Кинетический механизм действия апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы человека APE1 в процессе инцизионной репарации нуклеотидов

Тимофеева, Надежда Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Кинетический механизм действия апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы человека APE1 в процессе инцизионной репарации нуклеотидов
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Кинетический механизм действия апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы человека APE1 в процессе инцизионной репарации нуклеотидов"

На правах рукописи

ТИМОФЕЕВА НАДЕЖДА АЛЕКСАНДРОВНА

КИНЕТИЧЕСКИЙ МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ АПУРИНОВОЙШШРИМИДИНОВОЙ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ ЧЕЛОВЕКА АРЕ1 В ПРОЦЕССЕ ИНЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ НУКЛЕОТИДОВ

03.01.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Новосибирск - 2012

Работа выполнена в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Научный руководитель:

д.х.н., профессор Федорова Ольга Семеновна

Официальные оппоненты:

Малыгин Эрнст Георгиевич, д.х.н., профессор Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора, г.н.с.

Белоусова Екатерина Анатольевна, к.х.н. Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, м.н.с.

Ведущая организация:

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита состоится « Ц » июня 2012 г. в 10:00 часов на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 на базе Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск, пр-кт академика Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Автореферат разослан « » мая 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

к.х.н., доцент >о ^

Коваль В.В.

РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ

БИБЛИОТЕКА _2012

_ ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Большое число эндогенных и экзогенных факторов вызывают химические повреждения клеточной ДНК. Под действием ионизирующего излучения в отсутствие кислорода основными модифицированными основаниями являются 5,6-дигидропиримидины. Образование 5,6-дигидроуридина (DHU) из цитидина может вызывать превращение G/C-пары ДНК в А/Т-пару. В процессе эксцизионной репарации оснований (BER) репарация DHU начинается с действия ДНК-гликозилаз с образованием апуринового/апиримвдинового сайта (AP-сайта). В организме человека ДНК разрезается с 5'-стороны от AP-сайта с помощью апуриновой/апиримидиновой эвдонуклеазы АРЕ1. Кроме того, АРЕ1 способна участвовать в процессе инцизионной репарации нуклеотидов (NIR), разрезая ДНК с 5'-стороны от DHU по эндонуклеазному механизму, независимо от присутствия ДНК-гликозилаз. Из анализа кристаллической структуры комплекса АРЕ1 с АР-ДНК ясно, что AP-сайт упакован в активном центре фермента очень плотно. Кристаллическая структура АРЕ1 в комплексе- с ДНК, содержащей повреждённое азотистое основание, репарируемое в процессе NIR, до сих пор не получена. Остаётся невыясненным вопрос о том, как фермент узнаёт и связывает объёмные повреждённые нуклеотиды и каков детальный кинетический механизм процесса NIR.

Цель настоящей работы состояла в установлении детального кинетического механизма действия АР-эндонуклеазы человека (АРЕ1) в процессе инцизионной репарации нуклеотидов и его сравнении с кинетическим механизмом действия АРЕ1 в процессе эксцизионной репарации оснований.

Задачи настоящего исследования состояли в том, чтобы:

• исследовать динамику конформационных превращений фермента АРЕ1 и ДНК-субстратов в предстационарных и стационарных условиях по регистрации изменений интенсивности флуоресценции остатков триптофана в ферменте и остатков 2-аминопурина, введённых в ДНК-субстраты;

• установить детальные кинетические механизмы взаимодействия АРЕ1 с неповреждённой ДНК и ДНК, содержащей DHU или AP-сайт, и выяснить механизм связывания ферментом таких структурно различных повреждений, как AP-сайт и DHU;

• изучить влияние делеции 61-ой аминокислоты на N-конце АРЕ1 и замены лизина-98 белка на аланин на кинетические параметры действия фермента в процессах NIR и BER.

Научная новшна и практическая ценность работы. Настоящая работа представляет собой первое комплексное исследование кинетического механизма действия фермента АРЕ1 и его мутантных форм АРЕ1К98А и NA61APE1 в процессе NIR. Предложены кинетические схемы взаимодействия АРЕ1 с неповреждённой ДНК и ДНК, содержащей DHU или

АР-сайт. Определены количественные параметры этих процессов. Результаты, полученные в настоящей работе, важны для понимания механизма действия АРЕ1 в процессе NIR и биологической роли такого пути репарации.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы. Результаты работы были представлены на конференциях: «Chemical and Biological Problems of Proteomics», Новосибирск, 2004; «Физико-химическая биология», Новосибирск, 2006; «IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов», Новосибирск, 2008; «X International Conference on Environmental Mutagens», Флоренция, Италия, 2009; «Медицинская геномика и протеомика», Новосибирск, 2009; «Supramolecular Chemistry for Materials and Life Sciences», Новосибирск, 2010; «8th International Meeting on Recognition Studies in Nucleic Acids», Шеффилд, Великобритания, 2010; «Физико-химическая биология», Новосибирск, 2011; «Annual Meeting of European Environmental Mutagen Society», Барселона, Испания, 2011.

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 186 страницах, содержит 49 рисунков, 10 схем и 35 таблиц. Библиография включает 182 литературных источника.

СОДЕРЖА! IИ ЕТАБОТЫ

Фермент АРЕ1 в процессе BER разрезает ДНК с 5'-стороны от АР-сайта (Рис. 1). В процессе NIR АРЕ1 разрезает фосфодиэфирную связь с 5'-стороны от некоторых повреждённых дезоксинуклеотидов с образованием на З'-конце разрыва гидроксильной группы, на 5'-конце - фосфатной (Рис. 1). Разрезание фосфодиэфирной связи АР-ДНК ферментом АРЕ1 происходит по кислотно-основному SN2(P) каталитическому механизму, с участием двух ионов Mg2+. Один из этих ионов находится в так называемом сайте связывания металла А, второй ион расположен в сайте связывания металла Б.

К началу выполнения данной работы уже были известны кристаллические структуры АРЕ1 в свободном состоянии (Gorman М.А. el al., 1997; Beernink Р.Т. et al., 2001) и в комплексах с субстратом и продуктом эндонуклеазной реакции, содержащими аналог АР-сайта (Mol D.C. et al., 2000). Данных, свидетельствующих об изменении конформации фермента при взаимодействии с субстратом и в ходе ферментативной реакции, не было. Напротив, из рентгеноструктурного анализа был сделан вывод, что АРЕ1 имеет жесткую заранее сформированную структуру для узнавания ДНК, содержащей АР-сайт. АР-сайт упакован в активном центре фермента очень плотно. Эта плотная упаковка исключает связывание нуклеотидов ДНК и специфична для а-аномера природного АР-сайта. Кристаллической структуры АРЕ1 в комплексе с ДНК, содержащей повреждённое азотистое

основание, репарируемое в процессе NIR, до сих пор не получено. Оставался невыясненным вопрос о том, как фермент узнаёт и связывает объёмные повреждённые нуклеотиды. Поэтому представляло интерес провести детальное кинетическое исследование механизма взаимодействия фермента с ДНК-субстратами, специфическими для NIR, и сравнить кинетические механизмы взаимодействия АРЕ1 с субстратами, специфическими для NIR- и BER-путей.

Рис. 1. Схема реакций, катализируемых АРЕ1 в процессах В ER (Х-ОН) или NIR (X - 5,6-дигидроурацил (DHU), 5,6-дигидротимин, 5-гидроксиурацил, 5-гидроксицитозин, adA, adC, 3 .^-бензэтено-ёС, 1 .Ы^-бензэтено-ёА, 1 ,N2-6ero3TeHO-dG. 2,6-диамино-4-гидрокси-5-Ы-метилформамидопиримидин).

Используя регистрацию флуоресценции остатков триптофана (Тгр) белков и 2-аминопурина (2-аРи), введённых в субстраты, в настоящей работе была проанализирована конформационная динамика и изучен кинетический механизм действия АРЕ1 дикого типа и его мутантных форм АРЕ1К98А и NA61APE1. Домен Ref-1 (61-на аминокислота на N-конце АРЕ1) является регулятором транскрипции. По-видимому, для проявления активности BER этот домен не важен. В то же время предполагается, что этот домен может быть необходимым для проявления активности NIR. Lys98, вероятно, принимает опосредованное участие в координации иона Mg2+ в активном центре фермента, поскольку он образует водородные связи с карбоксильной группой Asp70, который вовлечён в связывание иона Mg2* в сайте связывания металла А.

1. Методы исследования В работе использовали как метод «остановленной струи» для изучения предстационарной кинетики ферментативных реакций, так и различные методы для исследования реакций, протекающих в стационарных условиях. Ферментативные реакции проводили в буферах следующего состава: 20 мМ HEPES/KOH pH 7,5, 50 мМ KCl, 5 мМ MgCl2 (буфер, оптимальный для BER или буфер BER); 20 мМ HEPES/KOH pH 6,8, 50 мМ KCl, 0,01 мМ MgCl2 (буфер, оптимальный для NIR или буфер NIR). Использовали набор ДНК-лигандов, содержащих или не содержащих специфические сайты узнавания (Таблица 1, Рис. 2).

Таблица 1. Олигодезоксирибонуклеотиды, использованные в работе.

d(TGACTGCATAÇGCATGTAGACGATGTGCAT) С

d(TGACT ОС AT AFGCATGTA GAC GATGTOCAT) F

d(TGACTGCATAiAP)GCATGTAGACGATGTGCAT) AP

d(TGACTGCATA(DHlOGCATGTAGACGATGTGCAT) DHU

d(ATGCAC ATCGTCTACATGCGTATGCAGTCA) G

d(TGACTGCAT(2-aPu)CGCATGTAGACGA TG TGC AT) (2-aPu)C

d(TGACTGCAT(2-aPu)(DHU)GCATGTA GACGATGTGCAT) (2-aPu)DllU

d(TGACTGCATArDHUV2-aPu)CATGTAGACGATGTGCAT) DHU(2-aPu)

d(TGACTGCATA)

pd(FGCATGTAGACGATGTGCAT)

pd((DHU)GCATGTAGAC GATGTGCAT)

□ 6

Рис. 2. Структуры | , I ( NH

модифицированных нуклеозидов, использованных в работе.

АР F DHU 2-aPu

В качестве специфического субстрата для изучения процесса NIR использовали 30-звенный олигодезоксирибонуклеотидный дуплекс (ODN), содержащий остаток DHU в одной из цепей напротив гуанозина (DHU/G). Кроме того, для регистрации конформационной динамики ДНК при взаимодействии с ферментом в этот двуцепочечный ODN вводили остаток 2-аРи с 5'- ((2-aPu)DHU/G), либо З'-стороны (DHU(2-aPu)/G) от DHU. В качестве специфических субстратов для изучения процесса BER использовали 30-звенные двуцепочечные ODN, содержащие природный AP-сайт (AP/G), либо его синтетический аналог 2-гидроксиметил-З-гвдрокси-тетрагидрофуран (тетрагидрофуран, F) (F/G) в одной из цепей дуплекса напротив гуанозина. В качестве неспецифического субстрата как для NIR-, так и для BER- процессов использовали 30-звенный полностью комплементарный двуцепочечный ODN, не содержащий повреждений (C/G). Кроме того, в этот неспецифический субстрат вводили остаток 2-аРи ((2-aPu)C/G). Для определения сродства исследованных форм фермента к продуктам реакций использовали двуцепочечные ODN с разрывом в одной цепи, моделирующие продукты ферментативного разрезания субстратов F/G или DHU/G. Количественную обработку кинетических кривых проводили с помощью метода нелинейной регрессии, включающего численное интегрирование дифференциальных уравнений, описывающих кинетическую схему процесса. Для этого использовали программный пакет DynaFit (BioKin, США). Кинетические схемы, описывающие взаимодействие ферментов с субстратами или лигандами, представляли собой последовательности обратимых и необратимых стадий. Первая стадия соответствовала связыванию фермента с субстратом/лигандом. Завершающая стадия соответствовала диссоциации фермента из комплекса с продуктом

ферментативной реакции или с лигандом. Кинетическая схема подбиралась таким образом, чтобы минимально возможное количество стадий описывало весь набор кинетических данных, полученных для исследуемого процесса. Часть кинетических кривых, зарегистрированных в работе, полностью описывалась предложенной для соответствующего процесса схемой. В то же время большинство кинетических кривых описывались отдельными стадиями полной схемы. В этом случае полная схема ферментативного процесса составлялась путём объединения данных, полученных из разных кинетических кривых. В процессе количественной обработки кинетическая кривая разбивалась на временные диапазоны таким образом, чтобы каждый следующий диапазон включал предыдущий. Начальный диапазон обрабатывали в соответствии со схемой, содержащей начальные кинетические стадии. Обрабатывая следующий диапазон, к начальным стадиям добавляли ещё одну равновесную или неравновесную стадию.

2. Сродство АРЕ1 к DHU-субстрату и продуктам ферментативного разрезания субстратов DHU/G и F/G

Для определения сродства фермента дикого типа к субстрату DHU/G, а также сродства всех исследованных форм фермента к продуктам разрезания субстратов DHU/G и F/G проводили титрование ферментов в стационарных условиях соответствующими ДНК (данные не представлены). При этом регистрировали зависимости интенсивности флуоресценции остатков Тгр от концентрации лигандов.

Значение равновесной константы диссоциации Кл комплекса АРЕ1 с DHU-субстратом в буфере NIR составило (1,3±0,1)*10'6 М. Значения равновесных констант диссоциации (ЛГР) комплексов ферментов с продуктами представлены в Таблице 2. Значение Кл комплекса АРЕ1 с DHU-субстратом (1,3 мкМ) практически совпадало с величиной К? для комплекса фермента с DHU-содержащим продуктом (1,4 мкМ). Таким образом, продукт разрезания субстрата, содержащего DHU, может являться конкурентным ингибитором АРЕ1. Из Таблицы 2 видно, что фермент дикого типа и АРЕ1К98А проявляют практически одинаковое сродство к продуктам реакций. Сродство NA61APE1 к продуктам немного понижено.

Таблица 2. Равновесные константы диссоциации комплексов АРЕ1,

АРЕ1К98А и NA61APE1 с продуктами разрезания субстратов DHU/G и F/G.

Буфер Ар, мкМ

DHU-продукт F-продукт

АРЕ1 BER 2,2±0,3 0,48±0,22

NIR 1.4±0,3 2,1±0,2

АРЕ1К98А В ER не определено 0,44±0,01

NIR 1,9±0,2 не определено

NA61APE1 BER не определено 0,83±0,36

NIR 2,Э±0,4 не определено

3. Ферментативное разрезание [32Р]-меченьп субстратов

Для определения скоростей накопления продуктов ферментативной реакции в процессе NIR были проведены эксперименты по ферментативному разрезанию 5'-[иР]-меченых субстратов DHU/G (Рис.3) и (2-aPu)DHU/G (данные не представлены). Обнаружено, что за 35 часов фермент дикого типа расщепляет > 60% субстрата, содержащего остаток DHU, как в буфере NIR, так и BER (Рис ЗА, Б). Тот же результат был получен и для субстрата, содержащего остаток 2-aPu ((2-aPu)DHU/G), в буфере NIR. Это показывает, что остаток 2-аРи не влияет на скорость разрезания ферментом субстрата, содержащего DHU, поэтому в этих условиях его можно использовать как нейтральную флуоресцентную группу. Видно (Рис. ЗВ, Г), что мутантные формы АРЕ1К98А и NA61APE1 работают медленнее фермента дикого типа. На всех полученных кинетических кривых накопления продуктов (Рис. 3) можно выделить три фазы. В случае фермента дикого типа в первой фазе на временах <20 с как в BER-, так и в NIR-буферах наблюдался скачок в накоплении продуктов. В следующих двух фазах продукты накапливались более медленно.

