Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональный анализ элонгационных комплексов бактериальной РНК полимеразы

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональный анализ элонгационных комплексов бактериальной РНК полимеразы"

На правах рукописи

(ХЬщ^

КАШКИНА ЕКАТЕРИНА АЛЕКСАНДРОВНА

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЭЛОНГАЦИОННЫХ КОМПЛЕКСОВ БАКТЕРИАЛЬНОЙ РНК ПОЛИМЕРАЗЫ.

Специальность. 03.00 03. - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва-2008

Работа выполнена в лаборатории энзимологии и транскрипции Института молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта РАН и лаборатории молекулярных механизмов транскрипции департамента клеточной биологии Университета медицины и стоматологии штата Нью Джерси (Стратфорд, США)

Научные руководители:

доктор химических наук,

профессор, член-корреспондент РАН С Н. Кочетков

кандидат биологических наук Д.Е. Темяков

Официальные оппоненты:

доктор химических наук,

профессор, член-корреспондент РАН А.Г. Габибов

доктор химических наук, профессор Е.С. Громова

Ведущая организация:

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Защита диссертации состоится года в -Я часов на

заседании Диссертационного совета Д 002.275 01 при Институте молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д 32

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им В.А.Энгельгардта РАН

Автореферат разослан Ж&еШиМ 2008 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук

АМ Крицын

СОКРАЩЕНИЯ

РНЬСП РНК полимераза

ЭК элонгационный комплекс

ЦЦН цикл добавления нуклеотида

Т ДНК транскрибируемая цепь ДНК

НТ ДНК нетранскрибируемая цепь ДНК

п.н пара нуклеотидов

нт нуклеотид

8й стрептолидигин

ДС двухцепочечный скаффолд, содержащий олигонуклеотиды Т ДНК, НТ ДНК, РНК

ОС одноцепочечный скаффолд, содержащий олигонуклеотиды

Т ДНК, РНК

ЭК ДС элонгационный комплекс, собранный на основе двухцепочечного

скаффолда

ЭК ОС элонгационный комплекс, собранный на основе одноцепочечного скаффолда

скаффолд модельная матрица, представляющая собой комплекс отожженных синтетических олигонуклеотидов

Актуальность темы. ДНК-зависимые РНК-полимеразы (РНКП), катализирующие синтез матричной РНК, являются ключевыми ферментами в экспрессии генетической информации у всех живых организмов. Среди ферментов этого класса выделяют односубъединичные РНКП бактериофагов и митохондрий и многосубъединичные РНКП хлоропластов, прокариотических и эукариотических организмов.

Многосубъединичные РНКП - ферменты, ответственные за синтез практически всех клеточных РНК Аминокислотные последовательности полипептидов многосубъединичных РНКП содержат большое число консервативных областей, а данные кристаллографических исследований демонстрируют сходство пространственной организации Особенно высокая степень гомологии наблюдается в области активных центров, что отражает аналогичность их функционирования во всех многосубъединичных РНКП Более простое строение бактериальных РНКП (6 субъединиц) по сравнению с эукариотическими РНКП, содержащими до 17 субъединиц (в случае РНКП III), делает первые прекрасной модельной системой для изучения клеточных РНКП в целом.

Поскольку структура белка определяет его функцию, структурный анализ многосубъединичных РНКП, среди которых известны высокоразрешенные кристаллические структуры кор-фермента Taquaticus (Zhang et al, 1999), холофер-мента Т thermophilus (Vassylyev et al, 2002), дрожжевой РНКП II и ее элонгацион-ных комплексов (ЭК) (Cramer et al, 2000, Gnatt et al, 2001, Kettenberger et al, 2004, Westover et al, 2004, Wang et al, 2006), a также комплексов РНКП с различными антибиотиками и транскрипционными факторами (Opalka et al, 2003, Artsimovitch et al, 2004, 2005; Peredenna et al, 2004; Vassylyev et al, 2005, Termakov et al, 2005), вместе с данными биохимических и генетических исследований позволяют предположить возможные механизмы функционирования РНКП В то же время многие аспекты остаются неизученными или недостаточно изученными, прямые доказательства предполагаемых механизмов, как правило, отсутствуют, в связи с чем в литературе часто приводятся несколько альтернативных моделей одного и того же процесса Таким образом, для получения исчерпывающей картины функ-

ционирования РНКП, необходимо детальное изучение каждого элементарного шага катализируемых ею реакций

Цель работы и задачи исследования. Целью работы являлось определение структурно-функциональной организации элонгационных комплексов бактериальной РНКП В работе ставились следующие задачи: 1) охарактеризовать кон-формационное состояние элонгационных комлексов бактериальной РНКП, собранных на основе модельных матриц, представляющих собой комплекс отожженных синтетических РНК-, ДНК-олигонуклеотидов, 2) установить молекулярный механизм ингибирования РНКП антибиотиком стрептолидигином (БИ), 3) определить молекулярный механизм ошибочного включения нуклеотида в транскрипт, приводящий к замене основания, 4) определить участок плавления ДНК-дуплекса в области активного центра РНКП

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые показана возможность сборки элонгационных комплексов (ЭК) бактериальной РНКП в определенном конформационном (пост- или пре-транслокационном) состоянии, что может быть использовано как в биохимических экспериментах для изучения различных стадий транскрипционного цикла, так и при кристаллизации, где требуется гомогенная популяция ЭК Установлен молекулярный механизм действия антибиотика ЭЙ, специфически ингибирующего бактериальные РНКП, показано, что БА предотвращает изомеризацию РНКП в каталитически компетентную кон-формацию, «замораживая» ЭК в неактивном состоянии; выявлены мутации, определяющие устойчивость, либо чувствительность РНКП к Бй Полученная модель взаимодействий БИ с бактериальной РНКП открывает ряд возможностей для дизайна новых, более эффективных антибиотиков, мишенью которых, также как и для БА, является ограничение подвижности структурных элементов активного центра фермента, участвующих в осуществлении каталитических реакций Впервые продемонстрирован новый механизм генерации ошибок клеточными РНКП, основанный на «выпетливании» транскрибируемой цепи ДНК (Т ДНК) в области активного центра фермента в присутствии стабилизирующего этот процесс ШТ, комплементарного дезоксинуклеотиду, следующему по ходу транскрипции после

«выпетленного» Высокая эффективность образования замен в синтезируемом транскрипте в результате «выпетливания» Т ДНК т vitro предполагает, что ошибочное включение нуклеотида in vivo может происходить согласно вышеупомянутому универсальному механизму. Возможное «выпетливание» Т ДНК следует принимать во внимание при планировании транскрипционных экспериментов т vitro как фактор, влияющий на кинетику связывания NTP в ЭК и включения NMP в РНК-транскрипт Впервые показано, что лишь одна пара оснований дуплексной ДНК, находящаяся в непосредственной близости от активного цетра по ходу транскрипции, «плавится» бактериальной РНКП в процессе элонгации «Плавление» единственной пары оснований ДНК дуплекса в области активного центра РНКП вносит определенную ясность в механизм отбора комплементарного NTP субстрата и его доставки в активный центр фермента и является одной из составляющих, обеспечивающих точность транскрипционного процесса.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на FASEB International Meeting on Prokaryotic Transcription (Vermont, USA, июнь 2005) и Keystone transcription initiation meeting (New Mexico, USA, февраль 2006).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ, в том числе 5 статей в научных журналах.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на "^^страницах, содержит рисунков и О таблицы, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего

199 источников

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Глава 1. Получение и характеристика элонгационных комплексов, имеющих определенное конформационное состояние

Изучение процесса транскрипции у бактерий традиционно проводится на примере РНКП Е coli, для которой накоплен большой объем данных генетических и биохимических экспериментов Однако, структуры высокого разрешения для

этого фермента все еще не получено. Между тем, РНКП термофильных бактерий ТлНегторкИш и Т.адиаИсш являются прекрасными моделями для кристаллографических исследований. Наибольший интерес представляют структуры этих ферментов в ассоциации с нуклеиновыми кислотами, т.е. структуры транскрипционных комплексов, позволяющие взглянуть на процесс функционирования РНКП на молекулярном уровне. Для успешной кристаллизации и рентгенострук-турных исследований подобных комплексов необходима их детальная характеристика.

