Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Транскриптрасщепляющая активность РНК-полимеразы Escherichia coli

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Орлова, Марианна Николаевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Краткие сведения о транскрипционном цикле.

1. 1. 1. Связывание РНК-полимеразы с промотором и инициация транскрипции.

1. 1. 2. Элонгация транскрипции.

1.1.3. Терминация транскрипции.

1. 2. Классическая модель структуры ТЭК и механизма элонгации транскрипции.

1. 3. Обнаружение спонтанного расщепления РНК-транскрипта в составе ТЭК.:.

1. 4. Транскрипционные факторы Индуцирующие реакцию расщепления РНК-транскрипта в составе ТЭК.

1. 4. 1. Транскрипционные факторы Е. coli - GreA и GreB

1.4.2. Действие GreA и GreB на тупиковые ТЭК.

1. 4. 3. Эукариотический транскрипционный фактор Sil функциональный аналог Gre факторов.

1. 5. Новые представления о структуре и динамике элонгационных комплексов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Транскриптрасщепляющая активность РНК-полимеразы Escherichia coli"

Актуальность проблемы. Одной из наиболее важных задач молекулярной биологии является изучение механизмов экспрессии генетической информации. Ключевой этап этого процесса -транскрипция - заключается в комплементарном синтезе РНК-транскрипта на ДНК-матрице. Бактериальный транскрипционный цикл удается целиком осуществить в простой бесклеточной системе, состоящей из ДНК-матрицы, очищенной РНК-полимеразы и рибонуклеотидов, без каких бы то ни было дополнительных белковых факторов. Тем не менее, РНК-полимераза не является единственным белком, участвующим в транскрипции in vivo. В ней также участвуют разнообразные регуляторные и вспомогательные белки, изучение которых важно для детального понимания процесса транскрипции в живой клетке. В процессе удлиннения транскрипта РНК-полимераза движется по ДНК-матрице с непостоянной скоростью. В некоторых участках матрицы длительные задержки в продвижении РНК-полимеразы, так называемые паузы, наблюдаются даже при оптимальных концентрациях субстратов. РНК-полимераза может также попадать в элонгационные "тупики" - состояние, при котором, несмотря на целостность тройного элонгационного комплеса (РНК-полимераза/ДНК-матрица/РНК-транскрипт), полностью блокируется нормальный процесс удлиннения РНК. Гомологичные бактериальные белки GreA и GreB, недавно идентифицированные у Escherichia coli

Borukhov et al., 1993), представляют собой новый класс транскрипционных факторов, способных предотвращать паузирование и образование "тупиковых" комплексов, а также уменьшать число ошибок при синтезе РНК (Erie et al., 1993). Действие этих белков состоит в индукции реакции расщепления РНК-транскрипта, обнаруженной ранее в элонгационных комплексах РНК-полимеразы Е. coli (Surratt et al., 1991). Эта реакция заключается в отщеплении и диссоциации З'-концевого фрагмента РНК длинной в 2 - 18 нуклеотидов из элонгационного комплекса с последующим возобновлением транскрипции с вновь образованного З'-конца РНК-транскрипта, что дает РНК-полимеразе повторную возможность преодолеть тупик или паузу, а также встроить в РНК правильный нуклеотид. Биологическая важность данного типа реакции отражена в ее эволюционной консервативности: недавние работы показали наличие транскриптрасщепляющей активности в элонгационных комплексах вирусной РНК-полимеразы (Hagler et al.,

1993) и эукариотических РНК-полимераз II и ill (Reines et al., 1992; Izban et al., 1992; Whitehall et al., 1994). Таким образом, изучение транскриптрасщепляющей активности в транскрипционных комплексах РНК-полимеразы Е. coli представляется актуальным.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось детальное изучение структурно-функциональных свойств транскрипционных факторов GreA и GreB и индуцируемой ими транскриптрасщепляющей активности в тройных элонгационных комплексах (ТЭК) РНК-полимеразы

E.coli.