Рис. 3. Разрезание субстрата DHU/G ферментами (1 мкМ) АРЕ1 (А, Б), АРЕ1К98А (В) и NA61APE1 (Г) в буферах BER (А) и NIR (Б, В, Г) Концентрации субстрата приведены на правой оси. А, Б - На левых врезках изображены начальные участки кинетических

кривых, соответствующие окончанию фазы 1. На правых врезках - участки кинетических кривых,

соответствующие фазе 2. В, Г - На врезках изображены начальные участки

кинетических кривых, соответствующие фазе 1.

В случае мутантных форм фермента в первой фазе наблюдалось быстрое накопление продуктов с выходом на промежуточное плато на временах < 100 с в случае АРЕ1К98А и на временах <200 с в случае NA61APE1. В следующих двух фазах продукты накапливались более медленно, как и в случае АРЕ1. Вторая фаза накопления продукта наблюдалась на временах 20 < t < 2000 с для АРЕ1, 100 < t < 20000 с для АРЕ1К98А и 200 < t < 5000 с для NA61APE1. Третья фаза соответствовала крайне медленному накоплению

продукта и протекала на временах > 2000 с для АРЕ1, > 20000 с для АРЕ1К98А и > 5000 с для NA61APE1. Медленное двухфазное накопление продукта может свидетельствовать о реакции с менее активной формой фермента и о существовании стабильного комплекса фермента с продуктом. Особенностью всех описанных кинетических серий (Рис. 3) было то, что концентрация продуктов, образовавшихся в первой фазе процесса, была меньше соответствующей начальной концентрации фермента. Во всех случаях амплитуда первой фазы составляла ~15% от концентрации исходного DHU-субстрата.

4. Определение активности АРЕ1

Методом задержки в геле было показано, что с ДНК-лигандом, содержащим DHU, связывалось не менее 64%, 48% и 44% молекул АРЕ1, АРЕ1К98А и NA6IAPE1, соответственно (данные не представлены). Известно, что такой метод недооценивает количество связанной ДНК. Для точного определения доли активного фермента было проведено титрование АРЕ1 неповреждённым лигандом (2-aPu)C/G, содержащим 2-аРи (Рис. 4).

Рис. 4. Флуоресцентное

титрование АРЕ1 (25 мкМ) неповреждённым 30-звенным ДНК-дуплексом (2-аРи)С/С в буфере ЫГО.. Экспериментальные точки приведены после коррекции базовой линии.

При этом регистрировали изменение интенсивности флуоресценции 2-аРи, возникающее при связывании лиганда с ферментом. Возрастание интенсивности флуоресценции 2-аРи за счёт увеличения концентрации лиганда с 2-аРи исключали путём коррекции базовой линии. Концентрация АРЕ1 составляла 25 мкМ и была намного больше константы диссоциации комплекса фермента с неповреждённым лигандом (Кл = 2,1 мкМ), определённой методом флуоресцентного титрования. В этих условиях весь лиганд образовывал комплекс с ферментом до тех пор, пока концентрация лиганда не превосходила концентрацию активных связывающих центров фермента (Рис. 4). На кривой возрастания интенсивности флуоресценции (Рис. 4) можно выделить один чётко выраженный излом в точке, соответствующей соотношению концентрации фермента и лиганда 1:1. Исходя из этого, было сделано заключение, что около 100% молекул АРЕ1 активно для связывания. Таким образом, пониженная амплитуда первой фазы накопления продуктов на Рис. 3 не может быть вызвана снижением

[(2-aPu)C/Gl, М

концентрации активного АРЕ1 относительно общей концентрации белка. Наиболее вероятно, что мутантные формы АРЕ1К98А и ЫД61АРЕ1 ведут себя в отношении связывания субстрата так же, как и фермент дикого типа.

Одно из возможных объяснений снижения амплитуды первоначального скачка на кинетических кривых накопления ОНи-продуктов (Рис. 3) может состоять в том, что фермент существует в двух конформациях. В начальный момент времени часть фермента существует в конформации (Е1), энергетически менее выгодной, но более активной дня разрезания ОНи-субстрата; другая часть фермента существует в конформации (Е2), энергетически более выгодной, но намного менее активной для разрезания данного субстрата. Менее активная форма фермента может либо непосредственно участвовать в формировании начального фермент-субстратного комплекса, либо находиться в равновесии с более активной формой. Поэтому как процесс формирования комплекса Е2 с субстратом, так и конформационный переход Е2 в Е1 сильно смещены в обратную сторону. Таким образом, в начальный момент времени (Рис. 3, фаза 1) при использованных концентрациях субстратов -15% фермента АРЕ1 и его мутантных форм находятся в каталитически активном фермент-субстратном комплексе, и процесс накопления продукта лимитируется скоростью химического разрезания ОНи-субстрата ферментом, существующим в более активной конформации Е1. В течение второй фазы (Рис. 3) накопление продукта лимитируется либо скоростью сформирования комплекса менее активной формы Е2 с ОНи-субстратом, либо конформационным переходом формы Е2 в форму Е1. В течение третьей фазы (Рис. 3) накопление продукта лимитируется скоростью распада комплекса фермента с продуктом. По-видимому, диссоциация фермента из комплекса с продуктом является лимитирующей стадией всего ферментативного процесса.

5. Изменение интенсивности флуоресценции 2-аминопурнна, введённого в Б1Ш-субстраты, в ходе взаимодействия АРЕ1 с этими субстратами

Была исследована динамика конформационных превращений в ДНК-субстрате, содержащем остаток ОНи, в ходе ферментативного процесса путем регистрации изменения интенсивности флуоресценции остатка 2-аРи, располагавшегося в субстрате либо с 5-, либо с З'-стороны от РНи.

При связывании АРЕ1 с неповреждённой ДНК ((2-аРи)СЛЗ) не было обнаружено никаких изменений интенсивности флуоресценции 2-аРи во времени (данные не представлены). В то же время, при взаимодействии ферментов с субстратом (2-аРи)ОНи/С на кинетических кривых можно выделить три фазы изменения интенсивности флуоресценции остатка 2-аРи (Рис. 5). В начальной быстрой фазе (для АРЕ1 в буфере N111 < 0,2 с; для АРЕ1 в буфере ВЕЯ < 1 с; для АРЕ1К98А < 20 с; для ЫД61АРЕ1 < 30 с) интенсивность флуоресценции остатков 2-аРи увеличивалась и выходила на промежуточное плато. Эти начальные отрезки возрастания интенсивности

флуоресценции остатков 2-аРи по времени соответствовали отрезкам на Рис. 3 (Фаза 1), на которых происходило первоначальное накопление продуктов разрезания [,2Р]-меченого субстрата, содержащего БЬШ, то есть соответствовали химическому разрезанию 01Ш-субстрата ферментом, находящимся в более активной конформации. Вторая фаза увеличения интенсивности флуоресценции наблюдалась до -1000 с для АРЕ1, до -4000 с для АРЕ1К98А и до -2000 с для ЫД61АРЕ1 (Рис. 5) и соответствовала изменению конформации продукта в комплексе с ферментом. Далее протекала третья фаза, которая соответствовала третьей фазе медленного накопления продуктов разрезания [32Р]-меченого ОНи-субстрата на Рис. 3, то есть диссоциации фермента из стабильного комплекса с продуктом.

Рис. 5. Изменение интенсивности флуоресценции остатков 2-аРи при взаимодействии АРЕ1 (А, Б), АРЕ1К98А (В) и МД61АРЕ1 (Г) с субстратом (2-аРи)ЭНи/0 (1 мкМ) в буферах ВЕК (А) и N01 (Б, В, Г) от времени. Гладкие кривые теоретическая подгонка. Концентрации ферментов приведены на правой оси.

Врмм,а

В случае взаимодействия АРЕ1 с субстратом DHU(2-aPu)/G (Рис. б А, Б), у которого остаток 2-аРи находится с З'-стороны от DHU, увеличение интенсивности флуоресценции остатков 2-аРи в первой фазе (< 0,2 с) (Рис. 6Б) соответствует быстрому участку (Фаза 1) на Рис. ЗБ, на котором происходит первоначальный скачок в накоплении продуктов разрезания [з:Р]-меченого DHU-субстрата, то есть быстрой стадии разрезания субстрата ферментом. Во второй фазе (< 10 с) (Рис. 6А) происходит изменение конформации продукта разрезания в комплексе с АРЕ1. В третьей фазе (< 1000 с) (Рис. б А), где наблюдается медленное увеличение интенсивности флуоресценции с выходом на плато, происходит ещб одно изменение конформации продукта в комплексе с АРЕ1. При этом образуется стабильный комплекс фермента с продуктом, концентрация которого достигает равновесия на отрезке времени до 1000 с. Третья фаза на Рис. 6А соответствует второй фазе на Рис. 5Б.

Рис. 6. Изменение интенсивности флуоресценции остатков 2-аРи при взаимодействии АРЕ1 с субстратом DHU(2-aPu)/G (1 мкМ) в буфере NIR от времени. Гладкие кривые - теоретическая подгонка. А - Полная кинетическая кривая; Б - начальный участок кинетической кривой,

представленный в увеличенном масштабе.

[АРЕ11, ычМ

[АРЕ1], шН

0,79

1 10 Время, с

100 1000

0,0 0,2 Время, С

б. Изменение интенсивности флуоресценции остатков триптофана в ходе взаимодействия АРЕ1 с неповреждённым лигнндом

Была исследована динамика конформационных превращений в ферментах путем регистрации изменения интенсивности флуоресценции Тгр на временах, не превышающих 10 с, что исключает выгорание белка.

При исследовании неспецифического связывания трёх форм АРЕ1 с ДНК использовали неповреждённый 30-звенный ДНК-лиганд (С/О) (Рис. 7).

А В Д

«.01 1.1 1 0.0' 0,1 « 1,1 4 1( Врмм, о Врм.« Врмм. •

Рис. 7. Изменение интенсивности флуоресценции остатков Тгр при взаимодействии ферментов (1 мкМ) АРЕ1 (А, Б), АРЕ1К98А (В, Г) и МД61АРЕ1 (Д, Е) с ¿/¿-лигандом в буферах ВЕЯ (А, В, Д) и N111 (Б, Г, Е) от времени. Гладкие кривые -теоретическая подгонка.

По-видимому, начальное падение интенсивности флуоресценции на кинетических кривых (Рис. 7) отражало образование начального неспецифического фермент-субстратного комплекса. Дальнейшее изменение интенсивности флуоресценции соответствовало изомеризации начального

комплекса. Такое двухстадийное связывание описывалось кинетической Схемой 1, содержащей две обратимые стадии. Таким образом, полученные экспериментальные данные

свидетельствуют о том, что при взаимодействии АРЕ1 с неповреждённым E+S ДНК-лигандом после образования начального комплекса (ES1) фермент

.bind

:(ES)1

£ С

(ES)2

Схема 1

изменяет свою конформацию. В результате обработки кинетических кривых в соответствии со Схемой 1 были получены значения кинетических параметров процессов взаимодействия АРЕ1, АРЕ1К98А и ЫД61АРЕ1 с С/О-лигандом (Таблица 3). В ряде случаев значения соответствующих констант скорости различны в разных буферах. Этот факт указывает на влияние рН и концентрации ионов М§5+ на активность фермента.

Таблица 3. Константы скорости реакций, входящих в кинетическую Схему 1, для

Буфер кшл (vr'c1) xlO"6 (с'1) ¿ES Ниш (с1) Off

BER АРЕ1 11±1 200±10 16±0,1 80±1

АРЕ1К98А 2,0±0,1 78±2 8,3±0,1 59±1

NA61APE1 6,2±0,1 50±1 4,3±0,1 55±1

NIR АРЕ1 0,44±0,01 12±1 0,82±0,01 1.5±0.1

АРЕ1К98А Э,8±0,1 71±1 0,23±0,01 28±0,2

NA61APE1 6,6±0,1 10±1 0,28±0,01 0,10*0,01

7. Изменение интенсивности флуоресценции остатков триптофана в ходе взаимодействия АРЕ1 с субстратом, содержащим DHU

Была исследована динамика конформационных превращений в ферментах АРЕ1, АРЕ1К98А и NA61APE1 путСм регистрации изменения интенсивности флуоресценции Tip в ходе взаимодействия с DHU-содержащим субстратом (DHU/G).

На кинетических кривых в случае АРЕ1 в буфере BER (Рис. 8А) и мутантных форм фермента в буфере NIR (Рис. 8В, Г) наблюдалось сначала резкое падение интенсивности флуоресценции Tip (в случае АРЕ1 до SO мс; в случае АРЕ1К98А для концентраций субстрата 0,75 мкМ, 1 мкМ до 0,1 с, для концентраций 1,25 мкМ, 1,5 мкМ, 2 мкМ до 1 с; в случае NA61APE1 до 1 с), что, вероятно, соответствовало образованию комплексов ферментов в более активной конформации El с субстратом и изомеризации этих комплексов. Затем в случае АРЕ1 в буфере BER происходило небольшое возрастание интенсивности флуоресценции белка с выходом на плато, а в случае мутантных форм фермента наблюдалось более медленное снижение интенсивности флуоресценции. Это изменение интенсивности флуоресценции совпадало по времени с начальным увеличением интенсивности флуоресценции (2-aPu)DHU/G (Рис. 5, фаза 1), то есть

соответствовало 1-ой быстрой фазе разрезания субстрата. На кинетических кривых в буфере NIR интенсивность флуоресценции Тгр двухфазно снижалась (Рис. 8Б). Сравнение кинетических кривых, представленных на Рис. 8Б, с кинетическими кривыми, представленными на Рис. 5Б, б, позволило сделать вывод о том, что первая стадия процесса взаимодействия АРЕ1 с субстратом DHU/G в буфере NIR (Рис. 8Б) соответствует образованию комплекса фермента (El) с субстратом, вторая стадия -изменению конформации белка в комплексе с продуктом ферментативной реакции, происходящему уже после каталитической стадии. Константы скорости прямой и обратной реакций стадии образования фермент-субстратного комплекса к^ *) представлены в Таблице 5. Константы

скорости прямой и обратной реакций стадии изомеризации фермента в комплексе с продуктом составляют к^тт * = 1,1 с"', j♦ = 1,3 с'1,

соответственно.

Рис. 8. Изменение интенсивности флуоресценции остатков Тгр при взаимодействии ферментов (1 мкМ) АРЕ1 (А, Б) , АРЕ1К98А (В) и ЫД61АРЕ1 (Г) с субстратом БНи/О в буферах ВЕЯ (А) и ЫШ. (Б, В, Г) от времени. Гладкие кривые теоретическая подгонка.

8. Кинетический механизм АРЕ1 в процессе инцизионной репарации

нуклеотидов

На основании полученных данных была предложена кинетическая схема ферментативного процесса, описывающая механизм превращения субстрата, содержащего остаток DHU, ферментом АРЕ1 в процессе инцизионной репарации нуклеотидов (Схема 2). В начальный момент времени часть фермента находится в более активной для разрезания DHU-субстрата конформации El, тогда как другая часть фермента существует в менее активной конформации Е2. Менее активная форма фермента Е2 может либо непосредственно участвовать в формировании начального фермент-субстратного комплекса (ES)1, либо находиться в медленном равновесии с

более активной формой £1. Фермент в более активной конформации Е1 быстро образует начальный фермент-субстратный комплекс (Е5)1, который подвергается двум конформационным переходам в (ЕБ)2 и (ЕБ)3. Затем протекает быстрый гидролиз 5'-фосфодиэфирной связи субстрата, вслед за которым происходят две стадии конформационых превращений комплекса фермента с продуктом ферментативной реакции. После этого следует лимитирующая стадия диссоциации фермента из стабильного комплекса с продуктом. Поэтому регистрируемые кинетические кривые представляют собой суперпозицию превращений двух форм фермента Е1 и Е2.

