Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование роли коактиватора транскрипции SAYP в активации DHR3-зависимой транскрипции генов у Drosophila melanogaster

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование роли коактиватора транскрипции SAYP в активации DHR3-зависимой транскрипции генов у Drosophila melanogaster"

На правах рукописи

КУЗЬМИНА ЮЛИЯ ЛЕОНИДОВНА

Исследование роли коактиватора транскрипции 8АУР в активации ОНШ-зависимой транскрипции генов у БговорНИа melanogaster

03.01.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 9 МАР ¿Ьї2

Москва 2012

005012850

005012850

Работа выполнена в Лаборатории регуляции экспрессии генов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии гена Российской академии наук. Научные руководители:

кандидат физико-математических наук, Шидловский Юлий Валерьевич; кандидат биологических наук, Воробьева Надежда Евгеньевна. Официальные оппоненты:

Головнин Антон Клеменсович,

доктор биологических наук, ИБГ РАН, заведующий лабораторией; Панкратова Елизавета Владимировна,

кандидат биологических наук, ИМБ РАН, старший научный сотрудник. Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук.

Защита состоится I'Ыър^СьК.С- 2012 года в_часов на заседании

Диссертационного совета 002.037.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биологии гена Российской академии наук по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 34/5. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, расположенной по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д.32.

Автореферат разослан 2012 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета

кандидат фармацевтических наук, Грабовская Любовь Сергеевна.

I. Общая характеристика работы

Актуальность темы

Сложная система клеточной коммуникации во многом определяется способностью клетки получать информацию из ее окружения и изменять свой метаболизм в ответ на поступающие сигналы. Возможность клеток реагировать на изменения окружающей среды является основой развития, репарации тканей, иммунитета и системы поддержания гомеостаза в целом. Нарушения клеточной сигнализации могут приводить к различным серьезным заболеваниям. Понимание механизмов передачи сигнала внутри клетки необходимы для разработки методов их лечения.

Передача сигнала в клетке осуществляется обычно через каскад биохимических реакций. В случае, когда конечным звеном каскада являются транскрипционные факторы, происходит изменение профиля экспрессии определенных генов-мишеней. Изменение профиля экспрессии влечет за собой изменения в метаболизме, строении и функциях клетки и определяет ее дальнейшую судьбу. В данном процессе одну из ключевых ролей играют различные транскрипционные факторы.

Транскрипционный аппарат клетки необычайно сложно устрен и данные о механизме его работы постоянно дополняются. Основной фермент транскрипционного аппарата - ДНК-зависимая РНК-полимераза. Для эукариотических клеток характерна специализация РНК полимераз, то есть транскрипция определенного типа генов осуществляется специальной РНК-полимеразой. Так, экспрессией генов, кодирующих мРНК, контролирует РНК-полимераза II. Несмотря на свое сложное строение, она не способна самостоятельно инициировать транскрипцию. Для этого ей необходимы многочисленные вспомогательные факторы.

На данный момент выделяют три условные группы факторов транскрипции: общие факторы транскрипции, необходимые для экспрессии большинства генов, специфические факторы транскрипции (активаторы и

репрессоры) и так называемые корегуляторы (коактиваторы и корепрессоры). Последние осуществляют связь между специфическими и общими факторами транскрипции, а также изменяют структуру хроматина. Традиционно биологические исследования сфокусированы на изучении отдельных частей транскрипционного аппарата. Знания об устройстве аппарата транскрипции важны как в теоретическом плане, так и для изучения патологий, связанных с нарушениями в его работе.

В данной работе были изучены функции коактиватора транскрипции РНК-полимеразы II SAYP в DHR-3-зависимой транскрипции при активации части экдизонового каскада у D. melanogaster. Транскрипционный коактиватор SAYP и ядерный рецептор DHR3 незаменимы в развитии D. melanogaster, консервативны в эволюции и имеют гомологов в протеоме человека. Мутации данных белков вызывают тяжелые нарушения в развитии как D. melanogaster, так и человека. В частности, для гомолога SAYP, белка PHF10 человека показано участие в контроле пролиферации клеток.

Цели и задачи исследования

Основной целью данной работы являлось изучение роли транскрипционного фактора SAYP как коактиватора транскрипции для ядерного рецептора DHR3.

В ходе работы предполагалось решить следующие экспериментальные задачи:

- получить антитела к белку DHR3 и проверить их специфичность;

- проверить, ассоциированы ли белки SAYP и DHR3 в ядерном экстракте из эмбрионов и куколок D. melanogaster,

- сравнить профили экспрессии генов DHR3 и е(у)3 в развитии D. melanogaster,

- проверить генетическое взаимодействие мутаций генов DHR3 и е(у)3 в развитии D. melanogaster,

- изучить привлечение DHR3 на промоторы SAYP-зависимых генов в организме;

- подобрать условия для активации DHR3 с помощью экдизона в культуре клеток S2 D. melanogaster,

- изучить транскрипцию и состояние промоторов SAYP-зависимых генов в культуре клеток при активации DHR3;

- исследовать привлечение SAYP и компонентов образуемого им комплекса на промотор ОНЯЗ-зависимого гена ftz-fl в культуре клеток при активации DHR3.

Научная новизна и практическая ценность работы

В данной работе изучена роль транскрипционного коактиватора SAYP в активации транскрипции генов экдизонового каскада. Показано, что SAYP в составе коактиваторного суперкомплекса BTFly взаимодействует с ядерным рецептором DHR3, участником данного сигнального пути. Взаимодействие исследуемых белков обнаружено как биохимически в ядерном экстракте на стадии эмбриона и куколки, так и в генетических экспериментах. Продемонстрировано, что SAYP важен для активации БГОЗ-зависимых генов.

В работе показано совместное участие активатора DHR3 и коактиватора SAYP в активации транскрипции нескольких генов, в частности, SAYP-зависимого гена yellow. Данные исследования говорят о наличии для DHR3 ранее неизвестных генов-мишений.

Предложена модельная система и подобраны условия по активации DHR3 в культуре клеток путем добавления в среду стероидного гормона экдизона. Показано, что при добавлении экдизона происходит повышение уровня транскрипции нескольких SAYP-зависимых генов. Продемонстрировано, что SAYP важен для активированной транскрипции этих генов.

Привлечение на промотор гена ftz-fl ядерного рецептора DHR3 стимулирует привлечение SAYP, взаимодействующих с ним комплексов, а также РНК-полимеразы II.

Получены новые данные о работе экдизонового каскада, на основании чего предложен механизм действия ядерного рецептора DHR3.

Ввиду того, что транскрипционный коактиватор SAYP и ядерный рецептор DHR3 имеют гомологов в протеоме человека, изучение их функций на примере модельного объекта D. melanogaster поможет понять, как их гомологи функционируют в организме человека.

Исследования в области изучения взаимодействия данных белков могут иметь большое фундаментальное значение, а также практическое применение в медицине, фармакологии, биотехнологии и селекции.