В работе ставились следующие задачи. 1) Сконструировать мутантный greA" greB" штамм Е. coli. Исследовать клеточный лизат этого штамма на присутствие дополнительных Gre-подобных факторов. В случае отсутствия таковых - исследовать РНК-полимеразу, выделенную из greA" greB" мутанта, на наличие собственной транскриптрасщепляющей активности. 2) Сверхпродуцировать и очистить белки GreA и GreB, детально охарактеризовать их физико-химические свойства. 3) Методом фотохимического сшивания с использованием фотоактивируемых аналогов нуклеотидтрифосфатов продемонстрировать связывание GreA и GreB белков с РНК-транскриптом в тройном элонгационном комплексе. 4) Сконструировать серию реципрокных гибридов между генами greA и greB и сверхпродуцировать кодируемые ими химерные белки. Исследовав последние на тип индуцируемой транскриптрасщепляющей активности, определить, какие участки аминокислотной последовательности GreA и GreB отвечают за их функциональную специфичность. 5) Провести крупномасштабное выделение белка GreA как дикого типа, так и модифицированного Se-Met, для последующего рентгеноструктурного анализа.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые показано, что в составе ТЭК РНК-полимераза Е. coli обладает, помимо полимеризующей и пирофосфоролитической активностей, третьей -транскриптрасщепляющей (эндонуклеазной) - активностью. Эта активность может быть индуцирована в отсутствие вгеА и вгеВ факторов слабощелочными рН. Впервые детально охарактеризованы физико-химические и структурные свойства вгеА и вгеВ, в том числе показано, что вгеА и вгеВ контактируют с З'-концом РНК-транскрипта в составе

ТЭК, и идентифицированы участки полипептидной последовательности вгеА и йгеВ, участвующие в этом контакте. Также установлено, что функциональная специфичность вгеА и вгеВ определяется их N1-концевыми доменами. Создан штамм-продуцент и осуществлено крупномасштабное выделение белка вгеА как дикого типа, так и модифицированного Бе-Ме^ что позволило провести рентгеноструктурный анализ вгеА.

Поскольку реакция расщепления транскрипта наблюдается в процессе транскрипции как у прокариот, так и у эукариот, полученные в данной работе результаты служат пониманию базисных аспектов транскрипции.

Апробация работы. Основные результаты работы представлены на Международной конференции РАБЕВ "Регуляция инициации транскрипции у прокариот" (1993, США), на Международном симпозиуме "Молекулярная и клеточная биология" (1994, Кистоун, США), а также на семинаре Отдела биотехнологии ГНИИгенетика.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Орлова, Марианна Николаевна

выводы

1. Показано, что, помимо полимеризующей и пирофосфоролитической активностей, РНК-полимераза Е. coli обладает третьей -транскриптрасщепляющей (эндонуклеазной) и антитупиковой -активностью, которая может быть индуцирована слабощелочными pH. В основе механизма этой реакции лежит, по-видимому, ионизационное состояние аминокислотных остатков с рК8.6 (таких как Lys, His или Cys) в субъединицах РНК-полимеразы. Действие транскрипционных факторов GreA и GreB заключается в индуцировании собственной транскриптрасщепляющей и антитупиковой активности РНК-полимеразы Е. coli.

2. Показано, что GreA и GreB специфически связываются с РНК-полимеразой и ТЭК. GreA связывается с полимеразой в 300 раз хуже, чем GreB. Эффективность связывания GreA и GreB с ТЭК не зависит от длины транскрипта (5, 6, 7, 9 и 12 нуклеотидов). Эффективность связывания GreA и GreB с ТЭК также не зависит от компетентности ТЭК к расщеплению транскрипта.

3. Показано, что GreA и GreB контактируют с З'-концом РНК-транскрипта в составе ТЭК. Сайты GreA и GreB, участвующие в этом контакте, картированы в участках Asp 41- Phe 57 и Asp 47 - Arg 63, соответственно, внутри которых находятся аминокислоты, формирующие положительно заряженные зоны на поверхности молекул GreA и GreB.

4. Показано, что участки полипептидной последовательности Lys 13- Pro 81 у GreA и Thr 7- Gin 81 у GreB формируют функциональные домены, определяющие тип индуцируемой транскриптрасщепляющей активности. Эти функциональные домены соответствуют четкой структурной компоненте в пространственной организации GreA и GreB -антипараллельному спираль-спиральному димеру.