Е2

^ I ьот ¡лот с|11 Р ¡^лч

гсиь»«1 ^ (ЕЯ)2 ^ * ► (ЕР)1 =г—~(ЕР)2^—~(ЕР)3^--- Е+Р

"" .1 N2 iv.nl

Е1 - К,„

Схема 2

Каждая кинетическая кривая, полученная для процессов взаимодействия ферментов с ЭНи-содержащими субстратами (Рис. 3,5,6,8), была количественно обработана в соответствии со Схемой 2 и с тем числом кинетических стадий, которое удалось зафиксировать на данной кривой. Полученные кинетические параметры представлены в Таблицах 4, 5 для фермента дикого типа и в Таблице 6, для мутантных форм АРЕ 1 ДЫб! и АРЕ1К98А, соответственно.

Таблица 4. Константы скорости реакций, входящих в кинетическую Схему 2, для

БНи/С (Рис. 8А) [33Р]-ВНи/С' (Рис. ЗА) (2-аРи)ОНи/С' (Рис. 5А)

(М-'с"1) (38±0,1)*106

кУ (с"1) 131±0,2

(с ') 145±0,6

А»' — (с-1) Зб±0,2

(32±3)х10"4

¿"«(с-1) 20±0,1 15±0,7

к? "от (с ') (1б±0,б)х10'4

(с1)1 (22±2)*10"6 (18±0,2)*10'6

субстрата, составляла 15% от его исходной концентрации.

1В эначения константы А£Р(1|и вносит дополнительную ошибку частичная инактивация фермента при длительной инкубации.

Таблица 5. Константы скорости реакций, входящих в кинетическую Схему 2, для процесса взаимодействия АРЕ1 с субстратами, содержащими DHU, в буфере NIR.

DHU/G (РИС. 8Б) ["PJ-DHU/G1 (Рис.ЗБ) {[и P]-(2-aPu)DHU/G}1 (2-aPu)DHU/G' (Рис. 5Б) DHU(2-aPUyG' (Рис. 6)

¿^«♦(м-У) (2,9±0,1)х106

18±1

*bin" (с1) inlet 4 ' (160±20)х10-4 {(250±20)х104)

км (с-1) 49±10 53±4

£ EP Uom (с-1) 0,56±0,1

¿ЕР ¡.on, (С"1) ^О.З^К)-4 (27±1)* 10"4

F*" (с"1)» (13±3)х10-6 {(22±3)*10'й} (îSiO.Oxio-6

• См. Таблицу 4.

Таблица 6. Константы скорости реакций, входящих в кинетическую Схему 2, для процессов взаимодействия NÄ61APE1 и АРЕ1К98А с субстратами, содержащими DHU, в буфере NIR.__

NAôlAPEl APE1K98A

DHU/G (Рис. 8Г) ["Pl-DHU/C.1 (Рис. ЗГ) (2-ttPu)DHU/G' (Рис. 5Г) DHU/G (Рис. 8B) f32P]-DHU/G' (Рис. 3B) (2-aPu)DIIU/G (Рис. SB)'

¿^■"»(М-'с"') (4,3±0,01)*106 (9£±0,l)* 10'

I3±0,0I 81±!

tESb«.™ (с1) он l,6±0,01 4,1±0,1

LESIvkb (С1) °ff 1,6±0,01 13±0,4

lESÎucra "on ' l,7±0,l

LES2non (с"1) off 2,2±0,1

¿bind(c') iniçl v ' (llri.DxIO"1 (l,9±0,6)*10'4

0,ll±0,01 0,10±0,01 0,10±0,01 0,20±0,0l 0,22±0,03 0,30±0,01

i2EP,,om(c"') (T^iO^OxlO-4 (4,4±0,7)x 10"1

/с" "-(с'')1 (9,4±1,1)*10'6 (9,5±l,7)xl0' (12±5)* 10"'

' См. Таблицу 4.

9. Изменения интенсивности флуоресценции остатков триптофана в ходе взаимодействия АРЕ1 с F- и АР-субстратами

Для определения кинетического механизма взаимодействия АРЕ1 с субстратом в процессе BER в настоящей работе была исследована динамика конформационных превращений в АРЕ1 (Рис. 9), АРЕ1К98А (Рис. 10А, Б) и ЫД61АРЕ1 (Рис. 10В, Г) при их взаимодействии с субстратами F/G и AP/G. При этом регистрировались изменения интенсивности флуоресценции остатков триптофана белков.

Рис. 9. Изменение интенсивности флуоресценции остатков Тгр при взаимодействии АРЕ1 (1мкМ) с субаратами F/G (А, В) и AP/G (Б) в буферах BER (А, Б) и NIR (В) от времени. Гладкие кривые - теоретическая подгонка. Концентрации субстратов приведены на правой оси.

Рис. 10. Изменение

интенсивности флуоресценции остатков Тгр при взаимодействии АРЕ1К98А (А, Б) и NAâlAPEl (В, Г) с субстратами F/G (А, В) и AP/G (Б, Г) в буфере BER от времени. Концентрация ферментов составляла 1 мкМ (А, Б, Г) и 1,5 мкМ (В).

Начальное падение интенсивности флуоресценции на кинетических кривых (Рис. 9, 10) отражает стадии образования начального фермент-субстратного комплекса и изомеризации этого комплекса. Таким образом, можно заключить, что при связывании с субстратом, содержащим природный АР-сайт или его аналог, АРЕ1 подвергается индуцированной конформационной подгонке. Небольшое возрастание интенсивности флуоресценции с выходом на плато в случае фермента дикого типа и МД61АРЕ1, а также перегиб на кинетических кривых в случае АРЕ1К98А были отнесены нами к стадии гидролиза З'-фосфодюфирной связи субстрата. Дальнейшее медленное падение интенсивности флуоресценции, зарегистрированное на кинетических кривых в случае АРЕ1К98А, по-видимому, соответствовало стадии изомеризации фермента в комплексе с продуктом реакции. На основании полученных данных предложена кинетическая схема, описывающая механизм действия фермента АРЕ1 в процессе ВЕЯ (Схема 3). Данная схема включает в себя две обратимые

стадии (стадию образования начального фермент-субстратного комплекса и стадию его изомеризации), необратимую стадию гидролиза 5'-фосфодиэф ирной связи субстрата, обратимую стадию изомеризации фермента в комплексе с продуктом реакции и обратимую стадию диссоциации фермента из комплекса с продуктом.

Е + S ~-- (ES) 1 =--- (ES)2 —

.bmJ >.S1 mm

"oir *aV

(EP)I

(EP)2 ~

E + P

Схема 3

Каждая кинетическая кривая (Рис. 9, 10) была количественно обработана в соответствии с предложенной кинетической схемой и с тем числом кинетических стадий, которое удалось зафиксировать на данной кривой. Полученные значения констант скорости для процессов взаимодействия ферментов с субстратами F/G и AP/G представлены в Таблицах 8 и 9.

Из полученных для АР- и F- субстратов экспериментальных данных невозможно выяснить, сколько конформаций имеет АРЕ1 в начальный момент времени. Можно лишь предположить, что если фермент находится в двух конформационных формах, то конформационный переход сильно смещён в сторону формы, активной для разрезания этих субстратов.

Таблица 8. Константы скорости реакций, входящих в

кинетическую Схему 3, для процесса взаимодействия АРЕ1 с субстратами, содержащими Р и АР-сайт.

Буфер NIR . Буфе pBER

F/G F/G AP/G

кьм (M-V) (0,23±0,01)x 108 (3,8±0,l)*10e (1,8±0,1)*10*

С"') 4,9±0,1 79±1 120±10

tESluom (с ') 24±1 59±1 18±1

.ESliiore fc ') K°ff V ' 68±1 18±1 32±1

rl(c-') ),0±0,1 68±1 97±1

Таблица 9. Константы скорости реакций, входящих в кинетическую Схему 3, для процессов взаимодействия АРЕ1К98А и ЫД61АРЕ1 с субстратами, содержащими Р и

APE1K98A NA61APE1

F/G AP/G F/G AP/G

¿bmd (M->C-1) (3,7±0,1)*10* (2,0±0,l)*10s (1,6±0,1)*108 (2^0,1)* 10"

С (c"') 38±1 492±2 7,3 ±0,5 34±1

30±1 289±1 15±1 38±1

310±1 355±2 58±1 4,2±0,1

(c') 5,5±0,1 58±1

(C-1) 2,7±0,l

.El'i.om 1,5±0,1

1Г.

10. Особенности взаимодействия АРЕ1 с субстратами, содержащими

DHU и АР-сайт

В соответствии с моделью «конформационной селекции» (Ма В. et al., 2002; Ма В. et al., 2010) все белки изначально существуют в динамическом равновесии между различными конформационными формами, связывающими различные лиганды. Результаты, полученные в настоящей работе, выявили тот факт, что «конформационная селекция» присутствует в процессе связывания АРЕ1 с DHU-субстратом. Получено, что АРЕ1 существует по меньшей мере в двух конформациях, находящихся в равновесии. Показано, что фермент в комплексах с субстратами, содержащими DHU, AP-сайт и F, подвергается дальнейшим изменениям конформации. Эти данные указывают на существование «индуцированной конформационной подгонки фермента и субстрата» при образовании комплексов АРЕ1 с ДНК. Согласно модели «индуцированного соответствия» (Koshland D.E. Jr., i960), после образования начального комплекса с субстратом фермент подвергается конформационным изменениям перед каталитической стадией. Исходя из данных рентгеноструктурного анализа, АР-ДНК, связанная с АРЕ1, изогнута на ~35°, AP-сайт при этом вывернут из спирали. Можно предположить, что наблюдаемые в настоящей работе изменения конформации фермента после образования начального фермент-субстратного комплекса приводят к изгибанию ДНК и выворачиванию AP-сайта или DHU из спирали. При этом образуются каталитически активные фермент-субстратные комплексы, в которых происходит гидролиз 5'-фосфодиэфирной связи субстратов. В то же время, в работе показано, что после образования комплекса с неповреждённой ДНК АРЕ1 также меняет свою конформацию. Можно предположить, что, двигаясь по ДНК, АРЕ1 меняет свою конформацию, непрерывно пытаясь образовать каталитически активный комплекс. Такой комплекс ферменту удаётся образовать лишь при взаимодействии с сайтами ДНК, которые содержат повреждения, являющиеся субстратами для АРЕ1. Таким образом, механизм образования комплекса АРЕ1 с ДНК-субстратом, вероятно, представляет собой комбинацию моделей «конформационной селекции» и «индуцированного соответствия». Активный центр фермента достаточно пластичен для того, чтобы связывать такие различные субстраты, как AP-сайт и DHU.

Полученные в работе данные указывают на то, что комплексы АРЕ1 с продуктами разрезания субстратов, содержащих DHU, AP-сайт и F, стабильны. Ранее (Mol D.C. et al., 2000) было показано, что фермент АРЕ1 структурно оптимизирован для того, чтобы удерживать расщеплённую ДНК, содержащую AP-сайт. Результаты, полученные в настоящей работе, позволяют предположить, что структура данного фермента также оптимизирована для того, чтобы удерживать расщеплённую ДНК, содержащую остаток DHU. По-видимому, существование прочного комплекса между АРЕ1 и продуктами разрезания субстратов обеспечивает

координированное присоединение других белков, участвующих в репарации, к субстратам и передачу субстратов от одного фермента к другому.

Кроме того, данная работа показала, что скорость гидролитического разрезания ДНК-субстрата, содержащего DHU, ферментом АРЕ1 в процессе NIR сопоставима по величине со скоростью разрезания ДНК-субстрата, содержащего AP-сайт, в процессе BER (Таблицы 5, 8). Это свидетельствует о том, что NIR может являться биологически значимым процессом.

11. Влияние замены К98А на кинетические характеристики АРЕ1

Полученные данные показывают, что при образовании начального неспецифического фермент-субстратного комплекса мутация К98А практически устраняет наблюдавшиеся для APEI большие различия между значениями соответствующих констант и определёнными в двух

разных буферах. Более того, замена Lys98 на Ala затрудняет индуцированную подгонку фермента в комплексе с неповреждённой ДНК.

Кроме того, мутация К98А значительно затрудняет индуцированную подгонку структуры фермента в комплексе с F-содержащим субстратом. Эта мутация в 12 раз понижает скорость гидролиза 5'-фосфодиэфирной связи субстрата, содержащего F. В случае взаимодействия фермента с ДНК, содержащей природный AP-сайт, замена К98А существенно понижает стабильность начального комплекса (ES)1 и ускоряет конформационные переходы в комплексе фермента с AP-субстратом. Таким образом, АРЕ1 по-разному взаимодействует с AP-сайтом и остатком тетрагидрофурана, который широко используется в качестве стабильного аналога АР-сайта.

Получено, что в процессе N1R замена лизина-98 на аланин значительно замедляет активацию менее активной формы фермента Е2 (*¿¡¡J) и в 200 раз

снижает скорость гидролиза 5'-фосфодиэфирной связи DHU-субстрата. Более того, эта аминокислотная замена замедляет конформационную перестройку комплекса фермента с продуктом разрезания DHU-субстрата.

На основании того, что мутация К98А оказывает влияние на разрезание и DHU-субстрата, и F-субстрата, был сделан вывод, что двухвалентный ион металла, координированный в сайте А, для разрезания DHU-субстрата необходим так же, как и для разрезания AP-субстрата. Вероятно, АРЕ1 использует один и тот же активный центр для катализа разрезания субстратов, содержащих DHU и АР-сайт.

12. Влияние домена Ref-1 на кинетические характеристики АРЕ1

Полученные данные свидетельствуют о том, что отсутствие домена Ref-1 в АРЕ1 приводит к увеличению стабильности начальных комплексов фермента как с неповреждённой ДНК, так и с ДНК, содержащей AP-сайт и F. При образовании начального неспецифического фермент-субстратного комплекса, как и в случае замены К98А, мутация NA61 устраняет наблюдавшиеся для АРЕ1 большие различия между значениями константы

, полученными в двух разных буферах. Следовательно, структура АРЕ1

оптимизирована таким образом, что скорость начального связывания АРЕ1 с неповреждённой ДНК сильно зависит от концентрации ионов Mg2" и pH. Более того, как и замена К98А, мутация NA61 замедляет индуцированную подгонку фермента в комплексе с неповреждённой ДНК.

В процессе BER домен Ref-1 влияет на скорость изомеризации начального комплекса и стабильность второго каталитически активного фермент-субстратного комплекса, причём это влияние не одинаково в случае F- и АР- субстратов. В процессе NIR домен Ref-1 участвует в специфическом узнавании повреждённой ДНК, содержащей DHU, ускоряет активацию менее активной формы фермента Е2 гидролиз 5'-фосфодиэфирной связи

DHU-субстрата и информационную перестройку комплекса фермента с продуктом разрезания DHU-субстрата. Домен Ref-1 немного повышает сродство АРЕ1 к продуктам разрезания DHU-субстрата и F-субстрата. Опираясь на эти данные можно предположить, что этот домен делает передачу расщеплённого продукта последующим ферментам, участвующим в репарации, более эффективной.

Присутствие домена Ref-1 в АРЕ1 приводит к ускорению гидролиза 5'-фосфодиэфирной связи DHU-субстрата в 500 раз, в то время как значительного влияния на скорость гидролиза F-субстрата не оказывает. Исходя из этого, можно заключить, что в процессе эволюции АРЕ1 вместе с доменом Ref-1 приобрёл способность осуществлять эффективную инцизионную репарацию нуклеотидов.

ВЫВОДЫ

1. Впервые установлен детальный кинетический механизм ферментативной реакции, катализируемой апуриновой/апиримидиновой эцдонуклеазой человека АРЕ1 в процессе инцизионной репарации нуклеотидов (NIR).

• Показано, что АРЕ1 в свободном состоянии существует по меньшей мере в двух конформациях, находящихся в равновесии и обладающих разной способностью связывать ДНК. При этом связывание ДНК-субстрата ферментом происходит по механизму «конформационной селекции».

