Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие поли(ADP-рибоза)полимераз 1 и 2 с ДНК-интермедиатами эксцизионной репарации оснований

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие поли(ADP-рибоза)полимераз 1 и 2 с ДНК-интермедиатами эксцизионной репарации оснований"

На правах рукописи

КУТУЗОВ МИХАИЛ МИХАИЛОВИЧ

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ПОЛИ(АБР-РИБОЗА)ПОЛИМЕРАЗ 1 И 2 С ДНК-ИНТЕРМЕДИАТАМИ ЭКСЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ

ОСНОВАНИЙ

03.01.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Новосибирск - 2013

005537771

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО

РАН

Научный руководитель:

д.б.н., доцент Ходырева Светлана Николаевна

Официальные оппоненты:

Грайфер Дмитрий Маратович, д.х.н., доцент, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, в.н.с.

Синицына Ольга Ивановна, к.б.н., Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии и генетики СО РАН, с.н.с.

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной генетики РАН

Защита состоится « П. » октября 2013 г. в _10:00_ часов на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 на базе Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск, пр. ак. Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Автореферат разослан « 9 » сентября 2013 г.

Учёный секретарь диссертационного с<

к.х.н., доцент

Коваль В. В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности Раковые заболевания, раннее старение, дефекты роста, нейродегенеративные заболевания, а также изменения иммунных функций организма становятся все более значимыми проблемами человечества. Во многом предрасположенность к этим заболеваниям обусловлена нарушениями в репарации ДНК. Сохранение целостности генома у эукариот обеспечивается функционированием ряда путей репарации ДНК. Каждый путь репарации направлен на исправление определенных типов повреждений. Эксцизионная репарация оснований (BER) задействована в исправлении наиболее часто встречающихся повреждений ДНК - апуриновых/апиримидиновых (АР)-сайтов и повреждений, не вызывающих значительных искажений структуры двойной спирали ДНК, таких как окисленные, дезаминированные или алкилированные азотистые основания и разрывы цепи. Ряд данных указывает на участие белков системы BER также в исправлении кластерных повреждений ДНК (когда несколько повреждений сгруппированы в пределах одного - двух витков спирали ДНК). При репарации таких повреждений возникают затруднения, связанные с риском образования токсичных для клетки двухцепочечных разрывов ДНК. Поэтому в ходе репарации кластерных повреждений необходима точная регуляция.

Одним из ключевых регуляторов BER является поли(АБР-рибоза)полимераза 1 (PARP1). PARP1 - ядерный фермент, вовлеченный в процессы детекции разрывов ДНК, возникающих как непосредственно под действием ионизирующей радиации, так и опосредованно вследствие ферментативного расщепления поврежденной ДНК (AP-сайты, окисленные или алкилированные основания). PARP1 при взаимодействии с поврежденной ДНК синтезирует поли(АБР-рибозу) (PAR), ковалентно присоединенную к белкам-акцепторам, в том числе самой PARP1. Считают, что РАЯилирование PARP1 выполняет сигнальную функцию для активации системы репарации и регуляторную функцию в ходе репарации. Некоторые белки, в том числе относящиеся к системе BER, например XRCC1 [Schreiber et al., 2002], содержат мотив, узнающий PAR, и специфически взаимодействуют с этим полимером, что служит для привлечения белков репарации к месту повреждения ДНК. Кроме того, отрицательно заряженный PAR облегчает диссоциацию PARP1 с ДНК, обеспечивая доступ ферментам репарации к месту повреждения [Lindahl, 1995]. PARP1 также принимает участие в регуляции репарации при переходе клетки к апоптозу [Jagtap & Szabo, 2005].

Кроме PARP1, функцию регулятора BER может выполнять ее ближайший гомолог - PARP2. PARP2 исследована значительно менее детально, чем PARP1 и большая часть данных получена с использованием культур клеток или модельных животных. Ее необходимость для эффективного протекания BER была ранее показана, но механизмы ее вовлечения и роль в этом процессе остаются невыясненными.

Биохимические и генетические исследования подтверждают ключевую роль PARP1 и PARP2 в клеточном ответе на повреждение ДНК. Оба белка могут формировать гомодимеры, гетеродимеры друг с другом и гетеродимеры с рядом других «белков-партнеров». Эксперименты на мышах показали, что животные дефицитные по обоим белкам PARP1 (Parpl") и PARP2 {Рагр2~ ) нежизнеспособны и погибают на стадии гаструляции, что подтверждает ключевую роль РАЯилирования в ходе эмбрионального развития [de Murcia et al., 2003]. Анализ фенотипического проявления отсутствия белков PARP1 и PARP2 на уровне клеток и организмов позволяет предположить, что эти белки имеют неперекрывающиеся функции. Это, по-видимому, обусловлено тем, что PARP1 и PARP2 узнают различные мишени в ДНК и взаимодействуют с разным набором белков-партнеров. Есть данные о белок-белковых взаимодействиях PARP2 с некоторыми белками-участниками BER и негомологичного соединения концов ДНК, что указывает на возможное вовлечение PARP2 в эти процессы. Тем не менее, на данный момент не представляется возможным детально описать механизм вовлечения PARP2 и ее роль в процессах репарации ДНК. В связи с этим представляет большой интерес проведение сравнительного анализа влияния PARP1 и PARP2 на белки BER с использованием ДНК, имитирующих ДНК-интермедиаты этого процесса.

Цель и задачи Целью данной работы являлся сравнительный анализ влияния PARP1 и PARP2 на процессинг ДНК, имитирующих интермедиаты BER. В ходе исследования планировалось решить следующие задачи:

• изучить специфичность взаимодействия PARP2 с ДНК, имитирующими интермедиаты репарации;

провести сравнительный анализ параметров взаимодействия PARP1 и PARP2 с некоторыми белками BER;

• в экстрактах клеток человека провести поиск белков, специфически взаимодействующих с апуриновыми/апиримидиновыми сайтами;

• провести сравнительный анализ характеристик взаимодействия PARP1 и PARP2 с АР-ДНК с использованием аффинной модификации, функциональных тестов и других методов;

изучить взаимодействие PARP1 с АР-ДНК, содержащими напротив АР-сайта дезоксиаденозин или аналоги АР-сайта (остатки диэтиленгликоля,

декандиола-1,10, З-гидрокси-2-гидроксиметилтетрагидрофурана), как моделями кластерных повреждений ДНК.

Научная новизна и практическая значимость работы Впервые продемонстрирована способность PARP1 специфически взаимодействовать с ранними интермедиатами BER — АР-сайтами. Это взаимодействие регулирует гидролиз АР-сайтов АР-эндонуклеазой 1 (АРЕ1). Кроме того, у PARP1 обнаружена 5'-с111Р/АР-лиазная активность, которая за счет расщепления АР-сайта может приводить к стимуляции поли(АОР-рибоза)полимеразной активности PARP1, обеспечивая сигнальную функцию для привлечения других белков репарации. Показано, что PARP2, подобно PARP1, взаимодействует с АР-сайтами с образованием оснований Шиффа, но, в отличие от PARP1, не расщепляет АР-сайты и менее эффективно конкурирует с АРЕ1. Изучено влияние PARP1 и PARP2 и их поли(АБР-рибозил)ирования на активность ферментов BER, что вносит существенный вклад в понимание регуляции BER. Эта информация важна как в фундаментальном плане, так и при разработке специфических ингибиторов системы репарации ДНК, используемых в качестве терапевтических средств.

Положения, выносимые на защиту

1.PARP1 и PARP2 взаимодействуют с интактными и расщепленными АР-сайтами с образованием стабильных аддуктов, опосредованных образованием основания Шиффа. PARP1 проявляет значимую АР-лиазную активность и обе PARP способны выщеплять остаток 5'-дезоксирибозофосфата из гидролизованного АР-сайта.

2. При взаимодействии PARP2 с ДНК-структурами, имитирующими интермедиаты некоторых процессов метаболизма ДНК, не обнаружено корреляции между эффективностью автополи(АОР-рибозил)ирования и сродством к ДНК.

3. Обе PARP ингибиторуют активность некоторых ферментов BER. Автополи(АОР-рибозил)ирование PARP1, в отличие от PARP2, может регулировать ее ингибиторное влияние.

4. PARP1 более эффективно узнает АР-сайты в составе кластерных повреждений по сравнению с одиночными АР-сайтами. Для PARP2 избирательность во взаимодействии с АР-сайтами в составе кластеров не выявлена.

Степень достоверности и апробация результатов По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ. Материалы диссертации были доложены на международных конференциях: IInd International conference Physico-chemical biology dedicated to the 85th anniversary of academician D. G. Knorre, Новосибирск, 2011; IV International Meeting «Early events in

з

Human Pathologies», Ереван, Армения, 2011; V International Meeting «Early events in Human Pathologies», Листвянка, 2012; 22nd IUBMB & 37th FEBS Congress «From Single Molecule to System Biology», Севилья, Испания, 2012, 38th FEBS Congress «Mechanisms in Biology», Санкт-Петербург, Россия, 2013 и др.

