Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурная организация функционально активных комплексов РНК полимеразы E. coli с факторами транскрипции GreA и GreB. Идентификация и анализ промоторных мишеней для GreA E. coli и Gfh1 T. thermophilus

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структурная организация функционально активных комплексов РНК полимеразы E. coli с факторами транскрипции GreA и GreB. Идентификация и анализ промоторных мишеней для GreA E. coli и Gfh1 T. thermophilus"

OÜ34823G5

На правах рукописи

ОЗЕРОВА МАРИЯ ВЛАДИМИРОВНА

Структурная организация функционально активных комплексов РНК полимеразы Е. coli с факторами транскрипции GreA и GreB. Идентификация и анализ промоторных мишеней для GreA Е. coli и Gfhl Т. thermophilus

03.00.03. - молекулярная биология

5 [-'оя ^п^г)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино-2009

003482365

Работа выполнена в лаборатории функциональной геномики и клеточного стре Учреждения Российской академии наук Института биофизики клетки РАН Университете медицины и стоматологии штата Нью Джерси (Стратфорд, США).

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Озолинь Ольга Николаевна

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

кандидат биологических наук Борухов Сергей Ионович

доктор биологических наук Станислав Владимирович Никонов кандидат биологических наук Марина Викторовна Захарова

Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии РАН

Защита диссертации состоится «&» ноября 2009 года в « 15 » часов 30 мин. заседании диссертационного совета Д 002.038.01 в ИБК РАН по адресу: 14229 Пущино Московской области, Институтская ул. 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института Биофизики Кле РАН

Автореферат разослан октября 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Т.И. Смолих

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Транскрипция генов является первым этапом реализации генетической информации у всех живых организмов. Ключевыми ферментами, катализирующими этот процесс в эукариотических и прокариотических клетках, являются многосубъединичные ДНК-зависимые РНК полимеразы (РНКП). Сложность транскрипции и необходимость ее координации для множества генов во время клеточного роста и в ответ на различные изменения внешней среды в бактериальных клетках требует строгого контроля активности РНКП. Принято считать, что основная регуляция этого процесса осуществляется ДНК-связывающими белками на стадии взаимодействия РНКП с промотором и инициации синтеза РНК. Однако, существует еще один класс регуляторов -белковые факторы, взаимодействующие с РНКП в области ее вторичного канала и непосредственно влияющие на процесс катализа. В эту группу входят белки семейств Gre (GreA, GreB и Gfhl), DksA (DksA, TraR) и Rnk, которые обладают структурной гомологией, но сильно различаются функционально.

Gre-подобные белки, для которых накоплен большой объем генетических и биохимических данных, являются прекрасными моделями для изучения регуляции транскрипции через вторичный канал РНКП. В экспериментах in vitro Gre-белки стимулируют синтез РНК за счет (1) ускорения перехода от инициации к элонгации, (2) предотвращения образования пауз транскрипции и арестованных комплексов, (3) повышения точности транскрипции. Действие Gre-белков основано на индукции и модуляции собственной транскриптрасщепляющей активности РНКП [Borukhov 2005]. Для более полного понимания их биологической роли, требуется понять, какие из выявленных in vitro эффектов, имеют физиологическое значение, а так же определить этапы транскрипции, на которых эти эффекты наиболее выражены. В то же время, Gfhl из Thermus thermophilus, являясь антагонистом GreA и GreB, ингибирует все активности РНКП. Его биологическая роль Gfhl пока мало понятна. Предполагается, что Gfhl может специфично ингибировать синтез РНК в определенных условиях жизни клетки [Laptenko 2006].

В настоящее время структуры высокого разрешения комплексов бактериальных РНКП с факторами вторичного канала не описаны. Существует только несколько спорных моделей, созданых на основании криоэлектронных структур низкого разрешения, и биохимических данных с использованием мутантных форм Gre-белков [Opalka 2003; Sosunova 2003; Laptenko 2003]. Отсутствие детальных структурных данных затрудняет понимание молекулярных механизмов, определяющих взаимодействие этих факторов с компонентами вторичного канала РНКП, а возможные функционально активные состояния их комплексов с РНКП остаются неизученными. Для создания целостной картины регуляции активности РНКП Gre-подобными белками необходимо получить как можно более детальную структурную модель комплексов РНКП-Gre, учитывающую их конформационные изменения на различных стадиях транскрипционного цикла.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось определение структурно-функциональной организации комплексов бактериальной РНКП с факторами транскрипции GreA и GreB Е. coli, а также изучение функциональной роли GreA Е. coli и Gre-подобного транскрипционного ингибитора Gfhl из Thermus thermophilus на разных этапах транскрипции.

В работе были поставлены следующие задачи:

1) картировать и исследовать расположение Gre-белков в комплексах с РНКП;

2) определить пространственное расположение регуляторного домена - G-петли ß'-субъединицы РНКП относительно Grc-белка, ДНК и элементов вторичного канала РНКП в элонгационном комплексе;

3) создать детальную модель комплекса Gre-белков с РНКП;

4) исследовать роль транскрипт-расщепляющей активности GreA в стимуляции транскрипции, иинциированной с разных промоторов Е. coli',

5) определить этап транскрипции, на котором действует Gre-подобный транскрипционный ингибитор Gfhl из термофильной бактерии Thermus thermophilus.

Научная новизна. Впервые предложена структурная модель комплекса РНКП-Gre, которая описывает расположение Gre-белков и G-петли относительно структурных модулей РНКП, ДНК и Gre-белков в элонгационном комплексе и учитывает возможные функциональные состояния Gre-белков. Впервые продемонстрирована необходимость расщепляющей активности GreA для стимуляции транскрипции, инициированной с пяти промоторов Е. coli. Получены новые данные, свидетельствующие о том, что GreA активирует переход абортивного комплекса к продуктивному синтезу РНК. Впервые установлен промотор-специфичный ингибирующий эффект Gre-подобного фактора транскрипции Gfhl, который наиболее выражен на стадии абортивного синтеза и обусловлен прямой конкуренцией Gfhl с нуклеозидтрифосфатами (НТФ).

Научно-практическая ценность. Предложенная в данной работе структурно-функциональная модель РНКП-Gre позволяет понять важнейшие аспекты регуляции транскрипции и открывает ряд возможностей для дизайна новых эффективных регуляторов транскрипции и антибиотиков, мишенью которых, также как и для Gre, могут стать подвижные структурные элементы активного центра фермента. Описанная модель вносит определенную ясность в понимание механизма передачи регуляторных сигналов, обеспечивающих фактор-зависимую регуляцию активности РНКП. Обнаружение стадии транскрипции, на которой действуют факторы вторичного канала РНКП - GreA Е. coli и Gfhl Т. thermophilus - позволяет предположить, что биологическая роль GreA заключается в повышении общего уровня синтеза РНК за счет уменьшения количества абортивных продуктов. Согласно полученным данным, Gfhl должен ингибировать синтез РНК в клетке, преимущественно действуя на танскрипционные комплексы, которым для начала синтеза РНК необходимы высокие концентрации субстратов. Такая регуляция может быть востребована для адаптации аппарата транскрипции клетки к изменяющемуся уровню источников питания.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на международной конференции International Е. соП alliance (Hinxton, UK, 2008), конференции UMDNJ Biomédical Sciences Conférence (Stratford, NJ, USA, 2008), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008). Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 6 печатных работ, из них 2 статьи и 4 тезисов стендовых сообщений на конференциях. Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего И2.9 источников. Работа изложена на <f 7- страницах машинописного текста и содержит 29 рисунков и _4_ таблицы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Компьютерные программы. Для моделирования структуры комплексов РНКП с Gré-белками использовали программы Accelrys DS Visualiser 1.7 и Molsoft 3.6. Выделение белков. РНКП T. thermophilus выделяли из клеток штамма НВ8 в соответствии с рекомендациями [Vassylyeva 2002]. РНКП Е. coli выделяли из Е. coli GreA'/GreK AD8571 или CAG 3016, трансформированный pCYB2b" С-РКА (экспрессирующей Р'-субъединицу Е. coli РНКП с С-концевым 6xHis и РКА сайтами под контролем ИПТГ индуцируемого tac промотора) по методике, описанной в [Nudler 2003]. Для выделения 6xHis-PHKn Е. coli в качестве первого этапа очистки использовали хроматографию на Ni-NTA агарозе (Qiagen, США). Выделение Gre-белков и их мутантов осуществляли согласно методике, описанной в [Laptenko 2003].

Модификация Gre-белков FeBABE-бромо ацетамидом и азидофенацил-бромидом. Рост клеток и выделение Gre-белков проводили непосредственно перед модификацией, чтобы избежать окисления Cys. После связывания Gre-белков из клеточного лизата на Ni-NTA агарозе, ее последовательно промывали 3 объемами буфера ЛБ (40 мМ Трис-HCl рН 7.7, 100 мМ NaCl, 10 мМ Р-МЭ); 5 объемами ЛБ с 1М NaCl и 2 объемами 40 мМ фосфатного буфера, рН 7.0 (ФБ), не содержащего р-МЭ. Затем к суспензии Ni-NTA агарозы с иммобилизованным очищенным Gre-белком в ФБ сразу добавляли FeBABE бромо ацетамид или азидофенацилбромид до конечной концентрации 1 мМ. Инкубацию с реагентами проводили в течение 1 часа при 25°С, после чего модифицированные и иммобилизованные на Ni-NTA агарозе Gre-белки промывали 3 раза 1 мл ФБ, содержащего 1М NaCl и 2 раза 1 мл ФБ. Степень модификации оценивали по уменьшению способности модифицированных цистеинов Gre-белков реагировать с флуоресцентным реагентом TexasRed-бромацетамидом. Чисту (более 90%) и степень модификации (80-85%) оценивали по данным денатурирующего белкового электрофореза в Трис-Трициновом 4-15% градиентном геле (GE Healthcare, США). Модифицированные белки, иммобилизованные на Ni-NTA агарозе хранили в темном месте при +4 °С .

