Химически активные ДНК в исследовании белков репарации ДНК: идентификация Ku-антигена как белка, взаимодействующего с апуриновыми/апиримидиновыми сайтами

Ильина, Екатерина Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Химически активные ДНК в исследовании белков репарации ДНК: идентификация Ku-антигена как белка, взаимодействующего с апуриновыми/апиримидиновыми сайтами
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Химически активные ДНК в исследовании белков репарации ДНК: идентификация Ku-антигена как белка, взаимодействующего с апуриновыми/апиримидиновыми сайтами"

На правах рукописи

ИЛЬИНА ЕКАТЕРИНА СЕРГЕЕВНА

ХИМИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ДНК В ИССЛЕДОВАНИИ БЕЛКОВ РЕПАРАЦИИ ДНК: ИДЕНТИФИКАЦИЯ Ки-АНТИГЕНА КАК

БЕЛКА, ВЗАИМОДЕЙСТВУЮЩЕГО С АПУРИНОВЫМИ/АПИРИМИДИНОВЫМИ

САИТАМИ

03.01.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Новосибирск - 2011

4844122

Работа выполнена в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Научные руководители:

д.б.н., доцент Ходырева Светлана Николаевна

д.х.н., профессор, член-корр. РАН Лаврик Ольга Ивановна

Официальные оппоненты:

д.х.н., профессор Кубарева Елена Александровна д.б.н., доцент Бунева Валентина Николаевна

Ведущая организация:

Институт цитологии и генетики СО РАН

Защита состоится « 25 » марта 2011 г. в 1_|_ часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 при Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск, пр. ак. Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

С авторефератом можно знакомиться на сайте www.niboch.nsc.ru

Автореферат разослан « » февраля 2011 г.

Учёный секретарь диссертационного

к.х.н., доцент

Коваль В. В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. ДНК каждой клетки подвергается действию разнообразных эндогенных и экзогенных факторов, вызывающих в ней различные повреждения. Повреждение ДНК может вызывать мутации, гибель клеток и их злокачественную трансформацию. Для предотвращения таких последствий клетки располагают несколькими специализированными системами репарации ДНК с частично перекрывающимися функциями. Эксцизионная репарация оснований (ЭРО) является одной из основных и наиболее важных систем репарации ДНК, поскольку ее действия направлены на исправление наиболее многочисленных повреждений, вызываемых эндогенными и экзогенными факторами, которые включают ионизирующее излучение, активные формы кислорода и некоторые противоопухолевые препараты [БсИагег, 2003]. В целом, для процесса ЭРО нехарактерно существование стабильного белкового ансамбля неизменного состава, который бы полностью проводил устранения повреждения в ДНК. В ансамбле по мере протекания репарации один из ферментов (факторов) заменяется белком, необходимым для следующей стадии процесса. Такой принцип организации процесса вносит ограничения в исследование структурной организации репарационного ансамбля рентгеноструктурным анализом или другими физико-химическими методами. Аффинная модификация широко применяется для исследования специфических взаимодействий белков с лигандами - биополимерами или низкомолекулярными соединениями. В частности, ее использование позволяет получать ценную информацию о структурно-функциональной организации белково-нуклеиновых комплексов, что является важнейшей фундаментальной задачей молекулярной биологии и биохимии. Цель и задачи работы. Целью данной работы являлось исследование взаимодействий белков экстрактов клеток человека с химически активными ДНК, имитирующими ДНК-интермедиаты различных этапов репарации ДНК. В ходе исследования планировалось решить следующие задачи:

• охарактеризовать вновь синтезированный фотоактивируемый аналог (1СТР и в сравнении с ранее использованными аналогами выявить фотоактивируемые производные ёСТР, которые наиболее пригодны для исследований в клеточных экстрактах;

• в экстрактах клеток человека провести поиск белков, специфически взаимодействующих с апуриновыми/апиримидиновыми (АР-) сайтами;

• отработать подходы к идентификации белков в составе ковалентных аддуктов с модифицированными ДНК-интермедиатами репарации ДНК;

• с использованием аффинной модификации, функциональных тестов и других методов изучить характеристики и биологическую значимость взаимодействия белков с АР-ДНК;

• оценить перспективность использования АР-ДНК для оценки

содержания в клеточных экстрактах белков, узнающих АР-сайты.

Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе химически активные ДНК-интермедиаты репарации ДНК были впервые применены для исследования репарации ДНК в экстрактах клеток человека. Для расширения возможностей аффинной модификации охарактеризован вновь синтезированный фотоактивируемый аналог dCTP и установлено, что с его использованием удается в несколько раз повысить эффективность модификации клеточных белков синтезированными in situ фотоактивируемыми ДНК. В экстрактах клеток человека впервые с использованием ДНК, содержащей апуриновые/апиримидиновые сайты, проведен поиск белков, узнающих AP-сайты. Отработана универсальная методика идентификации белков в составе ковалентных конъюгатов, образованных белками экстрактов с химически активными ДНК, основанная на масс-спектрометрическом анализе, которая применима к различным ДНК-связывающим белкам, специфически узнающим определенные структурные особенности в ДНК. С ее использованием Ки80-субъединица Ku-антигена была идентифицирована как основной белок-мишень, который образует сшивки с АР-ДНК. Для оценки содержания в клеточных экстрактах активных в связывании ДНК форм Ku-антигена предложен удобный и эффективный подход, основанный на использовании АР-ДНК, и с его использованием проведен скрининг ряда культивируемых клеток меланом.

Публикации и апробация работы. Основные результаты работы отражены в 5 статьях и 1 патенте. Результаты работы были представлены на международных конференциях: «Chemical and biological problems of proteomics», Новосибирск, 2004; «International conference on chemical biology», Новосибирск, 2005; «Физико-химическая биология», Новосибирск, 2006; Russian-European Workshop on DNA Repair and Epigenetic Regulation of Genome Stability (Санкт-Петербург, 2008), III International Meeting «Early events in Human Pathologies», Barbizon, France, 2010 и др.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, выводов, списка литературы. Она изложена на 132 стр. и включает 34 рисунка, 4 таблицы и список цитируемой литературы из 244 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Исследование взаимодействия белков клеточных экстрактов с фотоактивируемыми интермедиатами репарации ДНК

В арсенале химически активных аффинных реагентов для исследования белок-нуклеиновых взаимодействий значительное место принадлежит

аналогам ДНК на основе ароматических азидов [Khodyreva&Lavrik, 2005]. При активации УФ-светом арилазидных групп генерируются высоко реакционноспособные частицы, которые могут атаковать ближайшие атомы с образованием ковалентной связи между контактирующими частями биополимеров. Последующий анализ образовавшихся продуктов "фотосшивки" белок-ДНК позволяет получать информацию о структурной организации белково-нуклеиновых комплексов.

1.1. Включение фотоактивируемых аналогов dNTP в ДНК ДНК-полимеразами клеточных экстрактов и фотоаффинная модификация белков экстрактов синтезированными in situ ДНК

Ранее были синтезированы и охарактеризованы аналоги dCTP, содержащие фотоактивируемые группы, присоединенные по экзоциклической аминогруппе цитозина [Wlassoff et al., 1995, Сафронов с соавт., 1997]. На рис. 1 представлены структурные формулы фотоактивируемых аналогов dCTP исследованных в данной работе - ранее использованных FABO-dCTP и FABC-dCTP и вновь синтезированного FAP-dCTP.

-Ж

х} Iß II

I I I

pppdRib FABO-dCTP pppclRib FABC-dCTP pppdR,b FAP-dCTP

Рис. 1. Структурные формулы исследованных в работе производных нуклеотидов FABO-dCTP - экзо-М-[(4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензилиденаминоокси)-бу™локси]-2'-дезоксирибо-цитидин-5'-трифосфат; FABC-dCTP - экзо^-[2-{4-азидо-2Д5,6-тетрафторбензилиденаминооксиме-тилкарбамоил)-этил]-2'-дезоксирибоцитидин-5'-трифосфат; FAP-dCTP - экзо-Ы-{2-[М-(4-азидо-2,5-дифтор-3-хлорпиридин-6-ил>-3-аминопропионил]-аыиноэтил}-2'-дезоксирибоци™дин-5'-трифосфат.

Значения кинетических параметров в реакции элонгации праймеров, катализируемой ДНК-полимеразой ß (Pol ß), для FAP-dCTP и dCTP практически не отличаются. FAP-dCMP в составе ДНК обеспечивает высокий уровень сшивки с ДНК-полимеразой ß (при 4-х кратном избытке Pol ß по отношению к ДНК не менее 50% фотоактивируемой ДНК присоединяется к ферменту в условиях полного фотолиза). Уровни пришивки FABO-dCMP- и FABC-dCMP-содержащих ДНК к Pol ß при аналогичных условиях (при 85%-ном фотолизе фотоактивируемой группы) составляли около 20% и 2.5% соответственно Щрачкова с соавт., 2001].

Несмотря на достаточно широкое применение в исследованиях фотоактивируемых ДНК, синтезированных непосредственно в экстрактах, эффективность включения аналогов dNTP в ДНК ДНК-полимеразами клеточных экстрактов и влияние этого параметра на модификацию белков экстрактов фотоактивируемыми ДНК количественно не была оценена.

Следует отметить, что эффективность включения фотоактивируемых сйЧТР в состав ДНК в экстрактах может модулироваться присутствием белковых факторов, вклад которых не всегда можно учесть при экспериментах в системе, реконструированной из очищенных белков. В связи с этим при характеризации аналогов ёОТР, наиболее адекватным является сравнение эффективности синтеза фотоактивируемых ДНК в клеточных экстрактах, где присутствуют те же белки и в том же соотношении, что и в клетке. Это является принципиальным отличием экстрактов от реконструированных систем, где состав и соотношения белков задаются исследователем.

Синтезированные ш яки фотоактивируемые ДНК ранее применялись в исследовании белков репарации ДНК в экстрактах клеток млекопитающих, в том числе в ядерном экстракте семенников крупного рогатого скота (ЯЭСКРС) \Lavnk <?Г а!,, 2001, ЬеЬес1е\'а ег а/., 2002, Лебедева с соавт., 2003), но не охватывали клеток человека. Однако наибольший интерес представляет исследование системы репарации ДНК в клетках человека, поэтому в представленной работе использованы цельноклеточный экстракт НеЬа и ЯЭСКРС как образец сравнения.

Поскольку ранее было показано, что аналоги ёСТР могут опознаваться Ро1 Р как сГГТР, но с разной эффективностью |Драчкова с соавт., 2001], для синтеза фотоактивируемых ДНК ферментами экстрактов использовали две матрично-праймерные системы, в которых в матрицах в положениях +1 находились сЮМР или ёАМР, что обеспечивает возможность встраивания этих аналогов как ёСМР или сПГМР.

а)ов б)м

| ...............им I " Ш ш

...1.1 ..II

8 ^ ,сГ /С ¿Г 1 /С /Г> & ^

5 о* о» / с» ч» ч" & о* в* ¿Г ч» «Г

р Ч* Ч* «» 4 4 лнило| Я Чр Ч* Ч* Ч* 4 % Лняло)

Рис. 2. Количественная оценка эффективности элонгации праймера в составе ДНК-дуплекса с выступающей матричной цепью ДНК-полимеразами ЯЭСКРС (а) и экстракта клеток Не1_а (б) с использованием различных фотоактивируемых аналогов сШТР в качестве субстрата

Реакционные смеси содержали один из аналогов (30 мкМ), [32Р]-ДНК (0.1 мкМ) и белки ЯЭСКРС (3 мг/мл) (а) или экстракта клеток Не1_а (1.4 мг/мл) (б), а также стандартные компоненты: 50 мМ Тпв-НС1, рН 8.0, 10 мМ МдС12, 50 мМ МаС1, 0.25 мМ ДТТ и 5% глицерин. Реакцию синтеза проводили в течение 15 мин при 37°С. Продукты реакции разделяли электрофорезом в 20% ПААГ в присутствии 7 М мочевины. Обозначения аналогов приведены под рисунком. Символы ("С") и ("Т") обозначают в качестве какого из с)МТР (сЮТР или сПТР) был использован аналог в данной реакционной смеси. Эффективность элонгации праймера - доля праймера, удлиненного фотоактивируемым сММР. На гистограмме представлены данные трех независимых определений. Ошибка не превышала 15%.

Результаты количественной оценки эффективности синтеза фотоактивируемых ДНК для обоих экстрактов суммированы на рис. 2. Исходя из полученных данных, можно заключить, что ряды аналогов, выстроенные по эффективности их включения в ДНК, практически совпадают для обоих экстрактов.

При сравнении эффективности элонгации праймера в составе различных структур ДНК фотоактивируемым dNMP, эндогенными ДНК-полимеразами экстракта (рис. 3), обнаружено, что наибольший выход продуктов характерен для ДНК, содержащей мононуклеотидную брешь, фланкированную на 5'-краю фосфатной группой.

Известно, что Pol ß наиболее эффективно включает dNMP в мононуклеотидных брешах с фосфатом на 5'-краю [Chagovetz et al, 1997].

Кроме того, было показано, что в ЯЭСКРС синтез фотоактивируемых ДНК в основном осуществляет Pol ß [Лебедева с соавт., 2003].

■i я, I itg -I__Рис. 3. Количественная оценка эффективности

J |-*ИВ --элонгации праймера в составе различных ДНК-

f06 _ _i дуплексов эндогенными ДНК-полимеразами

| Н экстракта клеток HeLa с использованием FAP-dCTP

в 0.4 —^fc,______в качестве субстрата

--Состав реакционных смесей см. в подписи к рис. 2.

10.2--II - -■ — Схематическое обозначение использованных ДНК-

дуплексов приведено на рисунке. (■§) - нуклеотид с

й о .^И».. -*— —I гидроксильной (фосфатной) группой на 5'-конце.

¡1 ¡! t На гистограмме представлены данные трех

£ / / / независимых определений. Ошибка не превышала 15%.

% if Ii Н Исходный

т ц ц а дик-душ*™

С учетом специфичности Pol ß в синтезе ДНК на матрично-затравочных комплексах, отличающихся по структуре, можно предположить, что и в экстракте клеток HeLa Pol ß вносит основной вклад во включение фотоактивируемых dNMP.

Для дальнейшей характеризации FAP-dCTP и определения аналогов dCTP, наиболее пригодных для исследований в экстрактах, для нескольких производных dCTP был проведен сравнительный анализ модификации белков экстракта клеток HeLa и ЯЭСКРС ДНК, синтезированными in situ. При сопоставимых уровнях включения аналогов dNMP в ДНК ферментами экстракта (рис. 2) суммарный выход продуктов модификации белков определяется типом фотоактивируемого dNMP (рис. 4). Для обоих экстрактов наибольший выход продуктов модификации белков наблюдается для фотоактивируемой ДНК, при синтезе которой FAP-dCTP использовался в качестве аналога dCTP (рис. 4). Для FABC-dCTP, использованного в качестве аналога dCTP при сопоставимом с FAP-dCTP уровне включения в ДНК (рис. 2), выход продуктов модификации белков оказался в 2.5-3 раза ниже (рис. 4).