Структура и объем работы Диссертация состоит из введения, трех глав, выводов, списка литературы. Работа изложена на 157 страницах, содержит 45 рисунков, 9 таблиц и список цитируемой литературы из 271 наименования.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Взаимодействие PARP1 с АР-ДНК

Для поиска белков, взаимодействующих с АР-сайтами - ключевым интермедиатом BER, использовали метод аффинной модификации белков. Атом С1 дезоксирибозы в составе АР-сайта способен образовывать основания Шиффа с первичными аминогруппами белков. ДНК, содержащие АР-сайты, являются удобным инструментом для исследования репарации, поскольку АР-сайты одновременно являются и повреждением, и химически активной группой, обеспечивающей образование ковалентных сшивок ДНК с белками. В экстрактах культивируемых клеток человека и ядерного экстракта из семенников крупного рогатого скота (СКРС) с использованием кольцевой ДНК, содержащей АР-сайты и радиоактивную метку, был обнаружен продукт мечения белков, с кажущейся молекулярной массой (по электрофоретической подвижности), около ~ 120 кДа (Рис. 1).

Рисунок 1. Пришивка белков цельно-клеточных экстрактов культивируемых клеток человека и ядерного экстракта СКРС к АР-ДНК. Дорожки 1-4 - пришивка белков экстракта клеток HeLa, фибробластов человека, MCF7 и экстракта СКРС к кольцевой АР-ДНК. Дорожка 5 - контроль (пришивка белков экстракта клеток HeLa к АР-сайту в составе 32-мерного линейного ДНК-дуплекса). Ки80 полипептид был идентифицирован ранее [Ilina et al., 2008; Ильина и др., 2009].

С учетом электрофоретической подвижности продукта и литературных данных о взаимодействии поли(АОР-рибоза)полимеразы 1 с

12 3 4 5

Ш-

.7

■ ки«о

ДНК-интермедиатами эксцизионной репарации оснований [Ьаупк й а1., 2001; ЗикЬапоуа е1 а1., 2005; С^иШ Й а1, 2004; БикИагшуа й а1., 2010] было предположено, что модифицируемый белок - РАИР!.

12 3

12«-

МАЙ*

4 5

. 1>Аарцш> км , елке:

(»АК1'МЛ!>Р>»>

»«СТ.. - * + МАЯ* - - *

Б.

«Да «О-

«»1л СКГС Н«1.а «ЖГС

ТТЗ 4 I 6 #10!! ¡3

Ф& «ми» тш**

Ш

- ММРНМО

. 1>ЛНР1

г»*»'

Рисунок 2. АвтоРАКилирование рекомбинантной РАШЧ и РА1*Р1 экстрактов клеток НеЬа и СКРС, ковалентно присоединенной к АР-ДНК. Реакционные смеси содержали 20 нМ кольцевую или 0,1 мкМ линейную АР-ДНК, белки экстракта СКРС/НеЬа, 1,25 мг/мл (Панель Б.) или 0,1 мкМ РА11Р1 (Панель А). После стабилизации продуктов сшивки боргидридом натрия в образцах, содержащих кольцевую ДНК, проводили гидролиз ДНК бензоназой.

Для подтверждения предположения о природе белка была проведена модификация рекомбинантной РАЯР1 человека линейной и кольцевой АР-

ДНК, а также проведены функциональные тесты. PARP1 образует сшивки с линейной АР-ДНК (Рис. 2, А, Дор. 4, 5) и кольцевой АР-ДНК (Рис. 2, А, Дор. 1 и 2).

Ранее в работе [Lavrik et al., 2001] было установлено, что PARP1, ковалентно присоединенная к фотоактивированной ДНК, способна подвергаться РАЯилированию в присутствии NAD+ с образованием продуктов с более низкой электрофоретической подвижностью. С использованием рекомбинантной PARP1 была оценена применимость такого подхода в случае ковалентных аддуктов PARP1 с АР-ДНК (Рис. 2, А, Дор. 3 и 6). В обоих экстрактах в присутствии NAD+ также наблюдается появление продуктов с более низкой электрофоретической подвижностью с одновременным уменьшением количества исходных продуктов сшивки, относимых нами к PARP1 (Рис. 2, Б, сравнить Дор. 1, 2, 4, 5, 10, 11 и Дор. 3, 6, 12). Образование продуктов со сниженной электрофоретической подвижностью означает, что PARP1, ковалентно присоединенная к АР-ДНК, может подвергаться РАЯилированию.

Идентичность белка в составе ковалентного аддукта с АР-ДНК с использованием экстракта клеток СКРС подтверждена методом пептидного картирования на основе данных масс-спектрометрии с использованием разработанной ранее процедуры [Ilina et al., 2008; Ильина и др., 2009].

Для выяснения возможной роли обнаруженной способности PARP1 узнавать АР-сайты были исследованы характеристики взаимодействия рекомбинантного белка с АР-ДНК.

С использованием конкурентных ДНК была продемонстрирована специфичность PARP1 в узнавании ДНК, содержащих АР-сайты. В качестве конкурентных были использованы как ДНК без повреждений, так и ДНК, содержащие расщепленный АР-сайт или аналог АР-сайта, З-гидрокси-2-гидроксиметилтетрагидрофуран (THF).

Кроме того, показано, что PARP1, связываясь с АР-сайтами посредством образования основания Шиффа, формирует долгоживущие комплексы. Такое взаимодействие может служить для временной защиты АР-сайтов, поскольку реакция образования основания Шиффа обратима.

Представляло интерес выяснить насколько эффективно активируется PARP1 при взаимодействии с АР-сайтами. С использованием шпилечных АР-ДНК (не содержащих разрывов, способных активировать PARP1) и радиоактивно меченого NAD+, показано, что PARP1, взаимодействуя с АР-сайтами, активируется, однако уровень активации значительно ниже, чем при активации PARP1 ДНК, предварительно расщепленной АРЕ1.

Поскольку основание Шиффа является интермедиатом при расщеплении АР-сайтов некоторыми белками по механизму р-элиминирования и выщепления 5'-дезоксирибозофосфатного остатка, возникающего при гидролизе АР-сайта апуриновой/апиримидиновой

б

эндонуклеазой 1 [Piersen et al., 2000; McCullough et al., 1999; Summer et al., 2009; Krokan et al., 2000], были определены возможные каталитические функции PARP1 в отношении АР-сайтов. Показано, что PARP1 расщепляет АР-сайты, однако эффективность такого расщепления не высока (см. Рис. 3, А) и проявляет слабую лиазную активность при взаимодействии с 5'-dRP остатком (см. Рис. 3, Б).

к 1 2

Субстрат—

Продует . расщепления'"

PARP1 3 4 5

POlß 6 7 f

t, мин

5 20 5 10 20 5 10 20

t, мин

Оубстоат—^у Продукт

10

20

PARP1 10 20

polß

2 5

Рисунок 3. 5'-с1НР/АР-лиазная активность РАЯР1. Панель А.: расщепление АР-ДНК. Вверху указана структура ДНК, использованная в эксперименте. Реакционные смеси содержали 0,1 мкМ АР-ДНК, 0,2 мкМ РАИР1, 0,2 мкМ ро1(3. Панель Б.: Выщепление 5'-дезоксибизофосфатного остатка. Внизу приведена структура использованной в эксперименте ДНК. Реакционные смеси содержали 0,1 мкМ 5'сШР-ДНК, 0,1 мкМ РАЯР1, 5 нМроф.

Таким образом, катализируемое PARP1 расщепление сахарофосфатного остова (формирование разрыва) приводит к активации этого белка, что, с учетом продемонстрированной выше способности PARP1, зафиксированной на белке через основание Шиффа, подвергаться РАЯилированию, вероятно, обеспечивает формирование сигнала о повреждении ДНК в виде РАЯилированной PARP1, ковалентно (но обратимо) присоединенной к ДНК.

2. Взаимодействие АРЕ1 и PARP1 в присутствии АР-ДНК

AP-сайты один из наиболее часто встречающихся типов повреждений ДНК, поэтому имеет большое значение изучение взаимодействия ферментов и дополнительных факторов, узнающих АР-сайты. Основной фермент эукариот, процессирующий AP-сайты - АР-эндонуклеаза 1 [Barsky & Wilson, 2001]. Согласно вышеописанным результатам PARP1 - один из белков, взаимодействующих с интактными АР-

сайтами, поэтому представляет интерес исследование взаимодействий PARP1 с АРЕ 1 в присутствии АР-ДНК.

