Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональные исследования тройного элонгационного комплекса РНК-полимеразы E. coli

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональные исследования тройного элонгационного комплекса РНК-полимеразы E. coli"

Б Ой ь № ^

На правах рукописи

АВЕТИСОВА Екатерина Ашотовна

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ТРОЙНОГО ЭЛОНГАЦИОННОГО КОМПЛЕКСА РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ £ coli

(Специальность 03.00.03. - Молекулярная биология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1998

Работа выполнена в Институте молекулярной генетики РАН (Москва) и в Нью-Йоркском Институте здравоохранения.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор

В.Г. Никифоров

Официальные опоненты:

доктор химических наук, профессор

доктор биологических наук, профессор

Ю.А. Берлин Г.Б. Завильгельский

Ведущая организация:

Институт молекулярной биологии РАН

Защита состоится декабря 1998 года в/^часов на заседании диссертационного совета Д 098.12.01. при Государственном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу. 113545 Москва, 1-й Дорожный проезд, дом 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГосНИИ Генетика.

Автореферат разослан

/<£. //

1998 года.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

В.И. Щербакова

Удлинение РНК-транскрипта осуществляется в тройном элонгационном комплексе (ТЭК), состоящем из молекулы РНК-полимеразы (РНКП), ДНК-матрицы и РНК-продукта. Во время элонгации РНКП обладает двумя на первый взгляд противоречивыми свойствами: она прочно связывает РНК-продукт и ДНК-матрицу и одновременно свободно скользит вдоль ДНК. Эти два свойства определяют исключительную процессивность РНКП, т.е. способность транскрибировать длинные участки ДНК, не теряя матрицу и транскрипт.

Важно отметить, что РНКП на стадии инициации, узнавая определенные последовательности промотора, ведет себя как сайт-специфичный ДНК-связывающий белок. При переходе от стадии инициации к элонгации РНКП должна претерпевать значительные изменения в природе взаимодействий с матрицей и РНК. Когда транскрипционный комплекс покидает промотор он приобретает устойчивость к воздействию высоких концентраций моновалентных солей, что указывает на неионную природу взаимодействий на стадии элонгации.

Бактериальные и эукариотические РНКП представляют собой многосубъеденичные молекулы, значительный размер и сложная организация которых делают невозможным получение кристаллографической структуры с высоким разрешением. Использвание альтернативных методов для определения структурных элементов молекулы РНКП, взаимодействующих с нуклеиновыми кислотами, и выяснение их функциональной роли, дали бы возможность понять природу стабильности и процессивности ТЭК и, возможно, объяснить механизмы регуляции транскрипции на стадии элонгации.

Цель работы и задачи исследования.

Целью работы являлось определение структурных элементов РНКП из Escherichia coli, отвечающих за стабильность и процессивность ТЭК в процессе элонгации.

В работе ставились следующие задачи: 1) биохимически охарактеризовать основные элементы РНКП, отвечающие за связывание нуклеиновых кислот в ТЭК (ДНК и РНК-связывающие- сайты); 2) с помощью методов аффинной модификации локализовать участки субъединиц РНКП, вовлеченные в образование ДНК- и РНК-связывающих сайтов.

Научная новизна и практическая ценность работы. Выявлены и охарактеризованы следующие структурно-функциональные элементы ТЭК: ДНК-связывающий сайт (ДСС), РНК/ДНК-гибрид-связывающий сайт (ГСС) и РНК-связывающий сайт (РСС). ДСС неионно взаимодействует с 9 п.о. ДНК-дуплекса сразу впереди от положения активного центра фермента. ГСС ионно взаимодействует с сегментом РНК/ДНК-гибрида длиной примерно в 6 п.о. от

положения -5 до +1, считая от 3' -конца РНК. РСС образует неионные контакты с участком однонитевой РНК, длиной 9-11 оснований нуклеотидов, сразу выходящей из РНК/ДНК-гибрида.

С помощью методов аффинной модификации и картирования сшивок РНК-белок и ДНК-белок были идентифицированы участки субъединиц РНКП, вовлеченные в образование каждого сайта. Показано, что амино-концевой район субъединицы (метионин 29 - цистеин 58) и карбокси-концевой район р-субъединицы (метионин 1232 - метионин 1273) вовлечены в образвание как РСС так и ДСС. Карбокси-концевой район р-субъединицы (метионин 1232 -метионин 1273) участвует и в образовании ГСС. В состав ДСС также вовлечен амино-концевой район р-субъединицы (метионин 130 - метионин 239).

Результаты данной работы позволили предложить структурно-функциональную модель ТЭК, согласно которой совокупность взаимодействий между РНК, ДНК и белком в каждом из трех сайтов необходима и достаточна для полной стабильности и процессивности ТЭК. При этом, РСС и ДСС структурно и функционально интегрированы, т.е. нарушение одного из этих сайтов ведет к инактивации другого. Модель предполагает, что взаимодействия в ГСС являются сравнительно слабыми и достаточны лишь для поддержания целостности ТЭК в условиях низкой ионной силы.

. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения полученных результатов, их обсуждения и списка цитируемой литературы. Работа изложена на страницах машинописного текста и содержит рисунков. Библиография включает в себя названий, в том числе русских и иностранных.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕН ИЕ Глава1. Определение ДНК- и РНК-связывающих сайтов в РНКП.

1.1. Получение гомогенных ТЭК с использованием иммобилизованной РНКП. Для получения стабильных гомогенных ТЭК была использована РНКП с шестью остатками гистидина, введенными в С-конец Р' -субъединицы методами генной инженерии. Это позволило иммобилизовать фермент на сорбенте, содержащем ионы никеля (ЫЫЧТА-агароза). Все биохимические реакции с этим ферментом были выполнены в твердофазной системе, что позволило быстро менять компоненты реакционной смеси путем повторения

процедуры отмывок. Меняя комбинации четырех рибнуклеозидтрифосфатов (исключая хотя бы один из реакции), можно было осуществлять транскрипцинную реакцию пошагово в соответствии с последовательностью ДНК-матрицы и получать стабильные ТЭК, остановленные практически в любом положении матрицы.

1.2. Система анализа основных структурных компнентов РНК-полимеразы. В основе системы, использованной для выявления основных компонентов ДНК- и РНК-связывающих сайтов (доменов) РНКП Е.соИ лежит тот факт, что в определенных условиях РНКП в процессе элонгации способна «перепрыгивать» с 3'-конца первичной матрицы, на которой происходила инициация транскрипции, на 5'-конец другой ДНК-молекулы (вторичная матрица), не теряя при этом РНК-транскрипт. После «прыжка» транскрипция продолжается на новой матрице.

В качестве первичной матрицы использовался линейный фрагмент ДНК, содержащий Т7А1 промотор и транскрибируемый участок 49 п.о. (Рис. 1Б). При добавлении к остановленному ТЭК двунитевого ДНК-олигонуклеотида длиной 24 п.о., а также всех 4 нуклеозидтрифосфатов, образовывался полноразмерный РНК-продукт на 24 нуклеотида длиннее, чем в контрольном опыте без добавления олигонуклеотида (Рис. 1А, дорожки 2 и 4). В качестве вторичной матрицы могли выступать как двунитевые, так и однонитевые олигонуклеотиды, причем процесс смены матрицы в основном не зависел от последовательности ДНК.

Было показано, что в буфере с низкой ионной силой ТЭК, содержащие одинаковый РНК-продукт, остановленный как на однонитевой, так и на двунитевой вторичной матрице, были стабильны (Рис. 2А, дорожки 1 и 2). Существенные различия между одно- и двунитевой матрицами были замечены, когда ионная сила раствора была значительно увеличена: РНК-продукт из комплекса, остановленного на однонитевой вторичной матрице, полностью диссоциировал, тогда как на двунитевой матрице ТЭК оставался устойчивым к воздействию соли. Эти данные указывают на наличие двух типов взаимодействия между ДНК, РНК и ферментом: ионного, т.е. зависимого от концентрации соли, и неионного. Для последнего типа взаимодействия необходима нематричная нить.

Для определения минимальной длины участка ДНК, необходимого для стабильности ТЭК была приготовлена серия вторичных матриц (Рис. 2А). В каждом случае определялся период полужизни ТЭК в буферах с низкой и высокой ионной силой. В результате эксперимента было показано, что для неионного типа взаимодействий необходимо 9 п.о. ДНК от позиции +2 до +11, считая от положения З'-конца РНК (дорожки 4 и 7). Этот участок определяет передний ДНК-связывающий сайт (ДСС) в РНКП.

я

зторичная матрица - - - + + +■ (мечен.) с о а.

+НТФ - АСБи АСв! ь I

этмыв.КС — — + — — + *-элонг. о *

1 2 3 4 5 6171819110 11

первичная матрица

п.т. (вторичная матрица)

49-»« п.т.

(первичная матрица)

34 ■*

вторичная матрица

-контрольная матрица

_ первичная матрица вторичная матрица

Т7А1 :САСАСССССССААСА"3 ' 5 '-АССССАТААСААТТТСАСАСАССА-З '

¡СТОТСОСССССТТОТ-5' 3'-ТССССТАТТСГТАААСТСТСТССТ-5' * *

+ 34 +49 +55

Т7А1 ¡САСАСССССССААСААВСООАТААСААТТТСАСА-З ' :СТСТСССССССТТСТТСаССТАТТСТТАААОТОТ-5'

контрольная матрица

Рис.1. Результаты экспериментов, определяющих параметры контактов в ДСС и ГСС.

(А) Метод «перепрыгивания» РНК-полимеразы с первичной матрицы на вторичную. На радиоавтографе представлены РНК-транскрипты и фрагменты первичной и вторичной матриц, полученные в результате «шагания» РНК-полимеразы, иммобилизованной на М-сорбенте через Н1Б-«якорь». Цифрами обозначены длины РНК-продуктов, полученные в результате «шагания» РНК-полимеразы. «П.Т.» - полноразмерный транскрипт, образованный на данной матрице. (Б) Нуклеотидная последовательность первичной, вторичной и контрольной матриц, использованных в данном эксперименте.

п

Б

первичная матрица

нуклеотидная послед-ть

время полужизни(мин ТЭК 500тМ 5тМ КС1 КС1

42- -мер >120 >120

4 Ь <1 10

47 4 >120

43 3 >120

49 <1 4

42- -мер <1 8

4Ь <1 10

47 4 >120

48 3 >120

49 <1 4

42 -мер >120 >120

4Ь -100 >120

47 >120 >120

48 >120 >120

49 >120 >120

Ь1 >120 >120

35 90 >120

+ 34

САСАССССООвААСА-З'

¡СТаТС5<ЗССССТТ5Т-5 > ! ■

1 ЙАСАС-З' (ЕхоШ) Ьтотоовзссст'

! 4* 4547!

; 48

О ВЛСЛССССОСОААСААОСааАТААСЛАТТТСХСА СТЗТ^"С"СССТТСТТСаССТАТТ0ТТХАА0ТЗТ

48

55

49

# вторичная матрица время полужиэни(мин

нуклеотидная послед-ть ТЭК 500ГПМ КС1 5тМ КС1

1 Н1/М1 5 3 -АССССАТААСААТТТСАСАСАОСА -ТССССТАТТОТТАААСТОТСТССТ +55 80 >120

2 м1 3 -ТССССТ^ТТОТТАААСТгТСТССТ +55 <1 >120

3 н2/м1 3 5'-ТААСААТТТА -ТСОСС^АТТОТТАААОТОТОТССТ +55 2 >120

4 нЗ/м1 3 5'-АСААТТТСА -ТСОССТАТТОТТАААОТОТОТСС? +55 60 >120

5 н4/м1 3 5' -ААТТТСАСА -ТСССС^АТТСТТАААСТСТСГССТ +55 8 >120

6 н5/м1 3 5 ' -ТТТСАСАСА -ТСОСС^ТТЙТТАААОТОТОТССТ +55 <1 >120

7 нЗ/м2 3 5'-АСААТТТСА -ТСОССТ^ТТОТТАААОТ +55 60 >120

8 н4/м3 3 5'-ТААСААТТТСА -ТСОССТ^.ТТаТТААА +55 1.5 >120

9 нЗ/м4 3' 5'-АСААТТТСА _ТСАТТЕТТААД(ЗТ0ТСЗТССТ +51 <1 30

10 нЗ/м5 3' 5'-АСААТТТСА -ТССС^ТТОТТАААОТСТСТССТ +53 10 >120

11 -ТСОССТАТТОТТАААОТ 1 +55 <1 >120

Рис. 2. (А) Сравнение стабильности ТЭК, остановленных на различных вторичных матрицах. Название матриц определено буквами «н/м», обозначающими нематричную и матричную нити, соответственно. Стрелками указаны места остановки ТЭК на матрицах. Стабильность комплексов определялась временем их «полу-жизни» в буфере с низкой и высокой ионной силой. (Б) Определение параметров участка неионного взаимодействия в ТЭК. 1 и 2 первичные матрицы - те же, что и на рис. 1А. Первичная матрица 1 (ЕхоШ) получена путем обработки матрицы 1 экзонуклеазой ЕхоШ с целью удаления участка нематричной нити длиной 10 нуклеотидных остатков . (Остальные обозначения см. на рис. 1А).

Для ионного типа взаимодействия не требуется наличия двунитевой ДНК, важен лишь участок матричной нити размером как минимум в 4 нуклеотидных остатка сразу позади З'-конца РНК (дорожка 9). Для более детального изучения этого вида взаимодействий были получены ТЭК, остановленные в нескольких положениях вблизи 5'-конца матричной нити первичной матрицы, чтобы исключить неионное взаимодействие, ассоциированное с передней частью ТЭК (Рис. 2Б). При сравнении стабильности комплексов на трех матрицах: первичной, первичной с однонитевым участком в 10 нуклеотидов длиной на 5'-конце и контрольной, представляющей собой гибрид из первичной и вторичной матриц, было показано, что в образование ионного взаимодействия между РНКП и ДНК вовлечен сегмент матричной нити ДНК длиной в 6 нуклеотидов, от -5 положения до +1, считая от положения З'-конца РНК.

Недавно было показано (ЫисЯег е! а!., 1997), что ионные взаимодействия в этом районе происходят на самом деле между РНК-ДНК-гибридом и белковой частью, в связи с чем сайт был назван гибрид-связывающим (ГСС).

Глава 2. Структурные особенности сайтов связывания ДНК и РНК в элонгационном комплексе.

2.1. Определение участков субъединиц РНКП. вовлеченных в образование контактов с ДНК

Для определения ДНК-контактов в ТЭК был использован метод фотоактивируемой сшивки. Метод основан на использовании фотоактивируемых аналогов нуклеозидтрифосфатов, встроенных в определенные участки ДНК-матрицы и РНК-продукта (Рис. 3). Образование ковалентной сшивки между белком и нуклеиновыми кислотами активировали ультрафиолетовым облучением (УФ) при определенной длине волны. Положение сшивки на белке картировали по методу Мустаева-Грачева с помощью ограниченного расщепления субъединиц РНКП по определенным аминокислотным остаткам.

В качестве сшивающего реагента в случае ДНК был использован 5-иодо-2'-дезоксиуридин, производное тимидина, который был включен в определенное положение в матричную нить двунитевой вторичной матрицы (Рис. 4А). С помощью метода пошаговой транскрипции на вторичной матрице была получена серия остановленных комплексов, в которых реагент находился в различных положениях относительно активного центра фермента (Рис. 4Б, слева).

Образование высокоэффективной ковалентной сшивки с

Аналоги никлеотидов для сшивок РНК-белок

Аналог нцклеотипа для сшивок ПНК-белок

-ОСН2 0х N

и

он он 4-тио-уридин

о о

II II

с—ый-сн2—сн=сн_

о

—осн2

N4

с

он он «азидо»-уридин

НИ'

—оснг

^0-—

У1

ОН н 5-иодо-2' -дезоксиуридин

в

Рис. 3. Химические формулы фотактивируемых аналогов нуклеозидтрифосфатов, используемых в данной работе с целью получения ковалентных сшивок между ДНК и белком и РНК и белком в ТЭК. Реактивные группы обведены.

А

!САСАСССССС0ААСА-3'

промотор ¡СТСТСССССССТТСГ-Б ' + 3!1 +49

еторииная матрица

5 ' -АССССАТААСАССССАССТАСАСССАСА-З ' 3'-ТССССТАТТСТССССТССАТСПСССГСТ-Б'

I ♦

+55 5-и0д0-2'дУМФ

(Ш)

Рис. 4. ДНК-белковые сшивки в ТЭК. (А) Структура и нуклеотидная последовательность первичной и вторичной матриц, использованых в эксперименте «шагания» и «перепрыгивания» РНК-полимеразы с 5'-конца исходной матрицы на 3'-конец вторичной матрицы. (Б, слева) Фотоактивируемый реагент, 5-иодо-2'-дезокси-уридин (¡11), был включен в матричную нить вторичной матрицы в положение +22, считая от 3'-конца РНК.

(Б, справа) Радиоавтограф показывает радиоактивно-меченные продукты сшивок ДНК-белок (верхняя панель, 4% РАСЕ-БОБ гель), а также РНК-транскрипты и вторичные ДНК-матрицы, несущие радиоактивный у-фосфат на 5'-конце нематричной нити (нижняя панель, 12% ПАА гель). Цифры со знаком «+» соответствуют расстоянию между положением реагента и 3'-концом РНК.

р-субъединицей РНКП наблюдалось, когда реагент находился в ДНК на участке от +15 до -3 положения, считая от положения активного центра (Рис. 4Б, справа). Эффективное сшивание с р'-субъединицей происходило в положениях +9, +6 и +3, т.е. в пределах ДСС. Впереди или позади этого участка сшивки с р'-субъединицей практически не наблюдалось.

Для дальнейшего картирования сшивок ДНК-белок радиоактивно-меченые субъединицы из комплексов, сдержащих реагент в позиция от +3 до +15, были выделены из полиакриламидного геля и подвергнуты одноударному расщеплению по остаткам метионина, с использованием CNBr, и по остаткам цистеина, с использованием NTCBA. В случае р' -субъединицы наличие группы коротких цистеин-специфичных фрагментов указывает на пришивание метки к N-концевому участку полипептида (Рис.5А). Такой вывод подтверждал и характерный набор фрагментов расщепления по метионинам. Наиболее короткий радиоактивно меченый фрагмент соответсвовал расщеплению по цистеину 58, следовательно, место сшивки ДНК-р' располагается между цистеином 58 и следующим за ним метионином 29 (Рис. 5А, дорожки 3, 6 и 9).

Картирование сшивок в р-субъединице выявило 2 перекрывающихся участка (Рис. 5Б). Характерный набор фрагментов расщепления по метионинам определил С-концевой фрагмент от метионина 1232 до метионина 1273 в комплексах с реагентом в позициях +9, +6, и +1. На наличие N-концевого участка (Мет 130 - Мет 239) в комплексах с реагентом в позициях от +15 до +1 указывает меченый фрагмент, соответсвующий расщеплению по метионину 239 .

В совокупности эти результаты указывают на то, что N-концевой фрагмент р-(Мет 29 - Цис 58), С-концевой фрагмент р(Мет 1232 - Мет 1237) и N-концевой фрагмент р (Мет 130 - Мет 239), по видимому, вовлечены в образование ДСС. С-концевой фрагмент р (Мет 1243 - Мет 1237) образует контакты с матричной нитью ДНК в области гибрида и очевидно также участвует в формировании ГСС (см. рис. 9А).

