноионизи-рующим излучением у-излучением (Д В Журавель и AB Борейко, 2002 а, Ь) и ускоренными ионами (ДВ Журавель, 2004) В этом случае первичные события в облученной клетке несколько иные Например, прямое попадание заряженной частицы (наложение трека на область, в которой локализована хромосома Е. coli) вызывает множественные однонитевые и двунитевые разрывы ДНК, что приводит к летальному для клетки исходу Кроме того, прохождение заряженной частицы в конденсированной среде вызывает эффект образования «шубы», состоящей из вторичных треков б-электронов Вторичные 5-электроны могут формировать кластерные повреждения ДНК (Е А Красавин, и С Козубек, 1991), инициируют SOS-индукцию и являются причиной SOS-мутагенеза, к которому относится точная эксцизия транспозона

Согласно классической модели Эгнера, разработанной для спонтанной эксцизии транспозона Тп5 молекулярный механизм реализации события эксцизии является гесА-зависимым и не коррелирует с перемещением транспозона в новое положение Частота точной эксцизии по репликативному механизму составляет 10"8, что соответствует частоте спонтанных делеций между прямыми обратными повторами (С Egner and DE Berg, 1980) Классическая схема была усовершенствована на основании исследований влияния мутаций в SO.S'-индуцируемых генах и трансформировалась в молекулярную модель точной эксцизии ТпЮ по репарационно-репликативной модели шпилек (R Nagel and A Chan, 2003), которая, однако не раскрывает пока эффекта индукции точной эксцизии при действии излучений с разными физическими характеристками и не объясняет характерных особенностей «тонкой» структуры концевых последовательностей транспозона

Рассмотрим модель механизма SOS-индуцированной точной эксцизии транспозона ТпЮ, которая описывает реализацию этого события через возникновение первичных повреждений ДНК Инсерционные последовательности, инвертировано фланкирующие элемент содержат близкорасположенные прямые 10-нуклеотидные повторы и заканчиваются двумя палиндромами После облучения в тех клетках, где первичные повреждения распо-

ложены на последовательности элемента, образуются ступенчатые однонитевые разрывы за счет Л'(9.У-механизма ошибочного спаривания, и далее путем Лес5С£>-рекомбинации происходит удаление транспозона за исключением небольшого фрагмента Этот фрагмент содержит однонитевой разрыв или остаточное повреждение, служащее субстратом для индуктора эксцизионной репарации - белка RecA В процессе эксцизионной репарации одной нити, на второй нити формируется противоположная шпилька, которая не блокирует репликациоиного раунда и будет удалена предрепликативно системой мисматч репарации ДНК

Данная модель позволяет избежать неопределенности, которая имеет место в схемах с «репликативным глазком», имеющим размер более 10 тысяч оснований ДНК, и не требует свойства палиндромности от всего инсерционного элемента, фланкирующего последовательность транспозона Согласно представленной модели точная эксцизия должна реализоваться более эффективно при наличии кластерных повреждений, которые по стохастическому принципу локализованы в определенной области, а не равновероятно распределены по всей бактериальной хромосоме Это замечание подтверждается сравнением экспериментальных данных по индукции точной эксцизии УФ-светом и ускоренными ионами с разной ЛПЭ Выживаемость К coli при облучении дозой УФ-света 130 Дж/м2 падает до 0,2 %, при этом точная эксцизия происходит с частотой 1,7-10** При эквивалентной дозе ускоренных ионов *Не относительная частота точной эксцизии составляет 410"4 (Д В Журавель и Е Ю Козлова, 2003)

Современные биохимические исследования привели к открытию нового фермента - транспозазы и был предложен /ave-зависимый механизм транспозиции (В Ason and W S Reznikoff, 2002) По отношению к донорному сайту транспозиция также может являться точной эксцизией, независимой от классической модели Эгнера, построенной по репликативному способу Поэтому интервал частот точной эксцизии Ю10—10~R в отсутствии диссипативных факторов может быть полярно разделен на нижний, при котором точная эксцизия происходит через транспозицию элемента, и верхний, при котором точная эксцизия приводит к потере элемента Факт, что колонии клеток, в которых произошла точная эксцизия ТпЮ после облучения УФ-светом дозой свыше 25 Дж/м2 и ускоренными ионами на всем диапазоне доз не проявляют резистентности к тетрациклину, позволяет сделать вывод о том, что транспозиция в условиях SOS-ответа супрессируется точной эксцизией по SOS-индуктивному механизму с потерей элемента.

Выводы

1 Изучена радиочувствительность бактерий Escherichia coli и репарационно-дефицитных мутантов recA, recN, гесО, и recQ при действии излучений с разными физическими характеристиками Показано, что мутация гесА при облучении ультрафиолетовым светом и у-квантами в ряду рассмотренных гес-мутаций оказывает наибольшее влияние на чувствительность клеток Зависимость радиочувствительности клеток дикого типа от ЛПЭ излучений описывается кривой с локальным максимумом в области ~ 100 кэВ/мкм

2 Исследованы закономерности эксцизии транспозонов ТпЮ и 7л/ у клеток дикого типа Показано, что УФ-свегг и у-излучение являются эффективными индукторами эксцизии транспозонов

3 Изучено влияние мутаций гесА и recN на частоту эксцизии ТпЮ при у- и УФ-облучении клеток Показано, что в обоих случаях указанные мутации подавляют экс-цизию транспозона, в клетках с гесА мутацией дозовая зависимость частоты эксцизии не выявлена.

4 В широком диапазоне ЛПЭ излучений (0,3-200 кэВ/мкм) исследованы закономерности точной эксцизии транспозона ТпЮ Выявлено, что с ростом ЛПЭ частиц эффективность точной эксцизии возрастает, в диапазоне 20-40 кэВ/мкм, достигает максимума, а при дальнейшем увеличении ЛПЭ - снижается

5 Получены значения относительной биологической эффективности тяжелых ускоренных частиц по критерию летального действия и точной эксцизии ТпЮ Максимальные значения ОБЭ излучений составили 1,9 ± 0,5 и 2,4 ± 0,6 соответственно

6 Проведено статистическое моделирование встраивания транспозона ТпЮ и построено распределение вероятности встраивания Найдена наиболее вероятная мишень CGCTCAGC.

7 Предложена молекулярная модель, описывающая ДО5-индуцированную точную экс-цизию транспозона.