Апробация работы

Результаты работы были представлены автором на следующих конференциях: International Symposium "Control of gene expression and cancer" (Москва, 2010), XXIII Международная зимняя молодежная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2011), VII International Scientific Conference for Students and PhD Students "Youth and Progress of Biology" (Львов, 2011).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ. Из них статей - 3; тезисов, докладов и материалов конференций - 4.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на страницах и состоит из разделов: введение, обзор литературы, объект и задачи исследования, материалы и методы, результаты, обсуждение результатов, выводы, личный вклад автора, благодарности и список литературы. Диссертация содержит ¿^рисунков. Библиография включает 4^¿'источников.

II. Результаты исследований

Введение

Процесс активации транскрипции генов РНК-полимеразой II сложно организован и требует участия большого количества разнообразных ген-специфических активаторов. Активность и механизм действия последних определяется коактиваторами, которые обеспечивают слаженную работу компонентов транскрипционного аппарата.

Ранее, в нашей лаборатории был описан коактиватор транскрипции БАУР, кодируемый геном е(у)3 у О. те/а^аНег. Данный белок необходим для развития и нормального функционирования организма уже на самых ранних стадиях эмбриогенеза. Экспериментально было показано, что БАУР имеет ядерную локализацию и продуцируется во многих тканях на всех стадиях развития Д. mгlanogaster. Наибольший уровень БАУР наблюдается в эмбриогенезе, на стадии куколки и в репродуктивной системе взрослых самок. Среди многоклеточных БАУР имеет множество гомологов, для которых характерно наличие высококонсервативного БАУ-домена, вовлеченного в активацию транскрипции, а также двух цинковых пальцев РЖ-типа (Рис. 1(А)).

550

I-

( и і

Я

1692 1786

1340 1573

AT-hook SAY . PHD

200S

I SAY } I PHD |fc}

консервативный домен

SAYP

Brab ma

ремоделиш хроматина

TFIID

инициация транскрипции

am

Polll

промотор

Рис. 1. (А) Структура белка SAYP. Указаны AT-hook, консервативный SAY-домен и PHD-домены. Показан размер белка (количество аминокислот). (Б) Структура коактиваторного суперкомплекса BTFly, состоящего из хроматин-ремоделнрующего комплекса Brahma, фактора инициации транскрипции TFIID и транскрипционного коактиватора SAYP. Активация транскрипции происходит при привлечении на промотор (Рг) коактиваторного комплекса BTFly, общих факторов транскрипции (GTFs), РНК-полимеразы II (Pol II) и специфических активаторов (А).

Ранее в нашей лаборатории было показано, что SAYP функционирует как компонент стабильного коактиваторного суперкомплекса BTFly, который также включает в себя хроматин-ремоделирующий комплекс Brahma и ключевой фактор инициации транскрипции TFIID. Компоненты комплекса BTFly ассоциированы посредством взаимодействия субъединиц TAF5 (TFIID) и ВАР 170 (Brahma) с активационным доменом SAY коактиватора SAYP (Рис. X (Б)).

BTFly представляет собой функционально неделимый комплекс, который привлекается на промотор и активирует транскрипцию генов, контролируемых РНК-полимеразой II. В нашей лаборатории было показано, что SAYP колокализуется с РНК-полимеразой II во многих сайтах политенных хромосом D. melanogaster, таким образом, принимая участие в регуляции широкого спектра генов. Тем не менее, до недавнего времени конкретных активаторов, использующих данный механизм активации, найдено не было.

В данной работе описано взаимодействие коактиватора транскрипции SAYP с ядерным рецептором DHR3 (Нг46), кодируемым геном DHR3 (Нг46) у D. melanogaster. Транскрипция гена DHR3 в организме насекомого активируется выбросом стероидного гормона 20-гидроксиэкдизона (далее зкдизон) в составе экдизонового каскада. Экдизон запускает последовательную активацию транскрипции различных групп генов, в частности активацию гена DHR3, который в свою очередь активирует транскрипцию гена ftz-fl (Рис. 2).

Консервативный ядерный белок DHR3 относится к суперсемейству ядерных рецепторов, одному из крупнейших семейств транскрипционных активаторов. DHR3 продуцируется во многих тканях в эмбриогенезе, во время линек и в начале метаморфоза. Данный белок необходим для развития и жизнеспособности насекомого.

Экдизон

Рис. 2. Фрагмент экдизонового каскада у О. те1апо§ая1ег. Выброс экдизона приводит к активации йНЯЗ, который, в свою очередь, запускает активацию/&-//. Одновременно, высокая концентрация экдизона вызывает репрессию /¡г-/!.

ftz-fl

Хотя биологическая роль в развитии организма Д melanogaster для БНЯЗ изучена хорошо, молекулярный механизм его действия был неизвестен.

Белок ПНЮ взаимодействует с компонентом высокомолекулярного комплекса ВТПу коактиватором Ж4 УР на стадии эмбриона и куколки

Для выявления возможных партнеров коактиватора транскрипции ЭАУР, ранее в нашей лаборатории был проведен двугибридный скрининг библиотеки кДНК эмбрионов Д melanogaster. Было обнаружено взаимодействие АТ-Ьоок домена белка БАУР с С-концевым участком ядерного рецептора ЭНЯЗ, содержащим лиганд-связывающий домен (ЪЕШ) (Рис. 3). Таким образом, был обнаружен первый активатор транскрипции, взаимодействующий с коактиватором вАУР.

2008

»

Рис. 3. Схематическое строение белков SAYP и DHR3. Цифрами указаны номера аминокислот. Для SAYP указаны консервативные домены: AT-hook, SAY и PHD. Стрелкой показано взаимодействие AT-домена SAYP и лиганд-связывающего (LBD) домена DHR3.

Первым этапом настоящей работы явилось изучение взаимодействия данных белков. Для изучения взаимодействия SAYP и DHR3 были получены и аффинно очищены поликлональные кроличьи антитела против белка DHR3. Учитывая, что данный белок продуцируется на стадии эмбриона, для Вестерн-блот анализа антител против DHR3 был использован эмбриональный ядерный экстракт Д melanogaster дикого типа (Рис. 4(A)). Было показано, что антитела детектируют одну полосу, молекулярная масса

644 889 1623

say « phd

шт.....

111 1 487

шщттттшт

ШШ

LBL

которой около 65 кДа, что соответствует расчетной молекулярной массе белка DHR3 у D. melanogaster.

Специфичность данных антител была также проверена на препаратах слюнных желез предкуколок мух дикого типа и предкуколок мух, гомозиготных по гипоморфной мутации jjfift3Baoo5S5 (рис. 4(Б)). В мутантных мухах было показано снижение интенсивности полосы, узнаваемой антителами против DHR3.

Рис. 4. (А) Вестерн-блот анализ эмбрионального ядерного экстракта. Панель слева гибридизована с антителами против DHR3 (AT), панель справа - с преиммунной сывороткой (ПС). (Б) Вестерн-блот анализ препаратов слюнных желез предкуколок дикого типа (ДТ) и предкуколок мух, гомозиготных по гипоморфной мутации DflR3BG00585 (М), окрашенных полученными антителами к DHR3. На нижней панели представлено сравнение общего количество белка в исследуемых фракциях с помощью гибридизации с антителами против белка Tubulin.

Для проверки взаимодействия ядерного рецептора DHR3 с коактиватором транскрипции SAYP было проведено сравнение профилей элюции данных белков при хроматографическом разделении ядерного экстракта методом гель-фильтрации. Был использован ядерный экстракт из эмбрионов и куколок D. melanogaster, так как на этих стадиях развития детектируется наибольшее количество исследуемых белков.

