Роль поли(ADP-рибозо)полимеразы 1 в координации процесса эксцизионной репарации оснований ДНК

Суханова, Мария Владиславовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль поли(ADP-рибозо)полимеразы 1 в координации процесса эксцизионной репарации оснований ДНК
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль поли(ADP-рибозо)полимеразы 1 в координации процесса эксцизионной репарации оснований ДНК"

На правах рукописи

СУХАНОВА МАРИЯ ВЛАДИСЛАВОВНА

РОЛЬ ПОЛИ(АОР-РИБОЗО)ПОЛИМЕРАЗЫ 1 В КООРДИНАЦИИ ПРОЦЕССА ЭКСЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ ОСНОВАНИЙ ДНК

03 00 04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 2008

003170994

Работа выполнена в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Научные руководители д х н, профессор Лаврик Ольга Ивановна

к б н , доцент Ходырева Светлана Николаевна

Официальные оппоненты д х н , профессор Малыгин Эрнст Георгиевич

к б н Жарков Дмитрий Олегович

Ведущая организация Институт цитологии РАН

Защита состоится .2008 г в Л_ часов

на заседании диссертационного совета Д 003 045 01 при Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск, пр акад Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

С авторефератом можно ознакомиться на сайте www niboch nsc ru

Автореферат разослан « 16» мая 2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета

к х н, доцент Коваль В В

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение процесса репарации ДНК эукариот является важной фундаментальной задачей современной молекулярной биологии. В процессе жизнедеятельности организма ДНК постоянно подвергается воздействию генотоксических факторов, как экзогенного, так и эндогенного происхождения. Эксцизионная репарация оснований (ЭРО) является одной из основных систем репарации ДНК эукариот, действие которой направлено на восстановление исходной структуры ДНК при повреждении оснований. На данный момент достигнут значительный прогресс в изучении структуры ферментов системы ЭРО, охарактеризованы отдельные стадии и реконструированы основные пути этого процесса. Обнаружено, что помимо ферментов, катализирующих основные этапы ЭРО, в этом процессе участвуют белковые факторы, которые могут координировать репарацию ДНК, взаимодействуя с ферментами и ДНК-интермедиатами этого процесса. Одним из таких белков является поли(АБР-рибозо)полимераза 1 (РАЯР1), которая активируется при ее взаимодействии с разрывами ДНК, образующимися при воздействии генотоксических соединений или ферментов в процессе репарации повреждений ДНК Функционирование ферментов системы ЭРО происходит в тесном взаимодействии с РАЯР1, поскольку данный белок взаимодействует не только с интермедиатами репарации ДНК, но и образует непосредственные, либо опосредованные через ДНК, белок-белковые контакты с ферментами и факторами ЭРО Несмотря на большой интерес к исследованию РАЯР1, многие детали, касающиеся функции этого белка в репарации ДНК остаются невыясненными До сих пор остается открытым вопрос о роли РАЯР1 в координации функциональной активности ферментов, катализирующих основные этапы ЭРО Поэтому изучение взаимодействия РАЯР1 с ДНК-интермедиатами и ферментами, участвующими в репарации ДНК, необходимо для понимания механизма регуляции ЭРО на молекулярном уровне Метод фотоаффинной модификации является одним из наиболее информативных подходов для исследования белок-нуклеиновых или опосредованных через ДНК белок-белковых взаимодействий, как в реконструированных системах из отдельных компонентов, так и в многокомпонентных системах на уровне ядерных или клеточных экстрактов. Применение этого метода в сочетании с изучением влияния РАЯР1 на активность ферментов системы ЭРО представляется весьма актуальным для выяснения роли этого белка в координации функционирования репаративного ансамбля.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось установление роли поли(АОР-рибозо)полимеразы 1 в координации процесса эксцизионной репарации оснований

В ходе работы планировалось решить следующие задачи 1) исследовать взаимодействие РАМ1! с ДНК-дуплексами, моделирующими интермедиаты

короткозаплаточного и длиннозаплаточного пути ЭРО методом фотоаффинной модификации; 2) исследовать функциональное взаимодействие PARP1 и апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы 1 (АРЕ1) в процессе синтеза ДНК, катализируемого ДНК-полимеразой ß (Pol ß); 3) исследовать функциональное взаимодействие PARP1, ее апоптотического 24 кДа-фрагмента (р24) и белков ядерного экстракта из семенников крупного рогатого скота в процессе репарации ДНК по длиннозаплаточному и короткозаплаточному пути ЭРО.

Научная новизна и практическая ценность. Впервые изучено функциональное взаимодействие PARP1 и ферментов системы ЭРО Показано ингибирующее влияние PARP1 на Pol ß-зависимый синтез ДНК в длиннозаплаточном пути репарации, в том числе при участии АРЕ1, которая стимулирует активность Pol ß и за счет 3'—>5* экзонуклеазной активности может осуществлять удаление ошибочно встроенных нуклеотидов в процессе синтеза ДНК, катализируемого Pol ß. Установлено, что PARP1 и ее апоптотический 24 кДа-фрагмент практически не влияют на восстановление структуры ДНК по короткозаплаточному пути ЭРО В то же время эти белки ингибируют репарацию ДНК по длиннозаплаточному пути Показано, что PARP1 и р24 подавляют синтез ДНК с вытеснением запирающей цепи и активность флэп-эндонуклеазы 1 (FEN1), которая осуществляет процессинг "свисающего" 5'-конца ДНК в этом пути репарации. Впервые продемонстрировано, что в длиннозаплаточном пути синтез ДНК, катализируемый белками экстракта из семенников крупного рогатого скота, преимущественно выполняется по механизму "трансляции однонуклеотидной бреши", когда после заполнения однонуклеотидной бреши FEN1 выщепляет нуклеотидный остаток с 5'-конца одноцепочечного разрыва и образующаяся при этом однонуклеотидная брешь de novo застраивается под действием Pol ß Установлено, что поли(АЕ)Р-рибозил)ирование PARP1, приводящее к подавлению ДНК-связывающей активности этого фермента, является необходимым условием для эффективного протекания синтеза ДНК по механизму "трансляции однонуклеотидной бреши" в длиннозаплаточном пути ЭРО Полученные данные указывают на определяющую роль PARP1 в регуляции функциональной активности Pol ß в длиннозаплаточном пути репарации

Публикации и апробация работы. Материалы диссертации опубликованы в семи печатных работах. Результаты работы были представлены на международных конференциях. "The Third International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure", 2002, Новосибирск, Россия, "Conference on Chemical and Biological Problems of Proteomics", 2004, Новосибирск, Россия, "International Conference on Chemical Biology", 2005, Новосибирск, Россия, FEBS School "Chemistry meets Biology", 2005, Спетес, Греция, FEBS School "Biology and Pathophysiology of Poly(ADP-

nbosyl)ation", 2006, Гранада, Испания; "Физико-химическая биология", 2006, Новосибирск, Россия.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, списка цитируемой литературы (177 наименований). Диссертация изложена на 140 страницах машинописного текста и содержит 40 рисунков, 6 таблиц

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Взаимодействие поли(АБР-рибозо)полимеразы 1 с ДНК-интермедиатами эксцизионной репарации оснований

Поли(АБР-рибозо)полимераза 1 - ядерный ДНК-связывающий белок, активность которого была обнаружена в клетках всех высших эукариот и в большинстве клеток низших эукариот, за исключением дрожжей PARP1 активируется при взаимодействии с разрывами ДНК, и в присутствии NAD+ катализирует синтез поли(АЕ)Р-рибозы), осуществляя ковалентную модификацию ряда ядерных белков, участвующих в метаболизме ДНК, в том числе собственную (D'Amours et ai, 1999) Поли(АОР-рибозил)ирование самой PARP1 приводит к подавлению ДНК-связывающей активности этого фермента и рассматривается как механизм, обеспечивающий регуляцию взаимодействия PARJP1 с разрывами ДНК (Lindahl et al, 1995) Значительный интерес в исследовании функции PARP1 связан, в частности, с активацией этого белка m vivo в ответ на повреждение оснований или возникновение одноцепочечных разрывов ДНК Такие повреждения ДНК обычно устраняются в процессе эксцизионной репарации оснований. Установлено, что существует два альтернативных пути ЭРО короткозаплаточный (включение одного нуклеотидного звена) и длиннозаплаточный (включение нескольких нуклеотидных звеньев) При короткозаплаточном пути Pol р встраивает один нуклеотид и удаляет 5'-дезоксирибозофосфатный остаток (dRP) за счет своей лиазной активности, формируя разрыв готовый к лигированию. В длиннозаплаточном пути синтез ДНК проходит с вытеснением запирающей цепи и образующийся в результате "свисающий" 5'-конец ДНК выщепляется за счет активности FEN1 Последняя стадия, лигирование разрыва, происходит с участием ДНК-лигазы III/I (Lig III/I) Основные этапы процесса ЭРО протекают с формированием ДНК-структур, содержащих одноцепочечные разрывы, поэтому предполагается, что PARP1 вовлекается в данный процесс через взаимодействие с разрывами ДНК Данные о взаимодействии PARP1 с ДНК-интермедиатами, формирующимися на различных этапах ЭРО, в литературе практически отсутствуют, поэтому представляло интерес исследовать взаимодействие PARP1 с интермедиатами репарации ДНК Исследование этих взаимодействий проводили методом фотоаффинной модификации с использованием фотореакционноспособных ДНК-дуплексов Здесь и далее для изучения взаимодействия белков с интермедиатами репарации ДНК использовали ДНК-дуплексы, несущие

фотореакционноспособный остаток FABG-dCMP (рис. 1 а), который вводили в З'-конец 5'-[32Р]-меченого праймера ферментативно за счет активности Pol ß Полученные ДНК-дуплексы с фотореакционноспособной группой на З'-конце и тетрагидрофуранофосфатной (рР)/фосфатной группой (Р) на 5-конце олигонуклеотидов, ограничивающих брешь/разрыв, использовали для модификации белков (см. табл 1).

Таблица 1 Структуры и обозначения фотореакционноспособных ДНК

5'-[32P]-CTGCAGCTGATGCGC» pFTACGGATCCCCGGGTAC-3' 3'-GACGTCGACTACGC(GG) CATGCCTAGGGGCCCATG-5' (ДНКЬАВи1)

5'-[HP]-CTGCAGCTGATGCG С* pGTACGGATCCCCGGGTAC-3' 3'- GACGTCGACTACGC(GG) CATGCCTAGGGGCCCATG-5 (ДНКЬАИи2)

5'-[!2P)-CTGCAGCTGATGCGC C* "GTACGGATCCCCGGGTAC-3' З'-GACGTCGACTACGCG (G) CATGCCTAGGGGCCCATG-5' (ДНК^З)

5'-[BP]-CTGCAGCTGATGCGC C* pGTACGGATCCCCGGGTAC-3' З'-GACGTCGACTACGCG (G) CATGCCTAGGGGCCCATG-5' (ÄHKhABÜ4)

C* — FABG-dCMP, pF - З-гидрокси-2-гидроксиметилтетрагидрофуранофосфат, p- фосфат

ДНКРАВ01

и ДНКРАВ03 моделируют интермедиа™ длиннозаплаточного пути ЭРО, а ДНКРАВ02 и ДНКрав04 - интермедиаты короткозаплаточного пути Облучение реакционных смесей проводили при пропускании светового излучения ртутной лампы высокого давления в области 313-365 нм через светофильтр УФС-6 После УФ-облучения продукты мечения РА11Р1 анализировали методом электрофореза в 10%-ном ЗББ-ПААГ по Лэммли Количественная оценка эффективности модификации РАИР! при

использовании ДНК на рис. 1 б.

FABG

1, ДНК 2, ДНКГАВиЗ

FABG,

или ДНКраво4

представлена

FABG-dCTP Эгао-N [4<4-4H»>-2 J> «-тетряфтарбетктикмпифимнопрбсммд)-

булшарбамопл}-? «гюссшихткдик 5* тряфосфст

ДНК™"1

ДНК"»

0,2 W «,6 «,»

Конпситрши PAKF1, «КМ

Рис. 1. а) Структурная формула аналога <КЛТ - РАЕЮ-с1СТР б) эффективность мечения РАЯР1 фотореакциоиноспособными ДНК-дуплексами (эффективность мечения — доля [32Р]-меченого праймера, присоединенного к белку)

Для ДНКравс1 и ДНКраво2 с однонуклеотидной брешью общая эффективность мечения PAR.P1 была выше, чем в случае ДНКРАВ03 и ДНКрав04, содержащих разрыв (рис 1 б) Следует отметить, что интенсивность модификации РАЯР1 слабо зависела от типа группы (фосфат или рр) на 5'-конце запирающего олигонуклеотида.

В совокупности данные фотоаффинной модификации свидетельствуют о том, что РАЯР1 взаимодействует с З'-концом инициирующего праймера в

составе ДНК-дуплексов, содержащих однонуклеотидную брешь или одноцепочечный разрыв.

2. Влияние поли(АОР-рибозо)полимеразы 1 на синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразой ß

Методом фотоаффинной модификации продемонстрировано, что PARP1 взаимодействует с интермедиатами репарации ДНК, содержащими однонуклеотидную брешь или одноцепочечный разрыв (см. пункт 1) Возможным следствием взаимодействия PARP1 с З'-концом праймера на стадии образования однонуклеотидной бреши или разрыва в процессе ЭРО может быть регуляция синтеза ДНК. В настоящее время Pol ß рассматривается в качестве ключевой полимеразы, обеспечивающей репарационный синтез ДНК В связи с этим представляло интерес исследовать влияние PARP1 на ДНК-синтезируюшую активность Pol ß Для этого были использованы ДНК-дуплексы, содержащие однонуклеотидную брешь с pF или фосфатной группой на 5-конце олигонуклеотида, запирающего брешь (см. табл 2) ДНК1 моделирует интермедиат длиннозаплаточного пути, поскольку остаток pF не может выщепляться за счет лиазной активности Pol ß, а ДНК2 - интермедиат короткозаплаточного пути ЭРО

Таблица 2. Структуры и обозначения ДНК-дуплексов

5'-[,!P]-CTGCAGCTGATGCGC pFTACGGATCCCCGGGTAC-3' (ДНК1)

3'-GACGTCGACTACGCG(G) CATGCCTAGGGGCCCATG-5'_

5'-["P]-CTGCAGCTGATGCGC 'GTACGGATCCCCGGGTACO' (ДНК2)

3 -GACGTCGACTACGCG(G) CATGCCTAGGGGCCCATG-S_

pF - З-гидрокси-2-гидроксиметилтетрагидрофуранофосфзт, p- фосфат_

Для оценки влияния PARP1 на синтез ДНК, катализируемый Pol ß, сравнивали продукты элонгации 15-мерного праймера в составе ДНЮ и ДНК2 при различных концентрациях PARP1. Данные количественной оценки влияния PARP1 на средневзвешенную длину продуктов реакции синтеза ДНК и эффективность элонгации праймера для ДНЮ и ДНК2 представлены в табл. 3

Таблица 3. Влияние PARP1 на средневзвешенную длину продуктов и эффективность элонгации праймера в реакции синтеза ДНК, катализируемой Pol ß

Концентрация PARP1 (нМ)

0 50 100 500

Средневзвешенная длина продукта (эффективность синтеза*)

ДНК1 17,3 (93) 17,4(92) 16,8 (92) 15,6(60)

ДНК2 16,3 (96) 16,2(96) 16,0(96) 15,8(78)

♦Эффективность синтеза определяли как долю (%) 15-мерного праймера, удлиненного в ходе реакции Время проведения реакции составляло 5 минут В таблице представлены данные трех независимых определений Ошибка не превышала 1,5%

В случае обоих дуплексов в присутствии РА11Р1 в концентрациях 50 нМ и 100 нМ наблюдается в основном уменьшение средневзвешенной длины продуктов реакции, а доля элонгированного праймера не изменяется Однако при увеличении концентрации РАКР1 до 500 нМ эффективность застраивания

123456789 (О

бреши существенно снижается, а синтез ДНК с вытеснением цепи ингибируется. Таким образом, PARP1 в большей степени подавляет

активность Pol ß на стадии синтеза ДНК с вытеснением цепи, чем на стадии заполнения бреши.