Список работ

1 Журавель Д В Закономерности индукции эксцизии транспозона ТпЮ у гес-мутантов бактерий Е. coli у-излучением 137Cs Тезисы докладов V научной конференции молодых ученых и специалистов ОИЯИ, Дубна 2001, с 119

2 Журавель Д В Индукция генетических перестановок в бактериях Вестник Государственного университета «Дубна», 2001, № 5, с 33-37

3 Журавель Д В , А В Борейко Закономерности индукции эксцизии транспозона ТпЮ у rec-мутантов бактерий Е. coli у-излучением l37Cs Аннотации докладов П международ-

ного симпозиума «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии», ОИЯИ Дубна, 2001, с 141

4 Журавель Д В , А В Борейко Закономерности индукции эксцизии транспозона ТпЮ у rec-мутантов бактерий Е. соГ\ у-излучением l37Cs Тезисы докладов на IV Съезде по радиационным исследованиям, Москва, 2001, с 47

5 Журавель ДВ История открытия мобильных элементов Вестник государственного университета «Дубна», 2002, № 6, с 50-54

6 Журавель Д В , А В Борейко Индукция эксцизии транспозона ТпЮ излучением с разными физическими характеристиками Тезисы докладов VI научной конференции молодых ученых и специалистов ОИЯИ, Дубна 2002, с 255-256

7 Козлова Е Ю , А В Можаева, Д В Журавель .WW-индукция эксцизии транспозонов в бактериях Тезисы докладов VI научной конференции молодых ученых и специалистов ОИЯИ, Дубна 2002, с 256

8 Zhuravel D V Induction of the ТпЮ precise excision after accelerated heavy ions irradiation Тезисы международной конференции «Генетические последствия чрезвычайных радиационных ситуаций», 2002, с 34

9 Журавель Д В , А В Борейко Закономерности индукции эксцизии транспозона ТпЮ у ret-мутантов бактерий Е. coli у-излучением 137Cs Сборник докладов II международного симпозиума «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии», ОИЯИ Дубна, 2002, с 125-129

10 Журавель ДВ, AB Борейко Закономерности эксцизии транспозона ТпЮ у гес-мутантов бактерий Е. coli при у-облучении Журнал РАН, серия «Радиационная биология Радиоэкология», 2002, т 42, № 6, с 636-638

11 Журавель Д В Точная эксцизия транспозона ТпЮ в клетках Е. coli при облучении ускоренными ионами с разной ЛПЭ Тезисы докладов VII научной конференции молодых ученых и специалистов ОИЯИ, Дубна 2003, с 249-252

12 Козлова ЕЮ, AB Можаева, Д В Журавель УФ-индукция точной эксцизии транспозонов ТпЮ и Тп1 в бактериях К coli. Тезисы докладов VII научной конференции молодых ученых и специалистов ОИЯИ, Дубна 2003, с 257-260

13 Журавель ДВ , ЕЮ Козлова Индукция эксцизии транспозонов излучениями с разными физическими характеристиками Вестник государственного университета «Дубна», 2003, № 8, с 27-33

14 Журавель Д В Индукция точной эксцизии транспозона ТпЮ в клетках Е coli при облучении ускоренными ионами с разной ЛПЭ Препринт ОИЯИ, Дубна, Р19-2003-35, с 1-7

15 Журавель Д В Индукция точной эксцизии транспозона ТпЮ в клетках Е. coli при облучении ускоренными ионами с разной линейной передачей энергии Журнал РАН, серия «Радиационная биология Радиоэкология», 2004, т 44, №2, с 138-141

16 Журавель ДВ , ЕЮ Козлова Индукция эксцизии транспозонов излучениями с разными физическими характеристиками Вестник молодых ученых С-Петербург, в печати

17 Zhuravel D V Structural mutations induction by accelerated heavy ions in Escherichia coli• transposon ТпЮ precise excision Proceedings of the П International school "Accelerators in biology and medicine", Poznan, in print

Получено 4 ноября 2004 г.

I

I

I,

/

I f

t

i

I

u

s

t

1

I

с

•-1303 65

РНБ Русский фонд

2006-4 2243-

Макет Н. А. Киселевой

Подписано в печать 10.11.2004. Формат 60 х 90/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Уел печ. л. 1,25. Уч.-изд. л. 1,46 Тираж 100 экз. Заказ № 54655.

Издательский отдел Объединенного института ядерных исследований 141980, г. Дубна, Московская обл., ул. Жолио-Кюри, 6. E-mail: publish@pds.jinr ru www.jinr.ru/publish/

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Журавель, Даниил Валерьевич

Список условных сокращений

Введение

Глава I. Обзор литературы «Мобильные элементы»

1.1. История открытия мобильных элементов

1.2. Мобильные элементы в бактериях

1.2.1. Инсерционные последовательности

1.2.2. Транспозоны

1.2.2.1. Транспозоны класса I

1.2.2.2. Транспозоны класса II

1.2.3. ^О^-индукция эксцизии транспозонов

Глава II. Методы исследования ч

2.1. Источники ионизирующего излучения

2.1.1. Гамма-установка «Свет»

2.1.2. Установка «Геном».

2.2. Методы работы с бактериальными клетками

2.2.1. Питательные среды

2.2.2. Бактериальные штаммы

2.2.3. Определение радиочувствительности

2.2.4. Индукция транслокационных процессов

Глава III. Результаты исследования

3.1. Биокинетика клеток Е. coli, несущих гес-мутации

3.2. Радиочувствительность /*<?омутантов Е. coli к у-излучению

3.3. Спонтанная эксцизия транспозонов Тп1 и ТпЮ

3.4. Закономерности у-индуцированной эксцизии ТпЮ 54 3.4.1. Влияние мутаций гесЛ и recN на у-индуцированную эксцизию ТпЮ

3.4.2. Влияние условий инкубации Е. соИ

3.5. Точная эксцизия транспозонов Тп1 и ТпЮ при облучении 58 УФ-светом

3.6. Индукция точной эксцизии транспозона 7я/0 при облучении 62 ускоренными ионами с разной ЛПЭ

3.7. Статистическое моделирование встраивания ТпЮ

Глава IV. Обсуждение основных результатов ^ исследования

Выводы

Признательность

Введение Диссертация по биологии, на тему "Закономерности эксцизии транспозонов при действии излучений с разными физическими характеристиками"