ИО 2.0 эмбрион 07 0,4 мда

У ▼ т ▼

И 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 3334 35 36 37

SAYP | Ü' DHR3 j§

куколка

ИО 2.0 0.7 0.4 МДа

t г г г

И 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37

^U 0VM Н Шя ™ 'Мш ^шшшш ШШШШШШ^шЯШШ

щт — г~> ^ ; '

Рис. 5. Фракционирование ядерных экстрактов из эмбрионов (А) и куколок (Б) D. melanogasler методом гель-фильтрации на Superóse 6. Указан исключенный объем (ИО) и калибровка колонки маркерами с известной молекулярной массой.

Ранее было показано, что при разделении ядерного экстракта в результате гель-фильтрации SAYP элюируется с колонки во фракциях 16-17 в составе высокомолекулярного комплекса BTFly с молекулярной массой около 2 МДа.

Для белка DHR3 было детектировано два пика элюции (Рис. 5). Первый пик DHR3 в высокомолекулярной фракции (фракции 16-17) совпадает с пиком, содержащим SAYP. Второй (фракции 33-34), вероятно, представляет собой белок DHR3 в виде свободной низкомолекулярной формы. Результаты одинаковы как при разделении ядерного экстракта из эмбрионов (Рис. 5(А)), так и при использовании экстракта из куколок (Рис. 5(Б)). Таким образом, было показано, что DHR3 существует в организме не только в мономерном состоянии, но также и в составе высокомолекулярного комплекса, который по размеру соответствует комплексу, образуемому SAYP.

Для подтверждения взаимодействия данных белков во фракциях 16 и 17 была проведена их коиммунопреципитация (Рис. 6).

ип

И АТ ПС

«и» *•"» тт .

куколка

Рис. 6. Коиммунопреципитация компонентов высокомолекулярных фракций 16-17, полученных в результате гель-фильтрации из эмбрионального ядерного экстракта (А) и экстракта из куколок (Б). Коиммунопреципитация проводилась с помощью антител к белку БНЯЗ (АТ) и преиммунной сыворотки (ПС). Были проанализированы иммунопреципитированные белки и эквивалентное количество исходного экстракта (И). В качестве контроля использовалось окрашивание антителами к белку 8и(Нте), который не взаимодействует с ОНЯЗ.

Показано, что антитела против БНЯЗ в фракциях 16 и 17 как из эмбрионального ядерного экстракта, так и из экстракта из куколок, соосаждают БАУР.Таким образом, в высокомолекулярных фракциях ядерный рецептор ВНЯЗ ассоциирован с БАУР. Возможно, ассоциация с комплексом ВТР1у может объяснять миграцию БНЯЗ в составе высокомолекулярного комплекса на стадии эмбриона и куколки в ходе развития организма V. melanogaster.

Гены е(у)3 и Б1ШЗ имеют схожий профиль экспрессии входе развития ОгоаорИИа

Для сравнения транскрипционной активности генов е(у)3 и ЭНЯЗ был проведен Нозерн-блот анализ их экспрессии на разных стадиях развития О. melanogaster (Рис. 7).

ЭАУР Зи(Н\у)

ИП И АТ ПС

ШХ 1 &

Ж

БАУР

БНИЗ

Su(Hw)

эмбрион

DHR3

е(у)3 ftz-fl

yellow tubulin

Э ЛІ Л2 ЛЗр ЛЗп Kp Кс Кп С Ск

---

ШШШШ

mm

л» ж

Рис. 7. Сравнительный Нозерн-блот анализ профилей экспрессии генов DHR3, е(у)3, ftz-fl, yellow на разных стадиях развития D. melanogaster: Э - эмбрион, JI1 -личинка первого возраста, Л2 - личинка второго возраста, ЛЗр - личинка третьего возраста ранняя, ЛЗп

- личинка третьего возраста поздняя, Кр - куколка ранняя, Кс - куколка средняя, Кп

- куколка поздняя, С - взрослые самцы, Ск - взрослые самки. В качестве контроля предоставлен профиль экспрессии гена tubulin.

Показано, что пик экспрессии обоих генов, а также SAYP-зависимого гена, yellow, приходится на эмбриональную стадию и стадию средней куколки. Схожий профиль экспрессии генов DHR3 и е(у)3 в развитии организма может говорить об участии кодируемых ими белков в одних процессах. В частности, в регуляции экспрессии те.шyellow, для которого на этих стадиях развития показан пик экспрессии.

DHR3

і

DHR3

Рис. 8. Иммуноцитохимическое окрашивание препаратов политенных хромосом предкуколок О. melanogaster антителами против ОШЗ и 8АУР. Показана колокализация детектируемых сайтов.

Совместное участие в регуляции транскрипции схожего набора генов также подтверждается экспериментами по иммуноокрашиванию препаратов политенных хромосом слюнных желез предкуколок Д melanogaster антителами против 8АУР и ОНЯЗ. Было обнаружено, что БАУР и имеют множество сайтов колокализации (Рис. 8). Возможно, ОНЯЗ совместно с ЭАУР регулирует транскрипцию многих генов-мишеней в организме ВгозорЫ\а, в том числе ранее неизвестных для ОНЯЗ и 8АУР.

Гены е(у)3 и йНЯЗ взаимодействуют в ходе развития ОгоьоркИа

Для выявления взаимодействия е(у)3 и ОНРЗ в ходе развития Д melanogaster были проведены генетические эксперименты по скрещиванию мух, несущих мутации исследуемых генов.

Ранее, для самцов мух, гемизиготных по мутации е(у)3"\ было показано снижение выживаемости до 80% по сравнению с контрольной линией. В ходе нашей работы были поставлены скрещивания мух, несущих мутацию е(у)3"' и мух, мутантных по гену ПН КЗ (линии 13150 (ВЬогшгщйп)/; Р{Б1]Рог-Р}Нг46ксото/СуО; гуш и 15950 (В1оотшё1оп)/ ур67с"; Р{ЕР&2}Нг46ЕУ05т). Было проанализировано потомство от проведенных скрещиваний. Для самцов в Р1, несущих одновременно гемизиготную мутацию е(у)3"' и мутацию Нг4бкаото в гетерозиготе, было показано снижение выживаемости до 24% по сравнению с контрольной линией, а для самцов, несущих одновременно гемизиготную мутацию е(у)3"' и Нг46ЕГ0545' в гетерозиготе-снижение выживаемости до уровня 8%. Таким образом, сочетание мутаций генов е(у)3 и ОНЯЗ существенно влияет на выживаемость мутантных мух (Рис. 9(А)).

А

выживаемость

e(y)3[ul]/ Y; +/ +

e(y)3[ul]/ Y; DHR3[KG008S0]/ +

e(y)3[ul]/ Y; DHR3[EY054S1]/ +

цвет щетинок

y[2] +/ Y; DHR3[BG00S8S]/ + y[2] e(y)3[ul]/Y; +/+ y[2] e(y)3[ul]/ Y; DHR3[BG00585]/ +

80% 24% 8%

+5 +4 0

Рис. 9. Выживаемость (А) и цвет щетинок (Б) мух, несущих мутации генов е(у)3 и DHR3.