Мы изучили влияние АРЕ1 на уровень пришивки PARP1 к АР-ДНК, а также проанализировали эффективность расщепления AP-сайта АР-эндонуклеазой 1 в присутствии PARP1. Полученные результаты позволяют предположить конкурентный характер взаимодействий между PARP1 и АРЕ1. Однако взаимодействие между белками может осуществляться за счет формирования белок-белковых комплексов. Для PARP1 известны белок-белковые взаимодействия со многими белками BER: polß, PCNA, XRCC1, Ligllla [Almeida & Sobol, 2007]. Поэтому представляло интерес проанализировать взаимодействие PARP1 и АРЕ1 на наличие белок-белковых контактов.

Для выявления белок-белковых контактов PARP1 и АРЕ1 были реализованы два подхода: метод коиммунопреципитации и сшивка глутаровым альдегидом. В обоих случаях обнаружить белок-белковые взаимодействия не удалось. Однако полученные результаты полностью не исключают возможность формирования белок-белковых контактов между PARP1 и АРЕ1. Следует учесть, что метод коиммунопреципитации является неравновесным методом, и, поэтому непрочные белок-белковые контакты могут разрушаться в процессе выделения комплекса. При сшивке глутаровым альдегидом возможно отсутствие подходящим образом расположенных аминогрупп в области контакта исследуемых белков.

3. Взаимодействие PARP2 с АР-ДНК

Считается, что наряду с PARP1, PARP2 тоже участвует в регуляции репаративных процессов. На это указывает накопление PARP2 в области повреждений ДНК [Chalmers et al., 2004; Mortusewicz et al., 2007], а также повышенная чувствительность клеток, дефицитных по PARP2, к ионизирующему излучению [de Murcia et al., 2003; Yelamos et al., 2008]. Необходимость PARP2 для эффективного протекания BER, а также функциональное и физическое взаимодействие PARP2 с PARP1 [Schreiber et al., 2002] позволяют предположить, что оба этих белка совместно участвуют в регуляции репарации. Кроме того, с учетом полученных результатов о взаимодействии PARP1 с АР-ДНК, представляло интерес проверить способность PARP2 взаимодействовать с АР-сайтами.

Показано, что PARP2, подобно PARP1, взаимодействует как с интактными, так и предварительно расщепленными AP-сайтами, с формированием оснований Шиффа. При этом образуемые PARP2 с АР-ДНК аддукты стабильны в течение длительного времени (по меньшей мере, 60 мин).

Показано, что РАЯР2 в отличие от РАЯР1 не расщепляет интактные АР-сайты (Рис. 4, А), но проявляет 5'-с111Р лиазную активность подобно PAR.P1 (см. Рис. 4, Б).

Продует

Э-эяимимироваяй» Продув ГИДРОЛИЗА

Рисунок 4. 5'-с1КР/АР-лиазная активность РАЯР2. Панель А.: расщепление АР-ДНК. Вверху указана структура ДНК, использованная в эксперименте. Реакционные смеси содержали 0,1 мкМ АР-ДНК, 0,1 или 1,0 мкМ РАЯР1/РАЯР2, 0,1 нМ АРЕ1, 10 нМ Епс)оШ. Панель Б.: Выщепление 5'-дезоксибизофосфатного остатка.

Вверху приведена структура использованной в эксперименте ДНК. Реакционные смеси содержали 0,1 мкМ 5'аЯР-ДНК, 50 или 0,5 нМ роф, 2,0 или 0,2 мкМ РАЯР1/РАКР2.

Субстрат Продукт

6_ <»?аД-

3:———5" 1 2 г 4 5 6 7

St sgtitg^^*

Poip PARP2 PARP1 К

4. Взаимодействие PARP1 и PARP2 с АР-сайтами в составе кластерных повреждений

Большую сложность для клетки представляют кластерные повреждения, называемые также сайтами множественного повреждения, в которых окисленные основания, АР-сайты и разрывы цепи сгруппированы в пределах 1-2 витков спирали ДНК и могут располагаться в обеих цепях ДНК. Механизмы репарации кластерных повреждений и их влияние на жизненный цикл клетки нуждаются в детальном изучении. Кластерные повреждения характерны для воздействия ионизирующей радиации и лекарственных препаратов-радиомиметиков [Sung & Demple, 2006]. При репарации таких повреждений требуется тщательная регуляция последовательности репарации отдельных повреждений, чтобы избежать формирования двухцепочечных разрывов, которые более токсичны для клетки [Sung & Demple, 2006]. Тот факт, что количество кластерных повреждений, вызванных действием ионизирующей радиации на ДНК, уменьшается с течением времени, дает основания предполагать, что подобные повреждения

все-таки процессируются in vivo [Tsao et al., 2007; Guiston et al., 2004; Georgakilas et al., 2004]. Исследования in vitro с использованием очищенных белков BER и ядерных экстрактов показали, что при репарации кластерных повреждений возможно возникновение двухцепочечных разрывов [David-Cordonnier et al., 2002; Yang et al., 2004]. Несмотря на значительное количество исследований по репарации множественных повреждений белками BER, которые выполнены с использованием реконструированных систем и клеточных экстрактов, точные механизмы регуляции и факторы, ответственные за эффективную репарацию кластерных повреждений, не установлены. Не исключено, что существуют белки, специфически взаимодействующие с кластерными повреждениями и осуществляющие регуляцию их репарации. Среди известных белков системы BER потенциально такой функцией могут обладать PARP1 и PARP2.

Ненукпеотидные вставки как аналоги AP-сайтов. Мы исследовали взаимодействие PARP1 и PARP2 с ДНК-дуплексами, содержащими как природный AP-сайт, так и его синтетические аналоги. На Рис. 5 приведены структуры использованных в работе аналогов AP-сайта: остаток 3-гидрокси-2-гидроксиметилтетрагидрофурана (THF), остаток диэтиленгликоля (DEG) и остаток декан-1,10-диола (DD). В качестве контрольного был использован ДНК-дуплекс с дезоксиаденозинмонофосфатом (dAMP) напротив природного АР-сайта.

Следует отметить, что THF широко используется в исследовании системы BER как миметик AP-сайта, являющийся субстратом для АР-эндонуклеазы 1 [Takeshita et al., 1987; Erzberger & Wilson, 1999]. При использовании отличающихся по структуре аналогов AP-сайтов - остатков DEG и DD - предполагалось, что они могут оказаться более устойчивыми к действию АРЕ1. Было показано, что АРЕ1 действительно гидролизует ДНК с ациклическими аналогами AP-сайтов - остатками DD и DEG - со значительно меньшей эффективностью, чем THF-содержащую ДНК (данные не проиллюстрированы). Следует отметить, что использованные в работе аналоги не способны формировать основания Шиффа в отличие от природных AP-сайтов, что может быть удобно в некоторых исследованиях.

/

Рисунок 5. Структуры синтетических аналогов АР-сайта. ТОТ - остаток З-гидрокси-2-гидроксиметилтетрагидрофура-на, ОЕС -остаток диэтиленгликоля и ОО — остаток декан диола-1,10.

гГ

■о

\

THF

DEG

OD

Специфичность взаимодействия РАЛР1 и РАЛР2 с АР-сайтами в составе кластерных повреждений. Для оценки специфичности

ю

взаимодействия РА11Р1/РА11Р2 с ДНК, несущими кластерные повреждения, было исследовано влияние конкурирующих ДНК-дуплексов различной структуры на уровни пришивки ДНК, содержащим одиночный АР-сайт напротив <ЗАМР, к РАЯР2. В качестве конкурентных были использованы ДНК с АР-сайтом (для учета эффекта изотопного разбавления ДНК-пробы), ДНК с остатком ТНР, а также ДНК с АР-сайтом и остатком ТНР в комплементарных цепях напротив друг друга. Последняя структура имитирует ДНК с кластерным повреждением. Эксперименты проводили при фиксированной концентрации радиоактивно меченной АР//А-ДНК, концентрации конкурентных ДНК варьировали. Показано более эффективное связывание РА11Р1 с ДНК, содержащей два повреждения (см. Рис. 6). В то же время, для РАИР2 не наблюдается избирательность при взаимодействии с использованными ДНК (см. Рис. 6).

РА13Р1 !

Рисунок 6. Конкуренция ДНК-дуплексов за связывание с РАКР1/РАЯР2.

Эффективность пришивки АР-ДНК-пробы к РА11Р1/РА11Р2 в присутствии различных концентраций конкурентных ДНК. Уровень пришивки РАЯР1/РАЛР2 к АР-ДНК в отсутствие конкурентной ДНК принимали за 100% (столбец К). На рисунке приведены средние значения для трех независимых экспериментов. Линейные отклонения не превышали 10%.