2.2. Определение участков субъединиц РНКП. вовлеченных в образование контактов с РНК

Для выяснения РНК-белковых контактов в ТЭК был использован фотоактивирумый аналог УТФ - 4-тио-УТФ (Рис. 3). Короткое «реакционное плечо» реагента (меньше одного А) не припятствовало прохождению через РНКП и позволило определить участки субъединиц, непосредственно контактирующие с РНК-продуктом. В ТЭК, остановленных в определенных положениях во время пошаговой транскрипции, 4-тио-УТФ-зависимую

Мет -

Рис. 5. Картирование сшивок ДНК-белок. (А) Картирование сшивок ДНК-белок в р'-субъединице с помощью ограниченного расщепления по остаткам метионина (Мет) и цистеина (Цис). Места образования сшивок показаны стрелками на схеме распределения остатков Мет и Цис в р'-субъединице (внизу). Радиоавтографы градиентного (7-14%) денатурирующего ПААГ демонстрируют продукты сывг и мтсза расщепления Р'-субъединицы, модифицированной в ТЭК67, ТЭК64, ТЭК61 с помощью ¡и. Вставки фрагментов авторадиоавтографа (дорожки 3, 6 и 9) показывают разделение коротких фрагментов расщепления в 8.5% денатурирующем геле (РАЗЕ-БОБ). Вертикальные колонки представляют теоретический набор фрагментов расщепления по остаткам Мет и Цис ви- и с-концевой части субъединицы. (Б) Картирование сшивок ДНК-белок в р-субъединице с помощью ограниченного расщепления по остаткам метионина (Мет).

А

б

Рис. 6. Образование сшивок РНК-белок в ТЭК. (А) Схема включения фотоактивируемого 4-тио-уридина-5'-монофосфата (эи) в цепь РНК и продвижения реагента в определенные положения ТЭК с помощью методики «шагания» РНК-полимеразы, иммобилизованной на М-содержащем сорбенте через гистидиновый «якорь». (Б) Радиоавтограф демонстрирует [32Р] (3 и Р' -субъеденицы РНКП, образванные в результате сшивок РНК-

белок (верхняя панель, 4% денатурирующий ПААГ) и [32Р] РНК-транскрипты из ТЭК, полученные при «шагании» РНК-полимеразы от позиции +21 (места включения эи) до позиции +59 (нижняя панель, 12% РНК- денатурирующий ПААГ). Цифры под нижней панелью соответствуют длине транскриптов в нуклеотидах. Цифры с знаком «-» соответствуют расстянию от 3' -конца РНК до места включения бО реагента.

пришивку активировали УФ при длине волны 360 нм. Реагент включали в синтезирующуюся РНК в позиции +21 (Рис. 6А) или +45 (данные не представлены) относительно 5'-конца РНК .

В случае пробы «+21» образование высокоэффективной ковалентной сшивки между РНК и белком наблюдалось, когда реагент находился либо в положении -1, т.е. в районе каталитического центра, либо на участке от -10 до -18, считая от положения каталитического центра, причем мечение р' -субъединицы являлось доминирующим по сравнению с р (Рис. 6Б, дорожки 2, 5-7). В случае пробы «+21», из-за ограничений наложенных последовательностью ДНК-матрицы, РНК-белковые контакты не могли быть проанализированы на участке от -7 до -9. Однако, в случае пробы «+45», это было возможно. Мечение р- и р'-субъедениц в -8 положении оказалось промежуточным по интенсивности. Это указывает на то, что с этого положения начинается зона плотного контакта между РНК и белком.

Таким образом, зона плотного контакта РНК с р'- и р-субъединицами, локализована на участке от -8 до -18. Мы считаем, что этот район является РНК-связывающим сайтом (РСС).

При продвижении реагента от -2 до -7 положения образование сшивки было крайне не эффективным (Рис. 6Б, дорожки 3, 4). РНК на этом участке входит в состав РНК/ДНК-гибрида, и повидимому, не образует плотных контактов с белком.

Картирование мест РНК-пришивки на белке проводилось сходным образом с описанным выше картированием ДНК-пришивок. Радиоактивно меченые р'- и р-субъединицы были изолированы из ТЭК, в которых сшивающий реагент находился в положениях: -10 (ТЭКЗО) , -14 (ТЭК34), -18 (ТЭК38), -23 (ТЭК43), -33 (ТЭК53) и -8 (ТЭК52, проба «+45»), В случае -14 (ТЭК34) ограниченное расщепление р'-субъединицы по остаткам цистеина и метионина выявило набор фрагментов (58, 70, 72, 85, 88 и 102, 130, 151 -соответственно), характерный для М-концевого участка субъединицы (Мет 29-Цис 58) (данные не представлены). Появление дополнительного фрагмента в случае -18 (ТЭК38), соответствующего метионину 29, указывало на соседний участок взаимодействия - Мет 1 - Мет 29. Одновременно два района, Мет 29 -Цис 58 и Мет 298 - Мет 330, были выявлены в случае -8 (ТЭК52, проба «+45») и -10 (ТЭКЗО).

Исходя из этих данных, можно заключить, что в образовании наиболее плотного контакта с РНК, в основном, принимает участие М-концевой фрагмент р' -субъединицы (Мет 29 - Цис 58) (Рис. 7).

Картина, совершенно отличная от указанной выше, наблюдалась при ограниченном расщеплении Р'-субъединицы в случае ТЭК53, в котором

N (-

200 —I-

400 —I-

1000 -1-

1200 -1-

1400

—нС

>

Р"

Мет V i и и i' I i i I—пи ПИ III—I-1-н—I-1—н

Цис

0.

м—н

±_

Ч-1-

-1-п1

Рис.7. Картирование сшивок РНК-белок в р'-субъединице с помощью ограниченного расщепления по остаткам метионина (Мет) и цистеина (Цис). Места образования сшивок показаны стрелками на схеме распределения остатков Мет и Цис вр'-субъединице.

Рис. 8. Картирование сшивок РНК-белок в р-субъединице. На авторадиоавтографе градиентного денатурирующего геля (7-14%) представлены продукты ограниченного расщепления по остаткам Мет (А). Схема (Б) демонстрирует положение остатков Мет на субъединице, стрелками показаны места образования сшивок(см.объяснения к рис.5А).

реагент находился на расстоянии 33 нуклеотидов от 3'-конца РНК и сравнительно слабо пришивался к белку . Расщепление по остаткам метионина и цистеина в этом случае не выявило определенного района ни в N- ни в С-концевой части р' -субъединицы, что было интерпретировано как отсутствие специфичных контактов между РНК и белком за пределами зоны плотного контакта.

Картирование сшивок РНК-белок в р-субъединице в зоне плотного контакта, -10 (ТЭКЗО), -14 (ТЭК34), -18 (ТЭК38), определило С-концевой район. В случае -10 (ТЭКЗО) и -14 (ТЭК34) это был район между метионином 1243 и метионином 1273, что следует из результатов расщепления по остаткам метионина (фрагменты - 1243, 1232, 1230) (Рис. 8А, дорожки 1-6). Соседний район, ближе к самому С-концу (Мет 1304 - Мет 1321), был определен в случае -8 (ТЭК52, проба «+45») и -18 (ТЭК38) (фрагменты - 1304, 1290, 1273) (Рис. 8А, дорожки 7-9).

Суммируя результаты по картированию сшивок РНК-белок, нами был сделан вывод, что РСС образован по крайней мере двумя сайтами, которые соответствуют амино-концевому домену р'-субъединицы (Мет 29 - Цис 58) и карбокси-концевому домену р-субъединицы (Мет 1243 - Мет 1304) (см. рис. 9А).

Глава 3. Структурно-функциональная модель ТЭК:

На основе данных, приведенных выше, следует, что N-концевой район Р'-субъединицы и С-концевой район р-субъединицы, взаимодействующие с РНК-продуктом, совпадают с районами, контактирующими с ДНК-дуплексом впереди от каталитического центра (Рис. 9А). Эти результаты устанавливают топологическую связь между основными структурными элементами ТЭК: РНК/ДНК-гибридом, РСС и ДСС. Поскольку одни и те же домены в р - и ß' -субъединице формируют как ДСС, так и РСС, мы предлагаем модель ТЭК, в которой эти элементы структурно и функционально интегрированы (Рис. 9Б). Другими словами, ДСС и РСС в нашей модели представляют собой единый структурный элемент РНК-полимеразы, определяющий два основных ее свойства в процессе элонгации: прочное связывание с ДНК и РНК и свободное продвижение вдоль ДНК. Одна сторона этого элемента служит для входа ДНК-матрицы и выхода РНК-продукта, другая прилегает к активному центру и ДНК-РНК-гибриду. Данная модель подразумевает, что траектория «выходящей» РНК оказывается антипараллельна «входящей» ДНК. Стерически, такая модель возможна с учетом неполного поворота спирали в области РНК/ДНК-гибрида (Nudler et al., 1997) и сильного изгиба молекулы ДНК в ТЭК (Rees et al.,1993) .

Рис. 9. Схема, суммирующая ДНК-белковые и РНК-белковые контакты в ТЭК (А) и гипотетическая пространственная модель «двойного скользящего замка» в ТЭК (Б). Черными полосками изображены [5- и р'-полипептиды с эволюционно консервативными районами, обозначенными латинскими буквами. Стрелками показаны ДНК-белковые и РНК-белковые контакты, картированные в данной работе. Каталитический центр изображен в виде кружка. Цифры соответствуют расстоянию от 3' -конца РНК.

С функцинальной точки зрения интеграция РСС и ДСС означает, что РНК-связывающий домен, находящийся сразу позади РНК/ДНК-гибрида, является частью ДНК-«замка» спереди от активного центра. Таким образом присутствие РНК в РСС может одновременно отвечать за удержание ДНК в ДСС, и наоборот - ДНК дуплекс в ДСС стабилизирует РНК в РСС. Модель постулирует, что вхождение РНК в РСС во время инициации транскрипции замыкает ДСС, стабилизируя тем самым ТЭК, тогда как образование вторичной структуры РНК (шпильки) в РСС приводит к обратному эффекту -терминации транскрипции.

Взаимозависимость РСС и ДСС, постулированная данной моделью, находится в соответствии с имеющимися на данный момент экспериментальными данными. Так, как уже отмечалось в главе 1, нарушение ДНК-дуплекса в пределах 9 п.о. сразу впереди от положения каталитического центра (в ДСС), приводит к дестабилизации ТЭК, т.е. диссоциации как ДНК, так и РНК из комплекса. С другой стороны, было показано, что образование РНК-шпильки за 7-9 нт. от каталитического центра (в РСС) также ведет к одновременной диссоциации ДНК и РНК из комплекса (Arndt and Chamberlin, 1991).

Глава 4. Генетические данные, свидетельствующие в пользу представленной модели ТЭК.

Данные, приведенные выше, указывают на ключевую роль Ы-концевого участка ß'-субъединицы в формировании ДСС и РСС. Этот район субъединицы содержит эволюционно консервативный мотив, состоящий из 4 остатков цистеина. Такой мотив известен во многих ДНК- и РНК-связывающих белках и носит название «цинковый палец» в связи со способностью координировать атом цинка.

Для выяснения функциональной роли «цинкового пальца» в формировании ДСС и РСС было проведено сравнение стабильности ТЭК, содержащих РНКП дикого типа с ТЭК, содержащими РНКП, у которой два остатка цистеина в составе «цинкового пальца» были заменены на серин. Все комплексы были иммобилизованы на Ni-содержащей смоле через Hls-якорь. Как видно из рисунка, в буфере с низкой ионной силой мутантный фермент при добавлении в реакцию всех нуклеозид-трифосфатов наряду с полноразмерным транскриптом образовывал более короткие РНК-продукты, что объясняется преждевременной диссоциацией ТЭК (Рис. 10, дорожка 7). В то же время 20-мерные комплексы, содержащие РНКП дикого типа, в тех же условиях количественно образовывали полноразмерный продукт (Рис.10, дорожка 3). Еще более яркие различия между комплексами, содержащими

1 ЦТ «и ис» мутант

<С1отмые + - — + -

НТФ — — + — - - +

отмывка — — - - - + -

ДНК *-П.Т.+- 20 1 2 3 4 5 6 7

Рис. 10. Сравнение стабильности ТЭК, содержащих РНК-полимеразу дикого типа (ДТ) и мутантную РНК-полимеразу («Цис»-мутант). «П.Т.» - полноразмерные транскрипты, полученные из стабильных 20-мерных элонгационных комплексов путем добавления в реакционную смесь всех 4-х нуклеозид-трифосфатов в концентрации 250 цМ каждый (дорожки 3 и 7). Сравнение стабильности ТЭК проводилось как в буфере с низкой ионной силой (дорожка 6), так и в буфере с высокой ионной силой (дорожки 2 и 5).

«дикую» и мутантную РНКП, наблюдались при увеличении ионной силы в реакционной смеси. Тогда как комплексы, содержащие РНКП дикого типа, оставались стабильными, «мутантные» комплексы полностью диссоциировали (Рис. 10, дорожки 2, 5). Таким образом, нарушение структуры «цинкового пальца» ß'-субъединицы приводит к потере основных биохимический свойств ТЭК - устойчивости к соли и процессивности. Эти результаты подтверждают данные по близкой пространственной локализации ДСС и РСС в РНКП и о неионном характере взаимодействия в этих сайтах.

Важно отметить, что пространственная близость амино-концевого домена ß'H карбокси-концевого домена ß-субъединицы, показанная в данной работе методами аффинной модификации, согласуется с недавними данными Северинова и соавторов. Гибридная субъединица, полученная путем соеденения N-конца ß'nC-KOH^ß способна функционировать в составе РНКП как in vitro так и in vivo (Северинов и др., 1997).

выводы

1. Биохимически охарактеризваны основные функцинапьные элементы РНК-полимеразы, отвечающие за стабильнсть и процессивнсть тройного элонгацинного комплекса: ДНК-связывающий сайт (ДСС) и РНК-связывающий сайт (РСС).

2. С помощью методов аффинной модификации и ограниченного протеолиза идентифицированы участки субъединиц РНК-полимеразы, вовлеченные в образование РСС: район между метионином 29 и цистеином 58 в Р'-субъединице и район между метионином 1243 и метионином 1304 в р-субъединице.

3. С помощью методов аффинной модификации и ограниченного протеолиза уточнена локализация района р--субъединицы РНК-полимеразы (Мет 29- Цис 58), участвующего в формировании ДСС.

4. Показано, что мотив «цинкового пальца» в амино-концевом районе Р'-субъединицы РНК-полимеразы необходим для поддержания стабильности и процессивности ТЭК.

5. Предложена структурно-функциональная модель ТЭК, основанная на пространственной интеграции ДСС и РСС, позволяющая объяснить механизмы регуляции транскрипции на стадии элонгации.

СПИСОК РАБОТ опубликованных автором по теме диссертации

1. Nudler Е., E.Avetissova, V.Markovtsov, A.Goldfarb (1996). Transcription processivity: protein-DNA interactions holding together the elongation complex. Science, 273, 211-217.

2. Nudler E„ I.Gusarov, E.Avetissova, V. Kozlov, A.Goldfarb (1998). Spatial organization of transcription elongation complex in Escherichia coli. Science, 281, 424-428.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Аветисова, Екатерина Ашотовна, Москва

iJ-

/ $

ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ГЕНЕТИКИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

АВЕТИСОВА Екатерина Ашотовна

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ТРОЙНОГО ЭЛОНГАЦИОННОГО КОМПЛЕКСА РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ

Е. coli

(Специальность 03.00.03. - Молекулярная биология)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук,

профессор В.Г. Никифоров

Москва -1998

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.......................................................................................6

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..........................................................9

1.1. Краткие сведения о транскрипционном цикле.............................9

1.1.1. Инициация..............................................................................9

1.1.2. Элонгация.............................................................................11

1.1.3. Терминация...........................................................................12

1.2. Традиционные представления о структуре тройного

комплекса и механизме элонгации транскрипции...................12

1.2.1. Величина участка ДНК, закрываемого молекулой РНК-полимеразы в элонгационном комплексе.................................14

1.2.2. Величина расплетенного участка ДНК и наличие РНК-ДНК гетеродуплекса в элонгационном комплексе............................15

1.2.3. Положение каталитического центра относительно расплетенного участка ДНК....................................................17

1.3. Природа стабильности ТЭК......................................................17

1.4. Механизм факторнезависимой терминации..............................18

1.4.1. Роль вторичной структуры РНК в терминации..........................19

1.4.2. Роль олиго-Т-последовательности в терминации......................23

1.4.3. Понятие о сайтах связывания РНК-продукта............................25

1.4.4. Реитеративный синтез РНК на промоторе. Стабилизация инициационных комплексов,

содержащих короткие РНК.....................................................26

1.4.5. ДНК-РНК гетеродуплес в ТЭК ................................................28

1.5. Генетические данные, свидетельствующие о роли доменов ß- и ß'- субъединиц РНКП в элонгации

1.5.1. Нарушение элонгационных и терминационных свойств

РНКП с помощью мутаций......................................................29

1.5.2. Роль «цинкового пальца» в связывании РНКП с нуклеиновым кислотами.........................................................30

1.5.3. Значение NADF-района для элонгации..................................31

1.6. Пространственная структура РНК-полимеразы E.coli.............32

Заключение...........................................................................34

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ...................................................36

2.1. Бактериальные штаммы.........................................................36

2.2. Плазмиды и олигонуклеотиды.................................................36

2.3. Питательные среды................................................................36

2.4. Компетентные клетки и трансформация бактерий....................37

2.5. Модифицирующие реагенты...................................................37

2.6. Выделение плазмидной ДНК...................................................38

2.7. Неденатурирующий электрофорез ДНК и выделение фрагментов ДНК из гелей ......................................................38

2.8. Денатурирующий электрофорез РНК и ДНК ............................39

2.9. Денатурирующий электрофорез белков ..................................39

2.10. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).....................................40

2.11. Выделение РНК-полимеразы..................................................41

2.12. Выделение РНК-полимеразы с заменой двух остатков

цистеина на серии в положениях 71 и 73 |3'-субъединицы........43

2.13. Определение активности РНК-полимеразы.............................43

2.14. Иммобилизованная транскрипция на никелевом сорбенте (реакция «шагания»)..............................................................44

2.15. Химические способы расщепления субъединиц РНК-полимеразы...................................................................46

2.15.1. Частичное расщепление по остаткам метионина.............46

2.15.2. Частичное и исчерпывающее расщепление

по остаткам цистеина....................................................47

2.15.3. Исчерпывающее расщепление по остаткам

метионина....................................................................47

2.16. Фотоаффинная модификация РНК-полимеразы с использованием ДНК с включенным в нее

остатком 5-йодо-2' -дезоксиуридина........................................48

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ......................................49

3.1. Определение ДНК- и РНК-связывающих сайтов

в РНКП.................................................................................49

3.1.1. Получение гомогенных ТЭК с использованием иммобилизованной РНКП......................................................49

3.1.2. Система анализа основных структурных компнентов РНК-полимеразы...................................................................49

3.2. Структурные особенности сайтов связывания

ДНК и РНК в элонгационном комплексе.................................54

3.2.1. Определение участков субъединиц РНКП, вовлеченных

в образование контактов с ДНК...............................................54

3.2.2. Определение участков субъединиц РНКП, вовлеченных

в образование контактов с РНК..............................................60

3.3. Структурно-функциональная модель ТЭК...............................66

3.4. Генетические данные, свидетельствующие в пользу представленной модели ТЭК..................................................68

ВЫВОДЫ........................................................................................71

ЛИТЕРАТУРА..................................................................................72

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ АВТОРОМ

ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ................................................................86

ВВЕДЕНИЕ

Удлинение РНК-транскрипта осуществляется в тройном

элонгационном комплексе (ТЭК), состоящем из молекулы РНК-полимеразы (РНКП), ДНК-матрицы и РНК-продукта. Во время элонгации РНКП обладает двумя на первый взгляд противоречивыми свойствами: она прочно связывает РНК-продукт и ДНК-матрицу и одновременно свободно скользит вдоль ДНК. Эти два свойства определяют исключительную процессивность РНКП, т.е. способность транскрибировать длинные участки ДНК, не теряя матрицу и транскрипт.

Важно отметить, что РНКП на стадии инициации, узнавая определенные последовательности промотора, ведет себя как сайт-специфичный ДНК-связывающий белок. При переходе от стадии инициации к элонгации РНКП должна претерпевать значительные изменения в природе взаимодействий с матрицей и РНК. Когда транскрипционный комплекс покидает промотор, он приобретает устойчивость к воздействию высоких концентраций моновалентных солей, что указывает на неионную природу взаимодействий на стадии элонгации.

Бактериальные и эукариотические РНКП представляют собой многосубъеденичные молекулы, значительный размер и сложная организация которых делают невозможным получение кристаллографической структуры с высоким разрешением. Использвание альтернативных методов для определения структурных элементов молекулы РНКП, взаимодействующих с нуклеиновыми кислотами, и выяснение их функциональной роли дало бы возможность понять природу стабильности и процессивности ТЭК и, возможно,

объяснить механизмы регуляции транскрипции на стадии элонгации.

Цель работы и задачи исследования.

Целью работы являлось определение структурных элементов РНКП из Escherichia coii, отвечающих за стабильность и процессивность ТЭК в процессе элонгации

В работе ставились следующие задачи: 1) биохимически охарактеризовать основные элементы РНКП, отвечающие за связывание нуклеиновых кислот в ТЭК (ДНК- и РНК-связывающие сайты); 2) с помощью методов аффинной модификации локализовать участки субъединиц РНКП, вовлеченные в образование ДНК- и РНК-связывающих сайтов.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Выявлены и охарактеризованы следующие структурно-функциональные элементы ТЭК: ДНК-связывающий сайт (ДСС), РНК/ДНК-гибрид-связывающий сайт (ГСС) и РНК-связывающий сайт (РСС). ДСС неионно взаимодействует с 9 п.о. ДНК-дуплекса сразу спереди от положения активного центра фермента. ГСС ионно взаимодействует с сегментом РНК/ДНК-гибрида длиной примерно в 6 п.о. от положения -5 до +1, считая от 3'-конца РНК. РСС образует неионные контакты с участком однонитевой РНК, длиной 9-11 нуклеотидов, сразу выходящей из РНК/ДНК-гибрида.

С помощью методов аффинной модификации и картирования РНК-белок и ДНК-белок сшивок были идентифицированы участки субъединиц РНКП, вовлеченные в образование каждого сайта. Показано, что амино-концевой район (З'-субъединицы (метионин 29 -

цистеин 58) и карбокси-концевой район р-субъединицы (метионин 1232 -метионин 1273) вовлечены в образование как РСС, так и ДСС. Карбокси-концевой район р-субъединицы (метионин 1232 - метионин 1273), вместе с тем, участвует в образовании ГСС. В состав ДСС также вовлечен амино-концевой район р-субъединицы (метионин 130 -метионин 239).

Результаты данной работы позволили предложить структурно-функциональную модель ТЭК, согласно которой совокупность взаимодействий между РНК, ДНК и белком в каждом из трех сайтов необходима и достаточна для полной стабильности и процессивности ТЭК. При этом, РСС и ДСС структурно и функционально интегрированы, т.е. нарушение одного из этих сайтов ведет к инактивации другого. Модель предполагает, что взаимодействия в ГСС являются сравнительно слабыми и достаточны лишь для поддержания целостности ТЭК в условиях низкой ионной силы.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения полученных результатов, их обсуждения и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 86 страницах машинописного текста и содержит 13 рисунков и 1 таблицу. Библиография включает в себя 93 названия.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Данный обзор посвящен анализу существующих в настоящее время моделей, описывающих структурные основы механизмов элонгации и терминации транскрипции.

1.1. Краткие сведения о транскрипционном цикле

Транскрипционный цикл разделяют на стадии инициации, элонгации и терминации (von Hippel et al., 1984). ДНК-зависимая РНКП Е. coli способна осуществлять все стадии транскрипционного цикла в отсутствие дополнительных белковых факторов. Полный (холо-) фермент РНКП состоит из ß'- и ß-субъединиц, двух а-субъединиц и одной из

нескольких а-субъединиц, придающих кор-ферменту (ß' ß аг) способность

специфически узнавать определенный набор промоторов. Кор-фермент может самостоятельно осуществлять элонгацию и терминацию транскрипции, однако он не способен специфически инициировать транскрипцию на промоторах.

1.1.1. Инициация.

Связывание холофермента с промотором представляет собой сложный процесс поиска промотора, образования "закрытого" промоторного комплекса и изомеризации в "открытый" комплекс (Krakow et al., 1976). Изомеризация сопровождается плавлением (открыванием) 10-12 пар оснований ДНК в районе точки инициации транскрипции (Siebenlist et al., 1980). Закрытый комплекс нестабилен и может быть

получен только при низкой температуре (Straney and Crothers, 1985). Повышение температуры приводит к изомеризации закрытого комплекса в открытый. Процесс изомеризации обратим, и при понижении температуры открытый комплекс снова переходит в закрытый. Оба комплекса распадаются при повышении ионной силы до 0,3 М. ДНК в открытом комплексе устойчива к конкурентному вытеснению полианионами гепарином и поли[с!А-сГП (Hinkle and Chamberlin, 1972).

При добавлении нуклеозидтрифосфатов РНКП в открытом комплексе способна начинать синтез РНК. Как правило, транскрипция начинается с пуринового нуклеотида, который связывается в инициаторном центре фермента. Связывание инициирующего нуклеотида может происходить и в отсутствие ДНК (Wu and Goldthwait, 1969). Связывание второго субстрата реакции, нуклеозидтрифосфата, комплементарного основанию в положении +2 матричной цепи ДНК, происходит в субстратсвязывающем центре фермента. После того как оба нуклеотидных субстрата связались с ферментом, происходит образование фосфодиэфирной связи РНК. Продуктом реакции являются динуклеотид РНК и неорганический пирофосфат. Реакция образования фосфодиэфирной связи обратима, т. к. добавление высоких концентраций пирофосфата приводит к процессивному укорочению цепей РНК с образованием свободных нуклеозидтрифосфатов (Rosovskaya et al., 1982). Инициация транскрипции может также осуществляться с ди-, три-, и тетрануклеотидов (как ДНК, так и РНК), комплементарных матричной цепи ДНК поблизости от точки начала транскрипции (Grachev et al., 1984).

Как правило, короткие транскрипты длиной 2-10 нуклеотидов непрочно связаны с комплексом фермент-ДНК (двойной комплекс) и могут диссоциировать из тройного комплекса (фермент-ДНК-РНК) без

диссоциации РНК-полимеразы с промотора. При этом каталитический центр фермента возвращается в исходное состояние (напротив положения +2 матричной цепи ДНК) и заново инициирует синтез РНК (Carpousis and Gralla, 1980). Такой циклический процесс синтеза коротких олигорибонуклеотидов получил название абортивной инициации (Johnston and McClure, 1976). В большинстве изученных случаев РНКП успевает совершить несколько десятков и даже сотен циклов абортивной инициации, прежде чем она перейдет к процессивной элонгации РНК-продукта.

1.1.2. Элонгация

По достижении РНК-транскриптом длины в 9-12 нуклеотидов в

транскрипционном комплексе происходит перестройка, в ходе которой а-

субъединица диссоциирует из комплекса (Hansen and McClure, 1980), а РНКП приобретает значительно более компактную, чем в инициационном комплексе, конформацию (Scmltz and Galas, 1979). При этом происходит стабилизация РНК в тройном комплексе. Такой элонгационный комплекс становится устойчивым к действию высоких концентраций соли и низкой температуры (Rhodes and Chamberlin, 1974).

Во время элонгации синтез РНК осуществляется неравномерно: на определенных участках фермент резко снижает скорость синтеза РНК. Природа таких пауз не вполне ясна. Иногда места пауз совпадают с участками выраженной вторичной структуры в РНК или ДНК (Farnham and Platt, 1981). Некоторые паузы вызваны повышением кажущегося значения константы Михаэлиса для нуклеозидтрифосфатов. Такие паузы могут быть преодолены увеличением концентрации субстратов

(Kassavetis and Chamberlin, 1981).

1.1.3. Терминация.

Несмотря на очень высокую стабильность, элонгационный комплекс на определенных участках ДНК (терминаторах) спонтанно распадается на составные части. Так называемая факторнезависимая терминация связана с образованием вторичной структуры РНК (шпильки) при транскрипции некоторых палиндромных последовательностей ДНК. За палиндромной последовательностью обязательно следуют несколько А-Т пар подряд (олиго-Т), где и происходит терминация.

Другой тип терминационных сигналов требует наличия специальных белковых факторов. Наиболее изученным является p-фактор, ответсвенный за функционирование большинства теминаторов E.coli (Roberts, 1969; Platt and Richardson, 1992). Механизмы факторзависимой терминации непонятны. По-видимому, акт терминации вызывается взаимодействием между элонгационным комплексом и фактором терминации.

1.2. Традиционные представления о структуре тройного комплекса и механизме элонгации транскрипции.

Господствующая до настоящего времени модель структуры интермедиатов элонгации РНК-цепи бактериальными РНК-полимеразами происходит главным образом из работ Гампера и Херста, фон Хиппеля и Платта (Gamper and Hearst, 1982; Yager and von Hippel, 1987, 1991). Согласно модели Херста-фон Хиппеля, элонгирующий

фермент РНКП закрывает ~30 п.н. ДНК-матрицы, при этом 18 п.н. в ДНК-дуплексе расплетены. Растущий конец РНК комплементарно спарен с матричной цепью ДНК, формируя ~12 п.н. ДНК-РНК гибридный дуплекс, который определяет стабильность тройного комплекса (Рис.1). Исключая возможность конформационных изменений в элонгационном комплексе, авторы считают, что присоединение каждого последующего нукпеотида к З'-концу РНК сопровождается монотонным движением фермента вдоль ДНК.

Т. strand*^ N.T. strand

Рис.1. Структура тройного элонгационного комплекса (Yager and von Hippel, 1987). Пояснения даны в тексте. Прямоугольник - РНК-полимераза. Кружок - З'-конец РНК-транскрипта.

1.2.1. Величина участка ДНК, закрываемого молекулой РНК-полимеразы в элонгационном комплексе.

Согласно данным ДНК-азного и экзонуклеазного футпринтов некоторых перечисленных в таблице элонгационных комплексов, величина защищаемого РНК-полимеразой участка должна быть ~30 нуклеотидов.

Таблица 1. Результаты анализа зоны защиты ДНК в тройных комплексах.

промотор метод комплекс защищаемый автор

участок

Т7ДНК ДНКаза! гетерогенная ~30 Roher and Zillig, 1977

популяция

lac UV5 ДНКаза I 16-мер от -5 до + 25* Carpousis & Gralla, 85

lac UV5 ДНКаза I 11 -мер от -15 до + 20 Sraney & Crothers, 85 lac ДНКаза! 29-мер от+7 до+37(+49) Shi et al., 1988

Т7А1 экзонуклеаза III 11-мер от-3 до+27 Metzger et al., 89

Т7А1 экзонуклеаза III 20-мер от +7 до +29 Metzger et al., 89

* Значения в таблице выражены относительно +1-точки старта транскрипции.

1.2.2. Величина расплетенного участка ДНК и наличие РНК-ДНК гетеродуплекса в элонгационном комплексе.

Впервые гипотеза о существовании протяженного РНК-ДНК гибридного дуплекса была высказана на основе данных РНК-азных футпринтов тройных комплексов, полученных на поли[с!А-с1Т]-матрице. Защита фрагментов РНК длиной ~12 оснований в этих экспериментах была интерпретирована как результат РНК-ДНК и (или) РНК-белковых взаимодействий (Kumar and Krakow, 1975).

Мельникова и сотр. (Melnikova et al., 1978) использовали модифицирующий агент - диметилсульфат, который метилирует седьмое положение гуанина и первое положение аденина, если последний не находится в ДНК-дуплексе. Нуклеоти