1. 6. Заключение

Новая информация о структуре ТЭК, позволяет сделать следующие выводы: 1) протяженный ДНК/РНК гибрид не является основным условием стабилизации РНК-транскрипта в составе ТЭК; 2) стабилизация РНК-транскрипта в составе ТЭК в большой степени осуществляется за счет специфических контактов РНК-полимеразы с 3'-концевой областью РНК-продукта. Транскрипционные комплексы в ходе элонгации обладают пластичной конформацией, которая может изменятся в ответ на различные регуляторные сигналы, при этом существуют механизмы, обеспечивающие эту регуляцию. Одним из таких механизмов является реакция расщепления РНК-транскрипта. Биологическая роль которой, очевидно заключается в предотвращении остановки элонгации транскрипции, возникающей по разным причинам. Таким образом, изучение транскриптрасщепляющей активности в транскрипционных комплексах РНК-полимеразы Е. coli представляется важным для создания полной картины транскрипционного цикла.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2. 1. Бактериальные штаммы и плазмиды

В работе использовались следующие штаммы Escherichia coli:

Штамм

Генотип

Происхождение

XL1 -Blue endA 1 hsdR127 (гк'т|<+) supE44 thi-1 recA 1 gyrA96 re/A 1A lac (F proAB lac IOZA Ш5ТП10)

Stratagene, США

M5219

Srrf lacZ{Am) trp(Am) (Xbio252 CI857AH1) Gribskov and

Burgess, 1983

JM109

F" recAl endA! gyrA96 thi hsdRI7 Yanish-Perron supE44X~ (lac-proAB) traD36fac PM15 et al., 1985

HMS174 F" hsdR (rkmk+) Rif recA (DE3)

Studier and Moffatt, 1986

SG480 A76 F~araD139A (argF-!ac)U169 rpsL 150 re/A Garrett et al., f/bB5301 ptsF25 deoCI A (ompR-greB) 1985

AD8571 To же, но greA::KanR

Данная работа

ER 1648 F" fhuA2 A {!acZ)r1 supE44 trp31 mcrA 1272:.Tn 10(Tetr) his-1 rpsL 104 (StrO xyl-7 mti-2 metB 1A {mcrC-mrt) 102:.Tn 10{ Tetr)

В работе использовались следующие плазмиды:

New England Biolabs, США

Плазмида

Краткое описание, источник рМКа94 рТ7а pT7ß' pMRG8 pRLG930 pTrc 99А экспрессирует устойчивый к рифампицину аллель гроВ с 1ас промотора р1)С19 (КаэЫеу е1 а1., 1990) экспрессирует ген гроА с А1 промотора фага 17га1епзкауа е1 а1.,1990) экспрессирует ген гроС с А1 промотора фага Т7 (га1епэкауа а1.,1990) экспрессирует ген гроЭ с промотора Р1 фага X

6г1Ьзкоу, Видгеэз, 1983) содержит промотор ггпВ Р1 (Соигэе, 1988) экспрессирующий вектор (Атапп е1 а1.,1988)

В работе получены следующие плазмиды, экспрессирующие соответствующие гены под контролем промотора 1гс вектора рТгс 99А:

Плазмида

Экспрессируемый ген рМОА рМ01.4 greA greB рМОЛЬНв дгеА с Н1э-якорем рМОВН|'з дгеВ с Ыв-якорем рАВб рАВ12 рАВ31 рАВ81 рАВ107 рВАб рВА12 рВА31 рВА44 рВА81 рВА105 гибридные гены дгеА/дгеВ (номера указывают точку обмена) гибридные гены дгеВ/дгеА (номера указывают точку обмена)

2. 2. Питательные среды и антибиотики

В качестве жидкой питательной среды в работе использовался 1В-бульон и минимальная среда М9. Твердые агаризованные среды получали добавлением агара в 1В-бульон до 1.5% (МашайБе1 а!., 1989).

Использовались следующие концентрации антибиотиков: ампициллина -100 мкг/мл, тетрациклина - 25 мкг/мл, канамицина - 25 мкг/мл.

2. 3. Компетентные клетки и трансформация бактерий

Компетентные клетки готовили по стандартной методике (МатаИв ег а1., 1989) и хранили в 15% глицерине в лрисутсвии 50мМ СаС12 при -700С. В тех случаях, когда требовалась высокая эффективность трансформации (>5 х108/мкг ДНК) использовали коммерческие сверхкомпетентные клетки Х11-В1ие (8!га1адепе, США). Трансформацию клеток проводили согласно описанной методике (Мата^э et а1., 1989) или в соответствии с рекомендациями фирмы 8^а1адепе.