Большинство АР-сайтов, возникающих в ДНК, репарируется по пути ВЕЯ, при этом АРЕ1 - основной фермент высших эукариот, процессирующий этот тип повреждений ДНК. Поскольку АРЕ1 при взаимодействии с АР-сайтом вносит разрыв в сахарофосфатный остов, то при наличии близко расположенных повреждений в противоположной цепи ДНК могут возникнуть двухцепочечные разрывы. С использованием очищенных белков ВЕЯ и ядерных экстрактов показано, что в ходе репарации

кластерных повреждений могут возникать двухцепочечные разрывы [David-Cordonnier et al., 2002; Yang et al., 2004].

Поскольку PARP1 и APE1 задействованы в процессе BER и показано их функциональное взаимодействие с использованием ДНК-дуплексов, несущих АР-сайты, представляло интерес исследовать влияние PARP1 на активность АРЕ1 с использованием ДНК-дуплексов с кластерными повреждениями, которые также процессируются BER.

В первую очередь предполагалось проанализировать влияние PARP1 на эффективность расщепления АР-сайтов АРЕ1 в составе кластерных повреждений, которые имитировали за счет включения в структуру ДНК аналогов АР-сайта, напротив природного АР-сайта, и в отсутствие дополнительных повреждений в ДНК-дуплексе. Было показано, что присутствие PARP1 в реакционной смеси не оказывает достоверно детектируемого влияния на уровень расщепления АРЕ1 АР-сайтов в составе ДНК-дуплексов АР//А-ДНК или AP//DD-flHK, но в ДНК-дуплексах AP/ZDEG-ДНК и АР/ЛОТ-ДИК доля расщепленных АР-сайтов значительно снижается. Это согласуется с предположением о том, что в структурном плане остаток декан-1,10-диола хуже имитирует АР-сайт, чем две другие ненуклеотидные вставки, поскольку известно, что присутствие АР-сайтов в обеих цепях ДНК снижает скорость гидролиза АР-сайтов АР-эндонуклеазой 1 [McKenzie & Strauss, 2001]. Результаты, полученные при проведении количественной оценки эффективности расщепления АР эндонуклеазой 1 АР-сайтов в составе модельных дуплексов, приведены в Табл. 1.

Таблица. 1. Влияние PARP1 на уровень расщепления АР-ДНК АРЕ1.

Тип ДНК-дуплекса Эффективность расщепления АР-сайта АРЕ1 в отсутствие PARP1 (%) Эффективность расщепления АР-сайта АРЕ1 в присутствии PARP1 (%)

АР//А-ДНК 94±5 93±5

АР//ТНР-ДНК 93±8 62±10

AP//DEG-flHK 94±10 58±12

АР//ББ-ДНК 93±7 90±8

Эффективность расщепления АР-сайта АРЕ1 определена как доля радиоактивности в пятне, соответствующем, расщепленному олигонуклеотиду, от общего содержания радиоактивности в дорожке.

Анализ эффективности расщепления позволяет предположить, что PARP1 конкурирует с АРЕ1 за взаимодействие с такими АР-ДНК, и, таким образом, предотвращает расщепление ДНК-дуплексов, содержащих кластерные повреждения. В то же время, нельзя исключить, что при

образовании тройного комплекса PARPl-APEl-AP-ДНК может происходить изменение конформации PARP1, приводящее к уменьшению количества сшивок PARP1 - АР-ДНК.

5. Взаимодействие PARP2 с ДНК-интермедиатами репарации, сравнительный анализ влияния PARP1 и PARP2 на некоторые белки эксцизионной репарации оснований

Ранее было показано, что автоРАКилирование PARP1 стимулируется специфическими структурами ДНК, такими как одно- и двухцепочечные разрывы ДНК, 3'- и 5'-свисающие концы двухцепочечной ДНК, разветвленные структуры ДНК, а также шпилечные структуры [Pion et al., 2003, 2005; D'Silva et al., 1999; Kim et al., 2004; Potaman et al, 2005; Lonskaya et al., 2005]. В целом, активность PARP2 значительно ниже, чем активность PARP1, несмотря на высокий уровень гомологии их каталитических доменов, что, возможно, связано с различием в структуре ДНК-связывающих доменов (DBD) этих PARP [Ame et al., 1999; Pion et al., 2002]. Учитывая такое различие, можно предположить, что каждый из этих белков узнает специфические структурные элементы ДНК. Для выявления ДНК-структур, которые могут быть специфически связаны PARP2, мы проанализировали взаимодействие этого белка с некоторыми ДНК-структурами, содержащими разрыв (nickDNA), бреши (gap2DNA и gaplODNA), 5'-свисающие одноцепочечные участки (flap3DNA и flap9DNA, выступающие 5'- или 3'-концевые одноцепочечные участки (over5DNA и over3DNA соответственно), ДНК, представленные сочленениями 4-х или 3-х цепей (fwjDNA и twjDNA соответственно), шпилечную ДНК (hpDNA), и двухцепочечный ДНК-дуплекс (dsDNA). Значения Кд комплексов PARP2 с указанными ДНК были оценены методом задержки в геле.

PARP2 связывается с dsDNA наименее эффективно (Кд ~ 200 нМ), что позволяет использовать перечисленные ДНК-дуплексы, содержащие двухцепочечные концы, в качестве модельных ДНК для исследования взаимодействия PARP2 с ДНК, без значимого искажения данных о сродстве белка к ДНК. Аналогичные исследования для PARP1 затруднены из-за высокого сродства этого белка к двухцепочечным концам [D'Silva et al., 1999]. Мы обнаружили, что PARP2 наиболее эффективно связывается с flap9DNA (Кд ~ 10 нМ). Для остальных ДНК-структур значения Кд варьировали в пределах от 16 до 110 нМ. В целом, среди использованных в работе ДНК, кроме dsDNA, сродство PARP2 к ДНК варьирует в пределах одного порядка величины. Эти результаты указывают на то, что PARP2 может связываться широким спектром ДНК, имитирующих интермедиа™ различных процессов метаболизма ДНК: репарации (ДНК, содержащие бреши и флэпы), рекомбинации (ДНК, содержащие свисающие концы и разветвленные ДНК-структуры) и шпильки.

Для дальнейшей характеризации взаимодействия PARP2 с ДНК мы изучили реакцию РАЯилирования. В целом активность PARP2 значительно ниже активности PARP1, что находится в соответствии с литературными данными [Ame et al., 1999]. Примечательно, что уровень синтеза PAR при совместном присутствии PARP1 и PARP2 ниже, чем в случае с PARP1 без PARP2 (данные не проиллюстрированы). Наблюдаемый эффект может быть следствием конкуренции между этими белками, однако нельзя исключить прямого взаимодействия PARP1 и PARP2, приводящего к снижению эффективности PARanHpoBamw. Учитывая литературные данные для PARP1 [Pion et al., 2005] и полученные в настоящей работе данные для PARP2, следует подчеркнуть, что, для обеих PARP не наблюдается положительной корреляции между эффективностью активации и значением Кд комплекса PARP-ДНК.

Учитывая ранее опубликованные данные о необходимости PARP2 для эффективного функционирования BER [Schreiber et al., 2002], мы изучили функциональное взаимодействие PARP2 с некоторыми белками BER (polß, XRCC1, FEN1 и АРЕ1) в сравнении с PARP1. Функциональное взаимодействие PARP1 с белками BER в реконструированных из очищенных белков системах, а также влияние автоРARRtinpoBaH^ PARP 1 на активность белков BER ранее были широко изучены [D'Amours et al., 1999; Satoh & Lindahl, 1992; Lindahl et al., 1995; de Murcia & de Murcia, 1994; Dantzer et al., 1999; Woodhouse & Dianov, 2008; Rancourt & Satoh, 2009; Sukhanova et al., 2005; Sukhanova et al., 2010]. Мы проанализировали влияние PARP1/PARP2 и их PARилиpoвaния на ДНК-полимеразную активность polß. В качестве примера на Рис. 7 приведены данные для активированной ДНК.

Рисунок 7. Влияние

PARP1 и PARP2 на ДНК-полимеразную активность polß. Реакционные смеси содержали 2 Агбо/мл активированной ДНК,

..........................................................у;..... X Pel о * FAdP t » (Ш> 0,2 мкМ PARP1/PARP2,

, . - í- : - - ¿ 0,4 мМ NAD+, а также

____-ri*«"-'""" Ж Pot ß * PARP-2 + NAD* ' '

стандартные компоненты. На рисунке представлены средние значения 3 независимых экспериментов, стандартные отклонения не превышают 10%)

5 и

—у—

Ф PoijS Ш Poig + PÄRP-i Pol р ♦ PARP-2

t. МИН

PARP2 ингибирует активность роф менее эффективно, чем PARP1. При этом добавление NAD+ приводит к снижению ингибирующего эффекта PARP1, но не PARP2. С использованием модельных ДНК, содержащих 5'-свисающий конец или флэп-структуру, установлено, что обе PARP значительно снижают стимулирующий эффект XRCC1 на активность pol(3 (данные не проиллюстрированы).

