Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Поиск ингибиторов поли(ADP-рибозо)полимеразы-I. Миметики поли(ADP-рибозы)

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Поиск ингибиторов поли(ADP-рибозо)полимеразы-I. Миметики поли(ADP-рибозы)"

На правах рукописи

ДРЕНИЧЕВ Михаил Сергеевич

ПОИСК ИНГИБИТОРОВ ПОЛИ(АОР-РИБОЗО)ПОЛИМЕРАЗЫ-1. МИМЕТИКИ ПОЛИ(АОР-РИБОЗЫ)

03.01.03 - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 2013

005051720

005051720

Работа выполнена в Лаборатории стереохимии ферментативных реакций Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук.

Научный руководитель: заведующий Лабораторией стереохимии ферментативных реакций Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук (ИМБ РАН), доктор химических наук, профессор С.Н. Михайлов

Официальные оппоненты: профессор химического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова», доктор химических наук, профессор Т.С. Орецкая

ведущий научный сотрудник Лаборатории молекулярных основ действия физиологически активных соединений Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, доктор химических наук А.Р. Хомутов

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков Ю.А.Овчинникова и М.М. Шемякина Российской академии наук

30

Защита диссертации состоится «21 » 2013 г. в I¿.— часов на заседании

диссертационного Совета Д 002.235.01 при Федеральном государственном бюджетным учреждении науки Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32.

Автореферат разослан « 2О» ср&броху 2013 г.

Ученый секретарь Диссертационного кандидат химических наук

рицын

Актуальность исследования. Поли-АОР-рибозилирование - посттрансляционная модификация белков в эукариотических клетках, катализируемая поли(АОР-рибозо)полимеразами (ПАРП). Эти ферменты осуществляют превращение никотинамидадениндинуклеотида (NAD+) в поли(АОР-рибозу) (ПАР) с высвобождением никотинамида [Hassa P.O. et al. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 2006, 70, 789-829]. ПАР вовлечена в процессы модуляции структуры хроматина, репликации, транскрипции, репарации ДНК и дифференцировки клеток и представляет собой разветвленный биополимер, в котором остатки 2'-0-сх-0-рибофуранозиладенозина соединены между собой пирофосфатными связями. Поли(АОР-рибозо)полимераза-1 (ПАРП) относится к числу ключевых белков, осуществляющих регуляцию процесса репарации оснований и одноцепочечных разрывов ДНК, и отвечает за синтез 90% поли(АОР-рибозы) в клетке.

До настоящего времени ПАР не синтезирован, что связано как со сложностями синтеза дисахаридных нуклеозидов, так и с образованием пирофосфатной связи. Лишь недавно в нашей лаборатории был впервые получен 2'-0-а-0-рибофуранозиладенозин - мономерное звено ПАР.

Ингибиторы ПАРП представляют интерес как потенциальные противораковые агенты [Ferraris D.V., 2010, J. Med. Chem., 53, 4561—4584]. Алкилирующие препараты, которые реагируют с гетероциклическими основаниями нуклеиновых кислот и вызывают повреждение ДНК, и ионизирующее излучение, применяют в схемах лечения многих форм онкозаболеваний. Системы репарации ДНК противостоят действию агентов, повреждающих ДНК, поэтому терапевтический эффект зависит от эффективности систем репарации ДНК. Направленное ингибирование репарации ДНК может быть основой очень эффективной сопровождающей терапии. Ожидается, что использование ингибиторов ПАРП в комплексной химиотерапии позволит снизить концентрацию алкилирующих противоопухолевых агентов и, следовательно, понизить общую токсичность лечения. Вышесказанное определяет актуальность и большой интерес к изучению миметиков ПАР и созданию ингибиторов ПАРП.

Целью работы являлся поиск новых ингибиторов ПАРП-1 в ряду дисахаридных нуклеозидов, а также получение миметиков ПАР, исходя из фосфорамидитных синтонов на основе дисахаридных нуклеозидов и их ациклических аналогов. В ходе исследования решались следующие задачи:

- оптимизация методов получения дисахаридных нуклеозидов, исследование устойчивости 1,1,3,3-тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил (TIPDS) защитной группы в основных средах и подбор оптимальных условий для удаления ацильных защит (деблокирования);

- разработка синтеза фосфорамидитных синтонов на основе дисахаридных нуклеозидов и их ациклических аналогов;

- получение миметиков ПАР, разработка подходов, позволяющих вводить функциональные группы в олигонуклеотиды и получать разветвленные миметики ПАР;

- синтез пиримидиновых дисахаридных нуклеозидов и изучение их ингибиторной активности в реакции поли(АОР-рибозил)ирования, катализируемой рекомбинантной ПАРП-1, а также в культуре клеток.

Научная новизна и практическая значимость работы. Оптимизирован предложенный ранее метод получения 2'-0-а-В-рибофуранозиладенозина, мономерного звена ПАР, и других пентафуранозилнуклеозидов, что позволило увеличить общий выход целевых продуктов. Исследована стабильность исходных 3',5'-0-(тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил)нуклеозидов в основных средах и подобраны оптимальные условия для удаления ацильных защитных групп без затрагивания силильной группы. Получен большой ряд миметиков ПАР на основе дисахаридных нуклеозидов и их ациклических аналогов. В ряду пиримидиновых дисахаридных нуклеозидов найдены ингибиторы ПАРП с Кр-10"5. В ходе работы синтезировано 60 новых соединений, структура которых подтверждена данными масс-спектрометрии, УФ- и ЯМР-спектроскопии. Впервые осуществлен синтез З'-О-р-О-рибофуранозиладенозина - сигнальной молекулы, вырабатываемой в ответ на поражение растений фитопатогенными бактериями.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были представлены на научной конференции молодых ученых ИМБ РАН (Москва 14 октября 2010), на XIX международной конференции «Нуклеозиды, нуклеотиды и нуклеиновые кислоты» (Lyon, France, 29 August - 3 September 2010), на XXIII зимней молодежной школе-конференции Института биоорганической химии им. академиков Ю.А.Овчинникова и М.М.Шемякина РАН (Москва, 7-10 февраля 2011), на XV международном симпозиуме по химии компонентов нуклеиновых кислот (Cesky Krumlov, Czech Republic, June 5-10, 2011) и на научной конференции молодых ученых ИМБ РАН (Москва, 30 октября 2012).

Публикации По материалам диссертации опубликовано 2 статьи, глава в продолжающемся методическом издании и 3 тезисов докладов.

Структура и объем диссертации Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы наименований). Работа изложена на J.5,^страницах, включает J3 рисунковД^схем и ^•таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Миметики ПАР являются потенциальными ингибиторами ПАРП и поли(АОР-рибозо)гликогидролазы, фермента, ответственного за деградацию ПАР, и представляют интерес в

качестве новых объектов для исследований в молекулярной биологии, медицинской химии и биохимии (изучение систем репликации, транскрипции и репарации ДНК). Сложность синтеза ПАР и ее структурных аналогов связана с введением лабильных пирофосфатных связей между остатками дисахаридных нуклеозидов. Для получения миметиков ПАР пирофосфатные связи могут быть заменены на фосфатные, при сохранении расстояния между основными функциональными группами. Такая замена позволяет использовать автоматический олигонуклеотидный синтез с использованием фосфорамидитных синтонов.

Важной проблемой является направленный поиск новых ингибиторов ПАРП. Перспективное направление поиска - создание структур, схожих по строению с мономерным звеном поли(АОР-рибозы).

Ранее в нашей лаборатории был получен - 2'-0-а-П-рибофуранозиладенозин с применением 1,1,3,3-тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил (Т1РОЗ) защитной группы, предложенной Маркевичем. Стадия гликозилирования протекала в присутствии 5пСЦ с хорошим выходом (62%). Общий выход дисахаридного нуклеозида составил 13%. Относительно невысокий общий выход целевого продукта связан с нестабильностью Т1РВ8-нуклеозидов на стадии удаления ацильных групп. Поэтому в настоящей работе была изучена устойчивость бис-силильной защитной группы в условиях деблокирования ацильных защитных групп. При обработке ТТРЭЗ-нуклеозидов 1 метилатом натрия, раствором аммиака или ОВи в метаноле происходит раскрытие восьмичленного цикла с образованием 5'-региоизомера 2, содержащего метоксильную группу (схема 1). В 'Н-ЯМР-спектре (0М80-</6) соединения 2 (В = Ига) присутствует сигнал метальной группы в виде синглета. Гидроксильные группы проявляются в виде двух дублетных сигналов, которые исчезают при добавлении к образцу ЭгО, а в спектре производного 3 присутствуют сигналы двух ацетильных групп.

