Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Функции и механизм действия эукариотических ферментов NEIL1 и NEIL2

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Функции и механизм действия эукариотических ферментов NEIL1 и NEIL2"

004609124

На правах рукописи

ГРИН ИНГА РОСТИСЛАВОВНА

ФУНКЦИИ И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ 1Ш1Л И №1Ь2

03.01.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Новосибирск - 2010

004609124

Работа выполнена в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Научный руководитель:

д.б.н. Жарков Дмитрий Олегович

Официальные оппоненты:

д.х.н., профессор, чл.-корр. РАН Лаврик Ольга Ивановна к.б.н. Гончар Данила Александрович

Ведущая организация:

Институт молекулярной генетики РАН

Защита состоится » _2010 г. в /О часов

на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 при

Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

по адресу: 630090, Новосибирск, пр. акад. Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

С авторефератом можно ознакомиться на сайте www.niboch.nsc.ru

Автореферат разослан « » /¿¿ОлР_2010 г.

Учёный секретарь диссертационного совет; к.х.н., доцент Г

//

оваль В.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Репарация ДНК относится к числу важнейших клеточных процессов. Большинство повреждений в ДНК исправляются с помощью системы эксцизионной репарации оснований (ЭРО). В этой системе поврежденные основания узнаются и выщепляются из ДНК специфичными ферментами ДНК-гликозилазами, а затем с участием ферментов апурин-апиримидиновых (АП-) эндонуклеаз, дезоксирибо-5'-фосфатаиаз (dRP-лиаз), ДНК-полимераз и ДНК-лигаз спираль ДНК восстанавливается. Несколько лет назад были открыты ДНК-гликозилазы млекопитающих NEIL1, NEIL2 и NEIL3, гомологичные бактериальным белкам формамидопиримидин-ДНК-гликозилазе (Fpg) и эндонуклеазе VIII (Ne¡). Для белков NEIL1 и NEIL2 было показано, что они способны удалять из ДНК некоторые окисленные основания. Однако все эти основания также могут подвергаться репарации с участием других ДНК-гликозилаз. Таким образом, вопрос о функциях белков NEIL в клетках млекопитающих пока остается открытым. Кроме того, для многих поврежденных оснований ДНК до сих пор не известны гликозилазы, инициирующие их репарацию, и вполне можно предположить, что какие-то из этих оснований удаляются ферментами NEIL. Особый интерес представляют разные способы модуляции функций ДНК-гликозилаз. Показано ингибирование ряда ДНК-гликозилаз ионами тяжелых металлов и описаны случаи синергичного воздействия активных форм кислорода и ионов тяжелых металлов на процессы мутагенеза. Однако взаимодействие ионов металлов с другими белками суперсемейства Fpg/Nei практически не изучалось, а для белков NEIL такие исследования не проводились вообще. Кроме того, активность ДНК-гликозилаз, их стабильность и внутриклеточная локализация может активно регулироваться различными видами пострансляционной модификации. Таким образом, изучение регуляции активности ДНК-гликозилаз NEIL позволило бы выявить модификацию значимых аминокислотных остатков семейства Fpg/Nei.

Цель данной работы заключалась в установлении новых функций и способов модуляции активности ДНК-гликозилаз NEIL1 и NEIL2. Для этого в процессе работы было необходимо решить следующие задачи:

1) исследовать возможность и условия проявления ферментами NEIL дезоксирибо фосфат-5 '-лиазной активности;

2) изучить способность ферментов NEIL удалять из ДНК поврежденные основания 8-oxoAde;

3) исследовать влияние ионов металлов на активность ферментов суперсемейства Fpg/Nei;

4) определить нуклеофильные остатки - потенциальные сайты ковалентной модификации в составе ферментов суперсемейства Fpg/Nei.

Научная новизна и практическая ценность работы. Работа представляет собой разностороннее исследование субстратной специфичности и различных

факторов, влияющих на активность ДНК-гликозилаз NEIL. Впервые показано, что ДНК-гликозилазы NEIL1 и NEIL2 человека катализируют реакцию ß-элиминирования дезоксирибонуклеозид-5'-фосфата, определены значения кинетических параметров этой реакции, охарактеризованы предпочтительные субстраты, проведена реконструкция полной системы репарации с участием ферментов NEIL1 и NEIL2. Установлено, что NEIL1 удаляет 8-оксоаденин из пар с цитозином, но не из других пар, причем для эффективной репарации в этом случае требуется участие полину клеотидкиназы-З'-фосфатазы. Установлено, что активность ДНК-гликозилазы NEIL1 и гомологичных ей бактериальных ферментов из структурного суперсемейства Fpg/Nei ингибируется ионами Cd2+, Zn2+ и Cu2+, что частично обусловлено связыванием металлов с ДНК. Установлено, что фермент NEIL2 инактивируется пиридоксаль-5'-фосфатом за счет образования с ним ковалентного аддукта - основания Шиффа с остатком Lys50, что приводит к потере способности фермента связывать ДНК. Результаты работы позволяют глубже понять механизмы удаления повреждений из ДНК и возможность регуляции активности ферментов репарации в протекании этих процессов.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 4 печатных работы. Результаты работы были представлены н а международных кон ференциях «International Con ference on Ch emical Biology» (Новосибирск, 2005), «IXth International Workshop on Radiation Damage to DNA» (Текирова, Турция, 2006), «Физико-химическая биология» (Новосибирск, 2006), «International Free Radical Summer School 2006: Biomarkers of oxidative stress and responses» (Спеце, Греция, 2006), «3rd International Conference Basic Science for Medicine» (Новосибирск, 2007), «10th International Conference on Environmental Mutagens (ICEM) and 39th Annual Meeting of the European Environmental Mutagen Society (EEMS)» (Флоренция, Италия, 2009) и на конференции «Медицинская геномика и протеомика» (Новосибирск, 2009).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 139 страницах машинописного текста, содержит 46 рисунков и 4 таблицы. Библиография включает 281 литературный источник.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Дезоксирибофосфатлиазная активность белков NEIL

dRP-лиазная реакция лимитирует скорость всего пути ЭРО. В клетках млекопитающих dRP-фрагмент в основном удаляется dRP-лиазной активностью ДНК-полимеразы ß (POLß). У Е. coli эта активность принадлежит белку Fpg. Исходя из гомологичности последовательностей белков Fpg, Nei и NEIL1-NEIL3, можно предположить, что белки NEIL могут тоже обладать dRP-лиазной

активностью. Для изучения dRP-лиазной активности были получены олигонуклеотидные субстраты, содержащие 5'-dRP-фрагмент и радиоактивную метку на 3'-конце. Как NEIL1, так и NEIL2 обладали активностью, удаляющей dRP-фрагмент (Рис. 1). Ферменты NEIL1 и NEIL2 удаляли dRP-фрагмент более эффективно, если в ДНК-субстрате напротив него находились основания Ade, Cyt, или Thy; dRP-лиаза POLß удаляет dRP-фрагмент с одинаковой эффективностью при наличии напротив него любого основания. Во всех случаях dRP-лиазная активность фермента NEIL1 была выше, чем у фермента NEIL2.

