Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Процессивность ферментов эксцизионной репарации оснований

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Процессивность ферментов эксцизионной репарации оснований"

На правах рукописи

МЕЧЕТИН ГРИГОРИЙ ВЕНИАМИНОВИЧ

м.Г

ПРОЦЕССИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ ЭКСЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ ОСНОВАНИЙ

03.01.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

1 5 ДЕК 2011

Новосибирск - 2011

005006124

Работа выполнена в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Научный руководитель:

д.б.н., доцент Жарков Дмитрий Олегович

Официальные оппоненты:

д.х.н., доцент Грайфер Дмитрий Маратович к.б.н. Синицына Ольга Ивановна

Ведущая организация:

Институт молекулярной генетики РАН

Защита состоится « 28» декабря 2011 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 при Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск, пр. акад. Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

С авторефератом можно ознакомиться на сайте www.niboch.nsc.ru

Автореферат разослан « 18 » ноября 2011 г.

Учёный секретарь диссертационного совета к.х.н., доцент

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. ДНК-Я-гликозилазы и АП-эндонуклеазы являются ключевыми ферментами одного из наиболее значимых путей исправления повреждений в ДНК — системы эксцизионной репарации оснований (ЭРО). Как главные компоненты ЭРО, эти ферменты должны обладать способностью быстро обнаруживать модифицированные звенья в геноме значительных размеров на фоне избытка неповрежденных нуклеотидов. На сегодняшний день рассматривается несколько не зависящих от гидролиза ЫТР механизмов поиска белками специфических сайтов узнавания в ДНК. При коррелированном механизме поиска белок движется по ДНК случайным образом некоторое время без диссоциации {слайдинг), или же во время движения по ДНК может происходить увеличение расстояния между поверхностями ДНК и белка на несколько молекулярных слоев воды без полной потери взаимодействия ДНК-белок (хоппинг). Дистрибутивный механизм заключается в частых событиях ассоциации белка и ДНК с последующей диссоциацией этого комплекса. При интерсегментном переносе поиск осуществляется благодаря сближению в пространстве двух сегментов ДНК, далеких друг от друга по контуру ДНК, и переносу фермента с одного сегмента на другой. Этот механизм требует наличия более одного ДНК-связывающего домена у белка.

К настоящему моменту существует два распространенных биохимических метода изучения механизма поиска повреждений ферментами репарации: с использованием содержащих повреждения конкатемерного ДНК-субстрата или суперскрученной плазмиды. Однако, данные методы имеют ряд недостатков. Например, в методе суперскрученной плазмиды в субстрат можно вводить лишь ограниченный спектр повреждений, и невозможно контролировать их расположение. Оба метода не позволяют оценить параметры транслокации фермента по ДНК, а дают лишь оценку вклада коррелированного и дистрибутивного механизмов в процесс поиска ферментом мишени в ДНК; затруднены вариации структуры субстрата и введение дополнительных модификаций в субстрат.

Цель настоящей работы Цель настоящей работы состояла в развитии нового биохимического подхода для изучения механизма поиска повреждений ДНК ферментами репарации, позволяющего оценить параметры этого процесса, а также в изучении влияния различных факторов на механизм поиска, используемый ферментами

репарации. В ходе исследования необходимо было решить следующие задачи:

• развить метод, позволяющий количественно описать механизм транслокации ферментов репарации вдоль двойной цепи;

• для урацил-ДНК-гликозилазы из Е. coli (Eco-Ung) изучить влияние ионов К+ и Mg2+, эффекта вытесненного объема, ДНК-связывающих белков, разрывов и брешей разной протяжённости в ДНК на процесс поиска повреждений;

• сравнить механизмы поиска повреждений, осуществляемого полноразмерной ядерной изоформой урацил-ДНК-Л^-гликозилазы человека (hUNG) и ее каталитическим доменом (hUNGAN93);

• изучить поиск повреждений в ДНК АП-эндонуклеазами Е. coli (Есо-Шо) и человека (hAPEXl).

• оценить кинетические параметры одномерной диффузии фермента Ung вдоль ДНК.

Научная новизна и практическая ценность работы. В работе развит новый биохимический метод изучения механизмов поиска фермент-специфических модификаций ДНК ферментами ЭРО, позволяющий оценить константу скорости транслокации фермента вдоль цепи ДНК и константу скорости диссоциации комплекса фермент-ДНК при нахождении фермента на конце линейной ДНК. В отличие от ранее использованных биохимических подходов, метод позволяет значительно расширить спектр модификаций, вводимых в используемый ДНК-субстрат, а также полностью контролировать структуру субстрата. Подход позволяет исследовать механизмы поиска повреждений в одноцепочечной ДНК, чего нельзя было сделать ранее используемыми методами. Впервые изучено влияние дополнительного N-концевого домена белка hUNG на механизм поиска мишеней. Впервые показано, что ионы Mg2+ оказывают большее влияние на коррелированный поиск мишеней ферментом Ung в двуцепочечной ДНК, чем ионы К+. Даны первые количественные оценки коррелированного поиска мишеней АП-эндонуклеазами человека и Е. coli. Помимо ферментов ЭРО, метод может быть использован для изучения коррелированного поиска любыми ДНК-зависимыми белками, узнающими и расщепляющими специфические модификации или последовательности ДНК.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 4 печатных работы. Результаты работы были представлены на международных конференциях «Russian-European Workshop on DNA Repair and Epigenetic Regulation of Genome Stability» (Санкт-Петербург, Россия, 2008), «Медицинская геномика и протеомика» (Новосибирск, Россия, 2009), «Replication meets repair» (Иена, Германия, 2010).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, заключения, выводов, и списка литературы. Работа изложена на 110 страницах машинописного текста, содержит 33 рисунка, 6 таблиц и 1 приложение. Библиография включает 242 литературных источника.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Основы предложенного метода