Модификация ДНК FeBABE-бромо ацетамидом. nt-scaf-3'thiol-ДНК, содержащую на 3'-конце тиольную группу (ее структура описана на www.idtdna.com) обрабатывали реагентом Трис(2-карбоксиэтил)фосфин для восстановления SH группы. Реакционную смесь, содержащую 11 нмоль ДНК, 25 мМ Трис(2-карбоксиэтил)фосфин в 20 мМ буфере HEPES-NaOH, рН 7.5 инкубировали в течение 20 минут при 25°С. После этого ДНК, содержащую восстановленную SH-группу, очищали с помощью обратнофазовой хроматографии на С18-колонке (Amersham) в соответствии с [Gilar 2000]. Модификацию ДНК FeBABE-бромо ацетамидом проводили в 50 мкл реакционной смеси, содержащей 5 нмоль ДНК, 50 нмоль FeBABE-бромо ацетамида в 20 мМ фосфатном буфере, рН 7,5. Инкубацию проводили в течение часа при 25°С, после чего реакционную смесь наносили на колонку Quick-Spin, G-50 (Roche, США) для удаления непрореагировавшего FeBABE-бромо ацетамида.

FeBABE-индуцированнов гидроксилрадикалыюе расщепление РНКП: 1,6

пмоль очищенной и меченой [33Р] по р'-субъединице РНКП инкубировали в 6 мкл реакционной смеси с 48 пмоль Gre-белка (или ДНК-матрицы), модифицированных FeBABE, в присутствии 20 мМ HEPES (рН 7,5), 150 мМ NaCl, 5 мМ MgCl2, 0,3 мг/мл БСА в течение 10 мин при 37°С для образования исследуемого комплекса. Гидролиз инициировали добавлением 1 мкл 200 мМ аскорбата и 1 мкл свежеприготовленного раствора 10 мМ Н202. После 15 мин инкубации при 25°С реакцию останавливали 3,4 мкл 4-кратного стоп-буфера (Novex, США). Продукты расщепления разделяли на 7% или 12% ДСН-ПААГ. Анализ проводили на приборе Phosphorlmager или авторадиографическим методом.

Фотохимическое сшивание азидофенацил-производных GreA и GreB с РНКП.

GreA-AzPh (иммобилизованные на Ni-NTA агарозе или в растворе) смешивали с РНКП в эквимолярных соотношениях (1 мкМ) в 40 мМ фосфатном буфере, рН 7.0 и инкубировали в течение 10 мин при 30°С для образования комплекса GreA-РНКП. После завершения инкубации реакционную смесь облучали ультрафиолетом с Х=365 нм в течение 5 мин. После облучения Ni-NTA агарозу с иммобилизованным сшитым комплексом промывали 2 раза 40 мМ фосфатном буфером, рН 7.0 для удаления непрореагировавшей РНКП.

Транскрипция in vitro. Все реакции останавливали добавлением равного объема 2х Стоп-буфера". 90% формамид, 50 мМ ЭДТА, 1 мг/мл ксиленцианол, 1 мг/мл бромфенол голубой. После 2 мин инкубации при 100°С, продукты расщепления разделяли на 15, 20 или 23% полиакриламидном денатурирующем (7.М мочевина) геле и анализировали на приборе Phosphorlmager (Molecular Dynamics, США) или авторадиографическим методом.

Ингибирование транскрипции Gfhl проводили, используя линейные ДНК-фрагменты длиной 220 нуклеотидов (от -150 до +70 по отношению к началу транскрипции), содержащие различные промоторы T.thermophilus. Все реакции были выполнены при 55°С в буфере: 50мМ MOPS, рН 6.8; бОмМ КС1; 10 мМ MgCl2; 1мМ ДТТ; 0.2мг/мл БСА. Реакционная смесь содержала 50нМ ДНК, ЮОнМ РНКП T.thermophilus, смесь НТФ и [а-32Р]НТФ (3000 Ки/ммоль) в присутствии или

отсутствии 2.5 мкМ Gfhl. Для измерения кинетических параметров элонгации выполняли синтез полноразмерного продукта, начиная с «остановленного» элонгационного комплекса, полученного в отсутствии одного из нуклеотидов. Абортивный синтез динуклеотида pppGpG на промоторе rpsT проводили в присутствии увеличивающихся концентраций GTP, а тетрануклеотида pppGpApGpG на dnaK - в присутствии 0.5мМ GTP и увеличивающихся концентраций АТР.

Эффект GreA на транскрипцию с промоторов E.coli оценивали по результатам реакции с использованием в качестве матриц линейных промотор-содержащих фрагментов ДНК длиной 300 нуклеотидов (от -150 до +150 относительно старта транскрипции). Все матрицы имели терминатор транскрипции tR2. Реакции были выполнены при 37°С в ТВ (20 мМ Трис-HCl (pH 7.5), 100 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2, 5 мМ ß-МЭ) в присутствии или отсутствии 4.5 мкМ GreA. Реакционная смесь содержала 20нМ ДНК, бОнМ РНКП Е. coli, 0.1 мМ смесь НТФ и 5 мкКю [а-32Р]НТФ (3000 Ки/ммоль). Накопление абортивных продуктов регистрировали в реакционной пробе, содержащей 0.03 мМ НТФ, в остальном постановка реакции была такой же. Для подтверждения размеров РНК использовали [32Р]-радиоактивно меченные маркеры ДНК фХ174/НтЯ (Promega). Размер абортивных продуктов был подтвержден секвенированием РНК с использованием [у-32Р]НТФ и терминирующих 3 'деокси НТФ.

Анализ синтетической и расщепляющей активностей ковалентно-связаиных комплексов GreA-РНКП. Образование элонгационного комплекса из ковалентно-связанных комплексов GreA-РНКП и ДНК/РНК-матрицы (РНК длиной 16 нт) проводили в течение 5 минут при 30°С в ТВ, не содержащем MgCl2 (20 мМ Трис-HCl (pH 7.5 при 25°С), 100 мМ NaCl, 5 мМ ß-МЭ). После этого к реакционной смеси добавляли MgCb до 10 мМ, АТФ или все четыре НТФ до 50 мкМ и отбирали аликвоты в разное время для обнаружения синтетической активности РНКП. Расщепляющую активность GreA проверяли в отсутствии НТФ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Анализ взаимодействия Gre-факторов с РНКП и механизма их действия

1.1 Картирование пространственного расположения Gre-бслка в РНКП

На первом этапе создания детальной модели комплекса Gre-РНКП было необходимо определить контакты обоих доменов Gre-бвлков с кор-ферментом РНКП. Для этой цели были получены мутантные производные GreA и GreB Е. coli, из которых вначале были удалены природные цистеины (С58 и С68, соответственно), а затем в разные участки на поверхности белка были введены одиночные остатки цистеина, которые модифицировали химической протеазой FeBABE (Fe-р-бромоацетамидобензил ЭДТА) (рис 1). Добавление аскорбата и пероксида водорода индуцировало появление активных форм кислорода, в том числе ОН", которые разрушали все доступные связи на расстоянии 10-15 А от

исходного места связывания Fe2+. Для визуализации и идентификации продуктов гидроксилрадикального расщепления использовали радиоактивно-меченную (33Р) на С- или N-конце Р'-субъединицу РНКП, поскольку именно она формирует вторичный канал РНКП. Контрольные реакции, были выполненны с мутантными белками C58S GreA (рис 2А, дорожка 1) и C68S GreB Е. coli, не содержащими цистеиновых остатков, но модифицированными аналогично экспериментальным образцам. Такая стратегия адресной модификация Gre-белков позволила исследовать топологию их связывания с РНКП и выявить специфические контакты.

GreA/B ^^ Ч^

FeBABE Ч»

набор модифицированных GreA и GreB, расщепляющих на расстоянии ~15А

Рис 1. Схема модификации GreA и GreB реагентом ГеВАВЕ. Фигурными скобками выделены С- и N-концевой домены Gre-белков.

GreA/B г С

N^ ¡f j одиночные Cys мутанты GreA и GreB

Анализ продуктов расщепления позволил установить основные структурные модули РНКП, находящиеся в непосредственной близости от GreA и GreB. Они представлены четырьмя участками в Р'-субъединице: 1) coiled-coil доменом: Р'663-681; 2) районом F: Р'715-775; 3) G-петлей: (Г930-1160; 4) jaw-доменом: Р'1212-1230. Одна из основных зон расщепления - район 650-711 - приходится на структурно-консервативный участок полипептидной цепи Р'-субъединицы Е. coli РНКП - домен p'coiled-coil, являющийся основным местом связывания Gre-белков с РНКП (рис. 2 и 3). Только GreA C116-FeBABE расщепляет обе спирали этого домена (р'663 и р'681) с одинаковой интенсивностью (рис 2С, дорожка 3). Это говорит о том, что 116 аминокислота должна быть расположена между спиралями симметрично. GreA С4, содержащий FeBABE на границе С- и N-концевого доменов (ЫКД), расщепляет P'coiled-coil в его С-концевой спирали - Р'677 (рис 2С, дорожка 1). Зоны расщепления для позиций GreA 4 и 116 обладают наибольшей интенсивностью, что говорит об их близости к P'coiled-coil домену. Из трех остальных позиций С-концевого домена GreA (С142, С145 и С147) расщепление происходит в петлю P'coiled-coil, соединяющую две спирали этого домена (Р'670-675). Таким образом, эти данные позволяют ориентировать С-концевой домен GreA, почти перпендикулярно модулю P'coiled-coil в районе петли, соединяющей две его спирали.