Рис. 1 dRP-лиазная активность ферментов NEIL1 и NE1L2. А -радиоавтограф геля после электрофоре™ ческого разделения продуктов реакции отщепления dRP-фрагмента ферментами NEIL1 и NEJL2. Субстрат (20 нМ) обрабатывали ферментами 40 нМ NEIL1 или 70 нМ NEIL2 в течение 10 мин. 1 - U-содержащий олигонукпеотид; 2-5 — dRP-содержащий одигонуклеотид после обработки NaOH (2), ферментом NEIL1 (4) или ферментом NEIL2 (5). В реакциях в дорожках 3-5 dRP-содержащий олигонукпеотид

стабилизировали NaBHj для предотвращения деградации при электрофорезе. Стрелками отмечена подвижность соответствующих

олигонуклеотидов при электрофорезе в ПААГ. Б — график зависимости концентрации продукта отщепления dRP-фрагмента ферментами NEIL1 (•) или NEIL2 (О) от времени. Концентрация субстрата составляла ЮОнМ, концентрация ферментов - ЮнМ. В - радиоавтограф геля после разделения продуктов реакции восстановления NaBH< ковалентных аддуктов разных dRP-лиаз с dRP-содержащим субстратом (40 нМ), меченым 12Р: 1 - без фермента; 2 - NEIL1 (0.9 мкМ); 3 -NEIL2 (1.8 мкМ); 4- POLß (1.8 мкМ); 5 - Fpg (0.9 мкМ).

Для подтверждения предположения что, как и в случае ферментов POLß и Fpg, реакция удаления dRP-фрагмента, катализируемая ферментами NEIL1 и NEIL2, проходит по механизму ß-элиминирования, реакция была проведена в присутствии NaBH4. Если в ходе реакции образуется основание Шиффа между нуклеофильной каталитической аминогруппой dRP-лиазы и атомом С Г dRP-фрагмента, NaBH4 восстанавливает ненасыщенную связь, и образуется стабильный ковалентный аддукт фермент-ДНК. При восстановлении NaBH4 комплексов с З'-меченым dRP-субстратом ферменты NEIL1, NEIL2, Fpg и POLß образовывали комплексы с низкой подвижностью (Рис. 1В). Подвижности комплексов при электрофорезе совпадали с ожидаемыми.

Для количественного сравнения dRP-лиазной активности NEIL1 и NEIL2 с аналогичной активностью POLß были определены кинетические параметры реакции для всех трех ферментов (Табл. 1). При сравнении констант специфичности (квр = kcJKM) в реакции удаления dRP-фрагмента из ДНК фермент NEIL1 оказался столь же эффективен, как и POLß, и оба эти фермента превосходили фермент NEIL2. Значение константы Михаэлиса Ки для фермента NEIL1 было примерно в 5 раз ниже, чем для POLß, что указывает на большее сродство фермента NEIL1 к dRP-содержащему субстрату и на возможность конкуренции NEIL1 с POLß за этот субстрат при наличии обоих ферментов.

В ходе обычной ЭРО удаление dRP-фрагмента главным образом катализируется POLß после включения правильного dNMP. Для сравнения dRP-лиазной активности ферментов NEIL при утилизации субстрата с нависающим dRP-фрагментом возле одноцепочечного разрыва и субстрата, содержащего 5'-dRP-фрагмент до репаративного синтеза ДНК, была использована ДНК-полимераза ß с инактивированной dRP-лиазной функцией (mPOLß). Нависающий dRP-фрагмент после вставки одного dNMP с помощью mPOLß оказался более предпочтительным субстратом для NEIL1 и NEIL2.

Табл. 1. Кинетические параметры dRP-лиазной реакции, катализируемой NEIL1, NEIL2, и POLß

Фермент Км. мкМ км, мин 1 KJKм, мкМ~'мин~'

NEIL1 0.21 ±0.03 0.65 ± 0.04 3.1 ±0.2

NEIL2 2.2 ±0.7 1.6 ±0.1 0.74 ±0.32

POLß 1.0 ± 0.1 3.0 ±0.1 3.0±0.1

Для анализа dRP-лиазной активности ферментов NEIL1 и NEIL2 в мультиферментном процессе был реконструирован полный цикл ЭРО, включающий стадии удаления основания, расщепления АП-сайта, застройки бреши и удаления dRP-фрагмента. Для этого были использованы ферменты человека: урацил-ДНК-гликозилаза (UNG) или 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаза (OGG1), АП-эндонуклеаза (АРЕХ1), POLß и NEIL1 или NEIL2, а также олигонуклеотидные субстраты, содержащие поврежденные звенья: урацил (Ura), АП-сайт и 8-оксогуанин (8-oxoGua). Когда Ura-субстрат обрабатывали одновременно ферментами UNG, АРЕХ1 и POLß, основным продуктом выступал одноцепочечный разрыв ДНК, способный к дальнейшему лигированию (Рис. 2А). При использовании фермента mPOLß стадия достройки проходила столь же эффективно, но число разрывов, способных к лигированию, было гораздо ниже из-за того, что нависающий dRP-фрагмент мешал ДНК-лигазе завершить цикл репарации. Как фермент NEIL1, так и фермент NEIL2 (Рис. 2А) восстанавливали эффективное лигирование. Эффективность фермента NEIL1 в полном цикле ЭРО была выше по сравнению с NEIL2, что согласуется с кинетическими параметрами реакции. При реконструкции репарации АП-сайта.

единственным отличием от репарации ига было то, что процентное содержание лигируемых одноцепочечных разрывов было выше для всех сШР-лиаз.

UNG + + + + + + + + + + + +---

АРЕХ1 + + + + + + + + + + + +---

POLß - дд-мм-мм-мм---

NEIL1------+ + +----+ -

NEIL2---------+ + + -- +

лигаза + - + + - + + - + + - +---

OGG1 - -++++++++++++++

АРЕХ1 ---+ + + + + + - + ++ + + +

Fpg -+ --------------

POLß ~ ~ — дд-мм-мм-мм

NEIL1----------+ + +---

NEIL2-------------+ + +

лигаза ----+-++-++-++-+

Рис. 2. Реконструкция ЭРО с участием ферментов NEIL1 и NE1L2 как dRP-лиаз. Приведены радиоавтографы гелей после электрофоретического разделения продуктов реакции: А - для Ura-субстрата, Б - для 8-oxoGua-cy6crpaTa. Компоненты реакционной смеси указаны на рисунке. Стрелками отмечена подвижность соответствующих олигонуклеотидных субстратов, продуктов и интермедиатов. Процентное содержание лигируемых одноцепочечных разрывов рассчитывалось как процентное содержание 23-звенного олигонуклеотида в реакционной смеси, включающей все компоненты ЭРО за вычетом процентного содержания 23-звенного олигонуклеотида в реакционной смеси без ДНК-лигазы (дорожки 2, 5, 8 и 11 на рис. 24А; дорожки 6,9, 12 и 15 на рис. 24Б).

При реконструкции репарации 8-oxoGua-cy6cTpaTa требования к наличию dRP-лиазной активности в реакционной смеси были менее выражены. Тем не менее, ферменты NEIL1 и NEIL2 могли восстанавливать эффективность лигирования, не хуже, чем фермент POLß дикого типа (Рис. 2Б).

Удаление dRP-фрагмента представляет собой скоростьлимитирующую стадию процесса ЭРО и является наиболее удобной точкой для регуляции всего этого пути. Таким образом, нет ничего удивительного в том, что POLß может быть не единственной dRP-лиазой в клетках. В настоящей работе показано, что как минимум два других фермента репарации ДНК, NEIL1 и NEIL2, представляют собой функциональные dRP-лиазы in vitro. Эффективность катализа dRP-лиазной реакции этими ферментами сопоставима с таковой для POLß по кинетическим параметрам и по способности замещать POLß при реконструкции систем репарации Ura, АП-сайтов и 8-oxoGua.