Метод основан на расщеплении специально сконструированного ДНК-субстрата, представляющего собой одноцепочечный (оц-) или двуцепочечный (дц-) олигодезоксирибонуклеотид (ОДН) с двумя специфическими сайтами расщепления для данного фермента, разделенными неспецифической ДНК определенной длины, и 32Р-фосфатом в центре субстрата между сайтами расщепления. Субстрат конструируется лигированием двух коротких оц-ОДН, каждый из которых содержит по одному сайту расщепления, а один оц-ОДН - радиоактивную метку на 5'-конце, с использованием комплементарного оц-ОДН равного (или большего для получения оц-субстрата) размера (рис. 1, I). Для синтеза более протяженных субстратов те же оц-ОДН лигировали на более длинной матрице (или двух матрицах, каждая из которых комплементарна половине получаемого субстрата, а одна содержит фосфат на 5'-конце для возможности последующего лигирования), используя дополнительный линкерный ОДН с фосфатом на 5'-конце, соответствующий последовательности между оц-ОДН с сайтами расщепления (рис. 1, II, III).

"р Э2

I 3— х-'-X—5' лигирование ,._х—«р—х—6.

5'-3' 5'-3'

М1

заъ I р Э2

3'—х—'-X—5' лигирование 3._Х_12Е-Р_х—5'

м 5,-3, - -3,

М2

"р I. Р Э2

3'—х-/-X—5' лигирование ги-.Х-1гР—.-Р-Х—5'

111 5'-!-3' 51-Р-3'

М3.1 р М3.2

Рис. 1. Конструирование используемого в методе субстрата. $1, Б2 — оц-ОДН, содержащие фермент-специфический сайт расщепления (X). М1, М2, М3.1. М3.2 — комплементарные оц-ОДН, служащие матрицей для лигирования. I. — линкерный оц-ОДН.

В условиях большого избытка субстрата над ферментом, когда практически исключена возможность повторной ассоциации молекулы фермента с одной и той же молекулой ДНК, в ходе реакции будут формироваться два продукта расщепления по одному из сайтов (продукты Р1, Р2), и продукт расщепления по обоим сайтам (продукт РЗ, рис. 2А). Продукт РЗ может образоваться только в том случае, если, расщепив первый сайт, фермент достигнет второго сайта без диссоциации комплекса фермент-ДНК. Таким образом, накопление продукта РЗ соответствует коррелированному механизму поиска поврежденных звеньев ферментом. Взяв отношение начальной скорости накопления РЗ к суммарной скорости расщепления субстрата (которые можно определить как утлы наклона прямых накопления продуктов расщепления от времени, рис. 2Б), можно получить вероятность коррелированного расщепления ДНК: V

Рс: =---—. Величина Рсс зависит от исследуемого фермента

и заданного расстояния между сайтами расщепления, и представляет собой условную вероятность расщепления второго поврежденного сайга при условии, что первый сайт уже расщеплен.

3'-х—Р—X—5' ^Е,

5'--3'

3'-X-

5'-

Р1

з'

5'-

-5' -3'

Р2

О 100 _002_ АРЕХ1, нМ

10 10_0,5 1 1.5 2 3 5 7 10 время, мин.

*• -••••••••к

, », т тт «к +Р1 т т <т<* -Р2

ф .. т » т *"РЗ

Рис. 2. Расщепление используемого в методе субстрата. А — образование продуктов расщепления по одному из сайтов (Р1, Р2), и по обоим сайтам (РЗ), X — фермент-специфический сайт расщепления. Б — график накопления продуктов расщепления субстрата, содержащего два остатка тетрагидрофуранового аналога АП-сайта, АП-эндонуклеазой АРЕХ1 при концентрации КС1 100 мМ. Стандартное отклонение приведено для трех независимых экспериментов. • — Р1+Р2, О — РЗ. В — типичный радиоавтограф электрофореграммы разделения продуктов реакции в 20%-ном полиакриламидном геле в присутствии 8 М мочевины.

Величина Рсс может быть представлена как произведение вероятности транслокации фермента между первым и вторым сайтами расщепления без диссоциации (РТ) на вероятность расщепления второго сайта (РЕ), которая обычно имеет значения, близкие к единице. Значение РЕ может быть определено независимо при помощи методов предстационарной кинетики.

время, мин

Поскольку при расчете Рсс предполагается равная вероятность расщепления субстрата по каждому из сайтов, необходимо было убедиться в эквивалентности кинетических параметров расщепления олигонуклеотидов и Б 2 (рис. 1),

соответствующих каждой половине субстрата. Как можно видеть из табл. 1, параметры расщепления таких олигонуклеотидов мало отличались для одного и того же фермента, а отношение продуктов расщепления по одному из сайтов для субстратов, содержащих два расщепляемых звена, не менялось с течением времени и было близко к единице (рис. 3).

Табл. 1. Кинетические параметры расщепления 20-звенных оц- или дд-ОДН, содержащих одно поврежденное звено, использованных для конструирования субстратов

Фермент Повреждение ОДН Км, нМ &са1, мин 1

1Л\гО человека ига 4200 ±600 2400±100

82 2800 ± 500 2100 ±200

игщ из Е. соИ 1400 ±300 6200 ± 400

82 2600±1000 6900±1100

АРЕХ1 человека тетрагидрофурановый аналог АП-сайта 18 ± 3 500 ±30

82 24 ±6 460 ±50

Жо из Е. соИ 37 ± 10 29 ±3

82 35 ±8 20 ±2

Рис. 3. График зависимости соотношения концентраций продуктов расщепления по одному из сайтов (Р1/Р2, см. рис. 2) в полноразмерном ДНК-субстрате для иг^ (•) и Жо (О) из Е. соИ от времени. В случае Игщ субстрат содержал два остатка урацила, в случае Жо — два

тетрагидрофурановых аналога АП-сайта. Стандартное отклонение приведено для трех независимых экспериментов.

