Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение клеточной функции транскрипционного фактора E. coli GreA

ВАК РФ 03.00.28, Биоинформатика

Автореферат диссертации по теме "Изучение клеточной функции транскрипционного фактора E. coli GreA"

На правах рукописи

Степанова Екатерина Викторовна

Изучение клеточной функции транскрипционного фактора Е. coli GreA

03.00.28 - биоинформатика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

003485994

Москва-2009

003485994

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов Учреждения Российской академии наук Института биологии гена РАН и лаборатории механизмов регуляции транскрипции Департамента клеточной биологии Университета медицины и стоматологии штата Нью-Джерси (Стратфорд, США).

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор биологических наук Северинов Константин Викторович

кандидат биологических наук Борухов Сергей Ионович

доктор биологических наук Кульбачинский Андрей Владимирович

УРАН Институт молекулярной генетики РАН

кандидат биологических наук Родионов Дмитрий Александрович

УРАН Институт проблем передачи информации им. А.А. Харкевича РАН

Учреждение Российской академии наук Институт Молекулярной Биологии им. Энгельгардта РАН

Защита диссертации состоится 25 декабря 2009 года в 13 часов 00 мин. на заседании Диссертационного совета Д002.077.02 при Учреждении Российской академии наук Институте проблем передачи информации им. A.A. Харкевича РАН по адресу: г. Москва, ГСП-4, Большой Каретный переулок, 19, стр.1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института проблем передачи информации им. А.А. Харкевича РАН

Автореферат разослан «i9 » ноября 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, Доктор биологических наук

Г. И. Рожкова

Список сокращений

РНКП РНК-полимераза

дт дикий тип

ПРП полноразмерный РНК-продукт

нт нуклеотид

ЭК элонгационный комплекс

NTP рибонуклеотидтрифосфаты

АТР аденозинтрифосфат

СТР цитидинтрифосфат

GTP гуанозинтрифосфат

UTP уридинтрифосфат

ПААГ полиакриламидный гель

э/ф электрофорез

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Изучение механизмов регуляции экспрессии генов -одна из бурно развивающихся областей молекулярной биологии и генетики. РНК-полимераза (РНКП) - ключевой фермент первого этапа экспрессии генов - транскрипции ДНК. Активность РНКП регулируется большим количеством транскрипционных факторов, координирующих экпрессию генов в клетке на различных стадиях роста и в ответ на изменения внешней среды. Недавно охарактеризована особая группа факторов, связывающихся во вторичном канале РНКП и действующих на её активный центр. К настоящему моменту известно шесть факторов этой группы: пять прокариотических: GreA, GreB, Gfhl, Rnk, DksA и TraR, и эукариотический фактор TFIIS. Кроме того, известно что антибиотики микроцин J25 и стрептолидигин также действуют через вторичный канал РНКП. Среди факторов этой группы большой интерес вызывают GreA, GreB и TFIIS, которые стимулируют транскрипт-расщепляющую (РНказную) активность РНКП. Считается, что за счёт этой активности Gre/TFIIS факторы способствуют повышению точности транскрипции, преодолению транскрипционных пауз и перманентных остановок РНКП, а также ускоряют переход от стадии инициации транскрипции к элонгации.

За два десятилетия изучения бактериальных транскрипционных факторов GreA и GreB накоплен большой объём данных: получены рентгеновские структуры высокого разрешения, охарактеризована биохимическая активность белков in vitro, изучено их связывание с РНКП и установлен механизм катализа расщепления РНК этими факторами. Однако остается невыясненой клеточная функция факторов Gre. Очевидно, наличие транскрипт-расщепляющей активности в клетке способствует выживанию, так как гены gre широко распространены в геномах бактерий, а белковые последовательности факторов высоко консервативны. Хотя делеция генов gre А и gre В не является летальной для Е. coli, клетки штамма &greA\greB отличаются от штамма дикого типа замедленным ростом, повышенной чувствительностью к соли, ионам тяжёлых металлов, а также температурочувствительностью. Эти и другие данные указывают на то, что Gre факторы необходимы для выживания клетки в условиях стресса.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось изучение регуляторной роли GreA in vivo. Для достижения цели были поставлены следующие задачи: 1) выявить гены, транскрипция которых регулируется фактором GreA, 2) определить основные клеточные процессы, в которые вовлечены гены, регулируемые GreA, 3) установить, какая стадия транскрипции этих генов регулируется GreA, 4) охарактеризовать механизм регуляции транскрипции фактором GreA

Научная новизна и практическая ценность работы. В работе получен полный список генов, регулируемых GreA. Эти данные могут быть использованы для детального изучения механизма регуляции транскрипции GreA на промоторах этих генов.

Впервые показано, что основной стадией транскрипции, регулируемой GreA in vivo, является инициация, а не элонгация, как считалось ранее.

Впервые показано образование тупиковых инициаторных комплексов РНКП (перманентной остановки транскрипции) вблизи промотора in vivo и in vitro. Комплексы могут быть использованы как модель в дальнейших исследованиях взаимодействий РНКП с промоторной и начальной транскрибируемой областями генов, которые приведут к глубокому пониманию механизма инициации транскрипции в целом.

Впервые показано, что одной из основных функций GreA в клетке является предотвращение перманентных остановок транскрипции вблизи промотора.

Изучение активности транскрипт-расщепляющих факторов in vivo, проделанное в данной работе, расширяет представления о процессах регуляции экспрессии генов в клетке и в дальнейшем поможет в разработке новых видов антибиотиков, связывающихся во вторичном канале РНКП и ингибирующих её каталитическую активность.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на Biannual Meeting on Transcription Termination (2008, Mountain Lake, VA, USA); E-coli Aliance Conference (2008, Cambridge, London, UK); IV Съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, Россия, 2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 3 статьи в научных журналах, входящих в перечень ведущих рецензируемых научных журналов ВАК, и тезисы международных конференций в количестве 3.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 132 страницах, содержит 27 рисунков и 4 таблицы, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 95 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ КРАТКИЙ ОБЗОР

В процессе элонгации движение РНКП по ДНК-матрице не является непрерывным. Монотонное продвижение вперед чередуется с остановками различной продолжительности [Herbert K.M. et al. 2006, Cell], Во время паузы РНКП вместе с каталитическим центром может сместиться на несколько (2-20) нт назад относительно З'-конца РНК [Komissarova N.. Kashlev М, 1997, J. Biol. Chem.]. Фермент теряет способность самостоятельно совместить каталитический центр с 3'-концом транскрипта, который попадает во вторичный канал [Borukhov S. et al., 1991, J. Biol. Chem.]. Факторы GreA и GreB стимулиуют реакцию расщепления транскрипта РНКП. GreA стимулируюет гидролиз 2-3 нуклеотидов (нт) с З'-конца РНК, a GreB способен расщеплять РНК фрагменты длиной 2-18 нт, в зависимости от степени обратного смещения РНКП в транскрипционных комплексах. За счет реакции гидролиза РНК в каталитическом центре РНКП образуется новый 3'-конец транскрипта, и транскрипция возобновляется.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Для выяснения клеточной функции GreA проводился анализ экспрессионных профилей на микрочипах и экспрессии генов репортерных белков, серию реакций транскрипции in vitro и реакций достройки праймеров, и перманганатный футпринтинг in vitro и in vivo. Для компьютерной обработки данных микрочипов использовались программы Cytoscape 2.6.0, BinGO 2.3, Pathway Tools 13.0 и базу данных Ecid. Для транскрипции in vitro использовались линейные матрицы, полученные ПЦР. Для перманганатного футпринтинга использовались плазмиды, содержащие последовательности исследуемых промоторов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Сравнение экспрессионных профилей клеток Е. coli в отсутствие и присутствии GreA. Ген greA присутствует в геномах практически всех групп бактерий (исключениями являются отделы Aquificae, Fusobacteria, Dictyoglomi и Cyanobacíeriá), а распространенность гена greB ограничена отделом Proteobacteria. Поэтому на данном этапе работы мы исследовали клеточную функцию более распространенного транскрипционного фактора GreA

Для исследования роли GreA в клетке мы выбрали метод экспрессионных микрочипов как наиболее системный подход. С помощью микрочипов мы сравнили профили экспрессии штамма Е. coli с делецией обоих генов gre (AgreAAgreB), несущего плазмиду для экспрессии greA (AgreAAgreB+pGreA) или контрольную плазмиду (AgreAAgreB+pTrc99A). По имеющимся данным, GreA является стрессовым фактором, экспрессия которого возрастает в ответ на внешние сигналы. Таким образом, условия суперэкспрессии GreA имитируют условия стрессовых воздействий на клетку. С помощью иммуноблотинга мы показали, что количество GreA в клетках штамма AgreAAgreB+pGreA после индукции 0.05 шМ IPTG в 10 раз превышает количество белка в клетках штамма AgreB с хромосомной экспрессией GreA

По результатам анализа данных, полученных с использованием микрочипов, плазмидная экспрессия GreA приводит к изменению уровня мРНК 282 генов (в 1,7 и более раз) по сравнению с контрольным штаммом AgreAAgreB+pTrc99A. При этом экспрессия 103 генов увеличивается, а 179 генов - уменьшается.

Для подтверждения специфичности наблюдаемых эффектов для суперпродукции GreA мы профили экспрессиии клеткок, несущих плазмиду для экспресии каталитически неактивного мутанта GreA (GreA-D41E) или контрольную плазмиду. В этом эксперименте мы не наблюдали значимых изменений уровня экспрессии генов.

2. Проверка данных, полученных с использованием экспрессионных микрочипов, с помощью реакции достройки праймеров. Для подтверждения данных микрочипов мы проверили изменения уровня мРНК 14 GreA-зависимых генов с помощью реакции достройки праймеров.

Для этого были приготовлены препараты тотальной РНК, выделенной из клеток всех исследованных штаммов Е. coli: greAAgreB+p G re А, AgreAAgreB+pGreAD41E и AgreAAgreB+pTrc99A. Одинаковые количества тотальной РНК использовались как матрицы в обратнотраскриптазной реакции с радиоактивно меченным праймером, комплементарным мРНК выбранного гена Е. coli. В каждом из экспериментов контролем служила реакция достройки праймера, комплементарного мРНК генов отрА или рра, уровень экспрессии которых не зависел от GreA.

Результаты анализа реакций достройки праймера подтвердили данные анализа экспрессионных микрочипов.

3. Функциональный анализ данных экспрессионных микрочипов с помощью компьютерной обработки. Мы провели функциональный анализ данных микрочипов с помощью программы Cytoscape 2.6.0. С помощью встроенного расширения BinGO 2.3 мы провели статистическую обработку перепредставленности функциональных подсистем среди генов положительно и отрицательно регулируемых GreA. Среди положительно регулируемых генов статистически достоверно перепредставлены гены, продукты которых участвуют в процессе трансляции. Индукция GreA приводит к стимуляции экспрессии 50% генов, продукты которых участвуют в трансляции (Рис. 1). Кроме того, перепредставлены гены, продукты которых участвуют в процессах транскрипции, синтеза СТР и синтеза АТР АТР-синтетазой (Рис. 1).

Среди генов, отрицательно регулируемых GreA, перепредставлены гены, участвующие в ключевых стадиях процесса получения энергии за счет катаболизма органических веществ: транспорте и катаболизме углеводов и спиртов, гликолизе и цикле Кребса. В присутствии GreA снижается уровень экспрессии 25% генов, участвующих в получении энергии за счет окисления органических веществ.