Роль фермента NEIL1 в репарации 8-оксоаденина в ДНК

При действии активных форм кислорода на аденин (Ade) в качестве одного из основных продуктов окисления образуется 8-оксоаденин (oxoAde). Повышение уровня oxoAde отмечено в раковых клетках человека и в клетках мозга пациентов с болезнью Альцгеймера. В клетках млекопитающих in vivo

5

охоАёе слабо мутагенен (~1% плазмид, содержащих это звено в определенной позиции, несут мутации после репликации), причем среди мутаций преобладают трансверсии А-»С и транзиции А->0, что свидетельствует об образовании неканонических пар 8-охоА<1е:Оиа и 8-охоАс)е:Су1 как интермедиатов мутагенеза. Механизм репарации охоА<1е изучен недостаточно. До сих пор единственной ДНК-гликозилазой, способной удалять охоАёе, считалась ДНК-гликозилаза 0001. Интересно, что удаление поврежденного основания ферментом СЮ01 эффективно, только если охоАс!е находится в паре с Су1.

1 2 3 4 5 6

8-охоА: С А СОТ- 0 100 200 300 400

[Э], пМ

Рис. 3. А - радиоавтограф геля после электрофоретического разделения продуктов реакции расщепления различных олигонуклеотидов, содержащих 8-охоАс1е, ферментом ЫЕ1И. Реакционные смеси содержали следующие субстраты: 1,3- 8-охоЛск:СуГ, 2 - 8-oxoAde:Ade; 4 - 8-oxoAde:Gua; 5 -8-oxoAde:Thy; 6 - 8-oxoAde в одноцепочечной ДНК. Стрелками отмечена подвижность ДНК-субстрата (Б, 23 нт.) и продукта расщепления (Р, Юнг.). Б - график зависимости концентрации продукта от концентрации 8-oxoAde:Cyt-cyбстpaтa в реакции, катализируемой ферментами 10 нМ ЫЕИЛ (•) или 1 нМ 0001 (О). Для каждой концентрации субстрата указаны среднее и стандартная ошибка значения скорости по 3 независимым экспериментам, линии соответствуют аппроксимации данных по уравнению Михаэлиса-Ментен.

В число известных субстратов фермента ЫЕ1Ы входят окисленные пурины, например, формамидопиримидиновые производные, что указывает на пересечение субстратной специфичности с ООС1. В отличие от фермента 0001, который после удаления основания катализирует (З-элиминирование, фермент катализирует Р,5-элиминирование, оставляя в ДНК однонуклеотидную брешь, окруженную двумя фосфатами, что требует в дальнейшем участия полинуклеотидкиназы/З'-фосфатазы (РТ^КР) или других клеточных механизмов для удаления фосфата с 5'-стороны бреши и образования гидроксильного 3'-конца для дальнейшей работы ДНК-полимераз в процессе ЭРО.

Для анализа способности фермента ЫЕ1Ы расщеплять олигонуклеотиды, содержащие охоАёе, фермент инкубировали с субстратами, содержащими пары охоАйе:Аёе, охоАс1е:Оиа, охоАс!е:Су1, охоАс1е:ТЬу и охоАёе. Фермент КЕ1Ы эффективно расщеплял только oxoAde:Cyt (Рис. ЗА). Были установлены кинетические параметры для реакции расщепления охоАс1е:Су (-субстрата катализируемой ЫЕ11Л и 0001 (Рис. ЗБ). При анализе полученных данных в

6

рамках схемы Михаэлиса-Ментен значения для фермента N£^1 были примерно в 2 раза выше, чем для 0001, однако значения значение константы специфичности (к^/К^) было примерно в 5 раз выше, чем в случае №1Ь1 (Табл. 2). Тем не менее, значения кинетических параметров, полученные для фермента ЫЕ1Ы с использованием охоА<1е:Су1-субстрата, оказались сопоставимы со значениями соответствующих параметров при расщеплении этим ферментом других типов поврежденной ДНК.

Табл. 2. Кинетические параметры расщепления 8-охоА<1е:Су1-субстрата ферментами ИНЬ! и ООО!

фермент Км, нМ k«, мин"'

NEIL1 44±5 0,21 ±0,01 4,8 ±0,6

0GG1 84±8 2,3 ±0,1 27 ±3

В отличие от фермента 0GG1, фермент NEIL 1 не стимулировался АРЕХ1 ни при расщеплении. Добавление фермента POLß, в присутствии или в отсутствие dGTP, также не увеличивало эффективности расщепления. Ни в одном случае не наблюдалось изменения специфичности фермента к основанию напротив oxoAde. При реконструкции минимальной системы ЭРО, состоящей из ДНК-гликозилазы (0GG1 или NEIL1) и ферментов АРЕХ1, POLß и ДНК-лигазы Ша (LIG3a) репарация пары oxoAde:Cyt проходила до образования продукта ß,5-элиминирования и останавливалась без дальнейшего процессинга 3'-конца, тогда как в случае 0GG1 образовывался полноразмерный продукт. Добавление возрастающих количеств PNKP приводило к появлению продуктов включения dGMP, катализируемого ферментом POLß, но лигирования ДНК с восстановлением полноразмерного продукта ДНК при этом не происходило. Вероятно для завершения полного цикла репарации oxoAde:Cyt, инициируемой ДНК-гликозилазой NEIL1, требуются другие вспомогательные факторы.

Чтобы установить, какой из путей репарации oxoAde:Cyt-cy6cTpaTa будет доминировать при одновременном присутствии ферментов NEIL1 и 0GG1, был проведен анализ конкуренции этих ферментов за субстрат. Когда оба фермента присутствовали в смеси вместе с ферментами АРЕХ1, POLß и LIG3a, репарация в основном инициировалась с помощью ДНК-гликозилазы 0GG1, при этом наблюдались лишь небольшие количества продукта ß,5^HMHHHpoBaHM, и образовывался полностью лигированный субстрат (Рис. 4). Можно заключить, что репарация 8-oxoAde:Cyt-cy6cTpaToß, инициируемая ферментом NEIL1, вероятнее всего, представляет резервный способ репарации, а инициируемая ферментом 0GG1 - основной.

В данной работе впервые показана специфичность к основаниям напротив каких-либо окисленных оснований для фермента NEIL1. Более того, фермент NE1L1 не удаляет из ДНК какие-либо поврежденные пурины с неразорванным кольцом, кроме oxoAde. Хотя пара 8-oxoAde:Cyt представляет собой высокоспецифичный субстрат для фермента NEIL1, другие члены

7

суперсемейства Рр§/ТМе1 ДНК-гликозилаз не участвуют в репарации охоА<1е. Так, в условиях эффективного расщепления охоА(1е:Су1-субстрата ферментами ЫЕ11Л и ОСС1 наблюдалась крайне низкая активность Fpg по отношению к любым охоАёе-субстратам. Также не было обнаружено удаления 8-охоАс1е ферментом ЫЕ1Ь2.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

S —► - m

m тгех^ Q.OO. Ф Ф щь ашш

P1 —► m -

NEIL1 - + - + 4 +

OGG1 + + + + + + + + + + +

АРЕХ1 + + +■ ♦ + + + + ♦ +

POLß

mPOlfi + +

ÜG3u - - + - ♦ + + +

Рис. 4. Радиоавтограф геля после электрофорегимеского разделения продуктов реакции при реконструкции цикла репарации 8-oxoAde:Cyt-cy6cTpaTa с участием ДНК-гликозилаз OGG1 и NEIL1. Стрелками отмечена подвижность субстрата и разных видов продуктов и интермедиатов: S -олигонуклеотидный субстрат или продукт лигирования (23 нт); PI - продукт р,5-элиминирования (10 нт.); Р2 - продукт ß-элиминирования с последующим удалением а,р-ненасыщснного альдегида АРЕХ1; РЗ - продукт ß-элиминирования; Р4 - продукт включения dGMP ферментом POLß (11 нт ).