время, мин.

Влияние условий реакции на механизм поиска поврежденных оснований ферментом Ung из Е. coli

Внутри клетки существует ряд факторов, которые в принципе могут тем или иным способом влиять на эффективность коррелированного поиска. К таким факторам относятся эффект вытесненного объема, присутствие ионов К+ и Mg2+ и наличие внутри клетки ДНК-связывающих белков, которые могут мешать транслокации других ДНК-зависимых белковых факторов. В качестве высокомолекулярного агента для изучения влияния эффекта вытесненного объема использовали полиэтиленгликоль (ПЭГ) со средней молекулярной массой 8 кДа в интервале концентраций 0-5%. Однако влияния эффекта вытесненного объема ни на величину Рсс, ни на каталитическую активность Ung выявлено не было (рис. 4).

А Б

0 0,05 0,1 0,3 0,5 ' [ПЭГ8], %

0 0,05 0,1 0,3 0,5 1 [ПЭГ8], %

Рис. 4. График зависимости Рсс (А) и удельной активности расщепления (Б) субстрата, содержащего урацил, ферментом Ung из Е. coli от концентрации ПЭГ. Стандартное отклонение приведено для трех независимых экспериментов. Удельная активность определялась как отношение суммы скоростей накопления продуктов расщепления по одному из остатков урацила при разных концентрациях ПЭГ к этой сумме при отсутствии ПЭГ.

Как можно видеть из рис. 5, в присутствии ионов Mg2+ Рсс для дц-ДНК снижалась примерно в 2,5 раза быстрее, чем в присутствии ионов К+, при этом влияние этих ионов на Рсс для оц-ДНК было одинаковым. Так как сольватированные ионы Mg2+, помимо чисто электростатического взаимодействия с сахарофосфатным остовом, способны также образовывать координационные связи с разными позициями дц-ДНК, логично предположить, что большее влияние

ионов Mg2+ на Рсс для дц-ДНК обусловлено именно этой их способностью, а влияние ионов К+, по-видимому, обусловлено чисто электростатическими взаимодействиями с ДНК.

0,5

0 20 40 60 О 20 40

[К+ или Мд2+], мМ [К+ или Мд2+], мМ

Рис. 5. График зависимости Рсс дц- (А) и оц-ДНК (Б) от концентрации ионов Mg2+ (•) и К+ (о). Стандартное отклонение приведено по результатам трех независимых экспериментов.

Как можно видеть из табл. 2, значения Рсс для урацил-ДНК-гликозилазной активности в экстрактах клеток Е. coli были примерно в 3 раза ниже, чем активность очищенного препарата Ung. Данный эффект может быть объяснен прочным связыванием с ДНК молекул белков, конкурирующих с процессом транслокации фермента Ung по ДНК, а также связыванием с ДНК внутриклеточных полиаминов, экранирующих ее отрицательный заряд.

Табл. 2. Сравнение величин вероятности коррелированного расщепления для урацил-ДНК-гликозилазных активностей в экстрактах клеток Е. coli и

фермент или клеточный экстракт, субстрат Р 1 QQ

Е. coli, дц-ДНК 0,12

Е. coli, оц-ДНК 0,11

Ung, дц-ДНК 0,31

Ung, оц-ДНК 0,41

Для анализа влияния различных препятствий на процесс поиска была также определена способность белка Иг^ преодолевать оц-бреши длиной в 2-6 нуклеотидов между сайтами расщепления. Наличие бреши не влияло на вероятность коррелированного расщепления (рис. 6), что, по-видимому, связано либо со сходной эффективностью транслокации белка ТЛщ вдоль оц- и дц-ДНК, либо со

значительным вкладом хоппинга, позволяющим белку преодолевать небольшие по размеру препятствия без полной потери взаимодействия с ДНК.

Рис. 6. График зависимости Рсс субстрата с урацилом ферментом Ung из Е. coli от длины бреши. SO — дц-субстрат без разрыва цепи, нулевая точка — субстрат с разрывом цепи. Стандартное отклонение приведено по результатам трех независимых экспериментов.

Коррелированный поиск повреждений ДНК полноразмерной урацил-ДНК-гликозилазой человека и ее каталитическим

доменом

Многие ферменты эукариот отличаются от прокариотических гомологов наличием дополнительных последовательностей, не играющих роли в катализе, но выполняющих дополнительные функции. В то же время практически ничего не известно о влиянии таких дополнительных последовательностей на коррелированный поиск мишеней эукариотическими ДНК-зависимыми белками.

Ядерная изоформа белка hUNG человека и других эукариот отличается от белка Ung бактерий наличием дополнительного N-концевого участка, который не важен для активности и, по всей вероятности, выполняет регуляторные функции. Широко используемый в биохимических исследованиях рекомбинантный вариант урацил-ДНК-гликозилазы человека hUNGAN93 лишен 93 аминокислот с N-конца, представляя из себя высококонсервативный каталитический домен фермента, который отличается по длине от Ung всего на 7 аминокислотных остатков.

Как можно видеть из рис. 7, при концентрации КС1 100 мМ значение Рсс для полноразмерной формы hUNG превышало значение Рсс hUNGAN93 в два раза, что, по-видимому, связано с более высоким положительным зарядом полноразмерной формы фермента.

0,6 0,5 -0,4 а.8 0,3 0,2 0,1 -0,0

Л г^

SO 0 2 4 6 длина бреши, п.н.