К наблюдаемым изменениям уровня экспрессии генов может приводить как прямое действие GreA (за счет непосредственной регуляции транскрипции генов) так и опосредованное (за счет изменения распределения компонентов транскрипционной машинерии, факторов транскрипции или их лигандов).

биологические процессы клеточные процессы__ч

клеточнЦй метаболизм первдан/й ме;аб0лизм

6

су а .6 ' •• ■ пХ-1 « ь ¿гА б

■ -Л ■ ■ I

|Цйме

метаболизм нт ;

локал!

и л

Сг

й.Г)

получение энергии *Ст;

Ъ" ъ

метабол изумакромолекул

экспрессия генов биосинтез

ЗС5 ф

синтез ^кромолекул

регуляция

г

>л

и

т-ш

метаболизм белка

60 ^ А

л

6

тра^сляц! транспорт протонов АТР-синтетазой

Т

-•! V л л

ответ ка-стресс

■6

процесс1тг163рРНК , регуляци^трансляции транскрипция

сборка комплексов молекул ответ на низкие температуры ответ на антибиотики

Рис. 1 Онтологическая иерархия биологических процессов, статистически значимо перепредставленных среди генов, положительно регулируемых вгеА. Каждому классу процессов соответствует круг. Классы более высокого уровня иерархии расположены сверху, более низкого - снизу. Стрелки направлены от классов более высокого уровня к классам низших уровней. Размер кругов пропорционален количеству генов, участвующих в данном классе биологических процессов. Цвет кругов соответствует уровню значимости перепредставленности данного класса процессов среди ОгеА-зависимых генов.

Чтобы определить гены, экспрессию которых вгеА регулирует напрямую, мы проанализировали, какие из Оге-зависимых генов регулируются вгеА независимо, а какие гены согласованно регулируются на уровне тарснкрипции другими факторами, по данным ранее опубликованных работ.

В программе Су1овсаре 2.6.0 мы изобразили взаимодействия на основе согласованной регуляции транскрипции (всего 2138 взаимодействий) между ОгеА-зависимыми генами (Рис. 2). По данным базы ЕЫс1, более 80% положительно регулируемых вгеА генов не ко-регулируются с другими ОгеА-зависимыми генами на уровне траснкрипции. К этим 80% относятся практически все гены трансляции и рибосомных белков (53 гена), гены синтеза липополисахаридов (6 генов), гены компонентов АТР-синтетазы (3 гена) и 10 ^охарактеризованных генов. Отсутствие ко-регуляторных взаимодействий с другими Оге-зависимыми генами вероятно свидетельствует о том, что вгеА, оказывает прямой эффект на экспрессию генов этой группы.

Более половины (91 ген) отрицательно регулируемых вгеА генов объединены большим количеством ко-регуляторных взаимодействий (всего 2122). В эту группу входят практически все гены катаболизма и транспорта углеводов и спиртов, включая гены белков гликолиза, цикла Кребса и пентозофосфатного шунта. Среди генов, не регулируемых согласованно на уровне транскрипции, большую часть составляют ^охарактеризованные гены. Кроме того, в эту группу входят гены протеолиза, гены шоперонов и гены факторов стресса.

влияние GreA, количество раз

Рис. 2 Взаимодействия между генами, регулируемыми GreA, по данным базы Ecid. Во внутреннем круге расположены 120 генов согласованно регулируемых на уровне транскрипции (2138 ко-регуляторных взаимодействия, обозначенных серыми линиями). В линии между двумя кругами расположены 10 GreA-зависимых факторов транскрипции, образующих 269 взаимодействий на основе согласованной регуляции. В наружном круге расположены 162 гена, не регулируемых согласованно с другими GreA-зависимыми генами на уровне транскрипции. Значки генов окрашены в соответствии с влиянием GreA на экспрессию (легенда снизу).

Мы отдельно проанализировали гены транскрипционных факторов, которые согласованно регулируются на уровне транскрипции с другими Gre-зависимыми генами. GreA положительно регулирует транскрипцию генов fis и pdhR, и отрицательно - транскрипцию генов gcvR, betl, lldR, narL, bolA, hns и gatS. Мы не выявили корреляцию между изменением экспрессии этих факторов в присутствии GreA и наблюдаемым изменением уровня транскрипции согласованно регулируемых GreA-зависимых генов. Возможно, GreA оказывает эффект на транскрипцию согласованно регулируемой группы генов опосредовано, за счет изменения пула метаболитов или изменения числа

молекул РНКП и рибосом, доступных для транскрипции и трансляции, соответственно.

С помощью программы Pathway Tools 13.0 мы проанализировали расположение GreA-зависмых генов на хромосоме Е. coli. Мы обнаружили, что регуляция транскрипции GreA согласуется с оперонной организацией генов. GreA одинаково влияет (положительно или отрицательно) на транскрипцию всех генов, находящихся в одном опероне. Для большинства оперонов величина влияния GreA уменьшается от первого гена оперона к последнему. Это указывает на то, что GreA регулирует стадию инициации транскрипции, а не элонгации, как считалось ранее.

Исходя из результатов компьютерного анализа, мы выбрали для дальнейшего исследования несколько положительно регулируемых генов, на которые GreA, предположительно оказывает прямой эффект. Среди них гены рибосомных белков rpsJ, rplY, rpsB, rplN, ген основного мембранного липопротеина 1рр и ген неохарактеризованного белка наружной мембраны отрХ. С помощью ПЦР мы получили ДНК-матрицы, содержащие промоторы этих генов, чтобы изучить механизм прямого действия GreA на инициацию транскрипции.

4. Анализ механизма регуляции фактором GreA с помощью in vitro транскрипции. ДНК-матрицы, содержащие последовательность промоторов выбранных генов (примерно ±100 нт относительно старта транскрипции), содержали также последовательность транскрипционного терминатора tR2 (длиной 115 нт). Реакция транскрипции проводилась в отсутствие и в присутствии GreA. В качестве контроля, вместо GreA в реакцию добавляли каталитически неактивный мутант GreA-D41E или ортолог GreA из Т. thermophilus, неспособный связываться с РНКП Е. coli.

При транскрипции на выбранных промоторных ДНК происходит образование как продуктов терминации на tR2, так и полноразмерных РНК-продуктов (Рис. 3). Эффективность терминации варьировала на разных промоторах, от 30% до 60%.

Мы наблюдали увеличение количества полноразмерного транскрипта в 1.6-6 раз в присутствии GreA, но не в присутствии контрольных белков (Рис. 3). Таким образом, GreA стимулирует транскрипцию на выбранных промоторах как in vivo, так и в очищенной системе in vitro. Эти данные подтверждают предположение о прямой регуляции транскрипции GreA, сделанное на основе биоинформатического анализа.

Чтобы изучить механизм стимуляции транскрипции фактором GreA, мы проанализировали короткие РНК-продукты реакции. В отсутствие GreA дикого типа (дт) на всех исследованных промоторах происходит накопление коротких РНК длиной 4-14 нт, в то время как в присутствии фактора эти РНК исчезают и появляются лишь продукты реакции расщепления транскрипта.

Рис. 3. Стимулирующий эффект GreA на транскрипцию in vitro с промоторов генов rplN, отрХ, rpsJ, Ipp, rplY и rpsB. Приведены авторадиограммы РНК-продуктов, разделенных в 10% денатурирующем ПААГ. В столбцах слева указаны названия использованных матриц (по названию генов), в скобках, позиции концов ПЦР-фрагментов относительно точки старта транскрипции. Длина продуктов терминации (Т) или полноразмерных РНК-продуктов (ПРП) указана стрелками справа. Реакции проведены в присутствии 100 цМ N TP и [а32Р]СТР, в течение 5 и 15 минут инкубации, в отсутствие и в присутствии 4 цМ GreA факторов, как указано в подписи сверху. Величина влияния Gre-факторов на количество РНК-продукта (Т+ПРП), синтезированного за 15 минут по сравнению с контролем указана снизу.

Итак, GreA стимулирует накопление полноразмерного транскрипта и подавляет образование коротких РНК. При этом для стимуляции необходима каталитическая активность фактора, поскольку ни GreA Т. thermophilus, ни GreA-D41E не обладают подобным свойством. На исследованных промоторах GreA стимулирует транскрипцию, когда РНКП синтезирует РНК длиной до 14 нт и должна освободить промотор. Таким образом, за счет транскрипт-расщепляющей активности GreA стимулирует переход от инициации к элонгации.

5. Характеристика коротких РНК-продуктов транскрипции на промоторах генов отрХ и rplN. Мы предположили два механизма образования коротких РНК, синтезируемых при транскрипции in vitro в отсутствие GreA. В первом случае, происходит ранняя терминация синтеза, приводящая к распаду транскрипционного комплекса, с высвобождением всех его компонентов. Во втором случае, происходит остановка синтеза, при которой транскрипционный комплекс, содержащий короткие РНК, сохраняет целостность. Чтобы выяснить находятся короткие РНК в растворе или входят в состав транскрипционных комплексов, мы детального проанализировали короткие РНК, образующиеся при транскрипции in vitro в отсутствие GreA с промоторов отрХ и rplN (Рис. 4). Для удобства анализа мы использовали укороченные ДНК-матрицы, не содержащие терминатора.

При транскрипции на РrplN в присутствии GreA или GreB (Рис. 4А дорожки 1, 2), происходит накопление полноразмерного РНК-продукта (77 нт). В отсутствие Gre-факторов, практически не образуется полноразмерного РНК-продукта. Вместо этого образуются короткие РНК длиной 9-14 нт (дорожка 3).

+1 +5(6-7 +13 5' -p'ppGCCCUCGAUAUGG - 3'

GreA/GreB

после очистки на Сефадекс С-50

+1 +7+8+9 +12 5' -pppUUA*GGA*CUUA*UU-3'

GreA/GreB

первая вторая отмывка отмывка

1- | I 1

_ til II

123456789

. полноразмерныи 1 РНК-продукт

РНК-продукты ■остановленных комлексов

5'-продукты расщепления

полноразмерныи РНК-продукт

РНК-продукты

неактивных

комлсксов

I 5'-продукты Iрасщепления

I З'-продукты 3 [ расщепления < 21

1 2 3 4 5 6 7 8 9 Ю 11

Рис. 4 Анализ РНК-продуктов in vitro транскрипции на РrplN и РотрХ. Приведены авторадиограммы 23% денатурирующего ПААГ. Полноразмерные РНК, короткие РНК и продукты расщепления указаны стрелками справа. На диаграммах сверху указаны позиции расщепления РНК факторами GreA и GreB. Звездочками (*) обозначены позиции 32Р в РНК. (А) Продукты реакции транскрипции на РrplN, полученные до и после очистки на гель-фильтрации, после инкубации в отсутствие и в присутствии 4 цМ GreA или 0.4 цМ GreB и/или 100 цМ NTP, как указано в подписи над авторадиограммой. (Б) Продукты реакции транскрипции на РотрХ с 6xHis-PHKTI, иммобилизованной на Ni-NTA агарозе. Последовательность отмывок неактивных комплексов буфером до и после инкубации с 4 цМ GreA или 0.4 jtM GreB, в отсутствие и в присутствии 100 дМ NTP, указана в в подписи над авторадиограммой. Присутствие остаточных количеств GreA и GreB после отмывки отмечено (+). В каждую дорожку нанесена 1/12 исходной суспензии агарозного сорбента. Приведённые данные показывают, что на обеих промоторных ДНК образуются неактивные транскрипционные комплексы, которые находятся в состоянии обратного смещения и в которых происходит расщепление транскрипта и реактивация под действием Gre факторов.