Репарация повреждений системой BER может протекать по одному из двух путей: короткозаплаточному с заменой одного нуклеотида или длиннозаплаточному с заменой 2 - 13 нуклеотидов. Считается, что большинство репарационных процессов протекает по короткозаплаточному пути, инициируемому как моно- так и бифункциональными ДНК-гликозилазами. Схема короткозаплаточного пути BER - инициация монофункциональной гликозилазой с удалением поврежденного основания и затем расщепление АР-сайта АР-эндонуклеазой 1 [Wood et al., 2001], внесение разрыва в поврежденную цепь ДНК, с образованием З'-ОН и остатка 5'-дезоксирибозофосфата (5'dRP) по краям разрыва; удаление остатока 5'-dRP и застраивание однонуклеотидной бреши ДНК-полимеразой Р (роф), что подготавливает цепь ДНК к лигированию ДНК-лигазой I (Ligl) или комплексом ДНК-лигаза Ilia (Ligllla) и XRCC1.

Окисленные основания в основном удаляются бифункциональными ДНК-гликозилазами, обладающими дополнительно АР-лиазной активностью с образованием 3'-а,р-ненасыщенного альдегида (после Р-элиминирования) и 5'-фосфата или 3'-фосфата и 5'-фосфата (в случае р,5-элиминирования). АРЕ1 проявляет З'-фосфодиэстеразную активность [Wallace, 1998] и удаляет 3'-PUA группу, подготавливая для достройки полимеразой Р и лигирования ДНК-лигазой. Удаление 3'-концевой фосфатной группы, возникающей при р,8-элиминировании, осуществляется в основном полинуклеотидкиназой [Jilani et al., 1999].

Длиннозаплаточный путь реализуется в тех случаях, когда 5'-dRP фрагмент модифицирован и не может быть удален poip. Согласно литературным данным, в этом пути BER синтез ДНК проводят репликативные ДНК-полимеразы - ро!5 или 8 - с участием PCNA [Frosina et al., 1996; Klungland & Lindahl, 1997]. Кроме того, существуют данные об участии роф в длиннозаплаточном пути BER [Klungland & Lindahl, 1997; Dianov et al., 1999]. В результате синтеза ДНК с вытеснением цепи образуется флэп длиной 2-13 нуклеотидов [Dianov et al., 1999; Fortini et al., 1998; Stucki et al., 1998]. Синтез ДНК poip с вытеснением цепи стимулируется совместным присутствием FEN1 и PARP1 [Prasad et al., 2000; Prasad et al., 2001]. Затем FEN1 удаляет образующийся флэп, оставляя разрыв со смещением на 2-13 нуклеотидов к З'-концу относительно исходного положения повреждения. На заключительном этапе разрыв ДНК лигируется Ligl.

Можно предположить, что PARJP2 необходима для сдвига равновесия в сторону одного из путей - коротко- или длиннозаплаточного. Чтобы проверить это предположение мы сравнили влияние обеих PARP на синтез ДНК с использованием ДНК-интермедиатов как коротко-, так и длиннозаплаточного путей, содержащих 3'-гидроксильную группу и остатки 5'-dRP или 5'-pTHF (данные не проиллюстрированы).

Суммируя полученные результаты можно предположить, что PARP2, как и PARP1, участвует в регуляции «длиннозаплаточного» пути BER, дополнительно подавляя активность pol(3 при синтезе ДНК с вытеснением цепи, в том числе в условиях РАКилирования. Таким образом, PARP2, в дополнение к PARP1, может в ходе BER ограничивать синтез ДНК polp, которая не обладает корректирующей активностью. Для pol(3 характерна более высокая точность при заполнении бреши (короткозаплаточный путь) [Osheroff et al., 1999].

Изучение взаимодействия PARP1 и PARP2 с FEN1. Так как в процессе синтеза ДНК по длиннозаплаточному пути образуются флэп-структуры ДНК, которые эффективно связываются поли(АОР-рибоза)полимеразой 2, мы проанализировали функциональное взаимодействие PARP с FEN1 с использованием ДНК, содержащей флэп в 9 нуклеотидов. FEN1 расщепляет флэп-содержащие ДНК в точке разветвления [Murante et al., 1995]. Обе PARP ингибируют активность FEN1 (см. Рис. 8). Следует отметить, что при совместном присутствии обеих PARP достигается наиболее глубокий уровень ингибирования активности FEN1.

К12345678

PARP1 - - - ++ -- + +

PARP 2.....+ + + +

NAD+ - -+ -+ -+ - +

Рисунок 8. Влияние РАЯР1 и РАЯР2 на активность КЕМ. Эффективность расщепления ДНК РЕШ. Реакционные смеси содержали РА1^Р1 (столбики 3, 4, 7, 8), РАР1Р2 (столбики 5-8), КАБ+ (дор. 2, 4, 6, 8). Столбик К соответствует контрольной пробе, не содержащей РЕ№. На рисунке представлены средние значения 3 независимых экспериментов и стандартные отклонения.

РЕШ и обе РАКР активны в присутствии ионов магния, в то время как ионы кальция не могут использоваться РЕШ в качестве кофактора. Использование ионов кальция при определении активности РАКР1 позволяет исключить влияние расщепления ДНК флэпэндонуклеазой на эффективность

активации РАЯР. Показано, что РЕ1М1 слабо ингибирует активность РАШЧ, но стимулирует активность РА11Р2 (см. Рис. 9). Это усиление, по-видимому, обусловлено белок-белковым взаимодействием РАЯР2 с РЕШ.

A. PARP1

С———О

4000

Б. PARP2

с—^—о

12 3 4

100

2000

FEN1, ЦМ

н о

cu s

-е- о-

S" ¿

tT) Q <

■t

" 50

0

i o.i o.oi

FEN1, ЦМ

Рисунок 9. Влияние FEN1 на активность PARP1/PARP2. Значения начальных скоростей РАЯилирования PARP1/PARP2. Реакционные смеси содержали PARP1 (панель A.), PARP2 (панель Б.), FEN1 в концентрациях, указанных на рисунке. Столбцы с номером 1 соответствуют контрольным пробам, не содержащим FEN1, и отмечают уровни активации PARP в отсутствие FEN1. На рисунке представлены средние значения 3 независимых экспериментов и стандартные отклонения.

Совокупность полученных результатов указывает на регуляторную роль обеих PARP в процессе BER, но их влияние на процесс неэквивалентно. Различия касаются как стадий процесса, так и глубины оказываемого влияния. В целом, PARP2 оказывает более слабое воздействие на активность ферментов BER, чем PARP1.

Для PARP1 характерно более выраженное влияние на ранние этапы репарации. Согласно литературным данным PARP1 эффективно узнает интермедиаты процесса BER и близкого процесса репарации одноцепочечных разрывов, содержащие разрыв цепи ДНК, что вызывает ее активацию и автоРARилиpoвaниe [de Murcia et al., 1994], обеспечивая ее регуляторную роль. В ходе данной работы показана ранее не описанная функция PARP1 в регуляции более ранних этапов BER (до образования разрывов цепи). С одной стороны, взаимодействуя с АР-сайтами с образованием ковалентного, но обратимого комплекса, PARP1 может осуществлять временную защиту АР-сайтов. С другой стороны, 5'-dRP/AP-лиазная активность PARP1 за счет расщепления АР-сайта может приводить к стимуляции поли(АОР-рибоза)полимеразной активности PARP1, и, как следствие, к формированию сигнала о повреждении ДНК, чтобы привлечь белки репарации, осуществляющие более поздние этапы репарации ДНК.

PARP2, подобно PARP1, может взаимодействовать с АР-сайтами с образованием оснований Шиффа, но в отличие от PARP1, PARP2 не расщепляет АР-сайты и менее эффективно конкурирует с АРЕ1.

В данной работе мы показали, что PARP2, подобно PARP1, ингибирует активности Роф и FEN1, но одно из наиболее важных отличий в свойствах этих белков заключается в способности PARP2 сохранять ингибирующее действие на poip и FEN1 в условиях РАЯилирования. Предположительно, автоРАЯилированная PARP2 остается в комплексе с ДНК, в то время как комплекс PARP1 с ДНК после РАЛилирования становится менее прочным и диссоциирует.

Поскольку PARP2 проявляет повышенное сродство к ДНК, содержащим флэп, которые могут возникать в процессе синтеза ДНК с вытеснением цепи, можно предположить, что роль PARP2, в отличие от PARP1, заключается в регулировании более поздних стадий ресинтеза ДНК. Отчасти, в пользу этого предположения свидетельствуют литературные данные о динамике накопления PARP1 и PARP2 в области повреждения ДНК [Mortusewicz et al., 2007].