жмш

Cj Cq Jjj

тттт» т. Мет -747.743 -670

— 822.821

943 - _ — -932

950

1025

-1040

— 1095 1050

1125,

1147- -1189 1147

1212-

* MM$

о » v <o

. Me-r

_ J 025 IOJO

- 1095

1189

1050

ж 747.743 950 - , 822.821 - p932

681 677 : 671 ; 663

* да! •

■

М, Ш- т ■ ■ J

1 2 3 4 5

Мет

1259 L/1190 <1096 1040 932

-822 -747 725 698 624 1-581 525

1 2 3 4 5

1234 56

1135-1-

1230-

12 3 4

f P'GNCD 978. 998. 1020. 1050.1106.11161125 IG' 1160

I coiled-coi! 670,675 I p'GNCD 1050

*C142 ^ C.145

icSleJ-coil671.676 (p'GNCD 1050 '/coited-ral670.674 \ IVGNCD 1050

F 715,730,775 G 930 G' 1135 Jaw 1230

Рис. 2 Карты гидроксилрадикального расщепления Е. coli РНКП Gre-бвлками, модифицированными FeBABE. BrCN - расщепление Р'-субъединицы РНКП по Met. Справа от каждой авторадиограммы напротив линий указаны позиции BrCN-расщепления по метионинам Р'-субъединицы РНКП. А, В, С - Расщепление [Р33]р'-субъединицы РНКП FeBABE-GreA. Авторадиограмма 12% (А и В) и 7% (С) Трис-Гли ПААГ. А1 - GreA C58S, не содержащий Cys; А2,3 - GreA К63С и S70C, соответственно. IА4, В1 и D2 - исходный меченный и очищенный кор-фермент РНКП. В2-В6 - GreA 14С, G145C, KI16С, К142С, Е147С, соответственно. Слева стрелками указаны специфические зоны расщепления р'-субъединицы РНКП FeBABE-производными GreA, цифры указывают на аминокислоту, в районе которой происходит расщепление. D - Расщепление [Р33]р'-субъединицы РНКП FeBABE-GreB. Авторадиограмма 12% Трис-Гли ПААГ. D1 и D4- GreB К53С и S78C; Е - Схема Ре2+-индуцированного гидроксилрадикального картирования Р'-субъединицы из различных позиций Gre-белков. Фигурными скобками объединены элементы Р'-субъединицы. в которых происходит расщепление из соответствующей позиции GreA (отмечена желтым) или GreB (красным).

J Локализация других зон Fe2+-BABE индуцированного гидроксилрадикального расщепления однозначно указывает на связывание Gre-белка с РНКП в районе вторичного канала и взаимодействие с его подвижными элементами - jaw-доменом, G-петли и F-мостика, а так же P'GNCD (Рис. 2Е и ЗС). Участок расщепления из позиций 63 и 70 GreA представлен С-концевым участком ! jaw-домена (Р'1151-1214) в районе аминокислоты 1212 (Рис. 2А, Е). Он образует

внутреннюю стенку на выходе из вторичного канала, что позволяет расположить здесь середину N-концевого домена GreA (аминокислотные остатки 63 и 70).

Кроме того, GreA-FeBABE расщепляет районы G и G' консервативной части G-петли из позиций 4, 63 и 70 N-концевого домена (рис. 2А -дорожки 1,2; 2В -дорожка 2 и 2Е). Эта часть петли в структурах высокого разрешения РНКП Т. Thermophilus обнаружена в двух возможных конформациях - «закрытой» и «открытой». Аминокислоты 4, 63 и 70 GreA удалены более чем на 30 А от активного центра, что позволяет предположить, что G-петля в РНКП-GreA комплексах имеет «открытую» форму, располагаясь параллельно N-концевому домену GreA.

Расщепление из всех рассматриваемых позиций Gre-белков наблюдается и в неконсервативном участке G-петли ((3'GNCD), который представляет собой «вставку» в центре консервативного района G (район 940-1132 между G и G' на рис. ЗС). Этот домен отсутствует в (3'-субъединице РНКП T. thermophilus и Т. aquaticus, структуры которых определены с высоким разрешением и невиден в криоэлектронной структуре Е. coli РНКП, что может объясняться его высокой подвижностью. Отсутствие структурных данных для этого домена не позволяет использовать его для моделирования расположения Gre-белков. Но картирование P'GNCD относительно Gré-белка и какого-либо другого структурного элемента (например, ДНК) могло предоставить ценную информацию о структурно-функциональной организации вторичного канала РНКП и поэтому стало предметом дальнейшего исследования (см. раздел 1.2).

На данном этапе анализ профилей гидроксилрадикального расщепления Р'-субъединицы РНКП (рис. ЗС) позволил создать стационарную модель комплекса РНКП-Gre (рис. ЗА и В), в которой: 1) С-концевой домен Gre связывается в районе соединяющей петли модуля P'coiled-coil, формирующего вход во вторичный канал РНКП; 2) N-концевой домен Gre-белка находится во вторичном канале, образуя контакты с jaw-доменом, F-мостиком и «открытой» G-петлей; и 3) консервативные остатки D41 и Е44 N-концевого домена находятся в непосредственной близости от каталитического иона Mg2+, поскольку они принимают непосредственное участие в гидролизе РНК. Для достижения наилучшего соответствия полученным данным мы использовали ручную подгонку структуры высокого разрешения GreA [Stebbins 1995] и холофермента T. thermophilus [Vassylyev 2002] с помощью программы Accelrys DS Visualiser 1.7.

'Ж 1ДГ>'«1\ V, л

гМт'

100 200 N в 103

400

Р'соИ-соИ Р (650-711) (426-556)

600 ^ ^коо

1СЗ ^ _

670*674 6714» 676 670А 675 663А А 681

А 677

775 730 715

в

(920-1190)

/ 1000 \ I г

*1050

jaw (1151-1214)

12(/о

*1050

*943 1125**1147*1212 А 943 1125**1147* 1212 А943 '1050 '1147 Л925 А1135 1 1230

1020*1050 11251160 998 1116 978 1106

I 400 С Е147С С145С<? К142С го К116С ** Б70С К63С 14С

К53С У Э78С

Рис. 3 Структурная модель комплекса Сге-РНКП.

А и В - Зеленым цветом обозначен вгеА; желтым - р'сойей-сой домен; розовым - р-мостик (ВН); синим -в-петля (ТЬ) и оранжевым - jaw-дoмeн. На панели (А) Вторичный канал РНКП обозначен белой пунктирной линией; каталитические ионы М&2+ представлены в виде розовых сфер. С - Линейное изображение р'-субъединицы РНКП Е.соИ. Позиции вге-белков, модифицированные ИеВАВЕ указаны в правой части рисунка. Консервативные участки обозначены буквенными обозначениями в черных прямоугольниках. Цвета обозначения участков р-, расщепляемых ОгеА и ОгеВ соответствуют тем, которые указаны на верхней панели. Районы в и С, обозначенные синими прямоугольниками представляют собой консервативную часть Б-петли (между ними расположена неконсервативная вставка Е.соИ Р'ОЧСО).

1.2 Определение пространственного расположения неконсервативного регуляторного домена в-петли относительно элементов РНКП и ДНК в элонгационном комплексе

Рис. 4 Структура неконсерватнвной части С-петли -Р'&УСР (СЫепоу е1 а1,2005).

Зеленым цветом отмечен гибкий соединительный участок между ее доменами, голубым - участки соединения с консервативной частью О-петли.

С-концевой домен

М-концевой домен

G-петля ß'-субъединицы РНКП Е. coli представлена консервативной частью домена G, известным у всех бактерий и неконсервативной вставкой в середине этого домена (ß'GNCD), обнаруженной у некоторых из них. В настоящее время накоплен значительный объем биохимических данных, полученных в экспериментах in vitro, говорящих о важности ß'GNCD в регуляции каталитических функций РНКП и во взаимодействии с транскрипционными факторами [Zaharova 1998; Chlenov 2005]. Для анализа этих данных необходимо иметь детальную модель, показывающую взаимодействия этого домена с другими структурными элементами РНКП и факторами транскрипции.

Расположение ß'GNCD РНКП удобнее всего исследовать с помощью «внешних» факторов, таких как Gre-белок, ДНК или РНК, образующих комплексы с РНКП. Это позволяет использовать радиоактивно меченную РНКП с одной стороны и реакционную группу (например FeBABE) на «внешнем» факторе, с другой. Кроме того, недавно была определена структура домена ß'GNCD (рис. 4), отдельно от РНКП [Chlenov et al, 2005]. Это позволяет использовать ее для дальнейшего моделирования.

Наличие множественных зон расщепления из различных позиций Gre-FeBABE наблюдается в основном в N-концевой части ß'GNCD (рис. 2Е и ЗС). В то время как расположение ее С-концевого участка требует определенного уточнения. Для этого необходима дополнительная «реперная» точка, находящаяся в удаленном месте от вторичного канала, но вблизи от ß'GNCD (например участок выходящей из главного канала ДНК). Подобную точку можно получить с использованием «откатившихся» (backtracked) элонгационных комплексов, которые являются функциональной мишенью для Gre-белков. Пространственное расположение ß'GNCD в таких комплексах представляет особый интерес для изучения молекулярных механизмов регуляции каталитических свойств РНКП Gre-белками. Исходя из данных кристаллической структуры элонгационного комплекса T.thermophilus, в непосредственной близости от предполагаемой локализации ß'GNCD находится выходящая из главного канала ДНК (позиции +10/+11 матричной и +14/+15 нематричной цепей) [Vassylyev 2007]. Поэтому для картирования ß'GNCD, кроме одиночных цистеинов Gre-белка, было промодифицировано FeBABE и +14 основание нематричной нити ДНК в элонгационном комплексе (рис. 5А).