О 100

[KCl], мМ

Рис. 7. Рсс дц-субстрата при разных концентрациях KCl для ферментов hUNG (белые столбцы), hUNGAN93 (черные столбцы), Ung из Е. coli (штрихованные столбцы) и урацил-ДНК-гликозилазной активности экстракта клеток миеломы человека линии RPMI-8226 (серые столбцы). Стандартное отклонение приведено для трех независимых экспериментов.

При низкой концентрации KCl наблюдалась обратная картина: значение Рсс для hUNGAN93 превышало Рсс для полноразмерного фермента hUNG в 6,3 раза. Возможно, в условиях низкой ионной силы наличие положительно заряженного N-концевого фрагмента белка hUNG ведет к более тесному связыванию фермента с продуктом реакции по первому из двух поврежденных звеньев, что замедляет накопление продукта двойного расщепления. Значение Рсс для урацил-ДНК-А^-гликозилазной активности при использовании экстракта миеломной клеточной линии человека RPMI-8226 было заметно ниже, чем для очищенного каталитического домена фермента, но сопоставимо со значением для полноразмерного фермента (рис. 7), что указывает на возможность хотя бы частичной реализации коррелированного поиска в условиях конкуренции за субстрат между урацил-ДНК-гликозилазой и другими ДНК-связывающими белками в клетке.

Коррелированный поиск повреждений ДНК АП-эндонуклеазами АРЕХ1 человека и Nfo из Е. coli

При изучении зависимости значения Рсс АП-эндонуклеаз от концентрации KCl наблюдалось снижение Рсс при увеличении ионной силы среды, что типично для белков, осуществляющих коррелированный поиск (рис. 8). Для фермента Nfo обнаруживалось наибольшее значение Рсс из всех исследованных ДНК-гликозилаз и АП-эндонуклеаз, достигающее ~1 при нулевой концентрации KCl (рис. 8). При концентрации KCl 200 мМ, близкой к физиологической, значения Рсс для АП-эндонуклеаз лежали в диапазоне 0,1-0,3, что указывает на возможность реализации коррелированного поиска АП-эндонуклеазами внутри клетки.

Рис. 8. График зависимости Рсс дц-субстратов, содержащих два остатка тетрагидрофуранового аналога АП-сайта (для АП-эндонуклеаз) или урацила (для Ung) от концентрации KCl в реакционной смеси ферментами Nfo из Е. coli (■), АРЕХ1 человека (•) и Ung из Е. coli (А). Стандартное отклонение построено по результатам трех независимых экспериментов.

электростатический характер

взаимодействий ферментов репарации с ДНК дает основания предположить, что Рсс может зависеть от распределения положительного заряда в ДНК-связывающей области белка, так как больший положительный заряд снижает константу диссоциации комплекса ДНК-белок и, соответственно, должен увеличивать Рсс. Однако анализ величины и распределения заряда в ДНК-связывающих областях исследуемых ферментов, а также еще двух гликозилаз, для которых был изучен коррелированный поиск (OGG1 человека и Fpg из Е. coli), не выявил значительной корреляции между значениями суммарного заряда и Рсс для одних и тех же концентраций KCl.

Влияние расстояния меяеду поврежденными основаниями на вероятность коррелированного расщепления субстрата ферментом Ung

Коррелированный поиск может быть описан в терминах кинетических констант транслокации фермента между соседними позициями в ДНК (ки), диссоциации с занимаемой позиции (Ä"off), а также диссоциации с концов ДНК (kend) (рис. 9).

Рис. 9. Кинетическая схема, описывающая ^ 4 коррелированный поиск / белками специфических

—j-З' мишеней в ДНК.

5'

[KCl], мМ

Преимущественно

Теоретическое описание Белоцерковского-Зарлинга (В.Р. Belotserkovskii, D.A. Zarling, J. Theor. Biol., V. 226, №2, p. 195203; 2004) позволяет найти данные кинетические константы, исходя из

зависимости вероятности транслокации фермента между первым и вторым сайтами расщепления (позициями х0 и х) без диссоциации 1¥(Х(), х) от расстояния между сайтами расщепления:

При этом параметр а - ко{^к1г соответствует характерной дистанции коррелированного поиска, а параметр Ъ = /ссп//г1г характеризует вероятность отражения фермента от концов ДНК-субстрата.

Следует отметить, что данное описание рассматривает фермент после связывания с первым сайтом (х0), в то время как в реальности фермент связывается с произвольной позицией в ДНК. Кроме того, уравнение Белоцерковского-Зарлинга описывает функцию непрерывного аргумента х, в то время как в действительности процесс блуждания белка по ДНК состоит из переходов между дискретными состояниями. Для проверки применимости теории Белоцерковского-Зарлинга была составлена кинетическая схема, описывающая процесс каталитического превращения ЛГ+12 звенного ДНК-субстрата с фермент-специфическими сайтами в позициях 5 и ^+6, включающая стадию связывания фермента с произвольной позицией ДНК с возможностью диссоциации из этой позиции, одномерную диффузию фермента по ДНК до достижения первого фермент-специфического сайта, а также одномерную диффузию фермента по ДНК после расщепления обоих сайтов с возможной диссоциацией фермент-субстратного комплекса на каждом шаге. Система уравнений для двух частных случаев с расстоянием между сайтами расщепления в 20 и 80 нуклеотидов была решена в квазистационарном приближении, а решение системы было использовано для нахождения величины вероятности расщепления обоих сайтов без диссоциации с ДНК, РТ(Ы). Значения РТ(АГ) были сопоставлены с соответствующими им значениями Щх0, х). Как можно видеть из рис. 10, величины РТ(Ы) и Щх0,х) совпадают в широком диапазоне значений параметров а и Ъ.