2 .4. Выделение плазмидной ДНК

Плазмидную ДНК выделяли, пользуясь модифицированным методом щелочного лизиса, описанным в практическом руководстве (Матайз а1., 1989). Биомассу, лизированную щелочным раствором, нейтрализовали 3 М раствором КСНзСООН, рН 5.0, центрифугировали и к супернатанту добавляли 1/5 объема 60% раствора полиэтиленгликоля 6000 и выдерживали на льду в течение 30 минут. Образовавшийся осадок собирали центрифугированием и растворяли в небольшом объеме воды. К раствору добавляли 9/10 объёма насыщенного раствора V

1Ю1, выдерживали на льду в течение 30-40 минут и центрифугировали. Супернатант отбирали и осаждали двумя объемами этанола. Осадок плазмидной ДНК собирали центрифугированием и растворяли в воде.

2. 5. Использование ферментов в молекулярном клонировании

В работе использовали различные эндонуклеазы рестрикции, фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I, а также VentTM ДНК-полимеразу и ДНК-лигазу. Все ферменты были куплены у фирмы New England Biolabs, США. Буферы и условия реакций соответствовали рекомендациям фирмы-производителя.

2. 6. Электрофоретическое разделение нуклеиновых кислот и белков

2. 6. 1. Неденатурирующий электрофорез ДНК и выделение фрагментов ДНК из гелей

Идентификацию, разделение и очистку молекул ДНК проводили с использованием электрофореза в 0.8-1.2% гелях агарозы в 0.04 М трис-ацетатном буфере, рН 7.8. Для разделения мелких фрагментов ДНК использовали электрофорез в 4-10% полиакриламидных гелях (соотношение акриламида к метиленбисакриламиду 19:1) в 0.089 М трис-боратном буфере, рН 7.9. Фрагменты ДНК выделяли методом сорбции на мелкозернистое стекло в присутствии ЗМ KI с использованием V коммерческого набора GeneClean II (Bio101, США).

2. 6. 2. Денатурирующий электрофорез РНК

Для разделения продуктов транскрипционных реакций использовали электрофорез в 23% ПААГ (соотношение акриламида к метил енбисакрилам иду 20:3), содержащих 6М мочевину, в трисборатном буфере.

2. 6. 3. Денатурирующий электрофорез белков

Электрофорез белков в присутствии денатурирующего агента додецилсульфата Na (ДДС-Na) проводили в готовых коммерческих ПААГ различной процентное™ в трис-глициновом буфере с использованием системы Phast (Pharmacia LKB Biotechnology, США) или электрофорез ной камеры XCell (Novex, США) в соответствии с рекомендациями производителей.

2. 7. Олигонуклеотиды и определение первичных последовательностей ^НК

Олигонуклеотиды заказывали у фирмы Oligos etc., США. Определение первичной последовательности ДНК проводили с двухцепочечной ДНК по методу Сэнгера (Sanger, 1977) с использованием флуоресцентных нуклеозидтрифосфатов на автоматическом сиквенаторе фирмы Beckman в Колумбийском университете, США.

2. 8. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Реакцию амплификации ДНК проводили с использованием Vent™

ДНК-полимеразы (New England Biolabs, США) в соответствии с рекомендациями производителей. Стандартная реакция проводилась в объёме 100 мкл и содержала 10 мМ Трис-HCI, pH 8.3, 50 мМ KCl, 1.5 мМ MgCl2, 100 мкМ дНТФ, 10 фемтомолей амплифицируемой ДНК-матрицы, 90 фемтомолей каждого праймера и 5-10 единиц ДНК-полимеразы. 30 циклов амплификации проводили на приборе DNA Thermal Cycler (Cetus Perkin Elmer, США). Один цикл амплификации состоял из инкубации в течение 1 мин. при 94°С, 2 мин. при 59°С и 3 мин. при 72°С. Амплифицированные фрагменты ДНК очищали от невключившихся нуклеотидов и праймеров с помощью ультрафильтрации на центрифужном фильтре Centricon 100 (Amicon, США).