Таким образом, наиболее перспективным для исследований в клеточных экстрактах, как и в реконструированной системе, является вновь синтезированный аналог РАР-с1СТР, обеспечивающий максимальные выходы продуктов модификации белков из всех исследованных до сих пор аналогов ёСТР.

а)

100 кДа -66 кДа -

б)

1 2 3 4 5 6

ЕЕЕЕЕЕ

I im

В)

ЕЕЕЕЕЕ |р6р II1P1

, г,

¿Г ¿f

Рис. 4. Модификация белков ЯЭСКРС (а, в) и экстракта клеток HeLa (б, г) фотоактивируемыми ДНК-дуплексами с выступающей матричной цепью, полученными in situ

а), б) Состав реакционных смесей см. в подписи к рис. 2. После окончания реакции синтеза реакционные смеси облучали 15 мин при 0°С УФ-светом лампы ДРШ-120 с использованием светофильтра УФС-6 (длина волны падающего света - 313-365 нм). Продукты реакции разделяли электрофорезом в 10% ПААГ по Леммли. Обозначения аналогов приведены под рисунком. Символы ("С") и ("Т") обозначают в качестве какого из dNTP (dCTP или dTTP) был использован аналог в данной реакционной смеси.

Эффективность модификации белков экстрактов ЯЭСКРС (в) и HeLa (г) фотоактивируемыми ДНК, полученными in situ. Эффективность модификации белков - суммарная радиоактивность в дорожке, соответствующая продуктам модификации белков. На гистограмме представлены данные трех независимых определений. Ошибка не превышала 20%.

1.2. Фотоаффипная модификация в исследовании системы эксцизионной репарации оснований в экстрактах клеток человека

В предшествующих работах лаборатории для исследования белковых компонентов ЭРО были использованы экстракты эмбриональных фибробластов мыши и ЯЭСКРС [Lavrik et al., 2001, Лебедева с соавт., 2003]. В рамках данной работы фотоаффинная модификация впервые использована для изучения белков системы ЭРО в экстрактах клеток человека. Фотоактивируемые ДНК-интермедиаты ЭРО были получены с использованием FAP-dCTP in situ или предварительно синтезированы с помощью Pol р. Фотоактивируемая ДНК с выступающей матричной цепью не является ДНК-интермедиатом ЭРО и использована в качестве ДНК-структуры, которая применялась ранее при характеризации аналогов dNTP.

Спектр модифицируемых белков экстракта клеток HeLa определяется типом ДНК-дуплекса (рис. 5 а) и обусловлен специфичностью узнавания структуры ДНК белками. Для ДНК-дуплексов с одноцепочечным разрывом, в которых олигонуклеотид, фланкирующий разрыв, содержит на 5'-конце фосфатную или гидроксильную группы, спектры модифицируемых белков, различаются незначительно. Для этих ДНК-дуплексов характерно образование двух основных продуктов модификации pi и р2 с кажущимися молекулярными массами около 90 кДа и 80 кДа соответственно. Для ДНК-дуплекса с выступающей матричной цепью характерно преимущественное образование продукта р2. Следует отметить, что ни в ЯЭСКРС, ни в экстракте эмбриональных фибробластов мыши продукты модификации белков с такой кажущейся молекулярной массой не были зарегистрированы [Лебедева с соавт., 2003, Lavrik et al., 2001]. Это позволяет предположить, что модифицируемые белки либо специфичны для клеток человека, либо представлены в них большим числом копий, что обуславливает высокий выход продуктов сшивки с фотоактивируемыми ДНК. Более высокомолекулярный продукт с кажущейся молекулярной массой около 120 кДа, по-видимому, относится к поли(АБР-рибозо)полимеразе 1 (PARP1) (рис. 56). Интенсивность этого продукта увеличивается при добавлении экзогенной PARP1. Присутствие экзогенной PARP1 уменьшает количество продуктов модификации с низкими молекулярными массами и не влияет на выход продуктов pi и р2, что указывает на эффективное связывание соответствующих белков с ДНК.

Суммарный выход продуктов модификации белков выше для ДНК-дуплексов с одноцепочечными разрывами, чем с выступающей матричной цепью. Это может быть обусловлено как различием в уровнях превращения исходных ДНК в фотоактивируемые (рис. 3), так и различием в эффективности взаимодействия белков с ДНК для разных ДНК-дуплексов. Чтобы различить эти возможности, проведена модификация

белков предсинтезированными фотореакционноспособными ДНК (рис. 5в), в которых независимо от структуры ДНК инициирующий праймер полностью элонгирован фотоактивируемым FAP-dCMP. Наибольший выход продуктов модификации белков наблюдается для ДНК с выступающей матричной цепью. Следовательно, более низкие выходы продуктов фотоаффинной модификации белков экстракта для такой ДНК, синтезированной in situ, обусловлены менее эффективным превращением исходной ДНК в фотоактивируемую по сравнению с ДНК, содержащими бреши (см. рис. 3).

а)

б)

100 кЛя-66 кДя -

в)

100 кД» —

— PARPI

- pi — р2

— PARP1 Pi

— р2

Рис. 5. Модификация белков экстракта клеток HeLa предсинтезированными (в) и синтезированными in situ (а, 6) фотоактивируемыми ДНК-дуплексами

Условия модификации белков и анализа продуктов реакции см. в подписи к рис. 4. Панель б, дорожка 2 - реакционная смесь дополнительно содержала поли-(АОР-рибозо)полимеразу 1 (PARP1) (60 нМ).

Схематические обозначения использованных ДНК-дуплексов приведены на рисунке, «й - остаток FAP-dCMP.

Поскольку при фотоаффинной модификации белков ДНК, имитирующими интермедиа™ эксцизионной репарации оснований, в экстракте клеток человека были обнаружены специфические продукты сшивок, которые не регистрировались в экстрактах клеток Mus musculus и Bos taurus, представляло интерес идентифицировать эти белки. Для этой цели было исследовано взаимодействие белков с ДНК, содержащей апуриновые/апиримидиновые сайты (АР-сайты). АР-сайты, репарируются системой ЭРО и представляют собой более ранние интермедиа™ этого процесса по сравнению с разрывами [Schàrer, 2003].

2. Исследование взаимодействия белков клеточных экстрактов с ДНК, содержащими АР-сайты

АР-сайты являются наиболее часто встречающимися повреждениями в ДНК [Lindahl, 1993]. Они появляются в результате спонтанного или катализируемого ДНК-гликозилазами гидролиза N-гликозидной связи между азотистым основанием и дезоксирибозой в ДНК [Lindahl, 1972]. Нерепарированные АР-сайты цитотоксичны и мутагенны [Loeb, 1985]. Это обуславливает интерес к идентификации белков, взаимодействующих с АР-сайтами, и, возможно, участвующих в регуляции их репарации.

Остатки дезоксирибозы в АР-сайтах находятся в равновесии между циклической фуранозной и ациклической альдегидной формами. Альдегидная форма может реагировать с первичными аминогруппами белков, образуя основания Шиффа. Образование основания Шиффа -обратимый процесс, однако связь белка с ДНК можно стабилизировать за счет восстановления боргидридом натрия [Левина с соавт., 1980], что позволяет использовать АР-ДНК в качестве химически активной ДНК. 2.1. Поиск и идентификация белков клеток человека, взаимодействующих с АР-сайтами с формированием основания Шиффа

Для поиска белков человека, способных к формированию ковалентных аддуктов с АР-сайтами, был использован ДНК-дуплекс (32 н.п.), содержащий АР-сайт в средине радиоактивно меченой цепи. В цельноклеточных экстрактах нескольких культивируемых линий клеток человека основные продукты сшивки белков с АР-ДНК имеют одинаковую электрофоретическую подвижность. Кажущаяся молекулярная масса этих продуктов, оцененная по электрофоретической подвижности, соответствует приблизительно 95 кДа (рис. 6, дор. 1). Следует отметить, что кажущаяся молекулярная масса продуктов сшивки белка с ДНК приблизительно соответствует сумме их масс.

Рис. 6. Поиск белков экстракта клеток HeLa, взаимодействующих с АР-ДНК

Реакционные смеси содержали 0.1 мкМ 5'-[32Р] ДНК, белки экстракта HeLa (1.4 мг/мл) и стандартные компоненты: 50 мМ Tris-HCI, рН 8.0, 50 мМ NaCI, 10 мМ ЭДТА, 5% глицерин, 0.025% NP-40, 0.25 мМ ДТТ и ингибиторы протеаз. Время инкубации 10 мин при 37 °С. По окончании реакции добавляли 20 мМ NaBH4 (где указано) и инкубировали 30 мин при 0°С. Продукты реакции разделяли электрофорезом в 10% ПААГ по Леммли: дор. 1 - инкубация белков с АР-ДНК; дор. 2 - то же, но без обработки NaBH4; дор. 3 - инкубация белков с ДНК, содержащей аналог АР-сайта - остаток THF. Схематическое обозначение использованных ДНК-дуплексов приведено на рисунке. О - АР-сайт.

При замене в структуре ДНК АР-сайта на его аналог - остаток З-гидрокси-2-гидроксиметилтетрагидрофурана (THF) - (рис. 6, дор. 3) или

без обработки NaBH4 (рис. 6, дор. 2) продукты сшивки ДНК-белок не регистрируются.

Ни один из белков, для которых было достоверно установлено взаимодействие с AP-сайтами с образованием основания Шиффа, не обладает подходящей молекулярной массой, чтобы формировать указанные продукты. Для идентификации белка использовали несколько подходов. Аффинная модификация белков экстракта клеток HeLa фотоактивируемыми ДНК, имитирующими ДНК-интермедиаты более поздних стадий ЭРО, выявила продукты сшивки с белками с кажущимися молекулярными массами около 92 и 80 кДа (рис. 5). С учетом набора и кажущихся молекулярных масс продуктов сшивки белков с АР-ДНК и фотоактивируемыми ДНК, а также длины присоединяемого к белку олигонуклеотида (16 и 32 нт. для фотоактивируемой ДНК и АР-ДНК соответственно), было предположено, что возможным кандидатом является Ku-антиген (Ки).

Ки-антиген - эукариотический гетеродимерный ДНК-связывающий комплекс, состоящий из субъединиц с молекулярными массами около 70 кДа (Ки70) и 83 кДа (Ки80). Его основная функция связана с репарацией двухцепоченых разрывов ДНК путем негомологичного соединения концов. Ku-антиген, вместе с каталитической субъединицей ДНК-зависимой протеинкиназы (ДНК-ПКкс), входит в состав ДНК-зависимой протеинкиназы (ДНК-ПК) [Downs¿Jackson, 2004].

При сравнительном анализе сшивок белок-ДНК (фотоактивируемой и АР-), образовавшихся при использовании экстракта клеток HeLa и ДНК-ПК (в состав которой входит Ku-антиген), выделенной из тех же клеток, выявлены продукты с совпадающей электрофоретической подвижностью (рис. 7а). Следует отметить, что АР-ДНК проявляет большую селективность, чем фотоактивируемая ДНК, образуя сшивки с меньшим числом белков.

Дополнительно белок идентифицирован методом

иммунопреципитации, как описано в [Lavrik et al, 2001], с использованием анти-Ки80 антител (рис. 76).

И, наконец, природа белка в составе ковалентного аддукта с АР-ДНК установлена методом пептидного картирования на основе данных матричной лазерной десорбционной времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOF-MS) (см. схему на рис. 7в). Белок идентифицирован как Ки80-полипептид (Mowse score 115, coverage 15%).

Таким образом, тремя независимыми подходами было показано, что основной продукт ковалентного присоединения АР-ДНК к белкам экстракта клеток человека относится к Ки80-субъединице Ки-антигена.

а)

ДНК-ПКкс —-

Ки80 — Ки70 —

б)

Ки80 —

— 100 кД»

В)

100 кДа 66 кДа

— 45 кДа

Опосредованная боргидридом сшивка белков клеточного экстракта с ДНК. содержащей АР-сайгы и остатки биотина

Выделение сшитых с ДНК белков на сорбенте со стрелтавидином и дополнительная очистка электрофорезом в ПААГ

И?3

Поиск белка в базе данных на основе результатов масс-спектрометрии

Трипсинолнз в геле белка, сшитого с ДНК. MAl.OI-TOF.MS анализ полученных пептидов

.. щ

Рис. 7. Идентификация белка экстракта клеток Не[_а, образующего сшивки с АР-ДНК

а) Сравнение продуктов сшивки полипептидов в экстракте клеток Н91_а и препарате ДНК-ПК с АР-(дор. 1 и 2) и фотоактивируемой ДНК (дор. 3 и 4). Реакционные смеси содержали 0.1 мкМ 5'-[32Р] ДНК, белки экстракта (1.4 мг/мл) (дор. 1 и 3) или ДНК-ПК (0.1 мкМ) (дор. 2 и 4) и стандартные компоненты (см. рис. 6). Условия проведения реакции см. в подписи к рис. 4 для фотоактивируемой ДНК или к рис. 6 для АР-ДНК. Под радиоавтографом приведено схематическое обозначение использованных ДНК-дуплексов; б) Идентификация белка методом иммунопреципитации с использованием антител против Ки80. Состав реакционных смесей и условия проведения реакции см. в подписи к рис. 6. Дор. 1 -аликвота реакционной смеси, дор. 2 и 3 - анализ продуктов, адсорбированных на протеин в-сефарозе в присутствии преимунной сыворотки или анти-Ки80 антител соответственно; в) Схема идентификации белков в составе ковалентных аддуктов с АР-ДНК с использованием масс-спектрометрии.

2.2. Функциональные аспекты взаимодействия Ки с АР-ДНК

Ки наиболее эффективно связывается с двухцепочечными концами ДНК; кроме того, он способен взаимодействовать с одноцепочечными разрывами, брешами, «пузырями» [Эомпз^аекзоп, 2004]. Однако взаимодействие Ки с АР-сайтами в литературе ранее не описано. АР-сайты репарируются системой ЭРО [Бскагег, 2003], поэтому взаимодействие Ки, который не относится к белкам этой системе, с ДНК-интермедиатами ЭРО неожиданно. В связи с этим возникают вопросы о специфичности и биологической значимости взаимодействия Ки80 с АР-ДНК.

Некоторые характеристики взаимодействия Ки-антигена с АР-ДНК были исследованы с использованием клеточных экстрактов и ДНК-ПК. Данные по влиянию конкурентных ДНК на эффективность модификации Ки-антигена экстракта АР-ДНК (рис. 8а) свидетельствуют о специфичности взаимодействия Ки с АР-сайтами, поскольку ДНК, содержащая аналог

АР-сайта (остаток THF), снижает пришивку АР-ДНК к Ки80 в значительно большей степени, чем обычный ДНК-дуплекс.