Актуальность исследования,

Изучение проблемы индуцированного мутагенеза у прокариот при действии ионизирующих излучений служит необходимым фундаментом для интерпретации сложных механизмов, лежащих в основе мутационных процессов у высших организмов. С учетом этого, исследования закономерностей и механизмов мутагенного действия излучений с разной линейной передачей энергии (ЛПЭ) на бактериальные клетки представляются весьма актуальными (Е.А. Красавин и С. Козубек, 1991). Воздействие излучения индуцирует в » бактериальных клетках Escherichia coli ряд процессов, сопряженных с функционированием Л'ОЛ^-системы ответа на повреждающее воздействие: индукцию некоторых профагов и колицинов, ^(7Л-репарацию и ЗОЛ-мутагенез. При действии на клетки ДНК-повреждающих факторов репликация ДНК происходит с большим количеством, ошибок, вследствие снижения корректорских функций ДНК-полимеразы и, следовательно, становится причиной возникновения ^ОЯ-зависимых мутаций.

К числу наименее изученных вопросов радиационной генетики прокариот относятся исследования закономерностей возникновения; структурных мутаций: делеций, инсерций, и транслокаций. Это связано как с методическими трудностями выявления таких изменений * генетических структур, так и с относительно низкой частотой (по сравнению с генными мутациями) образования структурных мутаций. Закономерности индукции структурных мутаций у клеток прокариот излучениями? с высокой ЛПЭ практически не изучены. В клетках Е. coli структурные мутации с высокой частотой возникают при транспозиции мобильных элементов. Транспозиция является специфичным SOS-му тагенным процессом; который индуцируется химическими мутагенами, ультрафиолетовым светом, а также ионизирующей радиацией.

Показано, что точная эксцизия транспозонов является ЯОЯ-индуцибельным процессом, который происходит, по «мишенному механизму». Стрессовые состояния бактериальной клетки, индуцирующие ^OS-репарацию ДНК и мутагенез, прямо влияют на частоту транспозиции мобильных элементов: Корреляция; SOS-мутагенеза и активности мобильных элементов позволила разработать оригинальный подход к изучению индуцибельных систем репарации ДНК и мутационного процесса у прокариот с использованием генетических систем, сконструированных на основе транспозонов (Г.И. Алешкин и др., 1983).

Такой подход позволил определить влияние ключевых генов ÄAS-мутагенеза на индукцию точной эксцизии транспозона ТпЮ при действии УФ-излучения. Показано, что точная эксцизия находится под контролем ÄAS-индуцибельных генов рекомбинационной репарации ДНК: ruvw recN (R. Nagel et.al., 1994; A. Chan et.al;, 1994). При облучении клеток, несущих мутацию гесА эффективность У Ф-индуци-рованной точной эксцизии резко снижается, так как ген является ключевым в реализации ¿'О^-ответа (G.I. Aleshkin et. al., 1998). Оказалось, что точная эксцизия, ТпЮ в системе ¿"О^-мутабильности происходит без участия транспозазы, поэтому консервативный механизм точной эксцизии в процессе транспозиции, которая происходит через внесение ступенчатых двунитевых разрывов не позволял определить закономерности эксцизии при индуцирующем воздействии УФ-света. Было продемонстрировано участие гесВС и recF-зависимых рекомбинационных процессов в индукции точной эксцизии транспозона ТпЮ (R. Nagel, 1999). Точная эксцизия транспозона, происходящая в условиях индукции Л'ОЛ'-ответа является классическим делеционным процессом, который? происходит при участии небольших па-линдромных последовательностей. Аналогичные закономерности были обнаружены в активных локусах с высоким выходом структурных перестроек, и в: этом смысле точная эксцизия транспозона может служить модельной системой для определения закономерностей формирования делеций.

В экспериментах с ускоренными тяжелыми ионами (Е.А.Красавин и С. Козубек, 1991) получен обширный материал по индукции прямых и обратных генных мутаций излучениями в широком диапазоне ЛПЭ. Бьшо показано, что зависимость частоты мутирования клеток от дозы у-квантов и тяжелых заряженных частиц описывается линейно-квадратичной функцией, для которой; квадратичная компонента зависимости определяется эффективностью экспрессии генов, контролирующих SOS-ответ. Относительная биологическая эффективность (ОБЭ) частиц по критерию индукции мутаций увеличивается с ростом ЛПЭ и зависимость ОБЭ (ЛПЭ) описывается кривой с локальным максимумом при ЛПЭ « 20 кэВ/мкм. Различие в положениях максимумов по критерию летального (~ 80-100 кэВ/мкм) и мутагенного эффектов облучения определяется разным характером событий, участвующих в формировании этих эффектов. Летальный эффект вызван образованием двунитевых разрывов (ДР) ДНК, а мутагенный эффект - кластерными однони-тевыми разрывами ДНК.

В отличие от генных мутаций, структурные мутации у клеток прокариот формируются в результате возникновения ДР ДНК. Соотношение выходов прямых двунитевых разрывов, как результат разрыва опозитных нитей при прохождении частицы и энзиматических ДР ДНК, возникающих в процессе Л'О^-репарации может обуславливать специфику образования мутаций делеционного типа при действии излучений с разной ЛПЭ. G учетом этих обстоятельств исследование эксцизии транспозонов при действии излучений широкого диапазона ЛПЭ может дать важную информацию об особенностях индукции структурных мутаций у бактерий ионизирующим излучением с разными физическими характеристиками.

Цель и основные задачи исследования

Целью настоящего исследования является изучение закономерностей и механизмов ^О^-индуцибельной эксцизии транспозонов в клетках бактерии Escherichia coli при действии излучений с разными физическими характеристиками: ультрафиолетового света, у-излучения, и ускоренных тяжелых ионов с разной ЛПЭ. Для достижения поставленной : цели необходимо решить следующие основные задачи:

1. Исследовать характер индукции точной эксцизии транспозонов разных классов при облучении УФ-светом и определить роль структуры последовательности элемента в этом процессе.

2. Используя клетки, несущие мутации генов гес-семейства, определить зависимость индуцированной эксцизии транспозона 7и/0 от репарационного генотипа бактерий.

3. Изучить закономерности индукции точной эксцизии транспозона ТпЮ при облучении ускоренными ионами, в диапазоне ЛПЭ от 20 до 200кэВ/мкм в биологическом образце.

4. Оценить генетическую эффективность ускоренных ионов по критерию точной эксцизии ТпЮ и по критерию летального действия на клетки Escherichia coli.

5. Провести статистическое моделирование встраивания транспозона в новое положение и предложить механизм SOS-индуцибельной точной эксцизии транспозона при действии излучений разного качества.

Научная новизна

Исследования закономерностей ЗОЯ-мутабильности клеток Escherichia coli при действии излучений с разными физическими характеристиками, с использованием в качестве тест-системы мобильные элементы позволяют предложить новый перспективный подход для изучения механизма возникновения структурных мутаций у бактерий. В настоящей работе впервые определены закономерности эксцизии транспозона Тл/0 при действии у-излучения. Показано, что у-индуцированная экс-цизия является SOS-мутагенным процессом, который контролируется генами гес-семейства. Впервые показана возможность индукции точной эксцизии транспозона ТпЮ ускоренными многозарядными ионами с разной ЛПЭ, изучены закономерности этого процесса. Определены значения относительной биологической и генетической эффективности ускоренных ионов 4Не и 12С по критериям летального действия и точной эксцизии транспозона Тп 10. Проведен оригинальный статистический.расчет мишенного встраивания транспозона Тп10 в новое положение, исходя из функции вероятности распределения мишеней в геноме Escherichia coli, и построена модель, описывающая механизм точной эксцизии транспозона; ТпЮ, как Л'О^-индуцируемого мишенного делеционного явления:

Научно-практическая значимость работы

При решении ряда научно-практических задач радиационной генетики весьма важно иметь информацию не только о суммарном выходе различного рода мутаций в облученных клетках^ но исключительный интерес представляют сравнительные данные о частоте образования как генных, так и структурных мутаций. Эти задачи обусловлены необходимостью решения вопросов нормирования лучевых нагрузок от излучения разного качества на персонал, работающий в смешанных полях ионизирующих излучений, проблемам обеспечения радиационной безопасности экипажей при длительных космических полетах, другим важными практическим вопросами. Полученные данные представляют несомненный научный интерес при интерпретации механизмов мутагенного влияния излучений широкого диапазона ЛПЭ на клетки с разным генотипом. Результаты исследования могут быть использованы при разработке нормативных документов, связанных с обеспечением радиационной безопасности лиц, находящихся в условиях многокомпонентного радиационного воздействия.

Положения и результаты, выносимые на защиту:

1. закономерности радиочувствительности бактерий Escherichia coli при действии излучений широкого диапазона ЛПЭ;

2. закономерности у-индуцированной эксцизии транспозона ТпЮ в клетках Escherichia coli с различным репарационным генотипом;

3. дозовые зависимости точной эксцизии транспозона ТпЮ при ультрафиолетовом облучении клеток с мутациями в разных локусах генов re с;

4. результаты исследования закономерностей точной эксцизии ТпЮ при облучении ускоренными тяжелыми ионами с разной ЛПЭ и определение относительной биологической эффективности ускоренных ионов по критерию летального действия и точной эксцизии ТпЮ\

5. статистическое моделирование мишенного встраивания транспозона и модель точной эксцизии ТпЮ при облучении ускоренными ионами.

Заключение Диссертация по теме "Радиобиология", Журавель, Даниил Валерьевич

Выводы

11 Изучена радиочувствительность бактерий Escherichia coli и репарацион-но-дефицитных мутантов recA, recN, гесО, и recQ при действии излучений с разными физическими характеристиками. Показано, что мутация гесА при облучении ультрафиолетовым светом и у-квантами в ряду рассмотренных гее-мутаций оказывает наибольшее влияние на чувствительность клеток. Зависимость радиочувствительности клеток дикого типа от ЛПЭ излучений описывается кривой с локальным максимумом в области ~ 100 кэВ/мкм.

2. Исследованы закономерности эксцизии транспозонов ТпЮ и Тп1 у клеток дикого типа. Показано, что УФ-свет и у-излучение являются эффективными индукторами эксцизии транспозонов. При у-облучении относительная > частота эксцизии транспозона ТпЮ зависит от условий предрадиационного культивирования: в богатой питательной среде эксцизия транспозона осуществляется более эффективно, по сравнению с минимальной средой.

3. Изучено влияние мутаций гесА и recN на частоту эксцизии ТпЮ при у- и УФ-облучении клеток. Показано, что в обоих случаях указанные мутации подавляют эксцизию транспозона, в клетках с п?сЛ мутацией дозовая зависимость частоты эксцизии не выявляется.

41 В широком диапазоне ЛПЭ излучений (0,3-200 кэВ/мкм) исследованы закономерности точной эксцизии транспозона ТпЮ. Выявлено, что с ростом ЛПЭ частиц эффективность точной эксцизии возрастает, в диапазоне 20-40 кэВ/мкм, достигает максимума, а при дальнейшем увеличении ЛПЭ - снижается.

5. Получены значения относительной биологической эффективности тяжелых ускоренных частиц по критерию летального действия и точной эксцизии ТпЮ. Максимальные значения ОБЭ излучений составили 1,9 ± 0,5 и 2,4 ± 0,6 соответственно.

6. Проведено статистическое моделирование встраивания, транспозона ТпЮ и построено распределение вероятности встраивания. Найдена наиболее вероятная мишень: CGCTCAGC.

7. Предложена молекулярная модель, описывающая; индуцированную точную эксцизию транспозона:

Признательность

В заключении хотел бы выразить глубокую признательность за любезное предоставление штаммов Escherichia coli Бактериальному музею Отделения молекулярной и радиационной биофизики Петербургского института ядерной физики РАН, а также лично д.б.н. Г.Н. Алешкину, Институт иммунологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалея.

Выражаю искреннюю благодарность своим наставникам: А.П. Булаху и к.б.н. A.B. Борейко за консультативную помощь при проведении экспериментов с ускоренными тяжелыми ионами на базовых установках Объединенного института ядерных исследований, а также студенткам Университета «Дубна» A.B. Можаевой и Е.Ю. Козловой, как соавторам и коллегам по проведению некоторых экспериментов с УФ-излучением. Все результаты проходили первую апробацию через Научную конференцию молодых ученых и специалистов ОИЯИ, что было бы невозможным без деятельного участия организаторов - членов совета ОМУС.