Наблюдаемое подавление синтеза ДНК с вытеснением цепи, катализируемого Pol ß, в присутствии PARP1 может являться следствием конкуренции этих белков за взаимодействие с ДНК-интермедиатами, формирующимися после встраивания нуклеотида в брешь. Для исследования влияния PARP1 на взаимодействие Pol ß с интермедиатами репарации ДНК, содержащими одноцепочечный разрыв, были использованы фотореакционно-способные

Polß

ttfr*

Pol Р (1 мкМ) -++ + ++ + ++ -PARPI (мкМ) 1.0 - 0,1 0.5 1.0 - 0,1 0,5 1,0 1,0

Рис. 2. Анализ продуктов мечения Pol ß фотореакционноспособным праймером в составе ДНК-дуплексов, содержащих одно-цепочечный разрыв, в присутствии PARP1 (радиоавтограф геля).

0,05 мкМ ДНКРАВ03 (дорожки 1-5) или ДНКРАВ04 (дорожки 6-10) были инкубированы с 1 мкМ Pol ß (дорожки 2-9) в присутствии 0,11,0 мкМ PARP1 (дорожки 3-5 и 79). После УФ-облучения продукты модификации анализировали электрофорезом в 10%-ном SDS-ПААГ по Лэммли.

ДНК-дуплексы ДНКРАВС3 и ДНКРАВ04 (см. табл. 1). Для обоих ДНК-дуплексов в присутствии PARP1 наблюдается резкое снижение уровня мечения Pol ß (рис. 2, сравнить дорожки 2 и 3-5, 6 и 7-9). Полученные данные свидетельствуют в пользу того, что взаимодействие PARP1 с ДНК-разрывом приводит к вытеснению Pol ß с З'-конца инициирующего праймера и блокированию дальнейшего синтеза с вытеснением цепи.

Как уже отмечалось выше, регуляция взаимодействия PARP1 с ДНК осуществляется путем ее поли(АОР-рибозил)ирования. Поэтому представляло интерес изучить влияние поли(АОР-рибозил)ирования PARP1 на синтез ДНК, катализируемый Pol ß. Для этого анализировали продукты элонгации праймера в составе ДНК1 и ДНК2 в присутствии PARP1, или PARP1 и NAD+ (рис. 3).

Рис. 3. Анализ продуктов элонгации праймера в составе ДНК-дуплексов, содержащих однонуклеотидную брешь, в присутствии PARP1 и NAD+ (радиоавтограф геля).

Синтез ДНК, катализируемый Pol ß, проводили при 37°С в смеси, содержащей 50 нМ ДНК2 (а) или 50 нМ ДНК1 (б), 50 нМ Pol ß, dNTP (10 мкМ каждый) в присутствии PARP1 (дорожки 1-3), в присутствии PARP1 и NAD+ (дорожки 4-6), и в отсутствие PARP1 и NAD+ (дорожки 7-9). Продукты реакции разделяли электрофорезом в 20%-ном ПААГ в денатурирующих условиях.

(ДНК2)

12 3 4 5

длина продукта (и.о.) . —20

-<-18

—16

BfiuxKMHH.) I

б (дню)

1 2

■(СХОДНЫЙ праймер (15 H ei.)-

PARPI 1500 нМ) NAD+ (( мМ)

При совместном добавлении PARP1 и NAD+ эффективность застраивания бреши восстанавливается до уровня, наблюдаемого в отсутствие PARP1 (рис 3 а, б, сравнить дорожки 4 и 7) В то же время, эффективность синтеза ДНК с вытеснением цепи остается ниже, чем в условиях, когда этот процесс идет в отсутствие PARP1 (рис. 3 а, б, сравнить дорожки 6 и 9). Таким образом, в присутствии NAD+ ингибирующее влияние PARP1 на активность Pol ß снижается.

В совокупности, полученные данные свидетельствуют в пользу того, что PARP1 снижает эффективность синтеза ДНК, катализируемого Pol ß, на стадии застраивания однонуклеотидной бреши и в большей степени ингибирует синтез ДНК с вытеснением цепи, что обусловлено конкуренцией PARP1 с Pol ß за связывание ДНК-субстрата Следует отметить, что активность Pol ß в реакции синтеза ДНК с вытеснением цепи восстанавливается при поли(АОР-рибозил)ировании PARP1, что указывает на возможность регуляции Pol ß-зависимого синтеза ДНК в длиннозаплаточном пути репарации с помощью PARP1.

3. Функциональное взаимодействие поли(АОР-рибозо)полимеразы 1 и апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы 1 в процессе синтеза ДНК, катализируемого ДНК-полимеразой ß

Согласно данным, представленным в пункте 2, PARP1 подавляет активность Pol ß в реакции синтеза ДНК с вытеснением запирающей цепи, характерной для длиннозаплаточного пути ЭРО В длиннозаплаточном пути синтез ДНК может катализировать Pol ß или ДНК-полимераза 8/е (Frosina et al, 1996). Однако Pol ß с низкой эффективностью работает на протяженных участках ДНК и не обладает собственной 3'—>5* экзонуклеазной активностью, уступая репликативным ДНК-полимеразам S/e в точности синтеза ДНК Предполагается, что в комплексе с Pol ß может функционировать 3'—>5' экзонуклеаза, обеспечивающая удаление в процессе синтеза ДНК ошибочно включенных нуклеотидных остатков Апуриновая/апиримидиновая эндонуклеаза 1 обладает 3*—>5' экзонуклеазной активностью и способна выщеплять З'-концевой нуклеотидный остаток в одноцепочечном разрыве Более того, экзонуклеазная активность АРЕ1 проявляется более эффективно в отношении 3'-концевого нуклеотидного остатка в составе неканонической пары оснований по сравнению с канонической парой (Chou et al, 2002) Эти результаты послужили основанием для рассмотрения АРЕ1 в качестве 3'->5' экзонуклеазы, осуществляющей коррекцию ошибок в процессе Pol ß-зависимого синтеза ДНК С другой стороны АРЕ1, расщепляя апуриновый/апиримидиновый сайт в ДНК, генерирует одноцепочечный разрыв, который эффективно опознается PARP1 Совместное функционирование АРЕ1 и PARP1 в Pol ß-зависимом синтезе ДНК не было исследовано ранее Таким образом, представляло интерес изучить

функциональное взаимодействие PARP1 и АРЕ1 в процессе синтеза ДНК, катализируемого Pol ß.

3.1. Влияние апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы 1 на активность ДНК-полимеразы ß в процессе синтеза ДНК с вытеснением цепи при наличии неканонической и канонической пары оснований на 3'-конце разрыва

Функционирование АРЕ1 в качестве "корректирующей" экзонуклеазы в Pol ß-зависимом синтезе ДНК исследовано далеко не полностью, в связи с этим представляло интерес изучить 3'—>5* экзонуклеазную активность АРЕ1 и ее влияние на синтез ДНК, катализируемый Pol ß, при наличие канонической или неканонической пары оснований на 3'-конце одноцегючечного разрыва. Для этой цели были использованы ДНКЗ, ДНК4 с канонической (C/G) и ДНК5, ДНК6 с неканонической (T/G) парой оснований на З'-конце одноцепочечного разрыва и различной структурой 5'-конца олигонуклеотида, запирающего разрыв (табл. 4).

Таблица 4. Структуры и обозначения ДНК-дуплексов, используемых для анализа 3'-»5' экзонуклеазной активности АРЕ1 и ДНК-синтезирующей активности Pol ß

5-[ä2P]-CTGCAGCTGATGCGC(C) pFTACGGATCCCCGGGTAC-3' З'-GACGTCGACTACGCG (G) CATGCCTAGGGGCCCATG-5' (ДНКЗ)

5,-['2P]-CTGCAGCTGATGCGC(C)pGTACGGATCCCCGGGTAC-3' 3'-GACGTCGACTACGCG(G) CATGCCTAGGGGCCCATG-5 (ДНК4)

5'-[52P]-CTGCAGCTGATGCGC(T)pFTACGGATCCCCGGGTAC-3' 3'-GACGTCGACTACGCG(G) CATGCCTAGGGGCCCATG-5' (ДНК5)

5'-[32P]-CTGCAGCTGATGCGC(T)I'GTACGGATCCCCGGGTAC-3' 3'-GACGTCGACTACGCG(G) CATGCCTAGGGGCCCATG-5 (ДНК6)

pF - З-гидрокси-2-гидроксиметилтетрагидрофуранофосфат, p- фосфат

За выщеплением нуклеотидных остатков с З'-конца одноцепочечного разрыва за счет активности АРЕ! следили по деградации [32Р]-меченого 16-мерного праймера в составе ДНКЗ, ДНК4, ДНК5 или ДНК6. Для ДНК-дуплексов, содержащих "свисающий" фуранофосфат на 5'-конце разрыва, эффективность выщепления З'-концевого нуклеотида в составе неканонической (Т/О) пары оснований в два раза выше по сравнению с канонической парой (СЛЗ) (рис. 4). В случае присутствия фосфатной группы на 5'-конце разрыва эффективность удаления нуклеотида в составе неканонической пары в четыре раза выше по сравнению с канонической парой. Следует отметить, что максимальный

Эффективность (%) выщепления dNMP с З'-конца одноцепочечного разрыва ja счет Я1СГНВН0СТИ АРЕ1

Рис. 4. Эффективность выщепления нуклеотидного остатка с З'-конца праймера в составе ДНК-дуплексов, содержащих одноцепочечный разрыв, за счет активности АРЕ1.

уровень выщепления З'-концевого нуклеотидного остатка, катализируемого АРЕ1, наблюдается для ДНК6 с неканонической парой оснований (T/G) на 3'-конце и фосфатной группой на 5'-конце разрыва (рис. 4).

Для определения "корректирующей" активности АРЕ1 в процессе синтеза ДНК, катализируемого Pol ß, анализировали продукты элонгации праймера в составе ДНКЗ, ДНК4 с канонической и ДНК5, ДНК6 с неканонической парой оснований на З'-конце разрыва в присутствии АРЕ1 (рис. 5, дорожки 4-7, 1114, 18-21,25-28).

[ДНКЗ)~ '=даК4> (ДНК5) (ДШС6)

1 I 2 3 4 5 6 ? " 8 9 10 II 12 IS I^'li It. 17 18 10 20 zt '22 2* 24 2S 26 27 281

длина

продукта (и.о.) т- -

- т • t ß ; ¡Й

деградации 14 ^Ш^^рМ^ИШ^

pol ß (0.05 икМ) - - - + + + +- - - + ++ +- - . + + + + . . - + 4- 4- +

АРЕ1 (2,5 мкМ) - + + -4- -4--+4--4--4-.4-4- - -f - + -+ + -4-.+

dNTP (0,1 ЫКМ) 4--+4-4---4-. + ++ ..4--4-+ + . .4-. 4-4-4-..

dNTP (ddCTP-90%)..............4--f-.--.4-4-.....4-4-

Рис. 5. Анализ продуктов элонгации праймера в составе ДНК-дуплексов с канонической и неканонической парой оснований на З'-конце одноцепочечного разрыва в присутствии АРЕ1 (радиоавтограф геля).

Синтез ДНК, катализируемый Pol ß, проводили в течение 30 минут при 37°С в смеси, содержащей 0,05 мкМ ДНКЗ (дорожки 4-7), ДНК4 (дорожки 11-14), ДНК5 (дорожки 18-21), ДНК6 (дорожки 25-28) в присутствии АРЕ1, где указано; в присутствии четырех dNTP (10 мкМ каждый) - дорожки 4, 5, И, 12, 18, 19, 25, 26 и 1 мкМ dCTP и 9 мкМ ddCTP - дорожки 6, 7, 13, 14, 20, 21, 27, 28. Реакцию проводили в течение 30 минут при 37°С, продукты реакции разделяли электрофорезом в 20%-ном ПААГ в денатурирующих условиях.

Для всех использованных ДНК-дуплексов в присутствии АРЕ1 наблюдается увеличение эффективности синтеза ДНК, катализируемого Pol ß (рис. 5, сравнить дорожки 4 и 5, 11 и 12, 18 и 19, 25 и 26). Более того, в отсутствие АРЕ1 Pol ß не удлиняет праймер в составе ДНК5 и ДНК6, содержащих неканоническую пару оснований на З'-конце разрыва (рис. 5, сравнить дорожки 18 и 19, и 25 и 26). Следует отметить, что при использовании ddCTP в качестве субстрата в реакции синтеза ДНК основной продукт элонгации праймера в составе ДНК5 и ДНК6 соответствует 16-мерному олигонуклеотиду (рис. 5, сравнить дорожки 19 и 21, 26 и 28). Вероятно, АРЕ1 выщепляет некомплементарный остаток dTMP с З'-конца праймера в составе ДНК5 и ДНК6, а встраивание ddCMP в образовавшуюся брешь вместо остатка dTMP терминирует дальнейший синтез ДНК, что и приводит к накоплению продукта, соответствующего по длине исходному праймеру. Для ДНКЗ и ДНК4 с канонической парой оснований на З'-конце разрыва при использовании ddCTP основной продукт удлинения праймера

соответствует 20-мерному олигонуклеотиду, а последующая элонгация блокируется (рис. 5, сравнить дорожки 5 и 7, 12 и 14). Согласно нуклеотидной последовательности матрицы это соответствует встраиванию ddCMP на 4-ом шаге при удлинении праймера. Таким образом, в процессе Pol ß-зависимого синтеза ДНК АРЕ1 проявляет 3'-»5' экзонуклеазную активность преимущественно в отношении З'-концевого нуклеотидного остатка в составе неканонической пары оснований на З'-конце разрыва

Полученные данные указывают на то, что АРЕ1 стимулирует активность Pol ß в реакции синтеза ДНК с вытеснением цепи Кроме того, в случае ДНК с неканонической парой оснований на З'-конце разрыва элонгация праймера, катализируемая Pol ß, обеспечивается в результате удаления неканонически спаренного нуклеотидного остатка с З'-конца разрыва за счет 3'—>-5' экзонуклеазной активности АРЕ1. Таким образом, АРЕ1 может обеспечивать точность и эффективность репарационного синтеза ДНК, катализируемого Pol

3.2. Влияние поли(АОР-рибозо)полимеразы 1 на синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразой ß в присутствии апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы 1

Согласно данным, представленным в пунктах 2 и 3 1, PARP1 подавляет синтез ДНК, катализируемый Pol ß, а АРЕ1 оказывает противоположное влияние, стимулируя активность данной полимеразы при синтезе ДНК с вытеснением цепи Совместное действие АРЕ1 и PARP1 на синтез ДНК, катализируемый Pol ß, не было исследовано ранее, поэтому представляло интерес изучить совокупный характер действия PARP1 и АРЕ1 на ДНК-синтезирующую активность Pol ß Для этого анализировали продукты удлинения праймера в составе ДНКЗ и ДНК4 в присутствии АРЕ1, PARP1, или АРЕ1 hPARPI (рис.6).