• Лимитирующей стадией процесса NIR является диссоциация фермента из комплекса с продуктом. Продукт разрезания DHU-субстрата может выступать конкурентным ингибитором АРЕ1.

AP-сайт, в процессе BER, что свидетельствует о NIR, как о биологически значимом процессе.

2. Показано, что АРЕ1 изменяет свою конформацию при образовании комплексов со специфическими и неспецифическими ДНК, а в комплексах с субстратами, содержащими DHU, AP-сайт или тетрагидрофуран, подвергается изменениям конформации перед стадией гидролиза 5'-фосфодиэфирной связи, что свидетельствует об «индуцированной конформационной подгонке» молекулы фермента.

3. Установлено, что замена остатка Lys98 на аланин и удаление домена Ref-1 (61 аминокислота с N-конца) влияют на кинетические характеристики ферментативных процессов с участием АРЕ 1.

• Мутация Lys98Ala оказывает более сильное влияние на катализ в процессе NIR, чем в процессе BER.

• Присутствие домена Ref-1 в АРЕ1 приводит к уменьшению стабильности начальных комплексов АРЕ1 как с неповреждённой ДНК, так и с ДНК, содержащей F или AP-сайт; специфическому узнаванию повреждённой ДНК, содержащей DHU; ускорению каталитической стадии в процессе N1R и увеличению стабильности комплекса фермента с продуктом, что может способствовать эффективной передаче расщеплённого продукта последующим ферментам, участвующим в процессах репарации NIR и BER.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Тимофеева, H.A., Коваль, В.В., Федорова, О.С. Кинетический механизм действия фермента АРЕ1 в эксцизионной репарации оснований // Вестник НГУ. - 2008. - Т. 6. - С. 90-95.

2. Timofeyeva, N.A., Koval, V.V., Rnorre, D.G., Zharkov, D.O, Saparbaev, M.K., Ishchenko, A.A., Fedorova, O.S. Conformational dynamics of human AP endonuclease in base excision and nucleotide incision repair pathways // J. Biomol. Struct. Dyn. - 2009. - V. 26. - P. 637-652.

3. Тимофеева, H.A., Коваль, B.B., Ищенко, A.A., Сапарбаев, M.K., Федорова, О.С. Кинетический механизм действия апуриновой-апиримидиновой эндонуклеазы человека в процессе инцизионной репарации нуклеотидов // Биохимия. - 2011. - Т. 76. - С. 333-344.

4. Timofeyeva, N.A., Koval, V.V., Ishchenko, A.A., Saparbaev, M.K., Fedorova, O.S. Lys98 substitution in human AP endonuclease 1 affects the kinetic mechanism of enzyme action in base excision and nucleotide incision repair pathways // PLoS ONE. - 2011. - V. 6. - e24063.

2012091128

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Тимофеева, Надежда Александровна

Список сокращений

Введение 8 1. Взаимодействие АР-эндонуклеазы человека АРЕ1 с ДНК (Обзор литературы)

1.1. Связывание субстрата, содержащего АР-сайт

1.1.1. Влияние ионов на связывание АРЕ1 с ДНК

1.1.2. Особенности взаимодействия АРЕ 1 с субстратом и продуктом

1.1.3. Определение потенциальных контактов АРЕ1 с ДНК, содержащей АР-сайт

1.1.4. Стехиометрия связывания АРЕ1 с ДНК

1.1.5. Механизм поиска АР-сайта

1.2. Исследование кинетики взаимодействия АРЕ1 с АР-сайтом и его аналогами в стационарных условиях

1.2.1. Влияние локальной структуры ДНК-субстратов, содержащих АР-сайт или его аналоги

1.2.2. Особенности узнавания АР-сайта ферментом АРЕ

1.3. Проявление АР-эндонуклеазной активности АРЕ1 по отношению к альтернативным субстратам 42 1.3.1. АР-сайты в одноценочечной ДНК. Регуляция активности АРЕ концентрациями ионов иК*~ и ренликативным белком А (ЯРА)

1.3.2. АР-сайты в нуклеиновых кислотах сложной структуры: частично двуцепочечной ДНК, вилкоподобной ДНК, ДНК с расплетенным участком двойной спирали, ДНК/РНК-гибридах, псевдотриплексных структурах, одноценочечной РНК. Влияние АТР и последовательности субстрата на активность фермента 50 1.4. Выявление аминокислотных остатков АРЕ1, участвующих в узнавании и превращении АР-сайта

1.4.1. Роль остатка Asn212 в узнавании субстрата

1.4.2. Роль остатка Asp219 в узнавании субстрата. Влияние остатков Asp219 и Glu96 на каталитическую активность

1.4.3. Внутреннее подавление мутации Е96А второй мутацией K98R

1.4.4. Роль остатков Asp308, Asp283 и His

1.4.5. Роль остатка Asp210 в эндонуклеазной активности

1.4.6. Роль остатков Glu96, Asp210, His309 и Cys

1.4.7. Замены аминокислотных остатков, проникающих в спираль ДНК

1.4.8. Влияние контактов с сахарофосфатным остовом с 3'- стороны от AP-сайта на эффективность связывания субстрата и продукта

1.4.9. Влияние мутаций в петле а8 АРЕ1 на эффективность связывания субстрата и каталитическую активность

1.4.10. Делеция 33-х аминокислотных остатков с N-конца АРЕ

1.4.11. Необычная роль остатка Cys

1.4.12. Роль остатков Туг 128, Туг 171 и Туг269 в катализе 1Ъ

1.5. Кинетические исследования АРЕ1 в предстационарных условиях

1.5.1. Предстационарная кинетика взаимодействия с аналогом АР-сайта

1.5.2. Конформационные переходы eAPEl и его мутантной форме

АРЕ1Y171F-P173L-N174К в процессе репарации АР-сайта

1.6. Участие АРЕ1 в процессе инцизионной репарации нуклеотидов (NIR)

1.6.1. З^-бензэтено-йС - субстрат АРЕ1 в процессе NIR

1.6.2. Оптимальные условия для проявления активности NIR белком АРЕ1. Конформационные изменения АРЕ1, индуцированные ионами Mg2*

1.6.3. Кинетические параметры и специфичность к основаниям в процессе NIR

1.6.4. Основные продукты окисления цитозина — субстраты АРЕ 1 в процессе NIR

1.6.5. Роль окислительно-восстановительного домена АРЕ1 в процессе

1.6.6. Роль остатков Lys98, Asp308 и Argl85 в процессах BER и NIR

Введение Диссертация по биологии, на тему "Кинетический механизм действия апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы человека APE1 в процессе инцизионной репарации нуклеотидов"

Ионизирующее и ультрафиолетовое излучение, различные химические мутагены постоянно оказывают воздействие на клетки живых организмов. В процессах клеточного метаболизма образуются активные формы кислорода. Всё это, в первую очередь, действует на клеточную ДНК, вызывая её повреждения, что приводит к гибели клетки, раковым и аутоиммунным заболеваниям, ускоряет процессы старения. К настоящему времени идентифицировано около ста различных типов повреждений оснований и сахарофосфатного остова. Для исправления повреждений ДНК и сохранения стабильности генома в клетках всех организмов существуют различные ферментативные системы репарации. Небольшие повреждения азотистых оснований ДНК в основном удаляются в процессе эксцизионной репарации оснований (BER) [1]. Данный путь репарации начинается с действия ДНК-гликозилаз — ферментов, удаляющих повреждённые или неправильно спаренные основания с образованием апуриновых/апиримидиновых сайтов (АР-сайтов). АР-сайты возникают также в результате спонтанной потери оснований (в основном пуринов) [1-3]. В процессе BER ДНК разрезается с 5'-конца а-аномера АР-сайта с помощью апуриновых/апиримидиновых эндонуклеаз (АР-эндонуклеаз) (Рис. 1). В организме человека основной АР-эндонуклеазой является белок АРЕ1 (35,5 кДа) [4, 5]. Репарация некоторых повреждений оснований может проходить под воздействием одних лишь АР-эндонуклеаз без участия ДНК-гликозилаз [6-11] в процессе инцизионной репарации нуклеотидов ("nucleotide incision repair" (NIR)). При этом АР-эндонуклеаза разрезает фосфодиэфирную связь на 5'-конце повреждённого дезоксинуклеотида с образованием на З'-конце разрыва гидроксильной группы, на 5'-конце - фосфатной (Рис. 1). Образование З'-гидроксильной группы делает возможным дальнейший репарационный синтез ДНК. При этом повреждённый свисающий нуклеотид может быть удалён с помощью флэп-эндонуклеазы [12]. В клетках человека репарацию по пути NIR осуществляет АР-эндонуклеаза АРЕ1 [8].

5 I 0 1

О— Р=0 I о о он

О"

АР-эндонуклеаза о— Р=0

Механизм

-X

ВЕЯ

-ОН

N111 но.

N11, V у у\

5оЬС о Ч ч1 ын2 ас!С

ЗгЫ4-бензэтено-с1С 1 Д^6-бензэтено-с1А 1 ,N2-бeнзэтeнo-dG N N ■ 4 N Г ш2 аёА рНз он

I N N ын.

Ме-РаруО

Рис. 1. Схема реакций, катализируемых АР-эндонуклеазами в процессах ВЕЯ или N111. Циклическая форма АР-сайта (Х-ОН) существует в виде равновесной смеси а- и Р-аномеров. В обозначения а-аномеров нуклеозидов введён знак «а», в случае (3-аномеров повреждённых нуклеозидов знак <ф» в обозначениях опущен.

АРЕ1 разрезает фосфодиэфириый остов АР-ДНК по кислотно-основному Бы2(Р) каталитическому механизму с участием двухвалентных катионов металлов. Необходимо, чтобы имели место три события в этой реакции гидролиза: (1) образование в активном центре нуклеофила; (2) нейтрализация и ориентирование отрицательно заряженных атомов кислорода фосфодиэфирной связи мишени и образование переходного состояния; (3) стабилизация продукта реакции - фосфомоноэфирной уходящей группы. Изначально предполагалось, что остаток Шз309 в комплексе с Азр283 действует как главное основание, отнимающее протон от молекулы воды в активном центре для образования требуемого

Л I нуклеофила (Рис. 2, Схема 1) [13]. Ион М§ , оттягивая электронную плотность и ориентируя нужным образом фосфатную группу, стабилизирует переходное состояние и/или поляризует З'-связь Р-О, что усиливает эффективность нуклеофильной атаки. Остаток Аэр210 выступает в качестве донора протона и, таким образом, стабилизирует уходящую группу.

Основываясь на анализе кристаллических структур АРЕ1, была предложена модифицированная схема реакции (Рис.2, Схема2) [14], в которой АБр210 действует как основание, участвующее в образовании нуклеофила в активном центре. Остаток Шз309 ориентирует и поляризует З'-связь Р-О, а Мд2+ стабилизирует уходящую группу.

Позднее была получена новая кристаллическая структура АРЕ1 при рН 7,5, содержащая два двухвалентных иона металла в активном центре [15]. Один из этих ионов находится, в так называемом, сайте связывания металла А, где координируется остатками АБр70 и 01и96. Второй ион расположен в сайте связывания металла Б, который образован боковыми цепями аминокислот Азр210, Азп212 и Шз309. Была предложена еще одна схема реакции, включающая присутствие в активном центре двух ионов Мц2+ (Рис. 2, Схема 3). Ион металла в сайте А принимает участие в стабилизации переходного состояния и З'-уходящей группы. Ион металла в сайте Б, вероятно, стабилизирует гидроксильный ион, который, как полагают, выступает в роли нуклеофила. Этот ион металла также находится в благоприятном положении для нейтрализации отрицательного заряда фосфоранового переходного состояния [13-15]. base

GÎJ9S

АР 5ІІ<*

-О •p—0~ ^ и ô н«зоэ W-л

Asp283 у Asp210 О bas«

А»Ш74 Г 6 - Ma' °

Тр.

АР SI» \7 ç- \p- H / А5П212

H î H"*\

Адф283 / S о Hissa» y V,.^. Asp210 о ы&е

AW174 .1. Ô ••; li'S пій« o

NH,

I о

•-о ■

TV- I

APsi'e M0- p Q-i1—^Aan212 R „, Me

Hii A. V

Asp 283 / ^^ ! О His309 X

V base

Clu96

APste с ^ )

P à 'О'

R H rNH

Asp233 /ЧЛ*

S О Mls3ÛS о t'y0 y) Asp21P I

Aw174 T ^p—- va" 0

H Cj'r»

О r—О

APs"1« \^ çi ОН АЧП212

Asp283 Я

Д7 j ИлЗЭЭ

Asp2ta base

1174 Г .

Asn174

NH, X k o--- -m.

АР site

Амй«2

N-*

AspîBS / \ О НІЗЛ09

WC" 0

Aap210 basa y ивам . Г он

АР site С 7 "fC о/Ч°

R H

Q^o

Аьргез / \ о Hisse« о а"Ч І

S '

Asp219

Схема 1. base о y-/ аиле

И1174 І

NH.

As<I174 Г О"*- Ma 0 Nit,

Р=б' H,N 0

АР «Є \/- 0- ОН ^ As«212 R рГТ* "4,° S

Схема 2. s L.O.J .

AsntM І о*--M/* ° NH»

APs,-C Q HO ?" n X

R »,-"SY о Hts309 J VV/. Asp210 О

Aw2!2

Asp283

Схема 3.

Рис. 2. Предполагаемые схемы АР-эндонуклеазной реакции АРЕ1 [13-15].

Основываясь на результатах моделирования структуры комплексов АРЕ1 с расщеплённой и нерасщеплённой повреждённой ДНК методом молекулярной динамики [16], было высказано предположение о существовании «механизма со смещением металла», в ходе

Лі которого один ион в активном центре фермента смещается из более погружённого положения (сайт Б) в менее погружённое положение (сайт А) во время расщепления субстрата. Был сделан вывод, что оба сайта связывания металла не могут быть заняты одновременно, то есть во время реакции в активном центре присутствует только один ион металла, который перемещается между двумя центрами связывания металла (Рис. 3). В комплексе фермента с субстратом перед разрезанием фосфодиэфирной связи фосфатная группа стабилизирована ионом М§2+, находящимся в сайте Б, и связана водородными связями с остатками Ніз309 и Азп212. Связанная ионом М£2+ молекула воды передаёт протон на А8р210, и образующийся ОН" осуществляет нуклеофильную атаку по атому фосфора (Рис. 3). После расщепления фосфодиэфирной связи образовавшийся 3'-конец цепи ДНК уходит, и ион Мё2+ смещается в сайт А.

А Б

Abasie Site

Рис. 3. Схематическое изображение положений иона металла и лигандов в активном центре АРЕ1 до (А) и после (Б) расщепления фосфодиэфирной связи [16].

