Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение эволюционно-вариабельных участков бета-субъединиц бактериальных РНК-полимераз

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение эволюционно-вариабельных участков бета-субъединиц бактериальных РНК-полимераз"

г в

он

10 «я

На правах рукописи УДК 557.214

ЗАХАРОВА Наталья Александровна

ИЗУЧЕНИЕ ЭВОЛЮЦИОННО-ВАРИАБЕЛЬНЫХ УЧАСТКОВ Р'-СУБЪЕДИНИЦ БАКТЕРИАЛЬНЫХ РНК-ПОЛИМЕРАЗ

(03.00.03 - молекулярная биология)

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва -1998

Работа выполнена в Институте молекулярной генетики РАН (Москва) и в Институте им. Ваксмана (Нью Джерси, США).

Научные руководители:

доктор биологических наук,

профессор В.Г. Никифоров

кандидат биологических наук К.В. Северинов

Официальные оппоненты:

доктор химических наук,

профессор Ю.А. Берлин

доктор биологических наук,

профессор Г.Б. Завильгельский

Ведущая организация:

Институт молекулярной биологии РАН

О О

Защита состоится ^ декабря 1998 г. в часов на заседании Специализированного совета Д 025. 01. 01. при Научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов (Москва, 113545,1-ый Дорожный проезд, д. 1)

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке ННИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Автореферат разослан <</& ноября 1998г.

Учёный секретарь Специализированного совета:

кандидат биологических наук Щербакова В.И.

Актуальность темы. Олно из основных направлений молекулярной биологии - изучение механизмов экспрессии генетической информации. Первый этап генетической экспрессии, транскрипция, осуществляется ферментом ДНК-зависимой РНК-полимеразой. Наболес изученным ферментом транскрипции является РНК-полимераза Escherichia coli. Это сложный белковый комплекс с молекулярным весом 450 kDa, состоящий из кор-фермента (агРР')» обладающего каталитической активностью, и сг-субъединицы, необходимой для специфичного узнавания промоторов и эффективной инициации транскрипции. РНК-полимеразы других бактерий имеют сходное субъединичное строение. Более того, аминокислотные последовательности гомологичных субъелиниц обнаруживают в своём составе ряд эволюционно-консервативных районов, расположенных в одинаковой последовательности, что указывает на общую структурную организацию всех бактериальных РНК-полимсраз.

Изучение роли отдельных субъединиц в составе РНК-полимеразы и исследование её структурно-функциональной организации, а также изучение механизмов транскрипции являются взаимосвязанными задачами, решение которых необходимо для понимания процесса экспрессии генов. Наши знания о функциональной роли различных участков субъединиц РНК-полимеразы весьма ограничены. Мультисубъединичное строение и большие размеры РНК-полимеразы затрудняют применение прямых структурных методов для изучения фермента. Поэтому одним из основных подходов к изучению функционирования РНК-полимеразы является применение генно-инженерных и биохимических методов, а именно, получение мутаций в генах субъединиц РНК-полимеразы и исследование свойств мутантных ферментов.

Цели работы и задачи исследования. Целью данной работы являлось

выяснение функциональной роли СООН-концевого эволюционно-вариабельного района Р'-субъединицы РНК-полимеразы Е. coli и структурной организации РНК-полимеразы патогенной желудочной бактерии Helicobacter pylori. В работе ставились следующие задачи: (а) картирование антигенной детерминанты и изучение механизма подавления транскрипции моноклональными антителами, взаимодействующими с Р'-субъединицей РНК-полимеразы Е. coli; (б) исследование

функциональной роли протяжённого эволюционно-вариабельного района ß1-субъединицы при помощи делеционного мутагенеза и изучение свойств полученых мутантных ферментов in vitro; (в) выделение РНК-полимеразы из штамма 26695 Helicobacter pylori', (г) определение и сравнение последовательностей участков стыковки генов гроВС иротеобактсрий, родственных Helicobacter pylori.

Научная новизна и практическая ценность работы. Показано, что протяжённый СООН-концевой эволюционно-вариабельный район ß'-субъсдиницы не является необходимым для основных каталитических функций РНК-полимеразы Е. coli in vitro. В гене гроС получен ряд перекрывающихся делеций, приводящих к уменьшению скорости элонгации транскрипции мутантными ферментами Для одного из полученных мутантных ферментов показано, что делеция в вышеуказанном районе ß'-субъединицы понижает эффективность расщепления РНК-продукта в тройном элонгационном комплексе. Впервые выделена РНК-полимераза из патогенной желудочной бактерии Helicobacter pylori, и показано, что ß и ß'-субъединицы данного фермента представляют собой единый полипептид. Установленно, что слияние генов гроВС характерно для всех исследованных в данной работе бактерий, принадлежащих роду Helicobacter. Показано, что ß и ß'-субъединицы РНК-полимераз бактерий, принадлежащих родам Campylobacter и Arcobacter кодируются двумя генами (гроВ и гроС ), причём эти гены не разделены спейсером, как характерно для большинства изученых бактерий, а перекрываются.