Существование двух ферментов, OGG1 и NE1L1, способных инициировать репарацию пар oxoAdeiCyt, но не пар oxoAde:Thy, указывает на возможную биологическую значимость первой из этих неканонических пар. Возможно, что в клетках млекопитающих фермент NEIL 1 может быть необходим для репарации пар 8-oxoAde:Cyt в отсутствие белка OGGI, в некоторых тканях, на определенных стадиях развития, либо в определенных фазах клеточного цикла.

Влияние ионов тяжелых металлов на активность NEIL1

Соединения, содержащие тяжелые металлы, принадлежат к числу самых распространенных генотоксичных агентов. Помимо непосредственного повреждения ДНК, генотоксичность тяжелых металлов в значительной мере обусловлена ингибированием их соединениями процессов репарации ДНК. Описаны случаи комутагенной активности ионов тяжелых металлов -синергичного действия их и окислительного стресса, приводящего к резкому возрастанию уровня мутаций.

Механизмы ингибирования репарации ионами тяжелых металлов слабо изучены. Для ДНК-гликозилаз семейства Fpg показано, что прокариотический

фермент Fpg ингибируется рядом тяжелых металлов in vitro за счет конкуренции за центр связывания иона Zn2+ в мотиве цинкового пальца. Белки Nei, NEIL2 и NEIL3 также содержат цинковый палец, но в литературе нет данных об их взаимодействии с ионами тяжелых металлов. В последовательности зукариотического белка NEIL1 мотив цинкового пальца отсутствует. Поэтому сравнительный анализ ингибирования ДНК-гликозилаз суперсемейства Fpg/Nei ионами тяжелых металлов представляет интерес для понимания механизма генотоксичности тяжелых металлов.

Для измерения кинетических параметров и влияния ионов тяжелых металлов на активность ДНК-гликозилаз семейства Fpg использовали двуцепочечный олигонуклеотидный субстрат, содержащий основание 5,6-дигидроурацила (H2Ura) в паре с Gua. При исследовании стационарной кинетики расщепления были получены значения Км= 150 ± 20 нМ, ксЛ = 1,2 ± 0,1 мин4 и ksp = (8,0 ± 0,2)* 10~3 нМ"'хмин"', что сравнимо со значениями, описанными в литературе для ДНК-субстратов, содержащих другие поврежденные основания.

При проведении реакции расщепления Н2ига-субстрата в присутствии солей металлов с использованием Трис-HCl в качестве буфера активность фермента NEIL1 заметно снижалась в случае Al3+, Ni2+, Pb2", Со2+, Cd2+, Zn2+, Cu2+ и Fe2f, но оставалась практически неизменной для Mg2+, VIп2 и Са2+ (Рис. 5А).

100

#

л-80 Ь О О £ 60 со

£

ГО 40 X

О 20

0

А1 № РЬ Со Ы 1гу Си Ре Мп Са Мд А1 № РЬ Со СЛ 2п Си Ре Мп Са Мд А| № РЬ Со СЙ Ъа Си Ре Мп Са Мд Рис. 5. Влияние ионов металлов (А1'+, РЬ2', Со", С<1", Ъ}\ Си2*, Ре2+, Мп2+, Саг+, М^ на реакцию расщепления Н2ига-субстрата, катализируемую ферментами ЫЕ11Л (А), Fpg (Б) и Ые1 (В). Приведен график относительной активности (среднее и стандартная ошибка 5 независимых экспериментов)

Для сравнения было исследовано влияние солей металлов на активность ферментов Fpg и N61 - прокариотических гомологов белка N£11.1 (Рис. 5Б, В). Было показано, что ингибирование расщепления Н2ига-субстрата этими ферментами происходит для тех же металлов, что и в случае фермента ЫЕ1Ы.

Для дальнейшего исследования были выбраны ионы Cd2+, Zn2* и Си"'. Для них были измерены значения [1]50 - концентрации, при которых активность фермента снижается на 50%. Значения [1]50 составили 7 ± 2 мкМ, 16 ± 7 мкМ и

400 ± 95 мкМ для Сс12+, Zn2+ и Си2+, соответственно. Снижение активности ферментов в присутствии ионов металлов может происходить за счет связывания последних с ферментом, с субстратом, или с фермент-субстратным комплексом, при этом возможно изменение эффективности разных стадий каталитической реакции. Исходя из этого, было изучено влияние С(12+, 2п2+ и Си2+ на разные стадии реакции, катализируемой ферментом ЫЕ1Ы. ДНК-гликозилазы семейства сначала гидролизуют Д'-гликозидную связь

поврежденного дезоксинуклеозида (ДНК-гликозилазная реакция), при этом образуется щелочнолабильный АП-сайт. Затем происходит последовательное элиминирование фосфатных групп с З'-стороны и с 5'-стороны от образовавшегося АП-сайта (АП-лиазная реакция). При обработке щелочью продуктов реакции, катализируемой ферментом ЫЕ1Ы, не наблюдалось увеличения выхода расщепленного олигонуклеотида, что свидетельствует о том, что ионы Сс12+, Хп2 и Си2+ не оказывают влияния на АП-лиазную стадию реакции, а ингибируют реакцию еще на ДНК-гликозилазной стадии.

Рис. 6. График относительной активности фермента N£11^ после инкубации фермента или Н2ига-субстрата в присутствии Сй2\ 7_п2* или Си2+ с последующим хелатированием ЭДТА. Приведены значения относительной активности I фермента ЫЕПД в реакции расщепления Н2ига-субстрата в следующих условиях: 1 - контроль (реакция в отсутствие металлов и ЭДТА); 2 -предварительная инкубация фермента с ЭДТА с последующим добавлением субстрата; 3 -предварительная инкубация субстрата с ЭДТА с

последующим добавлением фермента; 4—6 -

1 2 з 4 5 е 7 8 9 ю 11 12 реакция в присутствии Хп2+ (4), Сс12* (5) или Си2+ (6); 7-9 - предварительная инкубация фермента с 2.П1* (7), С<32+ (8) или Си2+ (9), с последующим хелатированием ЭДТА и добавлением субстрата; 10-12 - предварительная инкубация субстрата с Хп'* (10), Сё2+ (11) или Си2+ (12), с последующим хелатированием ЭДТА и добавлением фермента.

Для установления того, связываются ли ингибирующие ионы металлов с белком или ДНК, использовали хелатирование ионов металлов ЭДТА. Для этого фермент или субстрат инкубировали с металлом, вносили ЭДТА для хелатирования несвязанных ионов и инициировали реакцию добавлением субстрата или фермента соответственно. При хелатировании ионов металлов в случае предварительной инкубации с ферментом активность последнего восстанавливалась практически полностью (Рис. 6). В случае же предварительной инкубации с Н2ига-субстратом происходила лишь частичная реактивация фермента, но полностью активность не восстанавливалась (Рис. 6). Таким образом, весьма вероятно, что ионы СсГ, гпг+ и Си2+ ингибируют фермент ЫЕ1Ы за счет прочного связывания с ДНК-субстратом.