Схема 1. Раскрытие восьмичленного цикла в Т1РОЗ-рибонуклеозидах (В=ига). ¡. 4М ЫНз-МеОН, 20 °С, 24 ч, 25%, или ОВи-МеОН (МеОЫа-МеОН), 20 °С, 8 ч, 75%; п. Ас20/пиридин, 20 °С, 1.5 ч, 88%.

Синтез дисахаридных нуклеозидов

м

-► 3 К=Ас

Подбор оптимальных условий деблокирования ацильных групп (Вг, Ас, ;-Ви) проводили в спиртовых растворах различных аминов и аммиака (таблица 1). Как видно из таблицы 1, для удаления ацильных защитных групп целесообразно использовать растворы аминов в этаноле. В этих условиях образование продуктов 2 составляло не более 2%.

Раствор МеМ Ь-НЮ11 использовался в синтезе 2'-0-а-Б-рибофуранозиладенозина для

удаления бензоильных защитных групп (схема 2, реакция и). Однако при использовании

алкиламинов для удаления бензоильных защит происходит как О-, так и ЛЧдебензоилирование с

образованием продукта 8. В связи с этим было решено использовать в реакции гликозилирования

производное аденозина 5 со свободной аминогруппой. О-Гликозилирование протекало

стереоспецифично, с образованием а-гликозидной связи (схема 2). Наличие в присоединяемом

Таблица 1. Относительная стабильность Т1Р08- и М-ацильных защитных групп в 4М спиртовых растворах аминов/аммиака при 20 °С'.

№ опыта Основание в нуклеозиде 1 Реагент Время деацилирования Степень расщепления Т1Р05-нуклеозидов через 24 ч2

1 1а ЫНз-МеОН 25%

2 В = №а КИз-ЕЮН <2%

3 МеЫН2-ЕЮН 2%

4 ЫНз-МеОН 3.5 ч 50%

5 1Ь В = Су1Вг ЫНз-ЕЮН 40 ч <2%

6 МеМН2-ЕЮН 30 мин 2%

7 ЕАМНг-ЕЮН 3.5 ч <2%

8 РГЫН2-ЕЮН 3.5 ч <2%

9 ЫНз-МеОН 10 мин 50%

10 1с В = Су1Ас Ша-ЕЮН 10ч <2%

11 Ме>Ш2-ЕЮН 5 мин 2%

12 Е1МН2-ЕЮН 10 мин <2%

13 РГЫН2-ЕЮН 10 мин <2%

14 ЫНз-МеОН 15ч 50%

15 111 Жз-ЕЮН 4 дня <2%

16 В = Сиа'"8" МеЫН2-ЕЮН 2.5 ч 2%

17 Е1НН2-ЕЮН 35 ч <2%

18 РГЫН2-ЕЮН 35 ч <2%

Протекание реакций контролировали методом ТСХ.

2При определении степени расщепления ИРОЭ-нуклеозидов учитывалось образование продуктов полного десилилирования (нуклеозиды) и продуктов раскрытия восьмичленного цикла.

моносахариде соучаствующей О-бензоильной группы обеспечивало образование 1,2-транс-замещенных арабинофуранозидов.

После удаления бензоильных групп вводилась вторая защитная ИРОБ-группа по 3"- и 5"-ОН группам арабинофуранозного остатка (схема 2, реакция Ш). Далее следовало обращение конфигурации при С-2" атоме углерода и удаление силильных групп действием тригидрата ТВАР или фторида триэтиламмония (схема 2, реакция VI). Таким образом, общий выход нуклеозида 13 удалось повысить с 13 до 19-21%. Данные ЯМР, УФ и масс-спектроскопии для структуры 13 согласуются с данными, описанными в литературе.

Схема 2. Синтез 2'-0-а-В-рибофуранозиладенозина и его оптимизация. ¡. ЭпСЦ/ДХЭ, О °С, 24ч, 62-64%; п. 0,1 М МеСЖа/МеОН, 10 °С, 40 мин, 7—9: 47% или МеЫН2/ЕЮН, 24ч 7—10: 77%; 8—10: 87%; ш. Т1РО.ЧС12 /пиридин, 24ч, 20 °С, 80%; ¡v. БМ50/Ас20 65 °С, 4ч; v. №ВН4/ЕЮН, 0 °С, 1ч, 62% (¡у+у); у1 ВщЫГ-ЗН20/ТГФ, 69% или Е13Ы Н17'ГГФ, 78%.

Заражение растений фитопатогенными бактериями индуцирует образование ряда метаболитов, которые являются производными индолов или нуклеозидов. При инфицировании культур арабидопсиса (Arabidopsis thalianä) бактериями Pseudomonas syringae образуется З'-O-ß-D-рибофуранозиладенозин, который был выделен из клеток пораженных растений Беднареком и

6

коллегами [Bednarek et al., 2004, Planta, 218, 668-672]. В данной работе был впервые осуществлен синтез этого нуклеозида (схема 3).

В качестве исходных соединений использовались 1-0-ацетил-2,3,5-три-0-бензоил-0-рибофураноза 15 и 2',5'-ди-0-(/ярет-бутилдиметилсилил)аденозин 14, полученный по известной методике. Реакция гликозилирования протекала без заметной миграции силильной группы с выходом 64%. Десилилирование нуклеозида 16 протекало в присутствии B114NF3H2O с выходом 55%. Конечный дисахаридный нуклеозид 18 был выделен кристаллизацией из воды с суммарным выходом 23%.

f-BuMe2SiO—| о tde

уч|

] [ дне

НО OSiMe2/-Bu i-BuMe2SiO-i 0 .

Г -U W

+ О OSiMe2i-Bu

BzOn П ?Ас В20-, О I Ц

У?

W

BzO OBz BzO OBz

15 16

НОп О ,Ade

¿он ООН

BZO-^ HO^j

BzO OBz НО ОН

17 18

Схема 3. Получение З'-О-р-Р-рибофуранозиладенозина. ¡. впСЦ/ДХЭ, 0 °С, 16ч, 64%; ii. Bu4NF-3H20/THF, 45 мин, 55%; iii. NH3/MeOH, 3 дня, 65%.

Конфигурация при С-1" атоме в рибозном остатке производного 18 подтверждается данными 'Н-ЯМР-спектроскопии: значение КССВ JV\v = 0 Гц свидетельствует о транс-расположении атомов НГ-Н2". В 13С-ЯМР-спектре соединения 18 сигнал С-3' атома в аденозиновом остатке сильно смещен в сторону слабого поля по сравнению с исходным нуклеозидом 14, что доказывает присоединение рибозного остатка к аденозину в положении С-3'. Сигналы в 13С-ЯМР-спектре были отнесены с использованием спектров HSQC. Наличие между углеводными остатками гликозидной связи У - 1" также было подтверждено ЯМР-экспериментом с использованием гетероядерных корреляций дальних взаимодействий (НМВС). В спектре присутствуют кросс-пики между атомами Н-1" (Rib) и С-3' (Ado) и между Н-3' (Ado) и С-1" (Rib). ЯМР спектры 18 идентичны приведенным в литературе для выделенного соединения.

Рисунок 1. НМВС-спектр соединения 18 при 50 °С (323 К) Таким образом, были получены производные аденозина, содержащие рибофуранозные фрагменты в 2'- и З'-положениях. Показана возможность применения ТВОМБ-защиты в условиях реакции гликозилирования. В ходе работы были подобраны оптимальные условия деблокирования ацильных защит в Т1Р05-нуклеозидах, что позволило существенно повысить общий выход дисахаридных нуклеозидов.

Получение мимегиков поли(АОР-рибозы) К настоящему времени, благодаря рентгеноетруктурному анализу, строение активного центра ПАРП изучено достаточно подробно. Согласно данным молекулярной динамики, ПАР -подвижная молекула и расстояние между атомами в соседних звеньях варьирует в пределах 5.016.2 А (рисунок 2, таблица 2). Природная ПАР представляет собой полимер с нерегулярной структурой, в то же время синтетические миметики ПАР имеют регулярную структуру, что важно для изучения их взаимодействий с белками.

ын2

О О ^

~-~0-Р-0-Р-0-| ' | М

ОН он г ч--сг

н г

НО О о /"-11 N

N—И-о-р-о-Р-о-, ' ? "

ОН ОН Г у -—сг НО О о

он

Рисунок 2. Структура ПАР

Полимер C-r-C-l',Ä O-O (furan) Ä

ПАР max 16.2 min 5.0 Ä" 10.3-11.3 11.4-11.8

ПАР в комплексе с ПАРП 10.7-11.3 10.6-11.4

Ado-a-D-RibJ 11.3 11.2

Ado-ß-D-Rib 10.8 10.2

Ado-a-D-Ara 11.3 11.2

Ado-CH2OCH2CH2 13.5 14.0

Ado-CH2OCH2CH2CH2 15.0 15.2

'-в миметиках ПАР пирофосфатная связь заменена на фосфатный остаток. На рисунке отмечены атомы, расстояния между которыми указаны в таблице

2-диапазоны расстояний между атомами рассчитаны с использованием молекулярной динамики ПАР в свободном состоянии и в комплексе с ферментом (к.х.н. Д.К.Нилов НИИ ФХБ имени А.Н.Белозерского МГУ)

3-среднестатистические расстояния между атомами рассчитаны при помоши программы ChemDraw Ultra 11.0

Для создания миметиков пирофосфатные связи были заменены на фосфатные, при этом сохраняются основные функциональные группы и расстояния между ними. Для увеличения стабильности миметиков ПАР предлагается также изменить конфигурацию гликозидной связи в остатках 2'-0-а-О-рибофуранозиладенозина, либо использовать ациклические аналоги дисахаридных нуклеозидов.

Нами был получен ряд фосфорамидитных производных дисахаридных нуклеозидов и их ациклических аналогов. Олигонуклеотидный синтез с использованием таких «строительных блоков» позволяет создавать олигомеры с расстояниями между функциональными группами, близкими к поли(АОР-рибозе) (таблица 2). Для получения фосфорамидитных синтонов на основе дисахаридных нуклеозидов необходимо проводить защиту всех ОН-групп. В этих соединениях присутствуют две первичных и три вторичных гидроксильных группы, для дифференциальной защиты которых требуются многостадийные манипуляции. Также необходимо блокировать аминогруппу аденина. Возможны два подхода к получению фосфорамидитных синтонов на основе дисахаридных нуклеозидов (схема 4).

<;-Pr)2N

СЕЮ

ММТЮ-, о AdeB* (H6^o fde

АсП НО О

Р—1 —1 n _

(i-Pr)2N

Р-О

СЕЮ

АсО о

Х)

BzO OBz

но он

А

ММТгО

W

\сО о

XI

BzO OBz

Схема 4. Стратегия химической модификации дисахаридных нуклеозидов.

Путь А заключается в получении производных, содержащих фосфорамидитную группу в 5'-положении нуклеозида и кислотолабильную тритильную защиту по 5"-положению, вторичные ОН-группы блокируются ацильными защитами. Этот вариант существенно сложнее пути В и требует проведения большего числа стадий. Путь В заключается в получении производного, содержащего фосфорамидитную группу в 5"-положении рибофуранозы и тритильную группу 5'-положении аденозина.

Использование полностью ацилированных нуклеозидов типа 7-8 (схема 2) исключает возможность дифференциальной защиты 5"-первичной гидроксильной группы. Для селективного блокирования этого положения (стратегия В) была использована левулиновая защитная группа (Lev), которая может быть селективно удалена в мягких условиях гидразинолиза без затрагивания других ацильных групп.

Синтоны на основе дисахаридных нуклеозидов были получены согласно схеме 5. N6 -Бензоил-3',5'-0-(тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил)аденозин 4 вводился в конденсацию с защищенным производным арабинофуранозы 19 в присутствии SnCU. TIPDS-группа удалялась действием трехводного фторида тетрабутиламмония. Тритилирование, ацилирование и гидразинолиз проводили последовательно с хроматографической очисткой производного 22 на последней стадии. Фосфитилирующим агентом выступал 2-цианоэтил-ДЛ',Лг'Лг-

тетраизопропилфосфорамидит, реакцию проводили в инертной атмосфере азота при О "С с использованием 1Я-тетразола в качестве активирующего реагента.

По аналогичной схеме были получены производные 24а и 24Ь, содержащие остаток рибофуранозы в ^-конфигурации. Введение изо-бутироильной группы в З'-положение позволяет повысить выход продукта на стадии удаления левулиновой группы, поскольку ацетильная группа частично удаляется в этих условиях.

Фосфорамидитные синтоны на основе 2'-0-гидроксиалкоксиметилнуклеозидов были получены согласно схеме 6, аналогично дисахаридным прозводным. Реакция с диацетатами 25а-с протекает значительно быстрее О-гликозилирования. Было показано, что при конденсации нуклеозидов с ациклическими производными целесообразно использовать нуклеозид 5 со свободной аминогруппой. В случае Л^-бензоил-производпого 4 образуется значительное количество побочных продуктов вследствие неустойчивости Лг-гликозидной связи в условиях реакции. В 'Н-ЯМР -спектрах 26а-с (CDCb), наряду с сигналами рибофуранозы и пуринового основания, проявляются дополнительные сигналы, относящиеся к ациклическому фрагменту. Удаление ацетильной группы в присутствии 4М MeNH2-EtOH протекало с высоким выходом и позволило избежать существенного раскрытия бис-силильной группы. Применение ИНз/МеОН на данной стадии существенно снижает выход продуктов 27.

AdeB;

Si-0 OH

T,k4

LevO

Hr^BzOVbOBz BzO

19

r

Si-O о

ть

OBz / BzO\

AdeB

LevO

LevO

НОП0| но о

OBz

AdeB

20

21

MMTrO—i ri ^d®BZ

V

AcO О OBz

HO—1 u 22

MMTrO-

AdeB

XI

AcO О

OBz / BzO\

Ko^

(/-PrfeN о-1 °

I 23 OCEt

DMTrO—] n I

V

RO о

AdeB

(i-Pr)2N

P—О

СЕЮ

BzO OBz

24a: R=Ac 24b: R=/-Bu

Схема 5. Получение амидофосфитных синтонов на основе дисахаридных нуклеозидов (Ьеу=С(0)СН2СН2С(0)СН3) ¡. ЭпС^ДХЭ, 0 °С, N2, 20 ч, 58%; и. ВщОТ-ЗЦО/ТГО, 10 мин, 73%; ш. ММТгС1/пиридин, 16 ч, ¡v. Ас20, 0 °С, 4 ч; v. К2Н4 Н20/Ас0Н/пиридин, 0 °С, 40 мин, выход на 3 стадии Ш-у 55%; VI (/-Рг2М)2РО(СН2)2СЫ/ 1Я-тетразол, ацетонитрил, пиридин, М2> 30 мин, 85%.

Структура полученных соединений 23, 24а-Ь, 32а-с подтвержается данными 31Р-ЯМР спектроскопии (таблица 3). Общие выходы рассчитаны по схемам 5 и 6, исходя из TIPDS-производных 4 и 5.

В синтезе миметиков ПАР использовалось два типа фосфорамидитных синтонов - с ММТг-группой (соединения 23, 32а-с) и с DMTr-группой (соединения 24а-Ь). Твердофазный синтез олигомеров проводили на автоматическом синтезаторе ABI 3400 (Applied Biosystems, США) с использованием в качестве твердого носителя стекла с контролируемым размером пор (500А) и ковалентно пришитым дезоксиаденозином или защищенным аминолинкером С7 (производное 7-амино-2-(гидроксиметил)гексан-1-ола) по методике, описанной в работе [Mikhailov et al., 2009, CPNAC, 4.36.1-4.36.19, ссылка 3 в списке литературы] для MMTr-производных. При использовании DMTr-производных протокол олигонуклеотидного синтеза изменяется на стадии детритилирования. Масштаб синтеза составлял 0,2 мкмоль. Деблокирование олигомеров проводили в стандартных условиях (конц. водный аммиак, 6 часов, 55 °С). В таблице 4 приведены некоторые синтезированные олигомеры.

0-1 Г> Айе От П

у-В" + АсО^О^ЛЭАс I > у-БГ » >

^ V/ "" ^ у-/

^¡-0 ОН 25а:п=2 51-0 О^О ОАс

I /-ч 25Ь: п=3 'Л- П

5 25с: п=4

26а-с

о АЧе 0 Айе»' Ч От 0 ***

V

V м а И ' ^ м „ л

27а-с 28а-с 29а-с

нот г, АОе* . ... ММТЮ—| о Ме* . ММТЮт 0 Мв

Ч "

Э>4 ^

г, ои ВгО О. . .О.

ЗОа-с

ВгО О^О О^М(/-Рг)2 31а-с 32а-с " ОСЕ!