Мы нанесли реакционную смесь, в которую не добавлялись Gre-факторы, на гель-фильтрационную колонку с Сефадексом G-50. На колонке задерживаются вещества малого размера: ионы металлов, NTP и РНК-продукты (длиной менее 70 нт), не связанные с РНКП. При очистке на колонке оказалось, что короткие РНК длиной 9-14 нт не задерживаются на колонке (дорожка 4). Это означает что эти РНК стабильно связаны с РНКП и находятся в составе транскрипционного комплекса.

При исследовании коротких продуктов транскрипции на промоторе гена отрХ (РотрХ) мы использовали методику иммобилизованной реакции транскрипции in vitro. Реакция проводилась с помощью РНКП, связанной через 6xHis якорь с Ni-NTA агарозным сорбентом (Рис. 4Б). После проведения реакции мы анализировали по отдельности продукты реакции, находящиеся в растворе, и продукты, связанные с сорбентом (т.е. с РНКП). После отмывки сорбента, (Рис. 4Б, дорожка 1), РНК длиной 11-13 нт оставались прочно связаны РНКП в транскрипционном комплексе (дорожка 2).

Продолжительная инкубация с субстратами не приводила к удлинению коротких РНК, образованных на РrplN (Рис. 4А, дорожка 5) и РотрХ (Рис. 4Б, дорожка 9). Таким образом, в самом начале транскрипции на РrplN и РотрХ образуются неактивные комплексы, содержащие короткие РНК-продукты.

Как уже упоминалось, субстратом для Gre факторов являются транскрипционные комплексы в состоянии обратного смещения. Так как расщепление и синтез происходят в одном каталитическом центре РНКП, то по длине продуктов расщепления можно судить о положении каталитического центра относительно 3'-конца коротких РНК. Чтобы выяснить, на сколько нуклеотидов смещена РНКП в неактивных транскрипционных комплексах, образованных на РrplN и РотрХ, мы обрабатывали очищенные комплексы Gre-факторами. Во всех экспериментах помимо GreA, стимулирующего гидролиз 23 нт с 3'-конца РНК, мы также использовали GreB, который способен расщеплять РНК фрагменты длиной 2-18 нт, в зависимости от степени обратного смещения РНКП в транскрипционных комплексах.

При добавлении GreB к неактивным комплексам, образованным на РrplN, транскрипты длиной 9-14 нт исчезали и образовывались видимые на авторадиограмме меченные 5'-концевые продукты реакции расщепления размером 4-6 нт (Рис. 4А, дорожка 8). Таким образом, в неактивных комплексах, образованных на РrplN, расщепление транскрипта происходит в 810 нт от З'-конца РНК (Рис. 4А, диаграмма сверху). Этим объясняется низкая эффективность расщепления коротких РНК фактором GreA (дорожка 6), не способным стимулировать гидролиз РНК более, чем в трех нт от З'-конца.

Добавление Gre-факторов к очищенным комплексам, образованным на VompX, приводило к образованию продуктов расщепления длиной 2-9 нт (Рис. 4Б, дорожки 4, 5). После отмывки сорбента (т.е. в комплексе с РНКП) оставались связаны 5'-концевые продукты длиной 7-9 нт, находящиеся в составе транскрипционного комплекса (дорожки 7, 8). Из этого следует, что расщепление коротких РНК, образованных на РотрХ, происходит в 2-4 нт от

-И-

3'-конца (Рис. 4Б, диаграмма сверху). В отличие от РrplN, на РотрХ GreA и GreB одинаково эффективно стимулируют расщепление транскрипта.

В присутствии субстратов 5'-концевые продукты реакции расщепления в комплексах, образованных на РrplN и VompX, удлинялись (Рис. 4А, дорожки 7, 9; Рис. 4Б, дорожки 10, 11), из чего следует, что Gre-факторы реактивируют неактивные комплексы, образованные на этих ДНК, за счет транскрипт-расщепляющей активности.

Таким образом, мы установили, что на двух промоторах, положительно регулируемых Gre-факторами, на начальных стадиях синтеза РНК образуются неактивные, или тупиковые, комплексы, неспособные возобновить синтез даже при продолжительной инкубации с субстратами. Эти тупиковые комплексы могут быть активированы за счет реакции расщепления транскрипта Gre-факторами. При транскрипции на хорошо изученных промоторах Т7А1 и T5N25 мы не наблюдали ни образования подобных комплексов, ни стимуляции транскрипции Gre-факторами. Следовательно, образование тупиковых комплексов на стадии инициации транскрипции может являться общим свойством промоторов, положительно регулируемых GreA.

6. Характеристика тупиковых комплексов, образованных на РrplN и Pomp. Для выяснения механизма активации транскрипции фактором GreA на промоторах генов rplN и отрХ in vitro и in vivo мы использовали перманганатный футпринтинг. Этот метод позволяет определить положение транскрипционного пузыря, а соответственно и РНКП, на ДНК по положению чувствительных к перманганату неспаренных остатков тиминов.

Мы сконструировали плазмиды, содержащие промоторы генов rplN и отрХ, pES-rplN и pES-ompX, которые можно использовать для футпринтинга в клетке и проанализировали перманганатный футпринт тупиковых комплексов, образуемый на этих матрицах in vitro. Детекцию модифицированных остатков тимина проводили с помощью реакции достройки радиоактивно меченного праймера.

Чтобы оценить, как изменяется положение РНКП на промоторе при переходе от ранних этапов инициации к образованию тупиковых комплексов мы сравнили футпринты комплексов, образуемых на PrplN и РотрХ in vitro в отсутствие и присутствии субстратов.

Как видно из Рис. 5, футпринт открытого промоторного комплекса на промоторе гена rplN не детектируется на нематричной цепи и имеет очень слабый сигнал на матричной цепи ДНК (дорожка 3). Это связано с нестабильностью открытого комплекса на pES -rplN, что является свойством всех известных промоторов рибосомных генов.

Чтобы проанализировать начальные стадии инициации PrplN, мы получили КМпС>4 футпринт транскрипционного комплекса, содержащего РНК-продукт длиной 7 нт (3K-7G), образуемого в присутствии GTP, СТР и UTP. Остатки Т модифицировались в позициях -10, -8, -7, +8 на матричной цепи (Рис. 5, данные показаны на верхней диаграмме), на нематричной - в позициях -6, +5, +9 (Рис. 5, дорожки 4-6, верхняя диаграмма). В присутствии GreA дт или GreA-D41E футпринт 3K-7G не изменялся (Рис. 5, дорожки 4-6).

Появление дополнительной радиоактивной зоны, соответствующей позиции +11, а также множественные зоны, соответствующие одной позиции Т, являются артефактами детекции с помощью реакции достройки праймера ДНК-полимеразой, которая останавливается в двух нт до и после поврежденного остатка Т.

рЕ55-фЛ/ нематричная цепь ДНК _

П + .....КМпО.

сси I +

- ш -та/

КУЧ'

МР

вгеА

-20 -Ю +1 +Ю 420

тао<заасттсоссасаао оо „„„. ° тасссстаааааттсстс

рррОСССОСв

ШЖИМв ________________ атаат«:с(х£ссс

I» +9 АТССТТСААОСССТОТТ •

«31 |*+11 ТАСеААСТТССССАСЛА»А««АСССССС(3(3(;деСТАТАССССТАААААТТеСТе

* | ррХсспсряше&в

ТТТТГ1Т 8 9 ' Р" растепление (Зге

Рис. 5. КМп04 футпринт тупиковых комплексов, образованных на плазмидной матрице рЕ5-грШ. Приведена авторадиограмма 5'-меченных продуктов реакции достройки праймера на модифицированной КМ11О4 нематричной цепи ДНК рЕЪ-грШ, разделенных в 6% секвенирующем ПААГ. Комплексы образованы в отсутствие или присутствии 100 р.М субстратов и 4 цМ вгеА дт или 0геА-041Е. Позиции расщепления отмечены кругами справа. На диаграммах справа указаны позиции высокой (большие круги) и низкой (маленькие круги) чувствительности оснований Т к КМпС>4 в обеих ДНК-цепях ЭК-70 (белые круги) и тупиковых комплексов (ЭК-140, черные круги). Старт транскрипции (4-1) указан прямоугольной стрелкой. Позиции расщепления РНК вге-факторами и Ре2+-индуцированными гидроксил-радикалами указаны стрелками снизу. Эти результаты показывают, что в тупиковых комплексах на рЕ%-грШ передняя граница транскрипционного пузыря смещена назад на 5-8 нт по отношению к З'-концу РНК.

Наконец, мы провели анализ футпринтов тупиковых комплексов, которые образуются на рЕ4,-грШ в присутствии четырех ЫТР и в отсутствие ОгеА (см Рис 4А, дорожка 3). Остатки Т в этих комплексах интенсивно модифицируются в позиции +5 и частично в позиции -6 (Рис. 5, дорожка 7). Таким образом, по сравнению с ЭК-7С, удлинение транскрипта до 9-14 нт приводит к сокращению размера транскрипционного пузыря в тупиковых комплексах и к сдвигу его передней границы назад на 4-5 нт (Рис. 5, верхняя и нижняя диаграммы).

В присутствии ОгеА дт, но не мутанта ОгеА-Б41Е, зоны футпринта значительно ослабевают (дорожки 8, 9), так как РНКП переходит от стадии инициации к стадии элонгации и освобождает промотор.

В отличие от ¥грШ, на промоторе гена отрХ образуется стабильный открытый комплекс в отсутствие субстратов (Рис. 6, дорожка 6). Остатки Т в позициях +3, от -2 до -5, -9 и -11 на матричной цепи ДНК и Т в позициях +9, +8, +2, +1, -6, -8 и -10, на нематричной цепи чувствительны к КМп04 (Рис. 6, верхняя диаграмма).

При добавлении всех четырех ЫТР в отсутствие ОгеА на РотрХ образуются тупиковые комплексы, содержащие транскрипт длиной 12-14 нт (см. Рис. 4Б). Это приводит к изменению набора зон чувствительности Т: на матричной цепи появляются зоны в положениях от -5 до -2, а в положениях -

11 и -9, на нематричной цепи появляются зоны в положениях +8, +9, исчезают -10, -8 и -6 (Рис. 6, дорожка 5). Следовательно, переход от открытого комплекса на рЕБ-отрХ к неактивному (тупиковому) комплексу сопровождается сокращением размера транскрипционного пузыря, приблизительно от 14 до 12 пн, при этом границы пузыря сдвигаются вперед: передняя - от +1/+3 до +9/+10, задняя - от -10/-11 до -2 (Рис. 6, диаграммы). Таким образом, по отношению к З'-концу РНК передняя граница пузыря смещена назад на 2-4 нт в сторону старта транскрипции. Аналогичные результаты были получены при картировании положения транскрипционного пузыря на линейных матрицах РгрШ и РотрХ. Как и в случае тупиковых комплексов на рЕЪ-грШ, в присутствии ОгеА интенсивность футпринта сильно снижается (Рис. 6, дорожка 4), а в присутствии мутанта ОгеАВ41Е набор зон чувствительности такой же, как и без ОгеА (дорожка 3). рЕЭ-отрХматричная цепь ДНК

- + КЛ1п04

- - + \г

- - + - УТР

- - /и- - ОгеА

• -5/-2 ®-11

-20

+1

+Ю

420

рапцаппение СЗгеА и (5геВ

образованных на плазмидной

СССАТТААТТТТТ5АТАоА1ТоААААавоА0САСТТАТТТСААТСАСАТТТ0АС ССВТААТТАААААСТАОдОдаа^^^1|5дд^ССТСААТААДСТТАОТОТАААСТС

г-*

СССАТТААТТТТТеАТАТАТТТ^^М^^^ФАТТТСААТСАСАТТТОАС вССТААТТАААААСТАТАТААА»*««(3дд^сс,15,(;ддТАААСТТАСТОТАААСТС

> 1 5 4 5 <Г

Рис. 6 КМ1Ю4 фугпринт тупиковых комплексов, матрице рЕ§-отрХ. Приведена авторадиограмма 5'-меченных продуктов реакции достройки праймера на модифицированной КМпС>4 матричной цепи рЕ§-отрХ, разделенных в 6% секвенирующем ПААГ. Комплексы образованы в отсутствие или присутствии 100 цМ ЫТР, и 4 цМ ОгеА дг или 0геА-041Е. Позиции расщепления отмечены кругами справа. На диаграммах справа указаны позиции высокой (большие круги) и низкой (маленькие круги) чувствительности Т к КМ11О4 в обеих ДНК-цепях открытых (серые круги) и тупиковых комплексах (ЭК-12и, черные круги). Старт транскрипции (+1) указан прямоугольной стрелкой. Позиции расщепления РНК Оге-факторами указаны стрелкой снизу. Результаты анализа показывают, что в тупиковых комплексах на рЕ8-отрХ передняя граница транскрипционного пузыря смещена назад на 2-4 нт по отношению к З'-концу РНК.

Таким образом, на стадии инициации на промоторах генов грШ и отрХ в отсутствие транскрипт-расщепляющих факторов РНКП образует вблизи промоторных участков тупиковые комплексы, неспособные образовывать полноразмерный РНК-продукт. Перманентная остановка транскрипции наступает, когда РНКП синтезирует транскрипт длиной 9-14 нт и смещается в обратном направлении на 5-8 нт на РгрШ и 2-4 нт на РотрХ. Оге-факторы предотвращают образование тупиковых комплексов за счет стимуляции расщепления РНК на начальной стадии обратного смещения, и способствуют продуктивному удлинению коротких транскриптов. Тупиковые комплексы, образованные на ?отрХ, могут быть реактивированы и ОгеА, и ОгеВ. Тупиковые комплексы на РгрШ реактивируются только ОгеВ, поскольку они находятся в состоянии глубокого смещения, и для их реактивации необходимо

отщепление фрагмента РНК длиной 5-8 нт. Такой тип расщепления свойственен только GreB.

7. Перманганатный футпринт тупиковых комплексов in vivo. Чтобы подтвердить образование тупиковых комплексов на промоторах генов rpIN и отрХ in vivo, мы провели анализ КМп04-футпринтов РНКП на этих промоторах в клетках штаммов Е. coli AgreAAgreB и AgreB, несущих плазмиды pES-rp/N и pES-отрХ.

Как следует из Рис. 7, на плазмидах, выделенных из клеток AgreAAgreB (дорожки 3, 7, 9), виден интенсивный футпринт, характерный для тупиковых комплексов. Футпринт на нематричной цепи pES-rpIN повторял футпринт, полученный для тупиковых комплексов in vitro с основной зоной чувствительности Т в позиции +5 (дорожка 3). Аналогично, футпринт на матричной цепи pES-отрХ повторял футпринт тупиковых комплексов, полученный на pES-отрХ in vitro, и соответствовал позициям Т —5/—2 (дорожка 7). При наличии GreA в клетках (плазмиды были выделенны из клеток AgreB), футпринт исчезал на обеих матрицах (дорожки 4 и 8).

Рис. 7. КМпС>4 футпринт тупиковых комплексов, образованных in vivo на плазмидных матрицах pES-отрХ и pES -rpIN. Приведены авторадиограммы 5'-меченных продуктов реакции достройки праймера на модифицированной КМпС>4 нематричной цепи pES-rp/N и матричной цепи pES-отрХ, 5/ 2 разделенных в 6% секвенирующем ПААГ. Позиции Т, чувствительные к KMnOí в тупиковых комплексах (черные круги) и в открытых комплексах (серые круги), отмечены справа. Эти результаты показывают что в отсутствие Gre-факгоров тупиковые комплексы с характерным футпринтом образуются in vivo на обоих промоторах.

Чтобы определить, насколько эти результаты отражают способность

GreA подавлять образование тупиковых комплексов, а не его способность дестабилизировать открытые промоторные комплексы, мы получили футпринты комплекса на начальных стадиях инициации транскрипции в клетке с использованием антибиотика рифампицин. При обработке рифампицином в клетке ингибируется синтез РНК длиной более 4 нт и блокируется переход РНКП от инициации к элонгации. Таким образом, получаемый при последующем добавлении КМп04 футпринт является характерным для инициаторных комплексов. Футпринт на матричной цепи pES-отрХ, выделенной из клеток AgreAAgreB, обработанных рифампицином, показывает положение тупиковых (позиции -5/-2) и инициаторных (позиции -11, -9) комплексов (Рис. 7, дорожка 9). В присутствии рифампицина и GreA футпринт тупиковых комплексов исчезает, а футпринт инициаторных комплексов остается без изменений (дорожка 10).

pES -ipIN нематричная цепь ДНК

КМпОд

// 4 4 // 4 4

¡M ш-

pES-отрХ матричная цепь ДНК

- +KMnOj

- - +Rif

// 4 4 i/ 4 4 i. i i" <«■' 4 4

ж

*> -

г * «u

5 6 7 8 9 10

Эти выводы также согласовались с результатами анализа экспрессии белка-репортера в Е. coli. Для этого мы сконструировали плазмиды, содержащие ген ß-галактозидазы (/acZ'), экспрессия которого находится под контролем PrplN (рrplN-lacZ) или РотрХ (pompX-lacZ). Клетки штамма Е. coli AgreAAgreB, содержащие плазмиду для экспрессии GreA дт (pGreA-wt), GreA-D41E (pGreA-D41E) или контрольную плазмиду (pBAD), были трансформированы репортерной плазмидой рrplN-lacZ или рompX-lacZ. По сравнению с контролями, активный GreA увеличивал экспрессию гена lacZ под контролем PrplN в 7 раз, а под контролем РотрХ - в 2 раза.

Полученные результаты подтверждают механизм положительной регуляции транскрипции на промоторах PrplN и РотрХ фактором GreA в клетке. За счет транскрипт-расщепляющей активности GreA предотвращает образование тупиковых комплексов на ранних стадиях транскрипции и таким образом стимулирует экспрессию генов под контролем PrplN и РотрХ. Вероятно, механизм стимуляции транскрипции за счет механизма подавления образования тупиковых комплексов является характерным для многих генов, положительно регулируемых GreA.

8. Изучение механизма образования тупиковых комплексов на PrplN и РотрХ. Ранее, в работах Roberts и сотрудников был описан механизм образования транкрипционных пауз на ранних стадиях элонгации за счет связывания о-субъединицы, в составе транскрипционного комплекса, с последовательностями ДНК, похожими на «-10»-промоторный элемент ТАТААТ. Биоинформатический анализ начальных транскрибируемых последовательностей PrplN и РотрХ не выявил элементов, похожих на «-10»-промоторный элемент. Однако это не исключает возможность того, что о-субъединица принимает участие в образовании тупиковых комплексов на промоторах, положительно регулируемых GreA. Для выяснения роли а-субъединицы в этом процессе мы использовали в экспериментах по транскрипции in vitro холо-фермент РНКП, содержащий мутантную о-субъединицу с заменой L402F. Предполагается, что замена L402F ослабляет взаимодействия «т-субъединицы с кор-ферментом.

В отсутствие GreA при транскрипции на матрице РотрХ in vitro холо-ферментом с O-L402F образует значительно меньше тупиковых комплексов и больше полноразмерных РНК-продуктов, чем при транскрипции холо-ферментом дикого типа (дт) (Рис. 8 дорожки 1, 3). С другой стороны, количество тупиковых комплексов, образованных холо-ферментом с O-L402F на PrplN при транскрипции в отсутствие GreA, незначительно снизилось по сравнению с холо-ферментом дт. В то же время, количество полноразмерного РНК-продукта увеличилось (дорожки 5,7).

В присутствии GreA количество тупиковых комплексов резко снижается, а количество полноразмерного РНК-продукта существенно увеличивается на обеих матрицах при транскрипции холо-ферментом дт и холо-ферментом с а-L402F (дорожки 2 и 4,6 и 8).

Чтобы выяснить причину одновременного накопления полноразмерного РНК-продукта и коротких РНК при транскрипции на PrplN холо-ферментом с

РотрХ

ДТ

L402F

PrplN

- +

L402F

- +

промотор

GreA

C-L402F, мы проанализировали продукты одного цикла реакции транскрипции in vitro. Для этого мы использовали рифампицин, который добавляли к открытым промоторным комплексам одновременно с добавлением субстратов. В одном цикле транскрипции на PrplN холо-фермент с C-L402F образует гораздо меньше тупиковых комплексов и больше полноразмерного РНК-продукта, чем холо-фермент дт. Анализ количеств продуктов одного цикла транскрипции показывает, что только около 12% молекул холо-фермента дт синтезируют полноразмерный продукт, а 88% - образуют тупиковые комплексы. В то же время, более 45% молекул холо-фермента с O-L402F синтезируют полноразмерный продукт, и около 55% - образуют тупиковые комплексы. Добавление Gre-факторов в обоих случаях приводило к увеличению количества полноразмерного РНК-продукта. Таким образом, накопление значительного количества коротких продуктов на РrplN холо-ферментом с O-L402F (Рис. 8) происходит в результате большого количества циклов реакции транскрипции, чем в случае холо-фермента с о дт. Благодаря этому возрастает эффективность рециркуляции Р1ЖП и увеличивается количество полноразменой РНК.

Рис. 8. Анализ продуктов реакции транскрип-ции in vitro на PrplN и РотрХ холо-ферментом РНКП содержащим о-L402F или холо-ферментом содержащим о дт. Приведена авторадиограмма [<х32Р]АТР -меченных РНК-продуктов, разделенных в 23% денатури-рующем ПААГ. Транскрипционные реакции проводили в присутствии 30 цМ NTP, в отсутствие или в присутствии 4 цМ GreA в течение 15 мин. Полноразмерные РНК, короткие РНК и продукты расщепления указаны стрелками и фигурными скобками справа. Приведённые данные показывают, что образование тупиковых комплексов и синтез полноразмерного РНК-продукта на обоих промоторах в значительной степени зависит от взаимодествия о с холо-ферментом РНКП.

продукты (расщепления

1 2 3 4 5 6 7 8

Приведенные выше результаты указывают на существенную роль ст-субъединицы в образовании тупиковых комплексов на РгрШ и РотрХ. Ослабление взаимодействий мутантной о-Ь402Р с холо-ферментом приводит к увеличению эффективности прохождения точки образования тупиковых комплексов и к общему повышению эффективности транскрипции.

1полноразмерныи I РНК-продукт

РНК-продукты ►тупиковых комплексов

.абортивные 'РНК-продукты

Мы подтвердили полученные результаты с помощью КМп04 футпринтинга на РrplN и РотрХ in vitro. В присутствии субстратов футпринт тупиковых комплексов значительно слабее для холо-фермента с C-L402F, чем для холо-фермента дт. На нематричной цепи YrplN уменьшается интенсивность футпринта в позиции +5, на нематричной цепи YompXотсутствует зона +8/+9.

Описанные в настоящей работе тупиковые комплексы, образующиеся на промоторах РrplN и РотрХ in vitro и in vivo, отличаются от известных «а-зависимых» транскрипционных пауз. Максимальное время полураспада описанных ранее «a-зависимых» пауз, измеренное в одном цикле транскрипционной реакции в присутствии рифампицина, составляет 5 минут. В нашем исследовании РНК-продукты тупиковых комплексов не достраивались в течение 30 минут инкубации с NTP в присутствии рифампицина. Это согласуется с экспериментами, описанными в главе 5, в которых после удаления субстратов мы не наблюдали удлинения коротких РНК-продуктов при дополнительной инкубации с NTP.

9. Поиск элементов промотора, вызывающих образование тупиковых комплексов. Поскольку последовательности, похожие на «-10» промоторный элемент, отсутствуют в начальной транскрибируемой последовательности как РrplN, так и РотрХ, мы поставили задачу определить участок промотора, присутствие которого вызывает образование тупиковых комплексов. Так как образование тупиковых комплексов наиболее выражено для PrplN, для детального анализа был выбран этот промотор. Для этого мы сконструировали с помощью ПЦР 15 вариантов промоторов, в которых участки ДНК от позиции -50 до -1 или от позиции +1 до +25 YrplN были заменены соответствующими частями промотора Al бактериофага Т7 или случайными последовательностями (Рис. 9). Промотор Т7А1 - один из самых сильных и хорошо изученных природных промоторов. Транскрипционную активность полученных вариантов промоторов анализировали с помощью транскрипции in vitro в присутствии или в отсутствие GreA. Количество тупиковых комплексов, образованных на каждом из вариантов YrplN, оценивалось по количеству коротких РНК-продуктов, прошедших очистку на гель-фильтрационной колонке.

Результаты анализа (Рис. 9, диаграмма справа) показывают, что замены как промоторной (позиции от -84 до -1, промотор 14), так и начальной транскрибируемой (позиции от +2 до +45, промотор 9) областях YrplN на соответствующие части промотора Т7А1 незначительно увеличивают количество полноразмерного РНК-продукта (1,7-2,5 раза), но значительно уменьшают количество тупиковых комплексов. Следовательно, образование тупиковых комплексов определяется и промоторной, и начальной транскрибируемой последовательностями YrplN.

Удаление или изменение «UPw-подобного элемента (АТ-богатый участок в области позиции -45, промотор 3), «-35» области (промотор 2, 4), дискриминатора (DSR, позиции от -5 до -1, промотор 6), а также нуклеотида в позиции +1 (промотор 7) практически не влияют на активность промотора и образование тупиковых комплексов. Замена нуклеотидов TG в области

расширенного «-10» промоторного элемента (позиции -13 и -14, промотор 5) на СС приводит к снижению активности промотора более, чем в 20 раз, и исчезновению тупиковых комплексов. Это указывает на то, что РгрШ относится к классу промоторов с расширенной «-10» областью и что связывание с-субъединицы с Тв элементом расширенной «-10» области важно для образования тупиковых комплексов. Этот вывод согласуется с результатами экспериментов, описанных в главе 8.

варианты промоторов

наэыни* Т. РгрН*цЪ*4,*46)

2. Pip/AfcoiMi-35J

3. P/pfflMUP

Л PtpW-iUPHJ3

5. PtpiNAfExtend-IOI

6. Prpl/WSR(C^T)

7. P/pW*lG->A

а. Ргр/Шяпйот DSfVTTR

9. PtplNmA14TR

10. PtpW+wndom l*2.*Bi It. PipWwidom (*Г.*11)

12. PrpJHiKulom (*12,*1Gj

13. PipVUtndom (*1T.+21)

14. Т7А1ЛрйМТЯ

15. T7A1 дт

активность

I ?

расширены*

-10 l>Mi -)

РНК-продуктов тупиковых комплексов от общего кол-ва продуктов

;vTTTATrT-TTTCTACCCATATCrTT^AAS;OOTGITATAATJ„^J^GcCCTCGATArJ3CGArrTTTAACC

..........-T.Vi.-A...............................G........................

AGCTGCATGC.....................................g........................

GAGGTAAGCTCCATGC..............................g.... ...................

. .СС. .

Рис. 9 Сравнение эффективности образования тупиковых комплексов на РrplN и искусственных вариантах промотора. Диаграмма слева показывает выравниванные последовательности исследованных промоторов. Позиции, идентичные РгрШ дт, обозначены точками. Элементы РrplN, подвергшиеся замене или делеции, выделены цветом. Цифрами слева показана относительная активность промоторов, где за единицу принята активность РrplN дт, измеренная по количеству полноразмерной РНК синтезированной в многоцикличной реакции за 15 минут в присутствии 100 рМ NTP и 4 рМ GreA. На гистограмме показано количество РНК-продуктов тупиковых комплексов (после очистки на колонке с Сефадексом G-50) в процентах от общего количества РНК, синтезированных в одном цикле траснкрипции в присутствии 30 цМ NTP. Приведённые данные указывают, что участки расширенного «-10» элемента промотора и начальной транскрибируемой последовательности от +2 до +6 необходимы для образования тупиковых комплексов на Р rplN.

Далее, в начальной транскрибируемой области были заменены четыре участка длиной пять нуклеотидов с позиции +2 до +21 (промоторы 10-13). Только замена нуклеотидов в позициях +2,+4,+5,+6 приводила к резкому снижению количества тупиковых комплексов. Замена других участков начальной транскрибируемой области РrplN не приводила к существенным изменениям набора РНК-продуктов. Таким образом, участок от позиции +2 до +6 также вносит вклад в узнавание сигнала для перманентной остановки транскрипции.

Итак, мы установили, что в образование тупиковых комплексов на промоторе РrplN основной вклад вносят последовательности расширенной «10» промоторной области и начальная транскрибируемая последовательность в позициях от +2 до +6. При анализе начальной транскрибируемой последовательности других исследованных промоторов, активируемых GreA

напрямую, как и в случае РrplN, мы наблюдали присутствие 2-3 нт С или G. Возможно, наличие этого элемента способствует образованию тупиковых комплексов при транскрипции на этих промоторах.

Результаты, полученные в настоящей работе, указывают на то, что предотвращение образования тупиковых комплексов является основной функцией транскрипт-расщепляющих факторов GreA и GreB в клетке. Известные механизмы устранения транскрипционных пауз в клетке и остановок транскрипции не могут быть задействованы в случае образования тупиковых комплексов на промоторе. Кооперативное действие молекул РНКП невозможно в связи с тем, что промоторная последовательность ДНК остается занятой молекулой первой РНКП, образовавшей тупиковый комплекс [Epshtein V et al., 2003, ЕМВО]. Вторая молекула РНКП не может начать инициацию, чтобы сместить тупиковый комплекс с точки остановки транскрипции. С другой стороны, действие АТР-зависимого фактора Mfd также невозможно из-за наличия с-субъединицы в составе тупикового комплекса [Park J.S. et al., 2002, Cell]. Действительно, наши эксперименты демонстрируют высокую эффективность образования тупиковых комплексов в отсутствие GreA и GreB in vivo, несмотря на наличие фактора Mfd и избытка РНКП в клетке.

Мы предполагаем, что образование тупиковых комплексов на промоторах является общим свойством для генов, стимулируемых транскрипт-расщепляющими факторами. Недавние исследования показали, что образование ранних пауз и перманентных остановок транскрипции является способом регуляции экпресии в эукариотических клетках [Nechaev S, Adelman К., 2008, Cell Cycle]. Остановленные инициаторные комплексы могут быть быстро активированы в ответ на внешние сигналы. Образование тупиковых комплексов на бактериальных промоторах и их активация Gre-факторами, возможно, является аналогичным механизмом регуляции экспрессии генов в прокариотических клетках.

выводы.

1. Выявлено 282 гена, экспрессия которых регулируется за счет транкрипт-расщепляющей активности GreA (103 гена активируются, 179 генов репрессируются).

2. С помощью компьютерного анализа предсказано, что регуляция транскрипции фактором GreA in vivo происходит на стадии инициации, а не на стадии элонгации, как считалось ранее. Выявлен ряд генов, экспрессию которых GreA стимулирует напрямую (среди них гены трансляционной машинерии, а также гены синтеза липополисахаридов и несколько ^охарактеризованных генов).

3. С помощью транскрипционных реакций in vitro подтверждена гипотеза о прямой стимуляции транскрипции фактором GreA на стадии инициации. Для стимуляции необходима транскрипт-расщепляющая активность.

4. Показано на примере промоторов генов rpIN и отрХ, что РНКП образует ранее не описанные тупиковые инициаторные комплексы, находящиеся в состоянии обратного смещения, и что Gre-факторы реактивируют эти комплексы за счет реакции расщепления транскрипта. Этот механизм осуществляется in vitro и in vivo.

5. Показано, что в образовании тупиковых инициаторных комплексов на РrpIN и РотрХпринимает участие а-субъединица РНКП.

6. Установлено, что для образования тупиковых комплексов на РrpIN необходимо наличие двух участков промоторной последовательности - одного в области расширенного элемента "-10", а другого - в начальной транскрибируемой последовательности в области от +2 до +5.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

Статьи.

1. Stepanova Е., Lee J., Ozerova М., Semenova Е., Datsenko К., Wanner B.L., Severinov К., and Borukhov S. Analysis of promoter targets for Escherichia coli transcription elongation factor GreA in vivo and in vitro. (2007) J. Bactcriol. 189(24):8772-85

2. Stepanova E, Wang M, Severinov K, Borukhov S. Early transcriptional arrest at E. coli rpIN and ompXpromoters. (2009) J Biol Chem. Epublication. M109.053983.

3.Степанова E.B.. Шевелёв А.Б., Борухов С.И., Северинов К.В. Физико-химимческие механизмы действия транскрипционных факторов, связывающихся с РНК-полимеразой, но не связывающихся с ДНК. (2009) Биофизика. 54(5):773-790.

Тезисы конференций и сообщения.

1. Stepanova, Е.. Lee, J., Ozerova, М., Semenova, Е., Datsenko, К., Wanner, В., Severinov, К., and Borukhov S. Analysis of promoter targets for E. coli transcription elongation factor greA in vivo and in vitro. Biannual Meeting on Transcription Termination. 2008, Mountain Lake, VA, USA, P. 7;

2. Stepanova, E.. Lee, J., Ozerova, M., Semenova, E., Datsenko, K., Wanner, В., Severinov, K., and Borukhov S. Analysis of promoter targets for E. coli transcription elongation factor GreA in vivo and in vitro. E. coli Aliance. 2008, Hinxton, UK, P.T17;

3. Степанова E.. Ли Дж, Озерова M, Семёнова Е., Даценко К., Ваннер Б. , Северинов К., Шевелёв А., Борухов С. Регуляция активности промоторов Е. coli транскриптрасщепляющим фактором GreA in vivo и in vitro. IV Съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск, Россия, 2008. Стр.31

Подписано в печать: 17.11.2009

Заказ № 3073 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Степанова, Екатерина Викторовна

I. Литературный обзор

Введение

1.1 Общие сведения об РНК-полимеразах прокариот

1.2 Транскрипционные факторы GreA и GreB

1.3 Регуляция факторами, взаимодействующими с РНКП через 27 вторичный канал

Структура и функции эукариотического аналога Gre — 27 транскрипционного фактора TFIIS

Структура и функции транскрипционного фактора Gfhl — 32 гомолога Gre

Структура и функции транскрипционного фактора DksA

Структура и функции транскрипционного фактора Rnk

Структура и функции транскрипционного фактора TraR

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение клеточной функции транскрипционного фактора E. coli GreA"

В настоящее время интенсивно изучаются механизмы регуляции транскрипции, основанные на модуляции каталитической активности РНК-полимеразы (РНКП). Большой интерес вызывают молекулярные механизмы действия факторов, связывающихся во вторичном канале РНКП (Рис.1). Число известных факторов этой группы постоянно растет. К ним относятся как гомологичные, так и неродственные белки со сходной пространственной организацией, которая приспособлена для связывания с ферментом. К настоящему моменту известны следующие факторы этого класса: транскрипт-расщепляющие факторы семейства вге [1, 2], обнаруженные почти во всех эубактериях; ингибитор транскрипции ОЙ11 [3], обнаруженный в микроорганизмах группы Ветососси8-Ткегти8\ глобальный регулятор системы строгого контроля ЭкзА [4, 5], осуществляющий регуляцию кооперативно с алармоном ррОрр; недавно открытый глобальный регулятор ТгаЯ [6], последовательность которого кодируется на ДНК конъюгативных плазмид широкого круга хозяев, а также фактор Япк [7].

Несмотря на обилие имеющейся информации, представления о факторах, действующих через вторичный канал, все еще остаются неполными: для некоторых из них отсутствуют структурные данные (ТгаЯ), для других остается невыясненным механизм связывания и регуляции активности РНКП (ЭкзА, ТгаК, Кпк), для третьих - не до конца установлена их биологическая роль в клетке (вгеА, ОгеВ, вШ, Япк). Очевидно, однако, что регуляция транскрипции через вторичный канал РНКП — это один из важных, эволюционно консервативных механизмов клеточной регуляции.

1.1 Общие сведения об РНК-полимеразах прокариот

ДНК-зависимая РНК-полимераза - главный фермент транскрипции в клетке, который ответственен за синтез цепи РНК, комплементарной транскрибируемой цепи ДНК-матрицы, в присутствии субстратов -рибонуклеозид-5'-трифосфатов. Мультисубъединичные РНКП эукариот, архебактерий и эубактерий гомологичны друг другу [8]. Каталитически активный кор-фермент РНКП большинства эубактерий состоит из 5 (агрр'ш) субъединиц: двух а (-36 кДа), р (-150 кДа), р' (-155 кДа) и со (-8,5 кДа) и имеет общий молекулярный вес, равный —380 кДа. Для специфической инициации транскрипции с определённой позиции ДНК-матрицы кор-фермент должен связаться с одним из факторов специфичности о (или а-субъединицей, -20-70 кДа) с образованием холо-фермента РНКП (агрр'соа) [8-12].

Структуру РНКП можно описать как глобулу эллипсоидальной формы с глубоким вырезом посередине молекулы, что придает ей сходство с клешней краба. Основанием «клешни» является димер а-субъединиц, взаимодействующие с ним участки р и р' и каталитический центр. Основная белковая масса Р и р' субъединиц образует своеобразные «зажимы», полость между которыми служит для связывания ДНК-матрицы и РНК-продукта. Удобно выделить передний и задний края фермента, взяв за основу направление движения РНКП вдоль молекулы ДНК. Соответственно, ДНК-дуплекс, входящий в полость фермента, будет называться передним, а выходящий — задним (Рис.1). Передняя часть полости разделена перегородкой на два канала: большой первичный и малый вторичный каналы [8-12].

Первичный канал (Рис. 1) служит для связывания входящего ДНК-дуплекса (длиной -15-20 пн), транскрипционного пузыря (участка ДНК длиной 12-14 пн, где происходит плавление ДНК-дуплекса) и ДНК-РНК-гетеродуплекса (длиной в 9±1 нт) (Рис.1) [13]. Для предотвращения схлопывания транскрипционного пузыря нематричная цепь удерживается элементами зажима ß, а матричная цепь ДНК направляется элементами субъединицы ß' к каталитическому центру. Каталитический центр РНКП встроен в стенку первичного канала. Он образован консервативным мотивом ß'-субъединицы NADFDGD. Три остатка Asp этого мотива (у Е. coli — Asp

0-4739, Asp-741 и Asp-743) хелатируют первый ион Mg I, необходимый для катализа. Эти остатки вместе с кислыми остатками ß-субъединицы (у Е. coli —

Glu-685 и Asp-686) также участвуют в хелатировании второго pi. каталитического иона Mg И [9, 11, 13]. ДНК-РНК-гетеродуплекс берёт своё начало от каталитического центра и, проходя по стенке первичного канала, заканчивается в задней части фермента, на перегородке, разделяющей ДНК и

РНК. Выходя из ДНК-РНК-гетеродуплекса, 5'-концевой одноцепочечный участок транскрипта (длиной в ~6 нт) поступает в канал выхода РНК. После

разделения РНК-ДНК-гетеродуплекса верхняя часть матричной цепи ДНК восстанавливает дуплекс с нематричной цепью ДНК и свободно покидает первичный канал, не вступая в дальнейшее взаимодействие с РНКП [9, 13].

Вторичный канал имеет форму воронки (Рис.1). Широкое отверстие воронки открывается на передней поверхности РНКП. Постепенно сужаясь, вторичный канал проходит внутрь фермента, и его малое отверстие открывается рядом с каталитическим центром. В нижней части полость вторичного канала отделена от первичного канала перегородкой, состоящей из элементов ¡З'Е-мост и ¡З'О-петля [9, 13]. Через вторичный канал в каталитический центр поступают субстраты, и происходит диссоциация 3'-концевого фрагмента РНК в обратно-смещенных комплексах (см. ниже). Вторичный канал также служит сайтом связывания транскрипционных факторов, рассмотренных в данном обзоре.

Транскрипция представляет собой циклический процесс, который можно разделить на три стадии: связывание РНКП промоторной ДНК и инициация синтеза РНК; процессивная элонгация цепи РНК; и терминация синтеза и диссоциация конечного продукта (полноразмерного РНК-транскрипта).

РНКП начинает новый транскрипционный цикл в виде холофермента, включающего а-субъединицу [9, 14, 15]. С ее помощью происходит узнавание и связывание промоторной последовательности ДНК. Для узнавания некоторых промоторов также необходимо участие а-субъединицы [16, 17]. После плавления ДНК-дуплекса в районе точки старта транскрипции и формирования транскрипционного пузыря начинается синтез РНК. Перед тем, как РНКП начнет процессивную элонгацию, фермент проходит стадию первичного, т.н. абортивного, синтеза транскрипта [9, 18].

Рис. 1.1 Эпонгационный комплекс (ЭК) РНКП. На рисунке схематически показано устройство ЭК, вид со стороны первичного канала. В полости первичного канала РНКП располагается каталитический центр (консервативный мотив ИАВРООО - тонкой линией, его аминокислоты хелатируют ионы М02+ I и Мц2+ II, изображенные серыми сферами), транскрипционный пузырь и ДНК-РНК-гетеродуплекс, в котором РНК изображена толстой прерывистой черной линией. Вблизи от каталитического центра открывается воронка вторичного капала (изображен как желоб серого цвета), которая отделена от первичного канала элементами рТ-мост и [З'О-петля. Передний ДНК-дуплекс связывается элементом РНКП передний ДНК связывающей зажим. Матричная цепь ДНК изображена черной толстой линией, нематричная цепь ДНК - серой. В задней части фермента расположен канал выхода РНК. В канале выхода РНК располагается эвакуируемый одноцепочсчный РПК-продукт.

На начальной стадии абортивного синтеза транскрипта кор-фермент сохраняет контакты с ст-субъединицей, а ст-субъединица - с промоторной последовательностью ДНК. В ходе синтеза, двигаясь вперёд относительно матрицы, РНКП, по-видимому, втягивает транскрибируемый участок двухцепочечной ДНК внутрь, а расплетенные одноцепочечные участки, вероятно, выпетливаются наружу. Этот процесс, т.н. сжатие (scrunching), должен сопровождаться внутренней деформацией фермента и ДНК-матрицы [19]. Накапливающееся по мере синтеза РНК упругое напряжение в инициаторном комплексе может являться источником энергии либо для высвобождения абортивного транскрипта, либо для перехода комплекса к стадии элонгации. В случае высвобождения абортивного транскрипта, продукт диссоциирует из комплекса через вторичный канал, РНКП возвращается к позиции старта и повторяет цикл заново. Количество абортивных циклов на разных промоторах может варьировать от десятка до нескольких тысяч, что может приводить к накоплению большого количества абортивных продуктов, а иногда и фактически блокировать синтез полноразмерной РНК [9, 18].

Когда длина транскрипта достигает 7-9 нт, инициаторный комплекс притерпевает существенную конформационную перестройку. В результате, а-субъединица высвобождается, как следствие, разрушается контакт РНКП с промоторной последовательностью ДНК, и фермент переходит к стадии продуктивной элонгации [9, 14]. Элонгационный комплекс (ЭК) обладает высокой стабильностью и процессивностью.

ЭК способен синтезировать РНК размером несколько десятков тысяч нт без диссоциации от ДНК-матрицы и РНК-продукта. На стадии терминации

ЭК распознаёт сигнал, закодированный в особой структуре транскрипта, формируемой в канале выхода РНК, и быстро диссоциирует с высвобождением ДНК-матрицы и РНК-продукта [20]. После этого кор-фермент РНКП оказывается готовым снова присоединить а-субъединицу и начать новый цикл транскрипции.

В процессе элонгации движение РНКП по ДНК-матрице не является непрерывным. Исследование динамики синтеза индивидуальных молекул показывает, что монотонное продвижение вперед чередуется с остановками различной продолжительности [21, 22]. В клетке к образованию пауз могут привести неоптимальные концентрации субстрата, локальные особенности структуры матричной ДНК, влияние транскрипционных факторов и малых молекул-регуляторов, а также спонтанные нарушения в структуре самой РНКП [23-28]. Транскрипционные паузы часто определяют общую скорость транскрипции, играя важную роль в синхронизации процессов транскрипции и трансляции.

В экспериментах по транскрипции in vitro ЭК в состоянии паузы могут быть получены при отсутствии одного из четырех субстратов или за счет создания механического препятствия, например ДНК-связывающего белка, на пути следования РНКП. [28-30]. Как показывают ДНК-футпринты таких «остановленных» комплексов, фермент в них не пребывает в статическом состоянии, а напротив, совершает постоянные осцилляции, перемещаясь вперед-назад вдоль ДНК. При этом РНКП вместе с каталитическим центром может сместиться на несколько (2-20) нт назад относительно З'-конца РНК [29-31]. Способность к смещению комплекса в обратном направлении определяется локальными свойствами ЭК и может резко изменяться при удлинении транскрипта даже на один нуклеотид [32].

Активный ЭК

• Каталитичесхии центр 1 ТТЛ ДНК-матрица - РНК-продукт

CZZI^ рнкп

О Транскрипционный пузырь

Обратное смешение ^ на 2-3 нт

Обратное смещение более чем наЗ нт

Арест

Дюинироввннык ЭК

Рис. 1.2 Механизмы образования и преодоления пауз и перманентных остановок транскрипции. Активный ЭК (сверху) содержит транскрипционный пузырь и РНК-продукт, 3'-конец которого находится в каталитическом центре. Обратное смещении па два-три нуклеотида назад (слева) приводит к образованию транскрипционной паузы. Это состояние является обратимым, ЭК способен активироваться спонтанно или за счет реакции расщепления транскрипта, стимулируемой факторами СгеА и/илн СгеВ (слева внизу). Отщепление З'-коицевого фрагмента РНК-продукта приводит к образованию нового З'-конца РНК в каталитическом центре, и ЭК переходит в активное состояние. При обратном смещении более чем на три нуклеотида (справа), комплекс не может самостоятельно совместить каталитический центр с З'-концом РНК и инактивируется, что приводит к перманентной остановке транскрипции и образованию тупикового комплексаю В случае тупикового комплекса для совмещения каталитического центра с 3'-концом РНК потребуется отщепление РНК-олигонуклеотида длиной 3-20 нт. Такой тип расщепления способен стимулировать только фактор ОгеВ (справа внизу)

Смещение назад на 2-3 нт (происходит при транскрипционной паузе), как правило, является обратимым, и при длительной инкубации с субстратами комплекс способен возобновить элонгацию (Рис.1.2). Таким образом, при наличии субстратов, в ЭК с малым смещением осциллирующая РНКП стабилизируется в активном положении, при котором каталитический центр располагается в непосредственной близости от 3'-конца РНК [29, 33].

После смещения в обратном направлении более чем на 3 нт происходит перманентная остановка транскрипции. Фермент теряет способность самостоятельно совместить каталитический центр с 3'-концом транскрипта, который попадает во вторичный канал [34, 35]. Такой ЭК инактивируется, превращаясь в тупиковый комплекс, который неспособен удлинять РНК-транскрипт даже при длительной икубации с NTP (Рис. 2). Этот переход коррелирует со значительным смещением футпринта РНКП в обратном направлении. Так же как и ЭК, тупиковый комплекс обладает большой стабильностью [29, 33]. Выйти из состояния перманентной остановки РНКП может за счет активации эндонуклеазной реакции, в результате которой в каталитическом центре происходит гидролитический разрыв цепи РНК. После реакции расщепления вновь образованный 3'-конец РНК оказывается совмещённым с каталитическим центром, а отщепленный РНК-фрагмент покидает ЭК через вторичный канал [29, 33, 37]. Помимо эндонуклеазного расщепления транскрипта, реактивация тупиковых комплексов in vivo может происходить с помощью транскрипционного фактора Mfd. Этот фактор связывается с ДНК позади РНКП и транслоцирует ЭК вперёд по ДНК-матрице за счет энергии гидролиза АТР, таким образом совмещая 3'-конец

РНК с каталитическим центром и восстанавливая активность РНКП [37]. Аналогичным образом обратно-смещенный комплекс может быть активирован второй молекулой РНКП, активно транскрибирующей ДНК позади него [30].

Образование тупиковых комплексов возможно также в ходе инициации на некоторых промоторах. В таких инициаторных комплексах фермент не способен разорвать связи с промоторной ДНК и поэтому удерживается от транслокации вперед. С другой стороны, первичный транскрипт стабильно связан с комплексом и не может диссоциировать (абортироваться), чтобы позволить РНКП начать новый цикл транскрипции [38, 39]. Как и в случае перманентной остановки ЭК, РНКП в тупиковом инициаторном комплексе приобретает конформацию обратного смещения, при которой фермент смещается назад, а 3'-конец РНК попадает во вторичный канал. Такой комплекс не только не способен продолжить транскрипцию, но и блокирует инициацию на данном промоторе другими молекулами фермента, тем самым исключая возможность активации тупикового комплекса за счет кооперативного действия РНКП, двигающихся сзади. Аналогично ЭК, тупиковый инициаторный комплекс может быть активирован за счет реакции расщепления транскрипта [38, 39].

Заключение Диссертация по теме "Биоинформатика", Степанова, Екатерина Викторовна

Выводы

1. Выявлено 282 гена, экспрессия которых регулируется за счет транкрипт-расщепляющей активности GreA (103 гена положительно и 179 генов отрицательно).

2. С помощью компьютерного анализа предсказано, что регуляция транскрипции фактором GreA in vivo происходит на стадии инициации, а не на стадии элонгации, как считалось ранее. Выявлен ряд генов, экспрессию которых GreA стимулирует напрямую (среди них гены трансляционной машинерии, а также гены синтеза липополисахаридов и несколько ^охарактеризованных генов).

3. С помощью транскрипционных реакций in vitro подтверждена гипотеза о прямой стимуляции транскрипции фактором GreA на стадии инициации. Для стимуляции необходима транскрипт-расщепляющая активность.

4. Показано на примере промоторов генов rplN и отрХ, что РНКП образует ранее не описанные тупиковые инициаторные комплексы, находящиеся в состоянии обратного смещения, и что Gre-факторы реактивируют эти комплексы за счет реакции расщепления транскрипта. Данный механизм осуществляется in vitro и in vivo.

5. Показано, что в образовании тупиковых инициаторных комплексов на РrplN и РотрХ принимает участие а субъединица РНКП.

6. Установлено, что для образования тупиковых комплексов на РrplN необходимо наличие двух участков промоторной последовательности — одного в области расширенного элемента "-10", а другого - в начальной транскрибируемой последовательности в области от +2 до +5.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Степанова, Екатерина Викторовна, Москва

1. Borukhov S., Polyakov A., Nikiforov V., Goldfarb A. GreA protein: a transcription elongation factor from Escherichia coli II Proc. Natl. Acad. Sei. U S A. 1992. V. 89. P. 8899-8902.

2. Borukhov SSagitov V., Goldfarb A. Transcript cleavage factors from E. coli II Cell. 1993. V. 72. P. 459-466.

3. Laptenko O., Borukhov S. Biochemical assays of Gre factors of Thermus thermophilic И Methods Enzymol. 2003. V. 371. P. 219-232.

4. Blankschien M.D., Potrykus K., Grace E., Choudhary A., Vinella D., Cashel M., Herman C. TraR, a homolog of a RNAP secondary channel interactor, modulates transcription // PLoS Genet. 2009. V. 5. el000345.

5. Lamour V., Rutherford S.T., Kuznedelov K., Ramagopal U.A., Gourse R.L., Severinov K., Darst S.A. Crystal structure of Escherichia coli Rnk, a new RNA polymerase-interacting protein // J. Mol. Biol. 2008. V. 383. P. 367-379.

6. Cramer P. Multisubunit RNA polymerases // Cuit. Opin. Struct. Biol. 2002. V. 12. P. 89-97.

7. Borukhov S., Nudler E. RNA polymerase: the vehicle of transcription // Trends Microbiol. 2008. V. 16. P. 126-134.

8. Zhang G., Campbell E.A., Minakhin L., Richter С., Severinov К., Darst S.A. Crystal structure of Thermus aquaticus core RNA polymerase at 3.3 Â resolution // Cell. 1999. V. 98. P. 811-824.

9. Vassylyev D.G., Sekine S., Laptenko O., Lee J., Vassylyeva M.N., Borukhov S., Yokoyama S. Crystal structure of a bacterial RNA polymerase holoenzyme at 2.6 Ä resolution // Nature. 2002. V. 417. P.712-719

10. Murakami K.S., Masuda S., Campbell E.A., Muzzin O., Darst S.A. Structural basis of transcription initiation: an RNA polymerase holoenzyme-DNA complex // Science. 2002 V. 296. P. 1285-1290.

11. Vassylyev D.G., Vassylyeva M.N., Perederina A., Tahirov T.H., Artsimovitch I. Structural basis for transcription elongation by bacterial RNA polymerase // Nature. 2007. V. 448. P. 157-162

12. Murakami K., Darst S.A. Bacterial RNA polymerases: the wholo story // Curr. Opin. Struct. Biol. 2003. V. 13. P. 31-39.

13. Borukhov S, Lee J. RNA polymerase structure and function at lac operon // C. R. Biol. 2005. V. 328. P. 576-587.

14. Kamzolova S.G., Osipov A.A., Beskaravainyi P.M., Dzheliadin T.R., Sorokin A.A. Regulation of promoter activity through electrostatic interactions with RNA-polymerase. // Biofizika. 2007. V. 52. P. 228-236.

15. Hsu L. M. Promoter clearance and escape in prokaryotes // Biochim. Biophys. Acta. 2002. V. 1577. P. 191-207.

16. Revyakin A., Liu C., Ebright R.H., Strick T.R. Abortive initiation and productive initiation by RNA polymerase involve DNA scrunching // Science. 2006. V. 314. P. 1139-1143.

17. Epshtein V., Cardinale C.J., Ruckenstein A.E., Borukhov S., Nudler E. An allosteric path to transcription termination //Mol. Cell. 2007. V. 28. P. 991-1001

18. Herbert K.M., La Porta A., Wong B.J., Mooney R.A., Neuman K.C., Landick R., Block S.M. Sequence-resolved detection of pausing by single RNA polymerase molecules // Cell. 2006.V.125. P.1083-1094

19. Herbert K.M., Greenleaf W.J., Block S.M. Single-molecule studies of RNA polymerase: motoring along //Annu. Rev. Biochem. 2008. V. 77. P. 149-176.

20. Fish R.N., Kane C.M. Promoting elongation with transcript cleavage stimulatory factors // Biochim. Biophys. Acta. 2002. V. 1577. P.287-307

21. Aivasashvilli V.A., Beabealashvilli R.S. Sequence-specific inhibition of RNA elongation by actinomycin D // FEBS Lett. 1983. V. 160. P. 124-128.

22. Duquesne S., Petit V., Peduzzi J., Rebuffat S. Structural and functional diversity of microcins, gene-encoded antibacterial peptides from enterobacteria // J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2007. V. 13. P. 200-209.

23. Toulokhonov L, Zhang J., Palangat M., Landick R. A central role of the RNA polymerase trigger loop in active-site rearrangement during transcriptional pausing //Mol. Cell. 2007. V. 27. P. 406-419.

24. Roberts J. IV., Shankar S., Filter J.J. RNA polymerase elongation factors // Annu. Rev. Microbiol. 2008. V. 62. P. 211-233.

25. Pavco P.A., Steege D.A. Elongation by Escherichia coli RNA polymerase is blocked in vitro by a site-specific DNA binding protein // J. Biol. Chem. 1990. V. 265.P. 9960-9969.

26. Komissarova N., Kashlev M. RNA polymerase switches between inactivated and activated states translocating back and forth along the DNA and the RNA // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 15329-15338.

27. Epshtein V., Toulme F., Rahmouni A.R., Borukhov S., Nudler E. Transcription through the roadblocks: the role of RNA polymerase cooperation // EMBO J. 2003. V. 22. P. 4719-4727.

28. Toulme F., Guerin M., Robichon N., LengM., Rahmouni A.R. In vivo evidence for back and forth oscillations of the transcription elongation complex // EMBO J. 1999. V. 18. P. 5052-5060.

29. Kashkina E., Anikin M., Tahirov T.H., Kochetkov S.N., Vassylyev D.G., Temiakov D. Elongation complexes of Thermus thermophilus RNA polymerase that possess distinct translocation conformations // Nucleic Acids Res. 2006. V. 34. P. 4036-4045.

30. Komissar ova N., Kashlev M. Transcriptional arrest: Escherichia coli RNA polymerase translocates backward, leaving the 3' end of the RNA intact and extruded // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1997.V. 94. P. 1755-1760.

31. Borukhov S., Lee J., Goldfarb A. Mapping of a contact for the RNA 3' terminus in the largest submit of RNA polymerase // J. Biol. Chem. 1991. V. 266. P. 2393223935.

32. Markovtsov V., Mustaev A., Goldfarb A. Protein-RNA interactions in the active center of transcription elongation complex // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1996. V. 93. P. 3221-3226.

33. Toulmé F., Mosrin-Huaman С., Sparkowski J., Das A., Leng M., Rahmouni A.R. GreA and GreB proteins revive backtracked RNA polymerase in vivo by promoting transcript trimming // EMBO J. 2000. V. 19. P. 6853-6859.

34. Park J.S., Marr M.T., Roberts J.W. E. coli transcription repair coupling factor (Mfd protein) rescues arrested complexes by promoting forward translocation // Cell. 2002. V. 109. P.757-767.

35. Susa M., Kubori T., Shimamoto N. A pathway branching in transcription initiation in Escherichia coli И Mol. Microbiol. 2006. V. 59. P.1807-1817.

36. Hatoum A., Roberts J. Prevalence of RNA polymerase stalling at Escherichia coli promoters after open complex formation // Mol. Microbiol. 2008. V. 68. P. 1728.

37. Surratt C.K, Milan S.C, Chamberlin M.J. Spontaneous cleavage of RNA in ternary complexes of Escherichia coli RNA polymerase and its significance for the mechanism of transcription // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1991. V. 88. P. 79837987.

38. Orlova M., Newlands J., Das A., Goldfarb A., Borukhov S. Intrinsic transcript cleavage activity of RNA polymerase // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1995. V. 92. P. 4596-4600.

39. Rozovskaya T.A., Chenchik A.A., Beabealashvilli R.Sh. Processive pyrophosphorolysis of RNA by Escherichia coli RNA polymerase // FEB S Lett. 1982. V. 137. P. 100-104.

40. Rudd M.D., Izban M.G., Luse D.S. The active site of RNA polymerase II participates in transcript cleavage within arrested ternary complexes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. P. 8057-8061.

41. Stebbins C.E., Borukhov S., Orlova M., Polyakov A., Goldfarb A., Darst S.A. Crystal structure of the GreA transcript cleavage factor from Escherichia coli II Nature. 1995. V. 373. P. 636-640.

42. Vassylyeva M.N., Svetlov V., Dearborn A.D., Klyuyev S., Artsimovitch I., Vassylyev D.G. The carboxy-terminal coiled-coil of the RNA polymerase beta'-subunit is the main binding site for Gre factors // EMBO Rep. 2007. V. 8. P.1038-1043.

43. Koulich D., Nikiforov V., Borukhov S. Distinct functions of N and C-terminal domains of GreA, an Escherichia coli transcript cleavage factor // J. Mol. Biol. 1998. V. 276. P. 379-89.

44. Koulich D., Orlova M., Malhotra A., Sali A., Darst S.A., Borukhov S. Domain organization of Escherichia coli transcript cleavage factors GreA and GreB // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 7201-7210.

45. Kulish D., Lee J., Lomakin I., Nowicka B., Das A., Darst S., Normet K., Borukhov S. The functional role of basic patch, a structural element of Escherichia coli transcript cleavage factors GreA and GreB // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 12789-12798.

46. Polyakov A., Richter C., Malhotra A., Koulich D., Borukhov S., Darst S.A. Visualization of the binding site for the transcript cleavage factor GreB on Escherichia coli RNA polymerase // J. Mol. Biol. 1998. V. 281. P. 465-473.

47. Opalka N., Chlenov M., Chacon P., Rice W.J., Wriggers W., Darst S.A. Structure and function of the transcription elongation factor GreB bound to bacterial RNA polymerase // Cell. 2003. V. 114. P. 335-345.

48. Laptenko O., Lee J., Lomakin I., Borukhov S. Transcript cleavage factors GreA and GreB act as transient catalytic components of RNA polymerase // EMBO J. 2003. V. 22. P. 6322-6334.

49. Sosunov V., Sosunova E., Mnstaev A., Bass I., Nikiforov V., Goldfarb A. Unified two-metal mechanism of RNA synthesis and degradation by RNA polymerase // EMBO J. 2003. V. 22. P. 2234-2244.

50. Glass J.I., Assad-Garcia N., Alperovich N., Yooseph S., Lewis M.R., Maruf M., Hutchison C.A. 3rd, Smith H.O., Venter J.C. Essential genes of a minimal bacterium // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2006. V. 103 P. 425-430.

51. Stepanova E., Lee J., Ozerova M., Semenova E., Datsenko K., Wanner B.L., Severinov K., Borukhov S. Analysis of promoter targets for Escherichia coli transcription elongation factor GreA in vivo and in vitro // J. Bacteriol. 2007. V. 189. P. 8772-8785.

52. Rhodius V.A., Suh W.C., Nonaka G., West J., Gross C.A. Conserved and variable functions of the sigmaE stress response in related genomes // PLoS Biol. 2006. V. 4. e2.

53. Len A.C., Harty D. W., Jacques N.A. Stress-responsive proteins are upregulated in Streptococcus mutans during acid tolerance // Microbiology. 2004. V. 150. V. 1339-1351.

54. Wei W., Jiang J., Li X., Wang L., Yang S.S. Isolation of salt-sensitive mutants from Sinorhizobium meliloti and characterization of genes involved . in salt tolerance// Lett. Appl. Microbiol. 2004. V. 39. P. 278-283.

55. Kawamoto J., Kurihara T., Kitagawa M., Kato /., Esaki N. Proteomic studies of an Antarctic cold-adapted bacterium, Shewanella livingstonensis Ac 10, forglobal identification of cold-inducible proteins // Extremophiles. 2007. V. 11. P. 819-26.

56. Singh V.K., Jayaswal R.K., Wilkinson B.J. Cell wall-active antibiotic induced proteins of Staphylococcus aureus identified using a proteomic approach // FEMS Microbiol. Lett. 2001. V. 199. P. 79-84.

57. Izban M.G., Litse D.S. The RNA polymerase II ternary complex cleaves the nascent transcript in a 3'—>5* direction in the presence of elongation factor SII // Genes Dev. 1992. V. 6. P. 1342-1356.

58. Wind M., Reines D. Transcription elongation factor SII // Bioessays. 2000. V. 22. P. 327-36

59. Kettenberger H., Armache K.J., Cramer P. Architecture of the RNA polymerase II-TFIIS complex and implications for mRNA cleavage // Cell. 2003. V. 114. P. 347-357.

60. Kim B., Nesvizhskii A.I., Rani P.G., Hahn S., Aebersold R., Ranish J.A. The transcription elongation factor TFIIS is a component of RNA polymerase II preinitiation complexes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007. V. 104. P. 1606816073.

61. Guglielmi B., Soutourina J., Esnault C., Werner M. TFIIS elongation factor and Mediator act in conjunction during transcription initiation in vivo // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007. V. 104. P. 16062-16067.

62. Galburt E.A., Grill S. W., Wiedmann A., Lubkowska L., Choy J., Nogales E., Kashlev M., Bustamante C. Backtracking determines the force sensitivity of RNAP II in a factor-dependent manner // Nature. 2007. V. 446. P. 820-3. c

63. Guermah M., Palhan V.B., Tackett A.J., Chait B.T., Roeder R.G. Synergistic functions of SII and p300 in productive activator-dependent transcription of chromatin templates // Cell. 2006. V. 125. P. 275-286.

64. Charlet-Berguerand N., Feuerhahn S., Kong S.E., Ziserman H., Conaway J.W., Conaway R., Egly J.M. RNA polymerase II bypass of oxidative DNA damage is regulated by transcription elongation factors // EMBO J. 2006. V. 25. P. 54815491.

65. Fousteri M., Mullenders L.H. Transcription-coupled nucleotide excision repair in mammalian cells: molecular mechanisms and biological effects // Cell Res. 2008. V. 18. P. 73-84.

66. Laptenko O., Kim S.S., Lee J., Starodubtseva M., Cava F., Berenguer J., Kong X.P., Borukhov S. pH-dependent conformational switch activates the inhibitor of transcription elongation // EMBO J. 2006. V. 25. P. 2131-2141.

67. Haugen S.P., Ross W., Gourse R.L. Advances in bacterial promoter recognition and its control by factors that do not bind DNA // Nat. Rev. Microbiol. 2008. V. 6. P. 507-519.

68. Szalewska-Palasz A., Wegrzyn G., Wegrzyn A. Mechanisms of physiological regulation of RNA synthesis in bacteria: new discoveries breaking old schemes // J. Appl. Genet. 2007. V. 48. P. 281-294.

69. Magnusson L.U., Gummesson B., Joksimovic P., Farewell A., Nystrdm T. Identical, independent, and opposing roles of ppGpp and DksA in Escherichia coli //J. Bacterid. 2007. V. 189. P. 193-202.

70. Artsimovitch ./., Patlan V, Sekine S., Vassylyeva M.N., Hosaka 71, Ochi K., Yokoyama S., Vassylyev D.G. Structural basis for transcription regulation by alarmone ppGpp // Cell. 2004. V. 117.P. 299-310.

71. Paul B.J., Berkmen M.B., Gourse R.L. DksA potentiates direct activation of amino acid promoters by ppGpp // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. V. 102. P. 7823-7828.

72. Leon E. A., Ezkurdia I., Garci'a B., Valencia A. and Juan D. EcID. A database for the inference of functional interactions in E. coli Nucleic Acids Research. 2009. V. 37. P. D629-D635.

73. Nechaev S, Adelman K. Promoter-proximal Pol II: when stalling speeds things up//Cell Cycle. 2008. V. 7. P. 1539-1544.

74. Datsenko K. A. u B. L. Wanner. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. V. 97. P. 6640-6645.

75. Ko D.C., Marr M.T., Guo J., Roberts J. W. A surface of Escherichia coli sigma 70 required for promoter function and antitermination by phage lambda Q protein. Genes Dev. 1998. V. 20.P. 3276-3285.

76. Barker M.M., Gaal T., Josaitis C.A., Gourse R.L. Mechanism of regulation of transcription initiation by ppGpp. I. Effects of ppGpp on transcription initiation in vivo and in vitro. J Mol Biol (2001). Y. 305. P. 673-688.

77. Maniatis T., Fritsch E., SambrookJ. Molecular cloning // A laboratory manual. 1989. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY.

78. Hager D.A., Jin D.J. and Burgess R.R. Use of Mono-Q high-resolution ion exchange chromatography to obtain highly pure and active Escherichia coli RNA polymerase ¡/Biochemistry. 1990. V. 29. P. 7890-7894.

79. Borukhov S., Goldfarb A. Recombinant Escherichia coli RNA polymerase: purification of individually overexpressed subunits and in vitro assembly // Protein ExprPurif. 1993. V. 6. P. 503-511.