[-1

ППп п г-1

Было изучено влияние ионов Cd2+, Zn2^ и Cu2+ на связывание фермента NEIL1 с неповрежденной и поврежденной ДНК. В качестве модели поврежденной ДНК использовали двуцепочечный олигонуклеотид, содержащий остаток тетрагидрофурана (THF). В отсутствие ионов металлов фермент NEIL1 связывал поврежденный лиганд лучше, чем неповрежденный (Рис. 7), что согласуется с повышенным сродством всех известных ДНК-гликозилаз к поврежденной ДНК. Ионы Cd2+ снижали эффективность связывания фермента как с поврежденным, так и неповрежденным олигонуклеотидом, в то время как добавление в реакционную смесь ионов Zn2 снижало только связывание неповрежденного ДНК-лиганда. Напротив, в присутствии ионов Си2+, фермент NEIL1 лучше связывал неповрежденную ДНК, чем в отсутствие ионов металлов, а связывание THF-содержащего лиганда не изменялось. Как следствие, в присутствии ионов Cd2+ и Си2+ разница между эффективностью связывания поврежденной и неповрежденной ДНК ферментом NEIL1 исчезала, в то время как в присутствии ионов Zn2+ фермент сохранял повышенную специфичность связывания по отношению к поврежденной ДНК.

Рис. 7 Связывание фермента NEIL1 с поврежденной и неповрежденной ДНК. На графике показана доля неповрежденного лиганда (1, 3, 5, 7) или THF-лиганда (2, 4, 6, 8), связанных с ферментом в стандартных условиях. [EL] - концентрация комплекса NEIL1-лиганд; [L)0-общая концентрация лиганда. Показано связывание в отсутствие ионов металлов (1, 2) и в присутствии ионов Cd2+ (3, 4) Zn2+ (5, 6) и Cu2+ (7, 8). Приведено среднее и стандартная ошибка 3-8 независимых экспериментов, знаками * и # отмечены достоверные отличия по критерию Сгьюдента (# -/><0,05; **, ## - р<0,0\) между связыванием неповрежденного лиганда и THF-лиганда (*) или между связыванием одного и того же лиганда в отсутствие и в присутствии ионов металлов (#).

Ш

12 3 4 5 6 7

Ингибирование фермента К;Е1Ы ионами тяжелых металлов, в частности, Cd2+, может служить одним из объяснений их комутагенных свойств. В норме ионы многих токсичных металлов в клетке связаны в комплексах с белками металлотионеинами, откуда они могут высвобождаться при окислительном стрессе. Концентрация металлов в комплексе с металлотионеинами может достигать заметных величин: так, в ткани почек взрослого человека Cd даже на фоне допустимых концентраций в окружающей среде накапливается до уровня 30-40 мкг/г. Полное высвобождение такого количества соответствует субмиллимолярным концентрациям Cd2+, и даже частичное окисление металлотионеинов может привести к высвобождению количеств ионов тяжелых металлов, достаточных для того, чтобы заметно влиять на биохимические процессы в клетке. Таким образом, одновременное окислительное повреждение

ДНК и ингибирование ее репарации за счет высвобождения ионов тяжелых металлов из металлопротеиновых комплексов может вести к значительному усилению мутагенных последствий окислительного стресса.

Ковалентная модификация белка NEIL2 пиридоксаль-5'-фосфатом

Пиридоксаль-5'-фосфат (PLP) - необходимый кофактор ферментов, участвующих во многих этапах метаболизма аминокислот. За счет альдегидной функции 4'-формильной группы PLP в активном центре PLP-зависимых ферментов в свободном состоянии обычно ковалентно присоединяется к остатку лизина с образованием основания Шиффа. Помимо метаболических ферментов, ингибирование или инактивация под действием PLP показаны для многих РНК-полимераз, ДНК-полимераз, интеграз и топоизомераза. Во всех этих случаях ингибирование протекает за счет взаимодействия PLP с аминогруппой в активном центре фермента либо вблизи него. Взаимодействие PLP с ферментами ЭРО до настоящего времени не исследовалось.

PLP

PS-*-

1 2 3 4 5

7 8 9 10 11 12 13 14

Рис. 8. А - радиоавтограф геля после электрофоретического разделения продуктов реакции расщепления АП-субстрата немодифицированными бифункциональными ДНК-пшкозилазами и этими же ДНК-гликозилазами, конъюгированными с PLP. 1,2- контроль (АП-субстрат в отсутствие фермента); 3, 4 - DenV; 5,6 - Nth; 7, 8 - Nei, 9, 10 - Fpg; 11,12- NEIL2; 13, 14 - NE1L1. Стрелками отмечена подвижность субстрата (S, 23 нт.) и продуктов реакции (Рр - продукт реакции ß-элиминирования; Р5 - продукт реакции 5-элиминирования, 10 нт ). АП-субстрат (20 нМ) расщепляли ферментами (500 нМ) в присутствии (четные дорожки) или в отсутствие (нечетные дорожки) PLP в течение 30 мин в присутствии NaBHi. Б - радиоавтограф геля после электрофоретического разделения продуктов реакции расщепления АП-субстрата ферментом NEIL2 после предварительной инкубации фермента с PLP в присутствии или в отсутствие NaBHi. 1 - полностью активный фермент NEIL2; 2 - NEIL2 предварительно инкубировали с PLP без NaBKi; 3 - NEIL2 предварительно инкубировали с PLP и NaBHi; 4 - АП-субстрат в отсутствие фермента. Стрелками отмечена подвижность ДНК-субстрата (S, 23 нт.) и продукта расщепления (Р. 10 нт.). В - график зависимости накопления продукта от концентрации фермента при расщеплении АП-субстрата (100 нМ) ферментом NEIL2 после восстановления NaBH4 в присутствии (О) или в отсутствие (•) PLP.

Была исследована возможность влияния PLP на каталитическую активность ряда бифункциональных ДНК-гликозилаз. Ферменты Fpg, Nei, NEIL1, NEIL2, Nth, и DenV инкубировали в присутствии PLP и NaBH4 для предотвращения гидролиза образующегося основания Шиффа. Остаточная активность в реакции расщепления общего для всех ферментов субстрата — олигонуклеотида, содержащего АП-сайт - была оценена по сравнению с ферментом,

обработанным NaBH4 в отсутствие PLP (Рис. 8 А). Был использован избыток фермента (500 нМ) над субстратом (20 нМ) исходя из предположения, что если PLP модифицирует каталитическую нуклеофильную аминогруппу, то фермент должен полностью терять активность. В отсутствие PLP все исследуемые ферменты давали продукт с ожидаемой подвижностью. В присутствии PLP не наблюдалось снижения активности ферментов Nei и NEIL1 в условиях избытка фермента. Незначительное повышение количества нерасщепленного субстрата наблюдалось для ферментов Nth и DenV. Напротив, фермент NEIL2 почти полностью инактивировался под действием PLP (Рис. 8А). Восстановление основания Шиффа NaBH4 не было необходимо для инактивации фермента NEIL2 (Рис. 8Б). Активность фермента NEIL2, обработанного PLP, была ниже, чем активность необработанного фермента в широком диапазоне соотношений концентраций фермент: субстрат (Рис. 8В).Для других белков суперсемейства Fpg/Nei (Fpg, Nei, NEIL1) также была исследована их активность при разных соотношениях фермента и субстрата. Во всех случаях наблюдалось умеренная инактивация ферментов, однако ни в одном случае не наблюдалось настолько el полной инактивации, как для фермента NEIL2.

