Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Доменная организация бета-субъединицы РНК-полимеразы Escherichia coli

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Доменная организация бета-субъединицы РНК-полимеразы Escherichia coli"

НАУЧНО-ИССЛЕДОНАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

IIa правах рукописи УДК 557. 214

СЕВЕРИНОВ Константин Викторопич

ДОМЕННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ß-СУБЪЕДИНИЦЫ РНК-ПОЛИМЕР АЗЫ ESCHERICHIA COLI

(03.00.03 - молекулярная биология)

Автореферат диссертации на соискание ученой сте пени кандидата биологичгскнх ::яук

Москна - ?993

О О

/ с<1

' J f /,>■

¡РаРота выполнена в Институте молекулярной генетики РАН (Москна) н Колумбийском университете (Нмо-Иорк).

Научный руководитель:

доктор биологических наук,

профессор В. Г. Никифоров

Официальные оппоненты:

доктор химических наук,Л|г»р . В.М. Степанов доктор биологических паук Л.Л. Гинцбург

Ведущая организация: Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, кафедра молекулярной биологии.

14

Защита состоится 16 ноября 19^3 года в >—1 часов на заседании Специализированного совета Д 025. {&. 01. при Научнонсследо-вательском институте генетики и селекции промышленных организмов (Москва, 113545, 1-ый Дорожный проезд, д. 1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ПИИ генетики и селекции промышленных организмов.

ь

Автореферат разослан "—" октября 1993 г.

Ученый секретарь Специализированного совета:

кандидат биологических наук Щербакова В. И.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. ДНК-зависимая РНК-полимераза Escherichia coli -сложный многосубьедииичный фермент, осуществляющий транскрипцию генов бактерии. Наши знания о функциональной роли различных участков субъедшпщ РНК-полимеразы ограничены. Применение прямых структурных методов затруднено сложным строением и большими размерами РНК-полимеразы. Кристаллы РНК-полимеразы, пригодные для рентгеноструктурного анализа, получить не удается, а методы нейтронного рассеивания и электронной микроскопии дали лишь общую форму фермента (Darsl et aL, 1989).

Молекулярно-генетическип подход к изучению структуры и функции РНК-полимеразы состоит в получении мутаций в генах, кодирующих субъединицы фермента, и изучении свойств мутантных ферментов in vivo и in vitro. Систематическое применение такого подхода познолит соотнести известные изменения в первичной последовательности субъединиц с функциональными дефектами мутантных ферментов. Это даст возможность построения моделей механизмов действия и регуляции РНК-полимеразы. Настоящая работа посвящена применению такого подхода к (3-субъединице РНК-полимеразы.

Цель работы и задачи исследования. Целью работы было построение структурно-функциональной модели Р-субъединнцы в составе РНК-полимеразы. В работе ставились следующие задачи: (i) изучить взаимоотношение между мутациями устойчивости к рифампицнну н стрептолнднгину в гене гроВ, кодирующем Р-субъеднннцу РНК-полимеразы; (ii) изучить роль протяженных эволюционно вариабельных районов Р-субъединнцы.

Научная новизна и практическая ценность работы. Получено большое количество новых RifR и Stl^ мутаций в гене гроВ. С помощью делеционно-инсерционного мутагенеза гроВ определен участок р-субъединицы, ответственный за взаимодействие со стрептолидигином;

1

покачано, что этот участок находится на поверхности РНК-полимеразы. Установлено, что более 25% последовательности ß-субъединнцы несущественны ни для сборки, ни для активности РНК-полимсразы in vitro. Получены данные, которые свидетельствуют о наличии двух независимых доменов в ß-субъедшшце. Определен участок ß-субьединицы, ответственный за взаимодействие с фактором термннации транскрипции Ale.

Структура il объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 139 страницах машинописного текста и содержит 21 рисунка и 1 таблицу. Библиография включает в себя 154 названии, в том числе 6 русских и 148 иностранных.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 1. Получение и изучение мутации гроВ, придающих

устойчивость к антибиотикам - ингибиторам транскрипции

РНК-полнмераза является мишеныо действия антибиотиков рнфампнцина и стрептолндигина (Sippel & Hartmann, 1968, Schlief, 1969). Химическая структура и механизмы действия рнфампнцина п стрептолндигина различны. Рифампицин блокирует РНК-полимеразу после образования первой фосфодиофирнои связи на стадии абортивной инициации транскрипции за счет связывания с участком фермента, взаимодействующим с РНК-продуктом (Kessler et al., 1977). Стрептолидипж ннгибирует образование фосфодиэфирной связи при инициации и элонгации транскрипции, возможно за счет конкурентного связывания с субстратсвязмвающим центром фермента (Cassani et al., 1971). Локализация мутации, приводящих к устойчивости РНК-полпмеразы к действию рнфампнцина и стрептолндигина, и параллельное

исследование механизмов ннгибнроиания позволят промоделировать взаимное расположение центров связывания антибиотиков н функциональных центров (фермента. Кроме того, изучение локализации мутаций устойчивости к. широко используемому в клинике рнфамницину необходимо при разработке простых гестои для выявлении патогенных бактерий, устойчивых к действию антибиотика.

