Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Конформационный анализ Т2-ДНК в комплексах с РНК-полимеразой Е. coli

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Иванова, Наталья Николаевна, Пущино

^ российская академия наук институт биофизики клетки

На правах рукописи

Наталья Николаевна Иванова

Конформационный анализ Т2-ДНК в комплексах с РНК-полимеразой Е. сой.

Диссертаций жа соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель доктор биологических наук С. Г. Камзолова

Пущино, 1999

СОДЕРЖАНИЕ

СТР 4

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 6

ГЛАВА 1. ПРОЦЕСС ТРАНСКРИПЦИИ И ФАКТОРЫ ЕГО РЕГУЛЯЦИИ 6

1.1. Неспецифическое связывание и поиск промоторов б

1.2. Специфические ДНК-связывающие домены РНК-полимеразы Е. coli. 8

1.3. Участки промоторной ДНК, взаимодействующие с РНК-полимеразой 9

1.4. Образование закрытых промоторных комплексов 14

1.5. Образование открытых промоторных комплексов 15

1.6. Связывание инициирующих нуклеозидтрифосфатов и абортивный синтез РНК 18

1.7. Элонгация транскрипции 21 ГЛАВА 2. КОНФОРМАЦИОННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ Е. COLI И ДНК В ПРОЦЕССЕ ИНИЦИАЦИИ ТРАНСКРИПЦИИ.

2.1. Конформационные изменения РНК-полимеразы 23

2.2. Конформационные изменения промоторной ДНК в процессе инициации транскрипции 25

2.3. Особенности структуры и динамики промоторной ДНК. 26 2.4 Роль структуры и динамики ДНК в активации транскрипции белками-регуляторами 31 ГЛАВА 3. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ И ДИНАМИКИ ДНК ' 35 ЦЕЛЬ И ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ 42 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 43

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 50

Введение. Особенности структуры и функционирования ДНК Т-четных фагов 50

ГЛАВА I. МОДИФИКАЦИЯ ДНК Т-ЧЕТНЫХ ФАГОВ СПИНОВЫМИ МЕТКАМИ. 61

1.1. Модификация Т2-ДНК 2,2',6,6'-тетраметил-4-

бромоацетоксшшперидин-1 -оксидом (I). 61

1.2. Модификация Т2- и Т4-ДНКЛЧ2,2'Д5'-тетраметил-3-карбоксипирролидин-1 -оксил)-имидазолом (II). 67

1.3. Компьютерные программы, используемые для моделирования ЭПР-спектров спин-меченой ДНК 75

1.4. Моделирование ЭПР-спектров свободной имидазолидной спиновой метки 78

1.5. Моделирование ЭПР-спектров спин-меченой глюкозилированной ДНК фага Т4 85

1.6. Моделирование ЭПР-спектров спин-меченой

неглюкозилированной ДНК мутантного фага Т4 86

ГЛАВА 2. КОНФОРМАЦИОННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ПРОМОТОРНЫХ УЧАСТКОВ ГЛЮКОЗИЛИРОВАННОЙ ДНК ФАГА Т2, МОДИФИЦИРОВАННОГО СПИНОВОЙ МЕТКОЙ I, В ПРОЦЕССЕ ОБРАЗОВАНИЯ ОТКРЫТЫХ ПРОМОТОРНЫХ КОМПЛЕКСОВ С РНК-ПОЛИМЕРАЗОЙ Е. COLI.

2.1. Матричная активность Т2-ДНК, модифицированного радикалом I. 90

2.2. Локализация спин-меченых участков в промоторно-полимеразных комплексах. 94

2.3. Конформационные изменения Т2-ДНК, модифицированной бромацетатной спиновой меткой по легкоплавким участкам, в процессе образования открытых промоторных комплексов с РНК-полимеразой Е. coli. 97

2.4. Моделирование ЭПР-спектров Т2-ДНК, модифицированной по

легкоплавким участкам бромацетатной спиновой меткой, при комплексообразовании с РНК-полимеразой Е. coli.

ГЛАВА 3. КОНФОРМАЦИОННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ГЛЮКОЗИЛИРОВАННОЙ ДНК ФАГА 12, МОДИФИЦИРОВАННОЙ СПИНОВОЙ МЕТКОЙ Ii В ПРОЦЕССЕ ОБРАЗОВАНИЯ ОТКРЫТЫХ ПРОМОТОРНЫХ КОМПЛЕКСОВ С РНК-ПОЛИМЕРАЗОЙ Е. COLI.

3.1. Матричные свойства ДНК Т-четных фагов, модифицированной спиновой меткой И. 106

3.2. Изменения ЭПР-спектров Т2-ДНК, модифицированной имидазолидной спиновой меткой, в процессе комплексообразования с РНК-полимеразой Е. coli 107

3.3. Моделирование ЭПР-спектров Т2-ДНК, модифицированной имидазолидной спиновой меткой, в процессе комплексообразования с РНК-полимеразой 112

3.4. Масштабы конформационных изменений, регистрируемых с помощью нитроксильного радикала II при образовании открытых промоторных комплексов 116

3.5. Характер конформационных измеиений, регистрируемых с помощью нитроксильного радикала II при образовании открытых промоторных комплексов 121

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

128

ВЫВОДЫ

132

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

133

введение.

Процесс транскрипции, т. е. синтез РНК на матрице ДНК является одним из ключевых в экспрессии закодированной в ДНК генетической информации. Помимо важной роли в обеспечении функционирования биологических систем, исследование процесса транскрипции представляет особый интерес, поскольку РНК-полимеразы занимают совершенно особое место среди белков, способных связываться с ДНК. Как правило, ДНК-связывающиеся белки разделяют на специфические, которые имеют высокую константу связывания с определенными нуклеотидными последовательностями и поэтому способны узнавать определенные сайты в ДНК, и неспецифические, которые имеют одинаковое сродство к разным нуклеотидным последовательностям. РНК-полимеразы относятся к специфическим ДНК-связывающим белкам, поскольку они начинают синтез РНК с определенных участков ДНК, называемых промоторами. Однако они способны и к неспецифическому связыванию с ДНК, что имеет важное значение для ускорения поиска промоторов среди других последовательностей ДНК. Кроме того, в процессе элонгации транскрипции РНК-полимеразы в идеале должны вести себя как сайт-неспецифические полимеразы, т. е. осуществлять синтез комплементарной РНК вне зависимости от последовательности транскрибируемой ДНК, останавливаясь только в точках терминации [1]. Однако, пожалуй наиболее необычным свойством РНК-полимеразы является ее способность к узнаванию сильно варьирующих по структуре промсггорных участков. Эта особенность РНК-полимеразы отличает ее как от других сайт-специфических ДНК-связывающих белков, таких как рестриктазы, белки-активаторы и репрессоры и др., так и от некоторых просто организованных РНК-полимераз, таких как фаговые РНК-полимеразы. Возможность узнавания разнообразных промоторных последовательностей одним и тем же белком - РНК-полимеразой, без участия каких-либо дополнительных белков-регуляторов, позволяет предположить, что в этом случае фактором,

Ч

определяющим взаимодействие фермента с промотором, является не только пространственное положение некоторого набора нуклеотидов, образующих контакты с боковыми цепями аминокислот, но и какие физико-химические характеристики промоторной ДНК, в частности, ее динамика.

Известно, что в регуляции процесса транскрипции на разных его стадиях участвуют различные механизмы. Они включают в себя взаимодействие РНК-полимеразы с белковыми и низкомолекулярными регуляторами, регуляцию за счет изменения концентрации субстратов -нуклеозидтрифосфатов, а также регуляцию транскрипции за счет изменения конформации и динамики ДНК. Структура и динамика ДНК является универсальным регулирующим фактором транскрипции, который действует на всех стадиях транскрипционного цикла, от инициации до терминации, и на всех транскрибируемых последовательностях ДНК. Таким образом, исследование конформации и динамики ДНК имеет большое значение как для выяснения общих механизмов функционирования генетического аппарата клетки, так и для понимания основных закономерностей, регулирующих экспрессию генетической информации.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. ПРОЦЕСС ТРАНСКРИПЦИИ И ФАКТОРЫ ЕГО РЕГУЛЯЦИИ.

Как правило, процесс транскрипции подразделяют на инициацию, элонгацию и терминацию. Однако в последнее время предлагается различать в транскрипционном цикле две основные фазы: 1) активация и инициация синтеза РНК, 2) элонгация синтезируемой РНК, которая включает в себя терминацию и "редактирование" транскрипта (укорочение транскрипта и синтез с большей точностью) [2]. Как уже отмечалось выше, в первой фазе транскрипции РНК-полимераза ведет себя как сайт-специфический ДНК-связывающий белок, в то время как во второй фазе эта специфичность если и не исчезает, то сильно уменьшается. Вероятно, это связано с особенностями функциональной организации РНК-полимераз: как правило, домены, определяющие специфичность связывания с промоторными сайтами, не участвуют в составе активного центра, катализирующего образование фосфодиэфирной связи между рибонуклеотидами, который, в свою очередь, не содержит элементов, прямо задающих специфичность к той или иной последовательности ДНК.

1.1. Неспецифическое связывание и поиск промоторов.

В инициацию транскрипции входит поиск РНК-полимеразой промоторов, образование специфического комплекса, связывание инициирующих нуклеотидов и образование первой или небольшого числа начальных фосфодиэфирных связей. При поиске промоторов сначала происходит образование неспецифического комплекса РНК-полимеразы с любым случайым участком ДНК. Затем неспецифически связанная с ДНК РНК-полимераза претерпевает одномерную диффузию вдоль ДНК [3], что приводит к ускорению поиска промоторов РНК-полимеразой. По-видимому, процесс одномерной или линейной диффузии вдоль ДНК является общим для всех специфических ДНК-связывающих бежов [4], однако возможно,

£

что в случае РНК-полимеразы одномерная диффузия имеет некоторые особенности. К примеру, для фермента рестрикции EcoRI было показано, что диффузия в любом направлении вдоль ДНК является равновероятной, и в этом случае приход белка к его специфическому сайту связывания с любой стороны приводит к образованию специфического комплекса [5], как это и предполагалось в теории одномерной диффузии специфических ДНК-связывающих белков [6]. Однако, в литературе имеются данные о направленности этого процесса при поиске РНК-полимеразой промоторных участков на ДНК. Так, в случае взаимодействия РНК-полимеразы с промотором А1 фага Т7 было показано, что участки в downstream области влияют на эффективность поиска промотора ферментом, в то время как длина и последовательность upstream области не влияет на этот процесс [7].

Скорость линейной диффузии вдоль ДНК неодинакова на участках, имеющих разную последовательность. Так, для рестриктазы EcoRI было показано, что скольжение этого фермента вдоль ДНК замедляется на участках с необычной структурой (изгиб, триплекс), а также на участках ДНК, имеющих сходную последовательность с сайтами разрезания этого фермента [5]. По-видимому, скольжение РНК-полимеразы Е. coli также может замедляться на последовательностях ДНК, имеющих необычную структуру, и на участках, имеющих сходство с промоторными сайтами. К примеру, было показано, что РНК-полимераза дольше задерживается на АТ-богатых участках ДНК по сравнению с ДНК, имеющей случайную последовательность [3]. Кроме того, поиск промоторов происходит быстрее на релаксированной ДНК, чем на суперскрученной [3].

Таким образом, можно сделать вывод о том, что топология ДНК, ее вторичная структура и особенности динамики регулируют скорость поиска промоторов РНК-полимеразой Е. coli, хотя процесс скольжения фермента по ДНК требует дальнейшего более детального исследования. В частности, практически не изучены неспецифические комплексы РНК-полимеразы с ДНК. По аналогии с другими специфическими ДНК-связывающими

белками можно предположить, что эти комплексы стабилизируются преимущественно за счет электростатических взаимодействий белка с сахаро-фосфатным остовом ДНК, в то время как контакты боковых цепей белка с основаниями в неспецифических комплексах отсутствуют [8].

1.2. Специфические ДНК-связывающие домены РНК-полимеразы Е.

coli.

По ходу линейной диффузии РНК-полимеразы вдоль ДНК происходит поиск участков ДНК, комплементарных ДНК-связывающей поверхности фермента. В настоящее время идентифицированы 3 домена РНК-полимеразы Е. coli, образующих поверхность, взаимодействующую с ДНК промоторов. Два из них расположены на а-субъединице и взаимодействуют с -10 и -35 областями промоторов (домены 2.4 и 4.2, соответственно) [9], а третий домен расположен на а-субъединице и взаимодействует с UP-элементом промоторов (С-концевой домен) [10].

Помимо этих достаточно хорошо изученных участков, на РНК-полимеразе Е. coli могут существовать и другие ДНК-связывающие домены. В частности, было показано, что домен 2.5 на а-субъединице также находится в непосредственной близости от промоторной ДНК [11], а в случае одной из групп промоторов - так называемых "extended -10" промоторов - образует прямые контакты с основаниями мотива TGN в -12 области. Кроме того, имеются еще участки в ß- и ß'-субъединицах, образующие контакты с двухцепочечной ДНК впереди транскрипционного комплекса, и с ДНК-РНК гибридом внутри комплекса во время элонгации [12]. Данные о том, контактируют ли эти участки ß- и ß'-субъединиц с ДНК промоторов, в настоящее время отсутствуют.

Недавно были получены данные о структуре двух доменов РНК-полимеразы, взаимодействующих с ДНК - протеолитического фрагмента а-субъединицы, содержащего домен 2.4, который взаимодействует с -10 областью промоторов [9], а также С-концевого домена а-субъединицы,

г

который взаимодействуют с последовательностями ДНК в upstream области [13]. Домен 4.2 а-субъединицы имеет высокую степень гомологии с так называемыми мотивами helix-turn-helix специфических ДНК-связывающих белков, таких как Сго-репрессор, САР и др. Для этого домена была построена модель на базе имеющихся данных рентгеноструктурного анализа и ЯМР спектроскопии [14]. Хотя все известные ДНК-связывающие домены РНК-полимеразы могут связываться с ДНК независимо от остального бежа [9], информация о структуре ДНК-белковых комплексов, образуемых этими белковыми мотивами и узнаваемыми ими участками ДНК, в настоящее время отсутствует. Следует подчеркнуть, что в структуре РНК-полимеразы Е. coli могут присутствовать и другие ДНК-связывающие домены, поскольку мутации, оказывающие влияние на взаимодействие фермента с промоторами, были получены для всех субъединиц РНК-полимеразы. Однако, по крайней мере в некоторых случаях, нельзя исключить возможность опосредованного влияния мутаций на узнавание промоторов через изменение архитектуры фермента и, соответственно, изменение взаимного расположения известных ДНК-связывающих доменов.

1.3. Участки промоторной ДНК, взаимодействующие с РНК-полнмеразой.

По-видимому, при специфическом взаимодействии с промотором, РНК-полимераза Е. coli образует контакты одновременно с -35 и -10 областями промоторов. Эти консенсусные гексануклеотиды были выявлены при статистическом анализе промоторных последовательностей [15]. Некоторые авторы считают, что последовательность в -35 области является наиболее важной в первичном узнавании и оказывает наибольшее влияние на величину константы связывания РНК-полимеразы с промотором, а последовательность в -10 области имеет наибольшее значение для локального плавления ДНК вблизи точки старта транскрипции. В связи с

\

этим гексануклеотид в -35 области иногда называют "recognition domain", а в -10 - "melting domain" [16].

Степень консервативности отдельных нуклеотидов -10 и -35 областей и их функциональная значимость различаются для 12 консенсусных нуклеотидов, в частности, среди нуклеотидов в -10 области замена основания в -12 и в -11 положении, а в -35 области - замена основания в -34 и в -32 положении приводит к более заметному снижению промоторной активности [17]. Однако, следует отметить, что только для очень немногих промоторов был систематически исследован эффект замены нуклеотида в том или ином положении. В то же время, как будет обсуждаться далее, результаты, полученные при изучении одного промотора, не всегда могут быть перенесены на другие промоторы. В среднем, в каждом индивидуальном промоторе оказывается 6-7 консенсусных нуклеотидов из 12.

Для многих промоторов было показано, что мутации, приближающие последовательности -10 и -35 гексануклеотидов к их консенсусу, приводят к усилению мутантного промотора по сравнению с исходным, что указывает на функциональную значимость этих участков в определении промоторной активности [18]. В то же время консенсусные промоторы (Ptac и Рсоп) вовсе не являются самыми сильными. В частности, на примере трех синтетических промоторов, отличающихся по гексануклеотидам в -10 и -35 области, было показано, что по мере приближения последовательности этих гексануклеотидов к коисенсусному, увеличивается константа связывания РНК-полимеразы с промоторами [19]. Однако увеличение константы связывания не коррелирует с активностью этих промоторов in vivo. Оказалось, что для промотора с наименьшим соответствием консенсусу скорость-лимитирующей стадией является связывание РНК-полимеразы с промотором, в то время как для промоторов с большим соответствием консенсусу наблюдается остановка инициирующего комплекса на +6 - +12 позициях, т. е. скорость-лимитирующей стадией в этом случае является уход

do

РНК-полимеразы с промотора и переход в стадию элонгации [19]. Таким образом, помимо консенсусных гексануклеотидов, для функционирования промоторов имеют значение и другие участки промоторной ДНК, причем разные участки могут влиять на разные стадии процесса инициации транскрипции. Примером таких участков является спейсер между консенсусными гексануклеотидами и так называемые UP-элементы.

Консенсусные гексануклеотиды разделены спейсерным участком длиной 16-18 нуклеотидных пар. Оптимальной является длина спейсера в 17 нуклеотидных пар, отклонения от этого значения, как правило, приводят к уменьшению силы промот