Рис. 9 Радиоавтограф геля после электрофоретического разделения свободного THF-лиганда (L) и его комплекса с ферментом NEIL2 (EL). 1 - инкубация в отсутствие фермента, 2-6 - инкубация в L присутствии комплекса NEIL2-PLP (2-1000 нМ), 7-11, инкубация в присутствии немодифицированного NEIL2 (2-1000 нМ).

Поскольку образование ковалентной связи обычно протекает достаточно медленно, можно было ожидать, что степень инактивации фермента NEIL2 будет зависеть от длительности инкубации фермента с PLP. NEIL2 инкубировали в присутствии PLP разное время, стабилизировали NaBH4 комплексы с основанием Шиффа и определяли относительное количество активного фермента в каждый момент времени. С увеличением времени предварительной инкубации с PLP доля остающегося активного фермента NE1L2, способного сшиваться с субстратом, понижалась. Полученные данные линеаризовали в полулогарифмических координатах, строя график зависимости I п( ([Е- S ] • S j L ü • S J г;—[Е * S )) от времени и определяя кажущуюся константу инактивации из наклона линейного графика. После построения графика значений kipp от концентраций PLP его можно было аппроксимировать прямой линией, пересекающей ось ординат. Из этого графика определяли константы скорости связывания фермента NEIL2 и PLP (коп = (1.34 ± 0.15)х 10 2 мМ'мин1) и гидролиза основания Шиффа (£off = (5.72 ± 0.84)х 10"2 мин"').

Для анализа возможных последствий взаимодействия фермента NEIL2 с PLP была изучена способность модифицированного и немодифицированного белка NEIL2 связывать поврежденную ДНК. В качестве модели поврежденной ДНК,

NBL2 PLF NhlLJ

12345678S10 11

был использован двуцепочечный олигонуклеотид, содержащий THF. Немодифицированный белок NEIL2 образовывал с этим лигандом комплекс, концентрация которого увеличивалась с ростом концентрации фермента. После обработки PLP белок NEIL2 полностью терял способность связывать THF-лиганд (Рис. 9).

Рис. 10. Масс-спектрометрическое секвенирование PLP-модифицированного пептида в белке NEIL2. А -хроматограмма общего ионного тока при разделении пептидов, полученных гидролизом эндопротеиназой Asp-N немодифицированного белков NEIL2 (врезка) и NEIL2, модифицированного PLP. В модифицированном образце наблюдался отсутствующий в контроле пик со временем удержания 42.33 мин. В масс-спектре этот пик идентифицировался как ион [М+ЗН]" с m/z 597.33. Расчетное значение m/z для иона [M+3H]+Î пептида 43DAQVHGK.KLFLRF5S, конъюгированного с одним остатком PLP, составляет 597.31, указывая на возможную модификацию именно этого пептида. Б -часть спектра MS/MS иона [М+ЗН]4 с m/z 597.33 в диапазоне m/z 400-1 ООО с указанием ионов основной последовательности. Жирным курсивом обозначены однозарядный ион t>7 с m/z 736.38 и комплементарный ему ион (у6+Руг) ион с m/z 956.58, а также как и пара комплементарных ионов (be+Pyr)+2/ys+'. Указана последовательность модифицированного пептида и ионы, наблюдаемые для нее в спектре.

Для более подробного установления механизма инактивации фермента NEIL2 при обработке PLP был идентифицирован сайт модификации в белке. Анализ методом MALDI показал, что одна молекула белка NEIL2 связывает один остаток PLP. Для непосредственной идентификации сайта модификации белок NEIL2, конъюгированный или не конъюгированный с PLP, гидролизовали эндопротеиназой Asp-N, которая специфично расщепляет пептидные связи с N-стороны от остатков Asp, и некоторые связи с М-стороны от остатков Glu. Продукты реакции анализировали методом LC/MS/MS (Рис. 10А). В случае немодифицированного белка NEIL2 в спектре LC/MS/MS был обнаружен пептид 43DAQVHGKKLFLRF55 как ион с зарядом +4, массой 1557,8 Да и временем удерживания на колонке 38,9 мин. При анализе белка NEIL2, конъюгированного

I ! 4M.

да

/ .1» / «.77

Коааленто модифицированный пелтид Расчетная [М*ЗН]" 597.31 Наблодааиая |М*ЗН|" 597 33

у

«О SM МО

с PLP, можно было заключить, что этот пептид модифицирован одним остатком PLP, по появлению в режиме LC/MS нового иона с зарядом +3 и m/z 597,33 (расчетное m/z 597,31) (Рис. 10А). Кажущаяся разница масс модифицированного пептида и пептида 43DAQVHGKKLFLRF55 составляла 231,09 Да при расчетной разнице масс 231,03 Да для конъюгата с одним остатком PLP.

Для изучаемого пептида в режиме LC/MS/MS была получена информация о последовательности (Рис. 10Б). Однозарядные ионы последовательности оту! до у5 четко идентифицировались вместе с ионами от Ь, до Ь7. Масс-спектр содержал пик однозарядного иона Ь7 с m/z 736,38, комплементарный ему ион у6, содержащий пиридоксальный остаток, (ув+Руг)+1 с m/z 956,58 и ион (Ь8+Руг)+2 с m/z 499,29. Ионы серии у с зарядами +1 и +2, соответствующие массе фрагмента с пиридоксальным остатком, продолжались от (у7+Руг) до (у!2+Руг). Следовательно, можно сказать, что основной сайт конъюгации PLP с белком NEIL2 соответствует остатку Lys50.

Фермент NEIL2 принадлежит к структурному суперсемейству Fpg/Nei, для которого характерна двухдоменная структура и наличие нескольких консервативных мотивов. Общая гомология последовательностей белков NEIL2, Nei и Fpg дает основание предполагать, что белок NEIL2 сохраняет общую структуру и основные структурные мотивы суперсемейства Fpg/Nei. При сопоставлении последовательностей участников суперсемейства Fpg/Nei оказывается, что Lys50 находится в короткой петле ß2/ß3, расположенной в междоменной ДНК-связывающей бороздке. Для NEIL2 ранее было показано ацетилирование соседнего остатка Lys49, значительно снижающее активность фермента. Результаты настоящей работы подчеркивают важность петли ß2/ß3 для активности белков Fpg/Nei и дают основания предполагать, что потеря активности фермента NEIL2 после ацетилирования по Lys49 тоже может происходить из-за потери белком способности связывать ДНК.

Выводы

1. Впервые показано, что ДНК-гликозилазы NEIL1 и NEIL2 человека катализируют реакцию ß-элиминирования 5'-концевого

дезоксирибо нуклеозид-5'-фосфата в процессе эксцизионной репарации оснований. Определены значения кинетических параметров данной реакции, которые оказались близки к значениям этих параметров для реакции, катализируемой ДНК-полимеразой ß. Установлено, что предпочтительным субстратом для проявления данной активности ферментов NEIL1 и NEIL2 служит интермедиат эксцизионной репарации оснований после включения dNMP ДНК-полимеразой ß. Проведена реконструкция полной системы эксцизионной репарации оснований для урацила, апурин-апиримидинового сайта и 7,8-дигидро-8-оксогуанина с участием ферментов NEIL1 и NE1L2 как дезоксирибонуклеозид-5'-фосфатлиаз.

2. Установлено, что NEIL1 эффективно удаляет 7,8-дигидро-8-оксоаденин (8-oxoAde) из пар с цитозином, но не из других пар. Показано, что значения кинетических параметров этой реакции близки к значениям параметров реакции удаления 8-oxoAde из пар 8-oxoAde:Cyt, катализируемой ферментом OGGI. Выявлены два альтернативных пути репарации 8-oxoAde, один из которых инициируется OGG1, а другой инициируется NEIL1 и требует участия полинуклеотидкиназы-З'-фосфатазы для эффективного включения dNMP ДНК-полимеразой ß.

3. Установлено, что активность ДНК-гликозилазы NEIL1 и гомологичных ей бактериальных ферментов из структурного суперсемейства Fpg/Nei ингибируется ионами Cd2+, Zn2+ и Cu2+. Определены значения 150 для ингибирования фермента NEIL1. Показано, что ингибирование NEIL1 частично обусловлено образованием комплексов металлов с ДНК-субстратом, что ведет к потере способности фермента преимущественно связывать поврежденную ДНК.

4. Установлено, что NEIL2 инактивируется пиридоксаль-5'-фосфатом (PLP) за счет образования основания Шиффа с аминогруппой фермента. Определены значения констант скорости образования и гидролиза ковалентного аддукта PLP с NEIL2. Показано, что фермент NEIL2, модифицированный PLP, теряет способность связывать ДНК. Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим детектированием установлено, что модификации подвергается остаток Lys50 в составе белка NEIL2.

Работа выполнена в рамках проектов РФФИ № 05-04-48619, 08-04-00596 и

Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и

клеточная биология» №22.14.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Grin I.R., Khodyreva S.N., Nevinsky G.A., ZharkovD.O. Deoxyribophosphate lyase activity of mammalian endonuclease VHI-like proteins // FEBS Lett. -2006. -V. 580.-P. 4916-4922.

2. Грин И.Р.. Коноровский П.Г., Невинский Г.А., Жарков Д.О. Влияние ионов тяжелых металлов на активность ДНК-гликозилаз семейства Fpg // Биохимия. -2009. -Т. 74. -С. 1539-1547.

3. Grin LR., Rieger R.A., Zharkov D.O. Inactivation of NEIL2 DNA glycosylase by pyridoxal phosphate reveals a loop important for substrate binding // Biochem. Biophys. Res. Commun. -2010. -V. 394. -P. 100-105.

4. Grin I.R., DianovG.L., ZharkovD.O. The role of mammalian NEIL1 protein in the repair of 8-oxo-7,8-dihydroadenine in DNA // FEBS Lett. -2010. -V. 584. -P. 1553-1557.

Изд. лиц. ИД № 04060 от 20.02.2001 Подписано к печати и в свет 20.05.2010 Формат бумаги 60 х 84/16. Бумага № 1. Гарнитура «Times New Roman». Печать офсетная. Печ. л. 1,1. Уч.-изд. л. 1,0. Тираж 130 экз. Заказ № 78 Институт неорганической химии им. A.B. Николаева СО РАН Пр. акад. Лаврентьева, 3, Новосибирск, 630090

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Грин, Инга Ростиславовна

1. Список сокращений.

2. Введение.

3. Обзор литературы.

3.1. Повреждения ДНК.

3.1.1. Потеря гетероциклических оснований.

3.1.2. Дезаминирование.

3.1.3. Алкилирование.

3.1.4. Фотохимические повреждения.

3.1.5. Окислительные повреждения.

3.2. Репарация ДНК.

3.2.1. Реактивация.

3.2.2. Эксцизионная репарация нуклеотидов.

3.2.3. Репарация гетеродуплексов.

3.2.4. Воссоединение негомологичных концов.

3.2.5. Гомологичная рекомбинация.

3.2.6. Эксцизионная репарация оснований.

3.2.6.1. Общий механизм.

3.2.6.2. Выбор между основными путями.

3.3. ДНК-гликозилазы.

3.3.1. Структурная классификация ДНК-гликозилаз.

3.3.1.1. Суперсемейство Ung.

3.3.1.2. Суперсемейство Nth.

3.3.1.3. Суперсемейство Fpg/Nei.

3.3.2. Механизм действия ДНК-гликозилаз.

3.3.2.1. Узнавание поврежденного основания.

3.3.2.2. Каталитический механизм.

3.3.3. Модуляция активности ДНК-гликозилаз.

3.4. Белки NEIL.

3.4.1. Общие характеристики.

3.4.2. Основные субстраты ферментов NEIL.

3.4.3. Структурные особенности белка NEIL 1.

3.4.4. Взаимодействие белков NEIL с другими белками.

3.4.5. Особенности экспрессии и полиморфизмы генов NEIL.

4. Материалы и методы.

4.1. Реактивы.

4.2. Стандартные буферы и смеси.

4.3. Ферменты.

4.4. Штаммы бактерий и плазмиды.

4.5. Олигонуклеотиды.

4.6. Получение олигонуклеотидных субстратов.

4.7. Гель-электрофорез, визуализация и обсчет результатов.

4.8. Выделение белка NEIL 1 человека.

4.9. Выделение белка NEIL2 человека.

4.10. Определение концентрации белка.

4.11. Анализ дезоксирибофосфатлиазной активности.

4.12. Анализ расщепления субстратов, содержащих 8-oxoAde.

4.13. Анализ расщепления субстратов, содержащих HoUra.

4.14. Определение влияния АРЕХ1 и POLß на активность фермента NEIL 1.

4.15. Реконструкция системы эксцизионной репарации оснований.

4.16. Влияние ионов тяжелых металлов на активность Fpg, Nei и NEIL1.

4.17. Связывание ионов металлов с белком NE1L1 и ДНК.

4.18. Связывание NEIL1 с ДНК в присутствии ионов тяжелых металлов.

4.19. Влияние PLP на активность ДНК-гликозилаз.

4.20. Анализ кинетики инактивации фермента NEIL 1 при обработке PLP.

4.21. Анализ связывания ДНК ферментом NEIL2 после обработки PLP.

4.22. Масс-спектрометрический анализ комплекса NEIL2*PLP.

5. Результаты и обсуждение.

5.1. Дезоксирибофосфатлиазная активность белков NEIL.

5.2. Роль фермента NEIL1 в репарации 8-oxoAde в ДНК.

5.3. Влияние ионов тяжелых металлов на активность NEIL1.

5.4. Ковалентная модификация белка NEIL2 пиридоксаль-5'-фосфатом.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Грин, Инга Ростиславовна

7. Выводы

1. Впервые показано, что ДНК-глнкозилазы NEIL1 и NEIL2 человека катализируют реакцию ß-элиминирования 5'-концевого дезоксирибонуклеозид-5'-фосфата в процессе эксцизионной репарации оснований. Определены значения кинетических параметров данной реакции, которые оказались близки к значениям этих параметров для реакции, катализируемой ДНК-полимеразой ß. Установлено, что предпочтительным субстратом для проявления данной активности ферментов NEIL1 и NEIL2 служит интермедиат эксцизионной репарации оснований после включения dNMP ДНК-полимеразой ß. Проведена реконструкция полной системы эксцизионной репарации оснований для урацила, апурин-апиримидинового сайта и 7,8-дигидро-8-оксогуанина с участием ферментов NEIL1 и NEIL2 как дезоксирибонуклеозид-5'-фосфатлиаз.

2. Установлено, что NEIL1 эффективно удаляет 7,8-дигидро-8-оксоаденин (8-oxoAde) из пар с цитозином, но не из других пар. Показано, что значения кинетических параметров этой реакции близки к значениям параметров реакции удаления 8-oxoAde из пар 8-oxoAde:Cyt, катализируемой ферментом OGG1. Выявлены два альтернативных пути репарации 8-oxoAde, один из которых инициируется OGG1, а другой инициируется NEIL1 и требует участия полинуклеотидкиназы-З'-фосфатазы для эффективного включения dNMP ДНК-полимеразой ß.

3. Установлено, что активность ДНК-гликозилазы NEIL1 и гомологичных ей бактериальных ферментов из структурного суперсемейства Fpg/Nei ингибируется ионами Cd2+, Zn2+ и Cu2+. Определены значения I50 для ингибирования фермента NE1L1. Показано, что ингибирование NEIL1 частично обусловлено образованием комплексов металлов с ДНК-субстратом, что ведет к потере способности фермента преимущественно связывать поврежденную ДНК.

4. Установлено, что NEIL2 инактивируется пиридоксаль-5'-фосфатом (PLP) за счет образования основания Шиффа с аминогруппой фермента. Определены значения констант скорости образования и гидролиза ковалентного аддукта PLP с NEIL2. Показано, что фермент NEIL2, модифицированный PLP, теряет способность связывать ДНК. Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим детектированием установлено, что модификации подвергается остаток Lys50 в составе белка NEIL2.

6. Заключение

До 2002 г. считалось, что за репарацию окисленных пуринов у эукариот отвечает ДНК-гликозилаза OGG1, а за репарацию окисленных пиримидинов — NTHL1. Открытие в 2002 г. ДНК-гликозилаз NEIL сразу несколькими группами исследователей поставило вопрос о возможных функциях этих белков. О том, что белки NEIL, возможно, играют в репарации ДНК нетипичную роль, свидетельствует несколько фактов. Во-первых, известный спектр субстратов ферментов NEIL в основном перекрывается со спектром субстратов ферментов OGG1 и NTHL1. Во-вторых, последовательности, кодирующие белки NEIL встречаются только у представителей типа хордовых и отсутствуют в секвенированных геномах других эукариот; это не позволяет считать, что белки NEIL выполняют какие-то незаменимые функции в эукариотической клетке. В-третьих, фенотип животных, дефицитных по белку NEIL1 не связан с общей геномной нестабильностью.

Настоящая работа представляет собой исследование нескольких аспектов функционирования белков NEIL, которые могут иметь значение для объяснения роли этих ферментов. В данном исследовании показано, что ферменты NEIL1 и NEIL2 обладают активностью dRP-лиаз, и что фермент NEIL 1 способен удалять основания 8-oxoAde из пар с Cyt. Интересно, что в обоих случаях описанная активность ферментов NEIL перекрывается с активностями других ферментов репарации (POLß и OGG1, соответственно). Таким образом, полученные нами и опубликованные другими авторами данные свидетельствуют о том, что белки NEIL образуют «вторую линию» защиты ДНК, необходимую при низкой активности основных ферментов ЭРО. Можно предположить, что такие ситуации возникают в каких-то определенных фазах клеточного цикла, в определенных типах клеток и тканей, на определенных стадиях развития организма, или при случайной инактивации генов, кодирующих основные ферменты ЭРО, в соматических клетках.

Ингибирование белка NEIL1 ионами тяжелых металлов и инактивация белка NEIL2 при ковалентной модификации остатка Lys50 служат примерами модуляции и регуляции активности ферментов NEIL, которые могут также иметь значение in vivo. В самом общем случае модуляция активности фермента — это изменение активности под влиянием любого внешнего фактора, а регуляция — частный случай модуляции, подразумевающий существование отдельных систем с определенными состояниями активности и сигналов, определяющих переходы между этими состояниями. Нами показано, что активность фермента NEIL1, а также его бактериальных гомологов, белков Fpg и Nei, может подавляться при наличии ионов Cd2+, Zn2+ и связанных с ДНК. Концентрации, при которых наблюдается это явление, сравнимы (по крайней мере, для Cd ) с концентрациями, достижимыми при высвобождении ионов из металлотионеиновых резервов при окислительном стрессе. Однако еще более общее значение для биологических функций ДНК-гликозилаз и ДНК-связывающих белков вообще имеет сам принцип модуляции активности за счет связывания ионов металлов с ДНК. Саму ДНК можно рассматривать как структурированный полимер, связывающий с достаточно высокой аффинностью разные катионы, в особенности те из них, которые способны к образованию координационных связей. При этом в ДНК существуют анионные, нуклеофильные и электрофильные группы, преимущественно связывающие те или иные ионы, что открывает широкие возможности для регуляции связывания с этими участками белков.

Ковалентная модификация белков представляет собой достаточно хорошо исследованный способ регуляции их функций, и ДНК-гликозилазы здесь не представляют исключения. Однако в очень немногих случаях известны последствия такой модификации. Обнаруженная нами инактивация фермента NEIL2 пиридоксальфосфатом проливает свет на возможный механизм регуляции за счет ковалентной модификации одной из петель белка, важной для связывания ДНК. Ацетилирование другого остатка Lys в этой петле было показано ранее, но механизм инактивации при этом раскрыт не был. Снижение положительного заряда ДНК-связывающей бороздки и введение в нее объемных заместителей при ацетилировании или фосфорилировании представляет собой достаточно логичный способ регуляции активности ДНК-гликозилаз.

Таким образом, в настоящем исследовании описаны дополнительные функции белков NEIL и возможные механизмы модуляции и регуляции их активности. Можно ожидать, что в дальнейшем изучение этой интересной группы белков откроет новые стороны процесса ЭРО.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Грин, Инга Ростиславовна, Новосибирск

1. Lindahl Т. (1993) Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature, 362, p. 709-715.

2. Lindahl Т., Nyberg B. (1972) Rate of depurination of native deoxyribonucleic acid. Biochemistry, 11, p. 3610-3618.

3. Male R., Fosse V.M., Kleppe K. (1982) Polyaminewinduced hydrolysis of apurinic sites in DNA and nucleosomes. Nucleic Acids Res., 10, p. 6305-6318.

4. Burrows C.J., Muller J.G. (1998) Oxidative nucleobase modifications leading to strand scission. Chem. Rev., 98, p. 1109-1151.

5. Shen J.-C., Rideout 111 W.M., Jones P.A. (1994) The rate of hydrolytic deamination of 5-methylcytosine in double-stranded DNA. Nucleic Acids Res., 22, p. 972-976.

6. Friedberg E.C., Walker G.C., Siede W., Wood R.D., Schultz R.A., Ellenberger Т., DNA Repair and Mutagenesis. — Washington: American Society for Microbiology, 2006 pp.

7. Василенко H.JI., Невинский Г.А. (2003) Пути накопления и репарации остатков дезоксиуридина в ДНК клеток низших и высших организмов. Биохимия, 68, с. 165183.

8. Duncan B.K., Miller J.H. (1980) Mutagenic deamination of cytosine residues in DNA. Nature, 287, p. 560-561.

9. Singer В., Kusmierek J.T. (1982) Chemical mutagenesis. Annu. Rev. Biochem., 51, p. 655-693.14.