Изначально мутация е(у)3"' была обнаружена вследствие ее влияния на экспрессию аллеляУ гена yellow в щетинках. Частичное снижение экспрессии гена е(у)3 при мутации и1 имеет слабое влияние на экспрессию аллеля/ rzna. yellow в щетинках, вызывая снижение пигментации с +5 до +4.

Для мух, несущих мутацию Hr46BG005s\ не отмечено влияние на пигментацию щетинок. Самцы, полученные в результате скрещиваний, гемизиготные по мутации е(у)3"' и гетерозиготные по мутации Нг4бво00585 (линия 12495 (Bloomington) w"'8; PfGTl}Hr46BG0058S), имеют фенотип / со значением пигментации 0, что соответствует полной потери экспрессии гена yellow в щетинках(Рис. 9(Б)).

Таким образом, и ядерный рецептор DHR3, и транскрипционный коактиватор SAYP, участвуют в регуляции транскрипции гена yellow в ходе развития организма D. melanogaster. Данные исследования подтверждают предположение о наличии для DHR3 ранее неизвестных генов-мишений, которые также регулируются SAYP.

DHR3 связывается с промоторами SA YP-зависимых генов на стадии средней куколки

Чтобы подтвердить совместное участие DHR3 и SAYP в регуляции транскрипции, нами были выбраны несколько SAYP-зависимых генов {yellow, CGI1395, Сур12а5).

Рис. 10. Иммунопреципитация хроматина, проведенная на экстракте из куколок. Уровень DHR3, SAYP и РНК-полимеразы II (Pol II) на промоторах SAYP-зависимых генов. Показано процентное отношение от исходного экстракта. В качестве контроля взяты данные для межгенной области.

Как было показано ранее, на данной стадии развития и SAYP и DHR3 активно экспрессируются. Поэтому, для характеристики состояния промоторов выбранных генов были проведены эксперименты по хроматин-иммунопреципитации на ядерном экстракте из куколок (Рис. 10).

Было показано присутствие значительного количества DHR3 на промоторах SAYP-зависимых генов, что говорит о возможном его участии в регуляции их транскрипции.

Модельная система активации І)Ш<3 в культуре клеток Б2

Для детального изучения найденного взаимодействия транскрипционного коактиватора БАУР и ядерного рецептора ОНЯЗ была предложена модель активации ИНЯЗ в культуре клеток 82 И. melanogaster.

Как известно, ОНЙЗ является участником экдизонового каскада у О. melanogaster. В норме транскрипция ИНЯЗ в клетках детектируется на очень низком уровне. Нами была предложена модель и подобраны условия по активации ПНЯЗ в культуре клеток путем добавления в среду стероидного гормона экдизона. Было детально изучено два состояния - в среде без экдизона и после инкубации с экдизоном 16 часов (ночь).

А Б

швтз

------------- ц

КОІГфОЛ» экдизон

Рис. 11. Активация части экдизонового каскада в культуре клеток S2 D. melanogaster добавлением в среду экдизона. (А) Вестерн-блот анализ клеточного экстракта до (контроль) и после (экдизон) добавления экдизона с использованием антител против DHR3. Для контроля общего уровня белков в обоих образцах данный Вестерн-блот был гибридизован с антителами против белка Tubulin. (Б) Уровень транскриптов DHR3 до (контроль) и после (экдизон) добавления экдизона, измеренный методом количественного ПЦР. За единицу взят уровень транскриптов, детектируемый в S2 клетках отсутствие экдизона.

Для контроля активации DHR3 на белковом уровне был проведен Вестерн-блот анализ клеточного экстракта с антителами против DHR3 (Рис.

18

DHR3 Tubulin

контроль экдшон

I зоо і 250 ■ і 200 -і 150

і 100 ■

І

I so о -

11(А)). Одновременно, для проверки активации транскрипции данного гена методом количественного ПЦР был измерен уровень транскриптов ЭНЯЗ до и после активации экдизоном (Рис. 11(Б)). Было показано значительное увеличение как количества транскриптов данного гена, так и увеличение концентрации белка в клетках.

Таким образом, можно заключить, что при добавлении экдизона к культуре клеток Б2 происходит активация транскрипции гена экдизонового каскада ОН ЯЗ.

ОНЯЗ и 5/4 КР совместно активируют экспрессию генов СО! 1395 и Сур12а5 в культуре клеток

Для изучения участия ВНЯЗ в активации ЗАУР-зависимой транскрипции в культуре Б2 клеток были проанализированы состояния промоторов нескольких БАУР-зависимых генов.

Рис. 12. Привлечение ОНЯЗ на промоторы нескольких 5АУР-зависимых генов при активации части эксдизонового каскада в культуре Б2 клеток. Показаны состояния промоторов до (контроль) и после (экдизон) добавления экдизона в среду.

Было показано, что при добавлении экдизона в культуру 82 клеток, происходит увеличение уровня ЭНЯЗ на промоторах нескольких 8АУР-зависимых генов (Рис. 12).

Для подтверждения того, что изменение уровня 8АУР и ЭНЯЗ на промоторах данных генов является специфическим, с помощью метода хроматин иммунопреципитации были проверены области, окружающие промотор (Рис. 13).

БАУР

^ выше промотора « промотор * нііже промотора

Саі1400 дІоЬіп! Сур12а5 Са11395

0,5 0,45 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 О

СвІМОО дЫШ Сур12а5 СС11395

БНИЗ

ш выше промотора

■ промотор

■ ниже промотора

Б

Рис. 13. Уровень вАУР (А) и БНЯЗ (Б) в области промоторов нескольких ЭАУР-зависимых генов в условиях активации экдизонового каскада. Иммунопреципитация хроматина на экстракте из клеток. Серой линией отмечен уровень количества исследуемых белков в межгенной области.

Было показано, что повышение уровня ЭАУР и ВНЯЗ на промоторах нескольких вАУР-зависимых генов происходит специфично относительно окружающей области.

Для более детального рассмотрения были выбраны два Э АУР-зависимых гена -СС11395 и Сур12а5. Методом количественного ПЦР анализа был измерен уровень их транскрипции до и после активации йНЯЗ экдизоном (Рис. 14).

Г

: V" •

8:2

* 82 ♦ зкдятов * РНКи

ш

vis **

о : ill

CGI №5 Q)pl2aS

Рис. 14. Уровень транскрипции SAYP-зависимых генов CGI 1395 и Сур12а5, измеренный методом количественного ПЦР. Показаны следующие состояния: S2 - норма; S2 + экдизон - клетки, активированные экдизоном; РНКи - клетки со сниженным уровнем SAYP; РНКи + экдизон - активация экдизоном в клетках со сниженным уровнем SAYP. За единицу взят уровень транскриптов, детектируемый в контроле.

Было показано, что в культуре клеток при добавлении экдизона происходит значительное увеличение транскрипции SAYP-зависимых генов CGI 1395 и Сур12а5 по сранению с контролем.

При помощи РНК-интерференции был снижен уровень белка SAYP и данные гены были вновь активированы при помощи экдизона. Оказалось, что на фоне пониженного уровня SAYP, активации данных генов происходит не так эффективно. Таким образом, транскрипция нескольких SAYP-зависимых

генов чувствительна к активации экдизоном. Эффективность данной активации зависит от уровня 8АУР.