Для обеих PARP обнаружены сшивки с АР-сайтами в составе кластерных повреждений, но для PARP2 не обнаружено избирательности при узнавании АР-сайтов в составе кластерного повреждения. PARP1 и ее автомодификация, по-видимому, вовлечены в регуляцию гидролиза АР-сайтов АР-эндонуклеазой 1 в составе кластерных повреждений, содержащих два АР-сайта в комплементарных цепях напротив друг друга. Такая регуляция особенно важна, чтобы минимизировать формирование двухцепочечных разрывов, которые наиболее токсичны для клеток [Sung & Demple, 2006]. Двухцепочечные разрывы могут возникать при спонтанном или катализируемом ферментами BER расщеплении АР-сайтов в составе кластерных повреждений.

Кроме того, полученные нами результаты позволяют предположить, что PARP2 вовлечена в регуляцию активности PARP1, предотвращая ее гиперактивацию при взаимодействии с поврежденной ДНК. Избыточный синтез PAR может приводить в клетке к истощению запасов NAD+ (а, следовательно, и АТР). Известно, что гиперактивация PARP1 может приводить к клеточной гибели [Virag & Szabo, 2002]. Таким образом, можно предположить, что регуляция активности PARP1 необходима для предотвращения клеточной гибели и позволяет провести репарацию повреждений. Можно предположить две, не исключающие друг друга, модели функционального взаимодействия PARP1 и PARP2: 1) формирование гетеродимера PARP1-PARP2; 2) конкуренция между PARP1 и PARP2 при взаимодействии с ДНК.

выводы

1. В экстрактах клеток млекопитающих обнаружен белок, взаимодействующий с апуриновыми/апиримидиновыми (АР) сайтами с образованием сшивок, опосредованных формированием основания Шиффа. Методом масс-спектрометрического анализа этот белок идентифицирован как поли(АОР-рибоза)полимераза 1 (PARP1).

2. Показано, что при взаимодействии поли(АОР-рибоза)полимеразы 2 (PARP2) с ДНК-структурами, имитирующими интермедиа™ некоторых процессов метаболизма ДНК, корреляция между эффективностью автополи(АОР-рибозил)ирования и сродством к ДНК отсутствует.

3. Сравнительный анализ функционального взаимодействия PARP1 и PARP2 с несколькими белками эксцизионной репарации оснований (BER) выявил, что:

• обе PARP ингибируют ДНК-полимеразную активность ДНК-полимеразы ß, эндонуклеазную активность флэпэндонуклеазы 1 (FEN1) и АР-эндонуклеазную активность апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы 1 (АРЕ1);

• FEN1 ингибирует активность PARP1, но стимулирует активность PARP2;

ингибиторное влияние на активность ферментов системы BER у PARP2 в целом ниже, чем у PARP1;

• PARP2 ингибирует активность PARP1;

• в условиях поли(АВР-рибозил)ирования ингибиторное влияние PARP2 на активность ферментов BER уменьшается в значительно меньшей степени по сравнению с эффектами, обусловленными PARP1.

4. Рекомбинантные PARP1 и PARP2, взаимодействуя с АР-сайтами (интактными и расщепленными), образуют стабильные аддукты. При этом PARP1 в отличие от PARP2, проявляет значимую АР-лиазную активность, и оба белка обладают слабой 5'-дезоксирибозофосфатлиазной активностью.

5. PARP1 более эффективно узнает AP-сайты в составе кластерных повреждений, (AP-сайт расположен напротив одного из его аналогов — остаток диэтиленгликоля, декандиола-1,10, или З-гидрокси-2-гидроксиметилтетрагидрофурана) по сравнению с одиночными АР-сайтами, что выражается в большем уровне сшивок ДНК-белок и в большем уровне ингибирования активности АРЕ1. Для PARP2 избирательность во взаимодействии с AP-сайтами в составе кластеров не выявлена.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах

1. Ходырева, С. Н., Ильина, Е. С., Кутузов, М. М„ Суханова, М. В., Лаврик, О. И. Взаимодействие поли(АОР-рибозо)полимеразы 1 с апуриновыми/апиримидиновыми сайтами // Докл. Акад. наук -2010. -Т. 431. -С. 132-135.

2. Khodyreva, S. N., Prasad, R., Ilina, E. S., Sukhanova, M. V., Kutuzov. M. M.. Liu, Y., Hou, E. W., Wilson, S. H., Lavrik, О. I. Apurinic/apyrimidinic (AP) site recognition by the 5'-dRP/AP lyase in poly(ADP-ribose)polymerase-l (PARP-1) // Proc. Natl. Acad. Sci. USA -2010. -V. 107. -P. 22090-22095.

3. Кутузов, M. M., Ильина, E. С., Суханова, M. В., Пышная, И. A., Пышный, Д. В., Лаврик, О. И., Ходырева, С. Н. Взаимодействие поли(АОР-рибозо)полимеразы-1 с апуриновыми.апиримидиновыми сайтами в составе кластерных повреждений ДНК // Биохимия -2011. -Т. 76. -С. 176-187.

4. Kutuzov, М. М., Amé, J.-C., Khodyreva, S. N., Schreiber, V., Lavrik, O. I. Interaction of PARP2 with DNA structures mimicking DNA repair intermediates // Biopolymers and cell -2011. -V. 27. -P. 383-386.

5. Kutuzov, M. M., Khodyreva, S. N., Amé, J.-C., Ilina, E. S., Sukhanova, M. V., Schreiber, V., Lavrik, О. I. Interaction of PARP-2 with DNA structures mimicking DNA repair intermediates and consequences on activity of base excision repair proteins // Biochimie -2013. -V. 95 -P. 1208 - 1215.

Подписано в печать 30.08.2013 г. Печать цифровая. Бумага офсетная. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 1 Тираж 110 экз. Заказ № 170.

Отпечатано в типографии «Срочная полиграфия» ИП Малыгин Алексей Михайлович 630090, Новосибирск, пр-т Академика Лаврентьева, 6/1, оф. 104 Тел. (383) 217-43-46, 8-913-922-19-07

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата химических наук, Кутузов, Михаил Михайлович, Новосибирск

СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ИНСТИТУТ ХИМИЧЕСКОЙ БИОЛОГИИ И ФУНДАМЕНТАЛЬНОЙ

МЕДИЦИНЫ СО РАН

На правах рукописи

04201361886

Кутузов Михаил Михайлович

Взаимодействие поли(АБР-рибоза)полимераз 1 и 2 с ДНК интермедиатами эксцизионной репарации оснований

03.01.04 - биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель: д.б.н., доцент Ходырева С.Н.

Новосибирск - 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений 5

Введение 7

Глава 1 Литературный обзор 10

1.1 Поли(АОР-рибозил)ирование и метаболизм поли(АОР-рибозы) 10

1.2 Семейство PARP 13

1.2.1 PARP, активность которых зависит от повреждений ДНК 15

1.2.2 Танкиразы 18

1.2.3 Белки PARP, содержащие цинковые пальцы СССН-типа 19

1.2.4 PARP, содержащие макродомен 20

1.2.5 Другие представители семейства PARP 20

1.3 Особенности структурной организации PARP2 22

1.4 Роль PARP2 в репарации ДНК 25

1.5 Роль PARP2 в сохранении целостности гетерохроматина 30

1.5.1 Роль PARP2 в сохранении целостности центромерного 30 гетерохроматина

1.5.2 Роль PARP2 в сохранении целостности теломерного 31 гетерохроматина

1.5.3 Роль PARP2 в сохранении целостности факультативного 31 гетерохроматина

1.6 Специфические функции PARP2 в процессе дифференцировки 33

1.6.1 PARP2 участвует в контроле дифференцировки половых 33 клеток самцов

1.6.2 PARP2 принимает участие в контроле дифференцировки и 34 морфогенеза

1.6.3 PARP2 необходима для нормального развития Т- 34 лимфоцитов

1.7 Роль PARP2 в воспалительном ответе 35

1.8 Перспективы ингибирования PARP2 37

1.9 Апуриновые/апиримидиновые сайты в составе кластерных 40 повреждений ДНК и их репарация

1.10 Заключение 47 Глава 2 Материалы и методы 48

2.1 Материалы 48

2.2 Методы 53

2.2.1 Выделение PARP2 53

2.2.2 Введение [32Р]-метки в 5'(3')-конец олигонуклеотида и 55 формирование ДНК-дуплексов