1. 1. Изучение Rif-pa/ioiia Р-субъедишщы

Рмфампицин образует прочный стехиометричсский комплексе I'llK-полимеразой, выделенной из чувствительных бактерий (Wehrli et al., 1969). РНК-полимераза, выделенная из мутантных клеток, способных расти на средах с рифампнцином, образует менее прочные комплексы с антибиотиком in vitro и и способна транскрибировать ДНК в присутствии антибиотика (Wehrli et al., 1969). Мутации устойчивости к рнфамшщнну

(Rif^ мутации) картируются в гене гроВ, кодирующем Р-субъединицу РНК-полимеразы (Errington et al., 1974). Считается, что мутации устойчивости определяют сайт связывании антибиотика на молекуле фермента. Большинство RifR мутаций локализуется в так называемом Rif-palioiie р-субъединицм, между 513-ым и 572-ым аминокислотными остатками (Ovchinnikov et al., 1983, Jin & Gross, 1988). Внутри Rif-района выделяют два кластера мутаций устойчивости к рифамницнну (Jin & Gross, 1988): кластер I (аминокислоты 510-533) и кластер И (аминокислоты 563-574).

Единственная локализования гроВ мутация , приводящая к устойчивой к действию стрептолндишна РНК-иолимеразе (Stl^ мутация), изменяет 545-ый и 546-ой аминокислотные остатки р-субьединицы Е. coli между двумя Rif-кластерами (Лиснцин и сотр., 1985). Перекрестной устойчивости между RifR и Stl^ мутациями не наблюдается (hvakura et al., 1973), что согласуется с различными механизмами действия этих двух антибиотиков.

3

ШГ КЛЛСТКГ I

Kif-K/IACTI')!'

Rif I Rif S {

О

п Y R

рр N Р

V FL V 0Q F Y

m

PL

(SIIR) I С OS YL

540

L

S I

I

560

f.'.C. KKFFGSSO^•';ü^•'MDClNNP^SFЛTIIKnRISЛLa^ЧЗGЬTRERЛГ,FEVRDVl^PTIIYGRVCPIETPEG^'NIGI.l^

St. .......................................I,...............................

B.Л. ................................L......................................

P.p. ...........................С...........................................

n.s. ...............T* • *Л* L.....L..............M......YS"-"M...............

M.J. .....T..............GL.....L........S.....L.......S* • • -M..............С

C.t. -O--SK....... . .f . VA - LT- • • - I,' •......fJ............SS • • • • I.........К

Т. ES- • -UIP-- -Vb-RT- • •TQIV-G-KL'Y.......GRT-S-KI* • I• • S • • •' • I • • -OS• • I • V- • -C

Рис. 1. Результаты случайного ЦПР-мутагспсза Rif-paiiona.

В нижней части рисунка представлены результаты сравнения участка послсдонагслыюсти Ц-субъедишщы Е.соП(Е.с.), представленном в однобукпеином коде, с соответствующими участками гомологичных субъсдшпщ l'llK-иолимсраэ Salmonella lypliimurium (S.t.), Buchnera aphidicola (H.a.), Pseudomonas putida (P.p.), Bacilus subtilis (D.s), Mycobacterium leprae (M.l.), Chlamydia trachomatis (C.t.) и хлоропластов табака('Г). Звездочки символизируют аминокислоты идентичные ß-субъединице Е. coli, дефисы означают делении. Над последовательностью E.coli прииедсны известные генетические изменения н Р-субъедшшце Е. coli, приводящие, или неприводящис к устойчивости к рифампнцнну. Полученные нами новые RifR мутации выделены жирным шрифтом.

Нами было проведено исследование, имевшее своей целью умучить распределение Rif^ nSlI^ мутаций внутри Rif-района клонированного гена /]юВ.

I. 1. 1. Получение точечных мутаций устойчивости к рифампицину к Rif-районе методом случайного ЦПР-мутагенеза

Для получения устойчивых к рифампицину мутациН в гене г poll мы воспольчовались методом случайного ЦПР-мутагенеза. Метод основан на амплификации изучаемого гена или его фрагмента Taq\ Д11К-иолимеразой п ходе ценной полимеразной реакции (ЦГ1Р). Отсутствие 3 -5' корректирующей активности у Taq\ ДНК-полимеразы приводи г к высокой частите возникновения случайны^ мутаций. По литературным данным (Zhang et al., 1992), применение этого метода позволяет получки, различные типы мутаций, равномерно распределенные но всей длине амплифицированного фрагмента ДНК.

RifR мутации получали в плазмиде pMKSe2, которая пксирессировала ген гроВ дикого типа. Rif-район амплифнциропали н составе С7«1 - П/нЛ фрагмента гена гроВ плазмвды pMKSe2. Лмплифицированный фрагмент клонировали в pMKSe2 и проводили трансформацию чувствительных бактерий. Сред» трансформантов, которые выросли на агаре с рнфамницином, были отобраны те, в которых устойчивость к рифамннцину определялась плазмидой. Затем была определена иуклеотидная последовательность Rif-района мутантных плазмндных генов гроВ, что позволило идентифицировать соответствующие аминокислотные замены в ¡Vcyoi,единице.

Среди 30 проанализированных клонов было обнаружено 22 различных RifR аллеля гроВ, 12 из которых в литературе не описаны (отмечены жирным шрифтом на Рис. 1). Большинство новых Rif^ мутаций представляли собой новые замены в положениях Р-субьсдннины,

n которых мутации устойчивости к рифаминцину уже были известны. Лишь две RifK мутации (G534D и S575F) изменяют ранее неописанные положения Р-субъединицы на левых границах кластеров 1 и II, соответственно.

1. 1.2. Дслсционно-пнсерционный мутагенез между Rif-кластерами и свойства мутантных генов rpnB in vivo

Участок грпВ между Rif-кластерами I и II не содержит отбираемых мутаций устойчивости к рифампнцииу. Это может свидетельствовать о том, что соответствующий сегмент Р-субъединицы между аминокислотами 535-562 не принимает участия в связывании антибиотика. Возможно также, что Rif^ мутации п этом участке гена приводят к летальному фенотипу и поэтому не могут быть отобраны простыми методами селекции. В лаборатории Р. Линдика было получено несколько точечных миссенс-мутаций в этом участке гроВ. Соответствующие мутантные РНК-полимеразы не были устойчивы к рифампицнну, но обладали измененной способностью терминировать транскрипцию (Landick el al., 1990В). Единственная локализованная мутацш устойчивости к стрептолнднгину также произошла в этом участке гроВ (Лнснцин и сотр.. 1985).

Для изучения роли сегмента р-субъедишщы между Rif-кластерами нами был получен ряд деленионно-инсерционных мутаций около 540-огс кодона гена гроВ дикого типа. Для этого в плазмиду рМKSe2 был введен уникальный сайт расщепления эндонуклеаэой рестрикции Smal между 539-ым и 540-ым кодонами структурного гена. Расщепленную Smal плазмиду использовали для получения небольших делений, обрабатывая а эк зонуклеазои Bal-3I с последующим лигиропанием. Продукты лигиронання трансформировали в чувствительный к рифампнцнн) штамм и отбирали клоны, способные расти на средах с низкой

Л 1540Р543)

Р А (535-542)

A(540L54S) L

ISAAVKEFFGSSQLSQFMDQtraPLSEITHKRRXSALGPGGL.TRERAGFEVRDVHPTHYGRVCPIETPEGPHIGLIt!.'

Rif-кластер I

Qprirg

Щ£-кластс|1

DS(SCI )

VLRL...WASI

Ü4 6

Рис. 2. Результаты делецпонно-инсерционного мутагенеза ltif-района.

Полученные п работе делеционные и инсерционные мутации представлены на фоне аминокислотной последовательности Rif-ранона ß-субъединицы Е. coli.

концентрацией рифампицина (20 мкг/мл). Было отобрано 5 различных делецнонных производных гроВ. Кроме того, обработанную Smal нлазмиду лнгировали с двуцепочечпыми олигодезоксирнбопуклсотидами различной длины и после трансформации отбирали клоны, которые сверхпродуцировали "полноразмерную" ß-субьеднннцу. Таким образом было получено три инсерцнонных мутанта, у которых ß-субьсдиница была удлинена на 5 (Í2PRIPG), 8(£2Н6) и 46 (Q46) аминокислот. Изменения в последовательности ß-субъединицы, соответствующие результатам определения нуклеотидных последовательностей у делеционно-инсерционных мутантов, представлены на Рис. 2.

Клетки, которые экспрессиропали ннсерционные варианты гроВ, оставались чувствительными к рнфамшишну. Неспособность роста на средах с рифамипцшюм не была связана с нефункциональностыо ß-субъединнц Í2PRIPG и Í2H6. так как соответствующие мутантные гены

гроВ комплементировали амбер-мутацию в хромосомной копни гена гроВ штамма A J 6207 (Kashlcv et al., 1990). Мутация £146 обладала доминантно летальным фенотипом и ее свойства in vivo не изучались.

Экспрессия всех функциональных делеционно-пнеерционных вариантов гена гроВ придавала чувствительному к стрептолидигину штамму Е. coli RTS522 (Schlief, 1969) способность роста на средах, которые содержали 100 мкг/мл стрептолидипша.

1. 1.3. Свойства делеционо-инсерционных мутантов in vitro

РНК-полимеразы, которые содержали ß-субъединпцы с генетическими изменениями между Rif-кластерами, были собраны из индивидуальных сверхпродуцированных н очищенных субъединиц и изучены in vitro. Мутантные ферменты были так же активны в стандартной системе транскрипции ДНК фага Т4 (Malik & Goldfarb, 1984) как и контрольная РНК-полимераза дикого типа и, в согласии с данными, полученными in vivo, были более устойчивы к действию стрсптолидигина,

8

чем контрольная РНК-полимераза. Ферменты, у которых делении затрагивали 543-546 положения Д-субъсдиницм, были устойчивы к-высоким концентрациям стрептолиднгина в реакции (>200 мкг/мл). Остальные делеционные, а также инсерционные мутанты обладали промежуточным уровнем устойчивости (полуингибрирование транскрипции при 50-100 мкг/мл стреитолидипша), Полуннгибирование транскрипции контрольной РНК-полимеразой дикого типа наступало при 10 мкг/мл стрептолндипша в реакции.

Свойства Q46 РНК-нолимеразы в системе транскрипции ДНК. фага Т4 изучить не удалось, т. к. она была неактивна н этом тесте. Однако, Q46 РНК-полимераза транскрибировала фрагмент ДНК, который содержал А1 промотор фага Т7 (Heumann et al., 1987), и была устойчива к действию стрептолидигнна » высоких концентрациях.

Несмотря на то, что отбор делеционных мутантов in vivo осуществляли на средах, которые содержали рифамшщин, все мутантныс РНК-полнмеразы (включая ОД6 ) ингибировались рифамиицином in vitro так же :к}х{>ектиино, как и контрольный фермент дикого типа.

1. 1.4. Иммобилизация QH6 полнмеразы на никелевом сорбенте * 1

Введение методами генной инженерии нескольких последовательных остатков гистидина в С- или N-конец белка позволяет иммобилизовать белок на сорбенте, содержащем ионы никеля (Hochuli et al., 1УК7). Недавно этот метод бы;! успешно применен для иммобилизации функциональной РНК-иолимеразы с удлиненной {У-субьединнцой, несущей на С-конце 6 гистидиновых остатков (KasJilcv el al., 1993А). Нами была исследована способность QHft РНК-полнмеразы, мутантная [)-

субъединица которой содержит шесть остатков гнетиднна между 539-ым и 540-ым аминокислотными остатками, связываться с никелевым сорбентом (NTA-agarose). Оказалось, что ЙНб РНК-полимераза не

только связывалась с никелевым сорбентом, но н сохраняла способность транскрибировать матрицу и ннгнбироваться рифампнцином п связанном состоянии.

Результаты случайного ЦПР-мутагснсза показывают перспективность применения этого метода для получения случайных мутаций в гсисгроВ. Результаты локализации Rif^ мутаций, полученных ЦПР-мутагснсзомб подтверждают разделение Rif-района на два кластера RifR мутаций, однако вывод о насыщении кластеров мутациями устойчивости к рифзпмнцину (Jin & Gross, 1988) преждевременный: почти половина полученных нами мутаций в литературе не описана. Результаты ннссрционно-дслсционного мутагенеза свидетельствуют с одной стороны об относительной несущсствснности сегмента ¡З-субъсдиницы между Rif-кластерами для устойчивости к рифампицину (и вообще для функции РНК-полимера зы), а с другой стороны определяют "Sll-сайт" внутри Rif-райоиа. Sll-eaiir Р-субъсдииицы расположен на поверхности фермента. Иммобилизация РНК-полнмсразм за эту се "грань" не влияет на способность фермента связывать рифампицин, ДНК и осуществлять транскрипцию.

* *

1. 2. Изучение N-концсвого сайта мутаций устойчивости к рифампицину и р-субъединнцс

Несколько лет назад п пашей лаборатории была получена необычная мутация устойчивости к рифампицину в гене гроВ. Мутация приводила к замене остатка валина в 146-ом положении Р-субъединицы на остаток фенилаланнна (Lisytsin et al., 1984). В последствии несколько групп интенсивно занимались локализацией различных RifR мутаций в гене гроВ, однако RifR мутации в N-концсвой части Р-субъединицы не были

10

обнаружены. Для выяснения роли N-концевой части ß-субъедшшцы н спязыиаиии рифампицнна нами был проведен сайт-специфический мутагенез кодона 146, а также других положений в эволюцнонно консервативном сегменте В ß-субъединицы (аминокислоты 135-148, Sweetseret al„ 1987).

1.2. 1. Исчерпывающий комбинаторный мутагенез консернатнниых положений сегмента В

Естественный сайт расщепления эндонуклеазой рестрикции Крп\ в 135-ом кодоне гроВ позволил нам провести мутагенез консервативных положении сегмента В путем амплификации Крп\ - С1а\ фрагмента структурного гена илазмиды pMKSe2. В разных опытах кодоны 136, 137 и 138; 139, 140 и 143; 144, 145 и 146, а также 144 и 145 были подвергнуты исчерпывающему комбинаторному мутагенезу (Reidhaar-Olsen & Sauer, 1988). Кроме того, отдельно мутагеиизировали кодон 146. Содержавшие мутации продукты ЦПР клонировали в pMKSe2 и после трансформации в чувствительный штамм отбирали трансформантов, способных расти на среде с низкой концентрацией рифампнцина (12,5 мкг/мл), у которых устойчивость к антибиотику определялась плазмидой.

Частота возникновения мутаций устойчивости к рнфампици.ну при одновременном мутагенезе кодонов 144-146 была в 10-20 раз выше чем при мутагенезе других положений сегменте В и равнялась 10*3,

В мутантных плазмидах определяли нуклеотндную последовательность сегмента В. В качестве контроля у мутантных генов также определяли последовательность Rif-района мутантных генов. Во всех случаях последовательность Rif-paiioHa не отличалась ог последовательности гроВ дикого типа (Ovchinnikov et al., 1981), а сегмент В содержал мутации. Замены аминокислотных остатков сегмента В мутантных (i-субьединнц, соответствующие результатам определения нуклеотидной последовательности у нескольких случайно выбранных

S.t. ........................

В.a. • «N» • • «X.......V........

P.P. "E................M----

T.m. • • *R» • • I• • • A• • • V"N* IW» i

B.s. * • *T* • • I • • • A........v-

Ы.1. • «EK» • • I.......

T. «NSL»«SIV-IVIN-IbQSP

Рис. 3. Мутации устойчивости к рифамшщпну n N-концевои части р-субъсдиннцм.

Р-субъсдиница изображена в виде темного отрезка в верхней части рисунка. Эволюционно-консервативные сегменты (Sweetser et al., 1987) обозначены штриховкой. В нижней части рисунка приведены результаты сравнения аминокислотной последовательности консервативного сегмента В (З-субъединицы E.coli с соответствующими сегментами гомологичных субъединиц бактериального и хлоропластного происхождения (обозначены как на Рис. 1; Т.т. - Thermatoga marítima). Выше представлены аминокислотные замены в полученных нами мутантах. Полученная Лненциным и сотр. (Lisytsin ct al., 1984) мутация V146F выделена жирным шрифтом.

мутантов приведены на Рис. 3.

1. 2. 2. Делецноно-иисерщюнныи мутагенез сегмента В

Ранее М. Кашлевым была получена инсерцня линкера между кодонамн 148 и 149 клонированного гена гроВ. Линкер длиной 8 пар оснований приводил к сбою рамки трансляции и содержал уникальный сайт расщепления рестриктазой В§111. Восстановление рамки трансляции привело к экспрессии мутантиой р-субъединицы с инсерциен четырех аминокислот между аминокислотами 148 и 149 (ПАРС!*). Кроме того, с помощью экзонуклеазы Ва1-31 была получена делеция четырех аминокислот Д( 148-152) (Рис. 3). Экспрессия мутантных генов не приводила к возникновению устойчивости к рифампицину. С2АРСЯ и Д(148-152) не комплементировали амбер мутацию в хромосомном гене гроВ штамма А16207 и были классифицированы как летальные.

1.2. 3. Свойства мутантных генов гроВ и РНК-полимераз

Уровень устойчивости .к рифампнцину клеток, которые экспресспронали функциональные гены гроВ с мутациями в сегменте В, определяли на чашках с линейным градиентом концентрации рифампицина (БгуЬакчЫ, 1952). Изменения в положениях 144-146 (3-субъедниицы приводили к относительно высоким уровням устойчивости: клетки, которые эксцрессировалн мутантные гены, росли на средах, содержавших 40-50 мкг/мл рифампицина. Остальные мутации поддерживали рост чувстипительных клеток лишь на низких концентрациях антибиотика (<30 мкг/мл). Контрольные клетки, которые пкспресспровалн |}-еубьеднницу дикого типа, полностью прекращали рост, когда концентрация рифампицина вереде превышала 8 мкг/мл.

Уровень устойчивости к рифампицину мутантных ферментов,

собранных in vitro из очищенных субъединиц, определяли в чувствительном тесте одноактной транскрипции фрагмента ДНК, который содержал AI промотор фага Т7. Мутантныс РНК-полимеразы V146F и V146W были высокоустойчивы к действию рифампицина: ферменты активно транскрибировала ДНК в присутствии 100 мкг/мл рифампицина. Мутации в других положениях сегмента В придавали соответствующим РНК-полимеразам лишь низкие уровни устойчивости (10-20% остаточной активности при 0,5 мкг/мл рифампицина), а РНК-полимеразы 1137К V138R и ilAFGR были также чувствительны к действию рифампицина как фермент дикого типа (полное подавление транскрипции в присутствии 0,5 мкг/мл рифампицина).

Полученные результаты показывают существование кластера RifR мутаций в эполюционно консервативном сегменте В ß-субъединнцы. Биохимический анализ мутантных РНК-полимераз свидетельствует о том, что остаток валина в 146-ом положении играет очень важную роль в связывании рифампицина и, возможно, непосредственно взаимодействует с гидрофобной молекулой антибиотика. В результате мутагенеза консервативных положений сегмента В были получены функциональные варианты гена гроВ. Следовательно, несмотря на высокую степень эволюционной консервативности, аминокислотные остатки в этих положениях несущественны для функции РНК-полимеразы.

Глава 2. Исследование вариабельных районов ß-субъсдиницы

Анализ первичных последовательностей нолнпептидов, гомологичных ß-субъедпнице РНК-полимеразы Escherichia coli, выявляет 9 эволюционно консервативных сегментов (Svvectser et al., 1987). Консервативные сегменты разделены нсконссрватипнымп вариабельными

14

районами. По-видимому, вариабельные районы несущественны для каталитической активности РНК-полимеразы. Возможно, они участвуют во взаимодействии с видоспецифичсскимн белковыми факторами, которые модулируют транскрипционную активность РНК-полимеразы в клетке.

Мы исследовали роль двух протяженных вариабельных районов ß-субъединицы с помощью делецнонного мутагенеза клонированного retía гроВ. Делеции в вариабельных районах гроВ получали на фоне точечной мутации устойчивости к рцфампицину в плазмнде р M К а 94 (Kashlev et al., 1990). Функциональность мутантных генов in vivo тестировали но способности клеток, которые экспрессировали делсшюнные варианты гроВ, расти на средах с рифампицином, а также по способности мутантных плазмид комплементиропать амбер-мутацию в хромосомном гене гроВ штамма AJ6207. В ряде случаев мутантные ферменты собирали in vitro in очищенных субъединиц, и изучали их свойства в биохимических тестах.

2. 1. Генетический и биохимический анализ делециониых мутапий п

левом вариабельном районе ß-субъединицы (аминокислоты 165-430)

N-концевой кластер мутаций устойчивости к рифампицину к центральный Rif-район ß-субъединнцы по-видимому сближены в четвертичной структуре РНК-полимеразы, совместно образуя центр связывания рифампнцина. Разделяющая эти два участка ß-субъсдиницы последовательность неоднозначна по своей структурно-функциональной роли. С одной стороны, она содержит консервативный сегмент С (аминокислоты 430-460), принимающий участие в связывании промоторной ДНК (Martin et al., 1992). С другой стороны, район ß-субъединицы Е. coli между аминокислотами 150 - 430 сильно днвергирован у грамм-отрицательных бактерий, частично отсутствует в ß-субъединицах РНК-полнмераз хлоропластов и грамм-положительных бактерий ü ке имеет какой-либо гомологии с соответствующими районами

ß-подобныч субъсднниц РНК-пол нмераз эукариотического происхождения.

2. I. 1. Получение мутантных генов гроВ и их свойства in vivo

Для делецнонного мутагенеза вариабельного района гроВ между кодонами 150-430 мы использовали полученную ранее М.Кашлевым инсершпо линкера с уникальным сайтом узнавания эндонуклеазон рестрикции Bant HI между 235 и 236 кодонами устойчивого к рифампицииу аллеля гроВ, клонированного на экепрессирующен плазмидс. Расщепленную Ват HI плазмиду обрабатывали Ва1-31 нуклеазои, лнгировалн и трансформировали в чувствительный к рифампшшну штамм Е. coli. Были отобраны трансформанты, которые сверхпродуцпровали ß-субъединицы с увеличенной подвижностью в полиакрилц,чпдных гелях с ДДС Na. Изменения в первичной последовательности ß-субъедитщ, соответствующие результатам определения нуклеотиднон последовательности у пяти отобранных делеционных мутаций, представлены на Рис. 4. Экспрессия мутантных генов придавала чувствительным клеткам способность расти на средах с низкой концентрацией рнфампицина (20 мкг/мл). Однако, мутантные плазмиды не комплементировалн амбер-мутацню в хромосомной копии гена г pol).

2. 1.2. Свойства мутантных РНК-полнмераз in vitro

Укороченные ß-субъеднннцы использовались для сборки мутантных РНК-полнмераз in vitro. Все мутантные ферменты активно транскрибировали ДНК фага Т4.

РНК-полимсразы, которые содержали ß-субъединицы с самыми крупными делениями Д(165-328) и Д(185-433), были изучены подробнее. Мутантные ферменты активно транскрибировали промоторные

фрагменты ДНК. При этом профиль абортивных продуктов транскрипции и скорость элонгации были такими же как у фермента дикого типа. Фермент Д( 165-328) имел слегка измененные терминационные свойства: он менее эффективно терминировал транскрипцию на р-независимом tR' терминаторе «fiara X. Мутантные полимеразы были чувствительны к действию /ас-рспрессора, факторов терминацин NusA и TRCF и элонгационныч факторов GreA и GreB. Таким образом, очень крупные дслецин в (З-субъединице оказывали незначительное влияние на функцию РНК-полцдеразы.

2. 1.3. Действие рифампнцина на мутантные РНК-полимеразы

Делешш и левом вариабельном могут повлиять на связывание рифамнуцина с РНК-полимеразои за счет нарушения взаимного расположения остатка валина 146 и центрального Rif-раиона |3-субьед|1Н1)цы. Для проверки этого предположения мутации Л( 165-328) и Л(]85-433) были получены на фоне аллеля гроВ дикого типа и собранные мутантные ферменты исследованы in vitro. Оказалось, что мутантные ферменты были так же чувствительны к действию рифамгшшша как и контрольный фермент дикого типа и, следовательно, центр связывания рифампицина остался неизмененным.

Рцс. 4. Левый вариабельным район Р-субъедшшцы .

Результаты делеционного мутагенеза клонированного гена гроВ представлены вместе с результатами сравнения аминокислотных последовательностей левых вариабельных районов Р-субъединиц из различных организмов. На рисунке так же указана мутация R368H, приводящая к РаГ-фенотипу.

2. 1.4. Действие фактора тсрминацни Л1с на мутантнмс РНК-

ноянмсразм

В ходе развития фага Т4 транскрипция ДНК зараженной клетки прекращается н клеточная РПК-полимераза транскрибирует лишь ДНК фага, которая содержит молифиниронаннос основание окснметнлцитознн (Snyder et al., 1976). Продукт фагового гена ale необходим для этого переключения. Недавно было показано, что Л1с является специфическим фактором терминации транскрипции цитоншеодержащей ДНК (Kashlcv el al., 1993).

В гене гроВ могут быть отобраны так называемые />я/-мутации, которые предотвращают действие Л1с in vivo (.Snyder & Jorisscn, 1988). В лаборатории JI. Снайдера (L. Snyder) была определена первичная последовательность одного из />я/-аллелсй rpofí. Оказалось, что замена остатка аргинина в 368-ом положении Р-субъеднницы на гистидин ответственна за появление РаГ-фенотипа. Проведенное нами исследование свойств R368H РНК-полимсразы показало, что мутантный фермент устойчив к действию Ale in vitro.

Так как />я/-мутацня произошла в леном париабсльном районе, мы решили выяснить РаГ фенотип делецноппых мутантов. Все мутантные нолимеразы с делениями в левом вариабельном районе Р-субъедипицы были устойчивы к действию Ale in vitro. Более того, клетки которые экспрсссиропалн аллель Д( 165-328) становились чувстпвтельнымн к

заражению А1с+ фагом Т4, ДНК которого содержала пемодифицнрованный цитозин (L. Snyder, частное сообщение) и,

следовательно, демонстрировали РаГ (J)CHOTiiri in vivo.

* » »

Получение функциональных полнмераз с очень крупными делениями в Р-субъедипнце доказывает незначнмость вариабельного района между

19

165-ой и 430-ой аминокислотами для сборки и каталитической активности РНК-нолимеразы in vitro. Полученные нами делецнонные производные RifR аллеля гроВ придают чуистинтельным клеткам способность роста па средах с рпфамшщином, что свидетельствует об их функциональности in vivo.

РНК-полимераза, выделенная из РаГ-клеток, устойчива к действию фактора Ale in vitro. С другой стороны, экспрессия производных гроИ с делецнямн в вариабельном районе придает клеткам РаГ-фенотип. Эти результаты доказывают, что механизм действия Ale in vivo действительно заключается в терминации транскрипции ДНК, которая содержит цптозин. По-видимому, иарнабельный район ß-субьединицы принимает участие и белок-белконом взаимодействии между РНК-нолнмеразой и (фактором терминации Ale, Не исключено, что этот район взаимодействует и с клеточными регуляторными факторами.

2. 2. Изучение правого вариабельного района ß-субьединицы

(аминокислоты 900-1050)

Пен и Гласс (Nene & Glass, 1983) сообщили о крупной делении и гене гроВ, которая не влияла на жизнеспособность клеток. Недавно эта деления была локализована и правом вариабельном районе р-субъединицы А(%7-1028, üorukliov et al., 1991, Рис. 5). Кроме того, в пашей лаборатории было получено несколько инсерционных мутаций в этом районе rpotí (Кашлен и сотр., 1989, Рис. 5). Для изучении правого вариабельного района мы применили делеционный мутагенез клонированного гена гроВ, а также ограниченный ирогсолю собранных in vitro мутантных РНК-полнмераз.

zn

1

2. 2. 1. Делсцпонный мутагенез правого вариабельного района

Для получения ограниченных делеции в правом вариабельном районе Р-субьедшшцм использовали полученную ранее М. Кашлевым плазмиду, которая экспрессиропала устойчивый к рифампицину аллель гроВ с imccpuueit Ihtf/iHI линкера в 989-ом кодоне. Плазмиду расщепляли flawiHl, обрабатывали экзонуклеазой Ва1-31, лигировали и после трансформации в чувствительный к рифампицину штамм отбирали клоны, которые в условиях индукции /ас-промотора сверхпродуцировали Р-жштептпды с увеличенной подвижностью в гелях с ДДС Na. Самая большая из полученных делеции удаляла из р-субъединицы 46 аминокислот ( Д937-983, Рис. 5). Мутантный ген гроВ комплементировал амбер-му ганию в хромосомном гене гроВ, и, следовательно, укороченная Р-субъедшщпа была функциональна in \'ivo.

2. 2. 2. Изучение ограниченного протеолиза мутантной РНК-полимеразы

С. Борухоиым в нашей лаборатории было показано, что в условиях ограниченной обработки РНК-полимеразы трипсином происходит преимущественное расщепление р-субъединицы в положениях 903 и 909 у левой границы правого вариабельного района (Рис. 5). При этом также происходит частичная деградация других субъединиц. Оказалось, что

Рис. 5. Правый вариабельный район р-субъединицы.

Результаты делеционно-инсерционного мутагенеза представлены вместе с данными по сравнению аминокислотных последовательностей правых вариабельных районов р-субъединиц из различных организмов. Стрелками указаны места атаки трипсином РНК-полимеразы дикого типа, а также мутантнмх РНК-полимераз £2989 и Д(980-1040).

генетические изменения н правом вариабельном районе сенсибилизируют мутантную Р-субъеднницу в составе РНК-полимеразы к атаке трипсином. При этом, протеолнз идет по новым лабильным сайтам поблизости от мест генетических изменений. Протеолнз £2989 РНК-полнмеразы, р-субъединица которой удлинена за счет инсериии 127 аминокислот между 989-м и 990-м кодонами гена грпВ, был изучен наиболее подробно. Были подобраны условия обработки трипсином, в которых происходило селективное и количественное расщепление удлиненной Р-субъединипы. При этом другие субъединицы оставались интактными. Полноту расщепления удлиненной Р-субъсднницы контролировали в иолиакриламидных гелях с ДДС Ыа с помощью окраски серебром и иммуноблоттингом с моноклональиымн антителами специфичными к н С-концсвым частям р-субъеднницы. Определение Ы-концсвой последовательности малого (С-концевого) протеолитического (фрагмента мутантной Р-субъединицы показало, что новый сайт атаки трипсином возник внутри инсерцин 12989, которая по-видимому образует петлю на поверхности молекулы фермента (Рис. 5).

2. 2. 3. Анализ транскрипционной активности £2989 РНК-полнмсразы,

обработанной трипсином

Обработанная трипсином 12989 РНК-полимераза, которая не содержала полноразмерной Р-субъединнцы, образовывала специфические комплексы с промоторными фрагментами ДНК. Эти комплексы были устойчивы к конкурентному вытеснснню полнанионами н чувствительны к присутствию в рекционной смеси рибонуклеоэидтрнфосфато». Анализ белковой компоненты промоторных комплексов в полиакриламндных гелях с ДДС Ыа показал наличие, наряду с р', О и а-субъединицами. триптических фрагментов Р-субъединицы и отсутствие полноратерной Р-субъеднннцы. Анализ продуктов транскрипции промоторного (фрагмента ДНК в денатурирующем полиакрнламидном геле не выявил отличий

23

между препаратами контрольной и обработанной трипсином ÍÍ989 PUK-

полимерачы.

2. 2. 4. Сборка активной £1989 РНК-полимеразы из триптическнх

фрагм е i и ов ß-суб ьедини цы

Обработанную трипсином Í2989 РНК-полимеразу, которая не содержа,);! нолноразмерной ß-субъединицы, денатурировали в присутствии 6 М гуаниднп-хлорнда. Индивидуальные субъединнцы (ß', о, а) и фрагменты ß-еубъединнцы разделяли гельфнльтраиией в присутствии 6 М гуанндина, смешивали и днализовалн против низкосолевого буфера в условиях, способствующих сборке РНК-полимеразь! из индивидуальных субъеднниц (Zalenskaya et al., 1990). В качестве контроля использовали препарат CÍ989 РНК-нолимеразы, который не обрабатывался трипсином. Конечные препараты использовались для определения полимеризационной активности » стандартном тесте транскрипции ДНК фага Т4. Оказалась, что сборка РНК-гюл!(!.;еразы происходила из триптических фрагментов мутантнон ß-субъедшшпы и интактных ß', а, и а субъеднниц и полученный таким

образом Цемент не отличается по своей активности от контроля.

♦ * *

Полученные данные позволяют охарактеризовать район гена г/юВ между колонами 937-1028 как несущественный для функции РНК-полимеразы in vivo. Изучение триптического расщепления РНК-полимераз с генетическими изменениями в правом вариабельном районе показало что: (i) этот район ß-субьедннпцы находится на поверхности РНК-нолимеразы; (¡i) ннтактный вариабельный район достаточно структурирован и недоступен для атаки трипсином в условия? ограниченного расщепления, но может быть сенсибилизирован генетическими изменениями (iii) непрерывность незначащего района

24

необязательна для функции и сборки РНК-полимсразы in vitro.

ВЫВОДЫ

1. Методом случайного ЦПР-мутагснеза фрагмента гена гроН мотнерждено разделение Rif-paiiona на дна кластера мутаций устойчивости к рнфпмпицнну. Доказано, что разнообразие мутаций устойчивости к рифамшщниу не исчерпано.

2. Получен новый класс мутаций устойчивости к стрсптолидигину, которые изменяют расстояние между кластерами мутаций устойчивости к рифампицину. Тем самым определен Stl-сайт внутри Rif-района СубьСДШПЩЫ.

3. Показано, что область Р-субъединицы существенная для связывания стснтолндигнна расположена на поверхности молекулы РНК-полимсразы. Впервые показана возможность иммобилизации белков на никелевом сорбенте за несколько гистндииопых остатков поеденных геиноинженернымн методами внутрь последовательности белка.

4. Подтверждено существование сайта мутаций устойчивости к рифамппцину в 146-ом положении р-субьединицы и продемонстрирован локальный характер этого N-концспого сайта.

5. Методом делецнонного мутагенеза доказано, что два протяженных пполюцнопно вариабельных района Р-субъеднницы несущественны для большинства функций РНК-полимсразы. В сумме эти функционально неважные районы составляют более 25% длины р-субьединицы.

6. Получены данные, которые указывают на участие левого париабсльного района р-субъсднпнцы во взаимодействии с фактором термннацни транскрипции Л1с.

7. Используя ограниченный протеолнз мутантных РНК-полимсразы показано, что непрерывность полнпептидной цепи в правом вариабельном районе р-субъсдпшщы не является необходимой для функции и сборки фермента in vitro. N- и С-концевыс триптнчсскнс фрагменты Р-

субъсдимнцы ведут себя независимо н возможно образуют отдельные структурные домены » составе РНК-полнмеразы.

СПИСОК РАБОТ, опубликованных автором по теме диссертации:

1. Borukhov, S-, Scverinov, К., Kashlev, М., Lcbcdev, Л., Bass, I., Rowland, G. С., Lim, P.-P., Glass, R. E„ Nikiforov, V., Gokllarb, A. (1991): Mapping of trypsin cleavage and antibody binding sites and delineation of a dispensable region in the [} subunit of Escherichia coli RN A polymerase. J. Biol. Chem., 266: 23921-23926.

2. Severinov, K., Mustaev, A., Kashlev, M., Borukhov, S., Nikiforov, V., Goldfarb, A. (1992). Dissection of the p subunit in the E. coli RNA polymerase into domains by proteolitic cleavage. J. Biol. Chem. 267:12813-12819.

3. Severinov, K„ Soushko, M„ Goldfarb, A., Nikiforov, V. (1993). Rif-region revisited: new RifR and Stl^ mutations in E. coli rpoB gene. J. Biol. Chem. 268: 14820-14825.

4. Kashlev, M., Martin, E., Polyakov, A., Severinov, K., Nikiforov, V., Goldfarb, A. (1993). Histidine-tagged RNA polymerase: dissection of the transcription cycle using immobilized enzyme. Gene, 9-14.

5. Ross, W., Gosink, К. K., Salomon, J., Igarashi, K., Zou, C., Ishichama, A., Severinov, K., Gourse, R. L. A third recognition element in prokaryotic promoters: site-specific DNA binding by the a subunit of RNA polymerase. Science, принято в печать.