Рис 6. Анализ продуктов элонгации праймера в составе ДНК-дуплексов, содержащих одноцепочечный разрыв, в присутствии АРЕ1 и PARP1 (радиоавтограф геля)

Синтез ДНК, катализируемый Pol ß, проводили в течение 30 минут при 37°С в смеси, содержащей 0,05 мкМ ДНКЗ (а) или 0,05 мкМ ДНК4 (б), 0,05 мкМ Pol ß, dNTP (10 мкМ каждый) Концентрацию АРЕ1 варьировали в пределах от 0,1 до 2,5 мкМ, концентрацию PARPI - в пределах от 0,1 до 0,6 мкМ Продукты реакции элонгации разделяли электрофорезом в 20%-ном ПААГ в денатурирующих условиях Из данных, представленных на рис. 6 (а, б), следует, что PARP1 подавляет синтез ДНК с вытеснением цепи, катализируемый как одной Pol ß, так и Pol ß

(днкз> ^ бщнк4) ^_

12 34 5 < 7 I Ч 10 II I : J 4 S « 1 $ 4 10 II

23— 20—

исходный праймер(н о)16

Pol ß (0,05 мкМ) -

¥ Г

АРЁ1 (мкМ) --0-3 " 2,3 В - 2,5

PARP1 (мкМ) - - - Ü,l "" " 0,1 ibö. 1 «

(ДНК5) "Р=1Ъ= (ДНК6)'>=^

1 2 3 4 5 6

7 8 9 10 11 12

СДНК4)

,'р:

в присутствии АРЕ1 (рис б а, б, сравшггь дорожки 2, 3-5 и 9-11) Таким образом, при совместном добавлении PARP1 и АРЕ1 основной подавляющий эффект на синтез ДНК оказывает PARP1, поскольку в ее присутствии стимулирующее влияние АРЕ1 не проявляется (рис 6 а, б, сравнить дорожки 5 и 11).

За счет 3'—>5* экзонуклеазной активности АРЕ1, выщепляя З'-концевой нуклеотидный остаток в составе неканонической пары оснований, может осуществлять коррекцию ошибочно встроенных нуклеотидов в процессе синтеза ДНК, катализируемого Pol ß (см. пункт 3 1) Поэтому представляло интерес исследовать влияние PARP1 на 3'-»5' экзонуклеазную активность АРЕ1. Для всех используемых ДНК-дуплексов в присутствии PARP1 наблюдается ингибирование выщепления З'-концевого нуклеотидного остатка, катализируемого АРЕ1 (рис. 7)

Рис. 7. Анализ влияния PARP1 на выщепление З'-концевого

нуклеотидного остатка в составе канонической и неканонической пары оснований за счет активности АРЕ1 (радиоавтограф геля)

0,05 мкМ ДНКЗ, ДНК4, ДНК5 или ДНК6 были инкубированы с 2,5 мкМ АРЕ1 (а, б, дорожки 2-6 и 8-12) в течение 30 минут при 37°С в присутствии 0,1-0,6 мкМ PARP1 (а, б, дорожки 3-5 и 9-11) или 0,6 мкМ PARP1 и 0,5 мМ NAD" (а, б, дорожки 6 и 12) Продукты реакции разделяли электрофорезом в 20%-ном ПААГ в денатурирующих условиях

В присутствии NAD+ ингибирующее влияние PARP1 на экзонуклеазную активность АРЕ1 снижается, но полного восстановления этой активности АРЕ1 не происходит (рис 7 а, б, сравнить дорожки 2 и 6, 8 и 12). Так, например, эффективность выщепления нуклеотидного остатка с З'-конца инициирующего праймера за счет активности АРЕ1 в присутствии PARP1 и NAD+ составляет для ДНКЗ - 55,5%, ДНК4 - 71%, ДНК5 - 36%, ДНК6 - 62% от уровня, наблюдаемого в отсутствие PARP1.

В совокупности полученные данные свидетельствуют о том, что PARP1 подавляет стимулирующее влияние АРЕ1 на синтез ДНК, катализируемый Pol ß, и ингибирует 3'—>5' экзонуклеазную активность АРЕ1 Поли(АОР-рибозил)ирование PARP1 ослабляет ее ингибирующее действие. Вероятно, модификация PARP1 является необходимым условием для реализации Pol ß-зависимого синтеза ДНК с участием АРЕ1 в качестве 3'-+5' корректирующей экзонуклеазы.

исходный праймер (16но)-1514-

(ДНКЗ)"р=о^= 12 3 4 5 6

исходный прайчер ^

(16 н о)—- ЩРЩжттШ

15-- *»»«•

14--

АРЕ1 (2,5 мкМ) -+ + + + + PARP1 (мкМ) -- 0 10,30606 NAD* (0,5 мМ).....+

—о 9*10 И 12

-+++++

- - О 1030606 .....+

4. Функциональное взаимодействие поли(АОР-рибозо)полимеразы 1, ее апоптотического 24 кДа-фрагмента и белков ядерного экстракта из семенников крупного рогатого скота в процессе репарации ДНК по длиннозаплаточному и короткозаплаточному пути

На основании результатов настоящей работы представляется вероятным, что поли(АБР-рибозил)ирование PARP1, обуславливающее диссоциацию комплекса PARP1 с ДНК, является необходимым условием для реализации Pol ß-зависимого синтеза ДНК в длиннозаплаточном пути ЭРО Не исключено, что такое воздействие PARP1 на этапе репарационного синтеза ДНК является проявлением функции этого белка в регуляции длиннозаплаточного пути ЭРО. Поэтому представляло интерес детально исследовать механизм влияния PARP1 на репарацию ДНК по длиннозаплаточному и короткозаплаточному пути ЭРО, а также взаимодействие PARP1 с ДНК-дуплексами, моделирующими различные этапы репарации ДНК, в многокомпонентной системе на уровне белковых экстрактов. Использование ядерного экстракта из семенников крупного рогатого скота в качестве системы для анализа дает возможность исследовать оба пути ЭРО, которые реализуются под действием ферментов и факторов репарации, присутствующих в экстракте

4.1. Влияние поли(АОР-рибозо)полимеразы 1 и ее 24 кДа-фрагмента на репарацию ДНК-дуплексов по короткозаплаточному и длиннозаплаточному пути

По-видимому, основной механизм вовлечения PARP1 в процесс ЭРО опосредован взаимодействием этого белка с интермедиатами репарации ДНК, содержащими одноцепочечные разрывы (Satoh et al, 1992, Lavrik et al 2001) Согласно (Kaufmann et al, 1993) в апоптозе в результате протеолиза PARP1 образуется 24 кДа-фрагмент, который содержит ДНК-связывающий мотив "цинковые пальцы", обеспечивающий функциональное узнавание интактным ферментом ДНК-разрывов Таким образом, р24 обладает ДНК-связывающей активностью, но его взаимодействие с ДНК уже не регулируется через поли(А0Р-рибозил)ирование. Предполагается, что р24, связываясь с разрывом ДНК, может ингибировать репарационный процесс, оказывая стерическое препятствие взаимодействию ферментов репарации с повреждением ДНК {D'Amours et al, 2001). Предварительные эксперименты показали, что р24, как и PARP1, подавляет синтез с вытеснением цепи ДНК, катализируемый Pol ß (данные не представлены) В связи с этим представляло интерес детально исследовать влияние PARP1 и р24 на репарацию ДНК-дуплексов по длиннозаплаточному и короткозаплаточному пути ЭРО под действием белков ядерного экстракта из семенников крупного рогатого скота Для этого были использованы ДНК1 и ДНК2, содержащие однонуклеотидную брешь с различной структурой 5'-конца запирающего олигонуклеотида (см табл 2) За репарацией ДНК-дуплексов следили по образованию [32Р]-меченого 34-

мерного олигонуклеотида при инкубации ДНЮ или ДНК2 с белками экстракта в присутствии четырех dNTP и АТР (рис 8).

ДНК1 ДНК2

длина . -

продукта, н о Ч 45 8 9 12« 16 17 20 21 34— -щ

ИСХОДНЫЙ !«-

праймер

Время, мин 0 5 20 0,5 20 0,5 20 0,5 PARP1 +

р24 - +

0,5 5 +

5 0,5 5 +

Рис. 8. Анализ репарации ДНК-дуплексов, содержащих однонуклеотидную брешь, за счет активности белков ядерного экстракта в присутствии экзогенных PARP1 и р24 (радиоавтограф геля)

Реакцию проводили при 37°С в смеси, содержащей 0,05 мкМ ДНК1 (дорожки 1-12) или 0,05 мкМ ДНК2 (дорожки 13-24), белки экстракта (1,8 мг/мл), 5 мМ ATP, dNTP (10 мкМ каждый), в присутствии 0,5 мкМ PARP1 (дорожки 9-12 и 21-24), или 3 мкМ р24 (дорожки 5-8 и 17-20) Продуты реакции разделяли электрофорезом в 20%-иом ПААГ в денатурирующих условиях

В данных условиях наблюдается образование 34-мерного олигонуклеотида, что соответствует продукту, образующемуся при лигировании разрыва в ходе репарации ДНК1 и ДНК2 (рис 8 а, дорожки 1-4 и 13-16) Для обоих ДНК-дуплексов при добавлении PARP1 или р24 к фракции белков экстракта наблюдается снижение эффективности репарации (рис 8 а, сравнить дорожки 1-4 и 5-8, 9-12, 13-16 и 17-24). Однако количественная оценка влияния PARP1 и р24 на эффективность репарации ДНК-дуплексов под действием белков экстракта, показывает, что PARP1 и р24 ингибируют репарацию ДНК1 по длиннозаплаточному пути гораздо в большей степени, чем ДНК2 по короткозаплаточному пути (рис 9)

ДНЮ ДНК2

Рис. 9. Влияние РАИЧ и р24 на эффективность репарации ДНК-дуплексов по коропсо-заплаточному и длиннозаплаточному пути Эффективность репарации (%) - доля 1згР]-меченого 34-мерного олигонуклеотида.

Необходимо отметить, что в этих же условиях совместное добавление РАЯР1 и NAD+ приводит к восстановлению только ДНК-синтезирующей

активности белков экстракта, а эффект ингибирования последующих стадий в ходе репарации ДНЮ сохраняется (данные не представлены).

Таким образом, РАЫР1 и р24 практически не оказывают влияния на репарацию ДНК2 по короткозаплаточному пути, в то же время блокируют длиннозаплаточный путь на стадиях, следующих за включением нуклеотидного остатка в брешь.

Репарация ДНК1 реализуется с участием РЕШ, которая должна отщеплять "свисающий" 5'-конец цепи ДНК с фуранофосфатным остатком, возникающий в результате синтеза с вытеснением цепи запирающего олигонуклеотида {Klungland е/ а!., 1997). Поэтому представляло интерес исследовать влияние РАЯР1 и р24 на процессинг олигонуклеотида, запирающего брешь с 5'-конца, в ходе длиннозаплаточного пути под действием РЕШ экстракта. Для анализа продуктов расщепления 5'-конца олигонуклеотида, запирающего брешь, за счет активности белков экстракта была использована ДНК*1, аналогичная ДНК1, но содержащая радиоактивную метку [32Р] в составе фуранофосфатной группы на 5'-конце запирающего олигонуклеотида. За продуктами реакции, катализируемой РЕ1Ч1, следили по расщеплению 5'-[32Р]-меченого олигонуклеотида в составе ДНК* 1 (рис. 10 а).

■:pF

(днк*1):

PARP1 + + + ..... б FENI + + + + + + - + +

р24 АТР - Pol ß - + - + - + - - +

- + + - + + - - - + + PARPI - - + + + + -

NAD+ - - + - - + - - - + + dNTP + -

dNTP + + + + + + - + + + + NAD - - + + -

исходный pF-N— праймер ls

pF-N-

pF-Nj— pF-N—

pF-N,-— *«««•*. m

123 456 7 S 4 10 II

Рис. 10. Анализ влияния PARPi и p24 на расщепление олигонуклеотида, запирающего брешь с 5'-конца, в составе ДНК*1 за счет активности белков ядерного экстракта (а) или рекомбинантной FEN1 (б) (радиоавтограф геля).

а) Реакцию проводили в течение 20 минут при 37°С в реакционной смеси, содержащей 0,05 мкМ ДНК*1, белки экстракта (1,8 мг/мл), dNTP (10 мкМ каждый) в присутствии 0,6 мкМ PARP1 (дорожки 4-6), 3 мкМ р24 (дорожки 9, 11), 5 мМ АТР и 0,5 мМ NAD", где указано, б) В реконструированной системе реакцию проводили в реакционной смеси, содержащей 0,05 мкМ ДНК*1, 0,5 мкМ FEN1, 0,1 мкМ Pol ß, dNTP (10 мкМ каждый) и 0,5 мМ NAD*, где указано, в присутствии 0,6 мкМ PARP1 (дорожки 3-6) или 3 мкМ р24 (дорожки 8, 9). Продукты реакции разделяли электрофорезом в 20%-ном ПААГ в денатурирующих условиях.

Основным продуктом, образующимся при расщеплении ДНК*! за счет активности белков экстракта, является нуклеотид с фуранофосфатной группой

pF-N^— pF-Nj—

pF-Nj—- «ф * #

I 23456789

(pF-NJ (рис 10 а, дорожки 1-3) Количественная оценка показывает, что в присутствии четырех dNTP содержание pF-Ni составляет 27%, а при добавлении АТР (или АТР и NAD*) оно возрастает до 40% от общего количества продуктов, образующихся при расщеплении ДНК*1. Полученные данные указывают на то, что в исследуемом экстракте синтез ДНК в длиннозаплаточном пути преимущественно осуществляется по механизму "трансляции однонуклеотидной бреши". Ранее такой механизм синтеза ДНК был обнаружен при исследовании функционирования Pol ß в присутствии FEN1 на ник-содержащих структурах ДНК в системе, реконструированной из рекомбинантных белков (Liu et al, 2005). В соответствии с этим механизмом Pol ß катализирует застраивание однонуклеотидной бреши, далее FEN1 удаляет один нуклеотидный остаток с 5'-конца разрыва и снова формируется однонуклеотидная брешь. На рис 10 б показаны результаты анализа продуктов, образующихся при расщеплении 5'-конца олигонуклеотида в составе ДНК*1 за счет активности рекомбинантной FEN1 (дорожки 1-2), а также FEN1 в присутствии Pol ß и четырех dNTP, то есть в условиях синтеза ДНК (дорожка 2) Таким образом, в системе, реконструированной из рекомбинантных белков ЭРО, также как и в экстракте, pF-ty является основным продуктом, образующимся при расщеплении 5'-конца олигонуклеотида в составе ДНК*1 (рис 10 сравнить дорожки 1-3 (а) и 1-2 (б))

При добавлении PARP1 или р24 к фракции белков экстракта расщепление ДНК* 1, катализируемое белками экстракта, ингибируется. Следует отметить, что PARP1 и р24 подавляют главным образом образование pF-N! (рис. 10 а, сравнить дорожки 2, 3 и 4, 5; 8, 10 и 9, 11) При совместном добавлении PARP1 и NAD+ уровень расщепления ДНК*1 под действием белков экстракта частично восстанавливается (рис 10 а, сравнить дорожки 3 и 6). Аналогичным образом PARP1 и р24 влияют на расщепление ДНК* 1, катализируемое рекомбинантной FEN1 (рис 10 б) PARP1 и р24 ингибируют расщепление 5'-конца олигонуклеотида в составе ДНК*1 за счет активности FEN1, однако в этих условиях эффект подавления, обусловленный присутствием р24, выражен слабее (рис 10 б, сравнить дорожки 2 и 4, 9) Следует также отметить, что при совместном добавлении NAD+ и PARP1 наблюдается неполное восстановление эффективности расщепления ДНК*1 за счет активности FEN1 (рис. 10 б, сравнить дорожки 1,2 и 5,6).

Полученные данные свидетельствуют о том, что в исследуемом экстракте синтез ДНК в длиннозаплаточном способе преимущественно выполняется по механизму "трансляции однонуклеотидной бреши". В этом случае, Pol ß является наиболее подходящим кандидатом для осуществления синтеза ДНК по этому механизму. PARP1 и р24 практически не оказывают влияния на репарацию ДНК по короткозаплаточному пути ЭРО, в тоже время эти белки, подавляя синтез ДНК и активность FEN1, ингибируют длиннозаплаточный путь Поли(АОР-рибозил)ирование PARP1 частично снимает ее

ингибирующее влияние на активность ферментов, катализирующих репарацию ДНК по длиннозаплаточному пути. Вероятно, модификация PARPI, приводящая к подавлению ДНК-связывающей активности этого белка, необходима для эффективного протекания длиннозаплаточной репарации, когда синтез ДНК осуществляется за счет активности Pol ß по механизму "трансляции однонуклеотидной бреши".