А

Б

« ""V^ I /о.5'

1С .ot h

a 10 ю-3

Рис. 10. Сравнение графиков зависимости величин Py(N) (■) и W(5, N+ 6) (и) от параметров а и b дня N= 20 нт. (А) и N= 80 нг. (Б). Обозначение F(N) на оси относится к функциям /'t('*v) или Щ5, N+ 6).

Описание Белоцерковского-Зарлинга было использовано для нахождения: кинетических параметров коррелированного поиска остатков урацила в ДНК ферментом TJng. Для определения PT(N) = Рсс/Рц было использовано значение РЕ, установленное в работе (R.H. Poreeha, J.T. Stivers. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. V. 105, №31, p. 10791-10796; 2008). Теория Белоцерковского-Зарлинга хорошо описывала экспериментальные значения Pj(N) (рис. 11).

Рис. 11. Аппроксимация экспериментальной зависимости транслокационной компоненты Рх= PJPt от расстояния между основаниями урацила для реакции коррелированного расщепления ДНК-субстрата ферментом Ung из Е. coli функцией

0,5х[ЙТ7, N- 8) + W{\1, N+ 13)]. Стандартное отклонение соответствует трем независимым

40 60

N, п.н.

экспериментам.

В результате были получены параметры а-10 , ¿=0,2, что соответствует характерной дистанции коррелированного поиска ~ 100 п.н. и вероятности отражения от концов линейного субстрата 0,83. Значения констант скорости кп и к,,ш\ были получены, исходя из

опубликованного значения koii = 200 с 1 (R.H. Porecha, J.T. Stivers. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. V. 105, № 31, p. 10791-10796; 2008), и составили 2xl06 с-1 и 4xl05 с"1 соответственно.

В рамках другого теоретического описания (N.P. Stanford et al., EMBO J., V. 19, № 23, p. 6546-6557; 2000) при использовании ферментом преимущественно слайдинга величина Рт зависит от

N2

расстояния между сайтами расщепления как Pj(N) = Р , в то время как при преимущественном вкладе хоппинга PT(iV) = А/г, где А — характерная дистанция слайдинга, а г — среднее расстояние между сайтами расщепления в пространстве. Экспериментальные данные достаточно хорошо описывались функцией А/г с характерной длиной слайдинга ~9 пар нуклеотидов и не аппроксимировалась функцией

N2

Р (рис. 12), из чего можно сделать вывод о значительном вкладе хоппинга в коррелированный поиск.

А Б

г, нм N, п.н.

Рис. 12. Аппроксимация экспериментальной зависимости транслокационной компоненты Pt = PcJPe от расстояния между основаниями урацила для реакции коррелированного расщепления ДНК-субстрата ферментом Ung из

„N2

Е. coli функциями (А) А/г (хоппинг) и (Б) Р (слайдинг).

Выводы

1. Развит новый метод, позволяющий изучать параметры коррелированного поиска мишеней в ДНК ферментами репарации с использованием величины вероятности коррелированного расщепления (Рсс) субстратов, содержащих два фермент-специфических сайта. Показано, что метод применим для исследования коррелированного

поиска мишеней как в одноцепочечной, так и в двуцепочечной ДНК.

2. Показано различное влияние ионов Mg2+ и К+ на эффективность коррелированного поиска мишеней в двуцепочечной ДНК урацил-ДНК-гликозилазой Ung из Е. coli, объясняемое разной способностью этих ионов образовывать с ДНК координационные связи и экранировать отрицательный заряд ДНК. Установлено отсутствие значительного влияния эффекта вытесненного объема, одноцепочечных разрывов и брешей различной длины на величину Рсс. Показано значительное влияние ДНК-связывающих белков в клеточных экстрактах на величину Рсс урацил-ДНК-гликозилазы.

3. Исследовано влияние N-концевого фрагмента ядерной изоформы урацил-ДНК-гликозилазы человека (UNG) на эффективность коррелированного поиска мишеней этим ферментом. При низкой ионной силе N-концевой фрагмент уменьшает значения Рсс, а при оптимальной концентрации соли — увеличивает их, что может быть связано с увеличением сродства полноразмерной формы UNG к ДНК за счёт положительного заряда N-концевого фрагмента.

4. Показано, что АП-эндонуклеазы человека (АРЕХ1) и Е. coli (Nfo) способны к коррелированному расщеплению ДНК-субстратов, причем значения Рсс при концентрациях KCl, близких к физиологическим (100-200 мМ), достигают 0,2-0,5, что указывает на возможность реализации АП-эндонуклеазами коррелированного поиска in vivo.

5. При помощи теории Белоцерковского-Зарлинга, описывающей процесс одномерной диффузии белков по ДНК, оценены параметры поиска мишеней ферментом Ung: характерная дистанция коррелированного поиска (100 пар нуклеотидов), вероятность отражения от концов линейного субстрата (0,83), константа скорости транслокации (2x106 с4) и константа скорости диссоциации комплекса белок-ДНК при расположении фермента на конце линейной ДНК (4x105 с"1). Установлено, что хоппинг вносит значительный вклад в коррелированный поиск мишеней ферментом Ung, при

этом характерная дистанция слайдинга составляет 8-9 пар нуклеотидов.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Sidorenko V.S., Mechetin G.V., Nevinsky G.A., ZharkovD.O. Correlated cleavage of single- and double-stranded substrates by uracil-DNA glycosylase // FEBS Lett. - 2008. - V. 582 - № 3. -P. 410-414.

2. ZharkovD.O., Mechetin G.V.. Nevinsky G.A. Uracil-DNA glycosylase: Structural, thermodynamic and kinetic aspects of lesion search and recognition // Mutat. Res. - 2010. - V. 685. № 1-2.-P. 11-20.

3. Мечетин Г.В., Жарков Д.О. Механизм поиска субстратов ферментами эксцизионной репарации оснований // Доклады АН. - 2011. - Т. 437. - № 5. - С. 695-698.