С помощью метода хроматин иммунопреципитации была также произведена оценка состояния промоторов данных ЗАУР-зависимых генов в условиях активации экдизонового каскада в культуре нормальных клеток и при одновременном нокдауне БАУР (Рис. 15).

і 1

т

ІІ»

И5 « N4 - ■ т

1,2 I 0,8 0,6 0,4 0,2 О

промотор СО} 1395 промотор Сур12а$

0,6 0.5 0,4 0,3 0,2 0,1 О

промотор СОИЗРв промотор Сур12йЗ

«

щ

С 1 І Г

I в І

.......] 1..........

8АУР

82

¡* * зкднзен в РНКи

«РНКи * экдижж

БНИЗ

82

+ экдяэоя «РНКи

■ РНКи * зкдизоя

Рис. 15. Уровень ЭАУР и БНЮ на промоторах вАУР-зависимых генов: Сй11395 и Сур12а5 при активации экдизонового каскада в нормальных клетках (столбцы - (82) и (Э2 + экдизон)) и в клетках с нокдауном ЭАУР (столбцы - (РНКи) и (РНКи + экдизои). Серой линией отмечен уровень факторов в межгенной области. Показано процентное отношение от исходного экстракта.

Оказалось, что при снижении внутриклеточного уровня SAYP при помощи РНК-интерференции уровень данного белка на промоторе генов снижается. Однако, уровень активатора DHR3 на промоторе генов не изменился на фоне снижения уровня SAYP, что говорит о независимости привлечения DHR3 от SAYP.

В условиях активации экдизонового каскада при одновременном нокдауне SAYP на промоторы исследуемых генов, видимо, привлекается остаточное количество SAYP, которое обеспечивает остаточный уровень транскрипции этих генов.

Ранее в нашей лаборатории было показано, что SAYP привлекается на промоторы генов в составе мультисубъединичного комплекса BTFly, состоящего также из хроматин ремоделирующего фактора Brahma и фактора инициации транскрипции TFIID.

Методом хроматин-иммунопреципитации было также проанализировано присутствие на промоторах двух SAYP-зависимых генов компонентов данного мультисубъединичного комплекса и РНК-полимеразы II в условиях активации экдизонового каскада в культуре S2 клеток. При помощи метода хроматин иммунопреципитации был измерен уровень компонентов суперкомплекса BTFly на промоторе генов до и после активации экдизоном (Рис. 16). Оказалось, что в условиях активации транскрипци данных генов происходит увеличение уровня компонентов комплекса на промоторе данных генов. При снижении внутриклеточного уровня SAYP при помощи РНК-интерференции, уровень компонентов на промоторе генов также снижается.

промотор CGI 1395

1,5

0,3

I

Л л

TAF1 IBP P8 Mar 'Pol 51

S2

• S2 + звддаов ¡8 РНКн + sKAüio»

Ak,

промотор Cypl2a5

0,5

І

і .... Шя.

S2

* S2 + экдизон ш РНК»! + знди-зои

ТАП. TBP Р8 Мог Pol!!

Рис. 16. Уровень компонентов комплекса BTFly и РНК-полимеразы II (Pol II) на промоторах SAYP-зависимых генов при активации экдизонового каскада в нормальных клетках (столбцы (S2) и (S2 + экдизон)) и со сниженным содержанием SAYP (РНКи + экдизон). Показано процентное отношение от исходного экстракта.

При активации экдизонового каскада на промоторах SAYP-зависимых генов происходит увеличение уровня компонентов мультисубъединичного комплекса BTFly, в частности, показано увеличение для субъединиц фактора инициации транскрипции TFIID (TAF1 и ТВР) и компонентов хроматинремоделирующего комплекса Brahma (РВ и Мог). В связи с этим, происходит и значительное повышение уровня РНК-полимеразы II на промоторе.

Схожие измерения уровня компонентов комплекса с помощью метода хроматин иммунопреципитации были проведены на клетках со сниженным содержанием 8АУР. Было показано, что в условиях РНК-интерференции ЭАУР происходит снижение уровня всех компонентов комплекса ВТР1у на промоторах рассмотреных генов, что влечет за собой и снижение уровня РНК-полимеразы II.

б |...........................................................................................................................................

5 -

3 «й«-//

контроль экдизов

Рис. 17. Уровень транскрипции генапри активации экдизонового каскада, измеренный методом количественного ПЦР анализа. За единицу взят уровень транскрипции в неактивированных клетках.

Обнаружив изменение уровня транскрипции 8АУР-зависимых генов в условиях активации ПНЮ при добавлении экдизона к клеткам, было решено уточнить роль 8АУР в регуляции транскрипции единственного известного на данный момент ОНЯЗ-зависимого гена//г-/У, который также является компонентом экдизонового каскада. Показано, что пик экспрессии гена/£-// смещен относительно пика экспрессии гена ЭНЮ и приходится на стадию поздней куколки (Рис. 7). В культуре Э2 клеток О. melanogaster при активации экдизонового каскада активации гена йг-{\ не происходит (Рис. 17).

ЛХ УР рекрутируется на промотор БНЯЗ-зависимого гена //г-// после активации экспрессии ОНКЗ в составе суперкомплекса ВТР1у

Для изучения участия ЭАУР в 0Н113-зависимой транскрипции было решено исследовать привлечение 8АУР на промотор гена/£-//. При помощи метода иммунопреципитации хроматина было проанализировано состояние промотора генадо, после активации экдизоном в культуре нормальных клеток 82, а также в активированных клетках на фоне сниженного внутриклеточного уровня ЭАУР.

промотор /tz.fl

32

» В2 * экдичак « РНКи * экдязои

Рис. 18. Уровень БАУР и ОНІУ на промоторе БНЯЗ-зависимого гена./Ьг-// при активации экдизонового каскада в культуре нормальных клеток Б2 (в2 + экдизон) и при одновременном нокдауне БАУР (РНКи + экдизон). Столбец в2 - неактивированные клетки в2. Показано процентное отношение от исходного экстракта.

Было показано, что при активации экдизонового каскада в культуре клеток на промотор гена /й-// происходит привлечение ядерного рецептора ИНЯЗ. Вместе с ЭНЯЗ на промоторе/£г-// происходит увеличение уровня ЭАУР. Снижение уровня ЭАУР на промоторе при нокдауне не влияет на уровень ЭНЯЗ, связанного с промотором (Рис. 18).

Было проанализировано привлечение компонентов комплекса ВТРІу, образуемого вАУР, на промотор //-г-// на разных стадиях активации. Также

26

-1» І

I

її

-

1 і №■■.........................."„.і

ЗАЇР пина

был исследован уровень РНК-полимеразы II на промоторе данного гена (Рис. 19).

промотор /Ї2-/І

Рис. 19. Уровень компонентов комплекса ВТРІу и РНК-полимеразы II на промоторе гена /&-// при активации экдизонового каскада в культуре нормальных Б2 клеток и при одновременном нокдауне БАУР. Показано процентное отношение от исходного экстракта.

Показано, что при обработке экдизоном происходит привлечение компонентов комплекса и РНК-полимеразы II, которое нарушается при одновременном нокдауне 8АУР.