Выражаю свою признательность за консультацию и редакторские замечания старшим коллегам по кафедре физики Университета «Дубна» проф. С.А. Хорозову и проф. И.М. Граменицкому. Finally, I would like to thank Dr R. Nagel (CEFYBO, Buenos Aires, Argentina) for providing author's paperscripts, which were very useful in the section of the discussions.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Журавель, Даниил Валерьевич, Дубна

1. Алешкин Г.И., Маркова А.П., Астафьева И.П. Индукция правильного вырезания транспозонов Тп1 и ТпЮ УФ-светом и 4-нитрохинолин-Ы-оксидом в клетках Е. coli. Мол. Ген. Микробиол. и Вирусол., 1983, т. 8, с. 23-31.

2. Булах А.П., Борейко A.B. Закономерности индукции делеционных мутаций у клеток Е. coli при действии у-излучения. Сообщения ОИЯИ, Р19-2000-109. Дубна, 2000, с. 1-14.

3. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика: практический курс. М: Фаир-пресс, 1999, с. 546-548.

4. Воложанцев Н.В., Данилевич В.Н., Смирнов С.П., Голуб Е.И. Встраивание транспозона устойчивости к ампицилину в хромосому Е. coli Kl2 и плазмиды. Генетика, 1979, т. 15, № 12, с. 209-214:

5. Гикал Б.Н., Гульбекян Г.Г., Козлов С.И., Оганесян Р.Ц. Опыт эксплуатации и совершенствования циклотрона У 200. Сообщения ОИЯИ, 9-83-311. Дубна, 1983, с. 1-12.

6. Гладилкин А.Н., Игнатов И.В., Кузин P.A., Попов В.И., Юргов В.В., Шафир-кин A.B. Гамма-установки для радиобиологических иследований. М.: Энерго-атомиздат, 1981, с. 25-28.

7. Гольдин Л.Л., Игошин Ф.Ф., Козел С.М., Можаев В.В., Ногинова Л.В., Самарский Ю.А., Францессон A.B. Лабораторные занятия по физике. М.: Наука, 1983, с. 18.

8. Журавель Д.В. Индукция генетических перестановок в бактериях. Вестн. гос. унив. «Дубна», 2002 а, № 5, с. 33-37.

9. Журавель Д.В. История открытия мобильных элементов. Вестн. гос. унив. «Дубна», 2002 Ь, № 6, с. 50-54.

10. Журавель Д.В., Борейко A.B. Индукция точной эксцизии ТпЮ при у-облучении137

11. Cs. Сборник докладов «II Международный симпозиум памяти академика Н.М. Сисакяна». Дубна, 2002 а, т. 1, с. 125-129.

12. Список литературы составлен в алфавитном порядке по авторам статей, монографий и т.д. со сквозной нумерацией.

13. Журавель Д.В., Борейко A.B. Закономерности эксцизии транспозона ТпЮ в клетках гес-мутантов Е. coli при у-облучении. Радиобиология, 2002 Ь, т. 42, № 5, с. 488-491.

14. Журавель Д.В., Козлова Е.Ю. Индукция эксцизии транспозонов излучениями с разными физическими характеристиками. Вест. гос. унив. «Дубна», 2003, №8, с. 27-33.

15. Журавель Д.В. Индукция точной эксцизии ТпЮ в клеткак Е. coli при облучении ускоренными ионами с разной. ЛПЭ. Препринт ОИЯИ, Р19-2003-35, Дубна, 2003, с. 1-7.

16. Журавель Д.В; Индукция точной эксцизии ТпЮ в клетках Е. coli при облучении ускоренными ионами с разной. ЛПЭ. Радиобиология, 2004, т. 44, №2, с. 138-141.

17. Захаров И.А., Кожин С.А., Кожина Т.Н., Федорова И.В. Сборник методик по генетике дрожжей-сахаромицетов. Л.: Наука, 1984, с. 10.

18. Измайлов З.Ф., Смирнов С.П., Тарасов В.А. Характеристика het мутантов Е. coli, вызывающих увеличение частоты транспозиции Tnl. Генетика, 1986, .т. 22, № 5, с. 777-786.

19. Козлова Е.Ю., Можаева A.B., Журавель Д.В: УФ-индукция точной эксцизии транспозонов ТпЮ и Tnl в бактериях Е. coli. Труды VII научной конференции молодых ученых и специалистов ОИЯИ, 2003, с. 257-260.

20. Козубек С. Закономерности и механизмы мутагенного действия ионизирующих излучений с разной линейной передачей энергии на клетки прокариот. Дисс. на соиск. уч. ст. докт. биол. наук. Дубна, 1985, с. 14-19.

21. Комова О.В. Закономерности ^О^-индукции в клетках бактерий Escherichia coli при действии ультрафиолетового света и ионизирующих излучений с разными физическими характеристиками. Дисс. на соиск. уч. ст. канд. биол. наук, Дубна, 2002, с. 38.

22. Красавин Е.А. Механизмы действия ионизирующих излучений с разной линейной передачей энергии на клетки. Дисс. на соиск. уч. ст. докт. биол. наук. Дубна, 1985, с. 40-44.

23. Красавин Е.А. Проблема ОБЭ и репарация ДНК. М. Энергоатомиздат 1989, с. 47-59.

24. Красавин Е.А., Козубек С. Мутагенное действие излучений с разной ЛПЭ. М. Энергоатомиздат, 1991, с. 5.

25. Кубанешвили М.Г., Смирнов С.П., Крашенникова Л.В., Тарасов В.А. Влияние мутаций в recB, recC, sbcB, и recF генах, контролирующих гомологичную рекомбинацию в клетках Е. coli на транспозицию Tnl. Мол. Ген., Микробиол. и Вирусол., 1986, т. 4, с. 31-34.

26. Маниатис Т., Фрич Т., Сэмбрук Дж. Методы молекулярной инженерии. Молекулярное клонирование. М. Мир, 1984, с. 389—392.

27. Смирнов С.П., Тарасов В.А. Индукция транслокации транспозона 7я7 в облученных УФ-светом клетках Е. coli. Генетика, 1981, т. 17, № 3, с. 420-423;

28. Элизбарашвили Д.А., Смирнов С.П., Тарасов В.А. Транслокация транспозона Tnl в Е. coli в процессе половой репродукции. Мол. Ген., Микробиол. и Вирусол., 1985, т. 4, с. 35-39.