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на страницах машинописного текста и содержит рисунков и таблиц Библиография включает в себя названий, в том числе русских и иностранных.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 1. Изучение СООН-концевого эволюционно-вариабелыюго района

Р'-субъединицы РНК-полимеразы Е. coli. Получение делений в вариабельном районе гена rpoC Е. coli и картирование антигенной детерминанты моноклональных антител. Исследуемый нами вариабельный район Р'-субъединицы РНК-полимеразы, присутствует в гомологичных субъединицах протсобактерий, но отсутствует у грамположительных эубактерий, архебактерий и эукариот (рис. 1). С другой стороны, эволюционно-вариабельная последовательность значительно большей длины (до 900 аминокислотных остатков (а.к.)) обнаружена в соответствующем районе Р'-субъединицы цианобактерий и хлоропластов. Слева данный вариабельный район фланкирован высоко консервативным районом G (а.к. 912940), а справа - коротким консервативным районом G' (а.к. 1131-1148), рис. 1). В Р'-гомологах эукариот, архебактерий и грамположительных бактерий участки G и G' представляют собой непрерывный элемент последовательности. Справа от G' распологается вариабельный участок, за которым следует консервативный район Н (а.к. 1324-1362).

Для исследования функциональной роли гипервариабельного района, расположенного между сегментами G и G', мы использовали метод делеционного мутагенеза клонированного гена rpoC Е. coli. Был получен набор делений и небольших инссрций, изображённых на рис. 1. Мутация Д(941-1130) удаляет весь гипервариабельный район Е. coli и таким образом приводит к возникновению структуры характерной для грамположительных бактерий, таких как Mycobacterium leprae (Honore et al., 1992). Д(1131-1155)S полностью удаляет район G' и вводит вместо него а.к. Ser. Д(1145-1198) удаляет 54 а.к. непосредственно справа от G'. Д(1145-1198), не нарушающая рамки считывания, была получена между сайтами рестриктной эндонуклеазы Asull и названа AAsu. Аналогично, Д(1091-1130), также не нарушающая рамки считывания, была получена между сайтами Крп! и названа ДКрп.

ß'

конкакт с

ДНК-матрицей каталитический

разрыв в хлоропластах

SUR му!ацшш

ра зрыв в архсбактсриях

пришивки из 3'-"конца РНК

4(941-1000)

Д(941-1130)

Л(987-1042)

f. е. Р. р. В. я. Я. 1. Т.

в. ь.

YP1 YF1

Л(1042-1091)

10W

СМ У Т PHIRG С К I L К D

III I 9?° ^ix | Г iqooj i|l

SICEPGTQLTMnTHIGGAASRAAAESSIQVTCWTOSIKLSN^

......................TS»«D*V-...G-ICASR»L-g-KRAD-M'»AV..SG..AIA.....EC- — -L.....JSVKE-.K.EA-AI.-Г•«••■Н-ГУ..LK.T-T.VG.EEHI.-К.........TNIE" • VKD'PAARJT"

..........................VTTGGT • •HVRAPS-GKirrNffiL VHP TR TWCHPAITCS ГО•YVTI •SEDILHSVKI ■ PKSL • LVQNDQY •EStQVI. E IRAGTSTLWTE(r7RKHI7SDS • • OCTVSTDVYHAi ETTTCHVHLLFK • SHLW | e

Л( 1042-1091)

Л(1091-1130) [ЛКрп]

A(1131-1155)S [AG'J

Л(941-1130)

Л(1145-1198) [AAsu]

1100

1200

D I D ЛЛАА

I I I ../'Vю

---------OLRPALKrTOAQGKDVLIPGTDKP AQYTLPG^IVQLEIXJVQISSGDTiJkRIPQESGOTlOITC^PRVADlJEAilRF^

......----HT1«. «I-M» ••A«K«LVL. • • - V.................................TSK«R...»>................S.-.-V..T«....................E. . . .L» ■ • • »H.....

-------...------------------------------------------------------------IQE. >••«Ц » »G(3*TIT» •□ »T« V" IM« VWJ' QQEIWQGAVETRSYTAPYNS '1JCVAEG

"-----------------------------------------------------------------------QE.....V'RQC.PI ■DVT,R«RLEDGDtrYKITIVPDDG«EEWYIlJ<LS»|tQR,R« «K

(6 04 ) WOKJ-p. .SOJVILVQ-DSIVIRSAKP.tATPG.T'B3HY'mTE> « • •VTTTT'KSRSG' • ■{>•« -K-P^-V-SVT5SIS«n.iratirVMrci!rBrLGrpWGFLIGi,ELTIAOSRISL>/NfriOQV

----------------------------------------------------------------------H* V-Q« • ■ • LIE»VD« »KTPDTPVHTvyLEDKTABERERAHiWWKIEATKILALfSDI STWADKV«KI

-----......------------------------------------------------------------AJiV«I,.I« ■LREIV>frASAAIKTPüliTLPIWKDVSD.QADTrQCS*SK«Ll..EVIDKV.VTE'nX»rS!i7

----------------------------------------------------------------------»KV« S »V» • LKEILNVAKHMKTPS •TVYLEPCliAADQEQA»LlHSAi EHTTLFSVTIASE tYVPDPPRS

----------------------------------------------------------------------KNV. L'V« • IK£tIii»SlCVISTP •tKAVLVXÜKDERAAKWKGR« EKTLLSDVbFYVQDVYVW» SFtQ

Рис. 1. Генетический контекст гипервариабельного района ß'-субьединицы

РНК-полимеразы Е. coli.

Ранее В.Г. Никифоровым и сотрудниками были получены моноклональные антитела Pynl и Руп4, взаимодействующие с ß'-еубъединицей. (Nikiforov et al., 1983). Pynl эффективно ингибировали реакцию транскрипции в экстрактах Е. coli и Pseudomonas pulida. Руп4 не оказывали эффекта на транскрипцию. Методом Вестерн-блота, нами было установлено, что ß'-субъединицы с дслециями в гипервариабельном районе не взаимодействуют с Pynl, а делеции вне вариабельного района, Д(877-948), Д(1131-1155)S и AAsu, не нарушают взаимодействия с Pynl. Таким образом, а.к. с 949 по 1091 содержат эпитоп моноклональных антител Pynl. AAsu была единственной из делеционных субъединиц, которая не взаимодействовала с Руп4. Следовательно а.к. с 1145 по 1198 содержат антигенную детерминанту Руп4.

Сборка мутантных РНК-полимераз in vitro.

Все вышеуказанные делеции в гене гроС были получены в плазмиде рМКа201 S693F. ß'-субъединицы, экспрессируемые данной плазмидой, имеют на СООН-конце последовательность из шести гистидиновых остатков. Такая конструкция позволяет выделять из клеточных лизатов РНК-полимеразу, имеющую в своём составе ß'-субъединицу плазмидного происхождения (Kashlev et al., 1993). Наши попытки по выделению РНК-полимераз, содержащих делецию сегмента G', и две самые большие делеции, закончились неудачей. Мы предпологаем, что делеция консервативного сегмента G', а также две большие делеции, удаляющие весь гипервариабельный район, исключают возможность включения ß'-субъединицы в состав РНК-полимеразы.

Мутантные субъединицы Д(941-1000), Д(987-1042), Д(1042-1091), ДКрп и AAsu, оказалось возможным включить в состав РНК-полимеразы, что было подтверждено появлением характерных пиков при хроматографической очистке. Каталитическая активность мутантных ферментов была продемонстрирована при помощи аффинной сшивки делеционных ß'-полипептидов с РНК-продуктом длиной 12 нуклеотидов, несущим фотореактивную группу. Фотоактивация элонгационных комплексов, образованых ферментом дикого типа, приводила к мечению и ß и ß'-субъединиц. Фотоактивация элонгационных комплексов,

образованых мутантными ферментами приводила к появлению меченой полосы, совпадающей по подвижности с полноразмерной р-субъединицей (рис. 26, 2в). Полосы, соответствующей полноразмерной (З'-субъединице, не наблюдалось. На основании данных результатов мы заключаем, что мутантные ферменты, собраные из отдельных субъединиц in vitro, активны и не содержат примеси фермента дикого типа.

Транскрипционная активность мутантных РНК-полимераз.

Подробно были исследованы только РНК-полимсразы ДКрп и AAsu, т.к. предварительные эксперименты показали, что ферменты Д(941-1000), Д(987-1042), Д( 1042-1091) очень похожи по своим свойствам на ДКрп.

Weilbacher и сотр. показали, что точечные мутации в изучаемом районе Р'-субъединицы изменяют элонгационные и терминационные свойства РНК-полимеразы in vivo и in vitro (Weilbacher et al., 1994). В связи с этим было решено исследовать элонгационные и терминационные свойства полученых нами мутантных ферментов. Мы приготовили иммобилизированые элонгационные комплексы, с радиоактивномеченым РНК-продуктом, остановленные в положении +20 (ЭК20) на промоторе Т7А1. Для определения скорости элонгации к ЭК20 были добавлены нуклеозидтрифосфаты (НТФ) в концентрации 10 цМ. Через определённые промежутки времени из реакции отбирали аликвоты и затем РНК-продукты анализировали в денатурирующем ПААГ (рис. 2г). Как следует из радиоавтографа, свойства фермента ДАви не отличались от свойств РНК-полимеразы дикого типа, а фермент ДКрп элонгировал РНК-продукт значительно медленнее. Кажущееся понижение скорости элонгации транскрирции ферментом ДКрп обусловленно увеличением длительности пауз (Ч/2~2.5мин) в положениях матрицы 26, 27, и далее 37 и 56. Увеличение длительности пауз в этих положениях было обнаружено также в экспериментах, когда транскрипция инициировалась с положений +12, +23 и +25 (данные не приведены).

Одной из возможных причин увеличения длительности пауз ферментом

и б

Б

В

о ем о>

Ео о

О о

7 Т N

т- Г4-

В «о о

£ а » с.

& Ъ Ъ Ъ

Кумассн

Радиоавтограф Радиоавтограф

ООО

„._„ _____ Юю Л о о 10ю Ю О о ЮЩЮ о о СМЛ, МИН ОО^СЧ и) Г- ООг^СМ 10 Г-ОО^О! Ю

_ полнораз мерный продукт

терминнрованыЗ продукт

ЭК56

ЭК37

ЭК27 ЭК26

Рис. 2. Транскрипционная активность мутантных ферментов

РНКП*- РНК-полпмсраза

ДКрп могло быть повышение способности каталитического центра РНК-полимеразы перемещаться "назад". Такое перемещение наблюдается в определённых положениях матрицы и приводит к переходу РНК-полимеразы в арестованное состояние, в котором она не способна удлинять РНК. Поэтому мы сравнили эффективность образования арестованного комплекса РНК-полимеразами

РНКП энквй тжп АКОП

НТФ +

Вртя пГп

экгт~

дорожка 1

Б

Дип тп

ДАзи ДКрг

солворазиерный продукт

термлвироваяыИ продукт

ЭК32

Рис. 3. Переход в арестованое состояние и терминация транскрипции ферментом ДКрп.

дикого типа и ДКрп. В эксперименте, результаты которого изображены на рис. За, степень транскрипционного ареста остановленных ЭК27 дикого типа и ДКрп измерялась по способности к элонгации в ЭК32 при добавлении АТФ и ЦТФ. Сразу после приготовления, ЭК27 дикого типа и ДКрп были компетентны к

элонгации (дорожки 2 и 5). Однако, после 5 минут инкубации при 37°С в отсутствие НТФ только 10% исходных ЭК27 были способны к элонгации транскрипта. Причём, не было обнаружено отличия в степени ареста между полимеразой дикого типа и ДКрп.

Возможно, делеция ДКрп изменяет конформацию фермента, что приводит к увеличению Км для субстратов в определённых положениях матрицы. Увеличение Км отражается на соотношении скоростей процессов удлинения РНК и перемещения каталитического центра РНК-полимеразы "назад". Действительно,

как показал следующий эксперимент, при увеличении концентрации НТФ длительность пауз мутантного фермента уменьшается. При высокой концентрации субстратов (250 цМ) фермент ДКрп за-1 минуту завершает цикл транскрипции и терминирует траискрипт на TR2 терминаторе с такой же эффективностью, как и ферменты дикого типа и AAsu (рис. 36). Следовательно, при высокой концентрации субстратов, скорость реакции удлинения РНК-продукта ферментом ДКрп превышает скорость реакции сдвига каталитического центра "назад". При таких условиях мутантный фермент элонгирует РНК-продукт с эффективностью фермента дикого типа.

Расщепление РНК-продукта в тройных элонгационньтх комплексах

мутантными ферментами.

Генетический скрининг дрожжевого гена RP021, эволюционного гомолога гроС, идентифицировал мутации, изменяющие способность РНК-гюлимеразы II взаимодействовать с фактором расщепления транскрипции TFIIS (Archambault et al., 1992). Все семь мутаций были локализованы между эволюционно-консервативными районами G и Н (Archambault et al., 1992). Было показано, что данные мутации в 50 раз уменьшают эффективность взаимодействия РНК-полимеразы II с фактором TFIIS (Wu et al., 1996). Поскольку вышеуказанные мутации в дрожжевой полимеразе были локализованы достаточно близко к изучаемому нами гипервариабелыгому району (см. рис. 1), мы решили исследовать транскрипт-расщепляющую активность полученых нами мутантных РНК-полимераз Е. coli. Как следует из радиоавтографа, изображённого на рис. 4а, для ЭК21 образованного ферментом ДКрп, требуется в 10 раз большее количество фактора GreB, чем для ЭК21 дикого типа и AAsu, чтобы достигнуть одинаковой степени расщепления РНК-транскрипта. При инкубации ЭК20 фермента дикого типа в буфере с рН 9.0 (условия, стимулирующие фактор-независимую нуклеазную активность РНК-полимеразы (Orlova et al., 1995)) происходит фактор-независимое расщепление транскрнпта (рис. 46). После 5 минут инкубации в буфере с рН 9.0, в более чем 75% ЭК20 дикого типа и AAsu произошло расщепление (дорожки 2 и 6). Однако, только 10% РНК-продукта из ЭК20 ДКрп подверглось расщеплению после 5 минут инкубации, и около 60% - после 20 минут инкубации (дорожки 10 и 12).

РНКТТ Ч1Т ЛАви ЛКрп

<аГ*В ДОрОЖК! 1 2 3 41 5 6 7 9 10 11 121

ЭК21~ вМИРвРв*

Б.

РНКП агжп ГЙ Т1 га АЛ 13и А! Кпп

Впемя. МЖ1 п 10 ?П п я 10 ?0 0 10 ?п

аовожжа 1 г ? 4 5 9 7 8 9 19 11 12

ЭК20~ вР''"" " ' ШШШт -->,Ч, 'ям««« ттшив «а»- - - ■

В

РНКП 7НКНЙ теп ЛКпп

дорожхс 1П 4 .1 Й 7 А 01Л11 V.

ОгеВ— ■МШШаКЯВШ • яаь '¡Ч11' ЧИЦВРгЩЯФ'ЩЦП^жчв*

-р

РНКП ЭгеВ

Рис. 4. Расщепление РНК-продукта и связывание с фактором СЗтеВ мутантных ферментов.

Следовательно мутация ДКрп снижает эффективность фактор-независимой расщепляющей активности каталитического центра РНК-полимеразы. Чтобы сравнить эффективность связывания ОгеВ с мутантной полимеразой и ферментом днкого типа, мы поставили эксперимент по сшиванию фактора расщепления с фотоактивируемым аналогом рибонуклеинового основания, находящимся на 3'-конце РНК-продукта в тройном элонгационном комплексе (рис. 4в). В соответствии с получеными ранее данными, в тройных элонгационных комплексах Р' и ОгеВ эффективно образуют сшивки с фотоактивируемым радиоактивномеченым РНК-продуктом (КоиНсЬ е1 а!., 1997, 51еЬЬтз е1 а!., 1995). Уменьшение количества ОгеВ в реакции приводит к уменьшению количества сшитого продукта ОгеВ-РНК, однако количество сшитого продукта Р'-РНК остаётся постоянным. Как следует из данного радиоавтографа (рис. 4в), эффективность сшивки для мутантного фермента приблизительно в 10 раз ниже, чем для полимеразы дикого типа. На основании полученых данных можно заключить, что делеция ДКрп либо непосредственно уменьшает эффективность связывания ОгеВ с РНК-полимеразой, либо изменяет относительное расположение ОгеВ и 3'-конца РНК-продукта.

Следующий эксперимент позволил непосредственно сравнить эффективность связывания ОгеВ с мутантной полимеразой и ферментом дикого типа. Для этого мы использовали ОгеВ-белок с введённым на ИНг-конце сайтом, который фосфорилируется киназой из сердечной мышцы быка (Ы. Ьо1го5, неопубликованые данные). Различные количества радиоактивно-меченого по ХН2-концу ОгеВ смешивали в реакции с кор-ферментами дикого типа и ДКрп. После непродолжительной инкубации, необходимой для формирования комплекса, продукты реакции разделяли электрофорезом в нативном ПААГ и ОгеВ-содержащие комплексы регистрировали при помощи радиоавтографии (рис. 4г). Как следует из рис. 4г, оба фермента с одинаковой эффективностью образовывали комплексы с радиоактивно-меченым ОгеВ.

Таким образом, полученные результаты позволяют предположить, что природа дефекта фермента ДКрп в реакции расщепления транскрипта является более сложной, по сравнению с дефектом, вызываемым мутациями в дрожжевой

РНК-полимеразе II, поскольку делеция ДКрп затрагивает как внутреннюю расщепляющую активность каталитического центра, так и способность фермента (не прямым образом) взаимодействовать с фактором GreB.

Влияние связывания антител с РНК- полимеразой на

реакцию транскрипции in vitro.

Результаты эксперимента, приведённые на рисунке 5а, показывают, что моноклональные антитела Pynl эффективно ингибируют элонгацию РНК-продукта ферментом дикого типа из ЭК20 в ЭК23 при низкой концентрации НТФ (10 цМ) (дорожка 3). Эти данные согласуются с результатами, полученными ранее в нашей лаборатории (Nikiforov et al., 1983). Pynl не влияют на транскрипцию ферментом ДКрп (дорожка 7), поскольку антитела не взаимодействуют данным мутантным ферментом (нижняя часть рис. 5а, дорожка 5). Моноклональные антитела Руп4, используемые в качестве контроля, не влияют на элонгацию транскрипта обоими ферментами, несмотря на то что в условиях эксперимента более 50% элонгационных комплексов связаны с антителами (нижняя часть рис. 5а, дорожки 3 и б).

При повышении концентрации субстратов (более 100 цМ) Pynl не подавляют реакцию транскрипции (данные не приведены). Опыты по влиянию антител Pynl на реакцию абортивной инициации при различных концентрациях НТФ (рис. 6) показали, что взаимодействие РНК-полимеразы с антителами в 20 раз повышает Км реакции.

Pynl полностью ингибируют реакцию фактор-независимого расщепления транскрипта ферментом дикого типа при рН 9.0 (рис. 56, дорожки 6 и 7), но не оказывают влияния на реакцию расщепления ферментом ДКрп (данные не приведены). При добавлении GreB к ЭК20 дикого типа расщепление транскрипта происходило даже в присутствии антител Pynl (рис. 5в). Однако для достижения одинаковой степени расщепления в присутствии антител требовалось в 10 раз большее количество фактора, чем в отсутствии антител (сравнить дорожки 5 и 7). Как показано на рис. 5г, фактор GreB не вызывал диссоциации Pynl из комплекса с

кц чнкяз тяж АК рп

\Тт _ _ PY41 Рт< _ _ Pvnl РотД

ГФ _ + + + _ + + +

»жха ™J5- J „™а.

:23"

.20

20-МА1

ЭК20

DH 9.0 I .

HTCD + _

Pvn1: 4 _ +

д«р«жп 1 а|э 4 5 4?

РНКП WT АКСП ЭК20

МАТ" Pvnl Р»п4 Руп1 Pvn4

_I— 3 4 5 6

»

ВреПЯ, т.и Ю 10

20 20

в

НТФ -I +

йгеВ

Руп1 _ _ + + I -

1 2 3 41 Si fll 7l fll 9

ЭК20-

ЭК11

згР-GreB

Pynl-

лорвжжа \IzLL 1151 6

РНКП Greg"

Ш

ж " Pynl :PHKTI:GreB

Рис. 5. Влияние моноклональных антител на транскрипцию, расщепление РНК- продукта и связывание с фактором GreB in vitro.

МАТ*-моноклональные антитела

Рис. б. Влияние Pynl иа реакцию абортивной инициации.

РНК-полимеразой. В этом эксперименте также был использован GreB, содержащий на МН2-конце детерминанту для киназы из сердечной мышцы быка. Различные количества радиоактивномеченого GreB инкубировали с ферментом дикого типа в присутствии и отсутствии антител Pynl. После 10 минут инкубации, необходимой для формирования комплекса, продукты реакции разделяли электрофорезом в нативном ПААГ и GreB-содержащие комплексы обнаруживали при помощи радоавтографии. В отсутствии антител, GreB образовывал комплекс с РНК-полимеразой (рис 5г, дорожки 1-3). Добавление Pynl приводило к формированию радиоактивномеченого комплекса с более высокой электрофоретической подвижностью (дорожки 4-6). На основании данного эксперимента мы утверждаем, что GreB и Pynl могут одновременно взаимодействовать с молекулой РНК-полимеразы.

* * *

Пять делеций, полученных в данной работе, в сумме удаляют 243 а.к. (>17%) Р'-субъединицы, но не приводят к полной потере каталитической активности РНК-полимеразы in vitro. Это свидетельствует о том, что исследуемый район не является необходимым для основных каталитических функций РНК-полимеразы in vitro. Данные делеции можно разделить на два класса. Делеция AAsu удаляет 54 а.к. справа от гипервариабельного района, и не изменяет

транскрипционных свойств фермента in vitro. С другой стороны, дслеции аналогичного размера внутри гипервариабельного района - Д(94]-1000), Д(987-1042), Д(1042-1091) и Д(1091-1130)( ДКрп) - оказывают значительный эффект на элонгацию транскрипции при ненасыщающей концентрации субстратов и ингнбируют расщепление транскрипта.

Значительное отличие между двумя классами делеций также очевидно при сравнении эффектов, вызываемых связыванием моноклональных антител. Pynl взаимодействуют с гипервариабельным районом (а.к. 948-1130) и эффективно ингибируют синтез РНК и фактор-независимое расщепление транскрипта. С другой стороны, Руп4, эпитоп которых удаляется делецией AAsu, не оказывают влияния на транскрипцию. Гипервариабельный район высоко иммунногенен: в независимых исследованиях в лаборатории Krakow был получен набор моноклональных антител, взаимодействующих с данным районом ß'-субъединицы Е. coli (Luo et al., 1992). Моноклонапьные антитела 311G2 ингибировали синтез РНК, препятствуя взаимодействию фермента с субстратами, и эпитоп этих антител был локализован между а.к. 1047 и 1093 ß'-субъединицы. Таким образом, антитела 311G2 аналогичны изучаемым нами антителам Pynl.

Биохимическое поведение делеций и эффект, вызываемый связыванием антител с гипервариабельным районом, указывают на причастность данной области ß'-субъединицы к реакциям элонгации и расщепления транскрипта. Как наиболее интересную особенность мутантных ферментов ДКрп-типа следует отметить удлинение пауз в положениях транскрипционного ареста.

Так как исследуемый гипервариабельный район полностью отсутствует у многих РНК-полимераз, вероятно, что описаные делеции в ß'-субъединице оказывают влияние на функциональные структуры фермента не прямым образом. Данные литературы позволяют предположить, что эволюционно-консервативный сегмент G, расположенный в непосредственной близости от района делеций, принимает участие в синтезе РНК, расщеплении транскрипта и транскрипционном аресте. Борухов и сотрудники показали, что участок ß'-субъединицы, содержащий 8 а.к. у правой границы сегмента G и первые 74 а.к. принадлежащие гипервариабельному району, находится в непосредственной близости от З'-конца

РНК в ЭК20 (ВогикЬоу е1 а1., 1991). Позднее было показано, что такое расположение З'-конца РНК характерено для арестованного элонгационного комплекса (Магкоу1зоу е1 а1., 1996). Дальнейшие эксперименты показали, что сегмент в и белок ОгеВ могут быть одновременно сшиты с З'-концом РНК в тройном элонгационном комплексе, и следовательно находятся на расстоянии нескольких ангстрем друг от друга и каталитического центра фермента (КоиИсЬ й а1„ 1997).

Данные \Уи и сотр указывают на то, что район Р'-подобной субъединицы РНК-полимеразы II дрожжей, расположенный между сегментами в и II, участвует во взаимодействии с фактором ТРНБ (\Уи а а1., 1996). С другой стороны, полученные в данной работе дслеции в Р'-субъединице Е.соИ оказывают относительно слабый эффект на взаимодействие с вгеВ - функциональным аналогом ТРИБ. Таким образом, два фактора расщепления транскрипта по-видимому взаимодействуют каждый со своей РНК-полимсразой по-разному.

Опубликованные выравнивания последовательностей Р'-подобных субъединиц (РиЫег й а1., 1989, ЬапсНск е! а1., 1990) значительно отличаются от приведённого нами на рис. 1. В нашем сравнении последовательностей выделен дополнительный консервативный сегмент С (положения 1031-1040 в последовательности Е. соИ). На основании данного выравнивания последовательностей становится возможным предположить причину значительной разницы биохимических свойств полученных в данной работе мутантных ферментов. У архебактерий, эукариот и многих бактерий консервативные районы в и в' представлены единой непрерывной последовательностью. У цианобактерий, хлоропластов, протеобактерий и многих их дальних родственников между в и С возникли значительного размера инсерции (область, называемая гипервариабельной, в данной работе). Последовательности инсерций не гомологичны среди протеобактерий и цианобактерий, и значительно дивергентны внутри каждой из групп. Интересно, что точка возникновения инсерции внутри последовательности ОС совпадает для протео- и цианобактерий, которые далеки друг от друга филогенетически. Возможно, инсерции в районе ОС произошли по-крайней мере дважды в течение эволюции. Район инсерции вероятно экспонирован

на поверхности молекулы РНК-полимеразы, и поэтому иммуногенен. Делеции внутри данного гипервариабельного района и взаимодействие с ним моноклональных антител вероятно изменяют относительное расположение сегментов G и G', что приводит к транскрипционным дефектам. Значимость района G' подтверждается ещё тем фактом, что наименьшая из полученых нами делеций Д(1131-1155) (удаляющая сегмент G') не позволяет входить ß'-субъединице в состав РНК-полимеразы in vitro. Делеция AAsu удаляет 54 а.к. справа от сегмента G' и не изменяет относительного расположения районов G и G' и таким образом не оказывает влияния на транскрипционные свойства фермента. Нам представляется интересным продолжить изучение консервативного сегмента G' с помощью сайт-специфического мутагенеза для выяснения его функциональной роли в процессах катализа, расщепления транскрипта и сборки РНК-полимеразы.

Глава 2. Исследование структурной организации генов гроВ/С e-группы протеобактерий.

Филогенетический анализ участков стыковки генов гроВ и гроС из

s-группы протеобактерий.

Гены гроВ и гроС эубактерий и архебактерий, кодирующие соответственно ß- и ß'-подобные субъединицы РНК-полимеразы, организованы в оперон, причём гроВ всегда предшествует гроС.

В 1997 г., когда была опубликована полная последовательность генома желудочного патогена Helicobacter pylori (штамм 26695) (Tomb et al., 1997), было обнаружено, что гены гроВ и гроС данной протеобактерии организованы в одну непрерывную открытую рамку считывания, потенциально кодирующую единый ß-ß' полипептид, длиной 2890 а.к.

Подобная естественная организация гроВ-гроС генов была обнаружена впервые. Однако, К.В. Севериновым было показано, что искуственное соединение гроВ и гроС генов не нарушает функционирования РНК-полимеразы Е. coli как in vitro, так и in vivo: продукт искуственно объединённых гроВ и гроС генов входит в состав функционально-активной РНК-полимеразы in vitro и in vivo, а штамм Е. coli, содержащий объединённый гроВС ген, как единственный источник ß- и ß'-

субъединиц РНК-полимеразы, является жизнеспособным и содержит РНК-полимеразу ожидаемого субъединичного состава (ß-ß')a2 (Severinov et al., 1997).

Helicobacter pylori (H. pylori) принадлежит к е-группе протеобактерий. Среди бактерий, принадлежащих к е-группе, последовательность генов гроВ и гроС была известна только для Н. pylori. Следовательно, представлялось возможным, что единый гроВС ген а) является характерной особенностью протеобактерий е-группы; б) специфичен для рода Helicobacter, в) случайно возник у вида Н. pylori, или даже г) случайно возник у отдельного штамма Н. pylori, который был выбран для геномного проекта. Для того чтобы сделать выбор между этими возможностями, нами был использован метод ЦПР-амплификации для определения ДНК-последователыюстей участков стыковки генов гроВ-гроС из следующих протеобактерий принадлежащих к Е-группе: Helicobacter pylori (штаммы Hpl, J-166, SSI и NCTC11638), Helicobacter felis, Helicobacter mustelae, Helicobacter nemestrinae, Helicobacter canis, Helicobacter fennelliae, Helicobacter sp.CLO-3, Helicobacter pametensis, Helicobacter muridarum, Flexispira rappini, Wollinella succinogenes, Campylobacter rectus, Campylobacter fetus, Campylobacter jejuni, Arcobacter cryaerophilus, Arcobacter butzleri, Arcobacter skirrowii. Для амплификации геномной ДНК были использованы два праймера, комплементарные высоко консервативным участкам последовательности на 3'-конце гроВ и 5'-конце гроС генов Н. pylori 26695. В результате амплификации, для каждого из указаных организмов был получен продукт размером около 500 пар оснований (п.о.). После клонирования была определена нуклеотидная последовательность ЦПР-продуктов Оказалось, что единый гроВС ген является характерной чертой всех исследованых нами бактерий, принадлежащих роду Helicobacter, но не родам Campylobacter и Arcobacter.

Следует отметить уникальную организацию генов гроВ и гроС бактерий принадлежащих родам Campylobacter и Arcobacter. У этих бактерий два последних кодона гена гроВ перекрываются с первыми двумя кодонами гроС. Таким образом, эти гены не разделены спейсером, как характерно для большинства известных бактерий, а перекрываются, как гроВ и гроС гены архебактерий.

Выделение РНК-полимеразы //. pylori.

Полученые нами данные о ДНК-последовательностях ещё не дают основания утверждать, что РНК-полимераза бактерий, принадлежащих роду Helicobacter, содержит единый ß-ß' полипептид. Для проверки этого предположения мы выделили РНК-полимсраэу из штамма Н. pylori, для которого была определена геномная последовательность.

ß- и ß'-субъединицы РНК-полимеразы являются одними из самых больших белков бактерий и могут быть легко обнаружены в грубых клеточных экстрактах

при помощи ДНС ПААГ. На рис. 7 приведён ДНС ПААГ грубых клеточных экстрактов Е. coli, С. jejuni (штамм Н840) и Н. pylori. Экстракты Е. coli и С. jejuni (дорожки 1 и 2) содержат характерную двойную полосу, которая комигрирует с ß- и ß'-субьединицами очищеной РНК-полимеразы Е. coli (дорожка 4). Экстракт Н. pylori (дорожка 3) не содержит подобных полос. Однако в экстракте Н. pylori, в отличие от экстрактов Е. coli и С. jejuni, обнаруживается полоса с

электрофоретической подвижностью около 300 kDa.

12 3 4

Рис. 7, ДНС ПААГ клеточных экстрактов Е, coli, С, jejuni и Н. pylori

Чтобы проверить, является ли данная 300 кОа-полоса единым р-р' полипептидом, мы приступили к выделению РНК-полимеразы. Для выделения РНК-полимеразы мы использовали стандартную процедуру, которая включает осаждение полиэтиленимином (ПЭИ), экстракцию РНК-полимеразы из ПЭИ-осадка и последующую хроматографию на гепарине. Фракции после стадий очистки наносили на ДНС ПААГ, изображённый на рис. 8.

ß-ß- -

Интересующий нас нолипептнд, размером 300 kDa, был количественно осаждён при помощи ПЭИ в буфере с низкой концентрацией NaCl (200 шМ) (рис 8, дорожка 3), затем экстрагирован из осадка в буфере, содержащем IM NaCl (дорожка 4). Дополнительная очистка была достигнута при помощи хроматографии на гепарин-колонке (дорожка 5). После такой очистки, фракция, содержащая полипептид размером 300 kDa, была смешана с очищеной РНК-полимеразой Е.соЧ и нанесена на гель-фильтрационную колонку Superóse 6. При данной процедуре, полипептид размером 300 kDa был коэлюирован с ß, ß' и а полипептидами Е. coli. Таким образом, хроматографическое поведение интересующего нас полипептида подтверждало предположение, что он может быть частью РНК-полимеразы с составом (ß-ß')ci2.

При инкубации фракции, содержащей полипептид размером 300 kDa, в стандартном для Е. coli транскрипционном буфере в присутствии поли [дА-дТ] матрицы и НТФ мы не обнаружили РНК-полимеразной активности. Контрольные фракции, содержащие РНК-полимеразу Е. coli подобной степени очистки, были высоко активны в данном эксперименте. Важно отметить, что экстракт С. jejuni после ПЭИ-очистки также проявлял значительную транскрипционную активность на поли [дА-дТ] матрице. Мы не обнаружили транскрипционной активности в грубых экстрактах Н. pylori ни в присутствии поли [дА-дТ], ни в присутствии сильного промотора Е. coli при добавлении в реакцию ст70-субъединицы Е. coli. Контрольные экстракты Е. coli, содержащие такое-же общее количество белка, были высоко активны в данных экспериментах.

Поскольку не было обнаружено каталитической активности во фракциях,

Рпс. 8. Стадии очистки РНК-полимеразы Я pylori

содержащих полипептид размером 300 kDa, мы определили его аминокислотную последовательность. NHi-концевая последовательность данного полипептида оказалась блокировано!}, поэтому была определена внутренняя последовательность, после расщепления Lys-C протеазой и HPLC-очисткл. Полученая аминокислотная последовательность: IQQQYDQGLLTDQER, совпадает с позициями 2040-2054 ожидаемой последовательности продукта объединённого гроВС гена Я. pylori.

* * *

В заключение данной части работы следует отметить, что единый гроВС ген характерен по крайней мере для 9 бактерий, принадлежащих роду Helicobacter, а также обнаружен в бактериях Flexispira rappini и Wollinella succinogenes, принадлежащих к £-группе. ß-ß' полипептид, размером 300 kDa, является либо основной, либо единственной формой продукта данного гроВС гена in vivo. Так как в экстрактах Н. pylori не было обнаружено белков с электрофоретической подвижностью, соответствующей отдельным ß- и ß'- субъединицам, единый ß-ß' полипептид вероятно не подвергается протеолизу и является единственным источником данных субъединиц в клетке.

Нами не было обнаружено каталитической активности во фракциях экстракта Я. pylori, содержащих единый ß-ß' полипептид, при условиях, оптимизированых для реакции транскрипции РНК-полимеразы Е. coli in vitro. Как было отмечено, приготовленью аналогичным образом фракции, содержащие РНК-полимеразы из экстрактов Е. coli и С. jejuni, были активны в условиях реакции. Известно, что РНК-полимеразы из различных эубактериальиых источников могут предъявлять различные требования для эффективной транскрипции in vitro (Stetter et al., 1974, Murray et al., 1981, Whipple et al., 1992). Поэтому можно предположить, что отсутствие активности РНК-полимеразы Я. pylori в наших условиях реакции отражает нестандартные буферные и солевые условия желудочной среды, в которых обитает данная бактерия.

Функциональная роль объединения гроВ и гроС генов не известна. В

организмах со взаимосвязаными процессами транскрипции-трансляции, гены гроВ и гроС всегда организованы в опсрон, что позволяет предположить, что сборка РНК-полимеразы в клетке происходит котрансляционно. Возможно, объединение двух генов повышает эффективность сборки РНК-полимеразы. Как было показано в лаборатории К.В. Северинова, искуствснно объединённые , гены гроВ и гроС стабилизируют РНК-полимеразу in vitro и in vivo (Т. Нарышкина и сотр., неопубликованные данные). Единый ß-ß' полипептид может служить преимуществом для желудочных бактерий, обитающих в кислых условиях. С другой стороны, как известно, многие архебактерии, обитающие в экстремальных условиях, содержат естественные разрывы в ß- и ß'-подобных субъединицах. В настоящее время мы проводим эксперименты, имеющие целью непосредственно проверить важность объединения гроВ и гроС генов Н. pylori.

ВЫВОДЫ

1. Протяжённый COOH-концевой эволюционно-вариабельный район ß'-субъединицы не является необходимым для основных каталитических функций РНК-полимеразы Е. coli in vitro.

2. Показано, что делеционная мутация в эволюционно-вариабельном районе ß'-субъединицы

(а) влияет на скорость элонгации транскрипции при низких (но не «нормальных») концентрациях НТФ за счёт удлинения пауз в определённых положениях ДНК-матрицы, но не влияет на переход фермента в арестованное состояние;

(б) на порядок уменьшает эффективность GreB-зависимого и GreB-независимого расщеплений РНК-продукта;

(в) уменьшает эффективность сшивания фактора расщепления РНК-продукта с фотоактивируемым аналогом рибонуклеинового основания, находящимся на З'-конце РНК-продукта в тройном элонгационном комплексе, но не влияет на связывание фермента с фактором расщепления РНК-продукта.

3. Картированы антигенные детерминанты двух моноклональных антител Pynl и Руп4, взаимодействующих с ß'-субъединицей РНК-полимеразы Е. coli.

4. Изучен механизм действия моноклоналыюго антитела Pynl, подавляющего активность РНК-полимеразы Е. coli. Показано, что подавление активности вызвано повышением в 20 раз кажущейся константы Михаэлиса для нуклеозидтрифосфатов - субстратов реакции.

5. Определена нуклеотидная последовательность участков стыковки генов гроВ и гроС протеобактерий е-группы. Показано, что слияние генов гроВ и гроС характерно для бактерий рода Helicobacter. Показано, что гроВ и гроС гены бактерий принадлежащих родам Campylobacter и Arcobacter, в отличие от большинства известных гроВ и гроС генов бактерий, не разделены спейсером, а перекрываются, как соответствующие гены архебактерий.

6. Впервые выделена и частично охарактеризована РНК-полимераза из желудочной патогенной бактерии Helicobacter pylori. Доказано, что ß и ß'— субъединицы РНК-полимеразы данной бактерии представляют собой единый полипептид.