2.2.3 Электрофорез ДНК в ПААГ в денатурирующих условиях 56

2.2.4 Электрофорез в ПААГ в неденатурирующих условиях 57

2.2.5 Электрофорез белков по методу Лэммли 57

2.2.6 Количественная обработка распределения радиоактивности 57 в гелях

2.2.7 Измерение концентрации белка по методу Бредфорд 58

2.2.8 Получение ДНК-дуплексов, содержащих АР-сайты 58

2.2.9 Модификация белков ДНК-дуплексами, содержащими АР- 58 сайт, в реконструированных системах

2.2.10 Определение АР-эндонуклеазной активности АРЕ 1 59

2.2.11 Выявление белок-белковых взаимодействий методом 59 коиммунопреципитации

2.2.12 Выявление белок-белковых взаимодействий методом 60

сшивок глутаровым альдегидом

2.2.13 Изучение кинетики поли(АОР-рибозил)ирования с 60 использованием радиоактивномеченого NAD+

2.2.14 Получение кольцевой двухцепочечной ДНК, содержащей 61 AP-сайты и метку 32Р

2.2.15 Модификация белков клеточных экстрактов АР-ДНК 61

2.2.16 Влияние PARP1/PARP2 и XRCC1 на ДНК-полимеразную 61 активность polß

2.2.17 Влияние PARP1 и PARP2 на активность FEN1 62

2.2.18 Оценка стабильности аддуктов белок-ДНК 62

2.2.19 Идентификация белков методом иммуноблоттинга 62

2.2.20 Определение значения Кд комплекса PARP-ДНК методом 63 задержки в геле

2.2.21 Приготовление клеточных экстрактов 63

2.2.22 Выявление АР-лиазной активности PARP1/2 63

2.2.23 Выявление 5'-с1ЯР-лиазной активности PARP 1/2 64

2.2.24 Влияние PARP1/PARP2 на расщепление АР-ДНК АР- 64 эндонуклеазой 1

2.2.25 Создание ДНК-структур, с bio-dUMP на З'-конце dUMP- 64 содержащей цепи (bio-AP-ДНК)

2.2.26 МALDI-TOF-MS анализ 65

2.2.27 Приготовление лигированной ДНК с двумя шпильками 66

2.2.28. Синтез фотоактивируемых ДНК, катализируемый pol ß 66

2.2.29. Фотоаффинная модификация белков 67 Глава 3 Результаты и обсуждение 68

3.1 Выделение PARP2 68

3.2 Взаимодействие PARP 1 и PARP2 с ДНК, содержащей АР-сайты 72

3.2.1 Исследование взаимодействия PARP1 клеточных 72 экстрактов с АР-ДНК

3.2.2 Исследование взаимодействия рекомбинантной PARP1 с 77 АР-ДНК

3.2.3 Изучение активации PARP1 при взаимодействии с АР-ДНК 79

3.2.4 Изучение стабильности аддукта PARP 1-АР-ДНК 83

3.2.5 Исследование взаимодействия АРЕ1 и PARP1 в 84 присутствии АР-ДНК

3.2.6 Выявление белок-белковых взаимодействий между PARP1 86 и АРЕ1

3.2.7 Исследование взаимодействия рекомбинантной PARP2 с 89 АР-ДНК

3.2.8 Изучение стабильности аддукта PARP2-AP-flHK 95

3.2.9 Изучение влияния PARP2 на активность АРЕ1 97

3.3 Взаимодействие PARP1 и PARP2 с AP-сайтами в составе 99

кластерных повреждений

3.3.1 Ненуклеотидные вставки как аналоги АР-сайтов 99

3.3.2 Изучение модификации PARP 1 АР//Х-ДНК 101

3.3.3 Влияние PARP1 на эффективность расщепления АР- 103 эндонуклеазой 1 AP-сайта в составе кластерного повреждения

3.3.4 Определение кофакторных характеристик ионов Са'+ в 105 реакциях автополи(АОР-рибозил)ирования PARP1 и расщепления AP-сайтов АРЕ1

3.3.5 Исследование влияния АРЕ1 на уровень модификации 107

PARP1 АР//Х-ДНК 3.3.6 Изучение специфичности взаимодействия PARP1/2 с ДНК, 110 несущими кластерные повреждения 3.4 Взаимодействие PARP2 с ДНК-интермедиатами репарации, 114 сравнительный анализ влияния PARP1 и PARP2 на некоторые белки эксцизионной репарации оснований

3.4.1 Оценка сродства PARP2 к ДНК-интермедиатам репарации 114

3.4.2 Сравнительный анализ эффективности активации PARP1 и 115 PARP2

3.4.3 Исследование влияния PARP1 и PARP2 на ДНК- 118 полимеразную активность polß

3.4.4 Изучение функционального взаимодействия PARP1 и 124 PARP2 с FEN1

Выводы

Список литературы

130

131

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

AIF - фактор индукции апоптоза АРЕ1 - АР-эндонуклеаза 1 ARH - ADP-рибозиларгинингидролаза 3 ART - ADP-рибозатрансфераза

ATM - киназа, инициирующая сигнальный каскад на двухцепочечных разрывах ДНК,

который обеспечивает остановку клеточного цикла

BER - эксцизионная репарация оснований

CENPA - центромерный белок А

CENPB - центромерный белок В

DBD - ДНК-связывающий домен

DNA lig III - ДНК-лигаза III

DNA lig IV - ДНК-лигаза IV

DNA-PK - ДНК-зависимая протеинкиназа

DP - тимоциты, содержащие рецепторы CD4 и CD8

EndoIII - эндонуклеаза III

FAP-dCTP - экзо-К-{2-[К-(4-азидо-2,5-дифтор-3-хлорпиридин-6-ил)-3-аминопропиопил]-

аминоэтил}-2'-дезоксирибоцитидин-5'-трифосфат (литиевая соль)

FEN1 - флэпэндонуклеаза 1

HR - гомологичная рекомбинация

IL - интерлейкин

MEF - мышиные эмбриональные фибробласты

NF-kB - ядерный фактор каппа-В

NHEJ - негомологичное соединение концов

NIR - инцизионная репарация нуклеотидов

NLS - сигнал ядерной локализации

PAR - поли(АОР-рибоза)

PARP - поли(АОР-рибоза)полимераза

PARPG - поли(АБР-рибоза)гликогидролаза

«PARP signature» - уникальная аминокислотная последовательность в каталитическом домене семейства белков PARP PARилиpoвaниeпoли(ADP-pибoзил)иpoвaниe pol - ДНК-полимераза

PPARy - рецептор, активирующий пролиферацию пероксисом гамма

SSB - одноцепочечный разрыв ДНК

SSBR/BER - репарация одноцепочечных разрывов/эксцизионная репарация оснований ДНК

TCR - рецепторы Т-клеток

TRF - фактор связывания теломерных повторов

TTF1 -тироидный транскрипционный фактор 1

WAT - белая жировая ткань

Xi - ингибирование Х-хромосомы

XIST - специфический транскрипт инактивации Х-хромосомы

XRCC1 - белок, входящий в группу комплементации, которая обуславливает

чувствительность клеток к рентгеновскому излучению

XY-тельца - конденсированные в процессе мейоза X и Y хромосомы

миРНК - малая интерферирующая РНК

н.о. - нуклеотидные остатки

ВВЕДЕНИЕ

Геном живых организмов постоянно находится под воздействием многочисленных повреждающих экзогенных и эндогенных агентов [1]. Стабильность клеточного генома во многом обусловлена существованием систем репарации повреждений. Дефекты в системах репарации являются источником множества болезней человека и могут определять предрасположенность к раковым заболеваниям, раннему старению, дефектам роста, нейродегенеративным заболеваниям и изменениям иммунных функций организма [2]. Считается, что в клетках эукариот существует пять основных способов восстановления целостности структуры ДНК: прямая репарация, гомологичная рекомбинационная репарация ДНК, негомологичное соединение двухцепочечных концов ДНК, эксцизионная репарация нуклеотидов и эксцизионная репарация оснований [3, 4]. Каждый путь репарации ДНК направлен на исправление определенных типов повреждений. Эксцизионная репарация оснований (BER) - один из основных путей репарации ДНК задействованный в исправлении наиболее часто встречающихся повреждений ДНК - AP-сайтов и повреждений, не вызывающих значительных искажений структуры двойной спирали ДНК, таких как окисленные, дезаминированные или алкилированные азотистые основания. Процесс репарации ДНК по пути BER можно разделить на несколько этапов: инициация репарации гидролизом N-гликозидной связи между поврежденным азотистым основанием и сахарофосфатом; расщепление AP-сайта с последующей застройкой «бреши» ДНК-полимеразой и лигирование разрыва ДНК на заключительном этапе. Для обеспечения функционирования системы репарации требуется точная регуляция каждого из этапов. Несмотря на многочисленные исследования процессов репарации, можно утверждать, что механизмы регуляции и факторы, ответственные за эффективную репарацию повреждений, установлены не полностью.