29. Aleshkin G.I., Kadzhaev К.V., Markov А.Р. High and low UV-dose responses in SOS-induction of the precise excision of transposons Tnl, Tn5, and TnlO in E. coli. Mutat. Res., 1998, v. 401, p. 179-191:

30. Albertini A.M., Hofer M;, Calos M.P., Miller J.H. On the formation of spontaneous deletion: the importance of short sequence homologies in the generation of large deletions. Cell, 1982, v. 29, № 2, p. 319-328.

31. Arthur A., Nimmo E., Hettle S., Sherratt D. Transposition and transposition immunity of transposon Tn3 derivatives having different ends. EMBO J., 1984, v. 3, №8, p. 1723-1729.

32. AsonB., Reznikoff W.S. Mutation analysis of the base flipping event found in Tn5 transposition. J. Biol. Chem., 2002, v. 277, № 13, 11284-11291.

33. Balbinder E., Mac Vean C., Williams R.E. Overlapping direct repeats stimulate deletions in specially designed derivatives of plasmid pBR325 in Escherichia coli. Mut. Res., 1989, v. 214, №2, p. 233-252.

34. Beacham I.R., Garrett S. Transposon mutagenesis: some factors influencing the frequency of translocation of TnlO to the bacterial chromosome. FEMS Microbiol. Lett., 1980, v. 6, p. 341-346.

35. Berg D.E. Mechanisms of transposition in bacteria. Basic Life Science, 1985, v. 30, p. 33-44.

36. Berg C.M., and Curtiss R. Transposition deriviatives of an Hfr strain of Escherichia coli K-12. Genetics, 1967, v. 56, p. 503-525.

37. Bhattacharya R., Beck D.J. Survival and SOS induction in cisplatin-treated Escherichia coli deficient in Pol II, RecBCDand RecFOR functions. DNA Repair (Amst), 2002, v. 1, № 11, p. 955-966.

38. Bi X., Liu L. DNA rearrangement mediated by inverted repeats. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, v. 93, p. 819-823.

39. Bierne H., Seigneur M., Ehrlich S.D., MichelB. uvrD mutations enhance tandem repeat deletions in the E. coli chromosome via SOS-induction of the RecF recombination pathway. MoL Microbiol;, 1997, v. 26, № 3, p. 557-567.

40. Birkenbihl R:P., Vielmetter W. Complete maps of IS 1, IS2, IS3, IS4, IS5, IS30 and IS150 locations inE. coli K12. Mol. Gen. Genetics, 1989- v. 220, № 1, p. 147-53.

41. Bishop R., Sherratt D. Transposon Tnl intra-molecular transposition. Mol. Gen. Genet., 1984, v. 196, №1, p. 117-122.

42. Brenna-Valle M., Serment-Guerrero J. SOS induction by gamma-radiation in E. coli strains defective in repair and/or recombination mechanisms. Mutagenesis, 1998, v. 13, №6, p. 637-64193

43. Bridges B.A., Law J., and Munson R:J. Mutagenesis in Escherichia coli: evidence for common pathway for mutagenesis by ultraviolet light and ionizing radiation. Mol. Gen. Genet., 1968, v. 103, p. 266-268.

44. Bridges B.A., and Munson R.J. Genetic radiation damage and its repair in Escherichia coli. Curr. Top. in Rad. Biol., New York, 1968, v. 4, p. 95-188.

45. Bridges B.A., Woodgate R. Mutagenic repair in E. coli: products of the recA gene and of the umuD and umuC genes act at different steps in UV-induced mutagenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, v. 82, p. 4193-4197.

46. Cameron R.K., Ulycznyj P.I., DuBow M.S. Mu transposase-stimulated illegitimate recombination of Tn3kan- and IS101-containing plasmids. Res. Microbiol., 1995, v. 146, № 8, p. 601-616.

47. Chan A., Levy M.S., Nagel R. RecN SOS gene and induced precise excision of TnlO in E. coli. Mut. Res., 1994, v. 325, № 2-3, p. 75-79.

48. Chan A., Nagel R., Involvement of recA and recF in the induced precise excision of TnlO in Escherichia coli. Mut. Res., 1997, v. 381, p. 111-115.

49. DouganG., SherrattD. The transposon Tnl as a probe for studying ColEl structure and function. Mol. Gen. Genet., 1977, v. 151, № 2, p. 151-160.

50. Eichenbaum Z., Livneh Z. Intermolecular transposition of IS 10 causes coupled homologous recombination at the transposition site. Genetics, 1995, v. 140. №3. p. 861-874.

51. Egner C., BergD.E. Excision of transposon Tn5 is dependent on the inverted repeats but not on the transposase function of Tn5. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1981, v. 78, p. 459-463.

52. Feiss M., Campbell A. Duplication of the bacteriophage lambda cohesive end site: genetic studies. J. Mol. Biol., 1974, v. 83, № 4, p. 527-540.

53. Finch P.W., Chambers P., Emmerson P.T. Identification of the E coli recN gene product as a major SOS protein. J. Bacterid., 1985, v. 164, № 2, p. 653-658.

54. Foster T.J., Lundblad V., Hanley-Way S., Hailing S.M., Kleckner N: Three TnlO-associated excision events: relationship to transposition and role of direct and inverted repeats. Cell, 1981, v. 23, №1, p. 215-227.

55. Ghosal D., Saedler H. DNA sequence of the mini-insertion /^-(i and its relation to the sequence of/52. Nature, 1978, v. 275, p. 611-617.

56. Gill R., Heffron F., Dougan G., Falkow S; Analysis of sequences transposed by complementation of two classes of transposition-deficient mutants of Tn3. J. Bacteriol., 1978, v. 136, № 2, p. 742-756.

57. Gottlieb G.S:, Fennewald M.A. UV photoaffinity labeling of Tn3 transposase-DNA • complexes: identification of DNA binding domains. Can. J; Microbiol., 1996, v. 42, № 1, p. 46-59.

58. Hanada K., Iwasaki M., Ihashi S., Ikeda H. £/wvl and UvrB suppress illegitimate recombination: synergistic action with^ RecQ helicase. Proc. Natl; Acad. Sci. USA, 2000, v. 97, № 11, p. 5989-5984.

59. Irino N., Nakayama K., Nakayama H. The recQ gene of E. coli K12: primary structure and evidence for SOS regulation. Mol. Gen. Genet., 1986, v. 205, № 2, p. 298304.

60. Johnson R.C., Reznikoff W.S. Localization of the Tn5 transposase promoter using the cycling reaction of RNA polymerase. Nucl. Acids Res., 1981, v. 9, № 8, p. 18731883.

61. Kans J;A., Casadaban M.J. Nucleotide sequences required for Tn3 transposition immunity. J. Bacteriol., 1989, v. 171, № 4, p. 1904-1914.

62. KeyeuxG., Lefranc G., Lefranc M.P. A mutagene deletion in the human IGH constant region locus involves highly homologous hot spots of recombination. Genomics, 1989, v.5, № 3, p. 431—441.

63. Kleckner N. DNA sequence analysis of TnlO insertions: origin and role of 9 bp flanking repetitions during TnlO translocation. Cell, 1979, v. 16, JM° 4, p. 711-720.

64. Kogoma A., Torrey T.A., Connaughton M. Induction of UV-resistant DNA replication in E. coli: induced stable DNA replication as an SOS function. Mol. Gen. Genet., 1979, v. 176, p. 1.

65. Kuan C-T., Liu S-K., Tessman I. Excision and transposition of Tn5 as an SOS activity in E. coli. Genetics, 1991, v. 128, p. 43-57.

66. Levy M.S., Pomposiello P., Nagel R. RecA dependent increased precise excision of TnlO in Salmonella typhimurium; Mutat. Res., 1991, v. 255, p. 95-100.

67. Levy M.S., Balbinder E., Nagel R. Effect of mutations in SOS genes on UV-induced precise excision of TnlO in Escherichia coli. Mutat. Res., 1993, v. 293, № 3, p. 241247.

68. Liu Y.H., Cheng A.J., Wang T.C. Involvement oi recF, recO, and^recR genes in UV-radiation mutagenesis of E. coli. J. Bacteriol., 1998, v. 180, № 7, p. 1766-1770.

69. Lloyd R.G., Porton M.C., Buckman C. Effect of recF, recJ, recN, recO and ruv mutations on ultraviolet survival and genetic recombination in a recD strain of Escherichia coli K12. Mol. Gen. Genet., 1988, v. 212, № 2, p. 317-324.

70. Lorenzo C.E., Howard E., Nagel R. Studies on TnlO transposition and excision in DNA repair mutants of Salmonella typhimurium. Mut. Res., 1990, v. 232, p. 99-104.

71. Lozovskaya E.R., Hartl D.L., Petrov D A. Genomic regulation of transposable elements in Drosophila. Curr. Opin: Gen. Dev., 1995, v. 5, № 6, p. 768-773.

72. Luisi-DeLuca G. Homologous: pairing of ssDNA and superhelical dsDNA catalyzed by RecO protein from E. coli. J. Bacteriol., 1995, v. 177, № 3, p. 566-572.

73. Luisi-DeLuca C., Kolodner R. Purification and characterization of the E. coli RecO protein. Renaturation of complementary ssDNA molecules catalyzed by the RecO protein. J; Mol. Biol., 1994, v. 236, № 1, p. 124-138.

74. Lundblad V., Kleckner N. Mutants of E. coliK12 which affect excision of transposon TnlO: Bas. Life Sci:, 1982, v. 20, p. 245-258.

75. LundbladiV., Kleckner N; Mismatch repair mutations of E. coli K12 enhance transposon excision; Genetics, 1985, v. 109, № 1, p. 3-19.

76. Lundblad V., Taylor A.F., Smith G.R., Kleckner N. Unusual alleles of recB and recC stimulate excision of inverted repeat transposons TnlO and Tn5. Proc. Natl. Acad; Sci; USA, 1984, v. 81, № 3, p. 824-828.

77. MacPhee D.G. The significance of deletions in spontaneous and induced mutations associated with movement of transposable DNA elements: possible implications for evolution and cancer. Mutat. Res., 1991, v. 250, p; 35-47.

78. Mazin A.V., Kuzminov A.V., Dianov G.L., Salganic R.I. Mechanisms of deletion formation in E. coli plasmids. I. Deletions mediated by long direct repeats. Mol. Gene Genet., 1991; v. 228, № 1-2, p. 153-159.

79. Mazin A.V., Kuzminov A.V., Dianov G.L., Salganic R.I. Mechanisms of deletion formation m E. coli plasmids. II. Deletions, mediated by short direct repeats. Mol. Gene Genet., 1991, v. 228, № 1-2, p. 209-214.

80. McClintock B. Nobel Prize acceptance presentation. Science, 1984, v. 226, p. 792801.

81. Mendonca V.M., Klepin H.D., Matson S.W. DNA helicases in recombination and repair: construction of a delta wvrD delta7/e/D delta recQ mutant deficient in recombination and repair. J. Bacteriol., 1995, v. 177, № 5, p. 1326-1335.

82. Michalik V. Model of DNA damage induced by radiations of various qualities. Int. J. Radiat. Biol., 1992, v. 62, № 1, p. 9-20.

83. Morrison P.T., Lovett S.T., Gilson L.E., Kolodner R. Molecular analysis of the E. coli recO gene. J. Bacteriol., 1989, v. 171, № 7, p. 3641-3649.

84. Nag D.K., DasGupta U., Adelt G., Berg D.E. AVJÖ-mediated inverse transposition: specificity and precision. Gene, 1985, v. 34, № 1, p. 17-26.

85. Nagel R., Chan A., Rosen E. Ruv and recG genes and the induced precise excision of TnlO in Escherichia coli. Mut. Res., 1994, v. 311, p. 103-109.

86. Nagel R., Chan A. RecBC and RecF recombination pathways and the induced precise excision of TnlO in E. coli. Mutat; Res., 1999, v. 433, p. 99-107.

87. Nagel R., Chan A. Enhanced Tnl0 and mini-Tn 10 precise excision in DNA replication mutants of Escherichia coli K12. Mutat. Res., 2000, v. 459, p. 275-284.

88. Nagel R., Chan A. Participation of DNA polymerase II in the increased precise excision of TnlO. DNA Repair, 2003, p. 727-735.

89. Nissley D.V., Lindh F.G., Fennewald M.A. Mutational analysis of the inverted repeats of TnS. J; Mol. Biol., 1990, v. 213, № 4, p. 671-676.

90. Nissley D.V., Lindh F., Fennewald M A. Mutations in the inverted repeats of Tn3 affect binding of transposase and transposition immunity. J. Mol. Biol., 1991, v. 218, № 2, p. 335-347.

91. Nuzhdin S.V., Pasyukova E.G., Morozova E.A., Flavell A.J. Quantitative genetic analysis of copia retrotransposon activity in inbred Drosophila melanogaster lines. Genetics, 1998, v. 150, № 2, p. 755-766.

92. Olasz F., Farkas T., Kiss J., Arini A., Arber W. Terminal inverted repeats of insertion sequence IS30 serve as targets for transposition. J. Bacterid., 1997, v. 179, № 23, p. 7551-7558.

93. Read H.A., Jaskunas S.R. Isolation of E. coli mutants containing multiple transpositions of IS sequences. Mol. Gen. Genetics, 1980, v. 180, № 1, p. 157-64.

94. Roberts D.E., Ascherman D., Kleckner N. IS 10 promotes adjacent deletions at low frequency. Genetics, 1991, v. 128, № 1, p. 37-43.

95. Roberts G.P., Paustian T.D. Bacterial genetics. Wisconins-Medison, 2000, http://www.bact.wisc.edu

96. RocaA.I., Cox M M. RecA protein: structure, function, and role in recombina-tional DNA. repair. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol., 1997, v. 56, p. 129-223.

97. Ronecker H.J., Rak B. Genetic organization of insertion element IS2 based on a revised nucleotide sequence. Gene, 1987, v. 59. № 2-3, p. 291-6.

98. Sargentini N.J., SmithK.C. Involvement of i?ec5-mediated (but not RecF-mediated) repair of DNA double-strand breaks in the y-radiation production of long deletions in E. coli. Mut. Res., 1992, v. 265, p. 83-101.

99. Sasakawa C., Berg D.E. /«S^O-mediated inverse transposition. Discrimination between the two ends of an IS element. J. Mol. Biol., 1982, v. 159, №.2, p. 257-71.

100. Sedgwick S.G., Levin A., Bailone A. Induction of recA protein synthesis in E. coli. Mol. Gen. Genet., 1978, v. 160, p. 267.

101. Selbitschka W., Arnold W., PrieferU.B., Rottschafer T., Schmidt M., Simon R., Puhler A. Characterization of recA genes and recA mutants of Rhizobium melioti and Rhizobium leguminosarum biovar viciae. Mol. Gen. Genet., 1991, v. 229, p. 86-95.

102. Shan Q:, Bork J.M., Webb B.L., Inman R.B., Cox M.M. RecA protein filaments: end-dependent dissociation from ssDNA and stabilize by RecO and RecR proteins. J. Mol. Biol., 1997, v. 265, № 5, p. 519-540.

103. Singer B.S., Weslye J. Deletion formation in bacteriophage 77. J; Mol. Biol., 1988 v. 202, №2, p. 233-243.

104. Simic D., Vucovic-Gacic B.,.Ajanovic A., Knezevic-Vukcevic J. Activation of RecA protein in recombination deficient strains of E. coli following DNA-damaging treatments. Mut. Res., 1991, v. 254, № 3, p. 255-262.

105. Stoppa-Lyonnet D., Carter P.E., Meo T., Tosi M. Clusters of intragenic Alu repeats predispose the human CI inhibitor locus to deleterious rearrengements. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, v. 87, №4, p. 1551-1555.

106. Timmons M.S., Lieb M., Deonier R.C. Recombination between IS5 elements: requirement for homology and recombination functions. Genetics, 1986, v. 113, №4, p. 797-810.

107. Tomich P.H., Clewell D. Properties of erythromycin-inducible transposon Tn917 in Streptococcus faecalis. J. Bacterid., 1980, v. 141, p. 1366.

108. Umezu K. Chi N.W., Kolodner R.D. Biochemical interactions of the E. coli RecF, RecO, and RecR proteins with 7?ec/4 protein and ssDNA binding protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, v. 90, № 9, p,3875-3879.

109. Umezu K., Nakayama H. RecQ helicase of E. coli. Characterization of the helix-unwinding activity with emphasis on the effect of single-stranded DNA-binding protein. J. Mol. Biol., 1993, v. 230, № 4, p. 1145-1150.

110. Umezu K., Nakayama K., Nakayama H: E. coli RecQ protein is a DNA helicase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, v. 87, № 14, p. 5363-5367.

111. Walker G.C. Mutagenic and inducible responses to deoxyribonucleic acid damage in E. coli. Microbiol. Rev., 1984, v. 48, p. 60-93:

112. Warren G.J., Green R.L., Comparison of physical and genetic properties of palindromic DNA sequences. J: Bacteriol;, 1985, v. 161; № 3, p. 1103-1111;

113. Way J.C., Kleckner N. Essential sites at transposon termini. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, v. 81, p. 3452-3456.

114. Weigle J.J. Induction of a mutation in a bacterial virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1953, v. 39, p. 628-636.

115. Whalen J.H., Grigliatti T.A. Molecular characterization of a retrotransposon in Drosophila melanogaster, and its relationship to other retrovirus-like mobile elements. Mol. Gene Genet., 1998, v. 260, № 5, p. 401-409.

116. Whitby M.C., Lloyd R.G. Altered SOS induction associated with mutations in recF, recO and recR.Mol. Gene Genet., 1995, v. 246, № 2, p. 174-179.

117. Willis D.K., Uhlin B.E., Amini K.S., Clark A.J. Physical mapping of the srl recA region of E. coli: analysis of TnlO generated insertions and deletions. Mol. and Gen. Genet., 1981, v. 183, № 3, p. 497-504.

118. Witkin E.M. Ultraviolet mutagenesis and inducible DNA-repair in E. coli. Bacterid. Rev., 1976, v. 40, p. 869.

119. Wray L.V., Reznikoff W.S. Identification of repressor binding sites controlling expression of tetracycline resistance encoded by TnlO. J. Bacteriol., 1983, v. 56, №3, p. 1188-1191.

120. Yang C.L., Liu Y.H., Wang T.C. Overexpression of the natural recO sequence and its effects on DNA repair of E. coli. Mut. Res., 1996, v. 362, № 1, p. 21-28.