2. 9. Получение плазмид рМОА и pMOAHis, свехпродуцирующих GreA и GreA-6His

На основе последовательности гена greA (Sparkowski, Das, 1990) были синтезированы олигонуклеотидные праймеры A1 (5'-рCAAGCTATTCCGAT

GACCTTA-3') и А2 (5'-CGCGCGGATCC TT АС AGG ТА ТТССАССТТАА ТТАС-3') (подчеркнутые нуклеотиды соответствуют сайту расщепления BamHI; курсивом выделены нуклеотиды, соответствующие 5'- и З'-концам гена greA, соответственно). Данные олигонуклеотиды использовали для амплификации гена greA с помощью ПЦР с хромосомной ДНК штамма

JM109 E. coli. Полученный фрагмент обрабатывали BamHI и клонировали в экспрессионный вектор рТгсЭЭА, последовательно обработанный Ncol (сайт в полилинкере), фрагментом Кленова в присутствии нуклеотидов (достройка концов) и BamHI (сайт в полилинкере). Результирующая плазмида рМОА содержала ген greA под индуцируемым промотором trc.

Для получения гена greA с полигистидиновым якорем, синтезировали другой З'-концевой олигонуклеотид A2His : 5'-CGCGCGGATCCTTAGTG

ATGGTGATGGTGATGCAGGTATTCCACCTTAATTAC-3', который содержал шесть гистидиновых кодонов в рамке greA (плотным курсивом выделены нуклеотиды соответствующие последовательности полигистидинового якоря). Для амплификации использовали праймер А1 и A2His. Полученный фрагмент клонировали в экспрессионный вектор рТгс99А, как описано выше. Результирующая плазмида pMOAHis содержала ген greA с шестью гистидиновыми кодонами на З'-конце открытой рамки считывания. Правильность нуклеотидной последовательности клонированных генов подтверждалась сиквенированием. v

2. 10. Получение плазмид рМР1.4 и pMQ1.4His, свехпродуцирующих GreB и GreB-6His

На основе последовательности гена greB (Borukhov et al., 1993b) были синтезированы олигонуклеотидные праймеры B1 (5'-GCGCGTCATGAAA

ACGCCCCGGTTACOZ') и B2 (5'-CG CGCGGATCC TTACGGTTTCACGTACT CTAGACG-3') (подчеркнутые нуклеотиды соответствуют сайтам расщепления BspHI и BamHI, соответственно; курсивом выделены нуклеотиды, соответствующие 5'- и З'-концам гена greB, соответственно). Данные олигонуклеотиды использовали для амплификации гена greB с помощью ПЦР с хромосомной ДНК штамма JM109 Е. coli. Полученный фрагмент обрабатывали BspHI и BamHI и клонировали в экспрессионный вектор рТгс99А по сайтам Ncol и BamH I полилинкера. Результирующая плазмида рМ01.4 содержала ген greB под индуцируемым промотором trc.

Для получения гена greB с полигистидиновым якорем, синтезировали другой З'-концевой олигонуклеотид B2His : 5'-CGCGCGGATCCTTAGTG А TGG TG А TGG TGA TGCGG TTTCA CG ТА С ТС TA GA CG-3\ который содержал шесть гистидиновых кодонов в рамке greB (плотным курсивом выделены нуклеотиды соответствующие последовательности полигистидинового якоря). Для амплификации использовали праймер В1 и B2His. Полученный фрагмент клонировали в экспрессионный вектор рТгсЭЭА, как описано выше. Результирующая плазмида pM01.4His содержала ген greB с шестью гистидиновыми кодонами на З'-конце открытой рамки считывания. Правильность нуклеотидной последовательности клонированных генов подтверждалась сиквенированием.

2. 11. Конструирование гибридных qreA/qreB и qreB/greA генов и получение плазмид, сверхпродуцирующих соответствующие гибридные белки

Для получения гибридных генов дгеАВб и дгеАВ12 синтезировали олигонуклеотидные праймеры: АВ6 - 5'-pCAAGCTA TTCCGATGACCCGG GAAGGGTATGAAAAACTC-3', и АВ12 - b'-pCAAGCTATTCCGATGACCTTA CGCGGCGCTGAAAAACTCAAACAAGAGCTTAATTAT-3\ у которых начальные пять (праймер АВ6) и одиннадцать (праймер АВ12) кодонов соответствуют 5'-концевой последовательности гена greA (выделены курсивом). Плотным курсивом выделены нуклеотиды, соответствующие последовательности гена greB, начиная с седьмого (праймер АВ6) и тринадцатого (праймер АВ12) кодонов. В реакции амплификации в качестве матрицы использовали ген greB и второй олигонуклеотидный праймер - B2His (см. выше). Полученные фрагменты клонировали в экспрессионный вектор рТгс99А, как описано выше для клонирования гена greA.