НО Ох ,0. ,01_еУ ВгО 0^,0 ОН ьги

Схема 6. Получение синтонов на основе 2'-0-гидроксиалкоксиметилнуклеозидов. ь ЯпСЦ/ДХЭ, -10 °С, N2,40 мин, 26а - 43%, 26Ь -56%, 26с - 54%; И. 4М МеШ2/ЕЮН, 24ч, 27а - 93%, 27Ь - 85%, 27с - 87% ш. Ме^а/пиридин, 1 ч; ВгС1, 2 ч; М14ОН, О °С, 20 мин, 28а - 80%, 28Ь - 72%, 28с -79%; ¡v. [.еуОП/ПСС, диоксан, 40 мин, 29а - 84%, 29Ь - 78%, 29с - 81%; v. ВщЫР-З Н20 /ТГФ, 10 мин, 30а - 85%, ЗОЬ - 81%, 30с - 76%; уч. ММТгС1/пиридин, 16 ч, ун. 1.5ес| ВгС1, 0 °С; уШ. N2H4•H20/Ac0H/пиpидин, 0 °С, 40 мин; выходы на 3 стадии \i-viii 31а - 74%, 31Ь - 60%, 31с -70%; ¡х. (¡-Рг21Ч)2РО(СН2)2СМ/ 1Я-тетразол, ацетонитрил, пиридин, N2, 30 мин, 32а - 58%, 32Ь -61%, 32с-41%.

Таблица 3.3,Р-ЯМР и общие выходы амидофосфитных синтонов.*

Соединение -"Р-ЯМР, 8 (м.д.) Общий выход, %

23 150.90(с); 150.71 (с) 19.8

24а 151.26(с); 150.88(с) 18.6

24Ь 151.27(с); 150.82(с) 22.5

32а 150,18(с); 150.14(с) 9.8

32Ь 150,68(с); 149.31 (с) 7.9

32с 149.10(с) 6.5

♦Спектры 23,24а-Ь, 32а, 32с регистрировались в ЭМЗО-с/б с подавлением сигналов протонов, спектр 32Ь - в СЭСЬ с

подавлением сигналов протонов

Олигонуклеотиды 1-12 не проявляют ингибнрующего действия на ПАРП-1 в концентрациях менее 0.1 мМ. Короткие олигомеры на основе 2'-0-а-0-арабинофуранозиладенозина, содержащие эозиновый флуоресцентный маркер, ингибируют интегразу ВИЧ, снижая активность фермента на 50% в концентрации 0.3 мкМ (проф. М.Б.Готтих, НИИ ФХБ им.А.Н.Белозерского МГУ).

Таким образом, исходя из соответствующих фосфорамидитных производных, были впервые получены и описаны миметики ПАР. Миметики ПАР, имеющие определенный состав и структуру, открывают новые возможности для изучения репарации ДНК и других важных клеточных процессов: а) изучения белков, участвующих в репарации ДНК; б) выяснения регуляторных функций поли(АОР-рибозы) в клетке.

Таблица 4. Структура и МА1ЛЭ1-спектрометрия миметиков ПАР.

№ Синтон Состав олигомера Мсаы Мгоип(]

1 23 н2м(сн2)4сн(сн2он)сн2о(5 ' 'рАгаАс1о5') 11 5221.8 5216.7

2 23 е051п-ны(сн2)4сн(сн20н)сн20(5' 'рАгаАс!о5') п 5927.8 5924.2

3 23 ¿АсЬфёА^Ь (5' 'рАгаАс1о5'),, 5952.2 5953.6

4 23 с1Ас1о(5' 'рАгаАс!о5 ">15 7171.1 7173.4

5 23 <1Ас1о(5' 'рАгаАс!о5 ">18 8555.1 8557.5

6 24а-Ь с!Ас1о(рс1Ас1о)2 (5"рГИЬАс1о5 ')п 5952.2 5950.1

7 24а-Ь аАао(5"ршьАао5'),5 7171.1 7175.6

8 24а-Ь аАао(5"р111ЬАс1о5')18 8555.1 8554.7

9 32а аАао(рсн2сн2осн2-Аао5 > 3067.2 3074.9

10 32а <1А<1о(рСН2СН2ОСН2-Аск>5')|, 4676.3 4678.9

11 32а с!Ас1о(рСН2СН2ОСН2-Ас1о5')|2 5078.6 5078.4

12 32а с1Ас1о(рСН2СН2ОСН2-А(]о5 ')|4 5883.2 5885.0

Использование «сНск»-реакции для функционализации олигонуклеотидов и создания разветвленных миметиков ПАР.

Включение дополнительных функциональных групп в состав олигонуклеотидов широко используется для решения ряда проблем, таких как их внутриклеточный транспорт и селективное накопление в клетках и тканях, введение флуоресцентных меток, модификация пептидов и белков и создание разветвленных олигонуклеотидов, изучение активности и механизма действия ферментов и.т.д. Одним из подходов для получения разветвленных биополимеров является циклоприсоединение методом «сПск»-химии. «СНск»-реакции протекают в воде при комнатной температуре с выходами, близкими к количественным. Наиболее часто применяется циклоприсоединние КЫз по терминальной тройной связи в присутствии солей одновалентной

меди. Все перечисленные особенности делают «сНск»-химию ценным методом для модификации иммобилизованных биополимеров.

В данной работе был предложен способ, позволяющий вводить два разных углеводных остатка в иммобилизованные олигонуклеотиды методом «сНск»-химии. Для этого были синтезированы амидофосфитное производное 43, содержащее атом брома, и Н-фосфонат 44, содержащий азидную функциональную группу.

(V4-бензоил 3',5'-0-(тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил)цитидин вводился в конденсацию с (2-бромэтокси)метилацетатом в присутствии ЭпСЦ при -12 °С (схема 7). Последующая реакция с №Ы3 давала производное ЗЗЬ. Дальнейшие стадии проводились аналогично схемам, описанным выше. Бромпроизводное 35а превращалось в 3'-(2-цианоэтил-Л',Л'-диизопропилфосфорамидит) 36. В случае производного 35Ъ получали З'-(Н-фосфонат) 37. Использование Н-фосфоната 37 обусловлено тем, что соответствующий фосфорамидит может вступать в реакцию Штаудингера с соседней азидной группой.

НО о^

34а: Х=Вг 34Ь:

йМТгО

35а: Х=Вг 35Ь: Х=К13

ОМТгО—1 <-, |

(/-Рг)2Мч уО Р

,0 36

РМТгО—] п I

°Ч /О о„

Л

Е13МН+н 37

Схема 7. Синтез синтонов для модификации олигонуклеотидов (В = С>4 2). ¡. ВидЫР-З Н2О/ТГФ, 10 мин, 41а-57%, 41Ь-94%; и. ПМгС1/пиридин, 16 ч, 42а-71%, 42Ь-72%; ш. (¿-Рг2Ы)2РО(СИ2)2СМ, Е13Ы/ДХМ, N2, 2ч, 71%; ¡v. (РЮ)2Р(0)Н, пиридин, 45 мин., EtзN/H20, 15 мин. 86%.

Фосфорамидитный блок 36 и Н-фосфонатный блок 37 позволяют вводить в состав олигонуклеотидов разные заместители. Были синтезированы 15-мерные 2'-0-метилированные олигорибонуклеотиды, содержащие (2-азидоэтокси)метильный и (2-бромэтокси)метильный линкеры в углеводном остове (синтез олигонуклеотидов проводился в лаборатории проф. X. Лоннберга, университет Турку, Финляндия). Включение блоков 36 и 37 в олигонуклеотидную последовательность проводилось по стандартным процедурам: конденсация амидофосфита 36 протекает в присутствии тетразола с выходом 99.9%, активация пивалоилхлоридом позволяет

15

присоединить к нуклеотидной последовательности Н-фосфонат 37 с выходом 85%. После завершения сборки цепи на полимерном носителе проводили модификацию иммобилизованных олигонуклеотидов методом «сИск»-химии (схема 8). В качестве вводимых функциональных остатков использовались пропаргил-2,3,4,6-тетра-0-ацетил-а-0-маннопиранозид и пропаргил-2,3,4,6-тетра-0-ацетил-р-0-галактопиранозид.

e(CAU) L CytB*

(UGGUU)

A cyt"

(UACGA)"^

5'-f-2'*OMe(CAU)

¿

тг

I N-N

(UGGUU)

I

Cyt*

ri^o^

(UACGA)Pr-3' 6

¿Ac

5'-r-2'-OMe{CAU)

XI

«У4»

N=N

0 О

1 ■

(UGGUU)

1 Cyt8*

(UACGA)^'

5'-r-2'-OMe(CAU)

^gXoAc

OAc

(UGGUU) О

Cyt bb^-OH

он I

OH

HO

6

(UACGA)-3*

nu UM

Схема 8. Введение двух разных моносахаридных лигандов в иммобилизованные 2'-0-Ме-олигорибонуклеотиды, Рг - защитные группы (protecting groups), i. СиЗОф/ТВТА/Аскорбат натрия/1-О-пропаргил-2,3,4,б-тетра-О-ацетил-а-О-маннопиранозид, ii. TMGA/Nal/DMF 65 °С, или NaN3/NaI/DMF 65 °С iii. СиЗО^ВТА/Аскорбат натрия/1-0-пропаргил-2,3,4,6-тетра-0-ацетил-р-0-галактопиранозид, iv. 33% ЫН3(водн.), 55 °С.

Реакция маннопиранозы, содержащей терминальную тройную связь, с азидогруппой катализировалась системой СиБОУэскорбат натрия. Присоединение моносахаридного фрагмента проводилось в присутствии трис[(1-бензил-1,2,3-триазол-4-ил)метил]амина (ТВТА), образующего хелатный комплекс с ионами меди, что препятствует деградации олигонуклеотида в условиях проведения «сНск»-реакции. Далее атом брома в модифицированном олигонуклеотиде заменяется на азидогруппу. Наилучшие результаты были получены при использовании тетраметилгуанидиний азида (ТМвА). Повторную «сНск»-реакцию проводили с пропаргил-

2,3,4,6-тетра-0-ацетил-р-0-галактопиранозой. Деблокирование и удаление с полимерного носителя осуществлялось действием водного аммиака. Наличие моносахаридных фрагментов в составе синтезированных олигонуклеотидов подтверждалось данными ESI-MS-спектроскопии.

Два углеводных остатка в составе 2'-0-Ме-РНК способствуют незначительной дестабилизации ее дуплексов с комплементарными последовательностями ДНК и 2'-0-Ме-РНК. С увеличением числа вставок, содержащих дополнительные углеводные фрагменты, стабильность дуплексов падает.

Таким образом, был предложен способ, позволяющий вводить в олигонуклеотиды два разных заместителя. Описанный метод может быть использован для получения разветвленных миметиков ПАР.

Ингибирование ПАРП-1 человека дисахаридными нуклеозидами - производными структурного элемента поли(АОР-рибозы).

Природные нуклеотиды и нуклеозиды являются слабыми ингибиторами ПАРП с IC50 около или более 1 мМ [Banasik М., Ueda К., 1994, Mol. Cell Biochem., 138, 185-197]. Их характеристики могут быть улучшены за счет введения соответствующих заместителей. В нашей работе был продолжен поиск ингибиторов ПАРП среди модифицированных аналогов структурного звена поли(АОР-рибозы). По известным методикам, исходя из 5-замещенных дезоксиуридинов, были синтезированы дисахаридные нуклеозиды, содержащие различные заместители в 5-м положении (таблица 5).

Таблица 5. Значения IC50 в реакции поли(АОР-рибозил)ирования, катализируемой рекомбинантной ПАРП-1 для различных дисахаридных нуклеозидов.

О Заместитель X IC50 mkM

Vo X=F >1000

X=I 44

HO>°J X=Me 38

w но OH 3-AB1 50

З-АВ-З-аминобензамид

Для определения ингибиторных характеристик дисахаридных нуклеозидов в реакции поли(АБР-рибозил)ирования, катализируемой рекомбинантной ПАРП, была использована тест-система, основанная на полимеризации меченного тритием по адениновому остатку NAD+

17

(исследования проводились совместно с Институтом химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, зав. лабораторией проф. Лаврик О.И.). В качестве показателя эффективности ингибирования использовали значение IC50 (таблица 5).

Дисахаридные нуклеозиды, представленные в таблице 5, обладают рядом структурных особенностей. Прежде всего, это наличие фармакофорной группы - карбоксамидного фрагмента в составе гетероциклического основания, что обеспечивает связывание с сайтом фермента, отвественным за связывание никотинамидного остатка (водородная связь с Ser-904 и Gly-863 ПАРП). Гидроксильные группы в составе углеводных остатков обеспечивают хорошую растворимость веществ в воде. Данные, приведенные в таблице 5, позволяют сделать вывод о влиянии заместителя X на ингибиторные свойства дисахаридных нуклеозидов. Соединения, содержащие объемные заместители (X=I, Ме), обладают гораздо большей активностью, сравнимой с активностью 3-аминобензамида (3-АВ).

Полученные результаты согласуются с данными рентгеноструктурного анализа (РСА) ПАРП в комплексе с рядом ингибиторов, близких по структуре гетероциклическим основаниям в составе полученных дисахаридных нуклеозидов. Согласно данным РСА, объемный заместитель X может увеличивать прочность связывания с ферментом, размещаясь в гидрофобном кармане (А1а898-Lys903) рядом с сайтом связывания никотинамида [Hattorf К et al., 2004, J. Med. Chem., 47, 41514154].

Было решено проверить, как наиболее активные из полученных в данной работе соединений влияют на клетки. В институте молекулярной генетики РАН (м.н.с. А.С.Ефремова, руководитель сектора к.х.н. С.И.Шрам) было показано, что пиримидиновые дисахаридные нуклеозиды (X=I, Ме) и их диальдегидные производные проникают в ядра клеток и ингибируют ПАРП. Исследования проводились на культуре опухолевых клеток SKOV-3 в условиях окислительного стресса (обработка перекисью водорода). Ингибирование ПАРП оценивали по окрашиванию ядер флуоресцентно мечеными антителами к поли(АОР-рибозе).

Таким образом, были обнаружены дисахаридные нуклеозиды, способные эффективно накапливаться в ядрах клеток и ингибировать ПАРП.

Также была изучена цитотоксичность синтезированного 3'-0-рибофуранозил-2'-дезокси-5-фторуридина на культурах клеток L1210, FM3A, Molt4, Сет и HeLa (проф. Я.Бальзарини, Pera институт, Бельгия). Активность дисахаридного нуклеозида оказалась примерно на три порядка ниже активности 5-фтордезоксиуридина. Можно предположить, что низкая активность пиримидиновых дисахаридных нуклеозидов в этих клетках обусловлена отсутствием ферментов, гидролизующих О-гликозидную связь.

выводы

1. Впервые синтезирован большой ряд миметиков поли(АОР-рибозы) на основе дисахаридных нуклеозидов и их ациклических аналогов, в которых пирофосфатный остаток в природном полимере заменен на фосфатный. В этих соединениях сохранены основные важнейшие функциональные группы и расстояния между ними.

2. Предложены новые синтоны для получения олигонуклеотидов, содержащих азидоалкильные и бромалкильные группы для постсинтетической модификации, позволяющие вводить в 2'-положение олигонуклеотидной цепи различные заместители.

3. Впервые синтезирован З'-О-Р-О-рибофуранозиладенозин, который был выделен из листьев Arabidopsis thaliana при бактериальном заражении Pseudomonas syringae. Оптимизирован метод получения дисахаридных нуклеозидов.

4. Исследована стабильность 3',5'-0-(тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил)нуклеозидов в основных средах и подобраны оптимальные условия для удаления ацильных защитных групп.

5. В ходе работы синтезировано 60 новых соединений, структура которых подтверждена данными масс-спектрометрии, УФ- и ЯМР-спектроскопии. В ряду синтезированных соединений обнаружены ингибиторы рекомбинантной поли(АОР-рибозо)полимеразы-1 с IC50 3-5'Ю"5 М.

Основное содержание работы отражено в следующих публикациях:

1. M.S.Drenichev, I.V.Kulikova, G.V.Bobkov, V.I.Tararov, S.N.Mikhailov. A New Protocol For Selective Cleavage of Acyl Protecting Groups in 3',5'-0-(Tetraisopropyldisiloxane-l,3-diyl)ribonucleosides. // Synthesis, 2010, № 22, 3827-3834.

2. A.Kiviniemi, P.Virta, M.S.Drenichev, S.N.Mikhailov, H.Lonneberg. Solid-Supported 2'-O-Glycoconjugation of Oligonucleotides by Azidation and Click Reactions. // Bioconjugate Chemistry, 2011, v. 22, 1249-1255.

3. S.N.Mikhailov, E.N.Timofeev, M.S.Drenichev, E.V.Efimtseva, P.Herdewijn, E.B.Roesch, M.M. Lemaitre. Oligonucleotides, containing 7V'-methyl-2'-deoxyadenosine and A^-methyW-deoxyadenosine. // Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, 2009, Unit 4.36.1-4.36.19. Supplement 38. John Wiley & Sons.

