Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Создание аналогов субстратов системы эксцизионной репарации нуклеотидов и анализ их взаимодействия с белками клеточных экстрактов

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Создание аналогов субстратов системы эксцизионной репарации нуклеотидов и анализ их взаимодействия с белками клеточных экстрактов"

На правах рукописи

ЕВДОКИМОВ АЛЕКСЕЙ НИКОЛАЕВИЧ

СОЗДАНИЕ АНАЛОГОВ СУБСТРАТОВ СИСТЕМЫ ЭКСЦИЗИОНИОЙ РЕПАРАЦИИ НУКЛЕОТИДОВ И АНАЛИЗ ИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С БЕЛКАМИ КЛЕТОЧНЫХ ЭКСТРАКТОВ

03.01.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

15ЯНВ 2015

Новосибирск - 2014

005557361

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Научные руководители:

Лаврик Ольга Ивановна, д.х.н., проф., член-корр. РАН Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, зав. лабораторией Петрусева Ирина Олеговна, к.х.н.

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, с.н.с.

Богачев Сергей Станиславович, д.б.н.

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии и генетики СО РАН, зав. лабораторией Гончар Данила Александрович, к.б.н. ООО "СибЭнзайм", зам. директора

Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова»

Защита состоится 24 декабря 2014 г. в 1200 часов на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: Новосибирск, 630090, пр. академика Лаврентьева, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, а также на сайте vvwvv.niboch.nsc.ru

Автореферат разослан « № » ноября 2014 г.

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

к.х.н., доцент

Ученый секретарь диссертационного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. ДНК живых организмов постоянно подвергается модификациям, возникающим в результате воздействия различных факторов. Для предотвращения их накопления и защиты генетической информации существует несколько путей репарации ДНК. Одним из важнейших путей репарации является эксцизионная репарация нуклеотидов (nucleotide excision repair, NER). NER удаляет из ДНК широкий спектр объемных повреждений, дестабилизирующих регулярную структуру ДНК.

Актуальность исследования механизмов репарации объемных повреждений обусловлена расширением спектра негативных факторов, воздействующих на клеточную ДНК. Кроме того, некоторые противоопухолевые препараты реализуют свою цитотоксичность за счет повреждения ДНК. Однако вследствие высокой адаптивности, характерной для репаративной машины NER, ферменты репарации препятствуют сохранению повреждений, а, следовательно, и лечебному действию препаратов. Мониторинг активности системы NER может позволить не только выбрать оптимальную стратегию лечения онкологических заболеваний, но оценить его перспективность.

Несмотря на то, что общая схема NER уже описана, многие детали этого процесса до сих пор остаются невыясненными. Так, например, значительные усилия исследователей направлены на выявление белок-белковых и белок-нуклеиновых взаимодействий, приводящих к образованию функционального предрасщепляющего комплекса и скоординированной работе специфических эндонулеаз. Кроме того, остаются невыясненными последовательность связывания с повреждением некоторых белковых факторов, а также композиция репаративного комплекса на разных стадиях NER.

Многие биохимические подходы к изучению системы NER основываются на использовании синтетических ДНК-аналогов субстратов, содержащих объемную модификацию в заданной позиции молекулы. Такие ДНК-аналоги могут быть использованы как для детекции каталитической активности системы NER, так и в качестве зондов для фотоаффинной модификации при условии наличия в их структуре соответствующих фотоактивируемых групп.

Цель и задачи работы. Целью данной работы являлось создание модельных ДНК - аналогов субстратов системы эксцизионной репарации нуклеотидов - и анализ их взаимодействия с белками клеточных экстрактов. В ходе работы планировалось решить следующие задачи:

1. Синтезировать серию протяженных линейных ДНК-аналогов субстратов эксцизионной репарации нуклеотидов и проанализировать свойства полученных модельных ДНК как субстратов реакции эксцизии объемного повреждения.

2. Проанализировать свойства двухцепочечной структуры модельных ДНК и охарактеризовать изменения регулярной структуры ДНК-дуплексов, возникающие при введении в их состав объемных повреждений.

3. Исследовать взаимодействие синтезированных фотоактивируемых модельных ДНК с белками различных клеточных экстрактов с помощью метода фотоаффинной модификации.

4. Разработать метод детекции эксцизионной активности системы NER in vitro, применимый на уровне экстрактов клеток и тканей.

Научная новизна и практическая значимость работы. Представленная работа является детальным и систематическим исследованием модельных ДНК-дуплексов — аналогов субстратов системы NER.