Для получения гибридных генов дгеВАб и дгеВА12 синтезировали олигонуклеотидные праймеры: ВА6 - 5'-GCGCGTC V

ATGAAAACGCCCCTGGTTACCTTACGCGGCGCTGAAAAÀTTACGC-3' и ВА12 - 5'-GCGCG1ÇATGAAAACGCCCCTGGTTACCCGGGAAGGGTATGAAA

AATTACGCGAAGAGCTGGAT-3' (подчеркнутые нуклеотиды соответствуют сайту расщепления BspHI; плотным курсивом выделены нуклеотиды, соответствующие 5'-концевой последовательности гена greB, курсивом выделены нуклеотиды соответствующие последовательности гена greA). В реакции амплификации в качестве матрицы использовали ген greA и второй олигонуклеотидный праймер - A2His (см. выше). Полученные фрагменты клонировали в экспрессионный вектор рТгс99А, как описано выше для клонирования гена дгеВ.

Остальные гибридные гены получали методом «каскадной» ПЦР. В первой реакции использовали праймеры 1 и М (табл. 2.1.) и матрицу рМОА (для АВ гибридов) или рМ01.4 (для ВА гибридов). Полученный в результате этой реакции фрагмент очищали электроэлюированием из 1% агарозного геля и использовали в качестве праймера для второй реакции амплификации, где вторым праймером служил праймер П. В качестве матрицы использовали рМ01.4 (для АВ гибридов) или рМОА (для ВА гибридов). Правильность нуклеотидной последовательности каждого гибридного гена проверяли сиквенированием.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Орлова, Марианна Николаевна, Москва

1. Altmann, С. R., Solow-Cordero, D. Е., Chamberlin, М. J. (1994) RNA cleavage and chain elongation by Escherichia coli DNA-dependent RNA polymerase in a binary enzyme-RNA complex. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91, 3784-3788.

2. Amann, E., Ochs, В., Abel, K. J. (1988) Tightly regulated tac promoter vectors useful for the expression of ubfused proteins in Esherichia coli. Gene 69, 301-315.

3. Bengal, E., Flores, O., Krauskopf, A., Reinberg, D., Aloni, Y. (1991) Role of mammalian transcription factors IIF, IIS and MX during"elongation by RNA polymerase II. Mol. Cell. Biol. 11,1195-1206.

4. Borukhov, S., Goldfarb, A. (1993) Recombinant Escherichia coli RNA polymerase: purification of individually overexpressed subunits and in vitro assembly. Protein Expression Purif. 4, 503-511.

5. Borukhov, S., Polyakov, A., Nikiforov, V., Goldfarb, A. (1992) GreAprotein: A transcription elongation factor from Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89, 8899-8902.

6. Borukhov, S., Sagitov, V., Goldfarb, A. (1993a) Transcript cleavage factors from E. coli. Cell72, 459-466.

7. Borukhov, S., Sagitov, V., Josaitis, C.A., Gourse, R., Goldfarb, A. (1993b) Two models of transcription initiation at the rrnB P1 promoter of Escherichia coli. J. Biol. Chem. 268, 23477-23482.

8. Bremer, H., Yegian, C., Konrad, M. (1965) J. Mol. Biol. 16, 94-103.

9. Burgess, R. R., Jendrisak, J. J. (1975). A procedure for the rapid, large-scale purification of Escherichia coli DNA-dependent RNA polymerase involving polymin P precipitationn and DNA-cellulose chromatography. Biochemistry 14, 4634-4638.

10. Busby, S., Spassky, A., Buc, H. (1981) On the binding of tRNA to Escherichia coli RNA polymerase. Interactions between the core enzyme, DNA and tRNA. Eur. J. Biochem. 118, 443-451.

11. Chamberlin, M. J. (1974) The selectivity of transcription. Ann. Rev. Biochem. 43, 721-775.

12. Erie, D. A., Hajiseyedjavadi, O., Young, M. C., von Hippel, P. H. (1993) Multiple RNA polymerase conformations and GreA: control of the fidelity of transcription. Science 262, 867-873.

13. Farnham, P. J., Platt, T. (1980) A model for transcription termination suggested by studies on the trp attenuator in vitro using base analogs.Cell20, 739-748.

14. Farnham, P. J., Platt, T. (1981) Rho-dependent termination: dyad simmetry in DNA causes RNA to pause during transcription in vitro. Nuci. Acids Res. 9, 563-577.

15. Fox, C. F., Gumport, R. I., Weiss, S. B. (1965) J. Biol. Chem. 240, 21012109.

16. Gamper, H. B., Hearst, J. E. (1982) A topological model for transcription based on unwinding angle analysis of E. coli RNA polymerase binary, initiation and ternary complexes. Cell29, 81-90.

17. Garrett, S., Taylor, R. K., Silhavy, T. J., Berman, M. L. (1985) Isolation and characterization of AompRstrains of Escherichia coli by a general method based on gene fusions. J. Bacteriol. 162, 840-844.

18. Gourse, R. L. (1988) Nucleic Acids Res. 16, 9789-9809. Visualization and quantitative analysis of complex formation between E. coli RNA polymerase and an RNA promoter in vito. Nucl. Acids Res. 16, 9789-9809.

19. Gribskov, M. and Burgess, R.R. (1983) Overexpression and purification of the sigma subunit of Ecsherichia coli RNA polymerase. Gene 26, 109-11

20. Hendrickson, W. A., Horton, J. R., LeMaster, D.M.(1990) Selenmethionyl proteins produced for analysis by multiwavelength anomalous diffraction (MAD): a vehicle for direct determination of three-dimentional structure. EMBO Journal 9,1665-1672.

21. Johnston, D., McClure, W. (1976) Abortiv initiation of in vitro RNA synthesis on bacteriophage DNA. In R. Losick and M. Chamberlin (ed.), RNA polymerase, pp.413-428. Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y.

22. Kashlev, M., Lee, J., Zalenskaya, K., Nikiforov, V., Goldfarb, A. (1990) Blocking of the initiation-to-elongation transition by a transdominant RNA polymerase mutation. Science 248, 1006-1009.

23. Kashlev, M., Martin, E., Polyakov, A., Severinov, K., Nikiforov, V., Goldfarb, A. (1993) Histidine-tagged RNA polymerase: dissection of the transcription cycle using immoilized enzyme. Gene 130, 489-493.

24. Kashlev, M., Nudler, E., Goldfarb, A., White, T.,Kutter, E. (1993) Bacteriophage T4 Ale protein: a transcription termination factor sensing local modification of DNA. Cell, 75, 147-154.

25. Kassavetis, G. A., Chemberlin, M. J. (1981) Pausing and termination of transcription within the early region of bacteriophage T7 DNA in vitro. J. Biol. Chem. 256, 277-2786.

26. Kerpolla, T. K.,Kane, C. M.(1990) Analysis for the signals for transcription termination by purified RNA polymerase II. Biochemistry29, 269278.

27. Kessler, C., Mi, H., Hartmann, G. R. (1982) Competition of rifampicin with binding of substrate and RNA to RNA polymerase. Eur. J. ^Biochem. 122, 515-518.

28. Kirkegaard, K., Buc, A., Spassky, A., Wang, J. C. (1983) Mapping of single-stranded regions in duplex DNA at the sequence level: single-strand specific cytosine methylation in RNA polymerase-promoter complexes. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80, 2544-2548.

29. Krakow, J. S., Rhodes, G. T., Jovin, M. (1976) RNA polymerase: catalytic mechanisms and inhibitors. In R. Losick and M. Chamberlin (ed.), RNA polymerase, pp. 127-157. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.

30. Krümmel, B., Chamberlin, M. J. (1989) RNA chain initiation by Escherichia coli RNA polymerase. Structural transcriptions of the enzyme in early ternary complexes. Biochemistry 28, 7829-7842.

31. Krümmel, B., Chamberlin, M. J. (1992b) Stractural analysis of ternary complexes of Escherichia coli RNA polymerase. Deoxyribonuclease I footprinting of defined complexes. J. Mot. Biol. 225, 239-250.

32. Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. (1989) Molecular cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.

33. Marks, G. L., Wood, D. O. (1992) Nucleotide sequence of the Rickettsia prowazekii greA homolog. Nucl. Acids Res. 20, 3785.

34. Martin, F. H., Tinoco, I. (1980) DNA-RNA hybrid duplexes containing oligo(dA:rU) sequences are exeptionaly unstable and may facilitate termination of transcription. Nucleic Acids Res. 8, 2295-2299.

35. McClure, W. R. (1980) Rate-limiting steps in RNA chain initiation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5634-5638.

36. Mustaev, A., Kashlev, M., Zaychikov, E., Grachev, M., Goldfarb, A. (1993) Active center rearrangemOOent in RNA polymerase initiation complex. J. Biol. Chem. 268, 19185-19187.

37. Nudler, E.,Goldfarb, A., Kashlev, M. (1995) Discontinuous mechanism of trenscription elongation. Science 265, 793-796.

38. Piatt, T. (1986) Transcription termination and regulation of gene expression. Annu. Rev. Biochem. 55, 339-372.

39. Reines, D. (1992) Elongation factor-dependent transcript shortening by template-engaged RNA polymerase II. J. Biol. Chem. 267, 3795-3800.

40. Reines, D., Chamberlin, M. J., Kane, C. M. (1989) Transcription elongation factor Sll (TFIIS) enables RNA polymerase II to elongate through a block to transcription in a human gene in vitro. J. Biol. Chem. 264, 1079910809.

41. Reines, D., Mote, J. (1993) Elongation factor Sll-dependent transcription by RNA polymerase II through a sequence-specific DNA-binding protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1917- 1921.

42. Rhodes, G., Chamberlin, M. J. (1974) Ribonucleic acid chain elongation by Escherichia coli ribonucleic acid polymerase. I. Isolation of ternary complexes and the kinetics of elongation. J. Biol. Chem. 249, 6675-6683.

43. Rudd, M. D., Izban, M. G.,Luse, D. S. (1994) The active site of RNA polymerase II participates in transcript cleavage within arrested ternary complexes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 8057-8061.

44. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A.R. (1977) DNA sequencing with chain termination inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74,5463-5467.

45. Sciebenlist, U., Simpson, R. B., Gilbert, W. (1980) E. coli RNA polymerase interacts homologously with two different promoters. Cell20, 269-281.

46. SivaRaman, L., Reines, D., Kane, C. M. (1990) Purified elongation factor Sll is sufficient to promote read-through by purified RNA polymerase II at specific termination sites in the human histone H3.3 gene. J. Biol. Chem. 265, 14554-14560.

47. Sluder, A. E., Greenleaf, A. L., Price, D. H. (1989). Properties of a Drosophila RNA polymerase II elongation factor. J. Biol. Chem. 264, 89638969.

48. Scmitz, A., Galas, D. J. (1979) The interaction of RNA polymerase and lac repressor with the lac control region. Nucleic Acids Res. 6, 111-137.

49. Sparkowski, J., Das, A. (1990). The nucleotide sequence of greA, a suppressor gene that restores growth of an Escherichia coli RNA polymerase mutant at high temperature. Nucleic Acids Res. 18, 6443.

50. Sparkowski, J., Das, A. (1991) Location of a new gene6 greA, on the Escherichia coli chromosome. J. Bacteriol. 173, 5256-5257.

51. Straney, D. C., Crothers, D. M. (1985) Intermediates in transcription initiation from the E. coli lac UV5 promoter. Cell43, 449-459.

52. Stevens, A. (1969) Studies of the ribonucleic acid polymerase from Escherichia coli. V. Studies of its complexes with polyribonucleotides. J. Biol. Chem. 244, 425-429.

53. Studier, F. W., Moffatt, B. A. (1986) Use of bacteriophageT7 RNA polymerase to direct selective high level expression of cloned genes. J. Mol. Biol. 189, 113-130.

54. Yager, T. D., von Hippel, P. H. (1991) A thermodinamic analysis of RNA transcript elongation and termination in E. coli. Biochemistry30, 1097-1118.

55. Yanish-Perron, C., Viera, J., Messing, J. (1985) Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mp18 and pUC19 vectors. Gene 33, 103-119.•V

56. Zalenskaya, K., Lee, J., Gujuluva, C. N., Shin,Y. K., Slutsky, M.,

57. Goldfarb, A. (1990) Recombinant RNA polymerase: inducible overexpression, purification and assembly of Escherichia coli rpo gene products.Gene 89, 7-12