R10/rS35/NT35

ЭК7 ЭК8 ЭК9 ЭКЮ

9кг-

NTP, OTP ATP UTP СТР РИ,50цМ - + + + + + -+++++-++++ + -++++ + 50цМ - +_ + - + _+ время, мин 1 2 4 10 30 1 2 4 10 30 1 2 4 10 30 1 2 4 10 30

"* Юнг—». Ä

Юнт—т» ш укг > —

,, 8нт_•»•«Щ»

7иг-4. mmmmm» « ;

_ jt 6кг-»- шш'ттт

7нг—

5 кг—

1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 И 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

Рис. 1. Способность к пнрофосфоролизу ЭК РНКП T.thermophilus. А. Полимеразная активность РНКП T.thermophilus в составе ЭК7-10. Сборку ЭК7-10 РНКП T.thermophilus проводили в течение 5 мин. при комнатной температуре в транскрипционном буфере на скаффолдах R7-10/TS3S/NT35, содержащих 5'-Р32 меченные РНК-праймеры, далее инкубировали с соответствующим 50 цМ субстратным NTP в течение 2 мин. при 60*С. Б. Чувствительность к PPi ЭК7-10 РНКП T.thermophilus. Сборку ЭК7-10 РНКП T.thermophilus проводили согласно вышеописанному методу, далее инкубировали с 50 цМ PPi при 60'С на протяжении указанного на рисунке времени. Следует заметить, что РНК праймер в ЭК8 удлинялся вследствие встраивания нуклеотида (UTP), освобожденного в процессе пирофосфоролиза.

Над буквенными обозначениями скаффодов R7-I0/TS35/NT35 представлено их схематическое изоражение: нижней линией показана Т ДНК, верхней - НТ ДНК, стрелкой - РНК; участки параллельности верхней и нижней линий соответствуют двухцепочечной ДНК, нижней линии и стрелки - РНК-ДНК гибриду (стрелка указывает направление роста РНК-праймера при транскрипции in vitro).

Для изучения свойств ЭК РНКП T.thermophilus мы использовали модельные матрицы, называемые скаффолдами, представляющие собой комплексы отожженных синтетических олигонуклеотидов: нетранскрибируемого олиго-ДНК (НТ ДНК), формирующего с транскрибируемым олиго-ДНК (Т ДНК) дуплексный участок транскрипции, и РНК праймера, образующего РНК-ДНК гибрид с Т ДНК (примеры скаффоддов схематически представлены на рисЛБ). Как было показано ранее, комплексы кор-фермента РНКП E.coli и Т7 РНКП, собранные на основе подобных скаффолдов, обладают многими свойствами ЭК (Sidorenkov et al, 1998,

Temiakov et al, 2002). Нами были протестированы ЭК, собранные на скаффолдах с РНК-ДНК гибридом 7-10 пар нуклеотидов (п.н.), обозначение как ЭК7, 8, 9 и 10, соответственно (Рис.1 А). Кор-фермент РНКП T.thermophilus, аналогично кор-ферменту РНКП E.coli, связывается со скаффолдом и эффективно удлиняет РНК праймер, при этом эффективность удлинения РЖ праймера не зависит от длины РНК-ДНК гибрида. Наблюдается практически 100% удлинение 5'-Р32 меченных РНК-праймеров при инкубации ЭК с соответствующим NTP в течение 5 мин. Подобно ЭК РНКП E.coli, ЭК8 и ЭК9 РНКП T.thermophilus одинаково стабильны и, как показали эксперименты по устойчивости к соли, не диссоциируют даже в присутствии 0.8 М NaCl.

пре-транслокационный ЭК пост-транслокационный ЭК

i i+1 продукт- сайт

Рис. 2. Схематическое представление цикла добавления нуклеотида (ЦДН). Показаны цепи транскрибируемой (Т ДНК), нетранскрибируемой (НТ ДНК) ДНК, РНК; овалами обозначены сайт включения нуклеотида (/+/) и продукт-связывающий (/) сайт в активном центре РНКП, затемненный овал - сайт включения нуклеотида со связанным ШТ.

Во время элонгации конформация активного центра РНКП осциллирует между двумя различными состояниями, определяемыми положением 3'-концевого нуклеотида образующегося транскрипта относительно каталитического центра фермента, в котором предполагается наличие продукт-связывающего сайта и сайта включения нуклеотида (Рис.2). В начале цикла добавления нуклеотида (ЦДН) ЭК находится в пост-транслокационном состоянии ■■ 3'-конец РНК в составе гете-родуплекса занимает продукт-связывающий сайт. Последующее встраивание МУ1Р в цепь РНК приводит к удлинению транскрипта, и 3'-конец РНК оказывается в сайте включения нуклеотида, а ЭК принимает пре-транслокационную кон-

формацию. ЦЦН завершается транслокацией 3'-конец РНК перемещается из сайта включения нуклеотида в продукт-связывающий сайт, т о ЭК вновь принимает пост-транслокационное состояние При завершении каждого ЦЦН освобождается пирофосфат (РР,) Реакция включения нуклеотида обратима (обратной реакцией является пирофосфоролиз) Чувствительность ЭК к РР, характеризует конформа-ционное состояние комплекса, так ЭК, чувствительные к РРЬ находятся в пре-транлокационном состоянии, в то время как пост-транслокационные ЭК устойчивы к РР,

ЭК РНКП Т ЖегторЫт обладали различной способностью к пирофосфоро-лизу, которая зависела от длины РНК-ДНК гибрида используемого скаффолда (Рис 1Б) Как видно из рис 1Б, при инкубации ЭК РНКП Т ЖегторЫш с 50 цМ РР! расщепление 5'-Р32 меченных РНК-праймеров наблюдалось во всех случаях, за исключением ЭК9. Активный пирофосфоролиз, наблюдаемый в ЭК8, приводил к появлению РНК размером 6, 7 нуклеотидов и одновременному накоплению стабильного 9 нуклеотидного продукта, который образовывался в результате встраивания в транскрипт ОТР, освобождающегося при деградации 7 нуклеотилного промежуточного продукта (Рис 1Б, дорожки 7-12) ЭК9 оставался нечувствительным к РР, как во время продолжительной инкубации (Рис 1Б, дорожки 13-18), так и при высокой концентрации РР, (1мМ). ЭКЮ быстро де1радировал до стабильного ЭК9 (Рис 1Б, дорожки 19-24). Изменения в топологии скаффолда (наличие одноцепочечного 5'-«хвостового» отрезка РНК, отсутствие НТ ДНК) не изменяли чувствительность ЭК к пирофосфоролизу, свидетельствуя об определяющей роли длины РНК-ДНК гибрида в транслокационной конформации комплекса Так, при инкубации с РР, ЭК14 и ЭК15, имеющих РНК-ДНК гибрид 8 и 9 п н, соответственно, и свободные 5'«хвосты» РНК длиной 6 нуклеотидов, наблюдался тот же характер пирофосфоролиза, что у ЭК8 и ЭК9

Транскрипционный элонгационный фактор вгеА стимулирует эндонуклеаз-ную активность РНКП Т ЛегторЫт (Новап et а1, 2002, Ьар1епко & а1, 2003) Эта активность, как и пирофосфоролиз, проявляется в пре-транслокационном состоянии ЭК (Рис.3). В присутствии ОгеА в пре-транслокационном ЭК14 5'-Р32 мечен-

ЭК 14 ЭК15

—

ный 14 нуклеотидный РНК-праймер полностью расщеплялся до 12 нуклеотидов за 5 мин. По-

Ш4/та5/МТ35 К15/Т835/МТ35

г-Л--,/■-л--, следующего гидролиза не наблюдалось (Рис.3,

время, мин 0.5 1 2 5 20 0.5 1 2 5 20

йгеА - + + + + + - + + + + + дорожки 1-6), вероятно, потому, что ооразую-

15 нт—>■ вйИЯрАь** ^ .

14 нт-»- «*<■»«»" щийся РНК-ДНК гибрид размером 6 п.н. приво-

Щ Ля ¿рг$ Я 4-

\2т-*- . ¿ дил к нестабильности и диссоциации комплекса.

И нт—

Пост-транслокационный ЭК 15 также был чувст-

1 2 3 4 5 6 7 8 9 ю U12 вителен к воздействию GreA, однако гидролиз Рис. 3. Эндонуклеазная активность

РНКП T.thermophilus в ЭК14 и ЭК15 в РНК-праЙМера ПРОИСХОДИЛ значительно мед-присутствии фактора GreA. эк14(15)

рнкп T.thermophilus, собранные на деннее. Для расщепления 15 нуклеотидного

скаффолдах r14(15)/ts35/nt35 с 5'-

меченным Р32-РНК праймером, инкубиро- PHK-праймера до 13 нуклеотидов требовалось вались с GreA фактором T.thermophilus

при 60-С в течение указанных на рисунке бодее чем 2Q м последниЙ Затем быстро де-промежутков времени. г

градировал до 11 нуклеотидов (Рис.2, дорожки 7-12). Подверженность ЭК 15 GreA-индуцированному расщеплению можно объяснить тем, что, вероятно, GreA может сдвигать равновесие в сторону пре-транслокационной или даже «откатившейся» (backtracked) конформации РНКП. Подобные изменения конформации наблюдались в ЭК дрожжевой РНКП II при связывании с TFIIS, функциональным гомологом GreA, который также как последний стимулировал отщепление 2 нуклеотидов от РНК транскрипта. (Ketten-berger et al, 2004).