Активации транскрипции гена/¡2-/1 при добавлении экдизона к Б2 клеткам не происходит, несмотря на активацию экспрессии активатора БНЯЗ, участвующего в транскрипции этого гена. Это согласуется с имеющимися литературными данными, указывающими на то, что может репрессироваться высокой концентрацией экдизона.

Однако, мы обнаружили, что активатор ОНЯЗ рекрутируется на промотор генав репрессированном состоянии. Было продемонстрировано, что вместе с увеличением уровня активатора на промоторе возрастает уровень компонентов комплекса ВТРІу, а также РНК-полимеразы II. Таким образом, на промоторе/?;-// при высокой концентрации экдизона происходит сборка неактивного преинициаторного

27

комплекса РНК-полимеразы II. Возможно, такая подготовка необходима для дальнейшей быстрой активации транскрипции гена в ответ на снижение уровня гормона.

Модель участия БА УР Г)НЯЗ-зависимой транскрипции

На основании полученных результатов была предложена модель участия БАУР в работе транскрипционного аппарата при активации части экдизонового каскада.

А Б

Рис. 20. Организация работы транскрипционного аппарата при активации экдизонового каскада (показаны только БНЮ-зависимые события).

Было показано, что при активации экдизонового каскада происходит привлечение ОНЯЗ на ряд промоторов. Затем происходит привлечение ВТР1у и РоШ, что приводит к сборке преинициаторного комплекса на промоторе и активации транскрипции. В условиях сниженного содержания 8АУР в клетке привлечение ОНЯЗ не нарушается, но активации транскрипции не происходит (Рис. 20).

^ есс/увопв

III. Выводы

1. Установлено, что в организме D. melanogaster ядерный рецептор DHR3 ассоциирован с коактиваторным суперкомплексом BTFly посредством взаимодействия с SAYP.

2. Для генов DHR3 и е(у)3, кодирующих DHR3 и SAYP, показано генетическое взаимодействие и коэкспрессия в развитии D. melanogaster.

3. Найдены новые гены-мишени DHR3. Показано влияние DHR3 на транскрипцию ранее неизвестных для него генов-мишеней, которые контролируются также SAYP.

4. Показано, что DHR3 и SAYP привлекаются на промоторы генов-мишеней при активации экдизонового каскада в культуре клеток S2 D. melanogaster.

5. Показано участие SAYP в ОР^З-зависимой транскрипции в условиях активации экдизонового каскада в культуре клеток S2 D. melanogaster.

6. Установлено, что SAYP участвует в привлечении на промотор DHR3-3aBHCHMoro генаftz-fl компонентов коактиваторного суперкомплекса BTFly и РНК-полимеразы II, формируя преинициаторный комплекс перед началом транскрипции.

7. Разработана система активации части генов экдизонового каскада в культуре клеток S2 D. melanogaster.

IV. Список публикаций по теме диссертации

Статьи:

1. Vorobyeva NE, Soshnikova NV, Kuzmina JL. Kopantseva MR, Nikolenko JV, Nabirochkina EN, Georgieva SG, Shidlovskii YV. The novel regulator of metazoan development SAYP organizes a nuclear coactivator supercomplex. Cell Cycle (2009); 8(14):2152-6.

2. Кузьмина Ю.Л., Панов B.B., Воробьева H.E., Сошникова Н.В., Копанцева М.Р., Николенко Ю.В., Набирочкина Е.Н., Георгиева С.Г., Шидловский Ю.В. SAYP - новый регулятор развития многоклеточных организмов. Генетика (2010); 46 (8), С. 1033-1040

3. Vorobyeva NE, Nikolenko JV, Krasnov AN, Kuzmina JL, Panov VV, Nabirochkina EN, Georgieva SG, Shidlovskii YV. SAYP interacts with DHR3 nuclear receptor and participates in ecdysone-dependent transcription regulation. Cell Cycle (2011) 10(11):1821-7.

Тезисы конференций:

1. Mechanism of transcription activation by factor SAYP. Shidlovskii YV, Kuzmina JL, Panov VV, Vorobyeva NE, Soshnikova NV, Georgieva SG, Ilyin YV. International Symposium "Control of gene expression and cancer", Russia, Moscow, 21-25.06.2010, Abstract book, p.15

2. Механизмы активации генов коактиватором SAYP. Кузьмина Ю.Л., Воробьева Н.Е., Николенко Ю.В., Набирочкина Е.Н., Краснов А.Н., Георгиева С.Г., Шидловский Ю.В. XXIII Международная зимняя молодежная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 7-10 февраля 2011, Тезисы докладов, стр. 80

3. Mechanisms of gene activation by transcription coactivator SAYP. Kuzmina JL, Vorobyeva NE, Nikolenko JV, Nabirochkina EN, Krasnov AN, Georgieva SG, Shidlovskii YV VII International Scientific Conference for Students and PhD Students "Youth and Progress of Biology", Lviv, Ukraine, April 5-8,2011, Abstract book, p. 304

4. Novel mechanism of genes activation by SAYP/PHF10 coactivator is important in signaling pathways. Panov VV, Kuzmina JL, Doronin SA, Vorobyeva NE, Soshnikova NV, Georgieva SG, Shidlovskii YV. EMBO Conference Series on Nuclear Structure and Dynamics, France, L'Isle sur la Sorgue, September 28 -October 2,2011, Abstract book, P-098

Подписано в печать:

13.03.2012

Заказ № 6809 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кузьмина, Юлия Леонидовна, Москва

61 12-3/851

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ ГЕНА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

Кузьмина Юлия Леонидовна

Исследование роли коактиватора транскрипции БАУР в активации I) IIИ 3 -ш в и с и м о й транскрипции генов у ВгоьоркИа те1апо£ан(ег

03.01.03 - Молекулярная биология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

кандидат физико-математических наук, Шидловский Юлий Валерьевич;

кандидат биологических наук, Воробьева Надежда Евгеньевна.

Москва 2012

СОДЕРЖАНИЕ

СОДЕРЖАНИЕ..............................................................................................................................2

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ...........................................................................................................4

ВВЕДЕНИЕ....................................................................................................................................7

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...............................................................................................................10

Глава 1. Факторы транскрипции............................................................................................10

Транскрипционный аппарат эукариот...............................................................................10

РНК-полимераза II...............................................................................................................11

Классификация факторов транскрипции..........................................................................14

Общие факторы транскрипции GTFs................................................................................14

Активаторы и репрессоры..................................................................................................16

Ядерные рецепторы.............................................................................................................17

Корегуляторы.......................................................................................................................26

Глава 2. Участие хроматина в транскрипции.......................................................................27

Посттрансляционные модификации гистонов. Гистоновый код....................................27

Механизмы регуляции транскрипции на уровне хроматина..........................................32

Ремоделинг хроматина и гистоновый обмен....................................................................33

Вариативные гистоны.........................................................................................................36

Нуклеосома как транскрипционный барьер.....................................................................36

Глава 3. Транскрипционный цикл эукариот.........................................................................39

Инициация транскрипции...................................................................................................39

Пауза РНК-полимеразы на промоторе..............................................................................43

Переход от абортивной к продуктивной инициации транскрипции..............................44

Факторы и события, влияющие на элонгацию.................................................................46

Терминация транскрипции.................................................................................................48

Генное выпетливание..........................................................................................................50

ОБЪЕКТ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ................................................................................54

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.......................................................................................................59

МАТЕРИАЛЫ..........................................................................................................................59

Ферменты, киты и реактивы...............................................................................................59

Векторные конструкции.....................................................................................................59

Праймеры.............................................................................................................................59

Штаммы Е. coli....................................................................................................................61

Культуры эукариотических клеток....................................................................................61

Среды для культивирования...............................................................................................61

Линии мух............................................................................................................................62

Антитела...............................................................................................................................62

Програмное обеспечение. Базы данных............................................................................62

МЕТОДЫ..................................................................................................................................63

Работа с ДНК........................................................................................................................63

Работа с РНК........................................................................................................................65

Работа с белками..................................................................................................................68

Работа с S2 клетками...........................................................................................................73

РЕЗУЛЬТАТЫ.............................................................................................................................74

Получение политональных антител к белку ИНЯЗ............................................................74

Белок ИНЯЗ взаимодействует с компонентом высокомолекулярного комплекса ВТПу

коактиватором БАУР на стадии эмбриона и куколки........................................................76

Гены е(у)3 и ОНЯЗ имеют схожий профиль экспрессии в ходе развития ОгояорИПа.....78

Гены е(у)3 и ОНЯЗ взаимодействуют в ходе развития Пго$орЫ1а...................................80

ВНИЗ связывается с промоторами БАУР-зависимых генов на стадии средней куколки82

Модельная система активации ИНЯЗ в культуре клеток Б2.............................................83

ВНИЗ и Б АУР совместно активируют экспрессию генов СОИ395 и Сур12а5 в культуре

клеток................................................... ....................................................................................84

Б АУР рекрутируется на промотор БНЯЗ -зависимого гена /&-// после активации

экспрессии ИНЯЗ в составе суперкомплекса ВТПу.............................................................91

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ...............................................................................................93

Модель участия БАУР ОНЯЗ-зависимой транскрипции.....................................................97

ВЫВОДЫ.....................................................................................................................................98

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...........................................................................................................99

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ACF (ATP-utilising Chromatin remodeling and assembly Factor) АТФ-зависимый фактор, ремоделирующий и структурирующий хроматин

AD (Activation Domain) — Активационный домен

СВР (CREB Binding Protein) — Белок, связывающийся с CREB

Chdl (Chromodomain-helicase-DNA-binding protein 1) Хромодоменный хеликазный ДНК-связывающий белок 1

ChIP (Chromatin Immunoprecipitation) Иммунопреципитация хроматина

CHRAC (Chromatin Remodeling and Assembly Complex) Комплекс ремоделирующий и структурирующий хроматин

CTD (C-terminal Domain) С-концевой домен большой субъединицы Pol II

DBD (DNA-binding Domain) — ДНК-связывающий домен

е(у)3 (enhancer of yellow 3) — Энхансер гена yellow 3

ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) Иммуноферментный анализ

GTF (General Transcription Factor) — Общий фактор транскрипции

HAT (Histone-acetyltransferase) — Гистонацетилтрансфераза

HDAC (Histone-deacetylase) — Гистондеацетилаза

НМТ (Histone-methyltransferase) — Гистонметилтрансфераза

ISWI (Imitation SWI) Белок, похожий свойствами на SWItch (переключатель)

IP (Immunoprecipitation) — Иммунопреципитация

КАТ (Lysine (K) Acetyl Transferases) - Лизин ацетилтрансфераза

KMT (Lysine (K) Methyl Transferases) Лизин метилтрансфераза

LBD (Ligand-binding Domain) — Лиганд-связывающий домен

MLL(l-5) (Mixed-lineage Leukemia) Метилтрансфераза смешенных линий лейкемии

NR (Nuclear Receptor) — Ядерный рецептор

NURF (Nucleosome Remodeling Factor) Фактор, ремоделирующий нуклеосомы

PAF (Polymerase II Associated Factor) Фактор, ассоциированный с Pol II

PHD (Plant Homeodomain) — Гомеодомен растений

PIC (Preinitiaitory Complex) — Преинициаторный комплекс

Pol II (RNA polymerase II) — РНК-полимераза II

Pol III (RNA polymerase III) — РНК-полимераза III

PRMT (Protein Arginine (R) Methyl Transferases) Белковая аргинин метилтрансфераза

RSC (Remodel the Structure of Chromatin) Комплекс, ремоделирующий структуру хроматина

RD (Repressive domain) - Репрессивный домен

SAYP (Supporter of activation of yellow protein) Белок, поддерживающий активацию yellow

SAGA (Spt-Ada-Gcn5 Acetyltransferase) Spt-Ada-Gcn5 ацетилтрансфераза

Ser2, Ser5, Ser7 - Положение аминокислоты в

CTD Pol II гептапептидном повторе CTD Pol II

SWI/ SNF (SWItch/ Sucrose NonFermentable) Переключатель/ Не перерабатывающий сахарозу

TAF (TBP-associated factor) — Фактор, ассоциированный с TBP

TBP (TATA-binding protein) — ТАТА-связывающий белок

TFIIA...H (Transcription Factor for Pol II) — Транскрипционный фактор Pol II

TFTC (TBP-free TAF-containing) Комплекс, не содержащий ТВР, но содержащий TAFs

a.o. — Аминокислотный остаток

МДа Мегадальтоны

п.н. — Пары нуклеотидов

т.п.н. — Тысяча пар нуклеотидов

Сложная система клеточной коммуникации обеспечивает способность клетки получать информацию из ее окружения и изменять свой метаболизм в ответ на поступающие сигналы. Возможность клеток реагировать на изменения окружающей среды является основой развития, репарации тканей, иммунитета и системы поддержания гомеостаза в целом. Нарушения клеточной сигнализации могут приводить к различным серьезным заболеваниям. Понимание механизмов передачи сигнала внутри клетки необходимы для разработки методов лечения различных заболеваний.

Передача сигнала в клетке осуществляется обычно через каскад биохимических реакций. В случае, когда конечным звеном каскада являются транскрипционные факторы, происходит изменение профиля экспрессии определенных генов-мишеней. Изменение профиля экспрессии влечет за собой изменения в метаболизме, строении и функциях клетки и определяет ее дальнейшую судьбу. В данном процессе одну из ключевых ролей играют различные транскрипционные факторы.

Транскрипционный аппарат клетки необычайно сложно устроен и данные о механизме его работы постоянно дополняются. Основной фермент транскрипционного аппарата - ДНК-зависимая РНК-полимераза. Для эукариотических клеток характерна специализация РНК полимераз, то есть транскрипция определенного типа генов осуществляется специальной РНК-полимеразой. Так, экспрессию генов, кодирующих мРНК, контролирует РНК-полимераза II. Несмотря на свое сложное строение, она не способна самостоятельно инициировать транскрипцию. Для этого ей необходимы многочисленные вспомогательные факторы.

На данный момент выделяют три условные группы факторов транскрипции: общие факторы транскрипции, необходимые для экспрессии большинства генов, специфические факторы транскрипции (активаторы и репрессоры) и так называемые корегуляторы

(коактиваторы и корепрессоры). Последние осуществляют связь между специфическими и общими факторами транскрипции, а также изменяют структуру хроматина. Традиционно биологические исследования сфокусированы на изучении отдельных частей транскрипционного аппарата. Знания об устройстве аппарата транскрипции важны как в теоретическом плане, так и для изучения патологий, связанных с нарушениями в его работе.

Основной целью данной работы являлось изучение роли транскрипционного фактора Б АУР как коактиватора транскрипции для ядерного рецептора БНЮ у Э. твЫпо^азгег. Транскрипционный коактиватор 8АУР и ядерный рецептор БНЯЗ незаменимы в развитии, консервативны в эволюции и имеют гомологов в протеоме человека. Мутации данных белков их гомологов вызывают тяжелые нарушения в развитии как В. те1апо$а$1ег, так и человека. Гомолог 8АУР, белок РНИО человека, также важен в контроле пролиферации клеток.

Для изучения взаимодействия данных белков были использованы разнообразные физико-химические методы работы с ДНК, РНК, белками, методы биоинформатики. В работе показано взаимодействие коактиватора БАУР с ядерным рецептором БНЯЗ как биохимических, так и в генетических экспериментах. Показано совместное участие активатора БНЯЗ и коактиватора Б АУР в активации транскрипции нескольких генов. Также были получены новые данные о работе экдизонового каскада, предложен механизм действия ядерного рецептора БНИ-З-

Ввиду того, что транскрипционный коактиватор БАУР и ядерный рецептор ОНЯЗ имеют гомологов в протеоме человека, изучение их функций на примере модельного объекта I). melanogaster поможет понять, как их гомологи функционируют в организме человека. Исследования в области изучения взаимодействия данных белков могут иметь

большое фундаментальное значение, а также практическое применение в медицине, фармакологии, биотехнологии и селекции.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Факторы транскрипции

Процесс синтеза РНК с использованием ДНК в качестве матрицы происходит во всех живых клетках и является первым и важнейшим этапом в реализации наследственной информации. Транскрипция осуществляется благодаря слаженному взаимодействию разнообразных транскрипционных факторов друг с другом, с другими клеточными белками и ДНК-зависимой РНК-полимеразой, основным ферментативным комплексом транскрипционного аппарата клетки. Привлечение транскрипционных факторов и полимеразы в процессе активации транскрипции происходит на определенные регуляторные последовательности генома. Так как доступность этих последовательностей чрезвычайно важна для эффективности распознавания их транскрипционными факторами, белковые комплексы, участвующие в изменении структуры хроматина, могут оказывать большое влияние на транскрипцию генов.

Транскрипционный аппарат эукариот

Эукариотическая транскрипция регулируется в несколько этапов. Обыно она

начинается со специфического связывания активатора с энхансерным элементом ДНК. В

результате этого инициируется последовательное привлечение общих факторов

транскрипции GTFs (General Transcription Factors) и РНК-полимеразы II (далее Pol II, RNA

Polymerase II) на промотор гена-мишени [1]. Инициация транскрипции характеризуется

образованием функционального преинициаторного комплекса PIC (Preinitiation Complex).

Далее происходит локальное плавление ДНК в области промотора и Pol II покидает район

промотора. Происходит переход из фазы инициации транскрипции к элонгации.

Кэпирование и процессинг транкрибируемой РНК, как правило, происходит

одновременно с процессом элонгации транскрипции. Этап терминации связан не только с

10

завершением процесса транскрипции, но и с процессом повторного использования транскрипционных комплексов и Pol II. На этом основана способность гена к нескольким раундам транскрипции.

РНК-полимераза II

Ферменты класса РНК-полимераз представляют собой многосубъединичные белковые комплексы, состоящие из двух больших (120-220 кДа) и 10-14 малых (10-100 кДа) субъединиц [2] [205] и химически являются нуклеотидил-трансферазами, полимеризующими рибонуклеотиды на З'-конце цепи РНК. Благодаря своему сложному строению РНК-полимеразы способны осуществлять обширную программу реализации генетической информации, взаимодействовать со многими факторами транскрипции и реагировать на многочисленные регуляторные сигналы.

Для эукариотических клеток характерна специализация РНК-полимераз, то есть транскрипция определенного типа генов осуществляется специальной РНК-полимеразой. Так, экспрессией генов, кодирующих мРНК, занимается РНК-полимераза II (Pol И). Наиболее изучена структура Pol II у дрожжей. Данная полимераза имеет молекулярный вес около 0,5 МДа и образована 12 субъединицами: двумя большими субъединицами Rpbl и Rpb2, формирующими структуру наподобие открытых челюстей, и 10 более мелкими субъединицами, располагающимися по периферии. Между большими субъединицами полимеразы расположена положительно заряженная щель, на одной из сторон которой формируется подвижный зажим, регулирующий открытие и смыкание всей структуры. Активный центр Pol II находится в выступающей петле одной из больших субъединиц Rpbl, между зажимом и границей щели. Молекула ДНК, связываясь с каналом в просвете больших субъединиц, может продвигаться по направлению к активному центру. В структуре минимального элонгирующего комплекса Pol II, ДНК и РНК образуют

гетеродуплекс из 9 пар оснований и зажим переходит в закрытое состояние. Однако, с внешней стороны зажима остается выступающий фрагмент, который взаимодействут с С-концевым доменом субъединицы Rpbl.

Важной характерной чертой Rpbl Pol II является наличие длинного С-концевого домена (CTD, C-Terminal Domain). После модификации CTD (в основном фосфорилирования) большой субъединицы Pol II может служить основой для связывания некоторых клеточных факторов, участвующих в разных стадиях транскрипции, таких как кэпирование транскрипта и процессинг мРНК. CTD большой субъединицы Pol II (далее CTD Pol II) составлен из тандемных гептапептидных повторов -Y-S-P-T-S-P-S- (52 для человека). Делеция CTD Pol II у мыши, Drosophila или дрожжей летальны для организма. Тем не менее, в in vitro экспериментах удаление CTD Pol II не оказывает ингибирующего действия на транскрипцию [3].

Основные модификации гептапептидного повтора CTD Pol II включают в себя пептидил-пролил изомеризацию (Pro), гликозилирование (Ser и Thr) и самое значимое из них - фосфорилирование (Ser) [4]. Различные модификации CTD могут происходит как изолированно, так и в сочетании с привлечением определенного набора белковых факторов. В каждом консенсусном пептиде есть два пептидилпролила, которые в результате модификаций могут быть отриентированы как в цис -, так и в транс-конформацию, приводя к четырем возможным комбинациям. Пептидилпролил цис-транс-изомераза Pinl млекопитающих (PPIase) и ее гомолог у дрожжей - ESS1 - вовлечены в процесс изомеризации пролина in vivo. Эти ферменты имеют очень высокую специфичность к остаткам пролина. Мутации в ESS1 приводят к дефектам в 3'-процессинге пре-мРНК у дрожжей [5].

Полимераза привлекается на промотор гена чаще всего в гипофосфорилированном состоянии. Известно, что серины, входящие в состав CTD Pol II (позиции 2, 5 и 7),

фосфорилируются на определенных этапах транскрипции [6, 7]. Последовательное появление модификаций гептапептидных повторов CTD координирует привлечение специфических факторов, связанных с транскрипцией. Этот процесс протекает по механизмам, похожим на функционирование гист