4.2. Влияние поли(АОР-рибозо)полимеразы 1 и ее 24 кДа-фрагмента на взаимодействие белков ядерного экстракта с ДНК-интермедиатами эксцизионной репарации оснований

Согласно данным, представленным в пункте 4.2, PARP1 и р24 незначительно снижают общую эффективность репарации ДНК по короткозаплаточному пути, однако ингибируют образование интактной структуры ДНК по длиннозаплаточному пути, подавляя функционирование ферментов на стадиях, следующих за заполнением однонуклеотидной бреши. В связи с этим представляло интерес исследовать влияние PARP1 и р24 на взаимодействие белков экстракта с ДНК-интермедиатами короткозаплаточного и длиннозаплаточного пути ЭРО, содержащими одноцепочечный разрыв Для этого были использованы фотореакционноспособные ДНК-дуплексы, синтезированные ферментативно за счет активности Pol ß в присутствии FABG-dCTP, a-[32P]dATP. Полученные таким способом ДНК-дуплексы содержали фотореакционноспособный нуклеотид (FABG-dCMP) во втором положении от З'-конца инициирующего праймера, остаток [32P]dAMP был введен непосредственно в З'-конец праймера На 5'-конце олигонуклеотида, ограничивающего разрыв, присутствовала pF-rpynna (3'32рДНК<ГАВО)3), фосфатная группа (3'32рДНК(РАВО)4) или 5'-рР-"свисающий" участок одноцепочечной ДНК размером в три нуклеотидных звена (3 ,32pflHK(FABG)flap) (см табл 5).

Таблица 5 Структура и обозначение фотореакционноспособных ДНК-дуплексов, используемых для фотоаффинной модификации

5'-CTGCAGCTGATGCGC*C2pA PFGTACGGATCCCCGGGTAC-3' З'-GACGTCGACTACGCG G—Т—CATGCCTAGGGGCCCATG-5' (3,ирДНК<КЛВС)3)

5'-CTGCAGCTGATGCGC*C2|,A PGTACGGATCCCCGGGTAC-3' З'-GACGTCGACTACGCG G—T—CATGCCTAGGGGCCCATG-5' з^рднк1"^

5'-PF GTAv S'-CTGCAGCTGATGCGCCG^'AGGATCCCCGGGTACJ' 3,-GACGTCGACTACGCGG4CAT)-GCCTAGGGGCCCATG-5" 3J!pÄHK<FABC,n«p

C*-FABG-dCMP, рР-3-гидрокси-2-гидроксимстилтстрагидрофуранофосфат, p фосфат

При использовании З^рДНК^^З и 3,32рДНК(РАВО)4 спектр модифицированных белков экстракта практически не отличается (рис 11 а, дрожки 4, 13) Среди продуктов мечения белков в экстракте были отмечены ДНК-белковые аддукты, которые ранее были охарактеризованы, как PARP1 и Pol ß, ковалентно присоединенные к ДНК (Lebedeva et al., 2002). Однако при мечении белков экстракта З'^рДНК^^Аар преимущественно модифицируется PARP1 (рис 11,6 дорожка 1) Кроме того, изменение спектра модифицированных белков экстракта и интенсивности их мечения

наблюдается в присутствии низкомолекулярных субстратов АТР и NAD+. Так, в случае 3,32рДНК(РАВС>3 и 3'32рДНК(РАВО)4 при добавлении АТР наблюдается менее интенсивное мечение Pol ß и одновременно увеличение уровня модификации PARP1 и белков с кажущейся молекулярной массой около 100 кДа (белок-1) и 90 кДа (белок-2) (рис. 11 а, сравнить дорожки 4 и 5, 13 и 14). Для всех используемых фотоактивных ДНК при совместном добавлении NAD* и АТР не наблюдается мечения PARP1 (рис. 11 а, дорожки 6 и 15; б, дорожка

3).

кДа 12 3 4 J 6 7 8 9 К» I I 12

ATI' I-4+-++-+ + -+ + NA1>» - - + - +

р24 I- - -+ + + + + +-- - -

PARPl.........+ + +

бсмзошпл + + + - - -+ + + - + -

Рис. 11. Анализ влияния PARP1 и р24 на мечение белков экстракта фотореакционноспособным праймером в составе ДНК-дуплексов, содержащих одноцепочечный разрыв (радиоавтограф геля).

0,05 мкМ 3'32pflHK(FABC>3 (а, дорожки 10-18) и 3'52pflHK(FABG>4 (а, дорожки 1-9) и 0,05 мкМ 3,:!2pi(HK<FABG,flap (б) были инкубированы с белками экстракта (1,8 мг/мл) в присутствии 0,6 мкМ PARP1 (а, дорожки 1-3 и 10-12, б, дорожки 10-12), 3 мкМ р24 (а, дорожки 7-9 и 16-18, б, дорожки 4-9) с добавлением 5 мМ АТР и 0,5 мМ NAD+, где указано. Продукты фотоприсоединения белков к ДНК обрабатывали нуклеазой, где указано, и разделяли методом электрофореза в 10%-ном SDS-ПААГ по Лэммли.

При добавлении PARP1 или р24 наблюдается снижение уровня мечения белков экстракта, и основной продукт фотоприсоединения представлен ДНК-белковым аддуктом, соответствующим модифицированной PARP1 (или р24) (рис. 11 а, сравнить дорожки 4 и 1, 7; 13 и 10, 16; б, дорожки 1 и 7, 10). Таким образом, PARP1 и р24 конкурируют с белками ядерного экстракта за взаимодействие с ДНК-дуплексами, содержащими разрыв. Следует отметить, что в случае 3,32рДНК(РАВО)3 и 3,32рДНК(РАВС)Пар добавление АТР не приводит к изменению уровня мечения р24 (рис. 11 а, сравнить дорожки 7 и 8, 16 и 17; б, сравнить дорожки 7 и 8). Однако при модификации белков 3'32рДНК(РАВС)4 в присутствии АТР (или АТР и NAD+) наблюдается уменьшение уровня количества фотосшивок р24 с ДНК (рис. 11 а, сравнить дорожки 7 и 8, 9). В случае 3,32рДНК(РАВС)4 в присутствии АТР за время инкубации белков и ДНК происходит лигирование разрыва и образуется фотоактивный ДНК-дуплекс без разрыва, что приводит к снижению уровня мечения р24 (данные не представлены). При модификации белков экстракта 3'32рДНК(РАВО,3 и 3,32рДНК(РАВО)Яар в присутствии экзогенной PARP1, АТР и NAD+ снижается

PARPI +++......++*......

р24 ----_- + ++ -- -- -- + + + NAEH- - + +- - +- -+- + + -- +- - + АТР - + +■- + +- + +- + + -+ +- + + бсизоназа ++-++++++++-++++++

уровень мечения PARP1 (рис 11 а, б, сравнить дорожки 10 и 11) Следует отметить, что в том случае, когда продукты мечения белков в аналогичных условиях необработанны нуклеазой, наблюдаются высокомолекулярные ДНК-белковые аддукты и одновременно снижается количество продукта, который соответствует модификации PARP1, не содержащей поли(АБР-рибозы) (рис. 11 а, б, сравнить дорожки 11 и 12) Из сопоставления данных по электрофоретическому разделению ДНК-белковых аддуктов, обработанных и необработанных нуклеазой, следует, что высокомолекулярные продукты соответствуют мечению поли(АОР-рибозил)ированной формы PARP1, то есть в результате нуклеазного гидролиза ДНК-белкового аддукта происходит деградация не только олигонуклеотида, но и поли(АОР-рибозы), ковалентно присоединенной к PARP1 (рис. 11, а, б, сравнить дорожки 10 и 11, 12) Таким образом, PARP1 и р24 не только эффективно взаимодействуют с ДНК-интермедиатами, возникающими на ранних и поздних этапах репарации, но и конкурируют с белками экстракта за взаимодействие с ДНК. Поли(АОР-рибозил)ирование PARP1 снижает ее ДНК-связывающую активность, однако модифицированная форма PARP1 сохраняет способность взаимодействовать с районом одноцепочечного разрыва ДНК. Снижение ДНК-синтезирующей и флэп-эндонуклеазной активностей белкового экстракта в присутствии экзогенной PARP1 и NAD+ также свидетельствует о возможности взаимодействия поли(АОР-рибозил)ированной формы PARP1 с ДНК-субстратом.

В совокупности результаты проведенных исследований указывают на то, что ингибирующее влияние PARP1 и р24 на репарацию ДНК обусловлено функциональной конкуренцией между этими белками и ферментами репарации, присутствующими в экстракте, за взаимодействие с ДНК-интермедиатами ЭРО, содержащими разрывы Такая конкуренция, вероятно, играет важную роль в процессе координации ЭРО, поскольку взаимодействие PARP1 с ДНК-интермедиатами репарации может способствовать вытеснению одних и связыванию других ферментов Таким образом, PARP1 может играть ключевую роль в обеспечении передачи ДНК-субстрата от одного белка к другому в ходе ЭРО и регуляции состава белков, входящих в репаративный комплекс

ВЫВОДЫ

1. Методом фотоаффинной модификации обнаружено эффективное взаимодействие PARP1 с ДНК-интермедиатами короткозаплаточного и длиннозаплаточного путей эксцизионной репарации оснований (ЭРО), которое не зависит от типа группировки (фосфат или фуранофосфат) на 5'-краю бреши/разрыва. Показана конкуренция PARP1 с ДНК-полимеразой ß (Pol ß) за взаимодействие с ДНК-интермедиатами ЭРО, содержащими одноцепочечный разрыв

2. Изучено функциональное взаимодействие PARP1, апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы 1 (АРЕ1) в процессе синтеза ДНК, катализируемого Pol ß, на субстратах, содержащих однонукпеотидную брешь или одноцепочечный разрыв с канонической либо неканонической парой оснований на З'-конце разрыва

• Выявлено, что PARP1 снижает эффективность реакции синтеза ДНК при застраивании однонуклеотидной бреши и ингибирует синтез с вытеснением цепи, катализируемый Pol ß.

• Показано, что АРЕ1 стимулирует активность Pol ß в синтезе ДНК с вытеснением цепи При некомплементарности оснований на З'-конце разрыва АРЕ1 выщепляет З'-концевой нуклеотидный остаток, обеспечивая последующее эффективное удлинение праймера, катализируемое Pol ß

• Обнаружено, что PARP1 подавляет стимулирующее влияние АРЕ1 на активность Pol ß на структурах с одноцепочечным разрывом. Поли(АОР-рибозил)ирование PARP1 ослабляет ее ингибирующее влияние, указывая на определяющую роль этого белка в регуляции ДНК-синтезирующей активности Pol ß в длиннозаплаточном пути репарации

3. Исследовано функциональное взаимодействие PARP1, ее фрагмента 24 кДа (р24) и белков ядерного экстракта при репарации ДНК по длиннозаплаточному и короткозаплаточному пути ЭРО

• С использованием ДНК-дуплексов, содержащих фотоактивные нуклеотидные остатки на З'-конце праймера в составе однонуклеотидной бреши, разрыва или разрыва со "свисающим" 5'-концом (флэп), выявлены конкурентные взаимоотношения между PARP1, р24 и белками экстракта за взаимодействие с ДНК-интермедиатами ЭРО.

• Показано, что PARP1 или р24 практически не оказывают влияния на восстановление структуры ДНК по короткозаплаточному пути, однако ингибируют репарацию ДНК по длиннозаплаточному пути ЭРО Установлено, что оба белка подавляют синтез ДНК с вытеснением запирающей цепи и активность флэп-эндонуклеазы 1 (FEN1).

• Установлено, что в длиннозаплаточном пути ЭРО синтез ДНК, катализируемый белками экстракта, выполняется преимущественно по механизму "трансляции однонуклеотидной бреши" FEN1 выщепляет один нуклеотид с 5'-конца одноцепочечного разрыва и формирует новую однонуклеотидную брешь, которая застраивается под действием Pol ß Поли(А0Р-рибозил)ирование PARP1, приводящее к подавлению ДНК-связывающей активности этого фермента, необходимо для эффективного синтеза ДНК по указанному механизму.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Sukhanova M.V., Lavrik O.I., Safronov I.V, Khodyreva S.N. Site-specific photomodification of mammalian Poly(ADP-ribose) polymerase-1 with photoreactive DNA base excision repair intermediate II Proceedings of the third international conference on bioinformatics of genome regulation and structure. Novosibirsk: IC&G. 2002 V. 4. P. 22-24.

2. Суханова M.B., Ходырева C.H., Лаврик О.И. Поли(АОР-рибозо) полииераза-1 ингибирует синтез ДНК с вытеснением цепи, катализируемый ДНК-полимеразой pll Биохимия. 2004. Т. 69 С. 686-698.

3. Суханова М.В., Лаврик О И, Ходырева С.Н. Поли(АОР-рибозо)полимераза-1 — регулятор белково—нуклеиновых взаимодействий в процессах, возникающих при генотоксическом воздействии Молекуляр биология 2004 Т 38 С 834-847

4. Sukhanova M.V., Khodyreva S N, Lebedeva N.A., Prasad R., Wilson S.H, Lavrik О I. Human base excision repair enzymes apurmic/apyrimidinic endonucleasel (APE1), DNA polymerase ft and poly(ADP-ribose) polymerase 1 Interplay between strand-displacement DNA synthesis and proofreading exonuclease activity I I Nucleic Acids Res. 2005 V. 33 P. 1222-1229

5. Суханова M.B., Ходырева С H, Лаврик О.И Влияние экзогенной поли(АОР-рибозо)-полимеразы-1 и ее апоптотического фрагмента 24 кДа на репарацию ДНК-дуплексов в ядерном экстракте из семенников крупного рогатого скота И Биохимия. 2006 Т 71. С. 909-923

6. Суханова М.В., Ходырева С.Н, Лаврик О И Влияние апоптотического фрагмента поли(АОР-рибозо)-полимеразы-1 24 кДа на репарацию ДНК-дуплексов в ядерном экстракте из семенников крупного рогатого скота П Сборник трудов международной конференции «Физико-химическая биология». Новосибирск АРТА 2006. С. 63-64

7. Sukhanova M.V., Khodyreva S.N, Lavrik ОI Suppression of base excision repair reactions by apoptotic 24 kDa-fragment of poly(ADP-ribose) polymerase 1 in bovine testis nuclear extract II DNA repair. 2007. V 6 P. 615-625.

Изд лиц ИД № 04060 от 20 02 2001 Подписано к печати и в свет 14 05 08

Формат бумаги 60x84 Печ л 1,1 Уч-изд л 1,1 Тираж 100 Заказ № 72 Институт неорганической химии им А В Николаева СО РАН Просп Акад Лаврентьева, 3, Новосибирск, 630090

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Суханова, Мария Владиславовна

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. РОЛЬ ПОЛИ(АОР-РИБОЗО)ПОЛИМЕРАЗЫ-1 В КООРДИНАЦИИ КЛЕТОЧНЫХ ПРОЦЕССОВ В ОТВЕТ НА ПОВРЕЖДЕНИЕ ДНК (ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР )

1.1. ФЕРМЕНТЫ, ОБЕСПЕЧИВАЮЩИЕ МЕТАБОЛИЗМ ПОЛИ(АОР-РИБОЗЫ)

В КЛЕТКАХ ЭУКАРИОТП

1.1.1. СЕМЕЙСТВО ПОЛИ(АОР-РИБОЗО)ПОЛИМЕРАЗ, ПРЕДСТАВЛЕНIЮЕ В ВЫСШИХ ЭУКАРИОТАХ. СТРОЕНИЕ ПОЛИ(АОР-РИБОЗО)ПОЛИМЕРАЗЫ 1И

1.1.2. СИНТЕЗ И ДЕГРАДАЦИЯ ПОЛИ(АОР-РИБОЗЫ) В КЛЕТКЕЫ

1.2. ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ ПОЛИ(АБР-РИБОЗО)ПОЛИМЕРАЗЫ 1 ПРИ РЕПАРАЦИИ ПОВРЕЖДЕНИЙ ДНК

1.2.1. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ФУНКЦИИ

ПОЛИ(АОР-РИБОЗО)ПОЛИМЕРАЗЫ 1 НА УРОВНЕ КЛЕТКИ И ОРГАНИЗМА

1.2.2. ВОВЛЕЧЕНИЕ ПОЛИ(АОР-РИБОЗО)ПОЛИМЕРАЗЫ 1 В ПРОЦЕСС ЭКСЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ ОСНОВАНИЙ ДНК ЭУКАРИОТ

1.2.2.1. ОСНОВНЫЕ ПУТИ ЭКСЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ ОСНОВАНИЙ

ДНК В КЛЕТКАХ ЭУКАРИОТ

1.2.2.2. ВЛИЯНИЕ ПОЛИ(АОР-РИБОЗО)ПОЛИМЕРАЗЫ 1 НА РЕПАРАЦИЮ ДНК, СОДЕРЖАЩЕЙ РАЗЛИЧНЫЕ ТИПЫ ПОВРЕЖДЕНИЙ

1.2.3.3. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ПОЛИ(АОР-РИБОЗО)ПОЛИМЕРАЗЫ 1 С БЕЛКАМИ И ДНК-ИН ГЕРМЕДИАТАМИ В ПРОЦЕССЕ ЭКСЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ ОСНОВАНИЙ

1.2.3.4. ИЗМЕНЕНИЕ СТРУКТУРЫ ХРОМАТИНА В ПРОЦЕССЕ РЕПАРАЦИИ ДНК ЗА СЧЕТ I ЮЛИ(АОР-РИБОЗИЛ)ИРОВАНИЯ ГИСТОНОВ

1.2.3. РОЛЬ АКТИВАЦИИ ПОЛИ(АОР-РИБОЗО) ПОЛИМЕРАЗЫ 1 11РИ МАССИРОВАННОМ ПОВРЕЖДЕНИИ ДНК, ПРИВОДЯЩЕМ К АПОПТОТИЧЕСКОЙ

ИЛИ НЕКРОТИЧЕСКОЙ ГИБЕЛИ КЛЕТКИ

1.2.4. МОДЕЛЬ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ПОЛИ(АОР-РИБОЗО)ПОЛИМЕРАЗЫ 1 В КЛЕТОЧНЫХ ПРОЦЕССАХ, ИНДУЦИРУЕМЫХ

ГЕНОТОКСИЧЕСКИМ ВОЗДЕЙСТВИЕМЗЙ

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. МАТЕРИАЛЫ

2.1.1. РЕАКТИВЫ, РАДИОАКТИВНЫЕ МАТЕРИАЛЫ,

ПРЕПАРАТЫ НУКЛЕОТИДОВ

2.1.2. БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ШТАММЫ И ПЛАЗМИДНЫЕ ДНК

2.1.3. ОЛИГОДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОТИДЫ

2.1.4. ФЕРМЕНТЫ

2.2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.2.1. ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА РЕКОМБИНАНТНОЙ ПОЛИ(АОР-РИБОЗО)ПОЛИМЕРАЗЫ I ЧЕЛОВЕКА, ЭКСПРЕССИРОВАН1ЮЙ

В КЛЕТКАХ E.COU

2.2.1. ВВЕДЕНИЕ [32Р]-МЕТКИ В 5'-КОНЕЦ ОЛИГОНУКЛЕОТИДА

2.2.3. ФОРМИРОВАНИЕ ДНК-ДУПЛЕКСОВ

2.2.4. ГЕЛЬ-ЭЛЕКТОФОРЕЗ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ И БЕЛКОВ

2.2.5. АНАЛИЗ ВЛИЯНИЯ ПОЛИ(АОР-РИБОЗО) ПОЛИМЕРАЗЫ 1, АПУРИНОВОЙ/АПИРИМИДИНОВОЙ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ 1 И ФЛЭП-ЭНД011УКЛЕАЗЫ 1 НА Д1IK-СИПТЕЗИРУЮЩУЮ АКТИВНОСТЬ ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ р

2.2.6. АНАЛИЗ ЭНДОНУКЛЕАЗНОЙ И ЭКЗОНУКЛЕАЗНОЙ АКТИВНОСТИ АПУРИНОВОЙ/АПИРИМИДИНОВОЙ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ

2.2.7. АНАЛИЗ АКТИВНОСТИ ФЛЭП-ЭНДОНУКЛЕАЗЫ

2.2.8. АНАЛИЗ РЕПАРАЦИИ ДНК-ДУПЛЕКСОВ, КАТАЛИЗИРУЕМОЙ БЕЛКАМИ ЯДЕР1 ЮГО ЭКСТРАКТА ИЗ СЕМЕННИКОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

2.2.9. АНАЛИЗ И11ТЕРМЕДИАТА ДНК-ЛИГАЗА-[32Р]АМР В ЯДЕРНОМ ЭКСТРАКТЕ

2.2.10. ФОТОАФФИННАЯ МОДИФИКАЦИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ И БЕЛКОВ ЯДЕРНОГО ЭКСТРАКТА ИЗ СЕМЕННИКОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ФОТОРЕАКЦИОННОСПОСОБ11ЫМИ, ПРЕДСИНТЕЗИРОВАН11ЫМИ

Д Н К-СТ РУ КТУ РА МИ

2.2.11. АНАЛИЗ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПОЛИ(АОР-РИБОЗО)ПОЛИМЕРАЗЫ 1 С ДНК-СТРУКТУРАМИ, ИМИТИРУЮЩИМИ ИНТЕРМЕДИАТЫ РЕПАРАЦИИ ДНК

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ (УСТАНОВЛЕНИЕ РОЛИ ПОЛИ(АОР-РИБОЗО)ПОЛИМЕРАЗЫ 1 В КООРДИНАЦИИ ПРОЦЕССА ЭКСЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ ОСНОВАНИЙ ДНК)

3.1. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ПОЛИ(АБР-РИБОЗО)ПОЛИМЕРАЗЫ

С ДНК-ИНТЕРМЕДИАТАМИ ЭКСЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ ОСНОВАНИЙ, СОДЕРЖАЩИМИ ОДНОНУКЛЕОТИДНУЮ БРЕШЬ ИЛИ

ОДНОЦЕПОЧЕЧНЫЙ РАЗРЫВ

3.2. ВЛИЯНИЕ ПОЛИ(АБР-РИБОЗО)ПОЛИМЕРАЗЫ 1 НА СИНТЕЗ ДНК, КАТАЛИЗИРУЕМЫЙ ДНК-ПОЛИМЕРАЗОЙ р

3.2.1. ВЛИЯНИЕ ПОЛИ(АОР-РИБОЗО)ПОЛИМЕРАЗЫ 1 НА СИНТЕЗ Д1IK, КАТАЛИЗИРУЕМЫЙ ДНК-ПОЛИМЕРАЗОЙ р ПРИ ЗАСТРАИВАНИИ ОДЫОНУКЛЕОТИДЫОЙ БРЕШИ

3.2.2. ВЛИЯНИЕ ПОЛИ(АОР-РИБОЗО)ПОЛИМЕРАЗЫ 1 НА СИНТЕЗ ДНК С ВЫТЕСНЕНИЕМ ЦЕПИ, КАТАЛИЗИРУЕМЫЙ ДНК-ПОЛИМЕРАЗОЙ

3.2.3. ВЛИЯНИЕ ПОЛИ(АОР-РИБОЗО)ПОЛИМЕРАЗЫ 1 НА ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ

Д1 IK-ПОЛ ИМ ЕРАЗЫ р С ФОТОРЕАКЦИОННОСПОСОБНЫМИ Д11К-ИНТЕРМЕДИТАМИ ЭКСЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ ОСНОВАНИЙ, СОДЕРЖАЩИМИ ОДНОЦЕПОЧЕЧНЫЙ РАЗРЫ В

3.3. ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ

ПОЛИ(А1)Р-РИБОЗО)ПОЛИМЕРАЗЫ 1 И АПУРИНОВОЙ/АПИРИМИДИНОВОЙ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ 1 В ПРОЦЕССЕ СИНТЕЗА ДНК,

КАТАЛИЗИРУЕМОГО ДНК-ПОЛИМЕРАЗОЙ р1±

3.3.1. ВЛИЯНИЕ АПУРИНОВОЙ/АПИРИМИДИНОВОЙ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ 1 СИНТЕЗ Д1IK, КАТАЛИЗИРУЕМЫЙ ДНК-ПОЛИМЕРАЗОЙ р, ПРИ НАЛИЧИИ НЕКАНОНИЧЕСКОЙ И КАНОНИЧЕСКОЙ ПАРЫ ОСНОВАНИЙ НА З'-КОНЦЕ ОДНОЦЕПОЧЕЧНОГО РАЗРЫВА

3.3.2. ВЛИЯНИЕ ПОЛИ(АОР-РИБОЗО)ПОЛИМЕРАЗЫ I НА СИНТЕЗ ДНК, КАТАЛИЗИРУЕМЫЙ ДНК-ПОЛИМЕРАЗОЙ В, В ПРИСУТСТВИИ

АПУРИНОВОЙ/АПИРИМИДИНОВОЙ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ

3.3.3. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ Р С ИНТЕРМЕДИАТАМИ РЕПАРАЦИИ ДНК, СОДЕРЖАЩИМИ ОДНОЦЕПОЧЕЧНЫЙ РАЗРЫВ, В ПРИСУТСТВИИ АПУРИНОВОЙ/АПИРИМИДИНОВОЙ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ 1 И

ПОЛИ(АОР-РИБОЗО)ПОЛИМЕРАЗЫ I

3.4. ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ

ПОЛИ(АОР-РИБОЗО)ПОЛИМЕРАЗЫ 1,ЕЕ АПОПТОТИЧЕСКОГО 24 КДА-ФРАГМЕНТА И БЕЛКОВ ЯДЕРНОГО ЭКСТРАКТА ИЗ СЕМЕННИКОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА В ПРОЦЕССЕ РЕПАРАЦИИ ДНК ПО ДЛИННОЗАПЛАТОЧНОМУ И КОРОТКОЗАПЛАТОЧНОМУ ПУТИ

3.4.1. ВЛИЯНИЕ ПОЛИ(АОР-РИБОЗО)ПОЛИМЕРАЗЫ 1 И ЕЕ 24 КДА-ФРАГМЕНТА 1IA РЕПАРАЦИЮ ДПК-ДУПЛЕКСОВ ПО КОРОТКОЗАПЛАТОЧНОМУ И

ДЛИННОЗАПЛАТОЧНОМУ ПУТИ ЭКСЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ ОСНОВАНИЙ

3.4.2. ВЛИЯНИЕ ПОЛИ(АОР-РИБОЗО)ПОЛ ИМ ЕРАЗЫ 1 И ЕЕ 24 КДА-ФРАГМЕНТА НА ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ БЕЛКОВ ЯДЕРНОГО ЭКСТРАКТА С ДНК-ИНТЕРМЕДИАТАМИ ЭКСЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ ОСНОВАНИЙ

3.4.3. ВЛИЯНИЕ 24 КДА-ФРАГМЕНТА НА РЕПАРАЦИЮ ДНК ПО

ДЛИ11НОЗАПЛАТОЧ1 ЮМУ ПУТИИЗ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль поли(ADP-рибозо)полимеразы 1 в координации процесса эксцизионной репарации оснований ДНК"

Исследование процесса репарации ДНК эукариог является важной фундаментальной задачей современной молекулярной биологии. В процессе жизнедеятельности организма геном постоянно подвергается воздействию генотоксических агентов, как экзогенного, так и эндогенного происхождения (1). Системы, обеспечивающие восстановление поврежденной структуры ДНК, играют ключевую роль в поддержании стабильности генома (2). Одним из основных механизмов, который направлен па восстановление исходной структуры ДНК при повреждении оснований, является эксцизиоппая репарация оснований (ЭРО) (3). На данный момент достигнут значительный прогресс в изучении структуры ферментов системы ЭРО, охарактеризованы отдельные стадии и реконструированы основные пути этого процесса. Установлено, что существует два альтернативных пути ЭРО: короткозаплаточный (включение одного нуклеотидного звена) и длиннозаплаточный (включение нескольких нуклеотидных звеньев (3). Показано, что в реконструированных системах ЭРО репарация поврежденных оснований может осуществляться за счет активности нескольких ферментов, катализирующих основные стадии этого процесса, такие как удаление поврежденного основания ДНК, расщепление ДНК с 5'-стороны апуринового/апиримидинового (АП-сайта), репарационный синтез и восстановление фосфодиэфирной связи в реакции лигирования (3). Функции этих ферментов строго координированы, и систему ЭРО зачастую рассматривают как взаимосогласованный, функциональный ансамбль (4). Представление о механизме функционирования ЭРО в живых клетках постоянно расширяется. К настоящему времени обнаружено, что помимо ферментов, катализирующих основные этапы репарации, в этом процессе задействованы белковые факторы, которые могут способствовать сборке комплекса ферментов на сайте повреждения, модулировать активность ферментов и обеспечивать сопряжение ЭРО с другими клеточными процессами, индуцируемыми в ответ на повреждение генома (5). Поэтому исследование функциональной роли факторов репарации, способствует более полному пониманию молекулярного механизма, обеспечивающего координацию и регуляцию ферментативной системы ЭРО в клетке.

Объектом нашего исследования является ядерный белок поли(АЭР-рибозо)полимераза 1 (PARP1), которая связывается с одноцепочечными и двуцепочечными разрывами ДНК, образующимися как при воздействии генотоксических соединений, так и при функционировании ферментов во время репарации ДНК (6).

Ферментативная активность PARP1 проявляется при связывании с разрывом ДНК, когда в присутствии NAD+ данный фермент катализирует синтез поли(АОР-рибозы), осуществляя ковалентную модификацию ряда клеточных белков, участвующих в метаболизме ДНК, в том числе собственную (7). Ковалентпое присоединение поли(АОР-рибозы), разветвленного отрицательно заряженного полимера, к молекуле белка приводит к диссоциации комплекса белок-ДНК (6, 7). Поли(АОР-рибозил)ирование PARP1 приводит к подавлению ее ДНК-связывающей активности и рассматривается как механизм, обеспечивающий регуляцию взаимодействия этого фермента с разрывами ДНК (6, 7). Поврежденные основания и одноцепочечные разрывы ДНК являются основным типом повреждений, которые индуцируют синтез поли(АБР-рибозы) in vivo, что предполагает взаимосвязь активации PARP1 и процесса ЭРО (8). Инактивация PARP1 in vivo и подавление поли(АОР-рибозил)ирования приводит к нестабильности генома, которая обусловленна нарушением репарационных процессов в клетке (9). На основании ряда экспериментальных данных, полученных при исследовании функционирования PARP1 в репарации ДНК, было выдвинуто предположение о том, что взаимодействие PARP1 с разрывами ДИК происходит до сборки комплекса ЭРО, и доступ ферментов репарации к сайту повреждения ДНК обеспечивается только в результате г10ли(АБР-рибозил)ирования PARP1 (7). С другой стороны, методами дигибридного анализа и иммунопреципитации было установлено, что PARP1 образует белок-белковые контакты с ферментами и факторами ЭРО, такими как ДНК-лигаза III, ДИК-полимераза Р и XRCC1 (10). Таким образом, функционирование ферментов системы ЭРО происходит в тесном взаимодействии с PARP1, поскольку данный белок взаимодействует не только с интермедиатами репарации ДНК, но и ферментами и факторами, функционирующими в процессе ЭРО. Несмотря на большой интерес к исследованию PARP1, многие детали, касающиеся функции этого белка в репарации ДНК, остаются невыясненными. До сих пор остается открытым вопрос о роли PARP1 в координации функциональной активности ферментов, катализирующих отдельные этапы ЭРО. В процессе репарации формируются ДНК-структуры, содержащие одноцепочечные разрывы, и при связывании с ДНК-разрывами PARPI может модулировать различные этапы этого процесса. Поэтому исследование взаимодействия PARP1 со структурами, формирующимися в процессе репарации ДНК, в сочетании с анализом влияния PARP1 на активность ферментов ЭРО, может дать дополнительную информацию о молекулярном механизме функционального вовлечения PARP1 в процесс репарации. В этом случае метод фотоаффинной модификации, является одним из наиболее информативных подходов для исследования динамических, многокомпонентных систем, к которым относится комплекс ферментов ЭРО. Использование фотореакционноспособных ДНК-структур, моделирующих ДНК-интермедиаты различных этапов процесса репарации, позволяет фиксировать относительно нестабильные комплексы белков и факторов ЭРО с ДНК в процессе репарации (11). Кроме того, данный подход позволяет исследовать белок-пуклеиновые или опосредованные через ДНК белок-белковые взаимодействия, как в реконструированных системах из отдельных компонентов, так и в многокомпонентных системах на уровне ядерных или клеточных экстрактов. (11). Применение этого метода в сочетании с изучением влияния PARP1 на активность ферментов системы ЭРО, представляется весьма актуальным для выяснения роли этого белка в координации функционирования репаративного ансамбля.

Целью настоящей работы являлось установление роли поли(АОР-рибозо)полимеразьт 1 (PARP1) в координации процесса экецизионной репарации оснований.

В ходе работы планировалось решить следующие задачи: исследовать взаимодействие PARP1 с ДНК-дуплексами, моделирующими интермедиаты короткозаплаточного и длиннозаплаточного пути ЭРО методом фотоаффинной модификации; исследовать функциональное взаимодействие PARP1 и апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы 1 (АРЕ1) в процессе синтеза ДНК, катализируемого ДНК-полимеразой Р (Pol р); исследовать функциональное взаимодействие PARP1, ее апоптотического 24 кДа-фрагмента (р24) и белков ядерного экстракта из семенников крупного рогатого скота в процессе репарации ДНК по длиннозаплаточпому и короткозаплаточному пути ЭРО.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Суханова, Мария Владиславовна

выводы

1. Методом фотоаффинной модификации обнаружено эффективное взаимодействие PARP1 с ДНК-интермедиатами короткозаплаточного и длиннозаплаточного путей эксцизионной репарации оснований (ЭРО), которое не зависит от типа группировки (фосфат или фуранофосфат) на 5'-краю бреши/разрыва. Показана конкуренция PARP1 с ДНК-полимеразой р (Pol Р) за взаимодействие с ДНК-интермедиатами ЭРО, содержащими одноцепочечный разрыв.

2. Изучено функциональное взаимодействие PARP1, апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы 1 (АРЕ1) в процессе синтеза ДНК, катализируемого Pol Р, па субстратах, содержащих однонуклеотидную брешь или одноцепочечный разрыв с канонической либо неканонической парой оснований на З'-конце разрыва.

• Выявлено, что PARP1 снижает эффективность реакции синтеза ДНК при застраивании однонуклеотидной бреши и ипгибирует синтез с вытеснением цепи, катализируемый Pol р.

• Показано, что АРЕ1 стимулирует активность Pol Р в синтезе ДНК с вытеснением цепи. При некомплементарности оснований на З'-конце разрыва АРЕ1 выщепляет 3'-концевой нуклеотидный остаток, обеспечивая последующее эффективное удлинение праймера, катализируемое Pol р.

• Обнаружено, что PARP1 подавляет стимулирующее влияние АРЕ1 на активность Pol р на структурах с одноцепочечный разрывом. Поли(АОР-рибозил)ирование PARP1 ослабляет ее ингибирующее влияние, указывая на определяющую роль этого белка в регуляции ДНК-синтезирующей активности Pol Р в длиннозаплаточном пути репарации.

• Показано, что PARP1 или р24 не оказывают существенного влияния на восстановление структуры ДНК по короткозаплаточному пути, однако ингибируют репарацию ДНК по длиннозаплаточному пути ЭРО. Установлено, что оба белка подавляют синтез ДНК с вытеснением запирающей цепи и активность флэп-эндонуклеазы 1 (FEN1).

• Установлено, что в длиннозаплаточном пути ЭРО синтез ДНК, катализируемый белками экстракта, выполняется преимущественно по механизму "трансляции однонуклеотидной бреши". FEN1 выщепляет один нуклеотид с 5'-конца одноцепочечного разрыва и формирует новую однонуклеотидную брешь, которая застраивается под действием Pol (3. Поли(АОР-рибозил)ирование PARP1, приводящее к подавлению ДНК-связывающей активности этого фермента, необходимо для эффективного синтеза ДНК по указанному механизму.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ходе настоящей работы проводилось изучение механизма влияния поли(АОР-рибозо)полимеразы 1 на процесс эксцизионной репарации оснований высших эукариот. В клетках эукариот поврежденные основания и одноцепочечные разрывы ДНК, репарируются посредством эксцизионной репарации оснований (ЭРО), протекающей двумя путями в зависимости от длины ресинтезируемого участка ДНК. ДНК, содержащие разрывы в цепи, возникают как промежуточные продукты обоих путей ЭРО (3). Предполагается, что PARP1 эффективно связывается с одноцепочечными разрывами ДНК и, следовательно, может влиять на процессы, протекающие с формированием таких структур (б, 8). В ходе исследования, направленного на изучение взаимодействия PARP1 с ДНК-дуплексами, имитирующими интермедиаты репарации ДНК, были получены данные, касающиеся взаимодействия PARP1 и ферментов репарации в присутствии PARP1 с З'-копцом разрыва на различных этапах эксцизионной репарации оснований. Методом фотоаффинной модификации, как в реконструированных системах ЭРО, так и в ядерном экстракте, было выявлено, что PARP1 взаимодействует с фотореакционноспособиыми ДНК-дуплексами, моделирующими интермедиаты различных этапов длиннозаплаточного и короткозаплаточного пути ЭРО. Кроме того, показано, что PARP1 конкурирует с ДНК-полимеразой Р, АРЕ1 и белками ядерного экстракта за взаимодействие с ДНК-интермедиатами, содержащими одноцепоченый разрыв, что указывает на возможность ингибирования активности ферментов ЭРО с помощью PARP1. Поэтому особый интерес представляют результаты исследования влияния PARP1 и поли(АВР-рибозил)ирования, механизма, обеспечивающего диссоциацию ее комплексов с ДНК, на репарацию ДНК по длиннозаплаточному и короткозаплаточному пути ЭРО. Возможным следствием взаимодействия PARP1 с 3'-концом однонуклеотидной бреши или одноцепочечного разрыва может быть регуляция репарационного синтеза ДНК. Согласно существующей на данный момент модели функционирования ферментативной системы ЭРО, ДНК-полимераза р играет ключевую роль в обеспечении репарационного синтеза ДНК (92, 157), поэтому был проведен детальный анализ влияния PARP1 на синтез ДНК, катализируемый Pol р. Нами обнаружено, что PARP1 снижает эффективность реакции синтеза ДНК при застраивании однонуклеотидной бреши и ингибирует синтез с вытеснением запирающей цепи. Активность Pol Р в реакции синтеза ДНК с вытеснением цепи восстанавливается только при поли(АОР-рибозил)ировании PARPl. По-видимому, взаимодействие PARP1 с разрывом ДНК, формирующимся после встраивания нуклеотида в брешь, приводит к вытеснению ДНК-полимеразы (3 с З'-конца инициирующего праймера и блокированию дальнейшего синтеза с вытеснением цепи, характерного для "длиннозаплаточного" пути репарации. Согласно литературным данным, при длиннозаплаточном пути, синтез ДНК может катализировать Pol р или ДНК-полимераза 6 (или s) (90). Pol р не обладает собственной 3'—экзонуклеазной активностью и с низкой эффективностью выполняет синтез на протяженных участках ДНК, поэтому традиционно сложилось представление о том, что Pol Р значительно уступает репликативным ДНК-полимеразам 8/с, как в точности, так и в эффективности при синтезе ДНК в длиннозаплаточном пути ЭРО (157, 161). Однако в ходе нашего исследования были получены данные, свидетельствующие в пользу того, что Pol Р может эффективно осуществлять репарационный синтез ДНК в длиннозаплаточном пути при участии АРЕ1. Нами впервые было показано, что АРЕ1 стимулирует активность Pol Р на ник-содержащих ДНК-структурах, увеличивая эффективность реакции синтеза ДНК. Кроме того, вьпцепляя З'-концевой остаток dNMP в составе неканонической пары основания за счет своей 3'—>5' экзонуклеазной активности, АРЕ1 может осуществлять коррекцию ошибочно встроенных нуклеотидов в процессе синтеза ДНК, катализируемого Pol р. На основании этих данных можно предположить, что точность и эффективность репарационного синтеза ДНК, катализируемого Pol р, может обеспечиваться за счет функционирования данной полимеразы в комплексе с АРЕ1. Однако следует отметить, что PARP1 мешает продуктивному функционированию Pol Р и АРЕ1 в реакции синтеза ДНК, поскольку при анализе ДНК-синтезирующей активности Pol Р при одновременном присутствии АРЕ1 и PARP1 было выявлено, что PARP1 подавляет синтез ДНК, осуществляемый Pol Р в присутствии с АРЕ1, и 3'—>5' экзонуклеазную активность АРЕ1. Поли(АОР-рибозил)ирование PARP1, ослабляет се ингибирующее действие, однако не приводит к восстановлению эффективности реакций, которые катализируют Pol р и АРЕ1. Таким образом, PARP1 кардинально влияет на способность АРЕ1 повышать эффективность и точность синтеза ДНК, катализируемого Pol р. Поэтому можно предположить, что поли(АОР-рибозил)ирование PARP1, обуславливающее диссоциацию комплекса PARP1 с ДНК, является необходимым условием для реализация Pol Р-зависимого синтеза ДНК с активным участием АРЕ1.

Несомненно, что кроме анализа влияния PARP1 на синтез ДНК, важно было выяснить роль этого белка в ЭРО на стадиях, следующих за синтезом ДНК. Поэтому был проведен анализ влияния PARP1 на репарацию ДНК по длиннозаплаточному и короткозаплаточному пути ЭРО в ядерном экстракте из семенников крупного рогатого скота. Было обнаружено, что PARP1 практически не оказывает влияния на синтез ДНК при заполнении однонуклеотидной бреши и лигирование одноцепочечного разрыва, то есть на восстановление интактной структуры ДНК по короткозаплаточному пути ЭРО. Известно, что при корогкозаплаточной репарации синтез ДНК при заполнении однонуклеотидной бреши катализирует Pol Р, а последняя стадия - лигирование разрыва происходит с участиехМ ДНК-лигазы III в комплексе с XRCC1 (91-93, 177). Таким образом, Pol Р и ДНК-лигаза III способны проявлять функциональную активность в присутствии PARP1. Следует отметить, что согласно современной модели функционирования PARI3! в ЭРО, предполагается, что связывание PARP1 с разрывом в ДНК полностью блокирует репарационный процесс, и только в результате поли(АОР-рибозил)ирования обеспечивается диссоциация комплексов PARP1 с ДНК и доступ к сайту повреждения ферментов репарации (6, 108). В свою очередь нами показано, что в короткозаплаточном пути ЭРО поли(АОР-рибозил)ирование PARP1 не является необходимым условием для эффективного функционирования ферментов, катализирующих репарацию по этому пути. В то же время, PARP1 ингибирует длиинозаплаточный путь ЭРО. Более детальный анализ выявил, что PARP1 подавляет синтез ДНК с вытеснением запирающей цепи и активность FEN1, которая осуществляет процессинг "свисающего" 5'-конца ДНК в длиннозаплаточном пути ЭРО. Поли(АОР-рибозил)ирование частично снимает ингибирующее влияние PARP1 на активность ферментов, катализирующих реакции в длиннозаплаточном пути репарации. По-видимому, в длиннозаплаточном пути ЭРО модификация PARP1 имеет принципиальное значение для эффективного протекания процесса.

Нами было установлено, что в исследуемом экстракте синтез ДНК в длиннозаплаточном пути преимущественно выполняется по механизму "трансляции однонуклеотидной бреши", который ранее был обнаружен при исследовании функционирования Pol Р в присутствии FEN1 на ник-содержащих структурах ДНК в системе, реконструированной из рекомбинантных белков (169). В этом случае, после заполнения однонуклеотидной бреши за счет активности Pol р, FEN1 выщепляет один пуклеотид с 5'-конца одноцепочечного разрыва и формирует новую однонуклеогидную брешь. Таким образом, создавая субстрат с однонуклеотидной брешью, на котором Pol р проявляет максимальную каталитическую эффективность, FEN1 стимулирует активность Pol р (169). Поскольку в нашей работе впервые показано, что синтез ДНК по механизму "трансляции однонуклеотидной бреши" осуществляется с участием белков ядерного экстракта, это говорит о возможности существования раннее не описанного способа синтеза ДНК в длиннозаплаточном пути ЭРО in vivo. Именно Pol Р является наиболее подходящим кандидатом для выполнения синтеза ДНК по этому механизму в живой клетке. Таким образом, Pol Р может играть ключевую роль в обеспечении синтеза ДНК в длиннозаплаточном пути ЭРО, и ее партнерами в этом процессе могут быть FEN1, формирующая ДНК-субстрат, на котором Pol Р работает более эффективно, а также АРЕ1, функционирующая как корректирующая экзонуклеаза. В тоже время, поли(АОР-рибозил)ирование PARP1, приводящее к подавлению ДНК-связывающей активности этого фермента, по-видимому, необходимо для реализации длиннозаплаточного пути репарации с участием Pol р в качестве основной полимеразы.

На настоящий момент не установлено, какая именно полимераза - Pol р или ДНК-полимераза 5/s, играет ключевую роль в длиннозаплаточном пути репарации, однако предполагается, что заполнение однонуклеотидной бреши всегда катализирует Pol р, а при дальнейшем синтезе с вытеснением цепи может происходить переключение синтеза ДНК от Pol р к PCNA-зависимым ДНК-полимеразам 5(или г) (3, 5, 158). Возможно, что взаимодействие PARP1 с одноцепочечным разрывом в ДНК может способствовать переключению синтеза ДНК от Pol Р к синтезу, катализируемому ДНК-полимеразой 5, так как известно, что ДНК-полимераза 5, в отличие от других репликативиых ДНК-полимераз с и а, способна выполнять синтез ДНК в присутствии PARP1 (118, 176). По-видимому, модификация PARP1 будет способствовать реализации Pol Р-зависимого синтеза ДНК, поскольку эффективное протекание длиннозаплаточной репарации, когда синтез ДНК осуществляется за счет активности Pol Р, возможно только при снижении ДНК-связывающей активности PARP1 за счет ее поли(АОР-рибозил)ирования.

Полученные данные позволили предложить модель координации ЭРО с помощью PARP1 (рис. 3.33). Согласно этой модели, PARP1 может вовлекаться в ЭРО на этапе образования однонуклеотидной бреши. На этом этапе представляется возможным, функционирование Pol р в комплексе с PARP1, в этом случае Pol Р встраивает нуклеогид в З'-конец праймера и за счет лиазной активности удаляет 5'-dRP остаток. Связывание PARP1 с одноцепочечным разрывом после заполнения бреши, возможно, способствует посадке ДНК-лигазы III, которая лигирует разрыв, завершая короткозаплаточный путь ЭРО (путь 1). В том случае, когда 5'-сШ.Р-остаток не удаляется за счет лиазной активности Pol р реализуется длиннозаплаточный путь, в котором синтез ДНК может осуществляться с участием Pol р или PCNA-зависимых ДНК-полимераз (5/s). По-видимому, взаимодействие PARP1 с ник-содержащими ДНК-интермедиатами длиннозаплаточного пути ЭРО способствует вытеснению Pol (3 с З'-конца разрыва и посадке ДНК-полимеразы 8. Таким образом, в процессе длиннозаплаточной репарации может происходить переключение синтеза Д1IK за счет активности Pol (3 к синтезу, катализируемому PCNA-зависимой ДНК-полимеразой 6 (путь 4). Поли(АОР-рибозил)ирование PARP1 и последующая диссоциация ее комплекса с ДНК может способствовать реализации Pol [3-зависимого синтеза ДНК при участии АРЕ1 (путь 2) или FEN1 (путь 3).

Короткозаплаточный путь

PAHW Рй (5

-г-гтТ^гт

54 3'I

-3-5'

3'-*

-1-Я? Г | ,,

5'п I"'1 г г г3' 3'-^' ' 5*

UWB,,

---т—О

-а1-I I ■ > ci

3'—'

-ГП--3' 5'

АЮЕ1

51—

-3' -5'

5' .1 I I I ! J 1 ; т-г 3' ■■ ■ g'

Длин нсаагитаточн ый путь

РуяАРЕ! aH*L—- 3'

ПопЧАСР-еибвжп*!™™» PARPI NAD-

2'I- ------

Р<хр I

5-ГТПГ-1 -т -----3

З' '-1. ■—5'

5'i I [ 1— i / I I 3' у ■ * ' ?■ т 1 ■ 5'

PoJ p

PARPI

3'.5' Pol!

-3' L 5'

Pol

53': '-1 l~>

54 L i i i-т-г —--3' i<

5'.

3^—-1 . ■ • 5"

3' ' ; i i ■ ' ' ' ■ 5'

Рис, 3.33. Гипотетическая модель координации процесса ЭРО с помощью PARP1.

Таким образом, взаимодействуя с ДНК-интермедиатами репарации, PARP1 может обеспечивать передачу ДНК-субстрата от одного белка к другому в процессе ЭРО, способствовать связыванию определенных ферментов, функционирующих на данном этапе репарации и регулировать композицию участников репарационного процесса.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Суханова, Мария Владиславовна, Новосибирск

1. Lindahl Т. Instability and decay of the primary structure of DNA // Nature 1993. V. 362. P. 709.

2. Sharer O.D. Chemistry and biology of DNA repair // Angew. Chem. Int. Ed. 2003. V. 42. P. 2946-2974.

3. Lindahl T. Suppression of spontaneous mutagenesis in human cells by DNA base excision-repair //Mutat. Res. 2000. V. 462. P. 129-135.

4. Wilson S.H., Kunkel T.A. Passing the baton in base excision repair // Nat. Struct. Biol. 2000. V. 7. P. 176-178.

5. Fan J., Wilson III D.M. Protein-protein interactions and posttranslational modifications in mammalian base excision repair//Free Radio. Biol. Med. 2005. V. 38. P. 1121-1138.

6. Lindahl Т., Satoh M.S., Poirier G.G., Klangland A. Post-translational modification of poly(ADP-ribose) polymerase induced by DNA strand breaks // Trends Biochem. Sci. 1995. V. 20. P.405-411.

7. D'Amours D., Desnoyers S., D'Silva I., Poirier G.G. Poly(ADP-ribosyl)ation reactions in the regulation of nuclear functions //Biochem. J. 1999. V. 342. P. 249-268.

8. Dantzer F., Атё J.С., Schreiber V., Nakamura J., Mdnissier de Murcia M.J., de Murcia G. Poly(ADP-ribose) polymerase-1 activation during DNA damage and repair// Methods Enzymol. 2006. V. 409. P. 493-510.

9. Shall S.S., de Murcia G. Poly(ADP-ribose) polymerase-1: what have we learned from the deficient mouse model? // Mutat. Res. 2000. V. 460. P. 1-15.

10. Dantzer F., Schreiber V., Niedergang С., Trucco C., Flatter E., De La Rubia G., Oliver J., Rolli V., Menissier de Murcia J., de Murcia G. Involvement of poly(ADP-ribose) polymerase in base excision repair //Biochimie. 1999. V. 81. P. 69-75.

11. Khodyreva S.N., Lavrik O.I. Photoaffinity labeling technique for studying DNA replication and DNA repair//Curr. Med. Chem. 2005. V. 12. P. 641-655.

12. Bernstein C., Bernstein II., Payne C.M., Garewal H. DNA repair/pro-apoptotic dual-role proteins in five major DNA repair pathway: fail-safe protection against carcinogenesis // Mutat. Res. 2002. V. 511. P. 145-178.

13. Althaus F.R., Kleczowska H.E., Malanga M., Muntener C.R., Pleschke J.M., Ebner M., Auer B. Poly ADP-ribosylation: a DNA break signal mechanism // Mol. Cell Biochem. 1999. V. 193. P. 5-11.

14. Hassa P.O., Haenni S.S., Elser M., Hottiger M.O. Nuclear ADP-ribosylation reactions in mammalian cells: where are we today and where are we going? // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2006. V. 70. P. 789-829.

15. Ngaewaa P.A., Fuertesb М.Л., Valladaresa В., Alonsob C., Perez J.M. Poly(ADP-Ribose)polymerases: homology, structural domains and functions, novel therapeutical application //Prog. Biophys. Mol. Biol. 2005. V. 88. P. 143-172.

16. Desmarais Y., Menard L., LagueuxJ., Poirier G. Enzymological properties of poly(ADP-ribose polymerase: characterization of automodification sites and NADase activity // Biochim. Biophys. Acta. 1991. V. 1078. P. 179-186.

17. A me J.C., Rolli V., Schreiber V., Niedergang C., Apion F., Decker P., Midler S., Iioger Т., Menissier de Murcia J., de Murcia G. PARP-2, a novel mammalian DNA damage-dependent poly(ADP-ribosc)polymerase// J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 17860-17868.

18. Sallmann F.R., Vodenicharov M.D., Wang Z.Q., Poirier G.G. Characterization of sPARP-1 //J. Biol. Chem. 2000. V. 275 P. 15504-15511.

19. A me J.C., Spenlehauer C., de Murcia G. The PARP superfamily //2004. BioEssays. V. 26. P. 1-12.

20. Ogata N., Ueda K, Kawaichi M., Hayaishi O. Poly(ADP-Ribose) synthetase, a main acceptor of poly(ADP-ribose) in isolated nuclei //J. Biol. Chem. 1981. V. 256. P. 41354137.

21. Yamanaka II., Penning C.A., Willis E.H., Wasson D.B., Carson D.A. Characterization of human poly(ADP-ribose) polymerase with autoantibodies //./. Biol. Chem. 1988. V. 263. P. 3879-3883.

22. Virag L., Szabo C. The Therapeutic potential of poly(ADP-Ribose) polymerase inhibitors //Pharmacol. Rev. 2002. V. 54. P. 375-429.

23. Kameshita I., Matsuda M., Nishikimi M., Ushiro H., Shiznta Y. Reconstitution and poly(ADP-ribosyl)ation of proteolytically fragmented poly(ADP-ribose) synthetase //./. Biol. Chem. 1986. V. 261. P. 3863-3868.

24. Nishikimi M, Ogasawara K, Kameshita I, Taniguchi T, Shizuta Y. Poly(ADP-ribose) synthetase. The DNA binding domain and the automodification domain // J. Biol Chem. 1982. V. 257. P. 6102-6105.

25. Kaufmann S.H., Desnoyers S., Ottaviano Y, Davidson N.E., Poirier G.G. Specific proteolytic cleavage of poly(ADP-ribose) polymerase: an early marker of chemo-therapy-induced apoptosis // Cancer Res. 1993. V. 53. P. 3976-3985.

26. BorkP., Hofmann K., Bucher P., Neuwald A.F., Altschul S.F, Koonin E. V. Superfamily of conserved domains in DNA damage-responsive cell cycle checkpoint proteins // FASEB J. 1997. V. 11. P. 68-76.

27. Alvarez-Gonzalez R., Watkins T.A., Gill P.K., Reed J.L., Mendoza-Alvarez H. Regulatory mechanisms of poly(ADP-ribose) polymerase // Mol. Cell. Biochem. 1999. V. 193. P. 1922.

28. Tanuma S., Yagi Т., Johnson G.S. Endogenous ADP-ribosylation of high mobility group proteins 1 and 2 and histone HI following DNA damage in intact cells //Arch. Biochem. Biophys. 1985. V. 237. P. 38-42.

29. Gradwohl G., Mazen A., de Murcia G. Poly(ADP-ribose) polymerase forms loops with DNA // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1987. V. 148. P. 913-919.

30. Huang K., Tidyman W.E., Le K.U., Kirsten E., Кип E„ Ordahl C.P. Analysis of nucleotide sequence-dependent DNA binding of poly(ADP-ribose) polymerase in a purified system // Biochemistry. 2004. V. 43. P. 217-223.

31. Lonskaya I., Potaman V.N., Shlyakhtenko L.S., Oussatcheva E.A., Lyubchenko Y.L, Soldatenkov V.A. Regulation of poly(ADP-ribose) polymerase-1 by DNA structure-specific binding// J. Biol. Chem. 2005. V. 280. P. 17076-17083.

32. Ruf A., Rolli V., de Murcia G., Schulz G.E. The mechanism of the elongation and branching reaction of poly(ADP-ribose)polymerase as derive form crystal structures and mutagenesis //1998. J. Mol. Biol. V. 278. P. 57-65.

33. Ikejima M., Marsischky G„ Gill D.M. Direction of elongation of poly(ADP-ribose) chains. Addition of residues at the polymerase-proximal terminus //./. Biol. Chem. 1987. V. 262. P. 17641-17650.

34. Kawaichi M., Ueda K., Hayaishi O. Initiation of poly(ADP-ribosyl)-histone synthesis by poly(ADP-ribose) synthetase //J. Biol. Chem. 1980. V. 255. P. 816-819.

35. Ueda K., Kawaichi M., Okayama H., Hayaishi O. Poly(ADP-ribosyl)ation of nuclear proteins. Enzymatic elongation of chemically synthesized ADP-ribose-histone adducts // ./. Biol. Chem. 1979. V. 254. P. 679-687.

36. Alvarez-Gonzalez R. 3'-Deoxy-NAD+ as a substrate for poly(ADP-ribosc)polymerase and the reaction mechanism of poly(ADP-ribose) elongation //J. Biol. Chem. 1988. V. 263. P. 17690-17696.

37. Rolli V., O'Farrell M., Menissier de Murcia J., de Murcia G. Random mutagenesis of the poly(ADP-ribose) polymerase catalytic domain reveals amino acids involved in polymer branching //Biochemistry. 1997. V. 36. P. 12147-12154.

38. Miwa M., Saikawa N., Yamaizumi Z, Nishimura S., Sugimura T. Identification of 2'-l"-ribosyl-2"-(or 3"-)(r"-ribosyl). adenosine-5,,5",5"'-tris(phosphate) as a branch linkage // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1979. V. 76. P. 595-599.

39. Mendoza-Alvarez H., Alvarez-Gonzalez R. Biochemical characterization of mono(ADP-ribosyl)ated poly(ADP-ribose) polymerase //Biochemistry. 1999. V. 38. P. 3948-3953.

40. Alvarez-Gonzalez R., Jacobson M.K. Characterization of polymers of adenosine diphosphate ribose generated in vitro and in vivo // Biochemistry. 1987. V. 26. P. 32183224.

41. Kiehlbauch C.C., Aboul-Ela N. Jacobson E.L., Ringer D.P., Jacobson M.K. High resolution fractionation and characterization of ADP-ribose polymers // Anal. Biochem. 1993. V. 208. P. 26-34.

42. Mendoza-Alvarez PI., Alvarez-Gonzalez R. Poly(ADP-ribose) polymerase is a catalytic dimmer and the auto modification reaction is intermolecular //J. Biol. Chem. 1993. V. 268.,P. 22575-22580.

43. Bauer P.I., Buki KG., Накат A., Kim E. Macromolecular association of ADP-ribosyl transferase and its correlation with enzymic activity //Biochem. J. 1990. V. 270. P. 17-26.

44. Pion E., Bombarda E., Stiegler P., Ullmann G.M., Mely Y., de Murcia G., Gerard D. Poly(ADP-ribose)polymerase-l dimerizes at a 5' recessed DNA end in vitro: a fluorescence study // Biochemistry. 2003. V. 42. P. 12409-12417.

45. Kirslen E., Кип E., Mendeleyev J., Ordahl C.P. Activity assays for poly-ADP ribose polymerase//Methods Mol. Biol. V. 287. P. 137-149.

46. Zahradka P., Ebisuzaki K. A shuttle mechanism for DNA-protein interactions. The regulation of poly(ADP-ribose) polymerase //Eur. J. Biochem. 1982. V. 127. P. 579-585.

47. Oka J., Ueda K., Hayaishi О., Komura H., Nakanishi K. ADP-ribosyl protein lyase. Purification, properties and identification of the product//1984. J. Biol. Chem. V. 259. P. 986-995.

48. Alvarez-Gonzalez R., Althaus F.R. Poly(ADP-ribose) catabolism in mammalian cells exposed to DNA-damaging agents //Mutat. Res. 1989. V. 218. P. 67-74.

49. Brochu G., Duchaine C., Thibeault L., Lagueux J., Shah G.M., Poirier G.G. Mode of action of poly(ADP-ribose) glycohydrolase // Biochim. Biophys. Acta. 1994. V. 1219. P. 342-350.

50. Davidovic L, Vodenicharov M., Affar E.B., Poirier G.G. Importance of poly(ADP-ribose) glycohydrolase in the control of poly(ADP-ribose) metabolism // Exp. Cell. Res. 2001. V. 268. P. 7-13.

51. Bauer P.I., Buki KG., Кип E. Evidence for the participation of histidine residues located in the 56 kDa C-terminal polypeptide domain of ADP-ribosyl transferase in its catalytic activity //FEBSLett. 1990. V. 273. P. 6-10.

52. Kim H., Jacobson M.K, Rolli V., Menissier de Murcia J., Reinbolt J., Simonin F., Ruf A., Schulz G., de Murcia G Photoaffinity labelling of human poly(ADP-ribose) polymerase catalytic domain //Biochem. J. 1997. V. 322. P. 469-475.

53. Juarez-Salinas H., Sims J.L., Jacobson M.K. Poly(ADP-ribose) levels in carcinogen treated cells //Nature. 1979. V. 282. P. 740-741.

54. Malanga M., Althaus F.R. Poly(ADP-ribose) molecules formed during DNA repair in vivo //J. Biol. Chem. 1994. V. 269 P. 17691-17696.

55. Rankin P.W., Jacobson M.K., Mitchell V.R., Busbee D.L. Reduction on nicotinamide adenine dinucleotide levels by ultimate carcinogens in human lymphocytes // Cancer Res. 1980. V. 40. P. 1803-1807.

56. Goodwin P.M., Lewis P.J., Davies M.I., Skidmore C.J., Shall S. The effect of gamma radiation and neocarzinostatin on NAD and ATP levels in mouse leukaemia cells // Biochim. Biophys. Acta. 1978. V. 543. P. 576-582.

57. James M.R., Lehmann A.R. Role of poly(adenosine diphosphate ribose) in deoxyribonucleic acid repair in human fibroblast // Biochemistry. 1982. V. 21. P. 40074013.

58. Berger N.A. Poly(ADP-ribose) in the cellular response to DNA damage // Radiat. Res. 1985. V. 101. P. 4-15.

59. Park S.D., Kim C.G., Kim M.G. Inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase enhance DNA strand breaks, excision repair and sister chromatid exchanges induced by alkylating agents //Environ. Mutagen. 1983. V. 5. P. 515-525.

60. Ktipper J.H., de Murcia G., Biirkle A. Inhibition of poly(ADP-ribosyl)ation by overexpressing the poly(ADP-ribose) polymerase DNA-binding domain in mammalian cells//./. Biol. Chem. 1990. V. 265. P. 18721-18724.

61. Menissier de Murcia J., Niedergang C., Trucco C., Ricoul M., Dutrillaux В., Mark M., Oliver F.J., Masson M., Dierich A., LeMeur M., Walztinger C„ Chambon P., de Murcia

62. G. Requirement of poly(ADP-ribose) polymerase in recovery from DNA damage in mice and in cells //Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1997. V. 94. P. 7303-7307.

63. Wang Z.Q., Auer В., Stingl L., Berghammer H., Haidacher D., Schwciger M., Wagner E.F. Mice lacking ADPRT and poly(ADP-ribosyl)ation develop normally but are susceptible to skin disease // Genes Dev. 1995. V. 9. P. 509-520.

64. Trucco C., Oliver F.J., de Murcia G., Menissier-de Murcia J. DNA repair defect in poly(ADP-ribose) polymerase-deficicnt cell lines // Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. P. 2644-2649.

65. Ding R„ Pommier Y., Kang V.H., Smulson M. Depletion of poly(ADP-ribose) polymerase by antisense RNA expression results in a delay in DNA strand break rejoining // J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 12804-12812.

66. Slevnsner Т., Ding R., Smulson M., Bohr V.A. Inhibition of gene-specific repair of alkylation damage in cells depleted of poly(ADP-ribose) polymerase// Nucleic Acids Res. 1994. V. 22. P. 4620-4624.

67. Ding R., Smulson M. Depletion of nuclear poly(ADP-ribose) polymerase by antisense RNA expression: influences on genomic stability, chromatin organization, and carcinogen cytotoxicity //Cancer Res. 1994. V. 54. P. 4627-4634.

68. Shieh W.M., Ame J.C., Wilson M.V., Wang Z.O., Koh D.W., Jacobson M.K., Jacobson E.L. Poly(ADP-ribose) polymerase null mouse cells synthesize ADP-ribose polymers//./. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 30069-30072.

69. Kupper J.H., MiXller M„ Btirkle A. Trans-dominant inhibition of poly(ADPribosyl)ation potentiates cancinogen-induced gene amplification in SV40-transformed Chinese hamster cells //Cancer Res. 1996. V. 56. P. 2715-2717.

70. Chatterjee S., Hirschler N.V., Petzold S.J., Berger S.J., Berger N.A. Mutant cells defective in poly(ADP-ribose) synthesis due to stable alterations in enzyme activity or substrate availability // Exp. Cell Res. 1989. V. 184. P. 1-15.

71. Witmer M. V., Aboul-Ela N., Jacobson M.K., Stamato T.D. Increased sensitivity to DNA-alkylating agents in CHO mutants with decreased poly(ADP-ribose) polymerase activity //Mutat. Res. 1994. V. 314. P. 249-260.

72. Wang Z.O., Stingl L., Morrison C., Jantsch M., Los M., Schulze-Osthoff K, Wagner E.F. PARP is important for genomic stability but dispensable in apoptosis // Genes Dev. 1997. V. 11. P. 2347-2358.

73. Seeberg E., Eide L., Bjoras M. The base excision repair pathway // Trends Biochem. Sci. 1995. V. 20. P. 391-397.

74. Krokan H.E., Standal 11, Slupphaug G. DNA glycosylases in the base excision repair of DNA //Biochem. J. 1997. V. 325. P. 1-16.

75. Wilson III D.M., Barsky D. The major human abasic endonuclcase: formation, consequences and repair of abasic lesions in DNA // Mutat. Res. 2001. V. 485. P. 283307.

76. Frosina G., Fortini P., Rossi O., Carrozzino F., Raspaglio G., Cox L.S., Lane D.P., Abbondandolo A., Dogliotti E. Two pathways for base excision repair in mammalian cells //J. Biol. Chem. 1996. V. 271. P. 9573-9578.

77. Matsumoto Y., Kim K. Excision of deoxyribose phosphate residues by DNA polymerase p during DNA repair //Science. 1995. V. 269 P. 699-702.

78. Sobol R. W, Horton J.K., Kuhn R., Gu H., Singhal R.K., Prasad R., Rajewsky K, Wilson S.H. Requirement of mammalian DNA polymerase-beta in base-excision repair // Nature. 1996. V. 379. P. 183-186.

79. Cappelli E., Taylor R., Cevasco M., Abbondandolo A., Caldecott K, Frosina G. Involvement of XRCC1 and ligase III gene products in base excision repair // 1997. J. Biol. Chem. V. 272. P. 23970-23975.

80. Matsumoto Y., Kim K, Bogenhagen D.F. Proliferating cell nuclear antigen-dependent abasic site repair in Xenopus laevis oocytes: an alternative pathway of base excision DNA repair//Mol. Cell. Biol. 1994. V. 14. P. 6187-6197.

81. Sattler U., Frit P., Salles В., Calsou P. Long-patch DNA repair synthesis during base excision repair in mammalian cells // EMBO Rep. 2003. V. 4. P. 363-367.

82. Klungland A., Lindahl T. Second pathway for completion of human DNA base excision-repair: reconstitution with purified proteins and requirement for DNAse IV (FEN1) // EMBO J. 1997. V. 16 P. 3341-3348.

83. Dianov G.L., Prasad R., Wilson S.II., Bohr V.A. Role of DNA Polymerase beta in the Excision Step of Long Patch Mammalian Base Excision Repair//,/. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 13741-13743.

84. Dianov G., Bischoff C., Piotrowski J., Bohr V.A. Repair pathways for processing of 8-oxoguanine in DNA by mammalian cell extracts//./. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 3381133816.

85. Fortini P., Parlanli E., Sidorkina O.M., Laval J., Dogliotti E. The type of DNA glycosylase determines the base excision repair pathway in mammalian cells // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 15230-15236.

86. Kubota Y, Nash R.A., Klungland A., Schar P., Barnes D.E., Lindahl T. Reconstitution of DNA base excision-repair with purified human proteins: interaction between DNA polymerase p and XRCC1 protein // EMBO J. 1996. V. 15. P. 6662-6670.

87. Bennett S.E., Sung J.S., Mosbaugh D.W. Fidelity of uracil-initiated base excision DNA repair in DNA polymerase beta-proficient and deficient mouse embryonic fibroblast cell extracts //J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 42588-42600.

88. Pascucci В., Stucki M„ Jonsson Z.O., Dogliotti E., Hubscher U. Long patch base excision repair with purified human proteins. DNA ligase I as patch size mediator for DNA polymerases delta and epsilon//J. Biol. Chem. 1999. V. 274 P. 33696-33702.

89. Satoh M.S., Lindahl T. Role of poly(ADP-ribose) formation in DNA repair // Nature. 1992. V. 356 P. 356-358.

90. Satoh M.S., Poirier G.G., Lindahl T. NAD+-dependent repair of damaged DNA by human cell-extracts //./. Biol. Chem. 1993. V. 268. P. 5480-5487.

91. Dantzer F., de La Rubia G., Menissier-de Murcia J., Hostomsky Z., de Murcia G., Schreiber V. Base excision repair is impaired in mammalian cells lacking poly(ADP-ribose) polymerase-1 //Biochemistry. 2000. V. 39. P. 3559-7569.

92. Vodenicharov M.D., Sallmann F.R., Satoh M.S., Poirier G.G. Base excision repair is efficient in cells lacking poly(ADP-ribose) polymerase 1 // Nucleic Acids Res. 2000. V.28. P. 3887-3896.

93. Sanderson R.J., Lindahl T. Down-regulation of DNA repair synthesis at DNA single-strand interruptions in poly(ADP-ribose) polymerase-1 deficient murine cell extracts // DNA Repair. 2002. V. 1. P. 547-558.

94. Allinson S.L., Dianova /./., Dianov G.L. Poly(ADP-ribose) polymerase in base excision repair: always engaged, but not essential for DNA damage processing // Acta Biochim. Pol. 2003. V. 50. P. 169-179.

95. Caldecott K.W., Aoufouchi S., Johnson P., Shall S. XRCC1 polypeptide interacts with DNA polymerase P and possibly poly(ADP-ribose) polymerase, and DNA ligase III is novel molecular'nick-sensor' in vitro //Nucleic Acids Res. J996. V. 24. P. 4387-4394.

96. Khamisy S.F., Masutani M., Suzuki II, Caldecott K. W. A requirement for PARP-1 for the assembly or stability of XRCC1 nuclear foci at sites of oxidative DNA damage // Nucleic Acids Res. 2003. V. 31. P. 5526-5533.

97. Pleschke J.M., Kleczkowska H.E., Strohm M„ Althaus F.R. Poly(ADP-ribose) binds to specific domains in DNA damage checkpoint proteins //J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 40974-40980.

98. Eki Т., Hurwitz J. Influence of poly(ADP-ribose) polymerase on the enzymatic synthesis of SV40 DNA //J. Biol. Chem. 1991. V. 266. P. 3087-3100.

99. Okano S., ban L., Caldecott K.W., Mori Т., Yasui A. Spatial and temporal cellular responses to single-strand breaks in human cells //Mol. Cell. Biol. 2003. V. 23. P. 39743981.

100. Ohashi Y., Itaya A., Tanaka Y, Yoshihara K., Kamiya Т., Matsukage A. Poly(ADP-ribosyl)ation of DNA polymerase beta in vitro // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1986. V. 140. P. 666-673.

101. Lavrik O.I., Prasad R., Sobol R.W., Horton J.K., Ackerman E.J., Wilson S.H. Photoafflnity labeling of mouse fibroblast enzymes by a base excision repair intermediate //J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 25541-25548.

102. Cistulli C., Lavrik O.I., Prasad R., Нои E., Wilson S.H. AP endonuclease and poly(ADP-ribose) polymerase-1 interact with the same base excision repair intermediate // DNA Repair. 2004. V. 3. P. 581-591.

103. Lebedeva N.A., Rechkunova N.I., Khodyreva S.N., Favre A., Lavrik O.I. Photoafflnity labelling of proteins in bovine testis nuclear extract // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. V. 297. P. 714-721.

104. Srivastava D.K., Berg В. J., Prasad R., Molina J. Т., Beard W.A., Tomkinson A.E., Wilson S.H. Mammalian abasic site base excision repair//J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 2120321209.

105. Parsons J.L., Dianova /./., Allinson S.L., Dianov G.L. Poly(ADP-ribose) polymerase-1 protects excessive DNA strand breaks from deterioration during repair in human cell extracts //FEBSJ. 2005. V. 272. P. 2012-2021.

106. Malanga M., Pleschke J.M., Kleczkowska H.E., Althaus F.R. Poly(ADP-ribose) binds to specific domains of p53 and alters its DNA binding functions // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 11839-11843.

107. Wesierska-Gadek J., Schmid G. Poly(ADP-ribose) polymerase-1 regulates the stability of the wild-type P53 protein //Cell. Mol. Biol. Lett. 2001. V. 6. P. 117-140.

108. Mendoza-Alvarez K, Alvarez-Gonzalez R. Regulation of P53 sequence specific DNA-binding by covalent poly(ADP-ribosyl)ation // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 3642536430.

109. Ran Z., Rayel В., Rommelaere J., Faisst S. Parvovirus H-l-induced cell death: influence of intracellular NAD consumption on the regulation of necrosis and apoptosis // Virus Res. 1999. V. 65. P. 161-174.

110. Leist M., Single В., Castoldi A.F., Kuhnle S., Nicotera P. Intracellular adenosine triphosphate (ATP) concentration: a switch in the decision between apoptosis and necrosis //J. Exp. Med. 1997. V.185. P. 1481-1486.

111. Скулачев В.П. Явления запрограмированной смерти. Организм // СОЖ. 2001. Т. 7. С. 2-6.

112. Kaufmann S.H., Desnoyers S., Ottaviano Y., Davidson N.E., Poirier G.G. Specific proteolytic cleavage of poly(ADP-ribose) polymerase: an early marker of chemotherapy induced apoptosis // Cancer Res. 1993. V. 53. P. 3976-3985.

113. Germain M„ Affar E.B., D Amours D., Dixit V.M., Salvesen G.S., Poirier G.G. Cleavage of automodified poly(ADP-ribose) polymerase during apoptosis. Evidence for involvement of caspase-7 // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 28379-28384.

114. Kim J.W., Kim K, Kang K, Joe C.O. Inhibition of homodimerization of poly(ADP-ribose) polymerase by its C-terminal cleavage products produced during apoptosis // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 8121-8125.

115. D Amours D., Sallmann F.R., Dixit V.M., Poirier G.G. Gain-of- function of poly(ADPribose) polymerase-1 upon cleavage by apoptotic proteases: implications for apoptosis//./. Cell. Sci. 2001. V. 114. P. 3771-3778.

116. Yung T.M., Satoh M.S. Functional competition between poly(ADP-ribose) polymerase and its 24-kDa apoptotic fragment in DNA repair and transcription//./. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 11279-11286.

117. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye-binding //Anal. Biochem. 1976. V. 72. P. 248-254.

118. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory Manual (2nd ed.)

119. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor, N.Y. 1989.

120. Nash R., Lindahl T. DNA Ligases: DNA replication in eukaryotic cells // Cold Spring

121. Harbor Laboratory Press, N.Y. 1996. P. 575-580.

122. Carey J. Gel retardation // Meth. Enzymol. 1991. V. 208. P. 103-117.

123. Корниш-Боуден Э. Основы ферментативной кинетики М.: Мир 1979.

124. Sobol R. W., Prasad R., Evenski A., Baker A., Yang X.P., Horton J.K., Wilson S.H. Thelyase activity of the DNA repair protein р-polymerase protects from DNA-damageinduced cytotoxicity //Nature. 2000. V. 405. P. 807-810.

125. Singhal R.K., Wilson S.H. Short gap-filling synthesis by DNA polymerase p is processive //J. Biol Chem. 1993. V. 268. P. 15906-15911.

126. Chagovetz A.M., Sweasy J.В., Preston B.D. Increased activity and fidelity of DNA polymerase p on single nucleotide gapped DNA //J. Biol. Chem. 1997. V. 44. P. 2750127504.

127. Beard W.A., Wilson S.H. Structure and mechanism of DNA polymerase p //2006. V. 106. P. 361-382.

128. Podlutsky A.J., Dianova I.I., Podust V.N., Bohr V.A., Dianov G.L. Human DNA polymerase p initiates DNA synthesis during long-patch repair of reduccd AP sites in DNA //EMBO./. 2001. V. 20. P. 1477-1482.

129. Osheroff W.P., Jung H.K., Beard W.A., Wilson S.H., Kunkel T.A. The fidelity of DNA polymerase beta during distributive and processive DNA synthesis //,/. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 3642-3650.

130. Griesenheck J., Oei S.L., Mayer-Kuckuk P., Ziegler M., Buchlow G., Schweiger M. Protein-protein interaction of the human poly(ADP-ribosyl)transferase depends on the functional state of the enzyme // Biochemistry. 1997. V. 36. P. 7297-7304.

131. Lindahl Г., WoodR.D. Quality control by DNA repair //Science. 1999. V. 286. P. 18971905.

132. Chou K.M., Cheng Y.C. An exonucleolytic activity of human apurinic/apyrimidinic endonuclease on 3' mispaircd DNA //Nature. 2002. V. 415. P. 655-659.

133. Jiricny J. An APE that proofreads // Nature. 2002. 415. 593-594.

134. Bennett R.A., Wilson III D.M., Wong D., Demple B. Interaction of human apurinic endonuclease and DNA polymerase beta in the base excision repair pathway // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1997. V. 94. P. 7166-7169.

135. Copeland W.C., Chen M.S., Wang T.S. Human DNA polymerases a and P are able to incorporate anti-HIV deoxynucleotides into DNA // J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 21459-21464.

136. Harrington J.J., Lieber M.R. The characterization of a mammalian DNA structure specific endonuclease // EMBO J. 1994. V. 13. P. 1235-1246.

137. Liu Y„ Beard W.A., Shock D.D., Prasad R., Hou E.W, Wilson S.H. DNA polymerase p and flap endonuclease 1 enzymatic specificities sustain DNA synthesis for long patch base excision repair//./ Biol. Chem., 2005. V. 280. P. 3665-3674.

138. Horton J.K., Srivastava D.K., Zmudzka B.Z., Wilson S.H. Strategic down-regulation of DNA polymerase beta by antisense RNA sensitizes mammalian cells to specific DNA damaging agents //Nucleic Acids Res. 1995. V. 23. P. 3810-3815.

Информация о работе

Суханова, Мария Владиславовна
кандидата биологических наук
Новосибирск, 2008
ВАК 03.00.04

Диссертация

Роль поли(ADP-рибозо)полимеразы 1 в координации процесса эксцизионной репарации оснований ДНК - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы