Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Транкрипрасщепляющая активность РНК-полимеразы Escherichia coli

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Транкрипрасщепляющая активность РНК-полимеразы Escherichia coli"

OA

г

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

На правах рукописи

ОРЛОВА Марианна Николаевна

ТРАНСКРИПТРАСЩЕПЛЯЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ Escherichia coli

03.00.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1995

Работа выполнена в Исследовательском институте общественного здоровья, Нью-Йорк, США, и в Государственном институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов, Москва, Россия.

Научный руководитель:

Официальные опоненты:

Ведущая организация:

доктор биологических наук, профессор С. В. Машко; кандидат биологических наук С. И. Борухов

доктор биологических наук, профессор Г. Б. Завильгельский; кандидат биологических наук Л. И. Патрушев

Институт молекулярной генетики РАН

Я

Защита состоится 23 мая 1995 года в ..: часов на заседании специализированного совета |2.01при Государственном научно-

исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 113545, Москва, 1-й Дорожный пр., д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

апреле

Автореферат разослан »....»....../.............1Э95 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

В. И. Щербакова

<

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одной из наиболее важных задач молекулярной биологии является изучение механизмов экспрессии генетической информации. Ключевой этап этого процесса - транскрипция - заключается в комплементарном синтезе РНК-транскрипта на ДНК-матрице. Бактериальный транскрипционный цикл удается целиком осуществить в простой бесклеточной системе, состоящей из ДНК-матрицы, очищенной РНК-полимеразы и рибонуклеотидов, без каких бы то ни было дополнительных белковых факторов. Тем не менее, РНК-полимераза не является единственным белком, участвующим в транскрипции in vivo. В ней также участвуют разнообразные регуляторные и вспомогательные белки, изучение которых важно для детального понимания процесса транскрипции в живой клетке. В процессе удлиннения транскрипта РНК-полимераза движется по ДНК-матрице с непостоянной скоростью. В некоторых участках матрицы длительные задержки в продвижении РНК-полимеразы, так называемые паузы, наблюдаются даже при оптимальных концентрациях субстратов. РНК-полимераза может также попадать в элонгационные "тупики" - состояние, при котором, несмотря на целостность тройного зпонгационного комплеса (РНК-полимераза/ДНК-матрица/РНК-транскрипт), полностью блокируется нормальный процесс удлиннения РНК. Гомологичные бактериальные белки GreA и GreB, недавно идентифицированные у Escherichia coli (Borukhovet al,, 1993), представляют собой новый класс транскрипционных факторов, способных предотвращать паузирование и образование "тупиковых" комплексов, а также уменьшать число ошибок при синтезе РНК (Erie et al., 1993). Действие этих белков состоит в индукции реакции расщепления РНК-транскрипта, обнаруженной ранее в элонгационных комплексах РНК-полимеразы Е. coli (Surratt et al., 1991). Эта реакция заключается в отщеплении и диссоциации З'-концевого фрагмента РНК длинной в 2 -18 нуклеотипов из элонгационного комплекса с последующим возобновлением транскрипции с вновь образованного З'-конца РНК-транскрипта, что дает РНК-полимеразе повторную возможность преодолеть тупик или паузу, а также встроить в РНК правильный нуклеотид. Биологическая важность данного типа реакции отражена в ее эволюционной консервативности: недавние работы показали наличие транскриптрасщепляющей активности в элонгационных комплексах вирусной РНК-полимеразы (Hagler et al., 1993) и эукариотических РНК-полимераз II и III (Reines et al., 1992; Izban et al., 1992; Whitehall et al., 1994). Таким образом, изучение транскриптрасщепляющей активности в транскрипционных

комплексах РНК-полимеразы Е. coli представляется актуальным.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось детальное изучение структурно-функциональных свойств транскрипционных факторов GreA и GreB и индуцируемой ими транскриптрасщепляющей активности в тройных элонгационных комплексах (ТЭК) РНК-полимеразы E.coli.

В работе ставились следующие задачи. 1) Сконструировать мутантный greA' greB* штамм Е. coli. Исследовать клеточный лизат этого штамма на присутствие дополнительных Gre-подобных факторов. В случав отсутствия таковых - исследовать РНК-полимеразу, выделенную из greA" greB" мутанта, на наличие собственной транскриптрасщепляющей активности. 2) Сверхпроду-цировать и очистить белки GreA и GreB, детально охарактеризовать их физико-химические свойства. 3) Методом фотохимического сшивания с использованием фотоактивируемых аналогов нуклеотидтрифосфатов продемонстрировать связывание GreA и GreB белков с РНК-транскриптом в тройном элонгационном комплексе. 4) Сконструировать серию реципрокных гибридов между генами greA и greB и сверхпродуцировать кодируемые ими химерные белки. Исследовав последние на тип индуцируемой транскриптрасщепляющей активности, определить, какие участки аминокислотной последовательности GreA и GreB отвечают за их функциональную специфичность. 5) Провести крупномасштабное выделение белка GreA как дикого типа, так и модифицированного Se-Met, для последующего рентгеноструктурного анализа.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые показано, что в составе ТЭК РНК-полимераза Е. coli обладает, помимо полимеризующей и пирофосфоролитической активностей, третьей - транскриптрасщепляющей (эндонуклеазной) - активностью. Эта активность может быть индуцирована в отсутствие GreA и GreB факторов слабощелочными pH. Впервые детально охарактеризованы физико-химические и структурные свойства GreA и GreB, в том числе показано, что GreA и GreB контактируют с З'-концом РНК-транскрипта в составе ТЭК, и идентифицированы участки полипептидной последовательности GreA и GreB, участвующие в этом контакте. Также установлено, что функциональная специфичность GreA и GreB определяется их N-концевыми доменами. Создан штамм-продуцент и осуществлено крупномасштабное выделение белка GreA как дикого типа, так и модифицированного Se-Met, что позволило провести рентгеноструктурный анализ GreA.

Поскольку реакция расщепления транскрипта наблюдается в процессе транскрипции как у прокариот, так и у эукариот, полученные в данной работе результаты служат пониманию базисных аспектов транскрипции.

Апробация работы. Основные результаты работы представлены на Международной конференции FASEB "Регуляция инициации транскрипции у прокариот" (1993, США), на Международном симпозиуме "Молекулярная и клеточная биология" (1994, Кистоун, США), а также на семинаре Отдела биотехнологии ГНИИгенетика.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 1. Собственная транскриптрасщепляющая активность РНК-полимеразы Е. coli

В данной работе все тройные элонгационные комплексы (ТЭК) были получены на промоторе rrnB Р1 Е. coli с начальной транскрибируемой последовательностью C+iA+2C+3C+4A+5C+6U+7G+8A+9C+ioA+iiC+12G+13.--и т. д. ТЭК, содержащие РНК-транскрипты различной длины, получали добавлением в реакцию соответствующих указанной последовательности (комбинаций) нуклеотидов. Сокращением N-ТЭК обозначены комплексы, содержащие транскрипт размером N нуклеотидов (например, 6-ТЭК, 7-ТЭК ит. д.).

1.1. Получение мутантного greA" дгеВ' штамма Е. coli. Анализ грубого клеточного лизата этого штамма на антитупиковую и транскриптрасщеплпю-щую активности

В искусственно остановленных элонгационных комплексах, полученных in vitro с использованием как высокоочищенной, так и реконституированной РНК-полимеразы Е. coli, наблюдалась слабая транскриптрасщепляющая активность (Borukhov et al., 1993). Было не ясно, обусловлена пи эта реакция действием Gre факторов или Gre-подобных факторов, содержащихся в препаратах полимераз в следовых количествах, или РНК-полимераза в комплексе сама катализирует расщепление РНК-транскрипта.

Чтобы исключить возможность примеси Gre факторов в препаратах РНК-полимеразы, а также исследовать предполагаемую собственную транскрипт-расщепляющую активность РНК-полимеразы, мы сконструировали мутантный greA" дгеВ" штамм Е. coli, в котором ген дгеВ был полностью делетирован из хромосомы, а ген greA был разрушен инсерцией гена канамициновой устойчивости.

Грубый клеточный лизат этого мутантного штамма тестировался на

антитупиковую и транскриптрасщепляющую активности (рис. 1). В первой части эксперимента (дор. 1-5) очищенный гель-фильтрацией исходный 6-ТЭК (СрАрСрСрАрС) (здесь и далее в тексте радиоактивные фосфаты выделены плотным шрифтом, а на рисунках помечены звёздочками), полученный с использованием реконституированной РНК-полимеразы (дор.1), был элонгирован добавлением всех четырех нуклеотидов с образованием полноразмерного транскрипта и тупиковых комплексов в позициях +12, +13 (дор. 2). В присутствии вгеА (дор. 3) и вгеВ (дор. 4) тупиковые комплексы не образовывались и появлялись низкомолекулярные продукты реакции расщепления. Добавление лизата дгеА' дгеВ~ клеток к подобному эффекту не приводило (дор. 5).

Полноразмерный_.

транскрипт

Тупиковые , комплексы \ «*

№ CpApCpCpApCpUpGpA

СрАрСрСрАрС

* * »

* <— pCpUpCpA Продукты ,

расщепления * —pGpA

I—► ФФ

1234 56789

+ + + + • - - NTP

* п - - 1/10 £ О 1/10 - - Кл. лизат

ю - + - ф - + - GreA

• - + - - - + GreB

Рис. 1. Анализ грубого клеточного лизата дгеА" дгеВ" штамма Е. coli на антитупиковую и транскриптрасщепляющую активность. Реакции проводились в стандартных условиях в течение 15 мин. Продукты реакций разделялись в 23% ПААГ с 8М мочевиной и детектировались авторадиографически.

I I

Транскриптрасщеплпющая активность (рис. 1, дор. 6-9) тестировалась на очищенном 9-ТЭК (CpApCpCpApCpUpGpA) (дор. 6). Добавление клеточного лизата greA" greB" штамма не приводило к расщеплению РНК-транскрипта (дор. 7), в то время как очищенные GreA и GreB факторы индуцировали отщепление З'-концевого динуклеотида (дор. 8) или тетрануклеотида (дор. 9), соответственно. Лизат клеток мутантного штамма в этом эксперименте разводился 1:10, в то время как клеточный лизат штамма дикого типа проявлял антитупиковую и расщепляющую активности в различном диапазоне разведений - от 1:10 до 1:10,000 (Borukhovet al., 1993). Таким образом, мы сделали вывод, что в растворимой фазе грубого клеточного лизата greA* greB" штамма нет детектируемой антитупиковой и транскриптрасщепляющей активности.

1.2. Обнаружение собственной транскриптрасщепляющей активности РНК-полимеразы Е. coli

В дальнейших экспериментах для получения элонгационных комплексов использовалась РНК-полимераза, выделенная из мутантного greA" greB" штамма. Как видно из следующего эксперимента (рис. 2, дор. 1-4), при длительной инкубации 9-ТЭК (CpApCpCpApCpUpGpA) в стандартных условиях происходит частичное расщепление РНК-транскрипта как по типу GreA, так и по типу GreB (с высвобождением димера и тетрамера, соответственно). Добавление 10-, 100- и 1000-кратного молярного избытка РНК-полимеразы к комплексу не приводило к усилению расщепления (дор. 5-7, 8-10 и 11-13 соответственно). Это означает, что препарат РНК-полимеразы, выделенной из мутантного greA* greB* штамма, не содержит факторов, способных индуцировать расщепление транскрипта. Более того, инкубация радиоактивно меченного 9-ТЭК в присутствии 100-кратного молярного избытка немеченного комплекса также не приводила к усилению расщепления транскрипта (данные не приведены), что исключает возможность того, что наблюдаемая реакция происходит за счет небольшого количества примесного трансдействующего Gre-подобного фактора, находящегося в препарате очищенной РНК-полимеразы в "латентной" форме и активируемого только в составе тройного элонгационного комплекса.

Мы сделали вывод, что расщепление транскрипта - результат собственной активности РНК-полимеразы, находящейся в тройном комплексе.

I I

Минуты 0 5 15 40 5 15 40 5 15 40 5 15 40

Комплекс: РНКпол 1:1 1:10 1:100 1:1000

Рис. 2. Собственная транскриптрасщепляющая активность РНК-полимеразы выделенной из дгеА" дгеВ" штамма Е.соИ. Продукты реакций разделялись в 23% ПААГ с 8М мочевиной и детектировались авторадиографически.

1.3. Щелочные рН индуцируют собственную транскриптрасщепляющую активность РНК полимеразы

Вывод о наличии у РНК-полимеразы Е. соГ| собственной транскрипт-расщепляющей активности был подтвержден тем, что расщепление транскрипта в отсутствие факторов может быть стимулированно слабощелочными рН. Известно, что энзиматическая активность РНК-поли-меразы вырьирует от 100% до 13% в диапазоне от рНб.Ь до рНЮ.О, с оптимумом рН7.8 - 8.2 (СЬатЬегГш е! а1., 1962). Мы обнаружили, что слабощелочной рН сильно ускоряет реакцию расщепления транскрипта в составе ТЭК.

1 3.1. Щелочные рН индуцируют расщепление транскрипта РНК-полимеразой как по типу СгеА, так и по типу вгеВ

Как видно из следующих экспериментов, инкубация ТЭК при рН >8 приводит к усилению расщепления транскрипта в 7-ТЭК (рис. ЗА, дор. 6-10) и 9-ТЭК (рис. ЗБ, дор. 5-9).

А

СрАрСрСрАрСрЧ СрАрСрСрА

pCpU—

1 2 3 4 5 6 ? 8 9 10 11 12 13

UTP * О + + + + + + + + + +

pH 6.0 6.5 7.0 7.5 ао S5 9.0 9.5 110 7.5 7.5 (0

Gre А 1- + -

Gre В +

®®SCS®W» — м—CpApCpCpApCpUpGpA

1» «р М—CpUpGpA • «WM»""»« pGpA

' 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

¥ 6.0 7.0 7.5 8.0 а: 9.0 3.5 100 7.5 7.5 рн

О 1- + - Gre А

о> + Gre В

Рис. 3. Собственная транскриптрасщепляющая активность РНК-полимеразы Е. coli индуцируется инкубацией ТЭК при слабощелочных pH. (А) рН-индуцированное расщепление РНК-транскрипта в 7-ТЭК. (Б) рН-индуцированное расщепление РНК-транскрипта в 9-ТЭК. Реакции проводились в течение 15 мин. Продукты реакций разделялись в 23% ПААГ с 8М мочевиной и детектировались авторадиографически.

-СрАрСрСрАрС

При значениях рН, оптимальных для полимеризационной реакции (рН7.5) и пирофосфоролиза (рН6.5), расщепление транскрипта незначительно (рис. ЗА, дор. 2-5, и рис. ЗЬ, дор. 2-4). Расщепление по типу ОгеА, при котором отщепляется динуклеотид с З'-конца РНК-транскрипта, преобладает в диапазоне от рН8.0 до рН9.5 (рис. ЗБ, дор. 5-8). Расщепление по типу вгеВ -отщепление тетрануклеотида с З'-конца РНК-транскрипта - начинает усиливаться при рНЮ.О (рис. ЗБ, дор. 9).

1.3.2. Щелочные рН оказывают влияние на тупиковые злонгационные комплексы

Мы проверили влияние рН на тупиковые элонгационные комплексы, образующиеся в ходе транскрипции в позициях +12, +13. Ранее было показано, что ОгеВ фактор способен разрешать уже образованные тупиковые комплексы, индуцируя расщепление РНК-транскрипта в таких комплексах (ВогикГюу е! а1., 1993). вгеА отличается от вгеВ те-л, что предотвращает образование "тупиков", только если его добавить в сяюнгационную реакцию до момента достижения РНК-полимеразой тупиковых позиций.

Мы исследовали образсиание тупиковых кс.лплохсов в ходе элонгационной реакции при рН от 6.0 до 10.0 (рис. 4). В каждой реакции исходный 7-ТЭК (СрАрСрСрАрСри) (дор. 2) инкубировался либ.-. только в транскрипционном буфере с определенным рН (нечетные дорожки), либо в таком же буфере, но в присутствии всех четырех нуклеотидов (четные дорожки). Накопление 5-ТЭК (СрАрСрСрА) в нечетных дорожках и его количественное исчезновение при добавлении нуклеотидов свидетельствует о тем, чго при рН>8 реакция расщепления ускоряется.

В следующем эксперименте исследовался зффолт щелочных рН на уже образовавшиеся тупиковые комплексы. Как видно из результатов (рис. 5), инкубация тупиковых комплексов при рНЭ.О и рНЮ.О приводила к расщеплению транскриптов +12 и +13 до пентамера СрАрСрСрА, который далее успешно удлиннялся до полноразмерного транскрипта в присутствии нуклеотидов (дор. 9-12). Следовательно, слабощелочные рН индуцируют антитупиковую активность РНК-полимеразы подобно вгеА и вгеВ факторам.

Полноразмерный транскрипт _

Тупиковые комплексы

Рис. 4. Влияние рН на образование тупиковых комплексов. Продукты реакций разделялись в 23% ПААГ с 8М мочевиной и детектировались авторадиографически.

СрЛрСрСрАрСри -СрАрСрСрАрС-

© ' •

. СрАрСрСрА

■»•-- такамаву рсри 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

I 6-ТЭК | * о н 6.0 7.0 8.0 | 9.0 10.0 рН

- + - + - | + I - + - + ИТР

Полноразмерный транскрипт ~

Тупиковые / комплексы

Л

«5» ла» ■ • г

Сггэ»«»^

СрАрСрСрАрС-

О

Рис. 5. Влияние рН на уже образованные тупиковые комплексы. Продукты реакций разделялись в 23% ПААГ с 8М мочевиной и детектировались авторадиографически.

— СрАрСрСрА

1_2 3 4 5 6 7 Ь 9 10 11 12 13 14 15 16

1) 6 0 7 0 8 0 9.0 10.0 7 0 7 0 рН

X* п" Б О а - + - - + - + - + - + - + Г1ТР

о>7 Хш X О + + йгеВ

X + + - - ЭгеА

1.3.3. Предполагаемый механизм транскриптрасщепляющей активности РНК-полимеразы Е. coli

Зависимость расщепления 7-ТК от pH представляет собой нелинейную кривую (рис. 6) с резким возрастанием начальной скорости реакции расщепления в диапазоне рН8.0- рНЭ.О. Такой вид кривой указывает на то, что расщепление транскрипта скорее всего зависит от ионизационного состояния аминокислотных остатков (возможно Lys, His или Cys с рК8.6) в субъединицах РНК-полимеразы. Таким образом, мы доказали, что, помимо полимеризующей и пирофосфоролитической активностей, РНК-полимераза Е. coli обладает третьей - транскриптрасщепляющей (эндонуклеазной) - активностью. GreA и GreB факторы, как мы предполагаем, лишь индуцируют собственную активность РНК-полимеразы.

РН

Рис. 6. pH-зависимость собственной транскриптрасщепляющей активности РНК-полимеразы Е. coli. На графике приведена зависимость накопления динуклеотида pCpU, образующегося в результате рН-индуцированного расщепления 7-ТЭК (CpApCpCpApCpU).

Глава 2. Физико-химические свойства транскрипционных факторов GreA и Greß, их пгпимспэйствие с РНК-полимеразой и с тройными элонгаиионными комплексами

2.1. Получение штаммов-продуцентов GroA и GroB

Для детального изучения физико-химических и структурно-функциональных свойств GreA и GrcB мы сконструировали штаммы Е. coli, сверхпродуцирующие эти белки. Были сконструированы плазмиды рМОА и рМ01.4, в которых экспрессия greA и greB генов, соответственно, находится под контролем trc промотора, индуцируемого IPTG. Индукция клеток, содержащих эти плазмиды, приводила к накоплению GreA и GreB в количестве 6-10% от суммарного растворимого клеточного белка (данные не приведены).