Чтобы убедиться в том, что ЭК с длиной РНК-ДНК гибрида 8 и 9 п.н. находятся в строго определенной конформации, а не в равновесии между пре- и пост-транслокационным состояниями, был проведен футпринтинг этих комлексов эк-зонуклеазой ExoIII (Рис.4). ЭК14 и ЭК15, содержащие 5'-Р32 меченную НТ ДНК, обрабатывались ЕхоШ в течение 5 и 10 мин. при 37°С. Так же как и при футприн-тинге ЭК РНКП E.coli (Korzheva et al, 2001), 14 нуклеотидов НТ ДНК в ЭК 14 РНКП T.thermophilus были защищены от расщепления ЕхоШ (Рис.4А, дорожки 1 и 2); в ЭК15, полученном при инкубации ЭК14 с субстратом АТР в результате удлинения PHK-праймера на 1 нуклеотид, длина нерасщепленной НТ ДНК увеличивалась до 16 нт (Рис.4А, дорожки 3 и 4), что отражало смещение положения

РНКП по цепи ДНК на 2 нуклеотида в направлении транскрипции. Таким образом, данные ЕхоШ футпринтинга показывают, что большая часть молекул ЭК 14 находится в пре-транслокационной конформации, в то время как для ЭК 15 предпочтительной является пост-транслокационная конформация (Рис.4Б).

ЭК14 ЭК15

направление ЕхоШ фугпринтинг

транскрипции ^^ РНКП

РНК 5

РНК-ДНК гибрид 8 п.н. 9 п.н. \ --■■ '' ;•• У НУ ЛИК

пре-трансзтокационный '1 5 : --4 -

R14/TS380/NT380 ЭК14 3' 1 «НК i; - ,„ ЩШ

i

время, мин 5 10 5 10 ATP - - + +

1

пост-трдасл. посг-транслокационный ___ _ ЭК15 ЭК14 --I NTP

c-i п

N-Ш, - ■ : +

щ0 *т» mm - > <К|»" W »PPi

пре-транслокационный Ша» 4 •> ЭК15 : n-in

12 3 4

Je

пока Ж15

Г

. . - п-1 п "

. 'Ii . : if

посг-транслокационный ЭК15

I

n-1 ri

Рис. 4. Определение транслокационных конформацнй ЭК РНКП T.lhermophilus методом Exo III футпринтинга. А. ЕхоШ футпринтинг ЭК14 и ЭК15. ЭК14, собранный на скаффолде R14/TS380/NT380, содержащем 5'-меченный Р32 олиго HT ДНК - NT 380, обрабатывался ЕхоШ (0.02 U/мкл) в течение 5 и 10 мин. (дорожки 1, 2, соответственно) при температуре 37'С. ЭК15 получали при инкубации ЭК14 с субстратным ATP 2 мин. при 60"С, затем обрабатывали ExoIII в течение 5 и 10 мин. в тех же условиях, что ЭК14 (дорожки 3, 4, соответственно). Б. Схематическое представление положения РНКП в ЭК14-15. Стрелки с пунктирными линиями показывают основной сайт ЕхоШ расщепления, за пределами которого (3' - 5') экзонуклеаза не способна гид-ролизовать субстратную HT ДНК, поскольку эта область защищена РНКП.

Результаты неспецифического ковалентного сшивания фотоактивируемого реакционноспособного аналога урацила, 4-тиоурацила (4-thioU), встроенного на 3'-конец РНК, с аминокислотами РНКП продемонстрировали различие в положении З'-концевого нуклеотида РНК праймера в активном центре ЭК14-15 с РНК-ДНК гибридами 8 и 9 п.н., соответственно (Рис.5). При облучении УФ (Х,=312нм) ЭК 14 наблюдалось ковалентное сшивание 4-тиоурацила преимущественно с ß' субъединицей, в то время как в ЭК 15 происходило связывание как с ß, так и ß' субъединицами РНКП T.thermophilus (Рис.5). Хотя данные этого эксперимента не дают прямого ответа о конформационных состояниях ЭК, они отражают измене-

ния характера РНК-белковых взаимодействий, происходящих в сайтах включения нуклеотида и связывания продукта и свидетельствуют в пользу различных кон-формационных состояний ЭК14 и ЭК15. Вероятно, в ЭК14 З'-конец РНК прайме-ра, находящийся в сайте включения нуклеотида, взаимодействует со структурными элементами р'-субъединицы, такими как F-спираль и G-петля, ответственными за связывание с субстратом и образование закрытого каталитически компетентного комплекса (Temiakov et al, 2005, Vassylyev et al, 2002, Bar-Nahum et al, 2005), чем и объясняется эффективное образование фотоаддукта исключительно с (З'-субъединицей.

ЭК14 ЭК15

Рис. 5. Определение конформации ЭК РНКГ1 T.thermophilus методом получения Р'-^вЁЁвМИ ковалентных сшивок (фотокросслинкинг). ЭК14 и ЭК15 РНКП T.thermophilus были Р —' ¡Щф получены в результате сборки на скаффолдах R13/TS351/NT351 и R14/TS352/NT351, соответственно, содержащих 5'-Р32 меченные РНК праймеры, которые удлиняли вклю-РНК чением 4-тиоуридина. После облучения УФ светом ЭК 14 и ЭК 15 продукты фотокросс-15 нт > tgm линкинга разделяли с помощью электофореза в геле NuPAGE MES (Invitrogen) (для идентификации сшитых субъединиц РНКП, вверху) и ПААГ (для контроля длины РНК 14 нт-*- Л-Ш' нраймера, внизу).

1 2

Таким образом, приведенные выше данные биохимических экспериментов свидетельствуют о том, что ЭК РНКП T.thermophilus, собранные на скаффолдах с РНК-ДНК гибридом 8 п.н., находятся в пре-транслокационном конформационном состоянии, в то время как ЭК РНКП T.thermophilus, собранные на скаффолдах с РНК-ДНК гибридом 9 п.н. или полученные из ЭК с РНК-ДНК гибридом 8 п.н. путем удлинения РНК-праймера, находятся в пост-транслокационном конформационном состоянии.

Глава 2. Механизм ингибирующего действия антибиотика стрептолидигина

Стрептолидигин (8Й) - антибиотик, производное 3-ацилтетрамовой кислоты (рис.6), впервые выделенный из культуры клеток З^ер^тусез lydigus, специфически ингибирующий бактериальные РНКП. Исходя из данных кристаллической структуры комплекса холофермента РНКП ТЛкегторЫ1т с БИ (Тегшакоу et а1, 2005), антибиотик связывается с РНКП на расстоянии 20 А от активного центра

10

фермента вдоль Р'-Б-спирали, расположенной поперек главного канала РНКП между РНК-ДНК гибридом и дуплексной ДНК Во взаимодействиях с вЙ участвуют аминокислотные остатки (3- и р'-субъединиц РНКП, формирующие БИ-связывающий участок (Рис.6), образуемый двумя субдоменами

А Б

Рис. б Взаимодействие Stl с РНКП Т ¡hemophilus А. Структурная формула Stl Указаны функциональные группы молекулы Б Схематическое представление Stl-связывающего сайта РНКП Ван дер вальсовские взаимодействия показаны прерывистыми линиями, водородные связи - стрелками Нумерация аминокислотных остатков приведена для РНКП Е coli Для ß'N792 и ßP567 в скобках приведена нумерация для аминокислотных остатков для РНКП Тthermophilus - Dl090 и А447, соответственно

Первый субдомен, состоящий из петель ß-субъединицы, STL1 (ß538"552) и STL2 (ß557"576), и N-кондевого участка ß'-F-спирали (ß'769'788), связывает стрептололь-ную группу Stl посредством множественных гидрофобных взаимодействий (здесь и далее нумерация аминокислотных остатков приведена для РНКП Ecolt, поскольку большая часть биохимических экспериментов и мутагенез были проведены с использованием данного фермента) Второй субдомен, сформированный центральной частью ß'-F-спирали (ß'789'795) и упорядоченной областью ß'-G-петли, образует немногочисленные контакты с одной из трех разветвленных групп тетрамовой кислоты Остаток сахара не участвует в связывании с РНКП, более того, он конкурирует за пространство с неупорядоченной областью TL, которая может вытеснять его, противодействуя связыванию, и принимать более стабильную конформацию. В целом, предполагается, что аффинность Stl к РНКП определяется стрептолольной группой, поскольку остаток тетрамовой кислоты не образует высокоспецифичных контактов с поверхностью фермента (Рис 6). Анализ аминокислотных последовательностей областей, содержащих Still

связывающие детерминанты, в ß- и ß'-субъединицах бактериальных РНКП (Temiakov et al, 2005), показывает, что участок связывания Stl высоко консервативен, поэтому результаты исследования структуры РНКП T.thermophilus с Stl могут быть применимы к РНКП других бактериальных видов.

В подтверждение структурной модели и для определения функционального значения структурных элементов РНКП, взаимодействующих со Stl, были сконструирован ряд мутантных форм РНКП E.coli. В ßA565'5680 РНКП E.coli четыре аминокислотных остатка петли STL2, участвующих в образовании гидрофобного стрептолол-связывающего кармана, были удалены и заменены на глицин; в ßR548A РНКП E.coli аргинин, образующий водородную связь с Stl, был замещен на ала-нин. Как и предполагалось, оба мутантных фермента оказались устойчивыми к действию Stl (Рис.7).

WT ßA565-568G ßR548A ß№92D

Stl, цМ о 0 10 100 500 0 0 50 0 0 500 0 0.2 3 UTP, ЮцМ - + + + + - + + + + + + +

' ää^Ä • ^i&fe ^^^t ЭШ5 ->-W в****'.. vM ggg -ф м m d

'Щ-'V.' feV ... ... ...

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Рис. 7. Полимеразиая активность мутантных форм РНКП E.coli в присутствии Stl. ЭК РНКП дикого типа E.coli (WT, дорожки 1-5), мутантных форм РНКП E.coli (ß4565"5680 , дорожки 6-8; рм48А, дорожки 9- 10; ß'N'9zc, дорожки 11-13), собранные на скаффолде R15/TS35/NT35, были преинкубированы с различными концентрациями (0-500 цМ) Stl в течение 5 мин., а затем инкубировались с 10 jiM субстратным UTP в течение 1 мин. при комнатной температуре.

Нами было определено, что чувствительность РНКП T.thermophilus к Stl значительно выше, чем у РНКП E.coli. Сравнительный анализ их аминокислотных последовательностей показал, что РНКП E.coli в позиции 792 ß'-F-спирали содержит аспарагин, в то время как в аналогичной позиции РНКП T.thermophilus находится аспарагиновая кислота, отрицательно-заряженная карбоксильная группа которой более предпочтительна для образования водородной связи с N2 атомом Stl, чем амино-карбонильная группа аспарагина (Рис.6). ß,N792D РНКП E.coli, где аспарагин был заменен на аспарагиновую кислоту, оказалась в 75 раз чувстви-

тельнее к Stl, чем РНКП дикого типа (Рис.7, дорожки 11-13). Вероятно, наличие аспарагин в p'-F-спирали РНКП E.coli может, по крайней мере частично, являться причиной относительной устойчивости этой РНКП к Stl. В связи с высокой консервативностью аспарагина и аспарагиновой кислоты подобная закономерность может быть справедлива и для других бактериальных РНКП.

Stl блокирует практически все специфические активности РНКП: добавление нуклеотида, пирофосфоролиз, GreA-индуцирусмую эндонуклеазную активность (Рис.8).

ATP PPi GreA

Рис. 8. Stl ингибирует пирофосфоролиз, полимеразную и GreA-stl -- + -+- + индуцируемую эндонуклеазную активности РНКП T.lhermopkilus в Щ ЭК14. ЭК14, собранный на скаффолде R14/TS35/NT3S, был преинкубиро-

ЭК14—ван 5 мин. со Stl (дорожки 3,5,7) или без него (1,2,4, 6), а затем инкубировался в течение 5 мин. с 10 цМ субстратным АТР (дорожки 2,3), 50 цМ PPi (дорожки 4, 5) и GreA в эквимолярной концентрации (дорожки 6, 7) при 1 2 3 4 5 6 7 комнатной температуре.

Связываясь с РНКП в транскрипционном комплексе, Stl заметно замедляет или даже прекращает дальнейший процесс транскрипции, не вызывая распад комплекса (т.е. диссоциации нуклеиновых кислот) (Siddhikol et al, 1969). Следовательно, наиболее вероятная причина ингибирующего действия Stl заключается в его вмешательстве в ЦЦН. Теоретически, Stl может: а) конкурировать за связывание с субстратом, уменьшая его аффинность к РНКП; б) ингибировать транслокацию РНКП; в) аллостерически воздействовать на активный центр РНКП; г) блокировать структурную изомеризацию активного центра РНКП из неактивной конформации в каталитически активную. В лаборатории К.В.Северинова при изучении влияния Stl на сродство фермента к субстрату методом мониторинга одношаговой элонгации в режиме реального времени было показано, что, несмотря на уменьшение константы скорости добавления нуклеотида в присутствии Stl, аффинность субстрата меняется незначительно (Temiakov et al, 2005). Эти данные, а также данные ренгеноструктурного анализа свидетельствуют о том, что Stl не занимает сайт добавления нуклеотида в активном центре РНКП и не модифицирует его аллостерически.

Для того, чтобы определить влияние Stl на транслокацию, мы исследовали

эффективность удлинения РНК-праймера в пре-транс локационном ЭК 14 и пост-транслокационном ЭК 15 в присутствии антибиотика (Рис.9). Если бы БЙ ингиби-ровал РНКП на этом этапе транслокации, то скорость добавления нуклеотида в пре-транслокационном ЭК 14, которому необходима транслокация перед включением 1ЧМР в транскрипт, должна была быть существенно ниже, чем в пост-транслокационном ЭК15, которому транслокация не требуется. Однако, как показали эксперименты, эффективность процесса добавления нуклеотида в присутствии БИ практически не зависела от конформационного состояния ЭК.

Рис. 9. Пре- и пост-транслокационные ЭК РНКП Т.МегторИИия обладают одинаковой чувствительностью к

БН. 1цМ ЭК14-15, собранные на скаффолдах Я14-15/Т335/МТ35, соответственно, были преинкубированы со Эй в концентрации 0-100дМ в течение 5 мин., а затем инкубировались с 10цМ субстратами - АТР и иТР, соответственно, в течение 5 мин. при комнатной температуре. Ингибирующие концентрации (1С5„) для ЭК14-15 указаны на рисунке.

5 эки :ЗИ5

п а! ............................

0.1 1 10 Концентрация вй, цМ

Как упоминалось ранее, 811 может опосредованно воздействовать на процесс катализа. В лаборатории К.В.Северинова для исследования аллостерического влияния БЙ на образование фосфодиэфирной связи в РНК использовали медленно гидролизующийся аналог КТР, а-тио-ЖР, а-тиофосфорная группа которого менее эффективно подвергается нуклеофильной атаке З'-ОН РНК-праймера, что, замедляет процесс включения КГМР в синтезируемую РНК. Поскольку образование фосфодиэфирной связи является лимитирующей стадией реакции, в том случае, если бы БИ был аллостерическим ингибитором катализа, ожидалось бы критическое падение скорости реакции в присутствии а-тио-ОТР и БЙ. Поскольку подобного эффекта не наблюдалось, можно полагать, что БЙ не влияет на образование фосфодиэфирной связи.

Таким образом, среди возможных причин ингибирующего действия БЙ остается только одна: антибиотик, по всей видимости, стабилизирует какой-либо не-

активный транскрипционный интермедиант в ЦЦН, предотвращая структурную изомеризацию РНКП в каталитически компетентное состояние В структуре мно-госубъединичной РНКП предполагается наличие трех сайтов связывания NTP так называемого Е-сайта, сайта предварительного связывания (preinserüon site) и сайта добавления нуклеотида (insertion site) (Temiakov et al, 2004, Kettenberger et al, 2004, Westover et al, 2004). Сравнительный структурный анализ многосубъеди-ничных РНКП показал, что, вероятнее всего, мишенью действия Stl является сайт предварительного связывания субстрата (Temiakov et al, 2005) В этом сайте субстрат связывается с пост-транслокационным комплексом с высокой специфичностью, образуя пару с комплементарным основанием Т ДНК, однако фосфатные группы NTP расположены достаточно далеко от активного центра РНКП, чтобы вступать в реакцию полимеризации При детальном рассмотрение этого сайта, обнаруженном также в структуре ЭК дрожжевой РНКП П (Kettenberger et al, 2004) было найдено, что ß'-F-спираль, ß'-G-петля и ß-петля STL2, которые структурно консервативны у эукариотических и бактериальных РНКП и взаимодействуют с Stl в бактериальном ферменте, находятся вблизи связанного субстрата и, по-видимому, активно вовлечены в ЦЦН

На основании приведенных выше биохимических данных, а также рентгено-структурного анализа комплекса РНКП Т thermophilus и Stl была предложена модель, согласно которой входящий субстрат сначала связывается в сайте предварительного связывания, образуя комплементарную пару с основанием матричной цепи ДНК, что необходимо для отбора корректного субстрата и стабилизации пост-транслокационной конформации, a SÜ, вероятно, блокирует дальнейшее преобразование этого каталитически неактивного промежуточного комплекса, ограничивая подвижность элементов: ß'-F-спирали, ß'-G-петли и ß-петли STL2, которые, как предполагается, участвуют в доставке субстрата в сайт включения нуклеотида Таким образом, Stl предотвращает изомеризацию РНКП в активную, более компактную («закрытую») конформацию.

Глава 3. Механизм ошибочного включения нуклеотида в транскрипт в результате «выпетливания» транскрибируемой цепи ДНК в области активного

центра

Аккуратное воспроизведение, передача и реализация генетической информации необходимы для жизнедеятельности всех организмов. Изучение образования ошибок, возникающих на этих этапах, сфокусировано, главным образом, на процессе репликации ДНК, в то время как ошибки, возникающие при транскрипции, остаются менее охарактеризованными.

С целью изучения механизма ошибочного включения нуклеотидов в процессе транскрипции мы использовали ЭК РНКП Е.соИ с РНК-ДНК гибридом 8-9 п.н., собранные на скаффолдах, в которых отсутствовала НТ ДНК. ЭК инкубировали с каждым из четырех ЫТР, при этом включение 1ЧГМР в транскрипт определяли по удлинению 5'-Р32 меченного РНК-праймера (Рис.10, на примере ЭК8).

йаггч-к осввсвли

КВПМ5 сессестАТАестАгююютсс

1ШСМЯ. мин

Рис. 10. Некомплементарный NTP, соответствующий п+1 основанию Т ДНК, наиболее эффективно включается РНКП Е.соИ в транскрипт, приводя к генерации ошибки - замене основания. ЭК8 РНКП E.coli, собранный на скаффолде R8/TS35, содержащем 5'-Р32 меченный РНК-праймер, инкубировался в присутствии четырех возможных 500 цМ NTP при 37°С в течение промежутков времени, указанных на рисунке.

В присутствии комплементарного субстрата, АТР, 8 нуклеотидный РНК-праймер ЭК8 удлинялся до 9 нуклеотидов, небольшие количества РНК размером более 9 нуклеотидов также наблюдались в результате ошибочного включения АТР (Рис.10, дорожки 2-7). Удлинение РНК-праймера в присутствии некомплементарного NTP (СТР, GTP, UTP) было менее эффективным. Тем не менее скорость включения UTP - субстрата, комплементарного п+1 основанию Т ДНК (основание, занимающее сайт добавления нуклеотида, принято называть п, соответствен-

но, следующие за ними по ходу транскрипции, п+1, п+2, n+З и т.д.), была заметно выше, и РНК-праймер удлинялся на 2 нуклеотида, а не на 1, как в случае остальных NTP (Рис.10, дорожки 20-25). РНКП E.coli была способна продуцировать подобную ошибку на серии скаффолдов: а) в п+1 позиции Т ДНК присутствовало каждое из четырех возможных оснований; б) каждое возможное основание присутствовало в п+1 позиции, но основание в позиции п оставалось тем же самым.

Аналогичный характер удлинения РНК-праймера на 2 нуклеотида в присутствии n+1 NTP, наблюдался ранее у Т7 РНКП (Pomerantz et al, 2006). Для объяснения этого явления был предложен механизм, согласно которому п+1 основание матричной цепи ДНК является акцепторным для входящего NTP сразу в двух последовательных ЦЦН (Рис. 11).

встраивание UTP выравнивание Т ДНК удлинение РНК

3'

Рис. 11. Схематическое представление механизма ошибочного включения п+1 нуклеотида в транскрипт, обусловленное выпетливанием матричной цепи ДНК в области активного центра. В качестве примера в п положении т ДНК показан TMP, (п+1) положении - AMP, (n+1) NTP, соответственно, - UTP.

На первом ЦЦН основание n (Т, на примере нуклеотидной последовательности скаффолда, представленного на рис.10) в Т ДНК «выпетливается» (flip out), в результате чего сайт добавления нуклеотида занимает (п+1) основание (А), что приводит к удлинению РНК-праймера NMP (UMP), комплементарного п+1 основанию Т ДНК. На втором ЦЦН происходит выравнивание Т ДНК и «выпетленное» основание (Т) перемещается в сайт связывания продукта, а основание, бывшее п+1 (А), вновь занимает сайт добавления нуклеотида. Далее РНК-продукт эффективно удлиняется все тем же NMP (UMP). Этот процесс приводит к замене основания в образующемся транскрипте. Поскольку в присутствии n+1 NTP РНК-

праймер всегда удлиняется на 2 нуклеотида с небольшой аккумуляцией промежуточного продукта, удлиненного только на 1 нуклеотид, вероятно, лимитирующей стадией является включение нуклеотида в результате выпетливания Т ДНК, а последующее удлинение протекает быстро

Для проверки этого утверждения мы использовали скаффолды, 3'-конец РНК которых был некомплементарен соответствующему нуклеотиду Т ДНК Как и предполагалось, РНКП Е coli эффективно удлиняла РНК-праймер в ЭК, собранных на подобных скаффолдах. Механизм ошибочного включения нуклеотида бактериальными РНКП в результате выпетливания Т ДНК в области активного центра был подтвержден методам флуоресцентной спектроскопии в ряде экспериментов с использованием флуоресцентного аналога цитозина, пирролоцитозина (Ср). Известно, что интенсивность флуоресценции Ср зависит от локального химического окружения Так, невысокий квантовый выход флуоресценции ожидается, если Ср находится в составе дуплексной ДНК, но существенно возрастает, если ДЬЖ в этом месте расплавлена и Ср не участвует в стэккинг-взаимодействиях (Liu and Martin, 2002, Martin et al, 2003) Еще более значительное увеличение эмиссии происходит при выпетливании нуклеотида, содержащего флуоресцентный аналог основания (Kobayashi et al, 2002)

Мы проверили изменения флуоресценции в ЭК РНКП Е coli, собранном на скаффолде, содержащем Ср в п положении Т ДНК, при инкубации с различными NTP (Рис 12) Согласно механизму продуцирования ошибки РНКП (Рис.10), добавление к ЭК (n+1) АТР должно повлечь за собой выпетливание Ср и, как следствие, высокий выход флуоресценции, зафиксировать который при использовании обычного АТР невозможно, поскольку вслед за выпетливанием происходит дальнейшее удлинение РНК-праймера на 2 нуклеотида, Ср вовлекается в стэк-кинг-взаимодействия и происходит гашение флуоресценции. Кроме того молекулы ЭК находятся в различных фазах процесса, который очень трудно синхронизировать В связи с этим для стабилизации выпетливания Т ДНК использовался негидролизуемый аналог АТР, аденозин-а, ß-метилен-трифосфат (АМРсРР), не-

способный образовывать фосфодиэфирную связь. Противоположный эффект на выход флуоресценции должен оказывать СГР: он встраивается в РНК-праймер, образуя комплементарную пару оснований с Ср в составе РНК-ДНК гибрида, что приводит к гашению флуоресценции. Инкубация ЭК с ОТР была использована как негативный контроль (Рис.12А). Как и предполагалось, добавление комплементарного ОТР к ЭК РНКП Е.соН снижало, а инкубация с (п+1) АМРсРР увеличивала квантовый выход флуоресценции. Некомплементарные ИГР и урацил-а,(3-метилен-трифосфат (ЦМРсРР), которые не могли взаимодействовать ни с п, ни с п+1 нуклеотидами Т ДНК, не влияли на изменение эмиссии; уровень флуоресценции ЭК с этими МТР практически совпадал с уровнем самого ЭК (Рис.12Б). Таким образом, было получено прямое доказательство того, что основание п в Т ДНК выпетливается в присутствии п+1 ЭТР, позволяя п+1 нуклеотиду Т ДНК занять сайт добавления нуклеотида.

умеренный квантовый вытол высокий квантовый вым

флуорсоиенша! С* флуоресценции С°

выиетлиаанне п п втТ ДНК .

ТДНК РНК

встраивание GTP

R9/TS42pC sScCGCTATCfTATCAGTCTGTCC

Добавление КТР

's 50000

I

5 40000 S 30000

I

20000

I

I 10000

У

контроль

.....HiHMHÜ^ÜMPcPP

(ГГР

3' ниакнй квантовый выход . ■

флуоресценция С

ВПСМЯ.С

Рис. 12. Выпетливание п нт T ДНК, стабилизируемое n+1 NTP. А. Схема эксперимента, позволяющего регистрировать выпетливание пкгТ ДНК. Б. Данные эксперимента, представленные в виде графика изменения интенсивности флуоресценции С' в ЭК РНКП Е.соН при инкубации с различными NTP от времени. 200 пМ ЭК РНКП Е.соН, был собран на скаффолде R9/TS42pC, содержащем в п положении T ДНК Ср, интенсивность флуоресценции которого регистрировалось до и после добавления NTP (0.5 мМ GTP, UTP, 1 мМ UMPcPP, 1-2 мМ АМРсРР). Образцы возбуждали при Х=350 нм, эмиссию регистрировали при Х=450нм. Спеиральная ширина щелей в каналах возбуждения и испускания была 5 нм. Измерения эмиссии проводились в течении 5-10 мин с интервалом в 1 сек при 23'С. Обозначение «контроль» на графике показывает уровень флуоресценции в ЭК РНКП Е.соН в отсутствии какого-либо NTP.

Предпочтительное удлинение РНК-праймера п+1 ШТ на 2 нуклеотида наблюдалось и в ЭК, собранных на скаффолдах, содержащих НТ ДНК, однако эффективность процесса была значительно ниже, чем в отсутствие НТ ДНК. При

19

сравнении возможностей продуцирования ошибки РНКП в присутствии n+1 NTP в ЭК, собранных на скаффолдах с различной топологией, и остановленных ЭК, полученных при инициации транскрипции с Т7А1-промотора, (с полностью комплементарной НТ ДНК; с НТ ДНК, имеющей разрыв на расстоянии 11 нуклеоти-дов от старт-сайта по ходу транскрипции, с отсутствующим основанием в положении 11 от старт-сайта по ходу транскрипции) было выяснено, что вероятность ошибки существенно снижается в присутствии НТ ДНК, но увеличивается, если п+1 нуклеотид Т ДНК не спарен Очевидно, что наличие дуплексной ДНК в области активного центра в направлении транскрипции играет важную роль в точности транскрипционного процесса

Эксперименты in vitro показали, что генерация ошибок многосубъединичной РНКП, приводящих к замене основания в РНК-транскрипте, происходит по универсальному механизму, предполагающему выпетливание Т ДНК в области активного центра, а не ошибочную загрузку несубстратного NTP в сайт добавления нуклеотида и последующего его встраивания в транскрипт. In vivo, по всей видимости, вероятность подобных ошибок увеличивается, если на пути РНКП встречаются нуклеотиды с «потерянными» основаниями или другие повреждения ДНК, которые на данный момент не были восстановлены репарационным аппаратом клетки

Глава 4. Определение участка плавления ДНК дуплекса в области активного центра бактериальной РНКП

Одним из наиболее острых вопросов в случае транскрипции, осуществляемой многосубъединичными РНКП, является механизм отбора комплементарного NTP субстрата и его доставки в активный центр фермента На данный момент существует несколько моделей, описывающих механизмы проникновения субстрата в активный центр фермента а) модель загрузки NTP через вторичный канал предполагает предварительное связывание субстрата в E-сайте, где входящий NTP не образует каких-либо специфических взаимодействий, с последующим пе-

ремещением в сайт включения нуклеогида (Westover et al, 2004), б) модель загрузки NTP через вторичный канал, согласно которой отбор субстрата происходит в результате комплементарного взаимодействия п основания Т ДНК и NTP. занимающего сайт предварительного связывания субстрата, отличный от Е-сайта и сайта включения нуклеотида (Temiakov et al, 2004); в) модель загрузки NTP через главный канал, в соответствии с которой несколько (3-4) молекул NTP одновременно образуют комплементарные пары с основаниями матричной цепи ДНК в направлении транскрипции, формируя, таким образом, «очередь» к сайту включения нуклеотида (Gong et al, 2005) В свете этих моделей очень важно установить участок расплавленности и доступности оснований ДНК для взаимодействий с субстратными NTP Очевидно, последняя модель допускает, что фрагмент двухцепочечной ДНК в области активного центра фермента в направлении транскрипции расплавлен на участке в 3-4 п.н., в то время как анализ известных структур ЭК многосубъединичной РНКП не дает определенного ответа на этот вопрос (Westover et al, 2004, Kettenberger et al, 2004).

Для определения участка плавления ДНК дуплекса в области активного центра бактериальной РНКП были исследованы пост-транслокационные ЭК РНКП Е coli, собранные на двухцепочечных скаффолдах (ДС) с НТ ДНК и одно-цепочеченых скаффолдах (ОС) без НТ ДНК с РНК-ДНК гибридом 9 п н, содержащих Ср в позициях п, n+1, n+2, n+3 Т ДНК Как упоминалось ранее, интенсивность флуоресценции Ср в составе двухцепочечной ДНК ниже, чем в одноцепо-чечной ДНК вследствие комплементарного взаимодействия оснований и, главным образом, стэккинг-взаимодействий. Таким образом, при регистрации излучения Ср в каждой из позиций n - (n+3) Т ДНК следовало ожидать гашение флуоресценции в скаффолдах при наличии НТ ДНК, те в ДС по сравнению с ОС (Рис.13), что и наблюдалось в ходе эксперимента интенсивность флуоресценции ДС была в 1 6-2.6 раза меньше по сравнению с ОС. ОС и ДС инкубировались с РНКП, формируя, соотвестственно, ЭК ОС и ЭК ДС В случае ЭК ОС предполагался высокий квантовый выход флуоресценции, а для ЭК ДС возможны были два варианта- 1) флуоресценция может достигать практически уровня ЭК ОС в

случае, если РНКГТ плавит двухцепочечную ДНК в исследуемом положении и Ср «выпадает» из стэккинг-взаимодействий; 2) может наблюдаться гашение флуоресценции по сравнению с интенсивностью флуоресценции ЭК ОС, если РНКП не плавит двухцепочечную ДНК и исследуемые основания спарены (Рис.13). Таким образом, если при

выеокав иитвнсивирси. . .... иитмсвмюсп.

РНК" флуоресценции С* . • V* *"Cv

Tnw 5' гшшшштшшшш 3 РНКП - j V ___-___' - Щ

т Д"гк IIIIIIIIIá - . -: ПИШИ» i

J IM1111» líílííTTTl I IfJJJJJU -*- 111111111 tílllím■ 1*J11Г11 параллельном измерении

эмиссии Cp в ЭК ОС и

ЭК ДС происходит зна-

флуоресценции С1'

Ш-2 п.о. ДНК дуплекса не расплавлена

РНКП

' X " • toyOlKÍWEmUII С1

й!У шшшШШ!!' itmiiniiimruinii

I • чительное гашение

iiiuiiiiiiilniinininii чнкп

п+2

iiiiiiiiltli

флуоресценции - РНКП не плавит ДНК в изучаемой позиции; если реги-

п+2 П.О. ДНК дунлсхса расплавлена

Рис. 13. Схематическое представление метода исследования расплав- СТрируеТСЯ ОДИНаКОВЫИ ленности пары оснований ДНК дуплекса в ЭК РНКП (метод гаше- ,

ния флуоресценции). В качестве примера флуоресцентная метка Ср по- Уровень флуоресценции казана в п+2 положении Т ДНК.

- ДНК расплавлена.

Наряду с ЭК РНКП E.coli были исследованы пост-транслокационные ЭК Т7 РНКП, собранные на тех же скаффолдах. Известно, что в пост-транслокационных ЭК Т7 РНКП только положение п в дуплексной ДНК расплавлено (Tahirov et al, 2002, Temiakov et al, 2004), поэтому данные флуоресцентного анализа, полученные для ЭК Т7 РНКП, были использованы в качестве контроля (Рис.14А). При сравнении интенсивности флуоресценции Ср в в позициях n, n+1, п+2, п+3 Т ДНК в ЭК Т7 РНКП, собранных на ОС и ДС, было найдено, что для всех позиций, за исключением п, наблюдалось уменьшение флуоресцентной эмиссии Ср в 1.6-1.8 раз, что свидетельствовало о том, что Т7 РНКП, в полном согласии со структурными данными, «плавит» только одну пару ДНК дуплекса в области активного центра фермента. При исследовании пост-транслокационных ЭК РНКП E.coli также наблюдалось гашение флуоресценции в 1.8-2.0 раза для Срв позициях п+1, п+2, п+3 Т ДНК в ЭК ДС по сравнению с ЭК ОС, но не для Ср в позиции п, где уровень флуоресценции в ЭК ДС и ЭК ОС был практически одинаковым (Рис.14Б). Таким образом, в ЭК бактериальной РНКП, также как в случае Т7

РНКП, расплавлена единственная пара ДНК дуплекса в области активного центра в направлении транскрипции.

А ЭК Т7 РНКП Б ЭК РНКП Е.соИ

п п+1 п+2 п+3 п п+1 п+2 п+3

Рис. 14. Относительная интенсивность флуоресценции С в позициях п, п+1, п+2, п+3 Т ДНК в ЭК Т7

РНКП (А) и ЭК РНКП Е.соН(В), собранных на ОС и ДС. Образцы возбуждали при >.=350 нм, эмиссию регистрировали при ^-450нм. Спектральная ширина щелей в каналах возбуждения и испускания была 5 нм. Измерения эмиссии проводились в течении 5 мин. с интервалом в 1 сек при 23°С. Значения флуоресцентного испускания Ср в ЭК ДС были нормализованы к флуоресцентному испусканию Ср в соответствующем положении ЭК ОС, принятому за I.

Полученные данные противоречат модели загрузки ЫТР через главный канал РНКП, предполагающей наличие нескольких расплавленных пар оснований ДНК. Вероятно, механизм загрузки ОТР через вторичный канал должен обеспечивать достаточно эффективную доставку субстрата напрямую к активному центру для связывания с акцепторным основанием матричной цепи ДНК.

Размер расплавленного участка ДНК дуплекса также имеет отношение к точности транскрипционного процесса. Как было показано ранее (глава 3), вероятность ошибочного включения нуклеотида РНКП в результате выпетливания Т ДНК в области активного центра значительно увеличивается, когда п+1 пара оснований ДНК дуплекса расплавлена (как следствие отсутствия основания или наличие некомплементарного основания в НТ ДНК). Следовательно, плавление только одной пары оснований ДНК дуплекса в области активного центра фермента является необходимым условием для аккуратной транскрипции.

выводы

1 С помощью РНК-ДНК скаффолдов получены элонгационные комплексы бактериальных РНКП в пост-транслокационном и в пре-транслокационном состояниях. Конформационное состояние элонгационнных комплексов определяется, главным образом, длиной ДНК-РНК гибрида

2 При исследовании взаимодействий бактериальной РНКП с антибиотиком БЙ выявлены мутации, определяющие устойчивость, либо чувствительность РНКП к Бй; определено, что ингибирование на стадии элонгации происходит вне зависимости от конформационного состояния ЭК, БЙ предотвращает изомеризацию активного центра полимеразы в каталитически компетентную «закрытую» конформацию

3 Установлено, что высокий уровень ошибочного включения нуклеотида, комплементарного п+1 основанию Т ДНК, обусловлен участком некомплементар-ности или отсутствием НТ ДНК в области активного центра, продемонстрировано «выпетливание» акцепторного нуклеотида п Т ДНК в ЭК, стабилизируемое п+1 ИТР, следствием которого может являться генерация РНКП замены в образующемся транскрипте

4. С помощью метода гашения флуоресценции показано, что бактериальная РНКП «плавит» единственную пару оснований ДНК-дуплекса в активном центре фермента, что опровергает известную модель одновременного связывания в главном канале нескольких субстратных 1ЧТР, взаимодействующих с основаниями «расплавленной» Т ДНК

СПИСОК РАБОТ,

опубликованных автором по теме диссертации

!. Temiakov, D., Zenkm, N., Vassylyeva, M.N, Perederina, A., Tahirov, T.H, Kashkina. E.. Savkma, M., Zorov, S., Nikiforov, V., Igarashi, N., Matsugaki, N., Wakatsuki, S, Sevennov, К, Vassylyev, D G (2005). Structural basis of transcription inhibition by antibiotic streptolydigin. Mot Cell, 19(5) 655-666

2. Kashlona. E., Amkin, M., Tahirov, T H., Kochetkov, S.N., Vassylyev, D.G., Temia-kov, D. (2006). Elongation complexes of Thermus theimophilus RNA polymerase that possess distinct translocation conformations. Nucleic Acids Res., 34(14). 40364045

3 Kashlona. E, Anikm, M., Brueckner, F, Pomerantz, R.T, McAllister, WT., Cramer, P., Temiakov, D (2006). Template misalignment in multisubumt RNA polymerase and transcription fidelity. Mol cell, 24(2)- 257-266

4. Kashkina. E„ Amkin, M., Brueckner, F.,Lehmann, E., Kochetkov, S.N, McAllister, W.T., Cramer, P., Temiakov, D. (2007). Multi-subtmit RNA polymerases melt only a single DNA base pair downstream of the active site. JBiolChem., 282(30): 2157821582

5. EA Кашкина. M.B. Аникин, У Т. Макаллистер, С.Н. Кочетков, Д.Е. Темяков. (2007) Определение участка плавления ДНК дуплекса в области активного центра бактериальной РНК полимеразы методом гашения флуоресценции ДАН, 416(5): 697-701

Автор выражает благодарность к х н. Аникину М В. за помощь в освоении методов экспериментальной работы и обработке результатов.

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от 01 12 99 г Подписано к печати 28 012008 г Формат 60x90 1/16 Услпечл 1,5 Тираж 100 экз Заказ 024 Тел 939-3890 Тел/Факс 939-3891 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им МВ Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Кашкина, Екатерина Александровна

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Основные классы ДНК-зависимых РНКП

2.2. Бактериальная ДНК-зависимая РНКП

2.3. Рентгеноструктурный анализ бактериальной РНКП

2.4. Модель элонгационного комплекса бактериальной РНКП

2.5. Каталитические активности бактериальной РНКП

2.5.1. Структура активного центра РНКП

2.5.2. Цикл добавления нуклеотида.

Конформационные состояния активного центра РНКП

2.5.3. Структурные элементы активного центра, вовлеченные в транслокацию

2.6. Конформационная динамика активного центра РНКП в ЭК

2.6.1. Транслокация-РНКП и ее возможные механимы

2.6.2. Механизм транслокации для бактериального ЭК по модели «Броуновского храповика»

2.7. Механизмы загрузки субстрата в активный центр РНКП

2.8. Точность РНКП в процессе транскрипции

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Получение и характеристика элонгационных комплексов, имеющих определенное конформационное состояние

3.2. Механизм ингибирующего действия антибиотика стрептолидигина

3.3. Механизм ошибочного включения нуклеотида в транскрипт, обусловленного «выпетливанием» транскрибируемой цепи ДНК в области активного центра

3.4. Определение участка плавления ДНК дуплекса. в области активного центра бактериальной РНКП

4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

4.1. Материалы и реагенты

4.2. Методы

ВЫВОДЫ

СОКРАЩЕНИЯ И ОБОЗНАЧЕНИЯ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурно-функциональный анализ элонгационных комплексов бактериальной РНК полимеразы"

ДНК-зависимые РНК полимеразы (РНКП), катализирующие синтез матричной РНК, являются ключевыми ферментами в экспрессии генетической информации у всех живых организмов. Среди ферментов этого класса выделяют односубъединичные РНКП бактериофагов и митохондрий и многосубъединичные РНКП хлоропластов, прокариотических и эукариотических организмов. Несмотря на отличие односубъединичных и многосубъединичных РНКП, особенно в структурной организации, они используют общий механизм катализа (нуклеофильное замещение), основанный на присутствии двух ионов Mg2+ в активном центре фермента; достигают практически полной процессивности в элонгационной фазе, формируя РНК-ДНК гибрид одинаковой длины; имеют сходство в механизмах биохимических процессов инициации, элонгации и терминации синтеза РНК. Наиболее охарактеризованной и изученной является односубъединичная РНКП бактериофага Т7 (Т7 РНКП). В силу некоторых общих закономерностей модели транскрипционных процессов, полученные для Т7 РНКП, могут быть рассмотрены для многосубъединичных РНКП.

Многосубъединичные РНКП ответственны за синтез практически всех клеточных РНК. Аминокислотные последовательности полипептидов многосубъединичных РНКП содержат большое число консервативных областей, а данные кристаллографических исследований демонстрируют сходство пространственной организации. Особенно высокая степень гомологии наблюдается в области активных центров, что отражает аналогичность их функционирования во всех многосубъединичных РНКП. Более простое строение бактериальных РНКП (6 субъединиц) по сравнению с эукариотическими, содержащими до 17 субъединиц (в случае РНКП III), делает первые прекрасной моделью для изучения- клеточных РНКП в целом. Поскольку структура белка определяет его функцию, структурный анализ многосубъединичных РНКП, среди которых известны высокоразрешенные кристаллические структуры кор-фермента T.aquaticus [3], холофермента T.thermophilus [34], дрожжевой РНКП II и ее элонгационных комплексов (ЭК) [41, 92, 101, 117-120], а также комплексов РНКП с различными антибиотиками и транскрипционными факторами [103, 158, 159, 164, 198, 199], вместе с данными биохимических, биофизических и генетических исследований позволяют предположить возможные механизмы функционирования.

В процессе транскрипции выделяют три этапа: 1) инициацию, характеризующуюся связыванием РНКП с промотором, абортивным синтезом и началом образования РНК-транскрипта; 2) элонгацию, в ходе которой происходит формирование стабильного элонгационного комплекса (ЭК), в состав которого входят кор-фермент РНКП, молекула транскрибируемой ДНК, образующийся РНК-транскрипт, и процессивный синтез РНК; 3) терминацию, завершающую синтез РНК-транскрипта и приводящую к диссоциации ЭК. Взаимодействия РНКП с различными сигнальными последовательностями* нуклеиновых кислот и (или) вспомогательными транскрипционными факторами контролируют транскрипцию, регулируя экспресию генов. Синтез РНК осуществляется, главным образом, на этапе элонгации в результате многократно повторяемого цикла добавления нуклеотида, (ЦДН); представленного последовательными стадиями: связывания субстрата NTP в активном центре РНКП, катализа - включения NMP в транскрипт и транслокации фермента, которые сопровождаются конформационными изменениями ЭК. При транслокации РНКП перемещается по транскрибируемой цепи молекулы ДНК, что позволяет рассматривать- поступательное движение фермента как работу молекулярного мотора, функционирование которого основано либо на броуновском и собственном тепловом движении, либо на действии движущей силы, которая, в данном случае, может быть представлена реализацией энергии расщепления высокоэнергетической связи в молекуле субстрата NTP путем преобразования конформационного состояния РНКП (ЭК). Прямых доказательств, свидетельствующих в пользу той или иной причины транслокации, пока не получено. Кроме полимеразной активности для РНКП1 характерны способность к пирофосфоролизу - процессу, обратному образованию фосфодиэфирной связи, собственная 3'-5'-экзонуклеазная активность и, индуцируемая транскрипт-расщепляющими факторами, эндонуклеазная активность. Архитектура РНКП и наличие подвижных структурных элементов, определяющих способность фермента к конформационным изменениям, обеспечивают осуществление этих процессов. Вследствие отсутствия структурных данных для каждой из возможных конформаций ЭК, на основании имеющихся фактов функциональное значение структурных элементов можно пока только предположить, хотя роль некоторых из них была продемонстрирована с помощью биохимических экспериментов с использованием мутантных форм РНКП.

В свете современных представлений об элонгации остаются неясными детальный ход событий ЦДН, полная картина конформационных изменений, претерпеваемых ЭК, и их взаимосвязь с биохимическими процессами, природа сил, вызывающих транслокацию, а также то, каким образом корректный NTP узнается РНКП и доставляется в активный центр, как обеспечивается^ точность воспроизведения последовательности транскрибируемой ДНК в РНК-транскрипте, что является причиной ошибок, продуцируемых РНКП, и возможна- ли их корректировка. Многие из этих аспектов остаются неизученными или недостаточно изученными, прямые доказательства предполагаемых механизмов, как правило, отсутствуют, в связи с чем в литературе часто приводятся несколько альтернативных моделей одного и того же процесса. Таким образом, для получения исчерпывающей картины функционирования РНКП, необходимо детальное изучение каждого элементарного шага катализируемых ею реакций.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Кашкина, Екатерина Александровна

выводы

1. С помощью РНК-ДНК скаффолдов получены элонгационные комплексы бактериальных РНКП в пост-транслокационном и в пре-транслокационном состояниях. Конформационное состояние элонгационнных комплексов определяется, главным образом, длиной ДНК-РНК гибрида.

2. При исследовании взаимодействий бактериальной РНКП с антибиотиком Stl выявлены мутации, определяющие устойчивость, либо чувствительность РНКП к Stl; определено, что ингибирование на стадии элонгации происходит вне зависимости от конформационного состояния ЭК; Stl предотвращает изомеризацию активного центра полимеразы в каталитически компетентную «закрытую» конформацию.

3. Установлено, что высокий уровень ошибочного включения нуклеотида, комплементарного п+1 основанию Т ДНК, обусловлен участком некомплементарности или отсутствием НТ ДНК в области активного центра; продемонстрировано «выпетливаиие» акцепторного нуклеотида n Т ДНК в ЭК, стабилизируемое n+1 NTP, следствием которого может являться генерация РНКП замены в образующемся транскрипте.

4. С помощью метода гашения флуоресценции показано, что бактериальная РНКП «плавит» единственную пару оснований ДНК-дуплекса в активном центре фермента, что опровергает известную модель одновременного связывания в главном канале нескольких субстратных NTP, взаимодействующих с основаниями «расплавленной» Т ДНК.

СОКРАЩЕНИЯ И ОБОЗНАЧЕНИЯ

РНКП РНК полимераза

Т7 РНКП РНК полимераза бактериофага Т7

ЭК элонгационный комплекс

ЦДН цикл добавления нуклеотида

Т ДНК транскрибируемая цепь ДНК

НТ ДНК нетранскрибируемая цепь ДНК п.н. пара нуклеотидов нт нуклеотид

ДС двухцепочечный скаффолд, содержащий олигонуклеотиды: Т ДНК, НТ ДНК, РНК

ОС одноцепочечный скаффолд, содержащий олигонуклеотиды:

ТДНК, РНК

ЭК ДС элонгационный комплекс, собранный на основе двухцепочечного скаффолда

ЭК ОС элонгационный комплекс, собранный на основе одноцепочечного скаффолда

ТБ транскрипционный буфер пДНК плазмидная ДНК

ПААГ полиакриламидный гель

ДСН додецилсульфат натрия

NTP нуклеозидтрифосфат

PPi пирофосфат

Stl стрептолидигин

ВН P'-F-спираль (Bridge helix)

TL P'-G-петля (Trigger loop)

AMPcPP аденозин-а,Р-метилентрифосфат - негидролизуемый аналог ATP, неспособный образовывать фосфодиэфирную связь

UMPcPP урацил-а,Р-метилентрифосфат - негидролизуемый аналог UTP, неспособный образовывать фосфодиэфирную связь

GMPcPP гуанозин-а,р-метилентрифосфат - негидролизуемый аналог GTP, неспособный образовывать фосфодиэфирную связь

Ср Ап пирролоцитозин, флуоресцентный аналог цитозина 2-аминопурин, флуоресцентный аналог аденозина скаффолд модельная матрица, представляющая собой комплекс отожженных синтетических олигонуклеотидов пробел» отсутствие нуклеотида остановленный» ЭК откатившийся» ЭК транскрипционныи комплекс, полученный при инициации транскрипции с промотора результате остановки реакций полимеризации, осуществляемых РНКП, из-за отсутствия соответствующего NTP элонгационный комплекс (backtracked), образовавшийся в результате перемещения каталитического центра РНКП («откатывания» РНКП) на одну из внутренних фосфодиэфирных связей РНК-транскрипта

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Кашкина, Екатерина Александровна, Москва

1. Никифоров В.Г. Структурно-функциональные исследования РНК-полимеразы (1962-2001). // Молекулярная биология. 2002. т. 36. № 2. с. 197-207.

2. Severinov К. Т7 RNA polymerase transcription complex: what you see is not what you get. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. V. 98. P. 5-7.

3. Zhang G., Campbell E.A., Minakhin L., Richter C., Severinov K., Darst S.A. Crystal structure of Thermits aquaticus core RNA polymerase at 3.3 A resolution. // Cell. 1999. V. 98. P. 811-824.

4. Gross C.A., Chan C., Dombroski A., Gruber Т., Sharp M., Tupy J., Young B. The functional and regulatory roles of sigma factors in transcription. // Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 1998. V. 63. P. 141-155.

5. Wosten M.M. Eubacterial sigma-factors. // FEMS Microbiol. Rev. 1998. V. 22. P. 127-150.

6. Kholodii G., Yurieva O., Mindlin S., Gorlenko Z., Rybochkin V., Nikiforov V. Tn5044, a novel Tn3 family transposon coding for temperature-sensitive mercury resistance. //Res. Microbiol. 2000. V. 151. P. 291-302.

7. Studholme D.J., Buck M. The alternative sigma factor sigma (28) of the extreme thermophile Aquifex aeolicus restores motility to an Escherichia coli fliA mutant. // FEMS Microbiol. Lett. ,2000. V.191. P.103-107.

8. Hajdukiewicz P.T., Allison L.A., Maliga P. The two RNA polymerases encoded by the nuclear and the plastid compartments transcribe distinct groups of genes in1 tobacco plastids. //EMBO J. 1997. V.16. P. 4041-4048.

9. Severinov K. RNA polymerase structure function: insights into points of transcriptional regulation. // Curr. Opin. Microbiol. 2000. V. 3. P. 118-125.

10. Kohler S., Delwiche C.F., Denny P.W., Tilney L.G., Webster P., Wilson R.J., Palmer J.D., Roos D.S. A plastid of probable green algal origin in Apicomplexan parasites. // Science. 1997. V. 275. P. 1485-1489.

11. Lang B.F., Burger G.3 O'Kelly C.J., Cedergren R., Golding G.B., Lemieux C., Sankoff D., Turmel M., Gray M.V. An ancestral mitochondrial DNA resembling a eubacterial genome in miniature. // Nature. 1997. V. 387. P. 493-497.14,15.16,17