4. MechetinG.V., ZharkovD.O. Mechanism of translocation of uracil-DNA glycosylase from Escherichia coli between distributed lesions // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2011. - V. 414. -№ 2. P. 425-430.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата химических наук, Мечетин, Григорий Вениаминович, Новосибирск

61 12-2/214

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИНСТИТУТ ХИМИЧЕСКОЙ БИОЛОГИИ И ФУНДАМЕНТАЛЬНОЙ

МЕДИЦИНЫ

на правах рукописи

Мечетин Григорий Вениаминович

Процессивность ферментов эксцизионной репарации

оснований

03.01.04 - Биохимия

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени

»

кандидата химических наук

Научный руководитель доктор биологических наук, доцент Жарков Д. О.

Новосибирск - 2011

Содержание

1. Список принятых сокращений.................................................................................4

2. ВВЕДЕНИЕ................................................................................................................6

3.1. Повреждения ДНК и их последствия..............................................................9

3.1.1. Апурин-апиримидиновые сайты...............................................................10

3.1.2. Урацил и другие продукты дезаминирования оснований ДНК.............11

3.1.3. Продукты электрофильного присоединения...........................................13

3.1.4. Фотопродукты.............................................................................................15

3.1.5. Окислительные повреждения ДНК...........................................................15

3.1.5.1. Окислительные повреждения пиримидиновых оснований.............16

3.1.5.2. Окислительные повреждения пуриновых оснований......................18

3.2. Репарация ДНК................................................................................................19

3.2.1. Эксцизионная репарация оснований........................................................20

3.2.1.1. Структура, свойства и механизм действия ДНК-ТУ-гликозилаз......25

3.2.1.2. Структура, свойства и механизм действия АП-эндонуклеаз..........30

3.2.1.3. Механизм дискриминации повреждений ДНК-ГчГ-гликозилазами и АП-эндонуклеазами........................................................................................................32

3.3 Механизмы поиска специфических мишеней ДНК-зависимыми белками...

...........................................................................................................................34

3.3.1 Влияние дополнительных последовательностей и макромолекулярного

окружения на механизмы поиска мишеней ДНК-зависимыми белками.......................45

4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ...................................................................................48

4.1. Реактивы...........................................................................................................48

4.2. Дезоксирибоолигонуклеотиды.......................................................................48

4.3. «Ферменты.........................................................................................................49

4.4. Штаммы бактерий и клеточные линии.........................................................50

4.5. Получение экстракта клеток Е. coli...............................................................50

4.6 Получение экстракта клеток RPMI-8226......................................................50

4.7. Определение суммарной концентрации белка в экстрактах Е. coli и клеток линии RTMI-8226....................................................................................................................51

4.8. Гель-электрофорез и количественный обсчет результатов экспериментов.. ...........................................................................................................................51

4.9. Введение радиоактивной метки в дезоксирибоолигонуклеотиды.............52

4.10. Стандартные условия отжига комплементарных цепей олигонуклеотидов. ...........................................................................................................................52

4.11. Получение субстратов для изучения коррелированного расщепления.....52

4.12. Определение кинетических параметров расщепления субстратов, содержащих единичное повреждение...................................................................................54

4.13. Изучение коррелированного расщепления субстратов, содержащих два повреждения ...........................................................................................................................55

4.14 Анализ зависимости величины вероятности коррелированного поиска от расстояния между сайтами расщепления.............................................................................56

4.15 Анализ распределения поверхностного потенциала и заряда ДНК-связывающей области для урацил-ДНК-гликозилаз и АП-эндонуклеаз...........................57

5. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ..................................................................58

5.1. Основы предложенного метода.....................................................................58

5.2. Влияние условий реакции, имитирующих внутриклеточные условия, на коррелированное расщепление субстратов ферментом Ung из Е. coli..............................65

5.3. Коррелированное расщепление ДНК полноразмерной урацил-ДНК-гликозилазой человека и ее каталитическим доменом........................................................71

5.4. Коррелированный поиск мишеней АП-эндонуклеазами АРЕХ1 и Nfo из человека и Е. coli.....................................................................................................................74

5.5. Влияние расстояния между фермент-специфическими сайтами на вероятность коррелированного расщепления Ung из Е. coli..............................................79

5.5.1. Проверка теории Белоцерковского-Зарлинга..........................................80

5.5.2. Определение параметров коррелированного поиска Ura ферментом Ung из Е. coli при помощи теории Белоцерковского-Зарлинга......................................88

6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.......................................................................................................92

7. ВЫВОДЫ.................................................................................................................93

8. ПРИЛОЖЕНИЯ.......................................................................................................95

9. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.......................................................................................97

1. Список принятых сокращений

3-metAde 3-метиладенин

5-metCyt 5-метилдитозин

5-OH-Cyt 5 -ги дроксицитозин

5-OH-dCTP 5-гидроксидезоксирибоцитидинтрифосфат

5-OH-dCyd дезоксирибо-5-гидроксицитидин

5-OH-Ura 5 -гидроксиурацил

5-OH-dUra дезоксирибо-5-гидроксиурацил

5-OH-dUrd дезоксирибо-5-гидроксиуридин

5-OH-dUTP 5-гидроксидезоксирибоуридинтрифосфат

7-metGua 7-метилгуанин

8-oxoAde 8-оксо-7,8-дигидроаденин

8-oxoGua 8-оксогуанин

8-oxodGua дезоксирибо-8-оксогуанозин

Ade аденозин

Gua гуанозин

Cyt цитозин

ATP аденозинтрифосфат

dAdo дезоксирибоаденозин

dAMP дезоксирибоаденозинмонофосфат

dGMP дезоксирибогуанозинмонорфосфат

dGuo дезоксирибогуанозин

dCMP дезоксирибоцитидинмонофосфат

dCyd дезоксирибоцитидин

dNMP дизоксирибонуклеотидмонофосфат

Thd дезоксириботимидин

dTMP дезоксириботимидинмонофосфат

dUMP дезоксирибоуридинмонофосфат

dUrd дезоксирибоуридин

dUTP дезоксирибоуридинтрифосфат

Fapy-Gua 2,6-диамино-4-оксо-5-формамидопиримидин

Fapy-Ade 4,6-диамино-5-формамидоаденин

HhH мотив «спираль — шпилька — спираль» (Helix — hairpin — Helix)