Данные, полученные в работе, позволили выявить новые, ранее неизученные аспекты функционирования системы эксцизионной репарации нуклеотидов. Исследованы субстратные свойства модельных ДНК, содержащих различные объемные аддукты, в реакции NER in vitro. Показано, что взаимное расположение объемного повреждения и индуцированного его введением участка дестабилизации регулярной двухцепочечной структуры ДНК может влиять на эффективность удаления такого повреждения в процессе NER, а более высокое сродство ХРС не может служить однозначным критерием эффективности ДНК-лиганда как субстрата реакции эксцизии. Показано, что PARP1 способна взаимодействовать с объемными аддуктами в ДНК, однако не влияет на эксцизию повреждения в процессе NER. Кроме того, разработан применимый на уровне экстрактов клеток и тканей метод детекции эксцизионной активности системы NER in vitro.

Полученные в данной работе результаты позволяют охарактеризовать систему «ДНК субстрат - NER компетентый экстракт» как перспективную экспериментальную платформу, которую можно использовать для создания технологий определения эффективности работы NER в различных системах.

Публикации и апробация работы. Материалы диссертации опубликованы в 5 научных статьях и 9 тезисах конференций, также получен патент на изобретение. Результаты работы были представлены на российских и международных научных конференциях, в том числе: Regulation of genome stability by DNA replication and repair (Санкт-Петербург,

Россия, 2010), 11th biannual DGDR Meeting of German Society on DNA Repair (Йена, Германия, 2010), Early Events in Human Pathologies (Листвянка, Россия, 2012), 13th FEBS Young scientists forum (Санкт-Петербург, Россия, 2013), 38th FEBS Congress " (Санкт-Петербург, Россия, 2013), Cooperation between Europe and Siberia in science and higher education: records, milestones, foresight (Кемерово и Барнаул, Россия, 2014).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 128 страницах, содержит 37 рисунков, 3 таблицы. Библиография включает 217 литературных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

1. Поиск эффективных субстратов NER.

Для данного исследования был выбран ряд объемных аддутов ДНК, в том числе фотоактивируемых, имитирующих продукты взаимодействия производных полициклицеских ароматических углеводородов с клеточной ДНК.

В качестве модельных повреждений были использованы ненуклеозидные вставки на основе (Л^-холестерил-З-аминопропил)-триэтиленгликоль-глицерина (Choi), Аг-[6-(5(6)-флуоресцеинил-карбамоил)гексаноил]-3-амино-1,2-пропандиола (nFlu), Аг-[6-(9-антраценилкарбамоил)гексаноил]-3-амино-1,2-пропандиола (nAnt), а также производные нуклеотидов - экзо-Лг-{2-[Аг-(4-азидо-2,5- дифторо-3-хлорпиридин-б-ил)-3-аминопропионил] аминоэтил}-цитозин (Fap-dC), Флуоресцеин-5(6)-карбоксиамидокапроил-[5-(3-аминоаллил)-урацил (Flu-dU) и (+)-cis-6eH3[a]nHpeH-/V2-ryaHHH (BP-dG) (рис. 1).

На первом этапе работы были синтезированы протяженные линейные ДНК-дуплексы (137 п.н.), содержащие исследуемые модельные повреждения.

Для исследования субстратных свойств полученных модельных ДНК нами был использован метод достройки продуктов специфической эксцизии. При использовании этого метода продукты реакции эксцизии -короткие олигонуклеотидные фрагменты, содержащие повреждение - гибридизовали со специфической матрицей, комплементарной содержащему повреждение участку ДНК. Затем фрагменты ДНК достраивали ДНК-полимеразой с использованием а-[32Р]-с1СТР в качестве субстрата. Полученные после такой достройки олигонуклеотиды содержат в своем составе несколько радиоактивных звеньев и имеют высокую удельную радиоактивность. Данный подход позволяет выявить продукты специфического гидролиза даже при низких уровнях эксцизии. С использованием этого метода было показано, что ненуклеозидные вставки, содержащие флуоресценильный и антраценильный остатки, удаляются из состава модельных ДНК с высокой эффективностью, то есть имеют ярко выраженные субстратные свойства в реакции эксцизии (рис. 2). Вырезание Е1и-с1и из соответствующей ДНК происходит с существенно меньшей эффективностью, а уровень вырезания участка Рар-с1С" и вовсе не позволил провести достоверную детекцию продуктов эксцизии. Таким образом, Рар-с1С можно отнести к нерепарируемым или трудно репарируемым повреждениям.

Для характеризации труднорепарируемых модельных ДНК как аналогов субстратов ИЕЯ может быть использована оценка их способности конкурировать с эффективными субстратами ИЕЯ, ингибируя процессинг последних. Если модельная ДНК содержит радиоактивную метку в непосредственной близости от повреждения, это позволит детектировать радиоактивные продукты специфической эксцизии. В то же время, добавление в реакционную смесь нерадиоактивной конкурентной ДНК приведет к перераспределению факторов репарации между ДНК-субстратами и, в итоге, к снижению эффективности репарации радиоактивной ДНК.

Были использованы радиоактивная ДНК, содержащая бенз[а]пиреновый аддукт и нерадиоактивные конкурирующие ДНК. При добавлении в реакционную смесь, содержащую радиоактивную ДНК, эквимолярного

1 2 3 4 5

Рис. 2. Радиоавтограф геля после разделения

продуктов реакции NER in vitro.

количества немодифицированного дуплекса наблюдалось незначительное снижение уровня эксцизии. Однако присутствие в реакционной смеси такого же количества Р1и-сН_1- или Рар-(1С-ДНК ведет к существенному снижению уровня эксцизии ВР-содержащего фрагмента (около 50 и 20 % соответственно). Уменьшение количества радиоактивных продуктов эксцизии объясняется распределением белков системы N£11 между радиоактивной и нерадиоактивной конкурентной ДНК (рис. 3).

131 нт-

I

34 нт -30 нт -

22 нт-

»

Ж* 1 #

I ** »

Р,2-ВР-сЮ-ДНК Р,2-ВР-сЮ-ДНК+н.м. ДНК Р32-ВР-<Ю-ДНК+Р1и-сШ-ДНК P,2-BP-dG-flHK+Fap-dC-flHK Р!2-ВРчЮ-ДНК+ВР^О-ДНК

подвижность радиоактивных продуктов 12 3 4 5 6 7

Рис. 3. Слева - радиоавтограф геля после разделения продуктов реакции NER in vitro. Все реакционные смеси содержали радиоактивную ВР-ДНК, нерадиоактивную конкурирующую ДНК, а также NER-компетентный экстракт клеток HeLa. Справа - результаты денситометрического анализа радиоавтографа.

Таким образом, Fap-dC в составе линейного субстрата может быть отнесен к труднорепарируемым или нерепарируемым повреждениям ДНК, но при этом Fap-dC способен к связыванию белков системы NER. Такие свойства модельных ДНК оптимальны для создания негидролизуемых зондов для фотоаффинной модификации.

0,3

1.6

-1 г

-1 г

¿^^ J^^

$• 5 ? О & s

белки экстракта, мг/мл

. с;

I;! »3

шш ял -34 нт

- -30 нт

1 2 3 4 5 6 78 9101112 13

Б

к £ I ill'

£ t g. О О) & ft* О О

; т

¿Г

ш 1-e мг/Мл

9 0.3 мг/мл

Рис. 4. Сравнение субстратных свойств новых модельных ДНК. А. Радиоавтограф геля после разделения продуктов реакции NER in vitro. Реакционные смеси содержали модельный ДНК-дуплекс и NER-компетентный экстракт клеток СНО в различной

концентрации. На дорожке 13 -маркер длины ДНК.

Б. Относительная

интенсивность специфических полос, соответствующая

эффективности вырезания

поврежденного фрагмента ДНК, после инкубации

немодифицированной, nFlu-, nAnt- или Choi-ДНК с экстрактом клеток СНО.

В то же время, для оценки активности системы NER необходимо использование модельных ДНК с выраженными субстратными свойствами. Поэтому для создания методики детекции активности системы ЫЕК в качестве модельных повреждений были выбраны ненуклеозидные вставки, содержащие остатки антрацена и флуоресцеина, как объемные аддукты, которые с наибольшей эффективностью могут быть удалены из состава протяженных ДНК-дуплексов.

Холестериновый остаток в составе ненуклеозидной вставки в ДНК — это хорошо охарактеризованный субстрат NER. При этом в реакции эксцизии вырезание фрагментов ДНК, содержащих флуоресценильный и антраценильный остатки, происходило в 3-5 раз более эффективно, чем удаление из состава ДНК холестеринового аддукта. Такая тенденция сохранялась при разных концентрациях белков клеточного экстракта (рис.

Таким образом, предложенные в данной работе ненуклеозидные вставки, содержащие остатки антрацена и флуоресцеина, имеют выраженные субстратные свойства в реакции эксцизии. Эти свойства могут быть использованы для создания метода детекции активности системы NER в экстрактах тканей и клеток различной природы.

Стоит отметить, что процедура получения NER-компетентных экстрактов не приводит к полному освобождению от неспецифических нуклеаз. При этом значительная часть пула неспецифических нуклеаз представляет собой нуклеазы, гидролизующие одноцепочечную ДНК. Продукты специфической эксцизии являются одноцепочечными фрагментами и наиболее подвержены неспецифической деградации. Чтобы защитить одноцепочечные фрагменты, при инкубации модельных ДНК с клеточными экстрактами, в реакционные смеси добавляли избыток специфической матрицы - олигонуклеотида, комплементарного участку ДНК, содержащему повреждение. Такой олигонуклеотид, находясь в растворе в большом избытке, может формировать дуплексные структуры с удаленными из состава модельных ДНК фрагментами, защищая их от деградации. Такой подход позволил на порядок повысить эффективность детекции активности системы NER in vitro (рис. 5).

1 2 3 4 5 6

Двухцепочечные модельные ДНК при инкубации с клеточными экстрактами с некоторой интенсивностью подвергаются неспецифическому эндо- и экзонуклеазному расщеплению. Поэтому специфичность реакции эксцизии, катализируемой белками экстракта, была объектом специального исследования.

Рис. 5. Радиоавтограф геля после разделения продуктов реакции NER in vitro. Результат достройки продуктов эксцизии после инкубации модельных ДНК с клеточными экстрактами в отсутствие (дорожки 1-3) или в присутствии (дорожки 4-6) избытка специфической матрицы.

^ -34 нт

специфическая матрица неспецифическая матрица + экстракт СНО

+

+

+

+

1Г

-34 нт

1234567 89

Рис. 6. Радиоавтограф геля после разделения продуктов реакции эксцизии, катализируемой белками NER in vitro. Продукты достройки удаленных из состава модельных ДНК фрагментов наблюдаются только при использовании специфической матрицы.

Продукты специфической эксцизии не удалось зафиксировать при использовании для их достройки матрицы, комплементарной участку ДНК, не содержащему повреждение. В то же время, при использовании специфической матрицы на радиоавтографе наблюдаются полосы, соответствующие достроенным фрагментам ДНК, удаленным из состава модельных дуплексов (рис. 6).

Согласно существующим представлениям, одной из лимитирующих стадий процесса эксцизионной репарации нуклеотидов может быть стадия узнавания повреждения. Поэтому на следующем этапе исследования для окончательного подтверждения специфичности метода детекции эксцизионной активности NER изучали влияние экзогенного рекомбинантного фактора XPC-HR23B на реакцию эксцизии in vitro (рис. 7). Было показано, что при добавлении экзогенного XPC-HR23B эффективность специфической эксцизии, катализируемой белками NER in vitro, монотонно увеличивается в 1,4-1,5 раза. При концентрации экзогенного белка -1,5-2 нМ эффективность специфической эксцизии достигает максимальных значений. Дальнейшее увеличение концентрации XPC-HR23B не приводит к повышению эффективности специфической эксцизии.

Таким образом, специфичность процесса накопления радиоактивных продуктов не вызывает сомнений.

2,5

пАШ-ДНК пР1и-ДНК

Рис. 7. Зависимость относительной

0,5

эффективности эксцизии поврежденного участка ДНК от концентрации экзогенного рекомбинантного ХРС-

НЯ23В в реакционной смеси при проведении реакции

о

эксцизии, катализируемой белками ЫЕЯ т \itro. За

О 0,7 1,5 2.2 2,9 3,7 4,4 5,1 5,9

концентрация ХРС-НР23В, нМ

единицу

принята

интенсивность полос, соответствующих продуктам специфической эксцизии пР1и из соответствующей модельной ДНК, катализируемой белками клеточного экстракта СНО без добавления экзогенного ХРС-НЯ23В.

2. Анализ свойств модельных ДНК.

Для оценки свойств полученных модельных ДНК было использовано несколько стандартных, широко используемых методов.

Ключевая роль в узнавании повреждения в составе ДНК принадлежит фактору ХРС-НИ.23В, который способен опознавать участки двухцепочечной структуры ДНК, дестабилизированные присутствием объемного повреждения, и инициировать дальнейший процесс эксцизионной репарации нуклеотидов. Поэтому способность модифицированной ДНК связываться с ХРС-НЯ23В является одной из важных характеристик субстратов КЕЯ. Для получения количественных характеристик взаимодействия комплекса ХРС-Н1123В с модельными субстратами (констант связывания) было использовано равновесное титрование ДНК белком с измерением анизотропии поляризации флуоресценции (или АПФ). Метод основан на том, что при связывании с белком скорость вращения флуоресцеиновой группы, введенной в ДНК-структуры, значимо уменьшается. Вследствие этого, значение АПФ ДНК, находящейся в комплексе с белком, выше, чем значение АПФ свободной ДНК. Таким образом, степень связывания определяется по изменению анизотропии. В результате для комплексов ХРС-НЯ23В с исследуемыми модельными структурами были получены приведенные в таблице значения констант диссоциации.

Характерной особенностью геометрии ДНК-дуплексов, содержащих объемные аддукты, является также изгиб оси спирали ДНК в районе повреждения. Чтобы оценить углы изгиба проводилось сравнение подвижности ДНК-дуплексов при электрофорезе в неденатурирующих

Рис. 8. Метод вычисления угла изгиба оси спирали , ДНК в районе С повреждения, основанный на измерении

электрофоретической подвижности 16-звенных ДНК-дуплексов, содержащих повреждение, в ПААГ в неденатурирующих условиях.

условиях. Электрофоретическую подвижность ДНК-дуплексов, содержащих модельные повреждения, сравнивали с подвижностью ДНК-дуплекса той же длины и последовательности, не содержащего модификации. Поскольку скорость миграции ДНК при электрофорезе зависит не только от ее длины, но и от геометрии (рис. 8), на основании такого сравнения можно вычислить угол изгиба спирали ДНК в районе повреждения.

Кроме того, с использованием метода дифференциального плавления были получены температуры плавления модельных ДНК. В качестве контроля в случае Рар-с1С был использован ДНК-дуплекс, не содержащий повреждения, а в остальных случаях - дуплекс, содержащий мисматч в том же положении, в котором находится объемное повреждение.

Полученные в результате проведенного анализа характеристики модельных ДНК приведены в табл. 1.

Таблица 1. Характеристика модельных ДНК. Эффективность эксцизии повреждения из пР1и-ДНК принята за единицу._

Модельная ДНК К0 [ХРС-Н1123В - ДНК], нМ Угол изгиба ДНК, ° ДТпл., °С Относительная эффективность эксцизии, отн. ед.

Рар-(1С-ДНК 3,4±0.6 27±3 -4,1±0.2 0

Р1и-аи-днк 1,6±0.1 36±5 - 6±0.2 0,16

пР1и-ДНК 1,5±0.2 32±4 - 7,8±0.2 1

пАпг-ДНК 3,4±0.2 18±3 - 3±0.2 1,2

Известно, что комплекс ХРС-Н1123В «узнает» не химическую модификацию в составе ДНК, а дестабилизацию регулярной двухцепочечной структуры, вызванную введением объемного аддукта. Действительно, полученные нами данные о сродстве ХРС-НЯ23В к модельным субстратам хорошо согласуются с данными о дестабилизации двухцепочечной структуры и изменении геометрии этих модельных ДНК. Логично было бы предположить, что повреждения, с наибольшей эффективностью распознаваемые ХРС- Н1123В, удаляются из состава ДНК также с наиболее эффективно. Однако, полученные нами данные говорят о том, что высокое сродство ХРС-НК23В к модельным ДНК не является фактором, определяющим эффективность эксцизии объемного аддукта из состава такой ДНК. Так, несмотря на то, что константы диссоциации комплексов ХРС- Н1123В с двуми различных ДНК с флуоресцеиновыми заместителями практически не отличаются, эффективность удаления из состава ДНК ненуклеозидной вставки до 10 раз выше по сравнению с эффективностью эксцизии участка ДНК, содержащего модифицированный флуоресцентной группой нуклеотид. По всей видимости, образование комплекса ХРС-НЯ23В и модельной ДНК может быть непродуктивным и не приводить к последующему удалению повреждения из состава ДНК-дуплекса.

Возможно, структура и характер расположения участков дестабилизации регулярной двухцепочечной структуры ДНК может оказывать влияние на как на эффективность связывания ХРС- НЯ23В, так и на эффективность формирования в районе повреждения мультисубъединичных комплексов на последующих стадиях N£11.

Чтобы приблизиться к пониманию структурных основ наблюдаемых функциональных особенностей модельных ДНК и объяснить их свойства как субстратов ЫЕЯ, было проведено компьютерное моделирование молекулярной структуры и динамики исследуемых аналогов ДНК-субстратов ЫЕЯ.

Моделирование молекулярной динамики ДНК-дуплексов было проведено с использованием разработанной в ИХБФМ СО РАН программы ВюРАБЕО. Этот метод основан на реалистичных моделях атом-атомных взаимодействий и позволяет моделировать тепловые флуктуации трехмерной структуры в водном растворе.

Объемные аддукты, связанные с ДНК протяженными и достаточно гибкими линкерами, в той или иной степени смещены относительно места введения модифицированного звена и располагаются в большой бороздке ДНК. Во всех случаях в районе модификации возникает изгиб ДНК, а

Уотсон-Криковские связи и стекинг взаимодействия пар оснований, находящихся вблизи повреждения, оказываются нарушенными.

Фторхлоразидопиридильная группировка Рар-с1С располагается в большой бороздке ДНК с З'-стороны от модифицированного нуклеотида и способна формировать водородные связи с ближайшими к ней нуклеотидами, что вносит дополнительный вклад в искажение структуры ДНК и приводит к образованию дополнительного участка дестабилизации (рис. 9). Однако в районе модифицированного основания дестабилизация структуры ДНК-дуплекса оказывается незначительной.

Введение в состав ДНК флуоресцеин-замещенного нуклеотида приводит к появлению протяженного участка дестабилизации. При этом объемный флуоресцеиновый аддукт, несмотря на достаточно протяженный линкер, располагается вблизи модифицированного нуклеотида. Флуоресцеиновый фрагмент пР1и оказался смещенным в 3' сторону относительно места включения вставки в ДНК на 4-6 нуклеотидов. Объемная группировка флуоресцеина укладывается вдоль сахаро-фосфатного остова ДНК и также способна формировать водородные связи с ближайшими к ней нуклеотидами.

nAnt

Рис. 9. Схематическое представление районов дестабилизации структуры ДНК-

дуплекса. Жирными линиями обозначены водородные связи, существующие на протяжении не менее 90% молекулярно-динамической траектории, тонкими -от 60 до 90% траектории,

пунктирными - менее 60%.

область

Fap-dC

дестабилизациидвухцеп

очечной структуры щ щ ц ||1 III III ill III II III H III II

ДНК.

Объемный антраценовый аддукт также формирует водородные связи с окружающими его нуклеотидами. Однако это не ведет к появлению дополнительного участка дестабилизации, а, наоборот, стабилизирует структуру дуплекса. Кроме того, в этом случае образовавшийся «пузырь» смещен в 5' сторону от повреждения. Линкер изогнут, а антраценовый фрагмент расположен в плоскости, параллельной основаниям и смещен в 3'-сторону от места введения модификации.

На основании полученных данных можно заключить, что участок дестабилизации регулярной двухцепочеченой структуры ДНК, расположенный с З'-стороны от повреждения, опознается ХРС, однако такое связывание, по-видимому, не ведет к образованию продуктивных комплексов на последующих этапах NER. В случае ненуклеозидной флуоресцеиновой вставки подобный участок дестабилизации является дополнительным. Его образование ведет к увеличению сродства этой модельной ДНК к ХРС, но не ведет к улучшению субстратных свойств в реакции NER in vitro по сравнению со схожим ненуклеозидным повреждением с антраценовой группой. В случае Fap-dC-ДНК единственный участок дестабилизации регулярной двухцепочечной структуры ДНК располагается с З'-стороны от повреждения. Такой объемный аддукт опознается ХРС, однако удаления повреждения из состава соответствующей модельной ДНК в процессе NER не происходит.

Согласно литературным данным, после первичного узнавания повреждения, ДНК проверяется на наличие химической модификации фактором XPD - субъединицей фактора транскрипции IIH. После связывания с ДНК TFIIH может транслоцироваться лишь в З'-сторону от сайта первичного связывания в поисках повреждения. Вероятно поэтому, при связывании ХРС с участком дестабилизации, расположенном с З'-стороны от повреждения, удаления такого повреждения из состава ДНК не происходит.

Таким образом, взаимное расположение объемного аддукта и индуцированного его введением участка дестабилизации регулярной двухцепочечной структуры ДНК может влиять на эффективность удаления такого аддукта в процессе NER, а более высокое сродство ХРС не может служить однозначным критерием эффективности ДНК-лиганда как субстрата реакции эксцизии.

Таким образом, были сконструированы и охарактеризованы модельные ДНК, обладающие выраженными субстратными свойствами в реакции NER, а также аффинный ДНК-зонд, способный к формированию комплексов NER, но не подвергающийся действию этой системы. С использованием новых

субстратов разработан оптимизированный метод детекции эксцизионной активности системы NER in vitro.

3. Применение модельных ДНК.

Фотоаффинная модификация - подход, успешно используемый для исследования динамики функционирования сложных белковых комплексов. Этот подход позволяет ковалентно фиксировать белок в комплексе ДНК-белок при условии наличия в структуре ДНК-лиганда фотоактивируемой группы.

В данной работе была предпринята попытка выявления белков NER-компетентных экстрактов, специфически связывающихся с участком ДНК, содержащим объемное повреждение.

Ранее в литературе встречались упоминания о взаимодействии поли(АДФ-рибоза)-полимеразы 1 (PARP1) с факторами NER, а также непосредственно с объемными аддуктами, такими как с цис-платина. Среди продуктов фотоаффинной модификации белков клеточного экстракта был обнаружен продукт с кажущейся молекулярной массой -115 кДа. Соответствующей молекулярной массой, а также высокой копийностью в клетке -10 копий на клетку ) обладает PARP1.

Для выявления присутствия PARP1 среди мишеней модификации белков экстракта был использован функциональный тест. Он основан на способности PARP1 авто-поли-АДФ-рибозилироваться. При этом элефктрфоретическая подвижность белка меняется, и полоса, соответствующая продукту фотоаффинной модификации PAPR1, исчезает (рис. 10, ср. дор. 3-6 и 7-10). С применением такого функционального теста действительно была идентифицирована PARP1. Очищенный рекомбинантный белок также взаимодействовал с фотоактивируемой ДНК с образованием ковалентных аддуктов (рис. 10, дор. 1, 2).

Рис. 10. Радиоавтограф геля после разделения продуктов реакции фотопришивки белков к ДНК. Реакционные смеси для модификации содержали [32P]-Fap-dC-flHK,

различные концентрации белков экстракта HeLa (дорожки 3-10), либо рекомбинантный белок PARP1 (дорожки 1 и 2), а также 1 мМ NAD+ (дорожки 1 и 7-10).

экстракт - -+ + + + + + + +

NAD* +-----+ + + +

PARP1 + +--------

Mr, кДа

50 -

37 -__

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Тем не менее, оставалось невыясненным, имеет ли такое взаимодействие функциональное значение для протекания стадии эксцизии in vitro.

Разработанный метод детекции эксцизионной активности NER позволил проанализировать, как присутствие экзогенной PARP1 влияет на стадию эксцизии поврежденного участка из состава модельной ДНК.

В реакционную смесь при проведении реакции NER in vitro добавляли очищенный рекомбинантный белок. Оказалось, что добавление PARP1 не влияет на эффективность вырезания повреждения (рис. 11). Кроме того, предварительная инкубация экстрактов клеток с NAD+ также не привела к изменению уровня гидролиза модельных ДНК.

3- 1.5

f

О 5 О

Рис. 11. Зависимость относительной эффективности эксцизии поврежденного

участка ДНК от концентрации экзогенного рекомбинантного PARP1 в реакционной смеси при проведении реакции эксцизии, катализируемой

белками NER in vitro. За единицу принята интенсивность полос, соответствующих

продуктам специфической эксцизии nFlu из соответствующей модельной ДНК, катализируемой белками клеточного экстракта СНО без добавления экзогенного PARP1.

----nAnt-ДНК

- nFlu-ДНК

si" 1

200 400 600

концентрация PARP1

800 нМ

Скорее всего, РА11Р1 влияет на эффективность протекания NER опосредованно, участвуя в других процессах метаболизма ДНК. Например, связываясь с объемным аддуктом, РАЛР1 может участвовать в процессах реорганизации хроматина. Также, активируясь в присутствии объемного аддукта, PAR.P1 может участвовать в регуляции транскрипции поврежденного участка ДНК и увеличивать доступность поврежденного участка ДНК для факторов репарации.

Перспективным направлением развития методики определения активности системы ЫЕЯ является использование модельных ДНК не только для фундаментальных, но и для прикладных исследований.

Стоит отметить, что современные подходы к лечению онкологических заболеваний позволяют справиться с большинством из этих тяжелых недугов. Однако при использовании интенсивной комбинированной терапии, ввиду большого количества побочных эффектов, актуальной

задачей становится минимизация отрицательного влияния самого лечения на здоровье пациента. Информация о статусе системы NER в клетках опухоли, а, следовательно, и о том, насколько интенсивная и продолжительная терапия требуется для лечения, может быть полезна при выборе схемы терапии. Своевременная коррекция схемы лечения при этом может привести к заметному уменьшению побочных эффектов.

В данной работе была проанализирована эффективность реакции эксцизии, катализируемой белками NER, содержащимися в экстрактах клеток линий цервикального рака HeLa, SiHa и СЗЗА, и выявлены различия между эффективностью работы NER в этих экстрактах (рис. 12).

Рис. 12. Радиоавтограф геля после разделения продуктов реакции NER in vitro. Белки системы NER,

содержащиеся в экстрактах клеток цервикальных

опухолей человека HeLa, SiHa и СЗЗА, с различной эффективностью удаляют ненуклеозидную вставка nAnt или nFlu из соответствующего модельного ДНК-дуплекса.

HeLa

СЗЗА

SiHa

¿r^r ¿г^ ¿г^-

1 23456789 10 11 12 13

Таким образом, разработанный метод позволяет оценивать относительную эффективность в экстрактах различных клеток, в том числе в экстрактах опухолевых клеток человека.

Однако описанные эксперименты были проведены с использованием экстрактов клеток клеточных линий, культивируемых в специальных искусственных условиях. Такие клетки фенотипически и метаболически отличаются от клеток, полученных из тканей живых организмов.

Для того, чтобы доказать применимость разработанного метода на уровне экстрактов тканей, был получен экстракт из печени домашнего кролика. Было показано, что белки NER в таких экстрактах способны эффективно распознавать и удалять модельное повреждение из состава протяженного ДНК-дуплекса (рис. 13). Применение предложенного подхода открывает возможность для различных исследований с использованием экспериментальных животных с оперативным мониторингом активности КЕК в различных тканях в зависимости от условий эксперимента. Такой

подход применим как для фундаментальных, так и для прикладных исследований.

Например, при доклинических исследованиях противораковых препаратов появится возможность параллельно с основным исследованием следить за эффективностью работы МЕЯ как в опухолевых клетках, так и в клетках здоровых органов. Информация о том, как действие препарата влияет на функциональное состояние систем репарации, позволит выработать дополнительные рекомендации по использованию тестируемого препарата в медицинской практике.

пАт-ДНК пР1и-ДНК

концентрация белков экстракта, мг/мл

1-II-1 0 3,3 6,6 0 3,3 6,6

* мА т, В ' Ш

Р

•я«**» Ж р» т • •

Рис. 13. Радиоавтограф геля после разделения продуктов реакции NER in vitro. Реакционные смеси содержали модельные ДНК-дуплексы, а также NER-компетентный -34 нт экстракт,

приготовленный из печени кролика.

1 2 3 4 5 6

Результаты, полученные в работе, позволили получить данные о новых, ранее не изученных аспектах функционирования системы эксцизионной репарации нуклеотидов. В основе работы лежит создание модельных ДНК -аналогов субстратов системы эксцизионной репарации нуклеотидов - и анализ их взаимодействия с белками клеточных экстрактов. В работе представлены результаты, характеризующие динамические, функциональные, структурные особенности выбранных модельных систем, продемонстрированы свойства повреждений молекулы ДНК, катастрофически меняющие эффективность репарации.

Созданные протяженные линейные ДНК-дуплексы, содержащие nFlu- и nAnt-фрагменты, продемонстрировали свойства эффективных субстратов реакции специфической эксцизии, катализируемой белками NER-компетентных экстрактов эукариотических клеток. Использование созданных модельных ДНК в сочетании с отработанным методом детекции продуктов эксцизии позволяет с высокой чувствительностью проводить измерение активности системы NER в экстрактах клеток различной природы. Таким образом, полученные данные позволяют характеризовать

систему «ДНК субстрат-NER компетентый экстракт» как перспективную экспериментальную платформу, которую можно использовать для создания технологий определения компетентности NER, в том числе в предлечебной фазе при терапии злокачественных онкологических заболеваний.

ВЫВОДЫ

1. Экзо-Аг-{2-[Аг-(4-азидо-2,5- дифторо-3-хлорпиридин-6-ил)-3-аминопропионил] аминоэтил}-2'-дезоксицитидин — Fap-dC и флуоресцеин- 5(6)-карбоксиамидокапроил-[5-(3-аминоаллил)-2'-дезоксиуридин — Flu-dU, введенные в состав протяженных линейных ДНК-дуплексов, являются труднорепарируемыми повреждениями, однако способны взаимодействовать с белками системы NER.

2. Объемные группировки (Лг-[6-(9-антраценилкарбамоил)гексаноил]-3-амино-1,2-пропандиол - nAnt и А'-[6-(5(6)-флуоресцеинилкарбамоил)гексаноил]-3-амино-1,2-пропандиол - nFIu), введенные в состав протяженных ДНК-дуплексов в виде ненуклеозидных вставок, эффективно распознаются и удаляются системой NER.

3. Взаимное расположение объемного повреждения и индуцированного его введением участка дестабилизации регулярной двухцепочечной структуры ДНК может влиять на эффективность удаления такого повреждения в процессе NER, а более высокое сродство ХРС не может служить однозначным критерием эффективности ДНК-лиганда как субстрата реакции эксцизии.

4. Показано, что PARP1 способна взаимодействовать с объемными аддуктами в ДНК, однако не влияет на эксцизию повреждения в процессе NER.

5. Разработан применимый на уровне экстрактов клеток и тканей метод детекции эксцизионной активности системы NER in vitro, основанный на применении nFIu- и nAnt-ДНК.

Основные результаты диссертации опубликованы в работах:

1. Евдокимов, А.Н.. Петрусева, И.О., Пестряков, П.Е., Лаврик, О.И. Фотоактивируемые ДНК-аналоги субстратов системы эксцизионной репарации нуклеотидов и их взаимодействие с белками NER-компетентного экстракта клеток HeLa. Синтез и применение протяженных модельных ДНК//Биохимия.—2011,-Т. 76.-С. 188-200.

2. Evdokimov, A., Tsidulko, A., Petruseva, I., Koroleva, L., Serpokrylova, I., Silnikov, V., Lavrik, O. Synthesis of model DNA and their application as substrates of nucleotide excision repair // Biopolymers and Cell. —2012, -V. 28.-P. 212-217.

3. A.H. Евдокимов. И.О. Петрусева, А.Ю. Цидулко, Л.С. Королева, И.Ю. Серпокрылова, В.Н. Сильников, О.И. Лаврик. Способ оценки активности системы эксцизионной репарации нуклеотидов млекопитающих // Патент РФ №2492242. Приоритет от 24 апреля 2012.

4. Evdokimov. A.. Petruseva, I., Tsidulko, A., Koroleva, L., Serpokrylova, I., Silnikov, V., Lavrik, O. New synthetic substrates of mammalian nucleotide excision repair system // Nucleic Acids Res. -2013, -V. 41. -P. el23.

5. Evdokimov. A.. Lavrik, O., Petruseva, I. Model DNA for investigation of mechanism of nucleotide excision repair // Biopolymers and Cell. -2014, -V. 30.-P. 167-183.

6. Petruseva, I.O., Evdokimov, A.N., Lavrik, O.I. Molecular mechanism of global genome nucleotide excision repair // Acta Naturae. —2014. -V. 6. -P. 23-34.

Подписано в печать 23.10.2014 г. Печать цифровая. Бумага офсетная. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 1 Тираж 150 экз. Заказ № 235

Отпечатано в типографии «Срочная полиграфия» ИП Малыгин Алексей Михайлович 630090, Новосибирск, пр-т Академика Лаврентьева, 6/1, оф.104 Тел. (383) 217-43-46, 8-913-922-19-07