Расщепление ß'-субъединицы FeBABE из этой позиции было зарегистрировано в двух местах: N-концевом участке jaw-домена (ß'1170) и ß'GNCD (ß'1073) (рис. 5В и 6). При этом [33P]GreA не расщеплялся FeBABE (рис. ЗС), что говорит о его удаленном расположении от выходящей ДНК и предполагает наличие места для расположения ß'GNCD.

Сопоставляя предложенную в предыдущей главе модель комплекса Gre-РНКП (рис. 3) с данными гидроксилрадикального расщепления из +14 позиции нематричной цепи ДНК можно достаточно точно расположить выступающую над вторичным каналом часть ß'GNCD (отмечена фиолетовым цветом на рис. 6АВС).

— 1189

1 2 3

Рис. 5 Картирование ß'GNCD Е. coli РНКП в элонгационном комплексе, в котором нематричная цепь ДНК (нтДНК) была модифицирована FeBABE. А - схема расположения Gre-белка и З'-конца нтДНК относительно G-петли в «откатившийся» элонгационном комплексе. Ее неконсервативная часть (ß'GNCD) обозначена пунктиром. В - Ре2+-индуцированное гидроксилрадикальное расщепление [33P]ß--субъединицы в элонгационном комплексе с GreA и FeBABE-ДНК (в подписи над рисунком обозначено как FeB), Авторадиограмма 12% Трис-Гли ПААГ. Дорожка 1 - комплекс с З'-FeBABE-ДНК; дорожка 2 - комплекс с ДНК, без модификации FeBABE; дорожка 3 - расщепление ß-субъединицы РНКП по остаткам Met (BrCN), справа напротив черных линий указаны позиции расщепления по Met. Стрелками слева указаны специфические зоны расщепления ß' субъединицы РНКП FeBABE-ДНК. С - Ре2+-индуцированное гидроксилрадикальное расщепление GreA в элонгационном комплексе с FeBABE-ДНК. Обозначения 1 и 2-ой дорожек как в (В). Дорожка 3 -контрольное расщепление GreA Fe2+H3 активного центра в районе 44 аминокислоты.

1.3 Определение необходимого для связывания Gre-бвлков расположения консервативной части G-петли во вторичном канале РНКП

Определение конформации консервативной части G-петли необходимо для идентификации места соединения с ß'GNCD в функционально-активных комплексах РНКП с Gre-белками. Кроме того, эта задача тесно связана с вопросом о возможности связывания Gre-белков с определенным типом РНКП-комплекса. За последнее время появились данные, указывающие на функциональную специализацию факторов вторичного канала. Это позволяет им избегать конкуренции друг с другом, несмотря на высокую структурную гомологию. Gre-белки должны обладать наибольшей аффинностью к «откатившимся» элонгационным комплексам, являющимися их функциональной мишенью, а также к кор-ферменту. Однако остается до конца непонятным 1) что мешает Gre-белкам взаимодействовать с другими комплексами РНКП (активным элонгационным и открытым промоторным комплексами) и 2) каким образом Gre-белки избегают конкуренции с НТФ и не ингибируют элонгацию транскрипции. Поскольку, связываясь во вторичном канале, они создают стерические ограничения для попадания НТФ в каталитический центр, а, конкурируя с каталитическим ионом Mg2+, препятствуют синтезу РНК.

А

ßW3 ^ ^ , Jtf)

ß'978 * ............

ß'1020 \ ' *i\ 1 *

ß'943-950 >. ' 5

ß'925 • *

.GreA

ß'GNCD

Ol

N

a im

670^674 671^ 676 670^675 663yy681 600 7Ж

A677

y1050

у 1050 970f T1010 1000

"ЯШЩШВ

Ж775 730 715

1200

UM

А 943 1125**1147*1212 Л943 1125А.Ж1147*1212 Ж943 ^1050 Att47 Л1073 Ж1170 A925 A1135 11230

1020A*1050^12541160

E147C G145C K142C K116C

1400

С

GreA

S70C K63C I4C

нтДНК14 скаффолд K53C S78C

GreB

Рис. 6 Структурная модель ß'GNCD в контексте ß'coiled-coil домена, ДНК/РНК-матрицы и Gre-белка. А и В - ß'coiled-coil обозначен желтым цветом; ДНК/РНК-матрица представлена в виде ленточной модели (светло-желтым -нематричная, зеленым -матричная цепи, красным - РНК). Участки расщепления из различных позиций Gre-белков в ß'GNCD и ß'coiled-coil обозначены зеленым цветом, из +14 позиции нтДНК - красным. На панели (А) зелеными цифрами указаны позиции расщеплений из Gre-белка, красными цифрами - из +14 позиции нтДНК. Два каталитических иона Mg2+ обозначены розовыми сферами. С - линейное изображение ß'-субъединицы Е. coli РНКП с результатами картирования ß'GNCD относительно Gre-белка и выходящей ДНК и элементов РНКП. Обозначения такие же как на рис. 3С. Позиции Gre-белков и ДНК, модифицированные FeBABE указаны в правой части рисунка. Район ß'GNCD обозначен фиолетовым прямоугольником.

В полученных недавно кристаллических структурах элонгационных комплексов Т. АегторЬПиз в-петля была определена в двух конформациях -«открытой» и «закрытой» [Уа55у1уеу 2007]. Они, вероятно, характерны для РНКП на разных стадиях транскрипционного цикла. Для определения роли конформации й-петли во взаимодействии вге-белков с РНКП и их функциональной специализации была проверена способность вгеА образовывать комплексы с цистеиновыми мутантами РНКП, в которых в-петля зафиксирована дисульфидной связью в двух альтернативных конформациях («открытой» и «закрытой») (рис. 1С и Э). Ковалентные сшивки были сконструированы на основании двух структур элонгационного комплекса (в присутствии и отсутствии правильного НТФ). РНКП со сшивкой между аминокислотными остатками 937 и 1139 (район в и С) с

- 14-

«открытой» в-петлей будет в дальнейшем называтся - СС-С (рис. 7С), а между 748 и 940 (район Р и в) с «закрытой» в-петлей - СС-Н РНКП (рис. 70). Об образовании | дисульфндной связи цистеинами в-петли РНКП свидетельствовало изменение электрофоретической подвижности Р'-субъединицы СС-С и СС-Н (8БР') (рис. 7А дорожки 1 и 2) по сравнению с Р' дикого типа (Р'\у1) (дорожка 3) в ДСН-П ААГ.

А В

Взаимодействие вгеА с РНКП было проверено с использованием метода фотосшивки между СС-С или СС-Н РНКП и радиоактивно меченным вгеА, ' несущим фотореактивную группу (АгРЬ) в положении С145. Эта позиция в вгеА | удалена от в-петли и сшивка не должна изменять ее конформацию. Результаты фотосшивки однозначно свидетельствуют о том, что конформация СС-С отражает то состояние РНКП, с которым взаимодействует вгеА (рис. 7В, дорожка 1 и 7С), хотя, возможно, она и не являются наиболее выгодной в функциональном отношении. С другой стороны, конформация СС-Н препятствует связыванию вгеА с РНКП, закрывая вход во вторичный канал (рис. 7В, дорожка 2 и 7Б).

Очевидно, что для взаимодействия вгеА с РНКП О-петля должна иметь «открытую» или сходную с ней конформацию. В опубликованных кристаллических структурах показано, что эта конформация характерна для элонгационных комплексов, формирующихся в отсутствии комплементарного

Рис. 7 Определение конформации G-петли, необходимой для взаимодействия РНКП с GreA. А -

образование сшивок между цистеинами G-петли в СС-С и СС-Н РНКП. 4-12% ДСН-ПААГ, окрашивание Кумасси R250. В - Ковалентная сшивка AzPh-Gl 45C-GreA-[33P] с мутантными формами РНКП, имеющими различные конформации G-петли. Авторадиограмма 7% ДСН-ПААГ. С и D - схемы, показывающие конформации G-петли в СС-С и СС-Н РНКП.

О-петпя

открыта

?

Ж G-петля * "закрыта"

GreA -PIIKI1 сшннка

субстрата и поэтому склонного к «откатыванию» [Vassylyev 2007; Wang 2009]. С такими комплексами и должны взаимодействовать Gre-белки для возобновления транскрипции. Таким образом, G-петля играет определенную роль во взаимодействии Gre-белков с РНКП и, возможно, их функциональной специализации.

1.4 Альтернативные положения Gre-белков во вторичном канале РНКП

До настоящего времени не было известно статичны или динамичны взаимодействия Gre-белков в РНКП во время их функционирования. К тому же, не до конца понятно только ли изменение конформации G-петли за счет ограничения связывания Gre-белков с функционально-активными комплексами позволяет им избегать конкуренции с НТФ. С другой стороны, известно, что GreA, содержащий замены необходимого для катализа D41 на Arg и Ser, в реакции расщепления РНК in vitro неактивен, но ингибирует синтез РНК и является токсичным для роста клеток. В то же время, неактивный мутант D41E такими свойствами не обладает. Мы предположили, что Gre-белки способны изменять свою активность за счет изменения положения во вторичном канале, которое позволяет НТФ диффундировать к каталитическому центру и располагать каталитическую петлю N-концевого домена в удалении от Mg2+. Таким образом, после гидролиза РНК GreA не обязательно должен покинуть транскрипционный комплекс. Оставаясь в нем, он может изменить конформацию так, чтобы не препятствовать дальнейшему синтезу РНК. Замены D41 на аминокислоты, имеющие другую геометрию и заряд, могут приводить к нарушению конформационной подвижности GreA и удерживанию каталитической петли N-концевого домена вблизи каталитического центра.

Предположение об изменении конформации GreA во вторичном канале РНКП в процессе его функциональной активности было проверено в экспериментах по транскрипции ш vitro с использованием комплексов, в которых GreA был зафиксирован в различных положениях РНКП сайт-специфической фотосшивкой. Сшитые комплексы были получены с использованием двух одиночных цистеиновых мутантов GreA, несущих фотореактивную группу AzPh в положениях С63 и С145. Место сшивки РНКП с GreA С63 во вторичном канале (район ß'932-950), a GreA С145 - в ß'coiled-coil (район ß'675) было определено с помощью химического и ферментативного картирования.

GreA фиксированные в РНКП из позиций 63 и 145 находятся в различных конформациях относительно КЦ, о чем свидетельствуют эксперименты по по расщеплению РНК16 до РНК14 и по удлинению РНК16 до РНК17 (в присутствии АТФ) или до более длинных продуктов (в присутсвии всех 4х субстратов). Так, сшитый GreA-бЗС за 30 минут расщепляет 40% РНК16 (рис. 8, дорожка 6), в то время как GreA-145C только 5% (дорожка 10), при этом начальные скорости расщепления РНК для этих комплексов отличаются почти в 30 раз (таблица под авторадиограммой). Это говорит о том, что конформация сшитого GreA-63C гораздо более соответствует каталитически-компетентному положению Gre-белка

-16-

и является функционально-активной, в отличие от сшитого СгеА-145С. Скорость расщепления сшитого ОгеА-63С только в 3 раза меньше, чем для нековалентного комплекса РНКП с ОгеА, в котором ОгеА может свободно изменять конформацию во время функционирования.

Конформация ОгеА-145С может соответствовать той, которая должна быть после расщепления РНК в комплексе ОгеА-РНКП, чтобы фермент мог возобновить транскрипцию. Об этом свидетельствует способность двух сшитых комплексов вгеА-бЗС и ОгеА-145С осуществлять реакцию синтеза РНК. За 10 минут вгеА-бЗС синтезирует только 8% РНКП, а ОгеА-145С - 55% (рис. 8, дорожки 7 и 11), а начальная скорость образования РПК17 для ОгеА-63С в 15 раз меньше, чем для ОгеА-145С. Эта же закономерность наблюдается и в присутствии всех четырех НТФ. Таким образом, фиксирование ОгеА-145С действительно не мешает РНКП осуществлять транскрипцию. Это свойство сшитого ОгеА-145С почти не отличается от комплекса РНКП со свободным ОгеА, который, принимая необходимую конформацию, не препятствует синтезу (рис. 8, дорожки 15 и 16).

М!-СгеА-РНКП сшивки С58.Ч К63С С145С

©■ р 9 в Э

М-РНКП+СгеА

И

е 8 § н н я м

< х г ¡-

в в < я =

■л

= ё < =

10 11 12 13 14 15 16

Начальные скорости реакции (V)

расщепления РНК

комплекс V

РНКП (у.е./мин)

К63С 27

СИбС 1

С58Б 0.8

РНКП 0.4

РНКП+ОгеА 68

удлинения РНК

комплекс V

РНКП (у.е./мин)

К63С 1

С145С 15

СбвЭ 2.6

РНКП 30

РНКП+ОгеА 20

Рис. 8 Активности сшитых комплексов СгеА-РНКП. Авторадиограмма 23% ПААГ с 7М мочевиной. Сверху обозначены сшитые комплексы с соответствующим мутантом ОгеА (С58Э не содержит Сув). ТБ - инкубация в транскрипционном буфере (30 минут); АТФ - инкубация в ТБ + АТФ (10 минут); НТФ - инкубация в ТБ в присутствии 4-х НТФ (10 минут). №-РНКП+ОгеА, иммобилизованная на №-МТА-агарозе РНКП в комплексе со свободным (несшитым) ОгеА. Слева обозначены размеры РНК-продуктов (14, 16, 17 нт).

Кроме того, в присутствии НТФ (или только АТФ) мы практически не наблюдаем расщепления РНК в РНКП+ОгеА и С145С (рис. 8, дорожки 11, 12 и 15, 16). Поскольку присутствие высоких концентраций НТФ позволяет находиться

комплексу преимущественно в посттранслокационном состоянии, в котором ОгеА, вероятно, принимает «неактивную» конформацию.

На основании полученных данных можно заключить, что одна из фиксированных конформаций ОгеА во вторичном канале (К63С) позволяет ему с высокой эффективностью расщеплять РНК, но препятствует синтезу РНК; другая (0145С), наоборот, ингибирует расщепляющую активность ОгеА, но не мешает транскрипции. В то же время, комплекс РНКП со свободным ОгеА каталитически-активен в обеих реакциях, что, по-видимому, объясняется свободой его перемещения во вторичном канале. Подвижность ОгеА объясняет тот факт, что он не препятствуют НТФ проникать в каталитический центр и не конкурируют с ними за связывание 1У^2+. Два описанных выше комплекса могут отражать две функциональных конформации ОгеА. Первую из них он принимает при расщеплении РНК в «откатившихся» комплексах (К63С), после чего смещает каталитическую петлю 1Ч-концевого домена, чтобы не препятствовать

Рис. 9 Схема, показывающая наблюдаемые конформации ОгеА во вторичном канале РНКП.

Место сшивки ОгеА с РНКП обозначено жирной волнистой линией. Две сферы (I и II) - каталитические ионы

Обнаруженная конформационная

динамика ОгеА в функционально-активных комплексах должна быть обусловлена изменениями в конформации РНКП. Оге-белки взаимодействуют со многими подвижными элементами вторичного канала РНКП (см. главу 1.1), которые претерпевают конформационные изменения во время каталитического цикла РНКП. Один из таких элементов - консервативный участок О-петли определяет возможность связывания Оге-белка с РНКП и, возможно, его функциональную специализацию (см. главу 1.3).

Для того чтобы определить, какие элементы РНКП «заставляют» Оге-белок изменять свое положение в различных комплексах был исследован профиль гидроксил-радикального расщепления РНКП после модификации ОгеВ 78С РеВАВЕ в: 1) открытом промоторном комплексе (ОПК); 2) ЭК16, находящемся преимущественно в посттранслокационной конформации; 3) ЭК17п-с1е2 в «откатившемся» состоянии; 4) кор-ферменте.

ОгеВ обладает большей аффинностью к РНКП и ее комплексам, чем ОгеА, что позволило получить большую эффективность расщепления. К тому же, как было показано на рис. 2, расщепление из 78 позиции ОгеВ происходит во множество участков О-петли, являющейся основным кандидатом на конформационные изменения при взаимодействии с Оге-белками. Кроме того,

дальнейшему синтезу РНК (рис. 9).

вгеВ гомологичен СгеА структурно и функционально, что позволяет распространять полученные с ним данные на СгеА.

Рис. 10 Диаграмма, отражающая удельную интенсивность зон гидроксилрадикального расщепления р'-субъединины в различных комплексах РНКП с GreB 78C-FeBABE.

При изменении положения участка РНКП, который взаимодействует с Gre-белком, должна изменяться и его доступность для расщепления Fe2*. Из проведенного анализа результатов расшепленния можно заключить, что при взаимодействии с GreB изменяется удельная интенсивность расщепления только зоны «1050» (увеличивается в ЭК) (рис. 10). Это говорит об увеличении ее доступности для расщепления GreB, а значит и приближении к позиции 78. Предварительная модель РНКП с Оге-белком и неконсервативным участком G-петли (рис. 6) показывает, что позиции GreB78 и (3' 1050 расположены на расстоянии, предполагающем их взаимодействие. Более того, аминокислота Р' 1050 расположена в подвижной петле P'GNCD, которая может изменять свое расположение, приближаясь или удаляясь от Gre-белка (петля Р' 1050 обозначена на рис. 6А).

Результаты этой серии экспериментов суммированы на рис. 11. Когда GreA/B связывается с РНКП (кор-фермент) и плавит ДНК (ОПК) он находится в неактивной, смещенной от каталитического центра конформации. После вступления в фазу элонгации (ЭК) G-петля РНКП меняет свою конформацию, приближая к GreA/B петлю «1050», тем самым, заставляя Gre-белок поворачиваться и приближать каталитическую петлю N-концевого домена к i каталитическому центру (каталитически-активное положение). Эта схема не отражает всех конформационных изменений, происходящих в РНКП при связывании Gre-белков, но позволяет объяснить причину изменения конформации ■ Сге-белков во вторичном канале.

кор- (холо-) фермент

открытый промоторныи комплекс

ЭК

„ рШШ "петля 1050"

\

Рис. 11 Схема, отображающая конформационные изменения СгеВ в различных комплексах под воздействием р'ИЧСО (кулачок). Сферами обозначены ионы М§2+ в каталитическом центре.

1.5 Моделирование структуры комплекса Сге-РНКП

Основываясь на данных, полученных в главе 1 и располагая структурами вгеА, ОгеВ, кор- и холофермента, ЭК РНКП, а так же (УСМСО высокого разрешения, была предложена модель Оге-белка в элонгационном комплексе РНКП (Рис. 12).

Рис. 12 Структурная модель элонгациониого комплекса с ОгеА. Зеленым цветом обозначен ОгсА; сиреневым - Р'ОМСИ; темно-синим - консервативная часть в-петли; ДНК/РНК-матрица представлена в виде ленточной модели (желтым -нтДНК, зеленым - тДНК, красным - РНК). (

Особое внимание при построении модели уделялось определению расположения в-петли и ее неконсервативного участка, поскольку она играет важную роль в функционировании Оге-белков, определяя их связывание с РНКП и конформационную динамику во вторичном канале. В этой модели Оге-белок

связывается с РНКП в районе ß'coiled-coil домена, его N-концевой домен расположен во вторичном канале, где контактирует с подвижными элементами ß'-субъединицы (jaw-доменом, F-мостиком и G-петлей). Консервативная часть G-петли находится в «открытой» конформации, а расположение ß'GNCD предполагает образование оптимальной сети контактов с Gre-белком и возможность описанных выше конформационных изменений. Grc-белок не закрывает полностью вторичный канал, что предполагает некоторую свободу его перемещения для принятия оптимальной конформации во время функционирования. Но каталитическая петля к двумя кислыми консервативными аминокислотными остатками располагается непосредственно в каталитическом центре.

2. Роль расщепляющей активности GreA в стимуляции транскрипции с промоторов Е. coli

В нашей лаборатории были получены данные (экспрессионный анализ на микроматрицах), свидетельствующие о том, что GreA дикого типа (СгеАдт) на некоторых оперонах стимулирует транскрипцию, а на других не оказывает на нее влияния или ингибирует. В то же время, функционально неактивный мутант GreA-D41E не изменял ее уровень во всех случаях. Молекулярный механизм этой избирательности был совершенно не понятен, но сам факт указывал на то, что РНК-расщепляющая активность GreA может быть важна для регуляции экспрессии ряда генов. Важное наблюдение состояло в том, что все гены оперона, отвечали на присутствие GreA одинаковым способом, что предполагает действие GreA на стадии инициации транкрипции и/или ухода РНКП с промотора.

Как известно, РНКП начинает транскрипцию с синтеза коротких абортивных РНК. Изменение эффективности этого процесса может влиять на образование полноразмерного продукта РНК. Для выяснения влияния GreA на способность РНКП переходить от абортивного синтеза коротких олигонуклеотидов к продуктивной элонгации были исследованы РНК, образующиеся в условиях многократной инициации транскрипции in vitro в присутствии и отсутствии GreA. Поскольку абортивный синтез - реферативный процесс, то после каждого цикла «прочитывания» матрицы эффект GreA должен накапливаться, что позволяет его оценить более достоверно.

По данным экспрессионного анализа на микроматрицах были выбраны 6 положительно-регулируемых промоторов (rplN, ompX, rpsJ, lpp, rplY и rpsB). Матричные ДНК (мДНК) для транскрипции были получены с помощью ПЦР.

Анализ полученных результатов свидетельствует о том, что для всех матриц GreAflT (но не GreA-D41E или GreA T.th) увеличивает количество полноразмерной РНК, но уменьшает число абортивных продуктов, имеющих длину 4-13 нуклеотидов (Рис. 13). Во всех случаях GreA это сопровождается накоплением ди-и три-нуклеотидов, которые являются продуктами расщепления GreA, а не

абортивной реакции. Исключение составил промотор гена отрХ, для которого мы не наблюдали образование абортивных РНК.

Эти данные свидетельствуют о том, что 1) ОгеА способен стимулировать транскрипцию на стадии инициации и 2) для такой стимуляции необходима его расщепляющая активность. Эта активность может быть важна для реактивации ранних арестованных комплексов в процессе ухода РНКП с промотора. Причем стимулируемое ОгеА расщепление РНК в таких комплексах может приводить к увеличению количества молекул РНКП, приступивших к продуктивной элонгации. Не исключено также, что ОгеА увеличивает эффективность транскрипции, удерживая короткие синтезируемые РНК в ее активном центре.

1 - •¡пу*]

00 ВО 30 60 30 т 30 60 1

грвВ

грзУ

ег I .Ф

......ж

. и м наш»! >' ' ■>

иМим ................

|рр

! сг: ^ и«1

гр!И

- У ✓

30 «0 39.60 30 60.30 69

111ШШ

12345678 й Т~т ПГГ8 Ь 1 ' I 3 4 5 _6 7 8 &12 34 56 76 512345678

Рис. 13 Влияние СгеА на синтез абортивных РНК в процессе многократной инициации транскрипции.

Авторадиограммы 23% денатурирующего ПААГ. Размеры абортивных продуктов указаны справа от каждой панели, продукты расщепления СгеА - отмечены внизу. СгеА обозначает вгеА дикого типа; 041Е -функционально неактивный ОгеА 041Е; Т.Й1 вгеА! - ОгеА1 ТЬегтиэ ЛегторЬПш.

Кроме этого, степень влияния ОгеА на синтез полноразмерного продукта оказалось зависимой от промотора. Такая специфичность может быть объяснена участием О-петли во взаимодействии с ОгеА (глава 1) Обладая высокой подвижностью, О-петля может «чуствовать» даже небольшие изменения в структуре ДНК и ДНК/РНК-гибрида, что может объяснять различную активность взаимодействующего с ней ОгеА на исследованных промоторах.

3. Определение функциональной мишени для действия Сге-подобного ингибитора транскрипции - вАй из ТЬегшив ШегторЬНив

Регулятор транскрипции ОШ из ТИегтиз 1кегторЫ1ш ингибирует синтез РНК в клетке за счёт конкуренции с НТФ субстратами РНКП, предотвращая их

связывание в активном центре фермента. В отличие от Оге-белков, Gfhl доставляет ! в активный центр РНКП 4 остатка Asp, которые конкурируют с НТФ за связывание в субстрат-связывающем сайте. По-видимому, эти остатки Asp имитируют j фосфатные остатки НТФ и координируют ион Mg2+ так, что блокируют попадание НТФ в каталитический центр, что ингибирует все каталитические активности ! РНКП [Laptenko 2006]. На модельном промоторе Т7А1 фага Т7 было показано что ' Gfhl действует как на инициацию, так и на элонгацию транскрипции [Laptenko ! 2006]. В то же время, можно было предположить и возможность ген-

специфической регуляции. | Для проверки предположения о специфичности действия Gfhl на различных

| промоторах мы провели эксперимент по образованию полноразмерного продукта I РНК (run-off) в присутствии и отсутствии Gfhl, а так же определили кинетические ' свойства для семи промоторов, выбранных из базы данных Thermus thermophilus. (PdnaK, PdnaA, PrpsT, PargF, P214, P35 и промотор для 16S РНК).

D0 0.2 0.4 0.6 0.6 1 1.2 1.4 1,6 [NTPJ, nil

Рис. 14. Анализ ингибирующей активности Gfhl на многократный синтез полноразмерного РНК-продукта. (А) - зависимость эффекта Gfhl от концентрации НТФ для различных промоторов. (В) -количества полноразмерной РНК и эффект Gfhl при 200мкМ НТФ. (*) - ранее опубликованные данные.

Из семи первоначально выбранных промоторов три оказались Gfhl-зависимыми - rpsT, dnaA, argF (6-8-кратное ингибирование для физиологических ■ концентаций НТФ 0,5 мМ), в то время как на остальных его эффект был выражен слабее (1х-3х для 0,5 мМ НТФ) (рис. 14А и В). Таким образом, исследованные промоторные комплексы заметно отличаются по чуствительности к Gfhl. Для выявления стадии транскрипции, на которой ингибирующий эффект Gfhl проявляет промоторную специфичность, мы исследовали кинетические свойства ' промоторных комплексов rpsT и dnaK в условиях однократной инициации транскрипции и абортивного синтеза in vitro.

Анализ скоростей синтеза РНК на стадии элонгации показал, что кажущиеся Км для НТФ варьируют в узком диапазоне (60-150 мкМ), a Gfhl увеличивает их до 600-1000 мкМ (Таблица 1). На стадии же абортивного синтеза Км для НТФ Gfhl-чуствительного промотора rpsT и резистентного dnaK отличаются в 20 раз (250мкМ и 12 мкМ соответственно). Gfhl незначительно изменяет Кч для НТФ на dnaK, но увеличивает ее в 8 раз для rpsT (таблица 2). I -23 -

промотор Км, мкМ

-аы +СПН эффект

Т7А1* 62 1500 24

с1паА 200 1500 7.5

грэТ 60 1000 17

а^ 150 1100 7.3

апаК 100 700 7

16Э РНК 90 650 7.2

Р35 135 750 5.5

Р214 150 750 5

промотор Км, мкМ

-С1Ъ1 +СП11 эффект

Т7А1* 300 1500 5

с1паК 12 25 2

грэТ 250 2000 , 8

* указывает, что данные для Т7А1 промотора были опубликованы ранее

Высокое сродство к НТФ у комплекса, формирующегося с промотором <1паК и отсутствие эффекта 0№1 на Км, указывает на то, что взаимодействие с субстратами в этом случае не является лимитирующей стадией в общем процессе инициации транскрипции. А низкое сродство к НТФ (Км=250мкМ) для грэТ по-видимому создает условия для эффективной конкуренции СЙ11 с субстратами, увеличивая Км до 2мМ. Ингибирующее воздействие ОГЫ может, следовательно, зависеть от свойств конкретного промотора. Это закономерно, поскольку инициация транскрипции является комплексным процессом со многими промежуточными стадиями, каждая из которых может быть подвержена воздействию разных регуляторных белков.

выводы

1) С помощью адресной модификации Gre-белков и ДНК-матрицы химической протеазой FeBABE определена локализация GreA и GreB во вторичном канале РНК-полимеразы E.coli.

2) С использованием мутантных производных РНК-полимеразы с G-петлей, фиксированной в двух альтернативных положениях показано, что для связывания GreA необходима ее «открытая» конформация. «Закрытая» конформация G-петли препятствует связыванию регулятора во вторичном канале фермента.

3) С помощью белок-белковых сшивок показано изменение положения Gre-белков во вторичном канале РНК-полимеразы в процессе ее функциональной активности. Предложена модель конформационной динамики Gre-белков с участием P'GNCD, согласно которой, для выполнения реакции гидролиза РНК, каталитическая петля N-концевого домена GreA располагается в каталитическом центре РНК-полимеразы, а во время синтеза РНК она от него удалена.

4) В элонгационном комплексе охарактеризовано расположение неконсервативного регуляторного домена G-петли (P'GNCD) РНК-полимеразы относительно Gre-белка и выходящей из главного канала ДНК. На основании полученных данных построена детальная модель комплекса Gre-PHK-полимераза.

5) Для генов пяти оперонов, позитивно регулируемых GreA in vivo, установлено, что стимулирующий эффект с разной степенью эффективности на разных промоторах реализуется в процессе инициации транскрипции, причем для активации синтеза РНК необходима расщепляющая активность GreA.

6) Показано, что ингибирующий эффект регулятора транскрипции Gfhl из Thermus thermophilus дифференцированным образом проявляется на разных промоторах и зависит от сродства транскрипционного комплекса к субстратам на стадии абортивной инициации.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1) Stepanova Е., Lee J., Ozerova М.. Semenova Е., Datsenko К., Wanner В., Severinov К., Borukhov S. Analysis of promoter targets for Escherichia coli transcription elongation factor GreA in vivo and in vitro // J. Bacteriology. - 2007. 189(24): p. 877285.

2) Озерова M.B.. Озолинь O.H. Бактериальные факторы транскрипции, регулирующие инициацию и элонгацию через вторичный канал РНК полимеразы // Естественные и Технические науки. - 2009. - №4 (42) - с. 65-69

Тезисы докладов

1) Озерова М., Озолинь О., Борухов С. Фактор транскрипции Gfhl из Т. thermophilics преимущественно ингибирует РНК полимеразу на стадии абортивного синтеза // IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов -Новосибирск. - 2008 - с. 30

2) Степанова Е., Ли Дж., Озерова М.. Семенова Е., Даценко К., Ваннер Б., Северинов К., Шевелев А., Борухов С. Регуляция активности промоторов Е. coli транскриптрасщепляющим фактором GreA in vivo и in vitro IIIV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов - Новосибирск. - 2008 - с. 31

3) Ekaterina Stepanova, Jookyung Lee, Maria Ozerova. Kirill Datsenko, Barry L Wanner, Konstantin Severinov and Sergei Borukhov. Analysis of promoter targets for E. coli transcription elongation factor GreA in vivo and in vitro - International E. coli alliance - Hinxton, UK - 2008. - p. T17

4) A.Parshin, M.Ozerova. J.Lee, S.Borukhov. Target specialization of prokaryotic transcription factors GreA, GreB and DksA - UMDNJ Biomedical Sciences Conference, Stratford, NJ, USA. - 2008 - p. 18

Подписано в печать: 23.10.2009

Заказ № 2801 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Озерова, Мария Владимировна

СОКРАЩЕНИЯ И ОБОЗНАЧЕНИЯ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Бактериальная ДНК-зависимая РНКП.

1.1.1. Субъединичный состав и функции РНКП.

1.1.2. Каталитические активности РНКП.

1.1.3. Транскрипционный цикл.

1.1.4. Структура РНКП (кор- и холо-ферменты, бинарный и элонгационный комплексы).

1.1.5. Каталитический центр и подвижные элементы вторичного канала РНКП (G-петля, F-мостик, jaw-домен).

1.2. Бактериальные транскрипционные факторы, модулирующие активность РНКП через вторичный канал.

1.2.1. Общие сведения о функциях и биологическая роль.

1.2.2. Структуры.

1.2.3. Механизм действия.

1.2.4. Модели комплексов с РНКП.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы и реагенты.

2.2. Методы.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Детальный анализ взаимодействия Gre-факторов с РНКП и механизма их действия.

3.1.1. Картирование пространственного расположения Gre-белков в РНКП.

3.1.2. Определение пространственного расположения неконсервативного регуляторного домена G-петли относительно элементов РНКП и ДНК в элонгационном комплексе.

3.1.3. Определение положения консервативной части G-петли во вторичном канале необходимого для связывания Gre-белков с РНКП.

3.1.4. Альтернативные положения Gre-белков во вторичном канале РНКП.

3.1.5. Моделирование структуры комплекса Gre-РНКП.

3.2. Роль расщепляющей активности GreA в стимуляции транскрипции на ряде промоторов Е. coli.

3.2.1. Анализ эффекта GreA на образование полноразмерного РНК-продукта на промоторах выбранных по данным экспрессионного анализа на микроматрицах!А

3.2.2. Анализ расщепляющей активности GreA на абортивный синтез РНК.

3.3. Определение функциональной мишени для действия Gre-подобного ингибитора транскрипции — Gfhl из Thermus thermophilus.

3.3.1. Анализ активности Gfhl на ряде промоторов Thermus thermophilus in vitro.

3.3.2. Анализ эффекта Gfhl на Км для НТФ при инициации и элонгации транскрипции19 ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурная организация функционально активных комплексов РНК полимеразы E. coli с факторами транскрипции GreA и GreB. Идентификация и анализ промоторных мишеней для GreA E. coli и Gfh1 T. thermophilus"

Актуальность проблемы. Транскрипция генов является первым этапом реализации генетической информации у всех живых организмов. Ключевыми ферментами, катализирующими этот процесс в эукариотических и прокариотических клетках, являются многосубъединичные ДНК-зависимые РНК-полимеразы (РНКП), осуществляющие комплементарный синтез РНК-транскрипта на ДНК-матрице [1, 2]. Многосубъединичные РНКП ответственны за синтез практически всех клеточных РНК. Их аминокислотные последовательности содержат большое число консервативных областей, а данные кристаллографических исследований демонстрируют сходство пространственной организации. Более простое строение бактериальных РНКП (6 субъединиц) по сравнению с эукариотическими, содержащими до 17 субъединиц (РНКП III), делает их прекрасной моделью для изучения клеточных РНКП в целом. Все оии используют общий механизм катализа (нуклеофильное замещение), основанный на присутствии двух ионов Mg2+ в активном центре фермента; достигают высокой процессивности в фазе элонгации, формируя РНК-ДНК гибрид одинаковой длины; имеют сходство в механизмах процессов инициации, элонгации и терминации синтеза РНК.

Процессивность РНКП во многом связана с ее способностью образовывать прочную связь как с транскрибируемой ДНК, так и с растущей цепью РНК. Однако, несмотря на эту особенность, в процессе удлиннения транскрипта РНКП движется по ДНК-матрице с непостоянной скоростью, с паузами различной продолжительности, способными привести к транскрипционному аресту - конформационному состоянию, при котором процесс удлиннения РНК становится невозможен несмотря на целостность ЭК [3]. Как паузы, так и аресты возникают в результате смещения РНКП на одну из внутренних фосфодиэфирных связей РНК, что приводит к разрыву связи между ее Ъ"-концевым нуклеотидом и активным центром РНКП (комплекс в этом случае называется «откатившимся») [4, 5].

Таким образом, сложность транскрипции и необходимость ее координации для множества генов во время клеточного роста и в ответ на различные изменения внешней среды в бактериальных клетках требует строгого контроля активности РНКП. Принято считать, что основная регуляция этого процесса осуществляется ДНК-связывающими белками на стадии взаимодействия РНКП с промотором и инициации синтеза РНК. Однако существует еще один класс регуляторов — белковые факторы, взаимодействующие с РНКП в области ее вторичного канала и непосредственно влияющие на процесс катализа. В эту группу входят белки семейств Gre (GreA, GreB и Gfhl), DksA (DksA, TraR) и Rnk, которые обладают структурной гомологией, но сильно различаются функционально.

Gre-подобные белки, для которых накоплен большой объем генетических и биохимических данных, являются прекрасными моделями для изучения регуляции транскрипции через вторичный канал РНКП. В экспериментах in vitro Gre-белки стимулируют синтез РНК за счет (1) ускорения перехода от инициации к элонгации, (2) предотвращения образования пауз транскрипции и арестованных комплексов, (3) повышения точности транскрипции. Действие Gre-белков основано на индукции и модуляции собственной транскриптрасщепляющей активности РНКП [1]. Для более полного понимания их биологической роли требуется выяснить, какие из выявленных in vitro эффектов, имеют физиологическое значение, а также определить этапы транскрипции, на которых эти эффекты наиболее выражены. В то же время, Gfhl из Thermus thermophilus, являясь антагонистом GreA и GreB, ингибирует все активности РНКП. Его биологическая роль пока мало понятна. Предполагается, что Gfhl может специфично ингибировать синтез РНК в определенных условиях ее жизни [2].

В настоящее время структуры высокого разрешения комплексов бактериальных РНКП с факторами вторичного канала не описаны. Существует только несколько спорных моделей, созданых на основании криоэлектронных структур низкого разрешения и биохимических данных с использованием мутантных форм Gre-белков [3-5]. Отсутствие детальных структурных данных затрудняет понимание молекулярных механизмов, определяющих взаимодействие этих факторов с компонентами вторичного канала РНКП, а возможные функционально-активные состояния их комплексов с РНКП остаются неизученными. Для создания целостной картины регуляции активности РНКП Gre-подобными белками необходимо получить как можно более детальную структурную модель комплексов РНКП-Gre, учитывающую их конформационные изменения на различных стадиях цикла транскрипции.

Цели и основные задачи исследования. Целью работы являлось определение структурно-функциональной организации комплексов бактериальной РНКП с факторами транскрипции GreA и GreB Е. coli, а также изучение функциональной роли GreA Е. coli и Gre-подобного транскрипционного ингибитора Gfhl из Thermus thermophilus на разных этапах транскрипции.

В работе были поставлены следующие задачи:

1) картировать и исследовать расположение Gre-белков в комплексах с РНКП;

2) определить пространственное расположение регуляторного домена — G-петли Р'-субъединицы РНКП относительно Gre-белка, ДНК и элементов вторичного канала РНКП в элонгационном комплексе, а также изучить роль конформации этого домена в связывании Gre-белков с ферментом и их функциональной активности;

3) создать детальную модель комплекса Gre-белков с РНКП;

4) исследовать роль транскрипт-расщепляющей активности GreA в стимуляции транскрипции, инициированной с разных промоторов Е. coli;

5) определить этап транскрипции, на котором действует Gre-подобный транскрипционный ингибитор Gfhl из термофильной бактерии Т. thermophilus.

Научная новизна. Впервые предложена структурная модель комплекса РНКП-Gre, которая описывает расположение Gre-белков и G-петли относительно структурных модулей РНКП,

ДНК и Gre-белков в элонгационном комплексе и учитывает возможные функциональные 5 состояния Gre-белков. Впервые продемонстрирована необходимость расщепляющей активности GreA для стимуляции транскрипции, инициированной с пяти промоторов Е. coli. Получены новые данные, свидетельствующие о том, что GreA активирует переход абортивного комплекса к продуктивному синтезу РНК. Впервые установлен промотор-специфичный ингибирующий эффект Gre-подобного фактора транскрипции Gfhl, который наиболее выражен на стадии абортивного синтеза и обусловлен прямой конкуренцией Gfhl с НТФ.

Научно-практическая ценность. Предложенная в данной работе структурно-функциональная модель РНКП-Gre позволяет понять важнейшие аспекты регуляции транскрипции и открывает ряд возможностей для дизайна новых эффективных регуляторов транскрипции и антибиотиков, мишенью которых, также как и для Gre, могут стать подвижные структурные элементы активного центра фермента. Описанная модель вносит определенную ясность в понимание механизма передачи регуляторных сигналов, обеспечивающих фактор-зависимую регуляцию активности РНКП. Обнаружение стадии транскрипции, на которой действуют факторы вторичного канала РНКП - GreA Е. coli и Gfhl Т. thermophilus — позволяет предположить, что биологическая роль GreA заключается в повышении общего уровня синтеза РНК за счет уменьшения количества абортивных продуктов. Согласно полученным данным, Gfhl должен ингибировать синтез РНК в клетке, преимущественно действуя на транскрипционные комплексы, которым для начала синтеза РНК необходимы высокие концентрации субстратов. Такая регуляция может быть востребована для адаптации аппарата транскрипции клетки к изменяющемуся уровню источников питания.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на международной конференции International Е. coli alliance (Hinxton, UK, 2008), конференции UMDNJ Biomedical Sciences Conference (Stratford, NJ, USA, 2008), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 6 печатных работ, из них 2 статьи и 4 тезиса стендовых сообщений на конференциях.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Озерова, Мария Владимировна

выводы

1) С помощью адресной модификации Gre-белков и ДНК химической протеазой FeBABE определена локализация GreA и GreB во вторичном канале РНК полимеразы Е. coli.

2) С использованием мутантных производных РНК полимеразы с G-петлей, фиксированной в двух альтернативных положениях, показано, что для связывания GreA необходима ее «открытая» конформация. «Закрытая» конформация G-петли препятствует связыванию регулятора во вторичном канале фермента.

3) Показано изменение положения Gre-белков во вторичном канале РНК полимеразы в процессе функциональной активности фермента. Предложена модель конформационной динамики Gre-белков с участием P'GNCD, согласно которой, для гидролиза РНК каталитическая петля N-концевого домена GreA располагается в каталитическом центре РНК полимеразы, а во время синтеза РНК она от него удалена.

4) В элонгационном комплексе охарактеризовано расположение неконсервативного регуляторного домена G-петли (P'GNCD) РНК полимеразы относительно Gre-белка и выходящей из главного канала ДНК. На основании полученных данных построена детальная модель комплекса Gre-PHK-полимераза.

5) Для генов пяти оперонов, позитивно регулируемых GreA in vivo, установлено, что в процессе инициации транскрипции стимулирующий эффект на разных промоторах реализуется с разной степенью эффективности, причем для активации синтеза РНК необходима расщепляющая активность GreA.

6) Показано, что ингибирующий эффект регулятора транскрипции Gfhl из Т. thermophilus дифференцированным образом проявляется на разных промоторах и зависит от сродства транскрипционного комплекса к субстратам на стадии абортивной инициации.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Озерова, Мария Владимировна, Пущино

1. Borukhov, S., J. Lee, and O. Laptenko, Bacterial transcription elongation factors: new insights into molecular mechanism of action. Mol Microbiol, 2005. 55(5): p. 1315-24.

2. Laptenko, O., et al., pH-dependent conformational switch activates the inhibitor of transcription elongation. Embo J, 2006. 25(10): p. 2131-41.

3. Opalka, N., et al., Structure and function of the transcription elongation factor GreB bound to bacterial RNA polymerase. Cell, 2003. 114(3): p. 335-45.

4. Sosunova, E., et al., Donation of catalytic residues to RNA polymerase active center by transcription factor Gre. Proc Natl Acad Sci USA, 2003. 100(26): p. 15469-74.

5. Laptenko, O., et al., Transcript cleavage factors GreA and GreB act as transient catalytic components of RNA polymerase. Embo J, 2003. 22(23): p. 6322-34.

6. Zhang, G., et al., Crystal structure ofThermus aquaticus core RNA polymerase at 3.3 A resolution. Cell, 1999. 98(6): p. 811-24.

7. Gross, C.A., et al., The functional and regulatory roles of sigma factors in transcription. Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 1998. 63: p. 141-55.

8. Wosten, M.M., Eubacterial sigma-factors. FEMS Microbiol Rev, 1998. 22(3): p. 127-50.

9. Ishihama, A., N. Fujita, and R.E. Glass, Subunit assembly and metabolic stability of E. coli RNA polymerase. Proteins, 1987. 2(1): p. 42-53.

10. Blatter, E.E., et al., Domain organization of RNA polymerase alpha subunit: C-terminal 85 amino acids constitute a domain capable of dimerization and DNA binding. Cell, 1994. 78(5): p. 889-96.

11. Severinov, K., RNA polymerase structure-function: insights into points of transcriptional regulation. Curr Opin Microbiol, 2000. 3(2): p. 118-25.

12. Sweetser, D., M. Nonet, and R.A. Young, Prokaryotic and eukaryotic RNA polymerases have homologous core subunits. Proc Natl Acad Sci USA, 1987. 84(5): p. 1192-6.

13. Severinov, K., et al., Dissection of the beta subunit in the Escherichia coli RNA polymerase into domains by proteolytic cleavage. J Biol Chem, 1992. 267(18): p. 12813-9.

14. Severinov, K., et al., A non-essential domain of Escherichia coli RNA polymerase required for the action of the termination factor Ale. J Biol Chem, 1994. 269(19): p. 14254-9.

15. Zakharova, N., et al., Mutations in and monoclonal antibody binding to evolutionary hypervariable region of Escherichia coli RNA polymerase beta' subunit inhibit transcript cleavage and transcript elongation. J Biol Chem, 1998. 273(38): p. 24912-20.

16. Zaychikov, E., et al., Mapping of catalytic residues in the RNA polymerase active center. Science, 1996. 273(5271): p. 107-9.

17. Grachev, M.A., et al., Studies of the functional topography of Escherichia coli RNA polymerase. A method for localization of the sites of affinity labelling. Eur J Biochem, 1989.180(3): p. 577-85.

18. Mustaev, A., et al., Modular organization of the catalytic center of RNA polymerase. Proc Natl Acad Sci USA, 1997. 94(13): p. 6641-5.

19. Ghosh, P., A. Ishihama, and D. Chatterji, Escherichia coli RNA polymerase subunit omega and its N-terminal domain bind full-length beta' to facilitate incorporation into the alpha2beta subassembly. Eur J Biochem, 2001. 268(17): p. 4621-7.

20. Ghosh, P., C. Ramakrishnan, and D. Chatterji, Inter-subunit recognition and manifestation of segmental mobility in Escherichia coli RNA polymerase: a case study with omega-beta' interaction. Biophys Chem, 2003. 103(3): p. 223-37.

21. Chatterji, D., et al., The role of the omega subunit of RNA polymerase in expression of the relA gene in Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett, 2007. 267(1): p. 51-5.

22. Vrentas, C.E., et al., Response of RNA polymerase to ppGpp: requirement for the omega subunit and relief of this requirement by DksA. Genes Dev, 2005.19(19): p. 2378-87.

23. Buck, M., et al., The bacterial enhancer-dependent sigma(54) (sigma(N)) transcription factor. J Bacteriol, 2000.182(15): p. 4129-36.24.