Н2ТН мотив «спираль — два поворота — спираль» (Helix — 2 Turns —

Helix)

Hyp гипоксантин

06-metGua О6 -метилгуанин

охоАР окисленный апуриновый/апиримидиновый сайт

THF (3 -гидрокситетрагидрофуран-2-ил)метилфосфат

Thy тимин

Tg тимингликоль

Ura урацил

Хап ксантин

sAde 1 ^-этеноаденин

sCyt 3,7V4-этеноцитозин

-Л Л

eGua N ' -этеногуанин, 1 ,N -этеногуанин

АП-сайт апуриновый-апиримидиновый сайт АП-эндонуклеаза апуриновая/апиримидиновая эндонуклеаза

АСМ атомно-силовая микроскопия

АФК активные формы кислорода

БСА бычий сывороточный альбумин

ДТТ дитиотреитол

дц двуцепочечный

ед.акт. единица активности

нт. нуклеотид

ОДН олигодезоксинуклеотид(ы), олигодезоксинуклеотидный

ОФМ одномолекулярная флуоресцентная микроскопия

оц одноцепочечный

ПААГ полиакриламидный гель

п.н. пара нуклеотидов

ПЭГ полиэтиленгликоль

Трис Трис(гидроксиметил)аминометан

УФ-излучение ультрафиолетовое излучение

Э ДТ A N,N,№ ,Л" -этилендиаминтетрауксусная кислота

ЭРО эксцизионная репарация оснований

ЦПД циклобутановый пиримидиновый димер

2. ВВЕДЕНИЕ

Молекула ДНК — основной носитель генетической информации — постоянно подвергается воздействию спонтанных (эндогенных) и экзогенных повреждающих факторов различной природы. Такими факторами могут быть различные виды ионизирующего излучения, химически активные соединения, активные формы кислорода, вещества, образующие объёмные аддукты с ДНК (то есть продукты ковалентного присоединения крупных молекул, таких как полициклические ароматические углеводороды, или молекулы белка, к ДНК). Повреждения ДНК и, как следствие, мутации могут повлечь за собой серьёзные патологические состояния как организма, подвергшегося их воздействию, так и проявиться на фенотипическом уровне в последующих поколениях. Функцию исправления повреждений и их последствий в организме осуществляет система репарации ДНК, включающая в себя эксцизионную репарацию оснований (ЭРО), эксцизионную репарацию нуклеотидов, фотореактивацию пиримидиновых димеров, другие системы реактивации определённых классов повреждений, репарацию гетеродуплексов (здесь и далее под гетеродуплексом понимается неканоническая пара оснований ДНК или петля размером до ~6 нуклеотидов), а также репарацию двуцепочечных (дц-) разрывов ДНК, в которую входят гомологичная рекомбинация и воссоединение негомологичных концов. ЭРО является одним из наиболее значимых репарационных путей в живых системах благодаря способности специфически удалять широкий спектр часто возникающих повреждений ДНК различной химической природы. Главная составляющая системы ЭРО — набор специфических ферментов, ДНК-А^-гликозилаз, каждая из которых, обладая более или менее широкой субстратной специфичностью, удаляет из ДНК определённый набор модифицированных оснований. После удаления поврежденного основания возникший в ДНК апурин-апиримидиновый сайт (АП-сайт) или разрыв с модифицированными концами подвергается процессингу другим компонентом системы ЭРО — ферментом АП-эндонуклеазой. На завершающих этапах ЭРО происходит репаративный синтез ДНК с участием ДНК-полимераз и лигирование разрыва.

Как ключевые компоненты системы ЭРО, ДНК-гликозилазы и АП-эндонуклеазы должны обладать способностью быстро корректировать ошибки в геноме значительных размеров на фоне большого избытка неповреждённых оснований. При этом ни ДНК-гликозилазы, ни АП-эндонуклеазы не используют активный транспорт вдоль цепи ДНК, зависящий от энергии гидролиза рибонуклеозидтрифосфатов, который мог бы ускорить процесс поиска. В то же время, проблема быстрого нахождения специфических мишеней

в геномной ДНК на фоне большого избытка неспецифической ДНК затрагивает не только ферменты ЭРО, но и другие ДНК-зависимые белки, не использующие активный транспорт вдоль ДНК и распознающие специфические модификации или специфические последовательности геномной ДНК: факторы инициации транскрипции, эндонуклеазы рестрикции и т.п.