Показано [4], что белок АРЕ1 имеет значительную гомологию с ЕхоА из Streptococcus pneumoniae (41%) [17] и экзонуклеазой III (Xth) из Е. coli (28%) [18]. С-концевой район белка Rrpl из Drosophila melanogaster на 53% гомологичен по аминокислотной последовательности белку АРЕ1. [19]. Последовательность АР-эндонуклеазы быка Bapl [20] на 93% идентична последовательности АРЕ1. АРЕ1 содержит на N-конце дополнительную пептидную последовательность длиной в 61 аминокислоту (домен Ref-1), которая не была обнаружена в бактериальных ферментах ЕхоА и экзонуклеазе III (Xth). Таким образом, АРЕ1 состоит из каталитического домена, высококонсервативного в семействе прокариотических и эукариотических ферментов репарации ДНК, и N-концевого домена, который отсутствует в бактериальных гомологах [4, 17, 18]. Домен 11е£-1 содержит сигналы ядерной локализации [4, 5]. Кроме того, этот домен вовлечён в окислительно-восстановительную регуляцию транскрипции [21-23]. Так, восстановленная форма АРЕ1 стимулирует ДНК-связывающую активность окисленных гетеродимеров Роз-1ип, составляющих фактор транскрипции АР-1, и гомодимеров Дип-Дип путём восстановления консервативного остатка цистеина в ДНК-связывающем домене .Тип [21]. Показано, что происходит прямое взаимодействие между цистеинами АРЕ1 и Дип [24]. В эту окислительно-восстановительную активацию вовлечён цистеин-65 фермента АРЕ1 в восстановленной форме. В окисленной форме цистеин-65 образует дисульфидный мостик с цистеином-93. Этот дисульфидный мостик должен быть разорван для проявления белком АРЕ1 окислительно-восстановительной активности [22]. Домен 11е1И, предположительно, необходим для формирования правильной третичной структуры фермента, так как этот домен расположен рядом с Суэ65 [22, 24]. Также показано, что АРЕ1 стимулирует ДНК-связывающую активность р53 и ЫР-кВ по окислительно-восстановительному механизму, хотя для этих факторов транскрипции существуют и альтернативные механизмы стимуляции ферментом АРЕ1 [23, 25].

Идентифицировано 11 природных вариантов фермента АРЕ1, содержащих следующие аминокислотные замены: Ь44С, С>51Н, 057А, 164У, ЬКМЯ, Е126Э, Б148Е, 11237А, 024111, Э2830 и вЗОбА [26]. Показано, что АР-эндонуклеазная активность ферментов АРЕ1, содержащих замены Ь10411, Е1260 или 11237А, понижена на -40-60% по сравнению с активностью фермента дикого типа. АР-эндонуклеазная активность фермента, содержащего замену 02830, вероятно, понижена в 10 раз. Наиболее распространённая замена 0148Е не оказывает влияния на АР-эндонуклеазная активность АРЕ1, также как и замены 0241Я и ОЗОбА.

АРЕ1 является мультифункциональным ферментом, который, кроме эндонуклеазной активности, проявляет 3'—>5'-экзонуклеазную [27], фосфодиэстеразную [28] активности и активность РНКазы Н [29]. Предполагают, что пути ВЕЯ координируются и регулируются белково-белковыми взаимодействиями, а АРЕ1 играет центральную роль в этих взаимодействиях. Так, например, известно, что АРЕ1 является активатором ДНК-гликозилаз [30]. Белок АРЕ1, связанный с повреждённой ДНК, способствует присоединению ДНК-полимеразы Р с образованием тройного комплекса [31]. Была выявлена также умеренная стимуляция фермента АРЕ1 в присутствии полимеразы р [32]. Выдвинуто предположение, что оптимальная каталитическая скорость отдельных ферментов эксцизионной репарации оснований достигается только в присутствии ферментов, вовлечённых в последующие шаги репарационного процесса [30]. Кроме того, показано, что АРЕ1 взаимодействует с флэп-эндонуклеазой 1 (FEN 1) и PCNA [33]. Присутствие АРЕ1 стимулирует также удаление свисающего олигонуклеотида («флэпа») ферментом FEN 1 [33, 34]. АРЕ1 позволяет эффективно завершить репарацию даже в отсутствие PCNA [34]. АРЕ1 также стимулирует последовательное присоединение к повреждённой ДНК ДНК-полимеразы 5 и ДНК-лигазы I и каталитические реакции, осуществляемые этими ферментами [35]. В условиях избытка ферментов (АРЕ1 и pol (3) по отношению к ДНК-субстрату АРЕ1 стимулирует синтез ДНК с вытеснением цепи, катализируемый ДНК-полимеразой р [36]. Помимо этого, АРЕ1 обладает ДНК-экзонуклеазной активностью в отношении неправильно спаренных нуклеотидов на З'-конце разрыва или бреши в молекуле ДНК, а так как АРЕ1 взаимодействует с pol Р в составе тройного комплекса с повреждённой ДНК, этот фермент может выполнять функцию корректора ошибок, допущенных ДНК-полимеразой р [37]. Математическая модель, при разработке которой использовались количественные кинетические параметры действия отдельных ферментов, предполагает, что в процессе репарации АР-сайта и 8-оксогуанина ферменты действуют кооперативно, и при удалении упомянутых повреждений доминирует «короткозаплаточный» путь репарации [38].

К началу выполнения данной работы уже были известны кристаллические структуры АРЕ1 в свободном состоянии [13, 15] и в комплексе с субстратом и продуктом эндонуклеазной реакции, содержащими аналог АР-сайта [14]. Кинетические исследования эндонуклеазной реакции проводились в стационарных условиях, когда начальная концентрация субстрата намного превышала исходную концентрацию фермента. Известно, что в стационарных условиях теряется большая часть информации, касающейся промежуточных элементарных стадий ферментативной реакции [39]. Так, не было данных, свидетельствующих об изменении конформации фермента при взаимодействии с субстратом и в ходе ферментативной реакции. Напротив, из рентгеноструктурного анализа был сделан вывод, что АРЕ1 имеет жёсткую заранее сформированную структуру для узнавания ДНК, содержащей АР-сайт [14]. Однако имелись косвенные данные, указывающие на то, что АРЕ1 может принимать разные конформации [40]. Об этом также свидетельствуют результаты исследований кинетического механизма превращения субстратов, содержащих АР-сайт, в присутствии фермента АРЕ1, опубликованных в литературе к моменту окончания данной работы [41, 42].

Целью настоящей работы являлось детальное изучение кинетического механизма действия АР-эндонуклеазы человека (АРЕ1) в процессе инцизионной репарации нуклеотидов и его сравнение с кинетическим механизмом действия АРЕ1 в процессе эксцизионной репарации оснований. Для этого в предстационарных условиях исследовалась динамика конформационных превращений фермента АРЕ1 и двуцепочечных ДНК-субстратов. Конформационные переходы в белке регистрировались по изменениям интенсивности флуоресценции остатков триптофана (Тгр) [43, 44]. Изменения конформации ДНК-субстратов регистрировались по изменению интенсивности флуоресценции остатков 2-аминопурина (2-аРи), введённых в субстраты [45-49]. В работе применяли метод «остановленной струи», который позволяет смешивать фермент с субстратом и регистрировать изменения флуоресценции в широком диапазоне времени, начиная с миллисекунд [50]. Для исследования механизма неспецифического связывания лиганда ферментом использовали неповреждённую ДНК. Процессы, происходящие в ходе эксцизионной репарации оснований, исследовали, используя ДНК-субстраты, содержащие природный AP-сайт или его синтетический аналог тетрагидрофуран (F). Для изучения механизма действия АРЕ1 в ходе инцизионной репарации нуклеотидов использовали ДНК, содержащую остаток дигидроуридина (DHU). Для обозначения процесса разрезания ферментом АРЕ1 субстратов, содержащих AP-сайт или F, ввели термин «активность BER». Для обозначения процесса разрезания субстрата, содержащего DHU, - термин «активность NIR».

Изучено влияние делеции 61-ой аминокислоты на N-конце АРЕ1 (АРЕ1AN61) и замены лизина в 98-ом положении на аланин (АРЕ1К98А) на конформационную динамику и кинетические параметры действия фермента в процессах BER и NIR. Домен Ref-1 является регулятором транскрипции [21-23]. По-видимому, для проявления активности BER этот домен не важен [8, 22, 24, 51], в то же время предполагается, что этот домен может быть необходимым для проявления активности NIR [8]. Лизин-98, вероятно, принимает участие в координации иона Mg2+ в активном центре фермента, поскольку этот аминокислотный остаток образует водородные связи с карбоксильной группой аспартата-70, который вовлечён в связывание одного из двух ионов Mg2+ [13].

В результате проведённых исследований показано, что фермент АРЕ1 существует, по меньшей мере, в двух конформациях, и ДНК-субстраты, содержащие разные повреждения, узнаются разными формами фермента. Установлен кинетический механизм действия АРЕ1 в процессе инцизионной репарации нуклеотидов и проведено его сравнение с кинетическим механизмом действия в процессе эксцизионной репарации оснований. Выявлены новые особенности кинетического механизма АРЕ1 в процессе эксцизионной репарации оснований. Определены кинетические параметры элементарных стадий каталитических процессов, протекающих по путям N111 и ВЕЯ. Показано, что замена остатка лизина-98 на аланин и удаление домена влияют на кинетические характеристики ферментативных процессов с участием АРЕ1. Получены данные, свидетельствующие о том, что N111, может являться биологически значимым процессом.

1. Взаимодействие АР-эндонуклеазы человека АРЕ1 с ДНК

Обзор литературы)

По оценкам в каждой клетке живых организмов ежедневно происходит образование 1х105 АР-сайтов [52]. Они образуются как под действием ДНК-гликозилаз в процессе эксцизионной репарации оснований, так и в результате спонтанной потери оснований (в основном пуринов) [1-3]. АР-сайты могут блокировать ДНК-репликацию и транскрипцию. В случае, когда репликация всё же идёт, во вновь синтезируемой цепи ДНК напротив АР-сайта преимущественно встраивается аденозин [53], что приводит к однонуклеотидным заменам в ДНК. Очевидно, что репарация АР-сайтов абсолютно необходима для поддержания стабильности генома. В организме человека >95% АР-сайтов исправляются с помощью АР-эндонуклеазы АРЕ1 [54] (Рис. 1). Одной из фундаментальных задач, которую пытались решить исследователи, являлось выяснение механизма обнаружения ферментом АР-сайта. Помимо АР-сайтов АРЕ1 может репарировать некоторые поврежденные основания ДНК, такие как З^-бензэтено-дезоксицитидин [55], 5,6-дигидропиримидины, а-2'-дезоксиаденозин, а-тимидин, а-2'-дезоксицитидин, 5-гидрокси-2'-дезоксиуридин и 5-гидрокси-2'-дезоксицитидин [8, 10, 11]. Отсюда возникает интересный вопрос о том, какова структура активного центра, с помощью которого узнаются эти достаточно объёмные повреждённые основания. Ведь в ферменте АРЕ1 найден только один активный центр. Рентгеноструктурный анализ показал, что фермент должен связывать только а-аномер АР-сайта, который очень плотно упаковывается в активном центре. Это должно исключать связывание оснований ДНК и Р-аномеров АР-сайтов в данном активном центре [13-15]. Поскольку известно, что пути репарации ДНК координируются и регулируются белково-белковыми взаимодействиями, и что АРЕ1 играет центральную роль в этих взаимодействиях [30], знание механизмов действия фермента АРЕ1 поможет составить полную картину репарации повреждений.

Настоящий литературный обзор посвящен результатам исследований эндонуклеазной активности АРЕ1, в которых определялись кинетические характеристики ферментативных процессов, а также параметры стабильности комплексов фермента с лигандами.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Тимофеева, Надежда Александровна

Выводы

1. Впервые установлен детальный кинетический механизм ферментативной реакции, катализируемой апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазой человека АРЕ1 в процессе инцизионной репарации нуклеотидов (NIR).

• Скорость гидролитического разрезания ДНК-субстрата, содержащего 5,6-дигидроуридин, ферментом АРЕ1 в процессе NIR сопоставима по величине со скоростью разрезания ДНК-субстрата, содержащего AP-сайт, в процессе BER, что свидетельствует о NIR, как о биологически значимом процессе.

• Мутация Lys98Ala оказывает более сильное влияние на катализ в процессе NIR, чем в процессе BER.

• Присутствие домена Ref-1 в АРЕ1 приводит к уменьшению стабильности начальных комплексов АРЕ1 как с неповреждённой ДНК, так и с ДНК, содержащей F или AP-сайт, специфическому узнаванию повреждённой ДНК, содержащей DHU, ускорению каталитической стадии в процессе NIR и увеличению стабильности комплекса фермента с продуктом, что может способствовать эффективной передаче расщеплённого продукта последующим ферментам, участвующим в процессах репарации NIR и BER.

Заключение

В представленной работе исследованы кинетические механизмы действия апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы человека АРЕ1 и её мутантных форм АРЕ1К98А и ЫА61АРЕ1 в процессах инцизионной репарации нуклеотидов и эксцизионной репарации оснований. Предложены кинетические схемы взаимодействия фермента с неповреждённой ДНК и ДНК, содержащей БНи, АР-сайт или Р. Получены количественные параметры этих процессов.

АРЕ1 взаимодействует с неповреждённой ДНК двухстадийно: после образования начального комплекса фермент меняет свою конформацию. Вероятно, при этом АРЕ1 пытается сформировать специфический фермент-субстратный комплекс, в котором было бы возможно разрезание ДНК. Вместо такого специфического комплекса образуется лишь второй неспецифический комплекс фермента с лигандом, не способный к расщеплению ДНК.

Исходя из того, что интенсивность флуоресценции Тгр АРЕ1 в процессе второй стадии изомеризации комплекса в двух разных буферах менялась разнонаправлено, был сделан вывод о том, что в процессе изомеризации фермента в комплексе с неповреждённой ДНК конформация АРЕ1 вблизи остатков Тгр меняется по-разному в зависимости от рН и

2+ концентрации ионов .

Получено, что около 100% молекул АРЕ1 активно для связывания ДНК. В то же время, в случае разрезания субстрата, содержащего БНи, ферментом, амплитуда начального скачка на кинетических кривых накопления продуктов разрезания снижена. На основании этих данных был сделан вывод, что фермент существует, по крайней мере, в двух конформационных формах.

Была предложена кинетическая схема превращения субстрата, содержащего остаток БНи, ферментом АРЕ1 в процессе инцизионной репарации нуклеотидов. В начальный момент времени часть фермента существует в конформации (Е1), энергетически менее выгодной, но более активной для разрезания БНи-субстрата, другая часть фермента существует в конформации (Е2), энергетически более выгодной, но намного менее активной для разрезания данного субстрата. Менее активная форма фермента может либо медленно образовывать начальный фермент-субстратный комплекс, либо также медленно превращаться в более активную форму. Фермент в более активной конформации Е1 быстро образует начальный фермент-субстратный комплекс (Е8)1, который подвергается двум конформационным переходам в (Е8)2 и (Е8)3. Затем протекает быстрый гидролиз

5'-фосфодиэфирной связи субстрата, вслед за которым происходят две стадии коиформационых превращений комплекса фермента с продуктом ферментативной реакции. После этого следует лимитирующий процесс высвобождения фермента из стабильного комплекса с продуктом.

Была предложена кинетическая схема, описывающая механизм действия фермента АРЕ1 в процессе эксцизионной репарации оснований. Она включает в себя следующие стадии: образование начального фермент-субстратного комплекса, его изомеризацию, гидролиз 5'-фосфодиэфирной связи субстрата, изомеризацию фермента в комплексе с продуктом реакции и диссоциацию фермента из комплекса с продуктом. Было высказано предположение, что равновесие между конформационно различными формами свободного фермента сильно смещено в сторону формы, активной для разрезания субстратов, содержащих АР-сайт и F. Поэтому, зафиксировать этот конформационный переход не удалось.

Показано, что при связывании АРЕ1 с субстратом, содержащим DHU, имеет место конформационная селекция. Фермент существует в равновесии, по меньшей мере, между двумя конформациями. Такие структурно различные повреждения, как АР-сайт и DHU, связываются различными конформационными формами АРЕ1. Следовательно, структура фермента в области активного центра довольно пластична.

Кроме того, было показано, что фермент в комплексах с субстратами, содержащими DHU, АР-сайт или F, подвергается изменениям конформации перед стадией гидролиза 5'-фосфодиэфирной связи. Таким образом, в исследованных фермент-субстратных комплексах присутствует индуцированная конформационная подгонка. Этот результат опровергает ранее высказанное основанное на рентгеноструктурных данных предположение о том, что АРЕ1 имеет жёсткую, заранее сформированную для связывания АР-ДНК структуру и не подвергается конформационным изменениям в процессе катализа. В настоящей работе было высказано предположение, что изменения конформации фермента после образования начального фермент-субстратного комплекса приводят к изгибанию ДНК и выворачиванию AP-сайта или DHU из спирали. При этом образуются каталитически активные фермент-субстратные комплексы, в которых происходит гидролиз 5-фосфодиэфирной связи субстратов. В то же время, в каталитически неактивном комплексе АРЕ1 с неповреждённой ДНК фермент также меняет свою конформацию. На основании представленных данных было высказано предположение о механизме поиска повреждения ДНК ферментом. Двигаясь по ДНК, АРЕ1 меняет свою конформацию, непрерывно «пытаясь» сформировать каталитически активный комплекс. Такой комплекс ферменту удаётся образовать при взаимодействии с сайтами ДНК, которые содержат повреждения, являющиеся субстратами для АРЕ1.

Более того, показано, что АРЕ1 также подвергается конформационным превращениям в процессе гидролиза 5'-фосфодиэфирных связей субстратов и в комплексах с продуктами ферментативных реакций. Таким образом, фермент подвергается конформационным перестройкам на всех стадиях ферментативных процессов.

Полученные в работе значения кинетических параметров показали, что формирование комплексов АРЕ1 со специфическими субстратами, содержащими как АР-сайт и F, так и DHU, кинетически более выгодно, чем формирование неспецифических комплексов данного фермента с неповреждённой ДНК.

Высказано предположение, что участие АРЕ1 в инцизионной репарации нуклеотидов может иметь биологическое значение. Такой вывод был сделан на основании того, что гидролиз 5'-фосфодиэфирной связи субстрата, содержащего DHU, осуществляемый АРЕ1 без участия ДНК-гликозилаз, протекает быстро. Так, скорость гидролитического разрезания ДНК-субстрата, содержащего DHU, ферментом АРЕ1 в процессе NIR сопоставима по величине со скоростью разрезания ДНК-субстрата, содержащего апуриновый/апиримидиновый сайт, в процессе BER.

Показано, что комплексы АРЕ1 с продуктами разрезания субстратов, содержащих DHU, АР-сайт и F, термодинамически стабильны. После химического разрезания субстратов происходят конформационные превращения комплексов фермента с продуктами ферментативных реакций как в процессе NIR, так и BER. В процессе инцизионной репарации нуклеотидов при расщеплении субстрата, содержащего DHU, лимитирующей стадией процесса является диссоциация фермента из комплекса с продуктом. Ранее [41] было показано, что действие АРЕ1 в процессе эксцизионной репарации оснований также лимитируется стадией, следующей за химическим разрезанием F-субстрата. Кроме того, в работе [14] было выявлено, что АРЕ1 структурно оптимизирован для того, чтобы удерживать расщеплённую ДНК, содержащую АР-сайт. Результаты настоящей работы позволяют сделать вывод о том, что данный фермент оптимизирован и для связывания расщеплённой ДНК, содержащей остаток DHU. По-видимому, существование прочного комплекса между АРЕ1 и продуктами разрезания субстратов обеспечивает координированное присоединение других белков, участвующих в репарации, к субстратам и передачу субстратов от одного фермента к другому.

На основании того факта, что значения равновесных констант диссоциации комплексов АРЕ1 с БНи-субстратом и продуктом разрезания этого субстрата практически не отличаются, можно сделать заключение, что продукт разрезания субстрата, содержащего ОНи, может являться конкурентным ингибитором АРЕ1. Ранее было показано, что продукт разрезания Б-субстрата также является конкурентным ингибитором данного фермента [32]. у.

Установлено, что рН и концентрация ионов Р^ влияют на активность фермента. Так, взаимодействия АРЕ1 с неповреждённой ДНК в буфере, оптимальном для ВЕЯ (рН 7,5, 5 мМ Г^Ог) протекают значительно быстрее, чем в буфере, оптимальном для N111 (рН 6,8, 0,01 мМ М§С12). Значения констант скорости прямых и обратных реакций стадий образования начального фермент-субстратного комплекса и изомеризации этого комплекса были выше в буфере ВЕЯ, чем в N111. В то же время, стабильность начального комплекса в двух разных буферах различалась слабо, а стабильность второго комплекса, образующегося на стадии изомеризации, была выше в буфере N111. При взаимодействии АРЕ1 с ДНК, содержащей аналог АР-сайта (Б), значения констант скорости прямой и обратной реакций стадии образования начального фермент-субстратного комплекса, константы скорости прямой реакции стадии изомеризации этого комплекса и константы скорости гидролиза 5-фосфодиэфирной связи субстрата были также выше в буфере ВЕЯ, чем в N111. Лишь константа скорости обратной реакции стадии изомеризации начального комплекса была выше в буфере N111, чем в ВЕЯ. Стабильность начального специфического комплекса АРЕ1 с Б-субстратом в двух разных буферах практически не различалась, как и в случае неспецифического комплекса, а стабильность второго каталитически активного специфического комплекса была выше в буфере ВЕЯ. При взаимодействии АРЕ1 с ДНК, содержащей ОНи, начальный столкновительный комплекс также формировался быстрее в буфере ВЕЯ. Напротив, скорости превращения менее активной формы фермента, гидролиза 5'-фосфодиэфирной связи ОНи-субстрата и медленной изомеризации комплекса фермента с продуктом ферментативной реакции были выше в буфере №Я, чем в ВЕЯ. Диссоциация фермента из комплекса с БНи-продуктом в двух разных буферах происходила практически с одинаковой скоростью.

В представленной работе было исследовано влияние замены лизина-98 на аланин (К98А) на кинетику действия АРЕ1. Ранее было показано, что лизин-98 принимает участие в координации одного из двух ионов М§ (в сайте связывания А) в активном центре фермента, и его замена приводит к образованию альтернативной структуры в области активного центра. Поскольку АРЕ1 разрезает разные по структуре ДНК-субстраты, узнаваемые разными конформациями фермента, изучение влияния различных конформаций фермента на активности BER и NIR представляет большой интерес.

Данные, полученные в работе, показывают, что мутация К98А влияет на образование начального неспецифического комплекса фермента с неповреждённой ДНК сложным образом, зависящим от концентрации ионов Mg и рН. Эта мутация практически устраняет наблюдавшиеся для АРЕ1 большие различия между значениями соответствующих констант скорости прямой и обратной реакций стадии образования такого начального комплекса, полученными в двух разных буферах. Более того, замена Lys98 на Ala затрудняет индуцированную подгонку фермента в комплексе с неповреждённой ДНК.

Кроме того, мутация К98А значительно затрудняет индуцированную подгонку фермента в комплексе с F-содержащим субстратом, приводящую к образованию каталитически активного комплекса. Эта мутация также снижает скорость гидролиза 5'-фосфодиэфирной связи F-субстрата. В случае взаимодействия фермента с ДНК, содержащей природный АР-сайт, замена К98А существенно понижает стабильность начального комплекса и ускоряет конформационные переходы в комплексе фермента с АР-субстратом. Таким образом, АРЕ1 по-разному взаимодействует с АР-сайтом и остатком тетрагидрофурана, который широко используется в качестве стабильного аналога АР-сайта.

Получено, что в процессе инцизионной репарации нуклеотидов замена лизина-98 на аланин значительно замедляет активацию менее активной формы фермента Е2, так же, как и гидролиз 5-фосфодиэфирной связи DHU-субстрата. Более того, эта аминокислотная замена замедляет конформационную перестройку комплекса фермента с продуктом разрезания DHU-субстрата.

Было высказано предположение, что ферментативным стадиям, на которые влияет

У+ замена К98А, требуется надлежащая координация ионов Mg в сайте связывания металла А.

Показано, что мутация К98А больше влияет на катализ в процессе инцизионной репарации нуклеотидов, чем в процессе эксцизионной репарации оснований, так как при такой замене константы скорости гидролитического разрезания субстратов, содержащих DHU и F, понижаются в 200 и 12 раз, соответственно. На основании того, что мутация К98А оказывает влияние на разрезание и DHU-субстрата, и F-субстрата, был сделан вывод, что двухвалентный ион металла, координированный в сайте А, для разрезания DHU необходим так же, как и для разрезания АР-сайта. Следовательно, наиболее вероятно, что АРЕ1 использует один и тот же активный центр для катализа разрезания субстратов, содержащих

DHU и АР-сайт. Таким образом, фермент может принимать конформацию, обеспечивающую необходимую ориентацию DHU в этом активном центре.

Кроме того, в представленной работе было проанализировано влияние N-концевого домена Ref-1 (61 аминокислота с N-конца), отсутствующего в бактериальных гомологах АРЕ1, на кинетику действия фермента. Ранее было показано, что Ref-1 не требуется для АР-эндонуклеазной активности АРЕ1, но необходим для эффективной инцизионной репарации нуклеотидов. В то же время, не было получено никаких количественных кинетических параметров действия укороченного фермента NA61 АРЕ 1, которые помогли бы определить роль домена Ref-1 в процессах BER и NIR.

В настоящей работе показано, что домен Ref-1 затрудняет связывание АРЕ1 с неповреждённой ДНК. Как и в случае замены К98А, мутация NA61 влияет на скорость образования начального неспецифического фермент-субстратного комплекса сложным образом, зависящим от концентрации ионов Mg и pH. Мутация К98А значительно сглаживает, а мутация NA61 полностью устраняет наблюдавшиеся для АРЕ1 большие различия между значениями константы скорости прямой реакции стадии образования начального комплекса, полученными в двух разных буферах. Следовательно, структура фермента дикого типа эволюционно оптимизирована таким образом, чтобы скорость начального связывания АРЕ1 с неповреждённой ДНК сильно зависела от концентрации ионов Mg и pH. Более того, как и замена К98А, мутация NA61 замедляет индуцированную подгонку фермента в комплексе с неповреждённой ДНК.

Присутствие домена Ref-1 в АРЕ1 приводит к уменьшению стабильности начальных комплексов фермента как с неповреждённой ДНК, так и с ДНК, содержащей F или АР-сайт. В процессе BER этот домен влияет на скорость изомеризации начального комплекса и стабильность второго каталитически активного фермент-субстратного комплекса, причём это влияние не одинаково в случае F- и AP-субстратов. В то же время, значительного влияния на скорость гидролиза 5'-фосфодиэфирной связи F-субстрата домен Ref-1 не оказывает. Кроме того, удаление N-концевого домена немного понижает стабильность комплекса фермента с продуктом разрезания F-субстрата.

Полученные в работе данные показали, что при связывании с ДНК укороченный фермент не оказывает никакого предпочтения субстрату, содержащему DHU. Таким образом, Ref-1 обеспечивает специфическое узнавание повреждённой ДНК, содержащей DHU, главным образом благодаря тому, что этот домен замедляет образование комплекса АРЕ1 с неповреждённой ДНК в буфере, оптимальном для NIR. Также, в процессе NIR домен Ref-1 ускоряет активацию менее активной формы фермента Е2 (Л:^), гидролиз

5'-фосфодиэфирной связи БНИ-субстрата и конформационную перестройку комплекса фермента с продуктом разрезания ОНЦ-субстрата. Домен ЯеМ немного повышает сродство АРЕ1 к продукту разрезания ЭНи-субстрата, так же, как и к продукту разрезания Б-субстрата. Опираясь на эти данные можно предположить, что домен ЯеМ делает передачу расщеплённого продукта последующим ферментам, участвующим в репарации, более эффективной.

Домен ЯеМ ускоряет гидролиз 5-фосфодиэфирной связи БНи-субстрата в 500 раз, в то время как значительного влияния на скорость гидролиза Б-субстрата не оказывает. Таким образом, в процессе эволюции фермент АРЕ1 вместе с доменом 11еМ приобрёл способность осуществлять эффективную инцизионную репарацию нуклеотидов.

Результаты, полученные в настоящей работе, важны для понимания механизма действия АРЕ1 в процессе инцизионной репарации нуклеотидов и биологической роли такого пути репарации. Кроме того, полученные данные позволяют выявить ранее неизвестные аспекты действия АРЕ1 в процессе эксцизионной репарации оснований.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Тимофеева, Надежда Александровна, Новосибирск

1. Gros, L., Saparbaev, M.K., Laval, J. Enzymology of the repair of free radicals-induced DNA damage // Oncogene. 2002. - V. 21. - P. 8905-8925.

2. Lindahl, Т., Nyberg, B. Rate of depurination of native deoxyribonucleic acid // Biochemistry. -1972.-V. 11.-P. 3610-3618.

3. Burrows, C.J., Muller, J.G. Oxidative nucleobase modifications leading to strand scission // Chem. Rev. 1998. -V. 98.-P. 1109-1151.

4. Demple, В., Herman, Т., Chen, D.S. Cloning and expression of APE, the cDNA encoding the major human apurinic endonuclease: definition of a family of DNA repair enzymes // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1991. - V. 88.-P. 11450-11454.

5. Robson, C.N., Hickson, I.D. Isolation of cDNA clones encoding a human apurinic/apyrimidinic endonuclease that corrects DNA repair and mutagenesis defects in E. coli xth (exonuclease III) mutants //Nucleic Acids Res. 1991. -V. 19. - P. 5519-5523.

6. Ischenko, A.A., Saparbaev, M.K. Alternative nucleotide incision repair pathway for oxidative DNA damage //Nature. 2002. - V. 415. - P. 183-187.

7. Ishchenko, A.A., Sanz, G., Privezentzev, C.V., Maksimenko, A.V., Saparbaev, M. Characterisation of new substrate specificities of Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae AP endonucleases // Nucleic Acids Res. 2003. - V. 31. - P. 6344-6353.

8. Gros, L., Ishchenko, A.A., Ide, H., Elder, R.H., Saparbaev, M.K. The major human AP endonuclease (Apel) is involved in the nucleotide incision repair pathway // Nucleic Acids Res. 2004. - V. 32. - P. 73-81.

9. Ishchenko, A.A., Ide, H., Ramotar, D., Nevinsky, G., Saparbaev, M. a-Anomeric deoxynucleotides, anoxic products of ionizing radiation, are substrates for the endonuclease IV-type AP endonucleases // Biochemistry. 2004. - V. 43. - P. 15210-15216.

10. Daviet, S., Couve-Privat, S., Gros, L., Shinozuka, K., Ide, H., Saparbaev, M., Ishchenko, A.A. Major oxidative products of cytosine are substrates for the nucleotide incision repair pathway // DNA Repair. 2007. - V. 6. - P. 8-18.

11. Kim, K., Biade, S., Matsumoto, Y. Involvement of flap endonuclease 1 in base excision DNA repair // J. Biol. Chem. 1998. - V. 273. - P. 8842-8848.

12. Mol, D.C., Izumi, T., Mitra, S., Tainer, J.A. DNA-bound structures and mutants reveal abasic DNA binding by APE1 and DNA repair coordination // Nature. 2000. - V. 403. - P. 451— 456.

13. Oezguen, N., Schein, C.H., Peddi, S.R., Power, T.D., Izumi, T., Braun, W. A "moving metal mechanism" for substrate cleavage by the DNA repair endonuclease APE-1 // Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics. 2007. - V. 68. - P. 313-323.

14. Puyet, A., Greenberg, B., Lacks, S. The exoA gene of Streptococcus pneumoniae and its product, a DNA exonuclease with apurinic endonuclease activity // J. Bacteriol. 1989. - V. 171.-P. 2278-2286.

15. Saporito, S.M., Smith-White, B.J., Cunningham, R.P. Nucleotide sequence of the xth gene of Escherichia coli K-12 // J. Bacteriol. 1988. - V. 170. - P. 4542-4547.

16. Sander, M., Lowenhaupt, K., Rich, A. Drosophila Rrpl protein: an apurinic endonuclease with homologous recombination activities // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1991. - V. 88. - P. 6780-6784.

17. Xanthoudakis, S., Miao, G., Wang, F., Pan, Y. C., Curran, T. Redox activation of Fos-JunDNAbinding activity is mediated by a DNA repair enzyme // EMBO J. 1992. - V. 11. -P. 3323-3335.

18. Walker, L.J., Robson, C.N., Black, E., Gillespie, D., Hickson, I.D. Identification of residues in the human DNA repair enzyme HAP1 (Ref-1) that are essential for redox regulation of Jun DNA binding // Mol. Cell. Biol. 1993. - V. 13. - P. 5370-5376.

19. Jayaraman, L., Murthy, K.G.K., Zhu, C., Curran, T., Xanthoudakis, S., Prives, C. Identification of redox/repair protein Ref-1 as a potent activator of p53 // Genes Dev. 1997. — V. 11.-P. 558-570.

20. Xanthoudakis, S., Miao, G.G., Curran, T. The redox and DNA-repair activities of Ref-1 are encoded by nonoverlapping domains // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. - V. 91. - P. 2327.

21. Hadi, M.Z., Coleman, M.A., Fidelis, K., Mohrenweiser, H.W., Wilson D.M. Functional characterization of APE1 variants identified in the human population // Nucleic Acids Res. -2000.-V. 28.-P. 3871-3879.

22. Chou, K.-M., Kukhanova, M., Cheng, Y.-C. A novel action of human apurinic/apyrimidinic endonuclease: excision of L-configuration deoxyribonucleoside analogs from the 3' termini of DNA//J. Biol. Chem. -2000. V. 275.-P. 31009-31015.

23. Suh, D., Wilson, D.M. 3rd, Povirk, L.F. 3'-phosphodiesterase activity of human apurinic/apyrimidinic endonuclease at DNA double-strand break ends // Nucleic Acids Res. -1997.-V. 25.-P. 2495-2500.

24. Barzilay, G., Walker, L.J., Robson, C.N., Hickson, I.D. Site-directed mutagenesis of the human DNA repair enzyme HAP1: identification of residues important for AP endonuclease and RNase H activity // Nucleic Acids Res. 1995. - V. 23. - P. 1544-1550.

25. Hill, J.W., Hazra, T.K., Izumi, T., Mitra, S. Stimulation of human 8-oxoguanine-DNA glycosylase by AP-endonuclease: potential coordination of the initial steps in base excision repair // Nucleic Acids Res. 2001. - V. 29. - P. 430-438.

26. Bennett, R.A., Wilson, D.M. 3rd, Wong, D., Demple, B. Interaction of human apurinic endonuclease and DNA polymerase p in the base excision repair pathway // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. - V. 94. - P. 7166-7169.

27. Masuda, Y., Bennett, R.A.O., Demple, B. Dynamics of the interaction of human apurinic endonuclease (APE1) with its substrate and product // J. Biol. Chem. 1998. - V. 273. - P. 30352-30359.

28. Dianova, 1.1., Bohr, V.A., Dianov, G.L. Interaction of human AP endonuclease 1 with flap endonuclease 1 and proliferating cell nuclear antigen involved in long-patch base excision repair // Biochemistry. 2001. - V. 40. - P. 12639-12644.

29. Ranalli, T.A., Tom, S., Bambara, R.A. AP endonuclease 1 coordinates flap endonuclease 1 and DNA ligase I activity in long patch base excision repair // J. Biol. Chem. 2002. - V. 277. - P. 41715^1724.

30. Tom, S., Ranalli, T.A., Podust, V.N., Bambara, R.A. Regulatory roles of p21 and apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 in base excision repair // J. Biol. Chem. 2001. - V. 276.-P. 48781-48789.

31. Chou. K.M., Cheng, Y.C. An exonucleolytic activity of human apurinic/apyrimidinic endonuclease on З'-mispaired DNA //Nature. 2002. - V. 415. - P. 655-659.

32. Sokhansanj, B.A., Rodrigue, G.R., Fitch, J.P., Wilson, D.M. 3rd. A quantitative model of human DNA base excision repair. I. Mechanistic insights // Nucleic Acids Res. 2002. -V. 30.-P. 1817-1825.

33. Березин, И.В., Мартинек, К. Основы физической химии ферментативного катализа М.: Высшая школа, 1977. - С. 171-175, 216-218.

34. Chou, К.М., Cheng, Y.C. The exonuclease activity of human apurinic/apyrimidinic endonuclease (APE1). Biochemical properties and inhibition by the natural dinucleotide Gp4G // J. Biol. Chem. 2003. - V. 278. - P. 18289-18296.

35. Maher, R.L., Bloom, L.B. Pre-steady-state kinetic characterization of the AP endonuclease activity of human AP endonuclease 1 // J. Biol. Chem. 2007. -V. 282. - P. 30577-30585.

36. Kanazhevskaya, L.Yu, Koval, V.V., Zharkov, D.O., Strauss, P.R., Fedorova, O.S. Conformational transitions in human AP endonuclease 1 and its active site mutant during abasic site repair // Biochemistry. 2010. - V. 49. - P. 6451-6461.

37. Лакович, Дж. Основы флуоресцентной спектроскопии М.: Мир, 1986. - С. 22-24, 345365.

38. Royer, С.А. Probing protein folding and conformational transitions with fluorescence // Chem. Rev.-2006.-V. 106.-P. 1769-1784.

39. Guest, C.R., Hochstrasser, R.A., Sowers, L.C., Millar, D.P. Dynamics of mismatched base pairs in DNA // Biochemistry. 1991. - V. 30. - P. 3271-3279.

40. Bloom, L.B., Otto, M.R., Beechem, J.M., Goodman, M.F. Influence of 5-nearest neighbors on the insertion kinetics of the fluorescent nucleotide analog 2-aminopurine by Klenow fragment // Biochemistry. 1993. - V. 32. - P. 11247-11258.

41. Hochstrasser, R.A., Carver, T.E., Sowers, L.C., Millar, D.P. Melting of a DNA helix terminus within the active site of a DNA polymerase // Biochemistry. 1994. - V. 33. - P. 1197111979.

42. Raney, K.D, Sowers, L.C, Millar, D.P, Benkovic, S.J. A fluorescence-based assay for monitoring helicase activity // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1994. V. 91. - P. 6644-6648.

43. Johnson, K.A. The Enzymes. Mechanisms of catalysis // California: Academic Press, Inc., 1992. V. 20. - P. 1-60.

44. Izumi, T., Mitra, S. Deletion analysis of human AP-endonuclease: minimum sequence required for the endonuclease activity // Carcinogenesis. 1998. - V. 19. - P. 525-527.

45. Goodhead, D.T. Initial events in the cellular effects of ionizing radiations: clustered damage in DNA // Int. J. Radiat. Biol. 1994. - V. 65. - P. 7-17.

46. Boiteux, S., Laval, J. Coding properties of poly(deoxycytidylic acid) templates containing uracil or apyrimidinic sites: in vitro modulation of mutagenesis by deoxyribonucleic acid repair enzymes //Biochemistry. 1982. -V. 21. - P. 6746-6751.

47. Demple, B., Harrison, L. Repair of oxidative damage to DNA: enzymology and biology // Annu. Rev. Biochem.- 1994.-V. 63.-P. 915-948.

48. Kane, C.M., Linn, S. Purification and characterization of an apurinic/apyrimidinic endonuclease from HeLa cells // J. Biol. Chem. 1981. - V. 256. - P. 3405-3414.

49. Rothwell, D.G., Hickson, I.D. Asparagine 212 is essential for abasic site recognition by the human DNA repair endonuclease HAP1 // Nucleic Acids Res. 1996. - V. 24. - P. 42174221.

50. Wilson, D.M. 3rd, Takeshita, M., Demple, B. Abasic site binding by the human apurinic endonuclease, Ape, and determination of the DNA contact sites // Nucleic Acids Res. 1997. -V. 25.-P. 933-939.

51. Masuda, Y., Bennett, R.A., Demple, B. Rapid dissociation of human apurinic endonuclease (APE1) from incised DNA induced by magnesium // J. Biol. Chem. 1998. - Y. 273. - P. 30360-30365.

52. Белоглазова, Н.Г., Лохова, И.А., Максакова, Г.А., Цветков, И.В., Невинский, Г.А. Апурин/апиримидиновая эндонуклеаза из плаценты человека. Узнавание ферментом апуринизированной ДНК // Мол. Биол. 1996. - Т. 30. - С. 220-230.

53. Barzilay, G., Мої, C.D., Robson, C.N., Walker, L J., Cunningham, R.P., Tainer, J.A., Hickson, I.D. Identification of critical active-site residues in the multifunctional human DNA repair enzyme HAP1 // Nat. Struct. Biol. 1995. - V. 2. - P. 561-568.

54. Strauss, P.R, Beard, W.A., Patterson, T.A., Wilson, S.H. Substrate binding by human apurinic/apyrimidinic endonuclease indicates a Briggs-Haldane mechanism // J. Biol. Chem. -1997.-V. 272.-P. 1302-1307.

55. Melo, L.F., Mundle, S.T., Fattal, M.H., O'Regan, N.E., Strauss, P.R. Role of active site tyrosines in dynamic aspects of DNA binding by AP endonuclease // DNA Repair. 2007. -V. 6.-P. 374-382.

56. Berg, O.G., Winter, R.B., von Hippel, P.H. Diffusion-driven mechanisms of protein translocation on nucleic acids. 1. Models and theory // Biochemistry. 1981. - V. 20. - P. 6929-48.

57. Winter, R.B., von Hippel, P.H. Diffusion-driven mechanisms of protein translocation on nucleic acids. 2. The Escherichia coli repressor-operator interaction: equilibrium measurements // Biochemistry. 1981. - V. 20. - P. 6948-60.

58. Higley, M., Lloyd, R.S. Processivity of uracil DNA glycosylase // Mutat. Res. 1993. - V. 294.-P. 109-116.

59. Gruskin, E.A., Lloyd, R.S. The DNA scanning mechanism of T4 endonuclease V. Effect of NaCl concentration on processive nicking activity // J. Biol. Chem. 1986. - V. 261. - P. 9607-9613.

60. Мечетин, Г.В., Жарков, Д.О. Механизм поиска субстратов ферментами эксцизионной репарации оснований // Доклады АН. 2011. - Т. 437. - № 5. - С. 695-698.

61. Wilson, D.M. 3rd, Takeshita, М., Grollman, А.Р., Demple, В. Incision activity of human apurinic endonuclease (Apel) at abasic site analogs in DNA // J. Biol. Chem. 1995. - V. 270. -P. 16002-16007.

62. Chen, D.S., Herman, V., Demple, B. Two distinct human DNA diesterases that hydrolyze 3'-blocking deoxyribose fragments from oxidized DNA // Nucleic Acids Res. 1991. - V. 19. -P. 5907-5914.

63. Weiss, B. Endonuclease II of Escherichia coli is exonuclease III // J. Biol. Chem. 1976. - V. 251. P.1896-901.

64. Mckenzie, J.A., Strauss, P.R. Oligonucleotides with bistranded abasic sites interfere with substrate binding and catalysis by human apurinic/apyrimidinic endonuclease // Biochemistry. -2001.-V. 40.-P. 13254-13261.

65. Chaudhry, M.A., Weinfeld, M. Induction of double-strand breaks by SI nuclease, mung bean nuclease and nuclease PI in DNA containing abasic sites and nicks // Nucleic Acids Res. -1995.-V. 23.-P. 3805-3809.

66. Chaudhry, M.A., Weinfeld, M. Reactivity of human apurinic/apyrimidinic endonuclease and Escherichia coli exonuclease III with bistranded abasic sites in DNA // J. Biol. Chem. 1997. -V. 272.-P. 15650-15655.

67. Белоглазова, Н.Г., Петрусёва, И.О., Булычёв, Н.В., Максакова, Г.А., Джонсон, Ф., Невинский, Г.А. Выделение и характеристика субстратной специфичности апурин/апиримидиновой эндонуклеазы из плаценты человека // Мол. Биол. 1997. - Т. 31.-С. 1104-1111.

68. Mol, C.D., Kuo, C.F., Thayer, М.М., Cunningham, R.P., Tainer, J.A. Structure and function of the multifunctional DNA-repair enzyme exonuclease III // Nature. 1995. - V. 374. - P. 381386.

69. Erzberger, J.P., Barsky, D., Scharer, O.D., Colvin, M.E., Wilson, D.M. 3rd. Elements in abasic site recognition by the major human and Escherichia coli apurinic/apyrimidinic endonucleases // Nucleic Acids Res. 1998. - V. 26. - P. 2771-2778.

70. Shida, T., Nöda, M., Sekiguchi, J. Cleavage of single- and double-stranded DNAs containing an abasic residue by Escherichia coli exonuclease III (AP endonuclease VI) // Nucleic Acids Res. 1996. - V. 24. - P. 4572-4576.

71. Scharer, O.D., Nash, H.M., Jiricny, J., Laval, J., Verdine, G.L. Specific binding of a designed pyrrolidine abasic site analog to multiple DNA glycosylases // J. Biol. Chem. 1998. - V. 273. -P. 8592-8597.

72. Sanderson, B.J., Chang, C.N., Grollman, A.P., Henner, W.D. Mechanism of DNA cleavage and substrate recognition by a bovine apurinic endonuclease // Biochemistry. 1989. - V. 28. -P. 3894-901.

73. Marenstein, D.R., Wilson, D.M. 3rd, Teebor, G.W. Human AP endonuclease (APE1) demonstrates endonucleolytic activity against AP sites in single-stranded DNA // DNA Repair. -2004. -V. 3. P. 527-533.

74. Rothwell, D.G., Hang, B., Gorman, M.A., Freemont, P.S., Singer, B., Hickson, I.D. Substitution of Asp-210 in HAP1 (APE/Ref-1) eliminates endonuclease activity but stabilises substrate binding // Nucleic Acids Res. 2000. - V. 28. -P. 2207-2213.

75. Lowry, D.F., Hoyt, D.W., Khazi, F.A., Bagu, J., Lindsey, A.G., Wilson, D.M. 3rd. Investigation of the role of the histidine-aspartate pair in the human exonuclease Ill-like abasic endonuclease Apel // J. Mol. Biol. 2003. - V. 329. - P. 311-322.

76. Wilson, D.M. 3rd. Apel abasic endonuclease activity is regulated by magnesium and potassium concentrations and is robust on alternative DNA structures // J. Mol. Biol. 2005. - V. 345. -P. 1003-1014.

77. Nguyen, L.H., Barsky, D., Erzberger, J.P., Wilson, D.M. 3rd. Mapping the protein-DNA interface and the metal-binding site of the major human apurinic/apyrimidinic endonuclease // J. Mol. Biol. 2000. - V. 298. - P. 447-459.

78. Fan, J., Matsumoto, Y., Wilson, D.M. 3rd. Nucleotide sequence and DNA secondary structure, as well as replication protein A, modulate the single-stranded abasic endonuclease activity of APE1 //J. Biol. Chem. 2006. - V. 281. - P. 3889-3898.

79. Wold, M.S. Replication protein A: a heterotrimeric, single-stranded DNA-binding protein required for eukaryotic DNA metabolism // Annu. Rev. Biochem. 1997. - V. 66. - P. 61-92.

80. Berquist, B.R., McNeill, D.R., Wilson, D.M. 3rd. Characterization of abasic endonuclease activity of human Apel on alternative substrates, as well as effects of ATP and sequence context on AP site incision // J. Mol. Biol. 2008. -V. 379. - P. 17-27.

81. Saenger, W. Structure and catalytic function of nucleases // Curr. Opin. Struct. Biol. 1991. -V. l.-P. 130-138.

82. Izumi, T., Malecki, J., Chaudhry, M.A., Weinfeld, M., Hill, J.H., Lee, J.C., Mitra, S. Intragenic suppression of an active site mutation in the human apurinic/apyrimidinic endonuclease // J. Mol. Biol. 1999. - V. 287. - P. 47-57.

83. Lucas, J.A., Masuda, Y., Bennett, R.A.O., Strauss, N.S., Strauss, P.R. Single-turnover analysis of mutant human apurinic/apyrimidinic endonuclease // Biochemistry. 1999. - V. 38.-P. 4958-4964.

84. Singer, B., Hang, B. Exocyclic DNA adducts in mutagenesis and carcinogenesis / Ed. B. Singer, H. Bartsch. Lyon, France: IARC Scientific Publications, 1999. - N 150. - P. 233-248.

85. Walker, L.J., Craig, R.B., Harris, A.L., Hickson, I.D. A role for the human DNA repair enzyme HAP1 in cellular protection against DNA damaging agents and hypoxic stress // Nucleic Acids Res. 1994. -V. 22. -P. 4884-4889.

86. Mol, C.D., Hosfield, D.J., Tainer, J.A. Abasie site recognition by two apurinic/apyrimidinic endonuclease families in DNA base excision repair: the 3' ends justify the means // Mutat. Res. 2000. - V. 460. - P. 211-229.

87. Izumi, T., Schein, C.H., Oezguen, N., Feng, Y., Braun, W. Effects of backbone contacts 3' to the abasic site on the cleavage and the product binding by human apurinic/apyrimidinic endonuclease (APE1) // Biochemistry. 2004. - V. 43. - P. 684-689.

88. Shen, J.-C., Loeb, L.A. Mutations in the a8 loop of human APE1 alter binding and cleavage of DNA containing an abasic site // J. Biol. Chem. 2003. - V. 278. - P. 46994-47001.

89. Chattopadhyay, R., Wiederhold, L., Szczesny, B., Boldogh, I., Hazra, T.K., Izumi, T., Mitra, S. Identification and characterization of mitochondrial abasic (AP)-endonuclease in mammalian cells // Nucleic Acids Res. 2006. - V. 34. - P. 2067-2076.

90. Hudson, E.K., Hogue, B.A., Souza-Pinto, N.C., Croteau, D.L., Anson, R.M., Bohr, V.A., Hansford, R.G. Age-associated change in mitochondrial DNA damage // Free Radic. Res. -1998.-V. 29. P. 573-579.

91. Yakes, F.M., Van Houten, B. Mitochondrial DNA damage is more extensive and persists longer than nuclear DNA damage in human cells following oxidative stress // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1997. - V. 94. - P. 514-519.

92. Mantha, A.K., Oezguen, N., Bhakat, K.K., Izumi, T., Braun, W., Mitra, S. Unusual role of a cysteine residue in substrate binding and activity of human AP-endonuclease 1 // J. Mol. Biol. -2008.-V. 379.-P. 28-37.

93. Mundle, S.T., Fattal, M.H., Melo, L.F., Coriolan, J.D., O'Regan, N.E., Strauss, P.R. Novel role of tyrosine in catalysis by human AP endonuclease 1 // DNA Repair. 2004. - V. 3. - P. 14471455.

94. Ondrechen, M.J., Clifton, J.G., Ringe, D. THEMATICS: a simple computational predictor of enzyme function from structure // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2001. - V. 98. - P. 1247312478.

95. Shehadi, I.H., Yang, Y., Ondrechen, M.J. Future directions in protein function prediction // Mol. Biol. Rep. 2002. - V. 29. - P. 329-335.

96. Mundle, S.T., Delaney, J.C., Essigmann, J.M., Strauss, P.R. Enzymatic mechanism of human apurinic/apyrimidinic endonuclease against a THF AP site model substrate // Biochemistry. -2009.-V. 48.-P. 19-26.

97. Connolly, B.A., Eckstein, F., Pingoud, A. The stereochemical course of the restriction endonuclease EcoRIcatalyzed reaction // J. Biol. Chem. 1984. - V. 259. - P. 10760-10763.

98. Grasby, J.A., Connolly, B.A. Stereochemical outcome of the hydrolysis reaction catalyzed by the EcoRV restriction endonuclease//Biochemistry. 1992.-V. 31.-P. 7855-7861.

99. Jeltsch, A., Alves, J., Wolfes, H., Maass, G., Pingoud, A. Substrate-assisted catalysis in the cleavage of DNA by the EcoRI and EcoRV restriction enzymes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. - V. 90. - P. 8499-8503.

100. Koziolkiewicz, M., Stec, W.J. Application of phosphatebackbone-modified oligonucleotides in the studies on EcoRI endonuclease mechanism of action // Biochemistry. 1992. - V. 31. - P. 9460-9466.

101. Nobbs, T.J., Williams, S.A., Connolly, B.A., Halford, S.E. Phosphorothioate substrates for the Sfil restriction endonuclease // J. Biol. Chem. 1998. - V. 379. - P. 599-604.

102. Колдин, E. Быстрые реакции в растворе. М.: Мир, 1966. - 310 с.

103. Хеммис, Г. Методы исследования быстрых реакций. М.: Мир, 1997. - С. 9-75.

104. Halford, S.E., Marko J.F. How do site-specific DNA-binding proteins find their targets? // Nucleic Acids Res. 2004. - V. 32. - P. 3040-3052.

105. Yu, E., Gaucher, S.P., Hadi, M.Z. Probing conformational changes in Apel during the progression of base excision repair // Biochemistry. 2010. - V. 49. - P. 3786-3796.

106. Lindahl, T. New class of enzymes acting on damaged DNA // Nature. 1976. - V. 259. - P. 64-66.

107. Laval, J. Two enzymes are required for strand incision in repair of alkylated DNA // Nature. -1977.-V. 269.-P. 829-832.

108. Blaisdell, J.O., Wallace, S.S. Abortive base-excision repair of radiation-induced clustered DNA lesions in Escherichia coli II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. - V. 98. - P. 74267430.

109. Friedberg, E.C., Meira, L.B. Database of mouse strains carrying targeted mutations in genes affecting biological responses to DNA damage. Version 5 // DNA Rep. 2003. - V. 2. - P. 501-530.

110. Laval, J., Jurado, J., Saparbaev, M., Sidorkina, O. Antimutagenic role of base-excision repair enzymes upon free radical-induced DNA damage // Mutat. Res. 1998. - V. 402. - P. 93-102.

111. Rosenquist, T.A., Zaika, E., Fernandes, A.S., Zharkov, D.O., Miller, H., Grollman, A.P. The novel DNA glycosylase, NEIL1, protects mammalian cells from radiation-mediated cell death // DNA Rep. 2003. - V. 2. - P. 581-591.

112. Cunningham, R.P., Saporito, S.M., Spitzer, S.G., Weiss, B. Endonuclease IV (nfo) mutant of Escherichia coli II J. Bacteriol. 1986. - V. 168. - P. 1120-1127.

113. Ramotar, D., Popoff, S.C., Gralla, E.B., Demple, B. Cellular role of yeast Apnl apurinic endonuclease/3'-diesterase: repair of oxidative and alkylation DNA damage and control of spontaneous mutation // Mol. Cell. Biol. 1991. - V. 11. - P. 4537-4544.

114. Ljungquist, S. A new endonuclease from Escherichia coli acting at apurinic sites in DNA // J. Biol. Chem. 1977. - V. 252. - P. 2808-2814.

115. McCullough, A.K., Dodson, M.L., Lloyd, R.S. Initiation of base excision repair: glycosylase mechanisms and structures // Annu. Rev. Biochem. 1999. - V. 68. - P. 255-285.

116. Popoff, S.C., Spira, A.I., Johnson, A.W., Demple, B. Yeast structural gene (APN1) for the major apurinic endonuclease: homology to Escherichia coli endonuclease IV // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1990. - V. 87. - P. 4193-4197.

117. Boiteux, S., Guillet, M. Abasie sites in DNA: repair and biological consequences in Saccharomyces cerevisiae II DNA Repair. 2004. - V. 3. - P. 1-12.

118. Johnson, A.W., Demple, B. Yeast DNA diesterase for 3'-fragments of deoxyribose: purification and physical properties of a repair enzyme for oxidative DNA damage // J. Biol. Chem. 1988. -V. 263. - P. 18009-18016.

119. Johnson, A.W., Demple, B. Yeast DNA 3'-repair diesterase is the major cellular apurinic/apyrimidinic endonuclease: substrate specificity and kinetics // J. Biol. Chem. 1988. -V. 263.-P. 18017-18022.

120. Liu, C., Pouliot, J.J., Nash, H.A. Repair of topoisomerase I covalent complexes in the absence of the tyrosyl-DNA phosphodiesterase Tdpl // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2002. - V. 99. -P.14970-14975.

121. Vance, J.R., Wilson, T.E. Repair of DNA strand breaks by the overlappingfunctions of lesion-specific and non-lesion-specific DNA 3'phosphatases // Мої. Cell. Biol. 2001. - V. 21. - P. 7191-7198.

122. Lindahl, T., Wood, R.D. Quality control by DNA repair // Science. 1999. - V. 286. - P. 1897-1905.

123. Elder, R.H., Dianov, G.L. Repair of dihydrouracil supported by base excision repair in mNTHl knock-out cell extracts // J. Biol. Chem. 2002. - V. 277. - P. 50487-50490.

124. Pongracz, K., Bodell, W.J. Detection of 3'-hydroxy-l,N6-benzetheno-2'-deoxyadenosine 3'-phosphate by 32P postlabeling of DNA reacted with p-benzoquinone // Chem. Res. Toxicol. — 1991.-V. 4.-P. 199-202.

125. Pongracz, K., Kaur, S., Burlingame, A.L., Bodell, W.J. Detection of (3'-hydroxy)-3,N4-benzetheno-2'-deoxycytidine-3'-phosphate by 32P-postlabeling of DNA reacted with p-benzoquinone // Carcinogenesis. 1990. - V. 11. - P. 1469-1472.

126. Jowa, L., Winkle, S., Kalf, G., Witz, G., Snyder, R. Deoxyguanosine adducts formed from benzoquinone and hydroquinone // Adv. Exp. Med. Biol. 1986. -V. 197. - P. 825-832.

127. Jowa, L., Witz, G., Snyder, R., Winkle, S., Kalf, G. Synthesis and characterization of deoxyguanosine-benzoquinone adducts // J. Applied Toxicol. 1990. - V. 10. - P. 47-54.

128. Evans, A.R., Limp-Foster, M., Kelley, M.R. Going APE over ref-1 // Mutat. Res. 2000. - V. 461.-P. 83-108.

129. Wang, D., Kreutzer, D.A., Essigmann, J.M. Mutagenicity and repair of oxidative DNA damage: insights from studies using defined lesions // Mutat. Res. 1998. - V. 400. - P. 99115.

130. Kreutzer, D.A., Essigmann, J.M. Oxidized, deaminated cytosines are a source of C—>T transitions in vivo // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - V. 95. - P. 3578-3582.

131. Wagner, J.R., Hu, C.C., Ames, B.N. Endogenous oxidative damage of deoxycytidine in DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. - V. 89. - P. 3380-3384.

132. Wilson, D.M. 3rd, Barsky, D. The major human abasic endonuclease: formation, consequences and repair of abasic lesions in DNA // Mutat. Res. 2001. - V. 485. - P. 283-307.

133. Guliaev, A.B., Hang, B., Singer, B. Structural insights by molecular dynamics simulations into specificity of the major human AP endonuclease toward the benzene-derived DNA adduct, p-BQ-C // Nucleic Acids Res. 2004. - V. 32. - P. 2844-2852.

134. Fasman, G.D. Handbook of biochemistry and molecular biology / Ed. G.D. Fasman. -Cleveland: CRC Press, 1975. -V. 2. P.589.

135. Bhagwat, M., Gerlt, J. A. 3 and 5-strand cleavage reactions catalyzed by the Fpg protein from Escherichia coli occur via successive p- and S-elimination mechanisms, respectively // Biochemistry. - 1996. - V. 35. - P. 659-665.

136. Hoehn, S.T., Turner, C.J., Stubbe, J. Solution structure of an oligonucleotide containing an abasic site: evidence for an unusual deoxyribose conformation // Nucleic Acids Res. 2001. -V. 29.-P. 3413-3423.

137. Molecular cloning: a laboratory manual: in 3 V. / Ed. J. Sambrook, D.W. Russell. Cold Spring Harbour, New York: Cold Spring Harbour Laboratory Press, 2001. - V. 1-3.

138. Bradford, M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. - V. 72. - P. 248-254.

139. Kuzmic, P. Program DYNAFIT for the analysis of enzyme kinetic data: application to HIV proteinase // Anal. Biochem. 1996. - V. 237. - P. 260-273.

140. Loeb, L.A., Preston, B.D. Mutagenesis by apurinic/apyrimidinic sites // Ann. Rev. Genet. -1986.-V. 20.-P. 201-230.

141. Lindahl, T. Instability and decay of the primary structure of DNA //Nature. 1993. - V. 362. -P. 709-715.

142. Boiteux, S., Laval, J. Coding properties of poly(deoxycytidylic acid) templates containing uracil or apyrimidinic sites: in vitro modulation of mutagenesis by deoxyribonucleic acid repair enzymes // Biochemistry. 1982. - V. 21. - P. 6746-6751.

143. Furlong, E.A, Jorgensen, T.J., Henner, W.D. Production of dihydrothymidine stereoisomers in DNA by g-irradiation // Biochemistry. 1986. - V. 25. - P. 4344-4349.

144. Rachofsky, E.L., Osman, R., Ross, J.B. Probing structure and dynamics of DNA with 2-aminopurine: effects of local environment on fluorescence // Biochemistry. 2001. - V. 40. -P. 946-956.

145. Dunlap, C.A., Tsai, M.D. Use of 2-aminopurine and tryptophan fluorescence as probes in kinetic analyses of DNA polymerase beta // Biochemistry. 2002. - V. 41. - P. 11226-11235.

146. Gonnelli, M., Strambini, G.B. Time-resolved protein phosphorescence in the stopped-flow: denaturation of horse liver alcohol dehydrogenase by urea and guanidine hydrochloride // Biochemistry. 1997. - V. 36. - P. 16212-16220.

147. Fedorova, O.S, Nevinsky, G.A., Koval, V.V., Ishchenko, A.A., Vasilenko, N.L., Douglas, K.T. Stopped-flow kinetic studies of the interaction between Escherichia coli Fpg protein and DNA substrates // Biochemistry. -2002. V. 41. - P. 1520-1528.

148. Bailly, V., Verly, W.G. The multiple activities of Escherichia coli endonuclease IV and the extreme lability of 5'-terminal base-free deoxyribose 5-phosphates // Biochem. J. 1989. - V. 259.-P. 761-768.

149. Krokan, H.E., Standal, R., Slupphaug, G. DNA glycosylases in the base excision repair of DNA//Biochem. J. 1997. -V. 325.-P. 1-16.

150. Ma, B., Shatsky, M., Wolfson, H.J., Nussinov, R. Multiple diverse ligands binding at a single protein site: a matter of pre-existing populations // Protein Sci. 2002. - V. 11. - P. 184-197.

151. Ma, B., Nussinov, R. Enzyme dynamics point to stepwise conformational selection in catalysis // Curr. Opin. Chem. Bio. 2010. - V. 14. -P. 652-659.

152. Koshland, D.E. Jr. The active site and enzyme action // Adv. Enzymol. Relat. Subj. Biochem. 1960. -V. 22.-P. 45-97.

153. Hammes, G.G. Multiple conformational changes in enzyme catalysis // Biochemistry. 2002. -V.41.-P. 8221-8228.

154. Wilson, S.H., Kunkel, T.A. Passing the baton in base excision repair // Nat. Struct. Biol. -2000.-V. 7.-P. 176-178.

Информация о работе

Тимофеева, Надежда Александровна
кандидата химических наук
Новосибирск, 2012
ВАК 03.01.04

Диссертация

Кинетический механизм действия апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы человека APE1 в процессе инцизионной репарации нуклеотидов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы