Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Доменная организация GreA- и GreB-факторов элонгации транскрипции E. coli

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кулиш, Дмитрий Михайлович, Москва

(г-: 1

ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ГЕНЕТИКИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

КУЛИШ Дмитрий Михайлович

ДОМЕННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ GreA- И GreB-ФАКТОРОБ ЭЛОНГАЦИИ

ТРАНСКРИПЦИИ Escherichia coli

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук (Специальность 03.00.03 - Молекулярная биология)

Научные руководители: доктор биологических наук,

профессор В.Г.Никифоров

кандидат биологических наук, С.И.Борухов

Москва 1998

ОГЛАВЛЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.................................................................. 1

1.1. Краткие сведения о транскрипционном цикле..........................................................................1

1.2. Современные представления о структуре

элонгационного комплекса........................................................................................................................................4

1.3. Реакция расщепления транскрипта..........................................................................................................7

1.4. Бактериальные транскриптрасщепляющие факторы................................................9

1.5. Эукариотические транскриптрасщепляющие факторы............................................17

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ......................................................................................................................22

2.1. Бактериальные штаммы и плазмиды....................................................................................................22

2.2. Молекулярное клонирование................................................................................................................................26

2.3. Электрофоретическое разделение нуклеиновых кислот и белков.... 27

2.4. Олигонуклеотиды и определение первичных последовательностей ДНК ....................................................................................................................................................................................................28

2.5. Получение плазмид..............................................................................................................................................................31

2.6. Выделение белков................................................................................................34

2.7. Транскрипция in vitro............................................................................................................................................................37

2.8. Тест на связывание гистидиновых Gre-факторов с РНК-полимеразой..................................................................................................................................................................38

2.9. Фотохимическое сшивание РНК-транскрипта в 9А-ТЭК........................................39

2.10. Картирование участков фотохимических сшивок............................................................40

2.11. Тест на активность GreA in vivo....................................................................................................................42

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ................................................................................................43

3.1. Методические основы транскрипционных анализов in vitro..............................43

3.2. Определение транскриптрасщепляющей активности гибридов доменов GreA и GreB в тупиковых комплексах......................................................................44

3.3. Сравнение связывания природных и гибридных

Gre-факторов с РНК-полимеразой..............................................................................................................46

3.4. Функции доменов вгеА..................................................................................................................................................48

3.5. Картирование района £Г-субьединицы, фотохимически сшивающегося с транскриптом одновременно с вге-факторами..........53

3.6. Функции положительно заряженного района [М-концевого

домена Сге-факторов........................................................................................................................................................56

3.7. Изучение свойств гибридного белка, состоящего из РНК-полимераз-связывающего домена СгеА и транскриптсвя-зывающего домена БИ-фактора......................................................................................................................66

ВЫВОДЫ ........................................................................................................................................................................................................74

СПИСОК РАБОТ, опубликованных автором по теме диссертации....................75

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ............................................................................................................................................................76

ПРИЛОЖЕНИЕ..........................................................................................................................................................................................89

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Краткие сведения о транскрипционном цикле.

ДНК-зависимая РНК-полимераза осуществляет первый этап передачи генетической информации - транскрипцию генов, в основе которой лежит синтез молекул РНК, комплементарных ДНК-матрице. Собственно синтез и простейшая регуляция транскрипции может осуществляться сравнительно простыми ферментами, такими как моносубьединичные РНК-полимеразы фагов. Однако, во всех клеточных живых организмах транскрипция осуществляется многосубьединичными РНК-полимеразами, сложность организации и функционирования которых обьясняется, видимо, чрезвычайной важностью надежности транскрипции и ее точной регуляции для жизнедеятельности организмов.

Многосубьединичные РНК-полимеразы бактерий, архебактерий и эукариот высококонсервативны, что предполагает их эволюционное родство, а также сходство механизмов действия и организации активных центров (Allison и сотр., 1985, Sweetser и сотр., 1987, Iwabe и сотр., 1991). Минимальный активный компонент всех многосубьединичных РНК-полимераз (т.н. кор-фермент) состоит из двух больших субьединиц (более 100 кДа) и одной или многих малых. Предполагается, что белковые участки, ответственные за наиболее важные и консервативные каталитические активности РНК-полимеразы, сосредоточены в больших субьединицах, в то время как малые выполняют, в основном, структурные и регуляторные функции (Sentenac, 1992). Большие субьединицы бактериальных РНК-полимераз называются Р'- и р-субьединицами. Их аналоги у эукариот называются субьединицами I и II.

Транскрипционный цикл условно разделяют на четыре основные стадии, каждая из которых, в свою очередь, состоит из многих элементарных этапов: 1) связывание РНК-полимеразы с промотором и его активация; 2) инициация цепи РНК; 3) элонгация цепи РНК; 4) терминация транскрипции.

Промоторный участок ДНК связывается и активируется субкомплексом РНК-полимеразы и специфических субьединиц, необходимых для инициации, называемом холо-ферментом (Gross, 1992). Под активацией промотора понимается расплетение ДНК с образованием транскрипционного пузыря и окончательная ориентация РНК-полимеразы на промоторе (von Hippel, 1992).

Следующая стадия, инициация, требует наличия субстратов РНК-полимеразы, нуклеозидтрифосфатов, и заключается в образовании первых нескольких звеньев цепи РНК. Первый нуклеотид входит в состав цепи, сохраняя свою трифосфатную группу, а последующие присоединяются к 3'-гидроксильной группе предыдущего с высвобождением пирофосфата. Реакция образования фосфодиэфирной связи обратима: пирофосфат в высокой концентрации приводит к процессивному укорочению цепи РНК (пирофосфоролизу) с образованием свободных нуклеозидтрифосфатов (Rozovskaya и сотр., 1982). Инициация цепи РНК может также осуществляться с ди-, три- и тетрануклеотидов, комплементарных матричной цепи ДНК вблизи от точки начала транскрипции (Grachev и сотр., 1984).

На стадии инициации РНК-продукт связан с тройным элонгационным комплексом (ДНК/РНК-полимераза/РНК) непрочно и транскрипты длиной от 2 до 9 нуклеотидов могут диссоциировать из комплекса без диссоциации РНК-полимеразы с промотора. Этот процесс получил название абортивной инициации (von Hippel, 1992). В ходе абортивной инициации положение РНК-полимеразы на промоторе практически не меняется.

Завершение стадии инициации приводит к формированию стабильного тройного элонгационного комплекса, который разрушается лишь при терминации. Он характеризуется диссоциацией а-фактора и значительно более компактной, чем у инициаторного комплекса, конформацией (Gross, 1992, Uptain и сотр., 1997). Элонгационный комплекс, в отличии от инициаторного, устойчив к низким температурам (+4°С) и высоким концентрациям соли (Rhodes & Chamberlin, 1974).

Несмотря на высокую процессивность РНК-полимеразы на стадии элонгации, фермент движется по ДНК-матрице с непостоянной скоростью. На некоторых участках матрицы наблюдаются длительные задержки в продвижении РНК-полимеразы, так называемые паузы. Паузы могут совпадать с участками выраженной вторичной структуры в РНК и ДНК (Das, 1993, Landick, 1997). На некоторых матрицах РНК-полимераза прекращает транскрипцию даже при высокой концентрации нуклеозидтрифосфатов, при этом образуются очень стабильные элонгационные комплексы, неспособные ни к элонгации, ни к терминации. Такие элонгационные комплексы были названы "тупиковыми". Причины образования и свойства тупиковых комплексов будут подробно обсуждаться в главе 1.2.

На определенных участках ДНК-матрицы - терминаторах - РНК-транскрипт спонтанно диссоциирует из элонгационного комплекса. Механизм терминации, приводящий к эффективному разрушению элонгационного комплекса, высоко стабильного на других участках ДНК, до сих пор остается неизвестным (Yager & von Hippel Р.Н., 1991, Nudler и сотр., 1995). Терминаторы разделяются на зависимые и независимые от факторов терминации (Das, 1993). Особенностью фактор-независимой терминации является образование вторичной структуры (шпильки) вблизи З'-конца РНК при транскрипции некоторых палиндромных последовательностей ДНК-матрицы. За палиндромной

последовательностью следует кластер адениловых остатков. Терминация может происходить также под действием белковых факторов терминации при отсутствии каких-либо специфических структур в ДНК или РНК (Das, 1993). Диссоциация РНК из тройного комплекса при терминации не приводит к мгновенной диссоциации РНК-полимеразы от ДНК-матрицы. Имеются данные, что а-субьединица вытесняет ДНК из комплекса с РНК-полимеразой и восстанавливает холо-фермент снова способный к инициации (Yager & von Hippel, 1991).

В процессе транскрипции РНК-полимераза взаимодействует с множеством вспомогательных и регуляторных факторов, действующих на каждой стадии транскрипции и зачастую определяющих транскрипцию того или иного гена (Das, 1993, Struhl, 1995). В настоящее время становится

очевидно, что механизмы действия многих регуляторных факторов также консервативны, несмотря на отсутствие гомологии между факторами. Консервативность проявляется в этом случае в схожести взаимодействий факторов с различными компонентами элонгационного комплекса. Наиболее изученным примером подобной ситуации является активация транскрипции. Большое количество различных белковых факторов прокариот и эукариот активируют транскрипцию по одному и тому же механизму - связываясь одним доменом с ДНК-матрицей вблизи промотора, а другим - со специфическим районом РНК-полимеразы, удерживая ее таким образом вблизи точки начала транскрипции (Busby & Ebright, 1997, Ptashne & Gann 1997). Другим примером является связывание РНК-полимеразой промотора, которое осуществляется у прокариот с помощью о-субьединиц, а у эукариот - так называемым преинициаторным комплексом. Эти белковые комплексы принципиально различны по структуре, но схожи по функциям - они осуществляют связывание промотора и диссоциируют из транскрипционного комплекса при переходе на стадию элонгации (Buratowski, 1997).

На протяжении долгого времени считалось, что регуляция транскрипции осуществляется на стадии инициации. Однако, на сегодняшний день, накоплен достаточный экспериментальный материал, указывающий на существование регуляторных механизмов, действующих на стадии элонгации (Bentley, 1995). Ярким примером подобного механизма является запирание и мгновенная активация промотора теплового шока эукариот посредством инактивации и реактивации элонгационного комплекса (Lis & Wu, 1994). Таким образом, изучение структуры и свойств тройного элонгационного комплекса и его взаимодействия с разнообразными белковыми факторами в ходе элонгации становится все более важной задачей современной молекулярной биологии.

1.2. Современные представления о структуре элонгационного комплекса.

Моделирование структуры и основных характеристик тройного элонгационного комплекса было значительно стимулировано методическими находками последних лет (Levin & Chamberlin, 1987, Krümmel & Chamberlin, 1991, Kashlev и сотр., 1991, Borukhov и сотр., 1993а, Nudler и сотр., 1994, 1996, Komissarova & Kashlev, 19976) и вызвало оживленную дискуссию (Yager & von Hippel, 1991, Chamberlin, 1992, Das, 1993, Nudler и сотр., 1997, Komissarova & Kashlev, 19976, Uptain и сотр., 1997).

Основными постулатами современной модели элонгационного комплекса (Landick, 1997, Nudler и сотр., 1997, Komissarova & Kashlev, 19976) являются неподвижность частей РНК-полимеразы друг относительно друга и подвижность РНК-полимеразы относительно ДНК и РНК. Высокая стабильность элонгационного комплекса и процессивность транскрипции обеспечивается взаимодействиями между РНК-полимеразой и ДНК, причем ДНК-РНК гибрид не важен для стабильности тройного комплекса (Nudler и сотр., 1996), а РНК-полимераза способна смещаться вдоль ДНК и РНК не теряя контакта с ними (Komissarova & Kashlev, 1997а, Reeder & Hawley, 1996, Samkurashvili & Luse, 1996), но с перемещением (расплетанием и заплетанием) РНК-ДНК гибрида и транскрипционного пузыря. Привлекательной моделью процессивных взаимодействий подобного рода является образование белкового кольца вокруг ДНК по примеру ДНК-полимеразы (Nudler и сотр., 1996, Polyakov и сотр., 1996).

Таким образом, считается, что в ходе транскрипции элонгационный комплекс находится в равновесии между активной и смещенной конформациями. В активной конформации активный центр РНК-полимеразы ассоциирован с З'-концом транскрипта и способен производить удлинение цепи РНК. В смещенной конформации РНК-полимеразы сдвинута относительно ДНК и РНК в направлении от З'-конца транскрипта. Каталитический центр РНК-полимеразы теряет при этом контакт с

Активная конформация

Тупиковая конформация

Расщепление

* тра!¡скрипта

Рисунок 1.1. Современные взгляды на механизм образования тупиковых комплексов и расщепления транскрипта.

Схематически изображены компоненты элонгационного комплекса: РНК-полимераза, ДНК, транскрипционный пузырь и ДНК-РНК гибрид. Магний соответствует каталитическому центру РНК-полимеразы. (А) В активной конформации каталитический центр связан с -концом транскрипта. (Б) Смещение РНК-полимеразы вдоль ДНК и РНК приводит к потере контакта между 3х-концом транскрипта и активным центром и, следовательно, к инактивации элонгационного комплекса. Восстановление активности возможно при обратном смещении (осцилляциях) РНК-полимеразы вдоль РНК и ДНК. Тупиковая конформация образуется при значительном сдвиге равновесия подобных осцилляций в сторону смещенной конформации. (В) Расщепление транскрипта позволяет активному центру восстановить контакт с новообразованным 3*-концом транскрипта и способность к элонгации.

З'-концом, что исключает возможность дальнейшей элонгации. Константа равновесия между активной и смещенной конформациями специфична для каждого элонгационного комплекса и определяется многими физико-химическими параметрами. Показано, что стабильность РНК-ДНК гибрида чрезвычайно важна для латеральной стабильности элонгационного комплекса и слабый гибрид является одной из причин смещения РНК-полимеразы (Nudler и сотр., 1997). В общем виде постулируется, что РНК-полимераза в элонгационном комплексе стремится занять такое положение на ДНК-матрице, в котором сумма энергий образования ДНК-РНК гибрида и двухцепочечной ДНК по краям транскрипционного пузыря минимальна. При наличии нескольких положений с одинаковой энергией РНК-полимераза осциллирует между ними (Komissarova & Kashlev, 19976).

При значительном сдвиге равновесия осцилляций в сторону смещенной конформации, РНК-полимераза пребывает в неактивном состоянии большую часть времени; такой элонгационный комплекс неспособен продолжать элонгацию (Arndt & Chamberlin, 1991, Borukhov и сотр., 1993а, Nudler и сотр., 1994, Samkurashvili & Luse 1996). Подобные элонгационные комплексы называются тупиковыми (рис. 1.1. Б). Необходимо отметить, что тупиковый комплекс сохраняет высокую стабильность и неспособен к терминации. Следовательно, транскрипция гена, на котором образовался тупиковый комплекс, невозможна. Таким образом, управляемое образование тупиковых комплексов может иметь регуляторный потенциал in vivo, в то время как неуправляемое их образование может быть летально.

Единственный известный на сегодня способ восстановления активности тупикового комплекса - это расщепление транскрипта (рис. 1.1. В). После расщепления активный центр восстанавливает контакт с вновь образованным З'-концом транскрипта и способен к продолжению процессивной транскрипции.

1.3. Реакция расщепления транскрипта.

Реакция расщепления транскрипта была открыта при изучении элонгационных комплексов РНК-полимеразы E.coli (Surrat и сотр., 1991) и впоследствии продемонстрирована в элонгационных комплексах практически всех известных РНК-полимераз (Hagler & Shuman, 1993, Rudd и сотр., 1994, Whitehall и сотр., 1994, Tschochner, 1996, Sastry и Ross, 1997). Высокая консервативность реакции расщепления транскрипта позволяет предположить ее важную биологическую роль. Одним из биологических механизмов, включающих в себя расщепление транскрипта, может являтся предотвращение образования или управление образованием тупиковых комплексов. Другим механизмом, способным обьяснить важную биологическую роль расщепления транскрипта, является контроль точности тра