Следует отметить, что аффинная модификация в присутствии конкурентных ДНК позволяет продемонстрировать специфичность взаимодействия исследуемого белка с определенным типом ДНК, даже если белок не выделен в индивидуальном состоянии. Более того, избирательность взаимодействия Ки с АР-сайт-содержащей ДНК удалось зарегистрировать даже, несмотря на высокое сродство этого белка к двухцепочечным концам.

Формирование белком основания Шиффа с дезоксирибозой АР-сайта часто вовлечено в процесс каталитического расщепления АР-сайтов [Scharer, 2003]. Для выяснения возможных каталитических функций Ku-антигена представляло интерес определить способность белка к расщеплению АР-сайтов. При использовании ДНК-ПК как источника Ku-антигена и ДНК-дуплекса, содержащего АР-сайт в середине цепи, расщепления АР-сайта не обнаружено (данные не проиллюстрированы). Однако позже другой группой исследователей было установлено, что Ки-антиген проявляет АР- и dRP-лиазные активности в отношении АР-сайтов и 5'-ёКР-остатков, расположенных в непосредственной близости от двухцепочечного разрыва ДНК [Roberts et al., 2010]. По-видимому, для адекватного проявления лиазной активности необходима точная ориентация АР-сайта и 5'-dRP остатка относительно определенных лизинов. Для Ku-антигена характерно ориентированное связывание с ДНК [Yoo et al., 1999]. При связывании Ku-антигена с двухцепочечными концами ДНК Ки70-субъединица расположена ближе к концу ДНК, а Ки80 смещена вглубь ДНК. Для использованной в настоящей работе АР-ДНК, по-видимому, не достигалась продуктивная ориентация субстрата.

Образование оснований Шиффа с АР-сайтами потенциально может быть вовлечено в их временную защиту или регуляцию репарации. Такой механизм был предложен для монофункциональной ДНК-гликозилазы MutY, формирующей с АР-сайтами значительно более стабильные комплексы, чем бифункциональные ДНК-гликозилазы [Zharkov&Grollman, 1998]. С учетом возможности существования такого механизма, оценено время жизни комплексов Ки*АР-ДНК и за 4 часа не обнаружено их значимого распада (рис. 86). Возможно, Ки, участвует во временной защите АР-сайтов.

а)

Конкурентная ДНК

Ки80 —

s 1

Sis i S | 0.8

5 I | 0.6

Ш"

of 2 0.2

Соотношение конкурентная ДНК/ АР-ДНК

*-----

■ 100 кДа

■ 66 кДа

0 0.5 1 2 0.5 1 2

б)

Конкурентная ДНК

Ки80 —

I 5 1

j 2 s 3 | | 0.6

1 § А м

¡■e-t

5 11e-2

— 100 кДя

Время, мин 0 1 5 30 60 120 240

ДНК-проба:

Рис. 8. Характеристики взаимодействия Ku-антигена с АР-ДНК: специфичность (а) и стабильность комплексов (б)

Белки экстракта (1.4 мг/мл) инкубировали с 5'-[32Р] АР-ДНК (0.1 мкМ) а) в присутствии (дор. 2-7) или отсутствие (дор. 1) конкурентных ДНК б) после предварительной инкубации добавляли конкурентную ДНК, содержащую остаток THF (0.5 мкМ) (дор. 2-7) и продолжали инкубацию при 37°С; через определенные промежутки времени отбирали аликвоты. Остальное аналогично подписи к рис. 6. Относительную эффективность рассчитывали как отношение уровней модификации белка в пробе, содержащей конкурентную ДНК, и контрольном образце без конкурентных ДНК.

Типы использованных ДНК-пробы и конкурентных ДНК схематично изображены на рисунке.

Поскольку АР-эндонуклеаза l (АРЕ1) - это основной фермент ЭРО высших эукариот, гидролизующий АР-сайты [Wilson&Barsky, 2001), было оценено влияние Ku-антигена (составе ДНК-ПК) на активность АРЕ1 (рис. 9). ДНК-ПК при эквимолярной концентрации по отношению к ДНК значительно ингибирует гидролиз АР-сайтов, что указывает на возможную функциональную значимость взаимодействия Ku-антигена с АР-сайтами.

Принимая во внимание способность Ки взаимодействовать с АР-сайтами через формирование оснований Шиффа, было предположено, что Ки может принимать участие в регуляции репарации АР-сайтов в составе кластерных повреждений, для которых такая регуляция особенно важна. Кластерные повреждения включают близко расположенные окисленные основания, АР-сайты, одноцепочечные разрывы или их сочетания, расположенные в одной или обеих цепях ДНК. При неправильной регуляции репарации кластерных повреждений могут возникать более токсичные для клеток двухцепочечные разрывы [Gulston et ai, 2004]. При образовании двухцепочечных разрывов под действием ДНК-повреждающих агентов на концах ДНК могут содержаться выступающие одноцепочечные участки, влияющие на сродство Ku-антигена к ДНК.

Рис. 9. Влияние ДНК-ПК на активность АРЕ1

а) Реакционные смеси содержали 5'-[32Р] АР-ДНК (0.1 мкМ), АРЕ1 (1 нМ), ДНК-ПК (0.1 мкМ), 50 мМ Tris-HCI, рН 8.0, 50 мМ NaCI, 10 мМ MgCI2, 1 мМ ДТТ, 0.1 мг/мл BSA. Смесь инкубировали при 37°С, через указанные интервалы времени отбирали аликвоты, к которым, добавляли 20 мМ ЭДТА, 20 мМ NaBH4 и инкубировали 30 мин при 0°С. Продукты реакции разделяли электрофорезом в 20% ПААГ в присутствии 7 M мочевины; б) Степень гидролиза АР-сайтов АР-эндонукпеазой 1.

На рис. 10 для набора АР-ДНК с различной структурой представлены результаты анализа их сшивки с белками экстракта клеток HeLa и данные определения целостности АР-сайт-содержащих олигонуклеотидов при инкубации в присутствии и в отсутствие ионов магния.

Характер и уровни расщепления олигонуклеотидов зависят от присутствия Mg2+ и структуры ДНК-пробы. В присутствии ионов Mg2+ (рис. 106, дор. 8-14) эффективность расщепления АР-сайтов выше, чем без них (рис. 106, дор. 1-7). Это связано со специфичностью и эффективностью действия ферментов экстрактов, принимающих участие в процессинге ДНК. Гидролиз АР-сайтов АР-эндонуклеазами экстракта, происходящий в присутствии ионов Mg2+, приводит к «инактивации» АР-ДНК-зондов, что, в свою очередь, снижает эффективность модификации белков экстракта. Кроме того, необходимо учитывать и влияние структуры АР-ДНК на скорость гидролиза АР-сайтов. Так, например, АР-ДНК 1 практически полностью гидролизуется уже за 30 с, тогда как реакция образования основания Шиффа между Ки80 и АР-ДНК1 выходит на плато примерно за 10 мин (определено в отсутствие Mg2+). АР-сайты в ДНК с дополнительными повреждениями гидролизуются с меньшей скоростью и «инактивация» этих ДНК-проб в меньшей степени влияет на картину модификации белков экстрактов. Известно, что для взаимодействия Ки с ДНК ионы магния не требуются [Chiu et al., 2001]. Учитывая перечисленные факты, можно предположить, что уровень пришивки конкретной ДНК к Ки в отсутствие ионов магния более адекватно характеризует сродство Ки к этой ДНК.

Эффективность модификации и спектры модифицируемых АР-ДНК клеточных белков при отсутствии ионов магния зависят от структуры использованной ДНК-пробы (рис. 10в, дор. 1-7). Выход продуктов

модификации конкретного белка в клеточных экстрактах зависит от нескольких параметров: концентрации комплекса исследуемого белка с ДНК, которая определяется концентрацией белка в экстракте, сродством белка к ДНК-пробе и конкуренцией других белков за ДНК. Если рассматривать уже сформированные нековалентные комплексы белок«реакционноспособная ДНК, то значительную роль в определении выхода продуктов модификации может играть взаимная ориентация реагирующих групп белка и ДНК, которая может различаться в комплексах белка с различными АР-ДНК.

а)

в)

■ 32 нт

15 нт

I 9 10 П 12 и 14

щ ■■* -

- гг-в*-

** т

£ 2 5 5 2 £ 5 2 5 2 2 2 2

? 7 ^ ? ? ? ^ ? ^

— 11)0 кДя - 66 кДа

<<<<<.< <<

< < < << < <

< < < ■

Рис. 10. Взаимодействие белков экстракта Не1-а с АР-ДНК, содержащими дополнительные повреждения

а) Схематическое изображение использованных АР-ДНК; б, в) Состав реакционных смесей и условия проведения реакции см. в подписи к рис. 6. Продукты реакции разделяли электрофорезом в 20% ПААГ в присутствии 7 М мочевины (б) и в 10% ПААГ по Леммли (в). Тип использованной АР-ДНК указан на рисунке.

Все АР-ДНК, кроме АР-ДНК7, имеют, по крайней мере, один "тупой" двухцепочечный конец, который необходим Ки для эффективного связывания с ДНК. Среди АР-ДНК, имеющих "тупой" двухцепочечный конец, наименьший выход продуктов модификации Ки80 характерен для АР-ДНК4. Это может быть обусловлено конкуренцией Ки и других белков за ДНК. Действительно, эта ДНК образует более низкомолекулярные продукты модификации (рис. 10в, дор. 4). Кроме того, другие белки, которые взаимодействуют с 5'-выступающей частью, но не способны формировать основания Шиффа, могут влиять на выход продуктов модификации Ки. Для АР-ДНК7, у которой с каждой стороны имеется одноцепочечный участок по 8 нт., продукт, относящийся к Ки80, является минорным. Кроме того, появляются два новых продукта - более высокомолекулярный и низкомолекулярный. Низкомолекулярный продукт имеет такую же электрофоретическую подвижность, что и низкомолекулярный продукт для АР-ДНК4 (рис. 10в, дор. 7 и 4 соответственно).

Исходя из анализа данных литературных источников, нельзя однозначно решить вопрос о влиянии длины свисающих одноцепочечных участков в АР-ДНК7 на образование комплексов с Ки-антигеном. С одной стороны известно, что 3'- и 5'-выступающие одноцепочечные участки на концах ДНК-дуплексов длиной в несколько нуклеотидов не влияют на сродство Ки-антигена к ДНК [ОомтМаскхоп, 2004]. С другой стороны, показано, что Ки связывает менее эффективно ДНК-дуплексы с длинными 5'-выступающими одноцепочечными участками, чем с "тупыми" концами \Falzon е? а/., 1993].

Из-за отсутствия Ки-антигена в индивидуальном состоянии невозможно напрямую оценить сродство этого белка к различным АР-ДНК. Для выяснения факторов, обусловливающих различия в эффективности модификации Ки80 АР-ДНК, несущими дополнительные повреждения, проведена фотоаффинная модификация белков экстракта клеток НеЬа с использованием набора ДНК, в которых вместо АР-сайта находился РАР-с1СМР (данные не проиллюстрированы). В отличие от АР-ДНК, присоединяющихся только к Ки80-субъединице, фотоактивируемые ДНК модифицируют обе субъединицы Ки-антигена. Для ДНК, не содержащей дополнительных повреждений, характерен более высокий уровень сшивки с Ки70, чем с Ки80. Введение любого повреждения в ДНК приводит к перераспределению сшивок в пользу Ки80. Изменение структуры фотоактивируемых ДНК незначительно влияет на суммарный уровень модификации обеих субъединиц Ки-антигена; максимальная разница не превышает 20%. Это указывает на сопоставимую эффективность образования комплексов Ки-антигена со всеми ДНК. Однако если уровни пришивки к Ки-антигену фотоактивируемой ДНК, у которой с каждой стороны имеется одноцепочечный участок по 8 нт., и других фотоактивируемых ДНК сопоставимы, то для АР-ДНК7 с аналогичной структурой концов выход продуктов сшивки значительно ниже, чем для других АР-ДНК (рис. 10в).

Таким образом, исходя из совокупности данных аффинной модификации Ки-антигена фотоактивируемыми и АР-сайт-содержащими ДНК различной структуры, можно предположить, что изменения взаимной ориентации реагирующих групп белка и ДНК при переходе от одной АР-ДНК к другой, в значительной степени определяют эффективность формирования оснований Шиффа.

2.3. Использование АР-ДНК для определения содержания Ки80 в экстрактах клеток

Поскольку пришивка АР-ДНК к Ки80 (см. рис. 6) в экстрактах происходит с высокой селективностью и эффективностью, этот подход потенциально может быть использован для оценки содержания активных в

связывании ДНК форм Ки-антигена в экстрактах клеток в присутствии других клеточных белков. Сравнительный анализ содержания Ки80 в экстрактах клеток нескольких культивируемых линий меланом и НеЬа, проведенный с использованием с)о1-Е1Л8А и АР-ДНК, показал, что количество ковалентных аддуктов Ки80 с АР-ДНК варьирует в значительных пределах и, в целом, положительно коррелирует с содержанием этого белка, оцененным иммуноферментным окрашиванием (рис. 11а).

а)

в)

dot-ELISA lili АР-ДНК

100 кДа—

г* s i

t 2 3 4 5fr

. АР-ДНК'Ки-КиНОАТ — АР-ДНК'Ки _ АР-ДИК'Ки(у) ___

— < пополняя ЛР.ДНК .

Рис. 11 Оценка относительного количества активной формы Ки80 в экстрактах клеток человека. Идентификация укороченной формы Ки80

а) Сравнительный анализ содержания Ku-антигена в экстрактах клеток меланом. АР-ДНК: Реакционные смеси содержали 20 нМ 5'-[згР] АР-ДНК, белки экстрактов (0.1 мг/мл). Остальные условия см. в подписи к рис. 6. Для dot-ELISA анализа были использованы моноклональные анти-Ки80 антитела против С-концевого участка и 0.4 мкг белков клеточного экстракта. Количество Ku80 в dot-ELISA анализе оценивали по интенсивности иммунохимического окрашивания, а при анализе с использованием АР-ДНК рассчитывали как долю АР-ДНК, сшитой с Ku80. Для экстрактов клеток меланом определяли относительное количество Ku80, нормируя значения на соответствующую величину для экстракта клеток HeLa; б) Идентификация укороченной формы по изменению электрофоретической подвижности комплекса Ки-антиген«АР-ДНК в присутствии антител, специфичных к С- или N-концу Ки80. После предварительной инкубации при 37°С в течение 10 мин 5'-(32Р] АР-ДНК (20 нМ) с белками экстрактов (0.1 мг/мл) к части реакционных смесей были добавлены определенные анти-Ки80 антитела (дор. 3, 5, 7 (б) или дор. 2, 4, 6 (в)). Анализ проводили в 8% ПААГ в нативных условиях. Тип использованного экстракта и антител указан на рисунке.

В некоторых образцах обнаружен интенсивный продукт сшивки с меньшей кажущейся молекулярной массой (рис. Па, дор. 6 и 7). Согласно литературным данным в некоторых культивируемых клетках человека представлена укороченная с С-конца форма Ku80 (Ku80v), возникающая под действием трипсиноподобной протеазы, существующей в этих клетках и активирующейся в определенных условиях [Sallmyr et al., 2002, Jeng et al., 1999]. Соответствующая Ku80v мРНК не обнаружена [Han et al, 1996, Muller et al., 1998]. Ku80v образует гетеродимеры с Ku70, сохраняющие активность в связывании ДНК, но не взаимодействующие с ДНК-ПКкс, что уменьшает негомологичное соединение концов и приводит к увеличению радиочувствительности клеток [Hau et al, 1996, Muller et al., 1998].

Образцы 5-7 (выделено малиновым прямоугольником) относятся к одной клеточной линии Mel 051102k, но отличаются по условиям приготовления экстрактов. Экстракт в образце 7 готовили по стандартной методике, а в случае образцов 5 и 6 предпринимали специальные меры для уменьшения вероятности протеолиза Ки80. Дальнейший анализ с использованием антител, специфичных к С- и N-концам Ки80 (рис. 116), позволил отнести указанные продукты к укороченному с С-конца полипептиду Ки80. Для этой клеточной линии, по-видимому, также характерна экспрессия такой специфической протеазы. Таким образом, с использованием АР-ДНК в экстрактах клеток возможна детекция активных в связывании ДНК форм Ku-антигена, в том числе укороченных. В таких сложных случаях адекватность оценки количеств белка с использованием антител будет зависеть от правильности их выбора, а часто применяемая оценка, основанная на определении количества мРНК, может давать искаженные данные.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В представленной работе впервые проведена количественная оценка эффективности синтеза фотоактивируемых ДНК ферментами клеточных экстрактов (в том числе клеток человека) с использованием нескольких аналогов dNTP в качестве субстрата и модификации белков экстрактов полученными in situ фотоактивируемыми ДНК. Как следует из данных анализа, наиболее перспективным для исследований в клеточных экстрактах является вновь синтезированный FAP-dCTP, который обеспечивает максимальные выходы продуктов модификации клеточных белков из всех синтезированных и исследованных до сих пор аналогов dNTP.

При скрининге экстрактов клеток человека с использованием АР-ДНК обнаружена эффективная и селективная модификация одного белка, которая опосредована образованием основания Шиффа. Идентификация белка была осуществлена за счет сочетания аффинной модификации белков АР-сайт-содержащими и фотоактивируемыми ДНК с другими подходами. Для идентификации белка была отработана специальная методика, позволяющая установить природу белка на основе данных масс-спектрометрического анализа пептидов, полученных при гидролизе белка в составе конъюгата с АР-ДНК, образовавшегося в экстракте. Белок идентифицирован как Ки80-субъединица Ku-антигена. Предложенная схема затем была с успехом применена для идентификации еще одного белка взаимодействующего с АР-сайтами - поли (ADP-рибозо)полимеразы 1 [Ходырева с соавт., 2010, Khodyreva et al., 2010]. Этот подход довольно универсален и может применяться для идентификации

различных ДНК-связывающих белков с использованием ДНК, содержащих структурные элементы, специфически узнаваемыми белками.

Впервые обнаруженное взаимодействие Ки80 с АР-сайтами ставит вопрос о биологической значимости таких взаимодействий. Возможно, что ковалентное, но обратимое присоединение белков к АР-ДНК через основание Шиффа, служит для временной защиты АР-сайтов. Временная защита АР-сайтов особенно важна, когда они входят в состав кластерных повреждений, например, близко расположенных в комплементарной цепи разрывов или АР-сайтов, поскольку в результате «попытки» репарации могут образовываться двухцепочечные разрывы, которые более токсичны для клеток [Gulston et al., 2004]. Действительно, в настоящей работе обнаружено, что Ки80 ингибирует гидролиз АР-сайтов АРЕ1. В пользу защитных функций свидетельствует стабильность комплексов Ки-антигена с АР-ДНК. При исследовании взаимодействия ДНК-зависимой протеинкиназы как источника Ku-антигена с ДНК, содержащей АР-сайт на расстоянии 15 нуклеотидных звеньев от концов, расщепления АР-сайтов не обнаружено. Не исключено, что проявление АР-лиазной активности белками зависит от структурных особенностей ДНК. В недавно опубликованной работе [Roberts et al., 2010] показано, что Ku-антиген проявляет слабую АР-лиазную активность, когда АР-сайт расположен непосредственно вблизи двухцепоченых концов. Однако если АР-сайт расположен на расстоянии более одного витка спирали от конца, как и в случае использованных в настоящей работе АР-ДНК, из-за образования непродуктивного комплекса АР-лиазная активность Ku-антигена не проявлялась. В настоящей работе предложен подход для оценки содержания Ku-антигена в клеточном экстракте, основанный на использовании АР-ДНК. Этот способ обладает некоторыми преимуществами по сравнению с применяемыми на данный момент методами оценки содержания Ku-антигена. В отличие от других методов он позволяет оценивать содержание в клеточных экстрактах форм Ku-антигена (в том числе с укороченной Ки80-субъединицей), которые активны в связывании ДНК.

ВЫВОДЫ

1. Охарактеризован вновь синтезированный аналог с!СТР — экзо-М-{2-[Ы-(4-азидо-2,5-дифтор-3-хлорпиридин-6-ил)-3-аминопропионил]-аминоэтил}-2'-дезоксирибоцитидин-5'-трифосфат (РАР-с1СТР) в системах, содержащих ДНК-полимеразу Р или экстракт клеток НеЬа. При сравнительном анализе нового и двух ранее использованных аналогов ёСТР - экзо-№[(4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензилиденаминоокси)-

бутилокси]-2'-дезоксирибоцитидин-5'-трифосфата и экзо-1Ч-[2-(4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензилиденами-нооксиметилкарбамоил)-этил]-2'-дезоксирибоцитидин-5'-трифосфата - установлено, что РАР-с1СТР по эффективности включения в ДНК ДНК-полимеразами не уступает, а по уровню сшивки РАР-сЮМР-содержащих ДНК с белками, значительно превосходит ранее использованные арилазидные производные с!СТР.

2.В экстрактах клеток человека проведен поиск белков, взаимодействующих с апуриновыми/апиримидиновыми (АР-) сайтами с образованием основания Шиффа; методами иммуноферментного и масс-спектрометрического анализа основной белок-мишень АР-ДНК идентифицирован как Ки80-субъединица Ки-антигена.

3. Установлено, что Ки-антиген в экстрактах специфически узнает АР-ДНК и образует с ней долгоживущие ковалентные аддукты; Ки-антиген в составе ДНК-зависимой протеинкиназы не расщепляет ДНК по положению АР-сайта и ингибирует АР-эндонуклеазную активность АР-эндонуклеазы 1 человека.

4. Сравнительный анализ модификации Ки-антигена в экстрактах клеток человека ДНК, содержащими АР-сайт или РАР-сЮМР в середине одной цепи и дополнительные повреждения в противоположной цепи ДНК, показал, что соотношение уровней модификации Ки70 и Ки80-субъединиц фотоактивируемыми ДНК и уровень модификации Ки80-субъединицы АР-ДНК зависят от типа дополнительного повреждения; для АР-ДНК эффективность сшивки, по-видимому, определяется взаимным положением реагирующих групп белка и ДНК.

5. Показано, что АР-ДНК можно применять для оценки относительного содержания Ки-антигена в экстрактах клеток человека и регистрации активных в связывании ДНК форм этого белка.

Основные результаты диссертации опубликованы в работах:

1. Dezhurov S.V., Khodyreva S.N., Plekhanova E.S.. Lavrik O.I. A new highly efficient photoreactive analogue of dCTP. Synthesis, characterization, and application in photoaffinity modification of DNA binding proteins // Bioconjug. Chem. -2005. -V. 16. -P. 215-222.

2. Плеханова E.C.. Солодова Е.И., Пышный Д.В., Пышная И.А., Лаврик О.И., Ходырева С.Н. Взагшодействие белков клеточных экстрактов с химически активными ДНКII Труды международной конференции «Физико-химическая биология». Новосибирск: АРТА. 2006. С. 157-158.

3. Ilina E.S.. Lavrik O.I., Khodyreva S.N. Ku antigen interacts with abasic sites //Biochim. Biophys. Acta-2008.-V. 1784. -P. 1777-1785.

4. Ильина E.C.. Лаврик О.И., Ходырева С.Н. Идентификация Ки80-субъединицы Ки-антигена как белка, взаимодействующего с апуриновыми/апиршшдиновыми сайтами II Докл. Акад. Наук -2009. -Т. 424. -С. 411-414.

5. Ilina E.S.. Khodyreva S.N., Berezhnoy А.Е., Larin S.S., Lavrik O.I. Tracking Ku antigen levels in cell extracts with DNA containing abasic sites // Mutat. Res. -2010. -V. 685. -P. 90-96.

6. Ильина E.C.. Лаврик О.И., Ходырева С.Н. Способ детекции Ки-антигена в экстрактах клеток человека II Патент на изобретение RU № 2384623, приоритет от 07.10.2008.

Подписано к печати 17 февраля 2011г.

Тираж 130 экз. Заказ № 017. Отпечатано "Документ-Сервис", 630090, Новосибирск, Институтская 4/1, тел. 335-66-00

-: /-

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Ильина, Екатерина Сергеевна

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. ОСНОВНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ Ku-АНТИГЕНА.

1.1.1. Структура Ки и функциональные особенности его доменов.^.

1.1.2. Свойства Ku-антигена.

1.1.2.1. Димеризация и функции субъединиц.

1.1.2.2. Взаимодействие с ДНК.

1.2. ФУНКЦИИ Ки.

1.2.1. Репарация двухцепочечных разрывов ДНК.

1.2.2. Роль Ku-антигена в сохранении целостности теломерных участков.

1.2.3. Регуляция транскрипции генов.

1.2.4. АТР-азная и геликазная активности Ки.

1.2.5. Участие Ки в антиапоптотических процессах.

1.2.6. Роль мембранной формы Ки.

1.2.6.1. Влияние мембранной формы Ku-антигена на адгезию и инвазию клеток.

1.2.6.2. Роль Ku-антигена в проникновении Rickettsia conorii и парвовируса В19 в клетки человека.

1.3. РОЛЬ Ки В КАНЦЕРОГЕНЕЗЕ.

1.3.1. Роль различных форм Ки.

1.3.2. Мутации Ки, приводящие к злокачественной трансформации клеток.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Химически активные ДНК в исследовании белков репарации ДНК: идентификация Ku-антигена как белка, взаимодействующего с апуриновыми/апиримидиновыми сайтами"

ДНК каждой, клетки подвергается действию разнообразных эндогенных и экзогенных факторов^ вызывающих в ней различные повреждения. Повреждение ДНК. может провоцировать гибель клеток, их злокачественную трансформацию или вызывать мутации. Для* предотвращения таких последствий клетки располагают несколькими специализированными системами репарации ДНК с частично перекрывающимися функциями. Системы репарации ДНК различаются используемыми субстратами, механизмами и ансамблями белков. Эксцизионная репарация оснований^ (ЭРО) является одной из основных и наиболее важных систем репарации ДНК, поскольку ее действия направлены на исправление наиболее многочисленных повреждении, вызываемых эндогенными и экзогенными факторами, которые включают ионизирующее излучение, активные формы кислорода и некоторые противоопухолевые препараты [1]. В целом; для процесса ЭРО нехарактерно существование стабильного белкового ансамбля неизменного состава, который бы полностью проводил устранения повреждения-в ДНК. В ансамбле по мере протекания, репарации один из ферментов (факторов) заменяется белком, необходимым для следующей стадии процесса. Такой принцип организации процесса вносит ограничения в исследование- структурной организации репарационного ансамбля рентгеноструктурным анализом или другими физико-химическими методами.

Для изучения таких динамичных надмолекулярных ансамблей развиваются и широко используются методы направленной химической модификации. В качестве продуктивного метода исследования белок-нуклеиновых ' и белок-белковых взаимодействий может применяться аффинная модификация, несомненным достоинством которой является способность регистрировать даже относительно непрочные комплексы. - Этот метод базируется на формировании специфического нековалентного комплекса между мишенью (белок, нуклеиновая кислота) и реагентом (реакционноспособным аналогом биополимера или лиганда) с последующим образованием ковалентной связи между реагентом и связывающим ее центром мишени. Одним из параметров аффинной модификации является ее эффективность, под которой в данной работе понимается уровень образования ковалентных аддуктов аффинный реагент-биополимер.

В арсенале химически активных аффинных реагентов для исследования белокнуклеиновых взаимодействий значительное место принадлежит аналогам ДНК на основе ароматических азидов [2]. При активации УФ-светом арилазидной группы 6 генерируются высоко реакционноспособные частицы, которые могут атаковать t ближайшие атомы с образованием ковалентной- связи между контактирующими частями биополимеров. Такой метод называется фотоаффинной модификацией. Последующий анализ образовавшихся продуктов "фотосшивки" белок-ДНК позволяет получать информацию о структурной организации белково-нуклеиновых комплексов.

Ранее были синтезированы и охарактеризованы аналоги dNTP, содержащие фотоактивируемые группы, присоединенные по экзоциклической аминогруппе цитозина [3, 4]. Для этих аналогов были определены субстратные характеристики и/или проведена количественная оценка эффективности модификации ДНК-полимераз и ДНК в комплексе с ДНК-полимеразами, в модельных системах, состоящих из очищенных белков [4-8]. Фотоаффинной модификацией в сочетании с иммунохимическими методами при использовании ДНК-интермедиата длиннозаплаточного пути эксцизионной репарации оснований, полученного in situ при включении в ДНК фотоактивируемого аналога dCTP, в экстракте эмбриональных фибробластов мыши были выявлены белки, специфично взаимодействующие с такими ДНК [9]. Из тысяч белков, присутствующих в клетке, модификации подвергались только 6 белков. Среди них были идентифицированы известные участники этого процесса: ДНК-полимераза р (Роф), флэпэндонуклеаза 1 (FEN1) и апуриновая/апиримидиновая. эндонуклеаза 1 (АРЕ1), а также поли(АБР-рибозо)полимераза 1 (PARP1), участие которой в этом процессе не считалось достоверно установленным. Наиболее перспективным направлением развития фотоаффинной модификации является ее использование в сочетании с масс-спектрометрией при поиске и идентификации новых белков-участников процессов репарации ДНК. Несмотря на высокую чувствительность современных масс-спектрометрических методов для идентификации белков в составе ковалентных аддуктов с ДНК, требуются достаточно высокие количества таких продуктов, поэтому повышение эффективности пришивки ДНК к белкам остается актуальной задачей, и одно из возможных решений — создание новых фотоактивируемых производных dNTP.

Несмотря на достаточно широкое применение в исследованиях фотоактивируемых ДНК,( синтезированных непосредственно в экстрактах, эффективность включения аналогов dNTP в ДНК ДНК-полимеразами клеточных экстрактов и влияние этого параметра на модификацию белков экстрактов фотоактивируемыми ДНК количественно не была оценена. Следует отметить, что эффективность включения фотоактивируемых dNMP в состав ДНК в экстрактах может модулироваться присутствием белковых факторов, вклад которых не всегда можно учесть в системе, реконструированной из очищенных белков. В частности, модифицированные аналоги могут выщепляться за счет корректирующей активности ДНК-полимераз и/или специализированных экзонуклеаз. В связи с этим при характеризации аналогов dNTP, наилучшим является сравнение эффективности синтеза фотоактивируемых ДНК в клеточном экстракте, где присутствуют те же белки и в том же соотношении, что и в клетке. Это является принципиальным отличием экстрактов от реконструированных систем, где состав и соотношения белков задаются исследователем.

В качестве альтернативной химически активной группы, обеспечивающей образование ковалентных аддуктов нуклеиновых кислот с белками, могут использоваться апуриновые/апиримидиновые сайты (AP-сайты). Остатки дезоксирибозы в AP-сайтах находятся в равновесии циклической фуранозной и ациклической альдегидной форм. Благодаря присутствию альдегидных групп АР-ДНК реагируют с первичными аминогруппами белков, образуя основания Шиффа. Образование основания Шиффа- обратимый процесс, однако связь белка с ДНК можно стабилизировать восстановлением боргидридом натрия [10-12]. Такой метод называется боргидридным треппингом. AP-сайты в качестве «сшивающей» группы обладают существенным преимуществом по сравнению с фотоактивируемыми группами - они являются интермедиатами в процессе ЭРО, т.е. одновременно играют роль «повреждения» в ДНК и химически активной функции «нулевой» длины.

AP-сайты - один из наиболее часто встречающихся типов нарушений в структуре ДНК; они возникают в клетках млекопитающих с частотой 104 случаев в сутки из-за спонтанного или катализируемого ДНК-гликозилазами гидролиза jV-гликозидной связи между дезоксирибозой и основанием в эксцизионной репарации оснований ДНК [13]. Нерепарированные AP-сайты цитотоксичны и мутагенны [14], поэтому является важным идентифицировать белки, взаимодействующие с ними и, возможно, участвующие в регуляции их репарации.

Формирование основания Шиффа в процессе катализа характерно для некоторых ферментов ЭРО [1, 15-18]. В частности, некоторые бифункциональные ДНК-гликозилазы, помимо гидролиза JV-гликозидной связи, обладают лиазной активностью и расщепляют сахарофосфатный остов ДНК по механизму ß-элиминирования. При функционировании таких гликозилаз образуется два типа продуктов, способных формировать основание Шиффа: дуплекс, содержащий AP-сайт, и ДНК с одноцепочечным разрывом, содержащим 4-гидроксипентен-2-аль с 3'-стороны и фосфатную группу с 5'-стороны [15, 18]. При гидролизе AP-сайта АР-эндонуклеазой 1 образуется разрыв цепи ДНК, с гидроксильной группой на 3'-конце и дезоксирибозофосфатной группой на 5'-конце (5'-dRP). В короткозаплаточном пути ЭРО 5'-dRP-0CTaT0K удаляется лиазной активностью Polß, и этот процесс также происходит с формированием основания Шиффа [19].

Формирование ковалентных сшивок белок-ДНК, опосредованных образованием основания Шиффа, широко используется исследователями при изучении механизмов * действия ферментов< [17]. Образование таких сшивок не означает, что белок обладает лиазной активностью, требуется дополнительное подтверждение механизма. Так, например, MutY, в отличие от других монофункциональных ДНК-гликозилаз, взаимодействует с AP-сайтами формируя оснований Шиффа, и при этом не обладает АР-лиазной активностью [20].

ДНК, содержащие AP-сайты (АР-ДНК) или продукты его расщепления с 4-гидроксипентен-2-алем на 3'-конце или с 5'-dRP, могут использоваться для поиска и идентификации белков, взаимодействующих с такими ДНК. Например, недавно, боргидридным треппингом в сочетании с масс-спектрометрией, было идентифицировано девять белков Escherichia coli и Saccharomyces cerevisiae, взаимодействующих с АР-сайтами [12]. Аналогичным методом в составе ковалентного аддукта с ДНК-дуплексом, содержащим разрыв с 5'-dRP, был также идентифицирован белок HMGB1 (high-mobility group box 1). Выделенный белок HMGB1 имеет слабую 5'-dRP-лиазную активность и при взаимодействии с белками ЭРО' стимулирует их активность [21]. Для другого представителя HMG-семейства - HMGA2, также была продемонстрирована способность взаимодействовать с AP-сайтами в геномной ДНК, а с использованием коротких ДНК-дуплексов' были обнаружены его АР- и 5'-dRP-лиазные активности [22]. Не исключено существование еще неидентифицированных белков, взаимодействующих с АР-сайтами.

Целью данной работы являлось исследование взаимодействий белков экстрактов клеток человека с химически активными ДНК, имитирующими ДНК-интермедиаты различных этапов ЭРО. В качестве химически активных ДНК-зондов использовали 32-мерные ДНК-дуплексы, содержащие фотоактивируемые группы или AP-сайты. Однако следует иметь в виду, что ДНК, содержащие двухцепочечные (дц-) концы, являются интермедиатами другого пути репарации ДНК - репарации двухцепочечных разрывов ДНК. Основной путь репарации двухцепочечных разрывов ДНК в клетках млекопитающих - негомологичное соединение концов [23, 24]. Этот путь инициирует Ku-антиген, связывая двухцепочечные концы ДНК. Ku-антиген - это эукариотический гетеродимерный ДНК-связывающий комплекс, состоящий из двух субъединиц с молекулярными массами около 70 кДа (Ки70) и 83 кДа (Ки80) и обладающий высоким сродством к дц-концам [23, 24]. Во время репарации ДНК молекулы Ки, как тиски зажимают и удерживают рядом концы ДНК, помогая сборке комплекса, осуществляющего репарацию ДНК [24-26].

Основные объекты исследования: белки клеточных экстрактов опухолевых линий человека. Основные использованные методы: специфические функциональные тесты, аффинная модификация белков химически активными ДНК, иммунологические подходы и масс-спектрометрия.

В ходе исследования планировалось решить следующие задачи:

• охарактеризовать вновь синтезированный фотоактивируемый аналог с1СТР и в сравнении с ранее использованными аналогами выявить фотоактивируемые производные ёСТР, которые наиболее пригодны для исследований в клеточных экстрактах;

• оценить перспективность использования АР-ДНК для оценки содержания в клеточных экстрактах белков, узнающих АР-сайты.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Ильина, Екатерина Сергеевна

выводы

1. Охарактеризован вновь синтезированный аналог с!СТР - экзо-Ы-{2-[М-(4-азидо-2,5-дифтор-3 -хлорпиридин-6-ил)-3 -аминопропионил] -аминоэтил } -2'-дезоксирибоцитидин-5'-трифосфат (РАР-сЮТР) в системах, содержащих- ДНК-полимеразу р или экстракт клеток НеЬа. При сравнительном анализе нового и двух ранее использованных аналогов с!СТР - экзо-Ы-[(4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензилиденаминоокси)-бутило-кси]-2'-дезоксирибоцитидин-5'-трифосфата и экзо-Ы-[2-(4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензилиденаминооксиметилкарбамоил)-этил]-2'-дезоксирибо-цитидин-5'-трифосфата - установлено, что БАР-ёСТР по эффективности включения в ДНК ДНК-полимеразами не уступает, а по уровню сшивки ЕАР-сЮМР-содержащих ДНК с белками, значительно превосходит ранее использованные арилазидные производные <1СТР.

2. В экстрактах клеток человека проведен поиск белков, взаимодействующих с апуриновыми/апиримидиновыми (АР-) сайтами с образованием основания Шиффа; методами иммуноферментного и масс-спектрометрического анализа основной белок-мишень АР-ДНК идентифицирован как Ки80-субъединица Ки-антигена.

4. Сравнительный анализ модификации Ки-антигена в экстрактах клеток человека ДНК, содержащими АР-сайт или РАР-с1СМР в середине одной цепи и дополнительные повреждения в противоположной цепи ДНК, показал, что соотношение уровней модификации Ки70 и Ки80-субъединиц фотоактивируемыми ДНК и уровень модификации Ки80-субъединицы АР-ДНК зависят от типа дополнительного повреждения; для АР-ДНК эффективность сшивки, по-видимому, определяется взаимным положением реагирующих групп белка и ДНК.

3.3. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе впервые проведена количественная оценка эффективности вюноченияфотоактивируемых аналогов dNTP в ДНК ферментами клеточных экстрактов, а также использование полученных ДНК для фотоаффинной модификации белков экстрактов клеток человека. С учетом эффективности модификации белков и субстратных характеристик, наиболее перспективным для исследований в клеточных экстрактах, является экзо-Ы-{2-[Ъ1-(4-азидо-2,5-дифтор-3-хлорпиридин-6-ил)-3-аминопропионил]-аминоэтил}-2'-дезоксирибоцитидин-5'-трифосфат (FAP-dCTP), который обеспечивает максимальный выход продуктов модификации клеточных белков из всех синтезированных и исследованных до сих пор аналогов dNTP.

С использованием ДНК, содержащих АР-сайт в середине цепи, впервые установлена способность белка, не относящегося к системе эксцизионной« репарации оснований - Ки80-субъединицы Ku-антигена, взаимодействовать с ранними интермедиатами этого процесса - АР-сайтами - с образованием основания Шиффа. Согласно литературным данным, наличие АР-сайта в ДНК вызывает изгиб по его положению, причем угол изгиба ДНК по положению апуринового сайта выше, чем апиримидинового [229]. Возможно, изгиб в ДНК, вызванный наличием АР-сайта, способствует удачному расположению альдегидной группы дезоксирибозы АР-сайта и акцепторных групп в Ки. Это предположение согласуется с тем, что выход продуктов модификации Ки80 с использованием апуриновой ДНК в 1.4 раза выше, по сравнению с апиримидиновой.

Обнаруженное нами взаимодействие Ки80 с АР-сайтами не сопровождается расщеплением цепи по положению АР-сайтов, и ставит вопрос о биологической значимости таких взаимодействий. С одной стороны, возможно, что ковалентное, но обратимое присоединение белков к АР-ДНК через основание Шиффа, может служить для временной защиты АР-сайтов. Согласно литературным данным, АВН1 после расщепления АР-сайтов в ДНК по лиазному механизму остается ковалентно связанным со своим продуктом, и, по мнению авторов, тем самым защищает расщепленную ДНК от неправильной репарации [228]. Временная защита АР-сайтов особенно важна, когда они входят в состав кластерных повреждений, например, близко расположенных в комплементарной цепи разрывов или АР-сайтов, поскольку в результате «попытки» репарации могут образовываться двухцепочечные разрывы, которые более токсичны для клеток [235, 236]. Действительно, в настоящей работе обнаружено, что Ки80 ингибирует гидролиз АР-сайтов АРЕ1. С другой стороны, не исключено, что проявление АР-лиазной активности белками, образующими основания Шиффа,.зависит от структурных особенностей ДНК. Так, например, в недавно опубликованной работе [230] показано, что Ки-антиген проявляет слабую АР-лиазную активность, когда АР-сайт расположен непосредственно вблизи двухцепоченых концов (второе положение с 5'-конца в свисающей одноцепочечной части ДНК-дуплекса). Однако- если АР-сайт расположен на расстоянии более одного витка спирали от конца АР-лиазная активность Ки-антигена не проявляется, как и в случае использованных в данной работе АР-ДНК. Кроме того, такая ковалентная фиксация белков на ДНК может вносить вклад в известную токсичность АР-сайтов.

Важно отметить, что АР-ДНК может использоваться для оценки содержания' Ки-антигена в клеточном экстракте. В настоящей работе показано, что предложенный подход, основанный на использовании АР-ДНК, обладает некоторыми преимуществами по сравнению с применяемыми на данный момент методами оценки содержания Ки-антигена. Этот метод позволяет оценивать в клеточных экстрактах содержание форм Ки-антигена, которые активны в связывании ДНК, в отличие от иммунохимических методов, определяющих только содержание той или иной полипептидной цепи. Оценка содержания Ки80 по количеству мРНК не позволяет учитывать возможность протеолиза Ки80. Кроме того, количество Ки80 оценивается-как доля АР-ДНК, ковалентно присоединенная к Ки80, что исключает необходимость контроля количества образца, нанесенного на гель, и контроля эффективности переноса белка на мембрану, что необходимо осуществлять,в белковом (вестерн) блоттинге. В целом, этот подход является менее затратным по времени и количеству использованных реактивов.

Еще одним перспективным направлением развития аффинной модификации белков оказалось использование модифицированных ДНК в сочетании с методами масс-спектрометрии для поиска и идентификации ранее неизвестных белков-участников •определенных процессов/стадий репарации ДНК. В данной работе этим подходом в1 составе конъюгата, образованного белком экстракта с ДНК, содержащими АР-сайты, была идентифицирована Ки80 субъединица Ки-антигена. Этот подход довольно универсален и может применяться для идентификации различных ДНК-связывающих белков с использованием ДНК, содержащих структурные элементы, специфически узнаваемыми белками. Предложенный подход был с успехом применен в нашей лаборатории для идентификации еще одного белка взаимодействующего с АР-сайтами - поли(АОР-рибозо)полимеразы 1 в составе коньюгата с ДНК [223, 244].

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Ильина, Екатерина Сергеевна, Новосибирск

1. Scharer O.D. Mechanisms of DNA Repair: Chemistry and Biology of DNA Repair И

2. Angew. Chem. Int. Ed. 2003. V. 42. P. 2946-2974.

3. Khodyreva S.N., Lavrik O.I. Photoaffinity labeling technique for studying DNA replicationand DNA repair II Curr. Med. Chem. 2005. V. 12. P. 641-655.

4. Wlassoff W.A., Dobrikov M.I., Safronov I.V., Dudko R.Y., Bogachev V.S., Kandaurova

5. V.V., Shishkin G.V., Dymshits G.M., Lavrik O.I. Synthesis and characterization of (d)NTP derivatives substituted with residues of different photoreagents II Bioconjugate Chem. 1995. V. 6. P. 352-360.

6. Сафронов И.В., Щербик H.B., Ходырева C.H., Власов В.А., Добриков М.И., Шишкин

7. Г.В., Лаврик О.И. Новые фотоактивные N4-3aMeu\ewibie аналоги dCTP: получение, фотохимические и субстратные свойства при синтезе ДНК, катализируемом обратной транскриптазой ВИЧ-1II Биоорган, химия 1997. Т. 23. С. 576-585.

8. Doronin S.V., Dobrikov M.I., Lavrik O.I. Photoaffinity labeling of DNA polymerase a

9. DNA primase complex based on the catalytic competence of a dNTP reactive analog H FEBS Lett. 1992. V. 313. P. 31-33.

10. Doronin S.V., Dobrikov M.I., Buckle M., Roux .P., Buc H., Lavrik O.I. Affinitymodification of human immunodeficiency virus reverse transcriptase and DNA template byphotoreactive dCTP analogs // FEBS Lett. 1994. V. 354. P. 200-202. ,

11. Lavrik O.I, Prasad R., Beard W.A., Safronov I.V., Dobrikov M.I., Srivastava D.K.,

12. Shishkin G.V., Wood T.G., Wilson- S.H. dNTP binding to HIV-1 reverse transcriptase' and mammalian DNA polymerase beta as revealed by affinity labeling with a photoreactive dNTP analog H J. Biol. Chem. 1996. V. 271. P. 21891-21897.

13. Драчкова И.А., Петрусева И.О., Сафронов И.В., Захаренко А.Л., Шишкин Г.В.,

14. Lavrik O.I., Prasad R., Sobol R.W., Horton J.K., Ackerman E.J., Wilson S.H. Photoaffinitylabeling of mouse fibroblast enzymes by a base excision repair intermediate II J. Biol. Chem. 2001. V. 27. P. 25541-25548.

15. Левина Е., Бавыкин С., Шик В., Мирзабеков А. Взаимодействие гистонов с ДНК в хроматине. Новый метод ковалентного связывания гистонов с ДНК, удобный для их локализации на ДНК Н Биохимия 1980. Т. 45. С. 1133-1145.

16. Haracska L., Prakash L., Prakash S. A mechanism for the exclusion of low-fidelity human Y-family DNA polymerases from base excision repair // Genes Dev. 2003. V. 17. P.2777-2785.

17. Rieger R.A., Zaika V., Xie W., Johnson F., Grollman A.P., Iden C.R., Zharkov D.O. Proteomic approach to identification of proteins reactive for abasic sites in DNA II Mol. Cell. Proteomics 2006. V. 5. P. 858-867.

18. Lindahl Т., Nyberg B. Rate of depurination of native deoxyribonucleic acid II Biochemistry 1972. V. 11. P. 3610-3618.

19. Loeb L.A. Apurinic sites as mutagenic intermediates II Cell 1985. V. 40. P. 483-484.

20. David S., Williams S.D. Chemistry of glycosylases and endonucleases involved in base-excision repair И Chem. Rev. 1998. V. 98. P. 1221-1261.

21. Boiteux S., Guillet M. Abasic sites in DNA: repair and biological consequences in Saccharomyces cerevisiae II DNA Repair 2004. V. 3. P. 1-12.

22. Piersen C.E., McCullough A.K., Lloyd R.S. AP lyases and dRPases: commonality of mechanism II Mutat. Res.«2000. V. 459. P. 43-53.

23. Hegde M.L., Hazra Т.К., Mitra S. Functions of disordered regions in mammalian early base excision repair proteins II Cell. Mol. Life Sci. 2010. V. 67. P. 3573-3587.

24. Sobol R.W., Prasad R., Evenski A., Baker A., Yang X.P., Horton J.K., Wilson S.H. The lyase activity of the DNA repair protein /?-polymerase protects from DNA-damage-inducedcytotoxicity //Nature 2000. V. 405. P. 807-810.

25. Zharkov D.O., Grollman A.P. MutY DNA glycosylase: base release and intermediate complex formation И Biochemistry 1998. V. 37. P. 12384-12394.

26. Mahaney B.L., Meek K., Lees-Miller S.P. Repair of ionizing radiation-induced DNA double-strand breaks by non-homologous end-joining II Biochem. J. 2009. V. 417. P. 639-650.

27. Gullo C., Au M., Feng G., Teoh G. The biology of Ku and its potential oncogenic role in cancer II Biochim. Biophys. Acta 2006. V. 1765. P. 223-234.

28. Downs J.A., Jackson S.P. A means to a DNA end: the many roles of Ku II Nat. Rev. Mol. and Cell. Biol. 2004. V. 5. P. 367-378.

29. Dynan W.S., Yoo S. Interaction of Ku protein and DNA-dependent protein kinase catalytic subunit with nucleic acids 11 Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. P. 1551-1559.

30. Muller C., Paupert J., Monferran S., Salles B. The double life of the Ku protein II Cell Cycle 2005. V. 4. P. 438-441.

31. Myung K., He D.M., Lee S.E., Hendrickson E.A. KARP-1: a novel leucine zipper protein expressed from the Ku80 autoantigen locus is implicated in the control of DNA-dependent protein kinase activity IIEMBO J. 1997. V. 16. P. 3172-3184.

32. Casellas R., Nussenzweig A., Wuerffel R., Pelanda R., Reichlin A., Suh H., Qin X.F., Besmer E., Kenter A., Rajewsky K.5 Nussenzweig M.C. Ku80 is required for immunoglobulin isotype switching II EMBO J. 1998. V. 17. P. 2404-2411.

33. Daniel R., Katz R.A., Skalka A.M. A role for DNA-PK in retroviral DNA integration II Science 1999. V. 284. P. 644-647.

34. Martinez J.J., Seveau S., Yeiga E., Matsuyama S., Cossart P. Ku70, a component of DNA-dependent protein kinase, is a mammalian receptor for Rickettsia conorii II Cell 2005. V.123. P. 1013-1023.

35. Munakata Y., Saito-Ito T., Kumura-Ishii K., Huang J., Kodera T., Ishii T., Hirabayashi Y., Koyanagi Y., Sasaki T. Ku80 autoantigen as a cellular coreceptor for human parvovirus B19 infection II Blood 2005. V. 106. P. 3449-3456.

36. Walker J.R., Corpina R.A., Goldberg J. Structure of the Ku heterodimer bound to DNA and its implications for double-strand break repair II Nature 2001. V. 412. P. 607-614.

37. Nick McElhinny S.A., Snowden C.M., McCarville J., Ramsden D.A. Ku recruits the XRCC4-ligase IVcomplex to DNA ends II Mol. Cell. Biol. 2000. V. 20. P. 2996-3003*.

38. Wu X., Lieber M.R. Protein-protein and protein-DNA interaction regions within the DNA end-bindingprotein Ku70-Ku80 II Mol. Cell. Biol. 1996. V. 16. P. 5186-5193.

39. Li B., Comai L. Requirements for the nucleolytic processing of DNA ends by the Werner syndrome protein-Ku70/80 complex II J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 9896-9902.

40. Koike M., Awaji T., Kataoka M., Tsujimoto G., Kartasova T., Koike A., Shiomi T. Differential subcellular localization of DNA-dependent protein kinase components Ku and DNA-PKcs during mitosis II J. Cell Sei. 1999. V. 112. P. 4031-4039.

41. Aravind L., Koonin E.V. SAP a putative DNA-binding motif involved in chromosomal organization II Trends Biochem Sei. 2000. V. 25. P. 112-114.

42. Aravind L., Koonin E.V. Prokaryotic homologs of the eukaryotic DNA-end-binding protein Ku, novel domains in the Ku protein and prediction of a prokaryotic doublestrand break repair system II Genome Res. 2001. V. 11. P. 1365-1374.

43. Bilaud T., Brun C., Ancelin K., Koering C.E., Laroche T., Gilson E. Telomeric localization of TRF2, a novel human telobox protein II Nat. Genet. 1997. V. 17. P. 236-239.

44. Jin S., Weaver D.T. Double-strand break repair by Ku70 requires heterodimerization with Ku80 and DNA binding functions II EMBO J. 1997. V. 16. P. 6874-6885.

45. Yoo S., Kimzey A., Dynan W. S. Photocross-linking of an oriented DNA repair complex. Ku boundat a single DNA end Iii. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 20034-20039.

46. Singleton B.K., Priestley A., Steingrimsdottir H., Gell D., Blunt T., Jackson S.P., Lehmann A.R., Jeggo P.A. Molecular and biochemical characterization ofxrs mutants defective in Ku80 II Mol. Cell. Biol. 1997. V. 17. P. 1264-1273.

47. Taccioli G.E., Gottlieb T.M., Blunt T., Priestley A., Demengeot J., Mizuta R., Lehmann A.R., Alt F.W., Jackson S.P., Jeggo P.A. Ku80: product of the XRCC5 gene and its role in DNA repair and V(D)J recombination II Science 1994. V. 265. P. 1442-1445.

48. Ochem A.E., Skopac D., Costa M., Rabilloud T., Vuillard L., Simoncsits A., Giacca M., Falaschi A. Functional properties of the separate subunits of human DNA helicase II/Ku autoantigen II J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 29919-29926.

49. Tuteja R., Tuteja N. Ku autoantigen: a multifunctional DNA-binding protein II Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 2000. V. 35. P. 1-33.

50. Higashiura M., Shimizu Y., Tanimoto M., Morita T., Yagura T. Immunolocalization of Ku-proteins (p80/p70): localization of p70 to nucleoli and periphery of both interphase nuclei and metaphase chromosomes I I Exp. Cell Res. 1992. V. 201. P. 444-451.

51. Yaneva M., Jhiang S. Expression of the Ku protein during cell proliferation II Biochim. Biophys. Acta 1991. V. 1090. P. 181-187.

52. Yu E., Song K.} Moon H., Maul G.G., Lee I. Characteristic immunolocalization of Ku protein as nuclear matrix II Hybridoma 1998. V. 17. P. 413-420.

53. Koike M., Ikuta T., Miyasaka T., Shiomi T. Ku80 can translocate to the nucleus independent of the translocation of Ku70 using its own nuclear localization signal II Oncogene 1999. V. 18. P. 7495-7505.

54. Koike M., Shiomi T., Koike A. Dimerization and nuclear localization of Ku proteins II J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 11167-11173.

55. Bakalkin G., Yakovleva T., Hurd Y.L., Nussenzweig A., Li G.C., Terenius L. Autoantigen Ku in the brain. Developmentally regulated expression and subcellular localization II NeuroReport 1998. V. 9. P. 2147-2151.

56. Dalziel R.G., Mendelson S.C., Quinn J.P. The nuclear autoimmune antigen Ku is also present on the cell surface II Autoimmunity 1992. V. 13. P. 265-267.

57. Prabhakar B.S., Allaway G.P., Srinivasappa J., Notkins A.L. Cell surface expression of the 70-kD component of Ku, a DNA-binding nuclear autoantigen II J. Clin. Invest. 1990. V. 86. P. 1301-1305.

58. Blier P.R., Griffith A.J., Craft J., Hardin J.A. Binding of Kuprotein to DNA. Measurement of affinity for ends and demonstration of binding to nicks II J. Biol. Chem. 1993. V. 268. P.7594-7601.

59. Falzon M., Fewell J.W., Kuff E.L. EBP-80, a transcription factor closely resembling the human autoantigen Ku, recognizes single- to double-strand transitions in DNA II J. Biol. Chem. 1993. V. 268. P. 10546-10552.

60. Bliss T.M., Lane D.P. Ku selectively transfers between DNA molecules with homologous ends Hi. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 5765-5773.

61. Chiu C.F., Lin T.Y., Chou W.G. Direct transfer of Ku between DNA molecules with nonhomologous ends 11 Mutat. Res. 2001. V. 486. P. 185-194.

62. Ruiz M.T., Matheos D., Price G.B., Zannis-Hadjopoulos M. OBA/Ku86: DNA binding specificity and involvement in mammalian DNA replication II Mol. Biol. Cell. 1999. V. 10. P. 567-580.

63. Smith G.C., Jackson S.P. The DNA-dependent protein kinase II Genes Dev. 1999. V. 13. P. 916-934.

64. Sutherland B.M., Bennett P.V., Saparbaev M., Sutherland J.C., Laval J. Clustered DNA damages as dosemeters for ionising radiation exposure and biological responses II Radiat. Prot. Dosimetry 2001. V. 97. P. 33-38.

65. Doherty A.J., Jackson S.P. DNA repair: how Ku makes ends meet // Curr. Biol. 2001. V. 11. P. R920-R924.

66. Rothkamm K., Krüger I. Thompson L.H., Löbrich M. Pathways of DNA double-strand break repair during the mammalian cell cycle II Mol. Cell. Biol. 2003. V. 16. P. 5706-5715.

67. Branzei D., Foiani M. Regulation of DNA repair throughout the cell cycle II Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2008. V. 9. P. 297-308.

68. Morrison C., Wagner E. Extrachromosomal recombination occurs efficiently in cells defective in various DNA repair systems 11 Nucleic Acids Res. 1996. V. 24. P. 2053-2058

69. Reliene R., Bishop A.J., Li G., Schiestl R.H. Ku86 deficiency leads to reduced intrachromosomal homologous recombination in vivo in mice II DNA Repair 2004. V. 3. P. 103-111.

70. Audebert M., Salles B., Calsou P. Involvement of poly(ADP-ribose) polymerase-1 and XRCC1/DNA ligase III in an alternative route for DNA double-strand breaks rejoining I I J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P. 55117-55126.

71. Audebert M., Salles B., Weinfeld M., Calsou P. Involvement of polynucleotide kinase in a poly(ADP-ribose) polymerase-1-dependent DNA double-strand breaks rejoining pathway H J. Mol. Biol. 2006. V. 356. P. 257-265.

72. Haber J.E. DNA repair. Gatekeepers of recombination II Nature 1999. V. 398. P. 665-667.

73. Jones J.M., Geliert M., Yang W. A Ku bridge over broken DNA II Structure 2001. V. 9. P. 881-884.

74. Gottlieb T.M., Jackson S.P. The DNA-dependent protein kinase; requirement for DNA ends and association with Ku antigen II Cell. 1993. V. 72. P. 131-142.

75. Suwa A., Hirakata M., Takeda Y., Jesch S.A., Mimori T., Hardin J.A. DNA-dependent protein kinase (Ku protein-p350 complex) assembles on double-stranded DNA II Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1994. V. 91. P. 6904-6908.

76. West R.B., Yaneva M., Lieber M.R. Productive and nonproductive complexes of Ku and DNA-dependent protein kinase at DNA termini II Mol. Cell. Biol. 1998. V. 18. P.5908-5920.

77. Chan D.W., Ye R., Veillette C.J., Lees-Miller S.P. DNA-dependent protein kinase phosphorylation sites in Ku 70/80 heterodimer // Biochemistry 1999. V. 38. P. 1819-1828.

78. Jackson S.P., Jeggo P.A. DNA double-strand break repair and V(D)J recombination: involvement ofDNA-PKII Trends Biochem. Sei. 1995. V. 20. P. 412-415.

79. Anderson C.W. DNA damage and the DNA-activated protein kinase // Trends Biochem. Sei. 1993. V. 18. P. 433-437.

80. Lees-Miller S.P. The DNA-dependent protein kinase, DNA-PK: 10 years and no ends in sight II Biochem. Cell. Biol. 1996. V. 74. P. 503-512.

81. Critchlow S.E., Bowater R.P., Jackson S.P. Mammalian DNA double strand break repair protein XRCC4 interacts with DNA ligase IV11 Curr. Biol. 1997. V. 7. P. 588-598.

82. Leber R., Wise T.W., Mizuta R., Meek K. The XRCC4 gene product is a target for and interacts with the DNA-dependent protein kinase II J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 1794-1801.

83. Ma Y., Pannicke U., Schwarz K., Lieber M.R. Hairpin opening and overhang processing by an Artemis/DNA-dependent protein kinase complex in nonhomologous end joining and V(D)J recombination II Cell 2002. V. 108. P. 781-794.

84. Ma Y., Schwarz K., Lieber M.R. The Artemis:DNA-PKcs endonuclease cleaves DNA loops, flaps, and gaps II DNA Repair 2005. V. 4. P. 845-851.

85. Povirk L.F., Zhou T., Zhou R., Cowan M.J., Yannone S.M. Processing of 5-phosphoglycolate-terminated DNA double strand breaks by Artemis nuclease II J. Biol. Chem. 2007. V. 282. P. 3547-3558.

86. Nick McElhinny S.A., Ramsden D.A. Sibling rivalry: competition between Pol Xfamily members in V(D)J recombination ■ and general double strand break repair II Immunol. Rev. 2004. V. 200. P. 156-164.

87. Davis B.J., Havener J M., Ramsden D.A. End-bridging is required for pol /u to efficiently promote repair of noncomplementary ends by nonhomologous end joining II Nucleic Acids Res. 2008. V. 36. P. 3085-3094.

88. Rasouli-Nia A., Karimi-Busheri F., Weinfeld M. Stable down-regulation of human polynucleotide kinase enhances spontaneous mutation frequency and sensitizes cells to genotoxic agents II Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004. V. 101. P. 6905-6910.

89. Karimi-Busheri F., Rasouli-Nia A., Allalunis-Turner J., Weinfeld M. Human polynucleotide kinase participates in ■ repair of DNA double-strand breaks by nonhomologous end joining but not homologous recombination // Cancer Res. 2007. V. 67. P. 6619-6625.

90. Iles N., Rulten S., El-Khamisy S.F., Caldecott K.W. APLF (C2orfl3) is a novel human protein involved in the cellular response to chromosomal DNA strand breaks II Mol. Cell. Biol. 2007. V. 27. P. 3793-3803.

91. Macrae C.J., McCulloch R.D., Ylanko J., Durocher D., Koch C.A. APLF (C2orfl3) facilitates nonhomologous end-joining and undergoes ATM-dependent hyperphosphorylation following ionizing radiation II DNA Repair 2008. V. 7. P. 292-302.

92. Ahel I., Ahel D., Matsusaka T., Clark A.J., Pines J., Boulton S.J., West S.C. Poly(ADP-ribose)-binding zinc finger motifs in DNA repair/checkpoint proteins II Nature 2008. V. 451. P. 81-85.

93. Bekker-Jensen S., Fugger K., Danielsen J.R., Gromova I., Sehested M., Celis J., Bartek J., Lukas J., Mailand N. Human Xipl (C2orfl3) is a novel regulator of cellular responses to DNA strand breaks II J. Biol. Chem. 2007. V. 282. P. 19638-19643.

94. Kanno S., Kuzuoka H., Sasao S., Hong Z., Lan L., Nakajima S., Yasui A. A novel human AP endonuclease with conserved zinc-finger-like motifs involved in DNA strand break responses IIEMBO J. 2007. V. 26. P. 2094-2103.

95. Brosh Jr R.M., Bohr V.A. Human premature aging, DNA repair and RecQ helicases II Nucleic Acids Res. 2007. V. 35. P. 7527-7544.

96. Li Z„ Otevrel T., Gao Y., Cheng H.L., Seed B., Stamato T.D., Taccioli G. E., Alt F.W. The XRCC4 gene encodes a novel protein involved in DNA double-strand break repair and V(D) J recombination II Cell 1995. V. 83. P. 1079-1089.

97. Junop M.S., Modesti M., Guarne A., Ghirlando R., Gellert M., Yang, W. Crystal structure of the Xrcc4 DNA repair protein and implications for end joining II EMBO J. 2000. V. 19. P. 5962-5970.

98. Grawunder U., Wilm M., Wu X., Kulesza P., Wilson T.E., Mann M., Lieber M.R. Activity of DNA ligase IV stimulated by complex formation with XRCC4 protein in mammalian cells II Nature 1997. V. 388. P. 492-495.

99. Grawunder U., Zimmer D., Leiber M.R. DNA ligase IV binds to XRCC4 via a motif located between rather than within its BRCT domains // Curr. Biol. 1998. V. 8. P. 873-876.

100. Gu J., Lu H., Tippin B., Shimazaki N., Goodman M.F., Lieber M. R. XRCC4:DNA ligase IV can ligate incompatible DNA ends and can ligate across gaps II EMBO J. 2007. V. 26. P. 1010-1023.

101. Yano K., Chen D.J. Live cell imaging ofXLF and XRCC4 reveals a novel view of protein assembly in the non-homologous end-joining pathway II Cell Cycle 2008. V. 7. P.1321-1325.

102. Yano K., Morotomi-Yano K., Akiyama H. Cernunnos/XLF: a new player in DNA double-strand break repair 11 Int. J. Biochem. Cell. Biol. 2009. V. 41. P. 1237-1240.

103. Ahnesorg P., Smith P., Jackson S.P. XLF interacts with the XRCC4-DNA ligase IV complex to promote DNA nonhomologous end-joining II Cell 2006. V. 124. P. 301-313.

104. Sekiguchi J.M., Ferguson D.O. DNA double-strand break repair: a relentless hunt uncovers new prey II Cell 2006. V. 124. P. 260-262.

105. Andres S.N., Modesti M., Tsai C.J., Chu G., Junop M.S. Crystal structure of human XLF: a twist in nonhomologous DNA end-joining II Mol. Cell 2007. V. 28. P. 1093-1101.

106. Yano K., Morotomi-Yano K., Wang S.Y., Uematsu N., Lee K.J., Asaithamby A., Weterings E., Chen D.J. Ku recruits XLF to DNA double-strand breaks II EMBO Rep. 2008. V. 9. P. 91-96.

107. Postow L., Ghenoiu C., Woo E.M., Krutchinsky A.N., Chait B.T., Funabiki H. Ku80 removal from DNA through double strand break-induced ubiquitylation II J. Cell Biol. 2008. V. 182. P. 467-479.

108. Kurimasa A., Ouyang H., Dong L.J., Wang S., Li X., Cordon-Cardo C., Chen D.J., Li G.C. Catalytic subunit of DNA-dependent protein kinase: impact on lymphocyte development and tumorigenesis II Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999. V. 96. P. 1403-1408.

109. Nussenzweig A., Chen C., da Costa Soares V., Sanchez M., Sokol K., Nussenzweig M.C., Li G.C. Requirement for Ku80 in growth and immunoglobulin V(D)J recombination I I Nature 1996. V. 382. P. 551-555.

110. Li G., Nelsen C., Hendrickson E.A. Ku86 is essential in human somatic cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002. V. 99. P. 832-837.

111. Cai Q.Q., Plet A., Imbert J., Lafage-Pochitaloff M., Cerdan C., Blanchard J.M. Chromosomal location and expression of the genes coding for Ku p70 and p80 in human cell lines and normal tissues II Cytogenet. Cell Genet. 1994. V. 65. P. 221-227.

112. Casellas R., Nussenzweig A., Wuerffel R.,' Pelanda R., Reichlin A., Suh H., Qin X.F., Besmer E., Kenter A., Rajewsky K., Nussenzweig M.C. Ku80 is required for immunoglobulin isotype switching IIEMBO J. 1998. V. 17. P. 2404-2411.

113. Manis J.P., Gu Y., Lansford R., Sonoda E., Ferrini R., Davidson L., Rajewsky K., Alt F.W. Ku70 is required for late B cell development and immunoglobulin heavy chain class switching II J. Exp. Med. 1998. V. 187. P. 2081-2089.

114. Danska J.S., Pflumio F., Williams C.J., Huner O., Dick J.E., Guidos C.J. Rescue ofT cell-specific V(D)J recombination in SCID mice by DNA damaging agents II Science 1994. V. 266. P. 450-455.

115. Strasser A., Harris A.W., Corcoran L.M., Cory S. Bcl-2 expression promotes B- but not T-lymphoid development in scidmice II Nature 1994. V. 368. P. 457-460.

116. Blackburn E.H. Structure and function of telomeres //Nature 1991. V. 350. P. 569-573.

117. Smogorzewska A., van Steensel B., Bianchi A., Oelmann S., Schaefer M.R., Schnapp G., de Lange T. Control of human.telomere length by TRF1 and TRF2 II Mol. Cell. Biol. 2000. V. 20. P. 1659-1668.

118. Hsu H.L., Gilley D., Galande S.A., Hande M.P., Allen B., Kim S.H., Li G.C., Campisi J., Kohwi-Shigematsu T., Chen D.J. Ku acts in a unique way at the mammalian telomere to prevent end joining II Genes Dev. 2000. V. 14. P. 2807-2812.

119. Song K., Jung D., Jung Y., Lee S.G., Lee I. Interaction of human Ku70 with TRF2 II FEBS Lett. 2000. V. 481. P. 81-85.

120. Porter S.E., Greenwell P.W., Ritchie K.B., Petes T.D. The DNA-binding protein Hdflp (a putative Ku homologue) is required for maintaining normal telomere length in Saccharomyces cerevisiae // Nucleic Acids Res. 1996. V. 24. P. 582-585.

121. Boulton S.J., Jackson S.P. Identification of a Saccharomyces cerevisiae Ku80 homologue: roles in DNA double strand break rejoining and in telomeric maintenance II Nucleic Acids Res. 1996. V. 24. P. 4639-4648.

122. Bianchi A., de Lange T. Ku binds telomeric DNA in vitro II J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 21223-21227.

123. Hsu H.L., Gilley D., Blackburn E.H., Chen D.J. Ku is associated with the telomere in mammals II Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999. V. 96. P. 12454-12458.

124. Bailey S.M., Meyne J., Chen D.J., Kurimasa A., Li G.C., Lehnert B.E., Goodwin E.H. DNA double-strand break repair proteins are required to cap the ends of mammalian chromosomes II Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999. V. 96. P. 14899-14904.

125. Samper E., Goytisolo F.A., Slijepcevic P., van Buul P.P., Blasco M.A. Mammalian Ku80 protein prevents telomeric fusions independently of the length of TTAGGG repeats and the G-strand overhang II EMBO Rep. 2000. V. 1. P. 244-252.

126. Chai W., Ford L.P., Lenertz L., Wright W.E., Shay J.W. Human Ku70/80 associates physically with telomerase through interaction with hTERT II J. Biol. Chem. 2002. V. 277. P. 47242-47247.

127. Ting N.S., Yu Y., Pohorelic B., Lees-Miller S.P., Beattie T.L. Human Ku70/80 interacts directly with hTR, the RNA component of human telomerase II Nucleic Acids Res. 2005. V. 33. P. 2090-2098.

128. Martin S.G., Laroche T., Suka N., Grunstein M., Gasser S.M. Relocalization of telomeric Ku and SIR proteins in response to DNA strand breaks in yeast II Cell 1999. V. 97. P. 621-633.

129. Espejel S., Franco S., Rodríguez-Perales S., Bouffler S.D., Cigudosa J.C., Blasco M.A. Mammalian Ku80 mediates chromosomal fusions and apoptosis caused by critically short telomeres IIEMBO J. 2002. V. 21. P. 2207-2219.

130. Jaco I., Muñoz P., Blasco M.A. Role of human Ku86 in telomere length maintenance and telomere capping II Cancer Res. 2004. V. 64. P. 7271-7278.

131. Giffin W., Torrance H., Rodda D.J., Prefontaine G.G., Pope L., Hache R.J. Sequence-specific DNA binding by Ku autoantigen and its effects on transcription II Nature 1996. V. 380. P. 265-268.

132. Liu E.S., Lee A.S. Common sets of nuclear factors binding to the conserved promoter sequence motif of two coordinately regulated ER protein genes, GRP78 and GRP94 II Nucleic Acids Res. 1991. V. 19. P. 5425-5431.

133. Li G.C., Yang S.H., Kim D., Nussenzweig A., Ouyang H., Wei J., Burgman P., Li L. Suppression of heat-induced hsp70 expression by the 70-kDa subunit of the human Ku autoantigen // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995. V. 92. P. 4512-4516.

134. Mo X., Dynan W.S. Subnuclear localization of Ku protein: functional association with RNA polymerase II elongation sites 11 Mol. Cell. Biol. 2002. V. 22. P. 8088-8099.

135. Woodard R.L., Lee K.J., Huang J., Dynan W.S. Distinct roles for Ku protein in transcriptional reinitiation and DNA repair II J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 15423-15433.

136. Cao Q.P., Pitt S., Leszyk J., Baril E.F. DNA-dependent ATPase from HeLa cells is related to human Ku autoantigen II Biochemistry 1994. V. 33. P. 8548-8557.

137. Shieh B., Schultz J., Guinness M., Lacy J. Regulation of the human IgE receptor (Fc epsilonRII/CD23) by Epstein-Barr virus (EBV): Ku autoantigen binds specifically to an EBV-responsive enhancer ofCD23 II Int. Immunol. 1997. V. 9. P. 1885-1895.

138. Cohen H.Y., Lavu S, Bitterman K.J., Hekking B., Imahiyerobo T.A., Miller C., Frye R., Ploegh H., Kessler B.M., Sinclair D.A. Acetylation of the C terminus of Ku70 by CBP andPCAF controls Bax-mediated apoptosis II Mol. Cell. 2004. V. 13. P. 627-638.

139. Amsel A.D., Rathaus M., Kronman N., Cohen H.Y. Regulation of the proapoptotic factor Bax by Ku70-dependent deubiquitylation II Proc. Natl. Acad. Sei. USA 2008. V. 105. P. 5117-5122.

140. Iijima K., Muranaka C., Kobayashi J., Sakamoto S., Komatsu K., Matsuura S., KubotaN., Tauchi H. NBS1 regulates a novel apoptotic pathway through Bax activation II DNA Repair 2008. V. 7. P. 1705-1716.

141. Lynch E.M., Moreland R.B., Ginis I., Perrine S.P., D. V. Faller D.V. Hypoxia-activated ligand HAL-1/13 is lupus autoantigen Ku80 and mediates lymphoid cell adhesion in vitro II Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2001. V. 280. P. 897-911.

142. Monferran S., Muller C., Mourey L., Frit P., Salles B. The membrane-associate form of the DNA repair protein Ku is involved in cell adhesion to fibronectin II J. Mol. Biol. 2004. V. 337. P. 503-511.

143. Ginis I., Faller D.V. Hypoxia affects tumor cell invasiveness in vitro: the role of hypoxia-activated ligandHAL1/13 Ku80 autoantigen II Cancer Lett. 2000. V. 154. P. 163-174.

144. Monferran S., Paupert J., Dauvillier S., Salles B., Muller C. The membrane form of the DNA repair protein Ku interacts at the cell surface with metalloproteinase 9 II EMBO J. 2004. V. 23. P. 3758-3768.

145. Tai Y.T., Podar K., Kraeft S.K., Wang F., Young G., Lin B., Gupta D., Chen L.B., Anderson K.C. Translocation of Ku80/Ku70 to the multiple myeloma cell membrane: functional implications II Exp. Hematol. 2002. V. 30. P. 212-220.

146. Fewell J.W., Kuff E.L. Intracellular redistribution of Ku immunoreactivity in response to cell-cell contact and growth modulating components in the medium II J. Cell Sci. 1996. V. 109. P. 1937-1946.

147. Walker D.H. Targeting rickettsia II N. Engl. J. Med. 2006. V. 354. P. 1418-1420.

148. Muller C., Dusseau C., Calsou P., Salles B. Human normal peripheral blood B-lymphocytes are deficient in DNA-dependent protein kinase activity due to the expression of a variant form of the Ku80 protein 11 Oncogene 1998. V. 16. P. 1553-1560.

149. Jeng Y.W., Chao H.C., Chiu C.F., Chou W.G. Senescent human fibroblasts have elevatedKu80proteolytic cleavage activity II Mutat. Res. 1999. V. 435. P. 225-232.

150. Kato M., Iida S., Komatsu H., Ueda R. Lack of Ku80 alteration in multiple myeloma II Jpn. J. Cancer Res. 2002. V. 93. P. 359-362.

151. Lanuszewska J., Widiak P. The truncation of Ku86 in human lymphocytes II Cancer Lett. 2004. V. 205. P. 197-205.

152. Sallmyr A., Henriksson G., Fukushima S., Bredberg A. Ku protein in human T and B lymphocytes:, full length functional form and signs of degradation II Biochim. Biophys. Acta 2001. V. 1538. P. 305-312.

153. Sallmyr A., Du L., Bredberg A. An inducible Ku80-degrading serine protease in human cells II Biochim. Biophys. Acta 2002. V. 1593. P. 57-68.

154. Khanna K.K., Jackson S.P. DNA double-strand breaks: signaling, repair and the cancer connection //Nat. Genet. 2001. V. 27. P. 247-254.

155. Li G.C., Ouyang H., Li X., Nagasawa H., Little J.B., Chen D.J., Ling C.C., Fuks Z„ Cordon-Cardo C. Ku70: a candidate tumor suppressor gene for murine T cell lymphoma II Mol. Cell 1998. V. 2. P. 1-8.

156. Kinzler K.W., Vogelstein B. Cancer-susceptibility genes. Gatekeepers and caretakers II Nature 1997. V. 386. P. 761-763.

157. Difilippantonio M.J., Zhu J., Chen H.T., Meffre E., Nussenzweig M.C., Max E.E., Ried T., Nussenzweig A. DNA repair protein Ku80 suppresses chromosomal aberrations and malignant transformation //Nature 2000. V. 404. P. 510-514.

158. Gao Y., Ferguson D.O., Xie W., Manis J.P., Sekiguchi J., Frank K.M., Chaudhuri J., Horner J., DePinho R.A., Alt F.W. Interplay of p53 and DNA-repair protein XRCC4 in tumorigenesis, genomic stability and development II Nature 2000. V. 404. P. 897-900.

159. Lindahl T., Satoh M.S., Poirier G.G., Klungland A. Post-translational modification of poly(ADP-ribose) polymerase induced by DNA strand breaks // Trends Biochem. Sci. 1995. V. 20. P. 405-411.

160. Herceg Z., Wang Z.Q. Functions of poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) in DNA repair, genomic integrity and cell death II Mutat. Res. 2001. V. 477. P. 97-110.

161. Tong W.M., Hande M.P., Lansdorp P.M., Wang Z.Q. DNA strand breaksensing molecule poly(ADP-ribose) polymerase cooperates with p53 in telomere function, chromosome stability, and tumor suppression II Mol. Cell. Biol. 2001. V. 21. P.4046-4054.

162. Lim J.W., Kim H., Kim K.H. Expression of Ku70 and Ku80 mediated by NF-kappa B and cyclooxygenase-2 is related to proliferation of human gastric cancer cells II J. Biol. Chem. 2002. V. 277. P. 46093-46100.

163. Lim J.W., Kim H., Kim K.H. Nuclear factor-kappaB regulates cyclooxygenase-2 expression and cell proliferation in human gastric cancer cells II Lab. Invest. 2001. V. 81. P. 349-360.

164. Sheng H., Shao J., Morrow J.D., Beauchamp R.D., DuBois R.N. Modulation of apoptosis and Bcl-2 expression by prostaglandin E2 in human colon cancer cells II Cancer Res. 1998. V. 58. P. 362-366.

165. Klein A., Miera O., Bauer O., Golfier S., Schriever F. Chemosensitivity ofB cell chronic lymphocytic leukemia and correlated expression of proteins regulating apoptosis, cell cycle and DNA repair II Leukemia 2000. V. 14. P. 40-46.

166. Pucci S., Mazzarelli P., Rabitti C., Giai M., Gallucci M., Flammia G., Alcini A., Altomare V., Fazio V.M. Tumor specific modulation of KU70/80 DNA binding activity in breast and bladder human tumor biopsies 11 Oncogene 2001. V. 20. V. 739-747.

167. Kim S.H., Kim D„ Han J.S., Jeong C.S., Chung B.S., Kang C.D., Li G.C. Ku autoantigen affects the susceptibility to anticancer drugs II Cancer Res. 1999. V. 59. P. 4012-4017.

168. Gabai V.L., Meriin A.B., Mosser D.D., Caron A.W., Rits S., Shifrin V.I., Sherman M.Y. HsplO prevents activation of stress kinases. A novel pathway of cellular thermotolerance II J. Biol. Chem. 1997. V. 272. V. 18033-18037.

169. Samali A., Cotter T.G. Heat shock proteins increase resistance to apoptosis II Exp. Cell Res. 1996. V. 223. P. 163-170.

170. Li G.C., He F., Shao X., Urano M., Shen L., Kim D., Borrelli M.,.Leibel S.A., GutinP.H., Ling C.C. Adenovirus-mediated heat-activated antisense Ku70 expression radiosensitizes tumor cells in vitro and in vivo II Cancer Res. 2003. V. 63. P. 3268-3274.

171. Lebedeva N.A., Khodyreva S.N., Favre A, Lavrik O.I. AP endonuclease I has no biologically significant 3 '—>5'-exonuclease activity // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003. V. 300. P. 182-187.

172. Суханова M.B., Ходырева C.H., Лаврик О.И. Поли(АОР-рибоза)полимераза 1 ингибирует синтез ДНК с вытеснением цепи, катализируемый ДНК-полимеразой /3 И Биохимия 2004. Т. 69. С. 686-698.

173. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. V. 72. P. 248-254.

174. Biade S., Sobol R., Wilson S., Matsumoto Y. Impairment of proliferating cell nuclear antigen-dependent apurinic/apyrimidinic site repair on linear DNA II J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 898-902.

175. Lanuszewska J., Cudak A., Rzeszowska-Wolny J., Widlak P. Detection of damage-recognition proteins from human lymphocytes H Acta Biochim. Pol. 2000. V. 47. P. 443-450.

176. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual II N. Y.: 2nd End. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989.

177. Wilm M., Shevchenko A., Houthaeve Т., Breit S., Schweigerer L., Fotsis Т., Mann M. Femtomole sequencing of proteins from polyacrylamide gels by nano-electrospray mass spectrometry II Nature 1996. V. 379. P. 466-469.ч

178. Shevchenko A., Wilm M., Vorm O., Mann M. Mass Spectrometry Sequencing of Proteins from Silver-Stained Polyacrylamide Gels H Anal. Chem. 1996. V. 68. P. 850-858.

179. Lebedeva N.A., Rechkunova N.I., Khodyreva S.N., Favre A, Lavrik O.I. Photoaffinity labeling of proteins in bovine testis nuclear extract II Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. V. 297. P. 714-721.

180. Дежуров C.B., Ходырева C.H., Речкунова Н.И., Колпащиков Д.М., Лаврик О.И. Сравнительное изучение эффективности модификации ДНК-полимераз и ДНК-матрицы различными фотоактивными группами на 3'-конце ДНК-праймера И Биоорган, химия 2003. V. 29. Р. 74-81.

181. Лебедева Н.А., Речкунова Н.И., Дежуров С.В., Ходырева С.Н., Фавр А., Лаврик О.И. Новая бинарная система для фотосинсибилизированной модификации ДНК-полимераз в ядерном экстракте II Биохимия 2003. Т. 68. С. 584-591.

182. Lavrik O.I., Kolpashchikov D.M., Prasad R., Sobol R.W., Wilson S.H. Binary system for selective photoaffinity labeling of base excision repair DNA polymerases II Nucleic Acids Res. 2002. V. 30. P. e73.

183. Chagovetz A.M., Sweasy J.B., Preston B.D. Increased activity and fidelity of DNA polymerase beta on single-nucleotide gapped DNA II J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 7501-27504.

184. Takeshita M., Chang C.N., Johnson F., Will S., Grollman A.P. Oligodeoxynucleotides containing synthetic abasic sites. Model substrates for DNA polymerases and apurinic/apyrimidinic endonucleases // J. Biol. Chem. 1987. V. 262. P. 10171-10179.

185. Дежуров C.B., Грин И.Р., Сафронов И.В., Шишкин Г.В., Лаврик О.И., Ходырева С.Н. Высокоэффективная модификация ДНК-полимеразы бета в условиях прямой и сенсибилизированной активации фотоактивных ДНК.

186. Модификация белков клеточного экстракта // Известия Акад. наук. Серия хим. 2005. Т. 54. С. 1273-1283.

187. Lindahl Т. Instability and decay of the primary structure of DNA II Nature 1993. V. 362. P. 709-715.

188. McCullough A.K., Dodson M.L. Lloyd R.S. Initiation of base excision repair: glycosylase mechanisms and structures И Annu. Rev. Biochem. 1999. V. 68. P. 255-285.

189. Atamna H., Cheung I., Ames B.N. A method for detecting abasic sites in living cells: age-dependent changes in base excision repair II Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000. V. 97. P. 686-691.

190. Loeb L.A., Preston B.D. Mutagenesis by apurinic/apyrimidinic sites II Annu Rev. Genet. 1986. V. 20. P. 201-230.

191. Nazarkina Z.K., Khodyreva S.N., Marsin S., Lavrik O.I., Radicella J.P. XRCC1 interactions with base excision repair DNA intermediates // DNA Repair 2007. V. 6. P. 254-264.

192. Ходырева C.H., Ильина E.C., Суханова M.B., Кутузов М.М., Лаврик О.И. Взаимодействие поли(АОР-рибозо)полимеразы 1 с апуриновьши/апиримидиновыми сайтами II Докл. Акад. наук 2010. Т. 431. С. 132-135.

193. Guggenheim E.R., Xu D., Zhang C.X., Chang P.V., Lippard S.J. Photoaffinity isolation and identification of proteins in cancer cell extracts that bind to platinum-modified DNA II Chembiochem 2009. V. 10. P. 141-157.

194. Zhu G., Lippard S.J. Photoaffinity labeling reveals nuclear proteins that uniquely recognize cisplatin-DNA interstrand cross-links II Biochemistry 2009. V. 48. P.4916-4925.

195. Hegde V., Wang M., Deutsch W.A. Human ribosomal protein S3 interacts with DNA base excision repair proteins hAPE/Ref-1 and hOGGl II Biochemistry 2004. V. 43. P. 14211-14217.

196. Postel E.H., Abramczyk B.M., Levit M.N., Kyin S. Catalysis of DNA cleavage and nucleoside triphosphate synthesis by NM23-H2/NDP kinase share an active site that implies a DNA repair function // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000. V. 97. P. 14194-14199.

197. Muller T.A., Meek K., Hausinger R.P. Human AlkB homologue 1 (ABH1) exhibits DNA lyase activity at abasic sites // DNA Repair 2010. V. 9. P. 58-65.

198. Roberts S.A., Strande N., Burkhalter M.D., Strom C., Havener J.M., Hasty P., RamsdenD.A. Ku is a 5'-dRP/AP lyase that excises nucleotide damage near broken ends //Nature 2010. V. 464. P. 1214-1217.

199. Errami A., Finnie N.J., Morolli B., Jackson S.P., Lohman P.H., Zdzienicka M.Z. Molecular and biochemical characterization of new X-ray-sensitive hamster celbmutants defective in Ku8011 Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. P. 4332-4338.

200. Eot-Houllier G., Eon-Marchais S., Gasparutto D., Sage E. Processing of a complex multiply damaged DNA site by human cell extracts and purified repair proteins II Nucleic Acids Res. 2005. V. 33. P. 260-271.

201. Tian K., McTigue M., de los Santos C. Sorting the consequences of ionizing radiation: processing of 8-oxoguanine/abasic site lesions II DNA Repair 2002. V. 1. P. 1039-1049.

202. Georgakilas A.G., Bennett P.V., Wilson 3rd D.M., Sutherland B.M. Processing of bistranded abasic DNA clusters in gamma-irradiated human hematopoietic cells II Nucleic Acids Res. 2004. V. 32. P. 5609-5620.

203. Gulston M., de Lara C., Jenner T., Davis E., O'Neill P. Processing of clustered DNA damage generates additional double-strand breaks in mammalian cells post-irradiation II Nucleic Acids Res. 2004. V. 32. P. 1602-1609.

204. Yang N., Galick H., Wallace S.S. Attempted base excision repair of ionizing radiation damage in human lymphoblastoid cells produces lethal and mutagenic double strand breaks I I DNA Repair 2004. V. 10. P. 1323-1334.

205. Hashimoto M., Donald C.D., Yannone S.M., Chen D.J., Roy R., Kow Y.W. A possible role of Ku in mediating sequential repair of closely opposed lesions II J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 12827-12231.

206. Wilson D.M. 3rd, Barsky D. The major human abasic endonuclease: formation, consequences and repair of abasic lesions in DNA I I Mutat. Res. 2001. V. 485. P. 283-307.

207. Matheos D., Ruiz M.T., Price G.B., Zannis-Hadjopoulos M. Ku antigen, an origin-specific binding protein that associates with replication proteins, is required for mammalian DNA replication 11 Biochim. Biophys. Acta 2002. V. 1578. P. 59-72.

208. Demple B., Herman T., Chen D.S. Cloning and expression of APE, the cDNA encoding the major human apurinic endonuclease: definition of a family of DNA repair enzymes II Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 1991. V. 88. P. 11450-11454.

209. Robson C.N., Hickson I.D. Isolation of cDNA clones encoding a human apurinic/apyrimidinic endonuclease that corrects DNA repair and mutagenesis defects in E. colixth (exonuclease III) mutants //Nucleic Acids Res. 1991. V. 19. P. 5519-5523.

Информация о работе

Ильина, Екатерина Сергеевна
кандидата химических наук
Новосибирск, 2011
ВАК 03.01.04

Диссертация

Химически активные ДНК в исследовании белков репарации ДНК: идентификация Ku-антигена как белка, взаимодействующего с апуриновыми/апиримидиновыми сайтами - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы