Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Поиск ингибиторов поли (ADP-рибозо)полимеразы-1. Миметики поли(ADP-рибозы)

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Поиск ингибиторов поли (ADP-рибозо)полимеразы-1. Миметики поли(ADP-рибозы)"

На правах рукописи

ДРЕНИЧЕВ Михаил Сергеевич

поиск ингибиторов поли(абр-рибозо)полимеразы-1. миметики полщаВГ-рибозы)

03.01.03 - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

1 я АПР Ш

Москва 2013

005057554

Работа выполнена в Лаборатории стереохимии ферментативных реакций Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук.

Научный руководитель: заведующий Лабораторией стереохимии ферментативных реакций Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук (ИМБ РАН), доктор химических наук, профессор С.Н. Михайлов

Официальные оппоненты: профессор химического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего

профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова», доктор химических наук, профессор Т.С. Орецкая

ведущий научный сотрудник Лаборатории молекулярных основ действия физиологически активных соединений Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, доктор химических наук А.Р. Хомутов

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков Ю.А.Овчинникова и М.М. Шемякина Российской академии наук

Защита диссертации состоится «21 » wUC^pmCX 2013 г. в 12. ~ часов на заседании диссертационного Совета Д 002.235.01 при Федеральном государственном бюджетным учреждении науки Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32.

Автореферат разослан « Ю »

?си-р 2013 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук

Актуальность исследования. Поли-АБР-рибозилирование - посттрансляционная модификация белков в эукариотических клетках, катализируемая поли(АВР-рибозо)полимеразами (ПАРП). Эти ферменты осуществляют превращение никотинамидадениндинуклеотида (NAD+) в поли(АОР-рибозу) (ПАР) с высвобождением никотинамида [Hassa P.O. et al. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 2006, 70, 789-829]. ПАР вовлечена в процессы модуляции структуры хроматина, репликации, транскрипции, репарации ДНК и дифференцировки клеток и представляет собой разветвленный биополимер, в котором остатки 2'-0-а-В-рибофуранозиладенозина соединены между собой пирофосфатными связями. Поли(АОР-рибозо)полимераза-1 (ПАРП) относится к числу ключевых белков, осуществляющих регуляцию процесса репарации оснований и одноцепочечных разрывов ДНК, и отвечает за синтез 90% поли(АОР-рибозы) в клетке.

До настоящего времени ПАР не синтезирован, что связано как со сложностями синтеза дисахаридных нуклеозидов, так и с образованием пирофосфатной связи. Лишь недавно в нашей лаборатории был впервые получен 2'-0-а-0-рибофуранозиладенозин - мономерное звено ПАР.

Ингибиторы ПАРП представляют интерес как потенциальные противораковые агенты [Ferraris D.V., 2010, J. Med. Chem., 53, 4561^1584]. Алкилирующие препараты, которые реагируют с гетероциклическими основаниями нуклеиновых кислот и вызывают повреждение ДНК, и ионизирующее излучение, применяют в схемах лечения многих форм онкозаболеваний. Системы репарации ДНК противостоят действию агентов, повреждающих ДНК, поэтому терапевтический эффект зависит от эффективности систем репарации ДНК. Направленное ингибирование репарации ДНК может быть основой очень эффективной сопровождающей терапии. Ожидается, что использование ингибиторов ПАРП в комплексной химиотерапии позволит снизить концентрацию алкилирующих противоопухолевых агентов и, следовательно, понизить общую токсичность лечения. Вышесказанное определяет актуальность и большой интерес к изучению миметиков ПАР и созданию ингибиторов ПАРП.

Целью работы являлся поиск новых ингибиторов ПАРП-I в ряду дисахаридных нуклеозидов, а также получение миметиков ПАР, исходя из фосфорамидитных синтонов на основе дисахаридных нуклеозидов и их ациклических аналогов. В ходе исследования решались следующие задачи:

- оптимизация методов получения дисахаридных нуклеозидов, исследование устойчивости 1,1,3,3-тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил (TIPDS) защитной группы в основных средах и подбор оптимальных условий для удаления ацильных защит (деблокирования);

- разработка синтеза фосфорамидитных синтонов на основе дисахаридных нуклеозидов и их ациклических аналогов;

- получение миметиков ПАР, разработка подходов, позволяющих вводить функциональные группы в олигонуклеотиды и получать разветвленные миметики ПАР;

- синтез пиримидиновых дисахаридных нуклеозидов и изучение их ингибиторной активности в реакции поли(АОР-рибозил)ирования, катализируемой рекомбинантной ПАРП-1, а также в культуре клеток.

Научная новизна и практическая значимость работы. Оптимизирован предложенный ранее метод получения 2'-0-а-0-рибофуранозиладенозина, мономерного звена ПАР, и других пентафуранозилнуклеозидов, что позволило увеличить общий выход целевых продуктов. Исследована стабильность исходных 3',5'-0-(тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил)нуклеозидов в основных средах и подобраны оптимальные условия для удаления ацильных защитных групп без затрагивания силильной группы. Получен большой ряд миметиков ПАР на основе дисахаридных нуклеозидов и их ациклических аналогов. В ряду пиримидиновых дисахаридных нуклеозидов найдены ингибиторы ПАРП с К,~10"5. В ходе работы синтезировано 60 новых соединений, структура которых подтверждена данными масс-спектрометрии, УФ- и ЯМР-спектроскопии. Впервые осуществлен синтез З'-О-р-Б-рибофуранозиладенозина - сигнальной молекулы, вырабатываемой в ответ на поражение растений фитопатогенными бактериями.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были представлены на научной конференции молодых ученых ИМБ РАН (Москва 14 октября 2010), на XIX международной конференции «Нуклеозиды, нуклеотиды и нуклеиновые кислоты» (Lyon, France, 29 August - 3 September 2010), на XXIII зимней молодежной школе-конференции Института биоорганической химии им. академиков Ю.А.Овчинникова и М.М.Шемякина РАН (Москва, 7-10 февраля 2011), на XV международном симпозиуме по химии компонентов нуклеиновых кислот (Cesky Krumlov, Czech Republic, June 5-10, 2011) и на научной конференции молодых ученых ИМБ РАН (Москва, 30 октября 2012).

Публикации По материалам диссертации опубликовано 2 статьи, глава в продолжающемся методическом издании и 3 тезисов докладов.

Структура и объем диссертации Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы ( наименований). Работа изложена на страницах, включает рисунков, схем и таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Миметики ПАР являются потенциальными ингибиторами ПАРП и поли(АПР-рибозо)гликогидролазы, фермента, ответственного за деградацию ПАР, и представляют интерес в

качестве новых объектов для исследований в молекулярной биологии, медицинской химии и биохимии (изучение систем репликации, транскрипции и репарации ДНК). Сложность синтеза ПАР и ее структурных аналогов связана с введением лабильных пирофосфатных связей между остатками дисахаридных нуклеозидов. Для получения миметиков ПАР пирофосфатные связи могут быть заменены на фосфатные, при сохранении расстояния между основными функциональными группами. Такая замена позволяет использовать автоматический олигонуклеотидный синтез с использованием фосфорамидитных синтонов.

Важной проблемой является направленный поиск новых ингибиторов ПАРП. Перспективное направление поиска - создание структур, схожих по строению с мономерным звеном поли(АОР-рибозы).

Ранее в нашей лаборатории был получен - 2'-0-а-0-рибофуранозиладенозин с применением 1,1,3,3-тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил (ТГРОЙ) защитной группы, предложенной Маркевичем. Стадия гликозилирования протекала в присутствии 5пСЦ с хорошим выходом (62%). Общий выход дисахаридного нуклеозида составил 13%. Относительно невысокий общий выход целевого продукта связан с нестабильностью Т1Р05-нукпеозидов на стадии удаления ацильных групп. Поэтому в настоящей работе была изучена устойчивость бис-силильной защитной группы в условиях деблокирования ацильных защитных групп. При обработке Т1Р05-нуклеозидов 1 метилатом натрия, раствором аммиака или БЕШ в метаноле происходит раскрытие восьмичленного цикла с образованием 5'-региоизомера 2, содержащего метоксильную группу (схема 1). В 'Н-ЯМР-спектре (ОМБО-с/б) соединения 2 (В = ига) присутствует сигнал метальной группы в виде синглета. Гидроксильные группы проявляются в виде двух дублетных сигналов, которые исчезают при добавлении к образцу БгО, а в спектре производного 3 присутствуют сигналы двух ацетильных групп.

Схема 1. Раскрытие восьмичленного цикла в Т1РБ8-рибонуклеозидах (В=ига). ¡. 4М 1ЧНз-МеОН, 20 °С, 24 ч, 25%, или ОВи-МеОН (МеОМа-МеОН), 20 °С, 8 ч, 75%; н. Ас20/ниридин, 20 "С, 1.5 ч, 88%.

Синтез дисахаридных нуклеозидов

3 [3=Ас

Подбор оптимальных условий деблокирования ацильных групп (В7., Ас, /-Ви) проводили в спиртовых растворах различных аминов и аммиака (таблица 1). Как видно из таблицы 1, для удаления ацильных защитных групп целесообразно использовать растворы аминов в этаноле. В этих условиях образование продуктов 2 составляло не более 2%.

Раствор МеЫНг-ЕЮН использовался в синтезе 2'-0-а-В-рибофуранозиладенозина для

удаления бензоильных защитных групп (схема 2, реакция и). Однако при использовании

алкиламинов для удаления бензоильных защит происходит как О-, так и Лг-дебензоилирование с

образованием продукта 8. В связи с этим было решено использовать в реакции гликозилирования

производное аденозина 5 со свободной аминогруппой. О-Гликозилирование протекало

стереоспецифично, с образованием а-гликозидной связи (схема 2). Наличие в присоединяемом

Таблица 1. Относительная стабильность Т1РОЯ- и Л'-ацильных защитных групп в 4М спиртовых растворах аминов/аммиака при 20 °С'.

№ опыта Основание в нуклеозиде 1 Реагент Время деацилирования Степень расщепления Т1Р[)8-пуклсозидов через 24 ч2

1 1а В = №а МНз-МеОН 25%

2 ИНз-ЕЮН <2%

3 МеШ2-ЕЮН 2%

4 1Ь В = Су1В2 Шз-МеОН 3.5 ч 50%

5 ЫНз-ЕЮН 40 ч <2%

6 МеШ2-ЕЮН 30 мин 2%

7 Е1ЫН2-ЕЮН 3.5 ч <2%

8 РгКН,-ЕЮН 3.5 ч <2%

9 1с В = Су1Ас ЫНз-МеОН 10 мин 50%

10 ЫНз-ЕЮН 10 ч <2%

11 МеКНз-ЕЮН 5 мин 2%

12 е1м12-еюп 10 мин <2%

13 РгЫН2-ЕЮН 10 мин <2%

14 ы В = Сиа'"Ви ЫНз-МеОН 15ч 50%

15 ЫНз-ЕЮН 4 дня <2%

16 МеКН2-ЕЮН 2.5 ч 2%

17 Е1ЫН2-ЕЮН 35 ч <2%

18 РгЫП2-ЕЮН 35 ч <2%

При определении степени расщепления Т1Р05-нуклеозидов учитывалось образование продуктов полного десилилирования (нуклеозиды) и продуктов раскрытия восьмичленного цикла.

моносахариде соучаствующей О-бензоильной группы обеспечивало образование 1,2-траис-замещенных арабинофуранозидов.

После удаления бензоильных групп вводилась вторая защитная "ПРОБ-группа по 3"- и 5"-ОН группам арабинофуранозного остатка (схема 2, реакция ііі). Далее следовало обращение конфигурации при С-2" атоме углерода и удаление силильных групп действием тригидрата ТВАР или фторида триэтиламмония (схема 2, реакция уі). Таким образом, общий выход нуклеозида 13 удалось повысить с 13 до 19-21%. Данные ЯМР, УФ и масс-спектроскопии для структуры 13 согласуются с данными, описанными в литературе.

Схема 2. Синтез 2'-0-а-О-рибофуранозиладенозина и его оптимизация, i. SnCU/ДХЭ, О °С, 24ч, 62-64%; ii. 0,1 М MeONa/MeOH, 10 °С, 40 мин, 7->9: 47% или MeNH2/EtOH, 24ч 7->10: 77%; 8—>10: 87%; iii. TiPDSCb /пиридин, 24ч, 20 °С, 80%; iv. DMS0/Ac20 65 °С, 4ч; v. NaBH,,/EtOH, 0 °С, 1ч, 62% (iv+v); vi ВU4NF• 3НгО/ТГФ, 69% или Et3N-HF/Tr®, 78%.

Заражение растений фитопатогенными бактериями индуцирует образование ряда метаболитов, которые являются производными индолов или нуклеозидов. При инфицировании культур арабидопсиса (Arabidopsis thaliana) бактериями Pseudomonas syringae образуется З'-O-ß-D-рибофуранозиладенозин, который был выделен из клеток пораженных растений Беднареком и

Є

коллегами [Bednarek et al., 2004, Planta, 218, 668-672]. В данной работе был впервые осуществлен синтез этого нуклеозида (схема 3).

В качестве исходных соединений использовались 1-0-ацетил-2,3,5-три-0-бензоил-0-рибофураноза 15 и 2',5'-ди-0-(тре/и-бутилдиметилсилил)аденозин 14, полученный по известной методике. Реакция гликозилирования протекала без заметной миграции силильной группы с выходом 64%. Десилилирование нуклеозида 16 протекало в присутствии BU4NF3H2O с выходом 55%. Конечный дисахаридный нуклеозид 18 был выделен кристаллизацией из воды с суммарным выходом 23%.

f-BuMe2SiO—і о

VJ

I I Ade

HO OSiMe2f-Bu ^ <-BuMe2SiO-j^oy

14

+

О OSiMe2i-Bu BzO-^oOAc BZO^J

BzO OBz BzO OBz

15

16

о он о он

BzO^J HO^

BzO OBz HO OH

17 18

Схема 3. Получение З'-О-Р-О-рибофуранозиладенозина. і. SnCU/ДХЭ, О °С, 16ч, 64%; iL Bu4NF-3H20/THF, 45 мин, 55%; iii. NH3/MeOH, 3 дня, 65%.

Конфигурация при С-1" атоме в рибозном остатке производного 18 подтверждается данными 'Н-ЯМР-спектроскопии: значение КССВ Jv\?,= 0 Гц свидетельствует о транс-расположении атомов Н1"-Н2". В 13С-ЯМР-спектре соединения 18 сигнал С-3' атома в аденозиновом остатке сильно смещен в сторону слабого поля по сравнению с исходным нуклеозидом 14, что доказывает присоединение рибозного остатка к аденозину в положении С-3'. Сигналы в 13С-ЯМР-спектре были отнесены с использованием спектров HSQC. Наличие между углеводными остатками гликозидной связи У - 1" также было подтверждено ЯМР-экспериментом с использованием гетероядерных корреляций дальних взаимодействий (НМВС). В спектре присутствуют кросс-пики между атомами Н-1" (Rib) и С-3' (Ado) и между Н-3' (Ado) и С-1" (Rib). ЯМР спектры 18 идентичны приведенным в литературе для выделенного соединения.

®

Рисунок 1. НМВС-спектр соединения 18 при 50 °С (323 К)

Таким образом, были получены производные аденозина, содержащие рибофуранозные фрагменты в 2'- и З'-положениях. Показана возможность применения ТВОМ8-защиты в условиях реакции гликозилирования. В ходе работы были подобраны оптимальные условия деблокирования ацильных защит в Т1РОЗ-нуклеозидах, что позволило существенно повысить общий выход дисахаридных нуклеозидов.

К настоящему времени, благодаря рентгеноструктурному анализу, строение активного центра ПАРП изучено достаточно подробно. Согласно данным молекулярной динамики, ПАР -подвижная молекула и расстояние между атомами в соседних звеньях варьирует в пределах 5.016.2 А (рисунок 2, таблица 2). Природная ПАР представляет собой полимер с нерегулярной структурой, в то же время синтетические миметики ПАР имеют регулярную структуру, что важно для изучения их взаимодействий с белками.

Получение миметиков поли(АОР-рибозы)

он

Рисунок 2. Структура ПАР

Таблица 2. Расстояния между дисахаридными звеньями в поли(АОР-рибозе) и ее миметиках

Полимер c-i'-c-r, A O-O (furan) A

ПАР max 16.2 min 5.0 А' 10.3-11.3 11.4-11.8

ПАР в комплексе с ПАРП 10.7-11.3 10.6-11.4

Ado-a-D-Rib3 11.3 11.2

Ado-P-D-Rib 10.8 10.2

Ado-a-D-Ara 11.3 11.2

Ado-CH2OCH2CH2 13.5 14.0

Ado-CH2OCH2CH2CH2 15.0 15.2

-в миметиках ПАР пирофосфатная связь заменена на фосфатный остаток. На рисунке отмечены атомы, расстояния между которыми указаны в таблице

2-диапазоны расстояний между атомами рассчитаны с использованием молекулярной динамики ПАР в свободном состоянии и в комплексе с ферментом (к.х.н. Д.К.Нилов НИИ ФХБ имени А.Н.Белозерского МГУ)

3-среднестатистические расстояния между атомами рассчитаны при помощи программы ChemDraw Ultra 11.0

Для создания миметиков пирофосфатные связи были заменены на фосфатные, при этом сохраняются основные функциональные группы и расстояния между ними. Для увеличения стабильности миметиков ПАР предлагается также изменить конфигурацию гликозидной связи в остатках 2'-0-а-0-рибофуранозиладенозина, либо использовать ациклические аналоги дисахаридных нуклеозидов.

Нами был получен ряд фосфорамидитных производных дисахаридных нуклеозидов и их ациклических аналогов. Олигонуклеотидный синтез с использованием таких «строительных блоков» позволяет создавать олигомеры с расстояниями между функциональными группами, близкими к поли(АОР-рибозе) (таблица 2). Для получения фосфорамидитных синтонов на основе дисахаридных нуклеозидов необходимо проводить защиту всех ОН-групп. В этих соединениях присутствуют две первичных и три вторичных гидроксильных группы, для дифференциальной защиты которых требуются многостадийные манипуляции. Также необходимо блокировать аминогруппу аденина. Возможны два подхода к получению фосфорамидитных синтонов на основе дисахаридных нуклеозидов (схема 4).

ММТЮ

AdeB

(/-Pr)2N

Р—О

СЕЮ

"Ф

JT5 ^в

BzO OBz

НО О

но он

Ade

(/-PrfeN

Р-О

СЕЮ

ММТгО

АсО о

AdeBz

BzO OBz

Схема 4. Стратегия химической модификации дисахаридных нуклеозидов.

Путь А заключается в получении производных, содержащих фосфорамидитную группу в 5'-положении нуклеозида и кислотолабильную тритильную защиту по 5"-положению, вторичные ОН-группы блокируются ацильными защитами. Этот вариант существенно сложнее пути В и требует проведения большего числа стадий. Путь В заключается в получении производного, содержащего фосфорамидитную группу в 5"-положении рибофуранозы и тритильную группу 5'-положении аденозина.

Использование полностью ацилированных нуклеозидов типа 7-8 (схема 2) исключает возможность дифференциальной защиты 5"-первичной гидроксильной группы. Для селективного блокирования этого положения (стратегия В) была использована левулиновая защитная группа (Lev), которая может быть селективно удалена в мягких условиях гидразинолиза без затрагивания других ацильных групп.

Синтоны на основе дисахаридных нуклеозидов были получены согласно схеме 5. Л^-Бензоил-3',5'-0-(тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил)аденозин 4 вводился в конденсацию с защищенным производным арабинофуранозы 19 в присутствии SnCU. TIPDS-группа удалялась действием трехводного фторида тетрабутиламмония. Тритилирование, ацилирование и гидразинолиз проводили последовательно с хроматографической очисткой производного 22 на последней стадии. Фосфитилирующим агентом выступал 2-цианоэтил-Лг,Л',Л",Лг'-

тетраизопропилфосфорамидит, реакцию проводили в инертной атмосфере азота при О °С с использованием 1Я-тетразола в качестве активирующего реагента.

По аналогичной схеме были получены производные 24а и 24Ь, содержащие остаток рибофуранозы в p-конфигурации. Введение шо-бутироильной группы в З'-положение позволяет повысить выход продукта на стадии удаления левулиновой группы, поскольку ацетильная группа частично удаляется в этих условиях.

Фосфорамидитные синтоны на основе 2'-0-гидроксиалкоксиметилнуклеозидов были получены согласно схеме 6, аналогично дисахаридным прозводным. Реакция с диацетатами 25а-с протекает значительно быстрее О-гликозилирования. Было показано, что при конденсации нуклеозидов с ациклическими производными целесообразно использовать нуклеозид 5 со свободной аминогруппой. В случае Л^-бензоил-производного 4 образуется значительное количество побочных продуктов вследствие неустойчивости Л'-гликозидной связи в условиях реакции. В 'Н-ЯМР -спектрах 26а-с (CDCI3), наряду с сигналами рибофуранозы и пуринового основания, проявляются дополнительные сигналы, относящиеся к ациклическому фрагменту. Удаление ацетильной группы в присутствии 4М MeNH2-EtOH протекало с высоким выходом и позволило избежать существенного раскрытия бис-силильной группы. Применение ЫНз/МеОН на данной стадии существенно снижает выход продуктов 27.

Ade

sr -TAJ

Ч.о-

Iw

Si-O OH

Г

LevO—| q

BzO

19

4.0

«. W

^V-til f\

Si" >4

AdeB

LevO

Si-O О

rh

OBz / BzO\

JV

20

LevO

НО о

OBz &

AdeH:

21

MMTrO—I о Y

VI

AdeB:

HO

(/-PrbN^,

I

MMTrO—I о ^deB'

VI

AcO О

OBz / Bzo\

23

OCEt

(/-Pr)2 N

СЕЮ

AdeB:

BzO OBz

24a: R=Ac 24b: R=/-Bu

Схема 5. Получение амидофосфитных синтонов на основе дисахаридных нуклеозидов (Ьеу=С(0)СН2СН2С(0)СНз) ь ЭпСУДХЭ, О °С, N2, 20 ч, 58%; н. Ви4М--ЗН20/ТГФ, 10 мин, 73%; Ш. ММТгС1/пиридин, 16 ч, ¡v. Ас20, 0 °С, 4 ч; v. ^Щ-НгО/АсОН/пиридин, 0 °С, 40 мин, выход на 3 стадии ш-у 55%; уг (/-Ргг^РСХСНг^ОЧ/ 1 Я-тетразол, ацетонитрил, пиридин, N2, 30 мин, 85%.

Структура полученных соединений 23, 24а-Ь, 32а-с подтвержается данными Р-ЯМР спектроскопии (таблица 3). Общие выходы рассчитаны по схемам 5 и 6, исходя из TIPDS-производных 4 и 5.

В синтезе миметиков ПАР использовалось два типа фосфорамидитных синтонов - с ММТг-группой (соединения 23, 32а-с) и с DMTr-группой (соединения 24а-Ь). Твердофазный синтез олигомеров проводили на автоматическом синтезаторе ABI 3400 (Applied Biosystems, США) с использованием в качестве твердого носителя стекла с контролируемым размером пор (500А) и ковалентно пришитым дезоксиаденозином или защищенным аминолинкером С7 (производное 7-амино-2-(гидроксиметил)гексан-1-ола) по методике, описанной в работе [Mikhailov et al., 2009, CPNAC, 4.36.1-4.36.19, ссылка 3 в списке литературы] для MMTr-производных. При использовании DMTr-производных протокол олигонуклеотидного синтеза изменяется на стадии детритилирования. Масштаб синтеза составлял 0,2 мкмоль. Деблокирование олигомеров проводили в стандартных условиях (конц. водный аммиак, 6 часов, 55 °С). В таблице 4 приведены некоторые синтезированные олигомеры.

\ о—1 „ Ade ^ п-1 „ Ade

у^1 + Ас0^°Х0Ас — Г

^Г0 ОН 25а: п=2 О^О ОАс

1 /К 25Ь:п=3 /К "п

5 25с: п=4

26а-с

Г

^ и

°-°хон тТ тт:

27а-с 28а-с 29а-с

НО

нП^О он в2о 0^0>Г0>.М(/-РГ)2

п оо- л п i

ЗОа-с " 31а-<= 32а_С ОСЕ!

Схема 6. Получение синтонов на основе 2'-0-гидроксиалкоксиметилнуклеозндов. ¡. ХпСЦ/ДХЭ, -10 °С, N2, 40 мин, 26а - 43%, 26Ъ -56%, 26с - 54%; и. 4М МеМН2/ЕЮН, 24ч, 27а - 93%, 27Ь - 85%, 27с - 87% ш. Ме^а/пиридин, 1 ч; ВгС1, 2 ч; МН4ОН, 0 °С, 20 мин, 28а - 80%, 28Ь - 72%, 28с -79%; ¡v. ЬеуОН/БСС, диоксан, 40 мин, 29а - 84%, 29Ь - 78%, 29с - 81%; v. Ви4№-3 Н20 /ТГФ, 10 мин, 30а - 85%, ЗОЪ - 81%, 30с - 76%; ММТгС1/пиридин, 16 ч, уп. 1.5ея ВгС1, 0 °С; уш. М2Н4Н20/Ас0Н/пиридин, 0 °С, 40 мин; выходы на 3 стадии \i-viii 31а - 74%, 31Ь - 60%, 31с -70%; IX. (¡-Рг2М)2РО(СН2)2СМ/ 1Я-тетразол, ацетонитрил, пиридин, Ы2, 30 мин, 32а - 58%, 32Ь -61%, 32с-41%.

Таблица 3.31Р-ЯМР и общие выходы амидофосфитных синтонов.*

Соединение ''Р-ЯМР, 8(м.д.) Общий выход, %

23 150.90(с); 150.71 (с) 19.8

24а 151.26(с); 150.88(с) 18.6

24Ь 151.27(с); 150.82(с) 22.5

32а 150,18(с); 150.14(с) 9.8

32Ь 150,68(с); 149.31 (с) 7.9

32с 149.10(с) 6.5

♦Спектры 23,24а-Ь, 32а, 32с регистрировались в 0М80-£/6 с подавлением сигналов протонов, спектр 32Ь - в СОС13 с

подавлением сигналов протонов

Олигонуклеотиды 1-12 не проявляют ингибирующего действия на ПАРП-1 в концентрациях менее 0.1 мМ. Короткие олигомеры на основе 2'-0-а-0-арабинофуранозиладенозина, содержащие эозиновый флуоресцентный маркер, ингибируют интегразу ВИЧ, снижая активность фермента на 50% в концентрации 0.3 мкМ (проф. М.Б.Готтих, НИИ ФХБ им.А.Н.Белозерского МГУ).

Таким образом, исходя из соответствующих фосфорамидитных производных, были впервые получены и описаны миметики ПАР. Миметики ПАР, имеющие определенный состав и структуру, открывают новые возможности для изучения репарации ДНК и других важных клеточных процессов: а) изучения белков, участвующих в репарации ДНК; б) выяснения регуляторных функций поли(АОР-рибозы) в клетке.

Таблица 4. Структура и МА1Л)1-спектрометрия миметиков ПАР.

№ Синтон Состав олигомера МсаЫ Мгоип<1

1 23 Н2М(СН2)4СН(СН20Н)СН20(5' 'рАгаА(1о5') 11 5221.8 5216.7

2 23 Е051п-НЫ(СН2)4СН(СН20Н)СН20(5 ' 'рАгаАс1о5') 11 5927.8 5924.2

3 23 с1Ас1о(р(1А(1о)2 (5"рАгаАс1о5')и 5952.2 5953.6

4 23 (1Ас1о(5' "рАгаЛ(1о5') [ 5 7171.1 7173.4

5 23 с1Ас1о(5' 'рАгаАс!о5 8555.1 8557.5

6 24а-Ь с1Ас1о(р(1Ас1о)2 (5' 'рШЬАс1о5'),, 5952.2 5950.1

7 24а-Ь (1Аао(5"рШЬАао5')15 7171.1 7175.6

8 24а-Ь с1Ас1о(5 "рй ЬАс1о5') 18 8555.1 8554.7

9 32а <1Ас1о(рСН2СН20СН2-Ас1о5')7 3067.2 3074.9

10 32а аАао(рсн2сн20сн2-Аао5'),, 4676.3 4678.9

11 32а ёАс1о(рС[ [2СН2ОСН2-Аёо5 ')12 5078.6 5078.4

12 32а аАёо(рСН2СН2ОСН2-Аёо5 ')14 5883.2 5885.0

Использование «сНск»-реакции для функционализации олигонуклеотидов и создания разветвленных миметиков ПАР.

Включение дополнительных функциональных групп в состав олигонуклеотидов широко используется для решения ряда проблем, таких как их внутриклеточный транспорт и селективное накопление в клетках и тканях, введение флуоресцентных меток, модификация пептидов и белков и создание разветвленных олигонуклеотидов, изучение активности и механизма действия ферментов и.т.д. Одним из подходов для получения разветвленных биополимеров является циклоприсоединение методом «сНск»-химии. «С1юк»-реакции протекают в воде при комнатной температуре с выходами, близкими к количественным. Наиболее часто применяется циклоприсоединние ГШз по терминальной тройной связи в присутствии солей одновалентной

(исследования проводились совместно с Институтом химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, зав. лабораторией проф. Лаврик О.И.). В качестве показателя эффективности ингибирования использовали значение IC50 (таблица 5).

Дисахаридные нуклеозиды, представленные в таблице 5, обладают рядом структурных особенностей. Прежде всего, это наличие фармакофорной группы - карбоксамидного фрагмента в составе гетероциклического основания, что обеспечивает связывание с сайтом фермента, отвественным за связывание никотинамидного остатка (водородная связь с Ser-904 и Gly-863 ПАРП). Гидроксильные группы в составе углеводных остатков обеспечивают хорошую растворимость веществ в воде. Данные, приведенные в таблице 5, позволяют сделать вывод о влиянии заместителя X на ингибиторные свойства дисахаридных нуклеозидов. Соединения, содержащие объемные заместители (X=I, Ме), обладают гораздо большей активностью, сравнимой с активностью 3-аминобензамида (3-АВ).

Полученные результаты согласуются с данными рентгеноструктурного анализа (РСА) ПАРП в комплексе с рядом ингибиторов, близких по структуре гетероциклическим основаниям в составе полученных дисахаридных нуклеозидов. Согласно данным РСА, объемный заместитель X может увеличивать прочность связывания с ферментом, размещаясь в гидрофобном кармане (А1а898-Lys903) рядом с сайтом связывания никотинамида [Hattori К et al., 2004, J. Med. Chem., 47, 41514154].

Было решено проверить, как наиболее активные из полученных в данной работе соединений влияют на клетки. В институте молекулярной генетики РАН (м.н.с. А.С.Ефремова, руководитель сектора к.х.н. С.И.Шрам) было показано, что пиримидиновые дисахаридные нуклеозиды (X=I, Ме) и их диальдегидные производные проникают в ядра клеток и ингибируют ПАРП. Исследования проводились на культуре опухолевых клеток SKOV-3 в условиях окислительного стресса (обработка перекисью водорода). Ингибирование ПАРП оценивали по окрашиванию ядер флуоресцентно мечеными антителами к поли(ЛПР-рибочс).

Таким образом, были обнаружены дисахаридные нуклеозиды, способные эффективно накапливаться в ядрах клеток и ингибировать ПАРП.

Также была изучена цитотоксичность синтезированного 3'-0-рибофуранозил-2'-дезокси-5-фторуридина на культурах клеток L1210, FM3A, Molt4, Сет и HeLa (проф. Я.Бальзарини, Pera институт, Бельгия). Активность дисахаридного нуклеозида оказалась примерно на три порядка ниже активности 5-фтордезоксиуридина. Можно предположить, что низкая активность пиримидиновых дисахаридных нуклеозидов в этих клетках обусловлена отсутствием ферментов, гидролизующих О-гликозидную связь.

выводы

1. Впервые синтезирован большой ряд миметиков поли(АБР-рибозы) на основе дисахаридных нуклеозидов и их ациклических аналогов, в которых пирофосфатный остаток в природном полимере заменен на фосфатный. В этих соединениях сохранены основные важнейшие функциональные группы и расстояния между ними.

2. Предложены новые синтоны для получения олигонуклеотидов, содержащих азидоалкильные и бромапкильные группы для постсинтетической модификации, позволяющие вводить в 2'-положение олигонуклеотидной цепи различные заместители.

3. Впервые синтезирован З'-О-р-О-рибофуранозиладенозин, который был выделен из листьев Arabidopsis thaliana при бактериальном заражении Pseudomonas syringae. Оптимизирован метод получения дисахаридных нуклеозидов.

4. Исследована стабильность 3',5'-0-(тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил)нуклеозидов в основных средах и подобраны оптимальные условия для удаления ацильных защитных групп.

5. В ходе работы синтезировано 60 новых соединений, структура которых подтверждена данными масс-спектрометрии, УФ- и ЯМР-спектроскопии. В ряду синтезированных соединений обнаружены ингибиторы рекомбинантной поли(АОР-рибозо)полимеразы-1 с IC50 3-510"5 М.

Основное содержание работы отражено в следующих публикациях:

1. M.S.Drenichev, I.V.Kulikova, G.V.Bobkov, V.I.Tararov, S.N.Mikhailov. A New Protocol For Selective Cleavage of Acyl Protecting Groups in 3',5'-0-(Tetraisopropyldisiloxane-l,3-diyl)ribonucleosides. // Synthesis, 2010, № 22, 3827-3834.

2. A.Kiviniemi, P.Virta, M.S.Drenichev, S.N.Mikhailov, H.Lonneberg. Solid-Supported 2'-O-Glycoconjugation of Oligonucleotides by Azidation and Click Reactions. // Bioconjugate Chemistry, 2011, v. 22, 1249-1255.

3. S.N.Mikhailov, E.N.Timofeev, M.S.Drenichev, E.V.Efimtseva, P.Herdewijn, E.B.Roesch, M.M. Lemaitre. Oligonucleotides, containing V-methyl-2'-deoxyadenosine and A^-methyl^'-deoxyadenosine. // Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, 2009, Unit 4.36.1-4.36.19. Supplement 38. John Wiley & Sons.

4. M.S.Drenichev, G.V.Bobkov, V.I.Tararov, S.N.Mikhailov. Selective Cleavage of Acyl Protecting Groups in 2'-0-Modified 3',5'-<3-(Tetraisopropyldisiloxane-l,3-diyl)ribonucleosides. Collection Symposium series, 12, 403-404 (2011).

5. M.S.Drenichev, I.V.Kulikova, G.V.Bobkov, V.I.Tararov, S.N.Mikhailov. Stability of tetraisopropyldisiloxane-l,3-diyl blocking group. XIX International Round Table "Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids" (Lyon, France, 29 August - 3 September 2010). Conference book, Abstract PA094, pages 245-246.

6. М.С.Дреничев, И.В.Куликова, Г.В.Бобков. Стабильность тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил -защитной группы и ее использование в синтезе дисахаридных нуклеозидов. Тезисы XXIII зимней молодежной школы-конференции. ИБХ РАН (Москва, 7-10 февраля 2011). С.121. Сборник тезисов.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ, программы РАН «Молекулярная и клеточная биология» и ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на 2007-2013 годы» (государственный контракт № 16.512.11.2239).

Список использованных сокращений.

Ado - аденозин

DBU - 1,8-диазабицикло[5,4,0]ундец-7-ен DMSO - диметилсульфоксид DMTr — диметокситритил

ESI-MS - electron-spray ionization spectroscopy, методика проведения съемки масс-спектра, основанная на ионизации направленным пучком электронов

НМВС - heteronuclear multibond correlation, методика гетероядерной корреляции дальних взаимодействий

HSQC - heteronuclear single quantum coherence, методика гетероядерной {'Н,|3С}-одноквантовой корреляции

IC50 - half maximal inhibitory concentration, концентрация ингибитора, при которой активность фермента составляет 50% от исходной

MALDI - matrix-assisted liser desorbtion ionization, методика проведения съемки масс-спектра,

основанная на ионизации лазером

ММТг - монометокситритил

Rib - остаток рибозы

TBAF - тетрабутиламмоний фторид

TIPDS - тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил

TMGA-тетраметилгуанидиний азид

ДХМ - дихлорметан

ДХЭ - 1,2-дихлорэтан

КССВ - константа спин-спинового взаимодействия ПАРП - поли(ЛГ)Р-рибозо)полимераза ТГФ - тетрагидрофуран

Заказ № 35-П/02/2013 Подписано в печать 12.02.2013 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1

"Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; e-mail:info@cfr.ru