На сегодняшний день рассматривают четыре нуклеозидтрифосфатнезависимых механизма поиска специфических сайтов расщепления или связывания ДНК-зависимыми белковыми факторами. Дистрибутивный механизм заключается в частых событиях ассоциации белка с ДНК в произвольном месте и последующей диссоциации комплекса без перемещения белка по ДНК. В случае, если белок обладает каталитической активностью, связавшись непосредственно с мишенью (например, поврежденным основанием) в составе ДНК и расщепив повреждение, он высвобождает ДНК, продолжая поиск в режиме трёхмерной диффузии. Механизм слайдинга подразумевает одномерную диффузию белка вдоль двойной цепи ДНК в случайном направлении под действием термодинамических флуктуаций. При нахождении повреждения фермент его расщепляет и продолжает одномерную диффузию до следующего акта распознавания. Если же рассматривается некаталитический сайт-специфический белок, то он остается связанным с мишенью. По прошествии некоторого времени комплекс белок-ДНК диссоциирует. Механизм хоппинга подобен модели одномерной диффузии при слайдинге, но в дополнение к ней, предполагает, что может происходить увеличение расстояния между поверхностями ДНК и белка на несколько молекулярных слоев воды без полной потери взаимодействия ДНК-белок. Связь лишь ослабляется и сохраняется благодаря взаимодействию белка с ДНК через так называемую «водяную подушку». В случае интерсегментного переноса поиск осуществляется благодаря сближению двух сегментов ДНК в пространстве и переносу белка с одного сегмента на другой, что требует наличия более чем одного ДНК-связывающего домена у белка. Механизмы слайдинга и хоппинга объединяются под названием коррелированного поиска, так как положение белка на ДНК на любом шаге поиска коррелирует с его положением на предыдущем шаге.

Если белковый фактор является ферментом, его способность осуществлять несколько каталитических актов без высвобождения ДНК называется процессивностъю. Понятие процессивности часто используется при описании функционирования ДНК-полимераз, у которых процессивность определяется как способность включать несколько дезоксинуклеозидмонофосфатов без распада фермент-субстратного комплекса и не включает акта транслокации между специфическими сайтами-мишенями. Однако в случае других ферментов основной характеристикой процессивности служит именно

способность оставаться связанными с ДНК после завершения одного каталитического акта и продолжать поиск мишеней-субстратов.

К настоящему моменту существует два распространённых метода изучения механизма поиска повреждений ферментами репарации. В первом методе используют дезоксирибонуклеотидный конкатемер, то есть полимерный двуцепочечный дезоксирибонуклеотид, состоящий из одинаковых блоков, каждый из которых содержит фермент-специфический сайт расщепления. В условиях избытка субстрата над ферментом будет накапливаться мономерный продукт (продукт расщепления фермент-специфических сайтов в соседних блоках), соответствующий коррелированному механизму поиска, и олигомерные продукты, соответствующие дистрибутивной модели. В другом методе используется суперскрученная плазмида, содержащая случайно распределённые между цепями повреждения. При коррелированном механизме поиска будет накапливаться линейная форма плазмиды за счет более быстрого расщепления повреждений, находящихся в противоположных цепях ДНК на небольшом расстоянии друг от друга, в то время как дистрибутивной модели соответствует преимущественное накопление релаксированной формы плазмиды. Однако данные методы имеют ряд существенных недостатков, ограничивающих их применение для исследования механизмов поиска мишеней ферментами реапрации.

Цель настоящей работы состояла в развитии нового биохимического подхода для изучения механизма поиска повреждений ДНК ферментами репарации, позволяющего оценить параметры этого процесса, а также в изучении влияния различных факторов на механизм поиска, используемый ферментами репарации. В ходе исследования необходимо было решить следующие задачи:

• развить метод, позволяющий количественно описать механизм транслокации ферментов репарации вдоль двойной цепи;

• для урацил-ДНК-гликозилазы из Е. coli (.Eco-XJng) изучить влияние ионов К+ и Mg2+, эффекта вытесненного объема, ДНК-связывающих белков, разрывов и брешей разной протяжённости в ДНК на процесс поиска повреждений;

• сравнить механизмы поиска повреждений, осуществляемого полноразмерной ядерной изоформой урацил-ДНК-Лг-гликозилазы человека (hUNG) и ее каталитическим доменом (hUNGAN93);

• изучить поиск повреждений в ДНК АП-эндонуклеазами Е. coli (Eco-Nfo) и человека (hAPEXl).

• оценить кинетические параметры одномерной диффузии фермента Ung вдоль ДНК.

3. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Возникнув несколько миллиардов лет назад, живые системы столкнулись с проблемой исправления ошибок и повреждений генетического материала, появляющихся вследствие воздействия как внешних факторов окружающей среды так и эндогенных процессов [1]. Для решения этой проблемы в процессе эволюции возникли несколько различных систем репарации ДНК. Эффективное исправление повреждений ферментами репарации в геноме огромных размеров требует использования специального механизма поиска модификаций и ошибок в ДНК, чтобы репарация протекала достаточно быстро для предотвращения ошибок репликации.

3.1. Повреждения ДНК и их последствия

Повреждения в молекуле ДНК в клетке могут возникать как спонтанно (эндогенные повреждения), так и под действием различных факторов внешней среды. Под спонтанными повреждениями понимаются модификации ДНК, возникающие в клетке постоянно, без внешних воздействий. К наиболее частым спонтанным повреждениям относятся апурин-апиримидиновые (АП-) сайты, продукты дезаминирования канонических оснований, окислительные повреждения ДНК, возникающие под действием продуктов кислородного метаболизма, основания, алкилированные внутриклеточными переносчиками метильной группы (^-аденозилметионином и т.п.), неканонические пары, возникающие при ошибках репликации. К числу типичных внешних факторов можно отнести ионизирующие излучения различной природы, ультрафиолетовое (УФ-) излучение, агрессивные химические соединения, способные алкилировать или окислять ДНК, ксенобиотики, способные образовывать объёмные аддукты с ДНК. В то время, как причины повреждений могут быть разделены на спонтанные и экзогенные, чёткого разделения самих повреждений по происхождению на внутреннее и внешнее не существует, так как спектры повреждений, вызываемых спонтанными и внешними факторами в значительной мере перекрываются. Ионизирующие излучения, например, генерируют в водной среде те же радикалы, что и клеточный метаболизм кислорода, что приводит к появлению одних и тех же окислительных повреждений ДНК. С другой стороны, объёмные аддукты ДНК можно привести как при