4. M.S.Drenichev, G.V.Bobkov, V.I.Tararov, S.N.Mikhailov. Selective Cleavage of Acyl Protecting Groups in 2'-0-Modified 3',5'-0-(Tetraisopropyldisiloxane-l,3-diyl)ribonucleosides. Collection Symposium series, 12,403-404 (2011).

5. M.S.Drenichev, I.V.Kulikova, G.V.Bobkov, V.I.Tararov, S.N.Mikhailov. Stability of tetraisopropyldisiloxane-1,3-diyl blocking group. XIX International Round Table "Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids" (Lyon, France, 29 August - 3 September 2010). Conference book, Abstract PA094, pages 245-246.

6. М.С.Дреничев, И.В.Куликова, Г.В.Бобков. Стабильность тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил -защитной группы и ее использование в синтезе дисахаридных нуклеозидов. Тезисы XXIII зимней молодежной школы-конференции. ИБХ РАН (Москва, 7-10 февраля 2011). С.121. Сборник тезисов.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ, программы РАН «Молекулярная и клеточная биология» и ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на 2007-2013 годы» (государственный контракт № 16.512.11.2239).

Список использованных сокращений.

Ado - аденозин

DBU - 1,8-диазабицикло[5,4,0]ундец-7-ен DMSO - диметилсульфоксид DMTr - диметокситритил

ESI-MS - electron-spray ionization spectroscopy, методика проведения съемки масс-спектра, основанная на ионизации направленным пучком электронов

НМВС - heteronuclear multibond correlation, методика гетероядерной корреляции дальних взаимодействий

HSQC - heteronuclear single quantum coherence, методика гетероядерной -одноквантовои

корреляции

IC50 - half maximal inhibitory concentration, концентрация ингибитора, при которой активность фермента составляет 50% от исходной

MALDI - matrix-assisted liser desorbtion ionization, методика проведения съемки масс-спектра,

основанная на ионизации лазером

ММТг - монометокситритил

Rib - остаток рибозы

TBAF - тетрабутиламмоний фторид

TIPDS - тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил

TMGA - тетраметилгуанидиний азид

ДХМ - дихлорметан

ДХЭ - 1,2-дихлорэтан

КССВ - константа спин-спинового взаимодействия ПАРП - поли(АОР-рибозо)полимераза ТГФ - тетрагидрофуран

Заказ № 35-П/02/2013 Подписано в печать 12.02.2013 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1

"Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ: info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Дреничев, Михаил Сергеевич

Список использованных сокращений Введение

Глава 1. Поли(АОР-рибоза) - важный биополимер. Особенности строения и биологическая роль. Биосинтез и ферментативное расщепление. Дисахаридные нуклеозиды и перспективы химического синтеза. Ингибирование поли(АЭР-рибозо)полимераз. (Обзор литературы)

1.1. Поли(АОР-рибоза)

1.1.1. Структура, биосинтез и функции в клетке

1.1.2. Подходы к искусственному получению Дисахаридные нуклеозиды и синтез фрагментов ПАР

Методы создания пирофосфатных связей и автоматизированный синтез ол игоиуклеот идов (АОР-рибозил)ирование белков

1.2. Ферменты биосинтеза и деградации ПАР

1.2.1. Семейство поли(АОР-рибозо)полимераз (ПАРП). Структура и биологические функции основных представителей

1.2.2. Поли(АОР-рибозо)гликогидролаза (ПАРГ)

1.3. ПАРП как фермент-мишень для создания новых лекарственных препаратов

1.3.1. Основные классы известных ингибиторов ПАРП и их биологическая активность

1.3.2. Ингибиторы ПАРП с улучшенными свойствами: оптимизация структуры и химический синтез

Глава 2. Поиск новых ингибиторов поли(АОР-рибозо)полимеразы-1. Миметики поли(АОР-рибозы). (Обсуждение результатов)

2.1. Синтез дисахаридных нуклеозидов

2.2. Получение миметиков поли(АТ>Р-рибозы)

2.3. Использование «сНск»-реакции для функционализации олигонуклеопгидов и создания разветвленных миметиков ПАР

2.4. Ингибирование ПАРП-1 человека дисахаридными нуклеозидами -производными структурного элемента ноли(АТ)Р-рибозы)

Глава 3. Экспериментальная часть

Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Поиск ингибиторов поли(ADP-рибозо)полимеразы-I. Миметики поли(ADP-рибозы)"

Поли-АОР-рибозилирование - посттрансляционная модификация белков в эукариотических клетках, катализируемая поли(АОР-рибозо)полимеразами (ГТАРП). Эти ферменты осуществляют превращение никотинамидадениндинуклеотида (NAD+) в поли(АЭР-рибозу) (ПАР) с высвобождением никотинамида [1]. ПАР вовлечена в процессы модуляции структуры хроматина, репликации, транскрипции, репарации ДНК и дифференцировки клеток и представляет собой разветвленный биополимер, в котором остатки 2'-0-а-0-рибофуранозиладенозина соединены между собой пирофосфатными связями [2,3]. Поли(АОР-рибозо)полимераза-1 (ПАРП) относится к числу ключевых белков, осуществляющих регуляцию процесса репарации оснований и одноцепочечных разрывов ДНК, и отвечает за синтез 90% поли(АОР-рибозы) в клетке [3]. До настоящего времени ПАР не синтезирован, что связано как со сложностями синтеза дисахаридных нуклеозидов, так и с образованием пирофосфатной связи. Лишь недавно в нашей лаборатории был впервые получен 2'-0-а-0-рибофуранозиладенозин - мономерное звено ПАР [4]. Детальное изучение внутриклеточных функций поли(АОР-рибозы) продолжается и в настоящее время. Молекулы полимера, как выделенные из природных источников, так и синтезированные in vitro с использованием поли(АБР-рибозо)полимеразы, могут содержать более 200-300 мономерных звеньев. Линейные участки длиной 20-50 звеньев чередуются с разветвленными фрагментами, которые, по-видимому, стабилизируют конформацию поли(АОР-рибозы) [1, 2, 5]. Важную роль в комплексообразовании с белками играют ионные взаимодействия между фосфатными группами ПАР и положительно заряженными остатками аминокислот в белках.

В настоящей работе впервые предложены миметики ПАР на основе дисахаридных нуклеозидов и их ациклических аналогов, в которых пирофосфатный остаток в природном полимере заменен на фосфатный при сохранении основных важнейшие функциональные группы и расстояния между ними. Такая замена позволяет использовать автоматический олигонуклеотидный синтез с использованием фосфорамидитных синтонов.

Получение миметиков ПАР, имеющих определенный состав и структуру, открывает новые возможности для изучения репарации ДНК и других важных клеточных процессов: а) изучение белков, участвующих в репарации ДНК; б) выяснение регуляторных функций поли(АОР-рибозы) в клетке.

Еще одной группой природных полианионных биополимеров являются сульфированные полисахариды, такие как гепарансульфаты, которые также могут рассматриваться в качестве миметиков ПАР [6-8]. Эти полимеры содержат большое число 0-сульфатных и ./^-сульфатных групп, количество которых в случае гепарансульфата достигает в среднем 2.7 групп на дисахаридный остаток [9-10]

Ингибиторы ПАРП представляют интерес как потенциальные противораковые агенты [11]. Алкилирующие препараты, которые реагируют с гетероциклическими основаниями нуклеиновых кислот и вызывают повреждение ДНК, и ионизирующее излучение, применяют в схемах лечения многих форм онкозаболеваний. Системы репарации ДНК противостоят действию агентов, повреждающих ДНК, поэтому терапевтический эффект зависит от эффективности систем репарации ДНК. Направленное ингибирование репарации ДНК может быть основой очень эффективной сопровождающей терапии. Ожидается, что использование ингибиторов ПАРП в комплексной химиотерапии позволит снизить концентрацию алкилирующих противоопухолевых агентов и, следовательно, понизить общую токсичность лечения.

Целыо работы являлся поиск новых ингибиторов ПАРП-1 в ряду дисахаридных нуклеозидов, а также получение миметиков ПАР, исходя из фосфорамидитных синтонов на основе дисахаридных нуклеозидов и их ациклических аналогов. В ходе исследования решались следующие задачи: оптимизация методов получения дисахаридных нуклеозидов, исследование устойчивости 1,1,3,3-тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил (ПРОБ) защитной группы в основных средах и подбор оптимальных условий для удаления ацильных защит (деблокирования);

- разработка синтеза амидофосфитных синтонов на основе дисахаридных нуклеозидов и их ациклических аналогов; получение миметиков ПАР, разработка подходов, позволяющих вводить функциональные группы в олигонуклеотиды и получать разветвленные миметики ПАР;

- синтез пиримидиновых дисахаридных нуклеозидов и изучение их ингибиторной активности в реакции поли(АОР-рибозил)ирования, катализируемой рекомбинантной ПАРП-1, а также в культуре клеток.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Дреничев, Михаил Сергеевич

выводы

1. Впервые синтезирован большой ряд миметиков поли(АОР-рибозы) на основе дисахаридных нуклеозидов и их ациклических аналогов, в которых пирофосфатный остаток в природном полимере заменен на фосфатный. В этих соединениях сохранены основные важнейшие функциональные группы и расстояния между ними.

2. Предложены новые синтоны для получения олигонуклеотидов, содержащих азидоалкильные и бромалкильные группы для постсинтетической модификации, позволяющие вводить в 2'-положение олигонуклеотидной цепи различные заместители.

3. Впервые синтезирован З'-О-Р-Б-рибофуранозиладенозин, который был выделен из листьев Arabidopsis thaliana при бактериальном заражении Pseudomonas syringae. Оптимизирован метод получения дисахаридных нуклеозидов.

4. Исследована стабильность 3',5'-0-(тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил)нуклеозидов в основных средах и подобраны оптимальные условия для удаления ацильных защитных групп.

5. В ходе работы синтезировано 60 новых соединений, структура которых подтверждена данными масс-спектрометрии, УФ- и ЯМР-спектроскопии. В ряду синтезированных соединений обнаружены ингибиторы рекомбинантной поли(А0Р-рибозо)полимеразы-1 с IC50 3-5 10"5 М.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Дреничев, Михаил Сергеевич, Москва

1. Hassa P.O., Haenni S.S., Elser M., Hottiger M.O. Nuclear ADP-ribosylation reactions in mammalian cells:where are we today and where are we going? // Microbiol. Mol. Biol. Rev., 2006, 70, P. 789-829.

2. Sugimura T., Miwa M. Poly(ADP-ribose): historical perspective. // Mol. Cell Biochem., 1994,138, P. 5-12.

3. Jagtap P., Szabo C. Poly(ADP-ribose)polymerase and the therapeutic effects of its inhibitors. II Nature Rev. Drug Discovery, 2005, 4, P. 421-440.

4. Mikhailov S.N., Kulikova I.V., Nauwelaerts K., Herdewijn P. Synthesis of 2'-0-a-D-ribofuranosyladenosine, monomeric unit of poly(ADP-ribose). // Tetrahedron., 2008, 64, P. 2871-2876.

5. D'Amours D., Desnoyers S., D'Silva I., Poirier G.G. Poly(ADP-ribosyl)ation reactions in the regulation of nuclear functions. // Biochem. J., 1999, 342, P. 249-268.

6. Seeberger P.H, Danishefsky S.J. Solid-phase synthesis of oligosaccharides and glycoconjugates by the glycal assembly method: a five year retrospective. // Acc Chem Res., 1998. 31, P.685-695.

7. Koeller K.M, Wong C.H. Complex carbohydrate synthesis tools for glycobiologists: enzyme-based approach and programmable one-pot strategies. // Glycobiology, 2000. 10, P. 11571169.

8. Kjellén L, Lindahl U. Proteoglycans: structures and interactions. // Annu Rev. Biochem., 1991,60, P.443-475.

9. Sugahara K, Kitagawa I I. Recent advances in the study of the biosynthesis and functions of sulfated glycosaminoglycans. II Carr. Opin. Struct. Biol, 2000,10, P.518-527.

10. Esko J.D., Lindahl U. Molecular diversity of heparan sulfate. // J. Clin. Invest., 2001,108(2), P. 169-173.

11. Ferraris D.V. Evolution of Poly(ADP-ribose) Polymerase-1 (PARP-1) Inhibitors. From Concept to Clinic. II J. Med. Chem., 2010, 53, P. 4561^584.

12. Schultheisz H. L., Szymczyna B. R., Williamson J. R. Enzymatic Synthesis and Structural Characterization of 13C, 15N-Poly(ADP-ribose). II J. Am. Chem. Soc., 2009, 131, P. 1457114578.

13. Brown J.A., Marala R. B. Development of a high-throughput screening-amenable assay for human poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors. // J. Pharmacol. Toxicol. Methods., 2002, 47, №3, P.137-141.

14. Keith G., Desgres J, de Murcia G. Use of two-dimensional thin-layer chromatography for the components study of poly(adenosine diphosphate ribose). // Analit. Biochem., 1990,191, № 2, P. 309-313.

15. Ефимцева E.B., Михайлов C.H. Дисахаридные нуклеозиды. // Успехи химии. 2004, 73 (4), С. 435-448

16. A.M.Ferro, N.J.Oppenheimer. Structure of a poly(adenosine diphosphoribose) monomer 2'-(5'-phosphoribosyl)- 5'-adenosine monophosphate. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1978, 75, P. 809-813.

17. A.A.Rodionov, E.V.Efimtseva, S.N.Mikhailov, J.Rozenski, I.Luyten, P.Herdewijn. Synthesis and properties ofO-beta-D-ribofuranosyI-(r'-2')-adenosine-5"-phosphate and its derivatives. // Nucleosides Nucleotides Nucl. Acids, 2000,19, P. 1847-1859

18. Антонов К. В., Есипов Р. С., Гуревич А. И., Чувиковский Д. В., Микулинская Г. В., Феофанов С. А., Мнрошников А. И. Химический и химико-ферментативный синтез а-тиотрифосфатов нуклеозидов. // Биоорганическая химия, 2003, 29, №6, С. 616-622

19. Ahmadibeni Y., Parang К. Selective diphoshorilation, dithiodiphosphorilation, triphosphorylation and trithiotriphosphorylation of unprotected carbohydrates and nucleosides. // Org. Lett., 2005, 7, № 25, P. 5589-5592.

20. Warneke S., Meier C. Synthesis of Nucleoside Di- and Triphosphates and Dinucleoside Polyphosphates with cyc/oSal-Nucleotides. // J. Org. Chem., 2009, 74, P. 3024-3030

21. Ahmadibeni Y., Tiwari R. K., Sun G., Parang K. Synthesis of nucleoside mono-, di-, and triphosphoramidates from Solid-Phase cyc/oSaligenyl Phosphitylating Reagents. // Org. Lett., 2009,11, № 10, P. 2157-2160.

22. Smith. M.; Drumaond, G. I.; Khorana, H. G. The synthesis and properties of ribonucleoside-3',5' cyclic phosphates II J. Am. Chem. Soc. 1961, 83, P. 698-706.

23. Ikehara, M.; Uesugi, S.; Yoshida, K. Studies on the conformation of purine nucleosides and their 5'-phosphates. // Biochemistry 1972,11, P. 830-836.

24. Kanavarioti A., Lu J.; Rosenbach, M. Т.; Hurley, Т. B. Unexpectedly facile synthesis of symmetrical Pl,P2-dinucleoside-5'-pyrophosphates. // Tetrahedron Lett. 1991, 32, P. 60656068.

25. Zaremba T., Curtin N. J., PARP inhibitor development for systemic cancer targeting. // AntiCancer Agents Med. Chem., 2007, 7, P. 515-523.

26. Wang Z. Q., Auer B., StingI L., Berghammer H., Haidacher, D., Schweiger, M., Wagner, E. F. Mice lacking ADPRT and poly(ADP-ribosyl)ation develop normally but are susceptible to skin disease. // Genes Dev., 1995, 9, P. 509-520.

27. Virag L., Szabo C. The therapeutic potential of poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors. // Pharmacol. Rev., 2002, 54, № 3, P. 375-429.

28. Ruf A.R., de Murcia G., Schulz G. E. The mechanism of the elongation and branching reaction of poly(ADP-ribose)polymerase as derived from crystal structures and mutagenesis. Hi. Mol. Biol., 1998, 278, № 1, P. 57-65.

29. Cosi C. New inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase and their potential therapeutic targets. // Exp. Opin. Therapeut. Pat., 2002,12, № 7, P. 1047-1071.

30. Kinoshita T., Nakanishi I., Warizaya M. et al. Inhibitor-induced structural change of the active site of human poly(ADP-ribose)polymerase. // FEBS Lett., 2004, 556, № 1-3, P. 4346.

31. Shall S. ADP-ribosylation reactions. // Biochimie., 1995, 77, № 5, P. 313-318.

32. Trucco C., Oliver F. J., de Murcia G., Menissier de Murcia J. DNA repair defect in poly(ADP-ribose) polymerase-deficient cell lines. // Nucleic Acids Res., 1998, 26, № 11, P. 2644-2649.

33. Satoh M. S., Lindahl T. Role of poly(ADP-ribose) formation in DNA repair. //Nature., 1992, 356, № 6367, P. 356-358.

34. Germain M., Affar E.B., D'Amours D., Dixit V. M., Salvesen G. S., Poirier G. G. Cleavage of automodified poly(ADP-ribose)polymerase during apoptosis. Evidence for involvement of caspase-7. // J. Biol. Chem., 1999, 274, № 40, P. 28379-28384.

35. Green D. R., Reed J. C. Mitochondria and apoptosis. // Science., 1998, 281, P. № 5381, 1309-1312.

36. Smith S., Giriat I., Schmitt A., de Lange T. Tankyrase, a poly(ADP-ribose) polymerase at human telomeres. // Science., 1998, 282, P. 1484-1487.

37. De Rycker M., Price C. M., Tankyrase polymerization is controlled by its sterile alpha motif and poly(ADP-ribose) polymerase domains. // Mol.Cell. Biol., 2004, 24, P. 9802 -9812.

38. Chang W., Dynek J. N., Smith S. NuMA is a major acceptor of poly(ADP-ribosyl)ation by tankyrase 1 in mitosis. // Biochem. J., 2005, 391, P. 177 -184.

39. Bonicalzi M.-E., Haince J.-F., Droit A., Poirier G. G. Regulation of poly(ADP-ribose) metabolism by poly(ADP-ribose)glycohydrolaze: where and when? // Cell. Mol. Life Sci., 2005, 62, P. 539-560.

40. Panda S., Poirier G.G. Key S.A. Tej defines a role for poly(ADP-ribosyl)ation in establishing period length of the arabidopsis circadian oscillator. // Dev. Cell., 2002, 3, P. 51-61.

41. Hanai S., Kanai M., Ohashi S., Okamoto K., Yamada M., Takahashi H et al. Loss of poly(ADP-ribose)glycohydrolaze causes progressive neurodegradation of Drosophila melanogaster. II Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2004,101, P. 82-86.

42. Y.Wang, V. L. Dawson, T.M. Dawson. Poly(ADP-ribose) signals to mitochondrial AIF: a key event in parthanatos. // Exp Neurol., 2009, 218, P. 193-202

43. Nottbohm A. C., Hergenrother. The promises and pitfalls of small-molecule inhibition of poly(ADP-ribose)glycohydrolase (PARG). // DRUG DISCOVERY RES. New Frontiers in the post-genomic era. Edited by Z. Huang. San-Diego, 2007, chapter 7, P. 173-184.

44. Ratnam K., Low J. A. Current development of clinical inhibitors of poly(ADP-ribose) in oncology. // Clin. Cancer Res., 2007,13, P. 1383-1388

45. Verbeek В., Southgate Т. D., Gilham D. E., Margison G. P. 06-Methylguanine-DNA methyltransferase in activation and chemotherapy. // British Med. Bull., 2008, 85, P. 17-33.

46. Fauzee N. J. S. et al. PARP and PARG Inhibitors -New Therapeutic Targets in Cancer Treatment // Pathol. Oncol. Res., 2010,16, P. 469-478.

47. Sandhu S. K., Yap T. A., de Bono J. S. Poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors in cancer treatment: A clinical perspective. II Eur. J. Cancer., 2010, 46, P. 9-20.

48. Banasik M., Ueda K. Inhibitors and activators of ADP-ribosylation reactions. // Mol. Cell Biochem., 1994,138, P. 185-197.

49. Banasik M, Komura H, Shimoyama M, Ueda K: Specific inhibitors of poly(ADP-ribose) synthetase and mono(ADP-ribosyl)transferase. J. Biol. Chem. 1992, 267, 1569-1575.

50. Rankin P. W., Jaeobson E. L., Benjamin R. C., Moss J., Jacobson M. K. Quantitative studies of inhibitors of ADP-ribosylation in vitro and in vivo. II J. Biol. Chem., 1989, 264, 43124317.

51. Pivazyan A.D., Birks E.M., Wood T.G., Tai-Shun Lin, Prusoff W.H. Inhibition of poly(ADP-ribose)polymerase activity by nucleoside analogs of thymidine. // Biochemical Pharmacology., 1992, 44, 947-953.

52. Geraets L., Moonen H. J. J., Wouters E. F. M., Bast A., Hageman G. J. Caffeine metabolites are inhibitors of the nuclear enzyme poly(ADP-ribose)polymerase-l at physiological concentrations. // Biochem. Pharm., 2006, 72, 902-910

53. Southan G. J., Szabo C. Poly(ADP-ribose)polymeraze inhibitors. // Curr. Med. Chem., 2003, 10(4), P.321-340

54. Ruf A., de Murcia G., Schulz G. E., Inhibitor and NAD+ binding to poly(ADP-ribose) polymerase as derived from crystal structures and homology modeling. // Biochemistry, 1998,37, P. 3893-3900

55. Ефимцева E.B., Куликова И.В., Михайлов C.H. Дисахаридные нуклеозиды важная группа природных соединений. // Молекулярная биология, 2009, 43, 327-338.

56. Zhou J., Shevlin Р. В. A short synthesis of 1-vinyluracil and 1-vinylthymine. // Synthetic Commun., 1997, 27(20), P. 3591-3597

57. Tararov V. I., Kolyachkina S.V., Alexeev C.S., Mikhzilov S.N. A^-Acetyl^'^'^'-tri-O-acetyladenosine. A convenient, "missed-out" substrate for regioselective A^-alkylations. // Synthesis, 2011, №15, P. 2483-2489

58. Steinhagen H., Gerish M., Mittendorf J., Schlemmer K-H., Albrecht B. Substituted uracil derivatives as potent inhibitors of poly(ADP-ribose)polymeraze-l (PARP-1). // Bioorg. Med. Chem. Lett., 2002,12, P. 3187-3190.

59. Drenichev M.S., Kulikova I.V., Bobkov G.V., Tararov V.I., Mikhailov S.N. A New Protocol For Selective Cleavage of Acyl Protecting Groups in 3',5'-0-(Tetraisopropyldisiloxane-l,3-diyl)ribonucleosides. // Synthesis, 2010, №22, P.3827-3834.

60. Drenichev M.S., Bobkov G.V., Tararov V.I., Mikhailov S.N. Selective Cleavage of Acyl Protecting Groups in 2'-0-Modified 3',5'-0-(Tetraisopropyldisiloxane-l,3-diyl)ribonucleosides. // Collection Symposium series, 2011,12, P. 403-404.

61. Kiviniemi A., Virta P., Drenichev M.S., Mikhailov S.N., Lonneberg H. Solid-Supported 2'-O-Glycoconjugation of Oligonucleotides by Azidation and Click Reactions. // Bioconjugate Chemistry, 2011, 22, P. 1249-1255.

62. Беккер Г., Бергер В., Домшке Г., Фангхенель Э., Фауст Ю., Фишер М., Гентц Ф., Гевальд К., Глух Р., Майер Р., Мюллер К., Павель Д., Шмидт Г., Шольберг К., Шветлик К., Зейлер Э., Цеппенфельд Г. // Органикум. М.: «Мир», 1976., том 2, С. 353377.

63. Markiewicz, W. Т. Tetraisopropyldisiloxane-l,3-diyl a group for simultaneous protection of 3 and 5-hydroxy functions of nucleosides. II J. Chem. Res. (5), 1979, P. 24-25.

64. Ogilvie K.K., Beaucage S.L., Schifman A.L., Theriault N.Y., Sadana K.L. The synthesis of oligonucleotides II. The use of silyl protecting group in nucleoside and nucleotide chemistry. // Can. J. ChemAm, 56, P. 2768-2780.

65. Beigelman L.N., Mikhailov S.N. Transient protection in nucleoside synthesis using trityl groups: is it necessary to block hydroxyl groups? // Carbohydrate Res., 1990, 203, P.324-329.

66. Bobkov G.V., Brilliantov K.V., Mikhailov S.N., Rozenski J., Van Aerschot A., Herdewijn P. // Collect. Czech. Chem. Commun., 2006, 71, №6, P. 804-819.

67. Bobkov G.V., Mikhailov S.N., Van Aerschot A., Herdewijn P. Phosphoramidite building blocks for efficient incorporation of 2'-0-aminoethoxy(and propoxy)methyl nucleosides into oligonucleotides. // Tetrahedron, 2008, 64, P. 6238-6251.