В репарации кластерных повреждений ДНК, в которых разрывы, окисленные основания и AP-сайты сгруппированы в пределах одного-двух витков спирали ДНК и могут находиться в противоположных цепях ДНК, также задействованы белки системы BER, как и в случае изолированных повреждений. Репарация кластерных повреждений требует точной регуляции репарации отдельных повреждений из-за риска образования двухцепочечных разрывов ДНК. In vitro с использованием очищенных белков BER и ядерных экстрактов показано, что в ходе репарации кластерных повреждений могут возникать двухцепочечные разрывы [5], которые наиболее токсичны для клетки. При этом наличие в составе кластеров разрывов и AP-сайтов, расположенных в противоположных цепях ДНК, повышает вероятность образования двухцепочечных разрывов [5].

Одним из ключевых регуляторов ВЕК является РА11Р1. PAR.P1 - ядерный фермент, вовлеченный в процессы детекции разрывов ДНК, возникающих как непосредственно под действием ионизирующей радиации, так и опосредованно, вследствие ферментативного расщепления поврежденной ДНК (АР-сайты, окисленные или алкилированные основания) [6]. При взаимодействии с поврежденной ДНК РАкР! синтезирует поли(АОР-рибозу), ковалентно присоединенную к белкам-акцепторам (в качестве белка-акцептора может выступать другая молекула PARP1) [7 - 11]. Автополи(АОР-рибозил)ироваие PARP1, предположительно, выполняет сигнальную функцию для активации системы репарации и регуляторную функцию в ходе репарации. PARP1 также принимает участие в регуляции репарации при переходе клетки к апоптозу, она подвергается расщеплению каспазами с образованием фрагмента, предположительно необходимого для остановки репарационных процессов [12, 13].

Кроме PARP1, функцию регулятора BER может выполнять PARP2 - ее ближайший гомолог. PARP2 исследована значительно менее детально, чем PARP1, и большая часть данных получена с использованием культур клеток или на модельных животных. Необходимость PARP2 для эффективного протекания BER была показана ранее [14], но механизмы ее вовлечения в этот процесс и роль остаются невыясненными. Поэтому представляло большой интерес провести сравнительный анализ влияния PARP1 и PARP2 на белки BER с использованием ДНК, имитирующими интермедиаты этого процесса.

При исследовании белок-белковых и белок-нуклеиновых взаимодействий широко используются методы рентгеноструктурного анализа, сайт-направленного мутагенеза и иммунологической идентификации белков в составе комплексов с ДНК. Сложность и динамичность комплексов репарации ДНК накладывают определенные ограничения на использование методов рентгеноструктурного анализа и сайт-направленного мутагенеза. Применимость иммунологических подходов тоже оказывается весьма ограниченной, поскольку нельзя утверждать, что идентифицированы все ферменты и факторы эксцизионной репарации оснований. В связи с этим для изучения таких надмолекулярных ансамблей как комплексы репарации ДНК развиваются и широко используются методы направленной химической модификации. Одним из наиболее перспективных подходов исследования белок-нуклеиновых взаимодействий оказалась аффинная модификация, в частности, с использованием модельных ДНК, содержащих апуриновые/апиримидиновые сайты (АР-ДНК). Альдегидная форма дезоксирибозы АР-сайта способна образовывать основания Шиффа с первичными аминогруппами белков, которые фактически являются сшивками «нулевой длины», позволяющими выявлять непосредственные контакты белка с ДНК. Восстановление основания Шиффа боргидридом приводит к формированию

стабильных продуктов, что позволяет использовать АР-ДНК для исследования взаимодействия белков с ними.

Целью данной работы являлся сравнительный анализ влияния PARP1 и PARP2 на процессинг ДНК, имитирующих интермедиаты BER.

В ходе исследования планировалось решить следующие задачи:

• изучить специфичность взаимодействия PARP2 с ДНК, имитирующими интермедиаты репарации;

• провести сравнительный анализ параметров взаимодействия PARP1 и PARP2 с некоторыми белками BER;

• в экстрактах клеток человека провести поиск белков, специфически взаимодействующих с апуриновыми/апиримидиновыми сайтами;

• провести сравнительный анализ характеристик взаимодействия PARP1 и PARP2 с АР-ДНК с использованием аффинной модификации, функциональных тестов и других методов;

• изучить взаимодействие PARP1 с АР-ДНК, содержащими напротив АР-сайта дезоксиаденозин или аналоги AP-сайта (остатки диэтиленгликоля, декандиола-1,10, З-гидрокси-2-гидроксиметилтетрагидрофурана), как моделями кластерных повреждений ДНК.

Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР Раздел. 1.1. Поли(АВР-рибозил)ирование и метаболизм поли(АОР-рибозы)

Поли(АОР-рибозил)ирование - один из типов посттрансляционной модификации белков. Перенос ADP-рибозы на белки был впервые обнаружен при изучении бактериальных токсинов (например, токсина Corynebacterium diphtheriae). В качестве субстрата используется молекула NAD+. Моно(АОР-рибозил)ирование, катализируемое ADP-рибозилтрансферазами (ART, ADP-ribosyltransferase) широко распространено у высших эукариот и модулирует иммунный ответ, клеточную адгезию, метаболизм и формирование внутриклеточного сигнала [15]. Поли(АОР-рибозил)ирование - обратимая посттрансляционная модификация белков гомополимерной цепью, состоящей из остатков ADP-рибозы, осуществляемая поли(АОР-рибоза)полимеразами (PARPs, poly(ADP-ribose)polymerases). Эта модификация - динамический процесс, о чем свидетельствует короткое время полужизни полимера ADP-рибозы в клетках (менее 1 минуты), который подвергается деградации ферментом поли(АОР-рибоза)гликогидролазой (PARG, poly(ADP-ribose)glycohydrolase) (Рисунок 1.1). Поли(АОР-рибоза) (PAR, poly(ADP-ribose)) также может быть разрушена по альтернативному пути - ферментом ADP-рибозиларгинингидролазой 3 (ARH3, ADP-ribosylarginine hydrolase-З), который подобно PARG проявляет поли(АОР-рибоза)гликогидролазную активность, гидролизуя PAR до мономеров ADP-рибозы. ARH3 структурно отлична от PARG, однако их каталитические домены имеют некоторое сходство, что, вероятно, объясняет сходство их каталитической активности [16].

ADP-рибог

Rib Rib

I 1 p __ p

Ado

I

Nam Ado i i RIB BIB

Nam

P _ P

nad*

RIO Rib — 1n

i i a p — P i

ШЬ flit/ — i I « p _ t>

Г 4' ' 1'

Rib Ri!j — I ! I « P — P

AdO

Rib Rill®— Rib

i i a i p __ p p

Поли(АОР-рибоза)

Рисунок 1.1. Реакция поли(АВР-рнбозил)ирования и катаболизм PAR [17].

PARG проявляет как экзо-, так и эндогликозидазную активность. Она гидролизует гликозидные связи между звеньями ADP-рибозы, и таким образом, приводит к образованию свободных молекул ADP-рибозы. На данный момент у млекопитающих обнаружен только один ген PARG, представленный одной копией [18]. Наряду с очень активным ядерным белком PARG (110 кДа) и короткой митохондриальной изоформой (65 кДа), которые являются преобладающими, также существуют некоторые усеченные формы, возникающие при альтернативных вариантах сплайсинга, которые не содержат экзон 1 (102 кДа) или экзон 2 (99 кДа). Роль и локализация этих изоформ еще не в полной мере ясны. Известно, что ядерная локализация человеческой PARG (110 кДа) обусловлена присутствием в структуре белка сигнала ядерной локализации (NLS, nuclear localization signal), который закодирован в экзоне 1 [19]. Методом иммунопреципитации было выявлено взаимодействие PARG с рядом белков, преимущественно относящихся к процессам метаболизма РНК, в частности, к сплайсингу [20].

При исследовании различных тканей было обнаружено, что PARG экспрессируется в тканях сердца, семенников, почек, а также в нейрональной ткани. Во всех исследованных типах тканей PARG преимущественно локализована в митохондриальных фракциях, однако в тканях сердца, семенников и почек этот фермент был также обнаружен в цитозольной фракции [21]. Авторы статьи предполагают, что перенос PARG в ядро зависит от активности PARP1, а концентрация PARG в ядре увеличивается в ответ на синтез PAR, вызванный повреждением ДНК.

Детальный анализ роли PARG затруднен из-за отсутствия специфичных и селективных ингибиторов. Однако некоторые данные удалось получить, следуя стратегии инактивации гена. Гомозиготные мыши с делецией экзона 4, приводящей к полному удалению всех изоформ PARG, погибают на 3,5 день эмбрионального развития в результате апоптоза, индуцированн