Очищенные препараты GreA и GreB не содержали нуклеазной активности и обладали такой же транскриптрасщеппяющей активностью, как и эндогенные факторы, выделенные непосредственно из штамма Е. coli MRE600 (дикий тип).

2.2. Физико-химические свойства GreA и GreB

Мы охарактеризовали некоторые физико-химические свойства GreA и GreB, которые суммированы в табл. 1. Как видно из этой таблицы, факторы сильно различаются по некоторым свойствам - изоэлектрической точке, термостабильности, электрофоретической подвижности и связыванию с РНК-полимеразой и ТЭК. Так, с помощью высокоэффективной гель-фильтрации и аффинной хроматографии мы установили, что GreA связывается с кор- и холо-РНК-полимеразой в 300 раз слабее, чем GreB. Ранее было показано, что GreB эффективно "расщепляет" тупиковые комплексы, содержащие транскрипты длиной от 12 до 1С нуклеотидсв. GreA на ^аких комплексах абсолютно неактивен. Мы также наблюдали, что GreA "расщепляет" 7-ТЭК в 10 раз эффективнее, чем 9-ТЭК, в то время как GreB демонстрирует противоположный эффект (неопбликованные данные). Кроме того, 5-ТЗК, который образуется в результате Gre-индуцированного расщепления 7-ТЭК и 9-ТЭК. устойчив к действию обоих факторов. При этом константа связывания обоих факторов с 5-, 6-, 7-, 9- и 12-ТЭК одинакова и не зависит от длины трпнскрипта и от способности факторов индуцировать реакцию расщепления. Тлким образом, связывание Gre-факторов с ТЭК само по себе не достаточно цпя индукции реакции расщепления транскрипта, что косвенно поддерживает M.nijv гипотезу о центральной роли самой РНК-полимеразы в реакции

расщепления.

Таблица 1. Физико-химические свойства вгеА и СгеВ.

Факторы Количество аминокислот Изо-элек-три-ческая точка (р!) Расчетная молекулярная масса, кДа Кажущаяся молекулярная масса, к.Да Термостабильность, (70°С, 20 мин.), % активности Кажущаяся константа связывания (Кв), М"1

Гель-фильтра-ция ПААГ с ДДС-№ Кор (о2р|3) Холофер-мент (агРР'а) * ТЭК

Эге А 158 4.56 17.6 25 18.5 90% 104 2х104 Зх 103

вгеВ 158 8.42 18.5 20 16.5 <1% 3x10® 6х106 106

* Кажущаяся константа связывания с 5-, 6-, 7-, 9- и 12-ТЭК.

Глава 3. Структурно-функциональные свойства транскрипционных факторов СгеА и вгеВ

з.1. Фотохимическое сшивание вгеА и йгеВ с РНК-транскриптом в ТЭК

Учитывая тот факт, что вге факторы индуцируют отщепление фрагмента РНК-транскрипта вблизи его З'-конца, мы предположили, что вгеА и ЭгеВ могут взаимодействать с РНК-транскриптом в составе ТЭК. Для проверки этого предположения мы использовали метод фотохимического сшивания. Эксперимент заключался в следующем. В процессе элонгации в З'-конец радиоактивно меченного РНК-транскрипта включался фотоактивируемый аналог нуклеозидтрифосфата. К такому комплексу добавлялись вгеА или вгеВ

и, после облучения ультрафиолетом, фотохимически сшитые с РНК-транскриптом белки анализировались путем электрофореза в денатурирующем ПААГ с ДДС-Ыа (рис. 7Б, дор. 4-6). В качестве фотоактивируемого аналога нуклеозидтрифосфата мы использовали 8-Мз-АТР, в котором

фотоактивируемая группа находится непосредственно в основании.

Исходный радиоактивный 6-ТЭК (СрАрСрСрАрС), синтезированный РНК-полимеразой на промоторе rrnB Р1 в присутствии инициирующего динуклеотида СрА , а также АТР и [а-32р]стр, очищался гель-фильтрацией (рис. 7А, дор. 1) и элонгировался до 7-, 8- и 9-ТЭК добавлением соответствующих последовательности промотора нуклеотидов (рис. 7А, дор. 2,3 и 4, соответственно). Добавление к исходному 6-ТЭК смеси UTP, GTP и 8-N3-ATP приводило к образованию модифицированного комплекса, называемого далее 9А* (рис. 7А, дор. 5). Подвижность модифицированного транскрипта на денатурирующем ПААГ немного отличается от немодифицированного за счет включенного фотоактифируемого аналога АТР. Очищенный гель-фильтрацией комплекс 9А* облучали ультрафиолетом в отсутствии и в присутствии Gre факторов (GreA или GreB добавлялись в 20-кратном молярном избытке по отношению к РНК-полимеразе). Продукты реакции анализировались с помощью электрофореза в градиентном (4%-20%) ПААГ с ДДС-Na. Результаты этого эксперимента приведены на рис. 7Б.

А Б

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6

9А—t* ^ «-»-4—9А*

8G—► ' "" Р,Р-—► «=»

7 U —► g ^ „, ,

6С—о

GreA GreB/

Рис. 7. Фотохимическое сшивание вгеА и йгеВ с РНК-транскриптом комплекса 9А*, (А) Авторадиограмма денатурирующего 23% ПААГ с 8М мочевиной. (Б) 14% ПААГ с ДДС-Ыа, окрашенный кумасси голубым (дор. 1-4). Авторадиограмма 14% ПААГ с ДДС-Ыа (дор. 5-7).

В отсутствии Gre факторов ультрафиолетовое облучение комплекса 9А* приводило к появлению радиоактивной полосы, соответствующей фотохимически сшитой с радиоактивным РНК-транскриптом ß'-субъединицы РНК-полимеразы (рис. 7Б, дор. 4). Добавление GreA или GreB к 9А* и последующее ультрафиолетофое облучение приводило к появлению полос, соответствующих подвижности GreA и GreB факторов (дор. 5 и 6, соответственно). Все реакции проводились в присутствии 100-кратного молярного избытка БСА и лизоцима, с которыми фотохимического сшивания не наблюдалось, что указывает на высокую специфичность сшивания.

Таким образом, из полученных данных следует, что GreA и GreB контактируют с З'-концом РНК-транскрипта.

3.2. Картирование участков GreA и GreB, контактирующих с З'-концевым нуклеотидом РНК

Для локализации участков полипептидной последовательности GreA и GreB, фотохимически сшитых с З'-концевым нуклеотидом радиоактивно меченной РНК в комплексе 9А*, мы использовали специфическую фрагментацию полипептидов химическими и ферментативными методами. Логика картирования схематически приведена на рис. 8.

3.2.1. Картирование GreA

Фотохимически сшитый комплекс GreA-9A*PHK электроэлюировался из денатурирующего 14% ПААГ с ДДС-Na и подвергался химическому расщеплению по остаткам Cys с использованием 2-нитро-5-тиоцианобензойной кислоты (НТЦБ) (рис. 8А). Поскольку GreA содержит только один Cys в положении 58, ожидаемые продукты расщепления - N-концевой и С-концевой пептиды с молекулярной массой 6.5 кДа и 11.1 кДа, соответственно (без учета массы РНК-транскрипта). Из авторадиограммы 16% ПААГ с ДДС-Na было определено, что в результате расщепления образуется продукт с молекулярной массой 7.5 кДа, соответствующий N-концевому фрагменту GreA (Met 1 - Phe 57) с пришитым к нему РНК-транскриптом.

Для дальнейшего картирования мы использовали ферментативное » расщепление GreA по остаткам Asp эндопротеазой Asp-N и последующую аффинную хроматографию на тиол-специфичном сорбенте. Результирующий радиоактивный продукт, элюированный с тиол-активированного сорбента, имел молекулярную массу 3.7 кДа. Учитывая вес РНК-транскрипта, мы заключили, что размер искомого пептида составляет 2.7 кДа. Это соответствует Суэ-содержащему фрагменту Asp 41 - Lys 63.

1 20 40 60 80 100 120 140 150

Суз| (НТЦБ)

I Г ' I

1. Авр-И^

.....♦

2.Тиол-активированная Сефароза 4В

! ' Г"1

41 57

I п —

-т—1

Дер*!

РИе57

01_КЕЫАЕУНААРЕйСЮр

1 20 40 60 80 100 120 140 153

68 4

Сув{ (НТЦБ)

I.............Г

3

47

Агд-С 4

Л_1!_I_1

Абр^7 АгдбЗ

оуаункквишон(лж

Рис. 8. Схема картирования участков йгеА (А) и йгеВ (Б), контактирующих с З'-концом РНК-транскрипта.

Таким образом, сайт фотохимического сшивания GreA с З'-концом РНК-транскрипта заключён в пределах участка Asp 41- Phe 57.

3.2.2. Картирование GreB

GreB, фотохимически сшитый с радиоактивным РHК-транскриптом комплекса 9А*, элюировали из ПААГ с ДДС-Na и подвергали химической деградации по остаткам Cys. GreB содержит только один Cys в положении 68, следовательно, без учета массы РНК, ожидаемые продукты расщепления - N-концевой пептид с массой 7.5 кДа и С-концевой пептид с массой 10.2 кДа. Мы определили, что расщепление исходного комплекса GreB-9A*PHK приводило к появлению на авторадиограмме ПААГ радиоактивной полосы с молекулярной массой 9 кДа. С учетом молекулярной массы пришитого РНК-транскрипта продукт расщепления соответствует N-концевому фрагменту GreB: Met 1- Lys 67.

.На следующем этапе картироёания мы использовали ограниченное ферментативное расщепление эндопротеазой Asp-N (по остаткам Asp). В неденатурирующих условиях свободный GreB количественно расщеплялся на два полипептидных фрагмента Met 1- Ala 46 и Asp 47- Pro 158, что было определено сиквенированием N-концевых аминокислотных последовательностей этих фрагментов (данные не приведены). Расщепление комплекса GreB-9A*PHK в тех же условиях приводило к появлению на авторадиограмме 16% ПААГ с ДДС-Na радиоактивной полосы с молекулярной массой 16 кДа, соответствующей С-концевому фрагменту GreB (Asp 47- Pro 158) с пришитым к нему РНК-транскриптом. Далее этот фрагмент элюировали из геля и подвергали глубокому расщеплению эндопротеазой Arg-C (по остаткам Arg). В результате расщепления образуется продукт с молекулярной массой 3.5 кДа, соответствующий фрагменту Asp 47- Arg 63 с пришитым к нему РНК-транскриптом.

Таким образом, сайт контакта GreB с З'-концом РНК-транскрипта заключен в пределах Asp 47- Arg 63.

3.3. N-концевые домены GreA и GreB определяют их функциональную специфичность

GreA и GreB имеют одинаковый размер -158 аминокислот. Их последовательности идентичны на 35% и сходны на 60% (ссылка). В то же время, эти белки функционально неэквивалентны: они индуцируют отщепление от 3'-конца РНК-транскрипта фрагментов различной длины (2-3 нуклеотида для

GreA и 2-18 для GreB). Чтобы определить, какие участки аминокислотной последовательности GreA и GreB отвечают за их функциональную специфичность, мы сконструировали серию реципрокных гибридов между генами greA и greB [использовался метод "каскадной" полимеразной цепной реакции (PCR)]. Белки, кодируемые гибридными генами, были сверхпродуцированы и тестированы на тип транскриптрасщепляющей активности, который определялся по характеру расщепления 9-ТЭК (CpApCpCpApCpUpGpA): отщепление динуклеотида pGpA - тип "А", отщепление тетрануклеотида pCpUpGpA - тип "В".

Белок

1

GreA

Grs В Е-"-.--..'

6_

ab б ;:; i^z 12

AB 12

„ ____3_1

AB 31 ~'T-:...... . - ....,- . .: .■.......,.,:- :: ^ не акт.

81

AB 81 - * - гудицдд _ д-у," -вдд.ян А

.............. " " " .........*............107

AB 107 . г:.......г- : г^дагяггяга А

6

........................... ....... ......

ВА 12 cssirzzrr™"———-—„.._л

— —. - ... „-.„J..,.,............S

В А 44 -г—--j не акт

81 .......

В А 81 В

105

ва 105 цяляииикдаии'■ '«-л.«шшж гшттяшш-----—---•----—« в

Тип

Cw^yP3 активности

158

ZZL.*—_в

1~......''"' - - ....... - -". .......••.-.: • .JJ"-.1-". .....не акт.

Рис. 9. Тип транскриптрасщепляющей активности GreA/GreB гибридов.

Из рис. 9 видно, что тип расщепления как для GreA, так и для GreB определяется участком в пределах их N-концевой половины (гибриды АВ81 и ВА81 ). Можно также заключить, что первые шесть аминокислот GreB и первые 12 аминокислот GreA не существенны для типа расщепления (гибриды АВ6 и ВА12). Попытки более точной локализации привели к образованию функционально неактивных гибридов (АВ12, АВ31, ВА31, ВА44). Это, по-видимому, означает, что участки Lys 13- Pro 81 у GreA и Thr 7- Gin 81 у GreB участвуют в формировании пространственно-функциональных доменов с тонкой специфической внутридоменной организацией.

3.4. Трехмерная структура GreA и GreB

В сотрудничестве с нами в лабораториии Сета Дарста (Rockefeller University) был получен кристалл белка GreA и проведен его рентгеноструктурный анализ с разрешением 2.2 А, который показал, что GreA (158 аминокислот) состоит из двух доменов, содержащих приблизительно одинаковое количество аминокислот. Пространственно белок напоминает заглавную латинскую букву "L", в которой длинное плечо - это N-концевой домен (79 аминокислот), а короткое плечо - С-концевой домен (67 аминокислот) (рис. 10).

N-концевой домен представляет собой спираль-спиральный димер, состоящий из двух антипараллельных а-спирапей (al и а2). С-концевой домен

состоит из одной a-спирали (аЗ), упакованной в пять р-слоев. Оба домена содинены петлей в 12 аминокислот.

Поразительная асимметрия наблюдается в распределении заряда по поверхности молекулы GreA. Одна сторона молекулы полностью заряжена отрицательно, в то время как противоположная сторона - нейтральна, за исключением небольшого положительно заряженного участка, который в основном формируется за счет Arg 52 и Arg 37. Вдоль всей большой оси по нейтральной стороне молекулы проходит гидрофобная полоса.

Сравнение последовательностей GreA и GreB показывает, что ключевые аминокислоты, определяющие особенности структуры GreA сохранены также и в GreB. На основании известной структуры GreA компьютерный анализ позволил построить модель трехмерной структуры GreB. Несмотря на то, что эти белки очень похожи (GreB также состоит из N-концевого и С-концевого доменов, которые аналогичны по своей структуре соответствующим доменам GreA), они отличаются по распределению электрического заряда по их поверхности. В отличие от GreA, у которого на в основном нейтральной

поверхности имеется положительно заряженное пятно, у ЭгеВ почти вся соответствующая поверхность заряжена положительно.

Рис. 10. Пространственная структура вгеА.

На основании структурных данных можно предположить, каким образом йгеА и вгеВ взаимодействуют с элонгационным комплексом РНК-полимеразы. Сама по себе РНК-полимераза заряжена сильно отрицательно: расчетная (по аминокислотному составу) изоэлектричкская точка кор-фермента - 5,34. Также нужно учесть отрицательно заряженные фосфатные группы ДНК-матрицы и РНК-транскрипта, ассоциированные с РНК-полимеразой в элонгационном комплексе. Молекула вге фактора скорее всего ориентирована своей

отрицательно заряженной поверхностью от элонгационного комплекса. Гидрофобная же поверхность, вероятно, участвующая в белок-белковом контакте, ориентирована так, чтобы взаимодействовать с неким участком полимеразы. В таком случае положительно заряженный участок GreA и GreB будет повернут по направлению к полимеразе таким образом, чтобы взаимодействовать с отрицательно заряженным транскриптом. Это предположение подтверждается результатами фотохимического сшивания Gre факторов с З'-концом РНК-транскрипта: идентифицированные нами участки Gre факторов, находящиеся в контакте с З'-концом РНК-транскрипта, как раз соответствуют положительно заряженным участкам на поверхности молекул этих факторов.

Сравнительный анализ показал, что у некоторых белков, связывающихся с РНК, есть структурные домены аналогичные доменам GreA. Так, например, серил-тРНК-синтетаза из Т. thermophilus содержит вытянутый спираль-спиральный домен (Cusack et al„ 1990). Согласно результатам рентгеноструктурного анализа комплекса серил-тРНК-синтетазы с тРНК§ег этот дфмен играет важную роль во взаимодействии с РНК (Biou et а!., 1994). Другой пример спираль-спиральной структуры, которая может играть важную роль в РНК-белковом взаимодействии, - это белок Rop, который регулирует репликацию Со1Е1, взаимодействуя с РНК-праймерами (Banner et al., 1987). Мономер Rop белка формирует внутримолекулярный антипараллельный спираль-спиральный димер, который образует межмолекулярный димер -"пучок" четырёх антипараллельных а-спиралей. Эти данные говорят о том, что N-концевой спираль-спиральный домен Gre факторов может являться ключевым для функции этих белков. Это подтверждается нашими данными по функциональному анализу гибридных GreA/GreB белков.

N ВЫВОДЫ

1. Показано, что, помимо полимеризующей и пирофосфоролитической активностей, РНК-полимераза Е. coli обладает третьей -транскриптрасщепляющей (эндонуклеазной) и антитупиковой - активностью, которая может быть индуцирована слабощелочными pH. В основе механизма этой реакции лежит, по-видимому, ионизационное состояние аминокислотных остатков с рК8.6 (таких как Lys, His или Cys) в субъединицах РНК-полимеразы. Действие транскрипционных факторов GreA и GreB заключается в индуцировании собственной транскриптрасщепляющей и антитупиковой активности РНК-полимеразы Е. coli.

2. Показано, что GreA и GreB специфически связываются с РНК-полимеразой и ТЭК. GreA связывается с полимеразой в 300 раз хуже, чем GreB. Эффективность связывания GreA и GreB с ТЭК не зависит от длины транскрипта (5, 6, 7, 9 и 12 нукпеотидов). Эффективность связывания GreA и GreB с ТЭК также не зависит от компетентности ТЭК к расщеплению транскрипта.

3. Показано, что GreA и GreB контактируют с З'-концом РНК-транскрипта в составе ТЭК. Сайты GreA и GreB, участвующие в этом контакте, картированы в участках Asp 41- Phe 57 и Asp 47 - Arg 63, соответственно, внутри которых находятся аминокислоты, формирующие положительно заряженные зоны на поверхности молекул GreA и GreB.

Показано, что участки полипептидной последовательности Lys 13- Pro 81 у GreA и Thr 7- Gin 81 у GreB формируют функциональные домены, определяющие тип индуцируемой транскриптрасщепляющей активности. Эти функциональные домены соответствуют четкой структурной компоненте в пространственной организации GreA и GreB - антипараллельному спираль-спиральному димеру.

СПИСОК РАБОТ, опубликованных автором по теме диссертации:

1. Orlova. М.. Borukhov, S., Newlands, J., Goldfarb, A., Das, A. (1994) Transcript cleavage factors GreA and GreB utilize intrinsic activity of RNA polymerase, J. Cell. Biochem. 13C, 64.

2. Darst, S.A., Stebbins, C.E., Borukhov, S„ Orlova, M.. Feng, G., Landick, R. & Goldfarb, A. (1994) Crystallization of GreA, a transcript cleavage factor from Escherichia coli, J. Mot. Biol. 242, 582-585.

3. Stebbins, C.E., Borukhov, S., Orlova. M„ Polyakov, A., Goldfarb, A. & Darst, S.A. (1995) Crystal structure of GreA, a transcript cleavage factor from Escherichia coli, Nature 373, 636-639.

4. Orlova. M.. Newlands, J., Das, A., Goldfarb, A. & Borukhov, S. (1995) Intrinsic Transcript Cleavage Activity of RNA Polymerase, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, в печати.