Механизм действия белкового суперкомплекса, содержащего фактор транскрипции SAYP

Шидловский, Юлий Валерьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Механизм действия белкового суперкомплекса, содержащего фактор транскрипции SAYP
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Механизм действия белкового суперкомплекса, содержащего фактор транскрипции SAYP"

На правах рукописи

Шидловский Юлий Валерьевич

Механизм действия белкового суперкомплекса, содержащего фактор транскрипции вАУР

Специальность 03.01.03 - "Молекулярная биология"

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

1 2 И ЮЛ 2012

005046416

Москва-2012

005046416

Работа выполнена в Лаборатории регуляции экспрессии генов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии гена Российской академии наук

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор Георгиева София Георгиевна Официальные оппоненты:

Гвоздев Владимир Алексеевич, академик РАН, доктор биологических наук, профессор, заведующий отделом молекулярной генетики клетки ИМГ РАН

Крамеров Дмитрий Александрович, доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией эволюции геномов эукариот ИМБ РАН

Буздин Антон Александрович, доктор биологических наук, руководитель группы геномного анализа сигнальных систем клетки ИБХ РАН

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской академии наук

Защита диссертации состоится 25 сентября_2012 года в 11 часов

на заседании Диссертационного совета Д 002.235.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта Российской академии наук по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32.

Автореферат разослан 25 июня 2012 года

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук Крицын А.М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы.

Экспрессия генов - фундаментальный процесс, лежащий в основе жизнедеятельности организма. Изучение механизмов регуляции активности генов - важнейшая задача как для фундаментальных, так и прикладных исследований.

Экспрессия генов включает в себя ряд последовательных молекулярных стадий: подготовка матрицы хроматина, транскрипция ДНК, созревание мРНК и формирование рибонуклеопротеиновых частиц, их внутриклеточный транспорт и трансляция на рибосомах. Каждая из указанных стадий контролируется определенным набором факторов - молекулярных машин, которые обычно представлены мультисубъединичными белковыми комплексами. Взаимодействие и согласованное привлечение различных факторов обеспечивает координацию отдельных этапов в единый процесс.

Контроль экспрессии генов осуществляется в основном на стадии транскрипции. У высших эукариот на этом этапе задействовано несколько тысяч белков и их комплексов. Они формируют большой аппарат транскрипции, обеспечиваюший точный контроль активности генов. Современные знания об этом аппарате далеки от полноты, в частности, остается малоизученным вопрос о координации действия его участников.

Экспрессия генов контролируется сигналами, поступающими в клетку извне. Распознавание и передача поступающих стимулов осуществляется многочисленными сигнальными путями. Важный вопрос - изучение молекулярных механизмов, обеспечивающих связь сигнальных путей с аппаратом транскрипции. Конечным звеном сигнальных каскадов часто является специфический фактор транскрипции, контролирующий определенный круг генов-мишеней. Детали молекулярных событий, происходящих при активации генов-мишеней не всегда достаточно ясны. Т.к. сигнальные пути - важнейший регулятор онтогенеза, указанная проблема тесно связана с вопросом о молекулярных основах контроля работы генов в онтогенезе.

В работе изучался механизм действия фактора транскрипции высших эукариот SAYP. Гомологи SAYP найдены у всех многоклеточных животных, они являются незаменимыми в развитии. Было обнаружено, что SAYP координирует два этапа экспрессии генов посредством нового механизма. Также выяснена роль этого механизма в ряде сигнальных путей и в онтогенезе.

Цель работы и основные задачи исследования.

Целью данной работы является изучение механизма действия фактора транскрипции SAYP эукариот на модельном организме Drosophila melanogaster.

Предполагалось решить следующие задачи:

1. Разработать метод получения высокоочищенных белковых комплексов факторов транскрипции и протестировать его.

2. Очистить белковый комплекс, содержащий SAYP.

3. Исследовать молекулярную связь SAYP с близким по функциям фактором ENY2.

4. Изучить молекулярную структуру SAYP-содержащего комплекса.

5. Исследовать роль SAYP-содержащего комплекса в процессе транскрипции.

6. Идентифицировать специфические транскрипционные активаторы, взаимодействующие с SAYP, и связанные с ними биологические процессы.

7. Выяснить роль SAYP и содержащего его комплекса в активации генов-мишеней найденных активаторов.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Основным результатом работы является открытие нового белкового суперкомплекса BTFly, объединяющего хроматин-ремоделирующую активность и способность инициировать транскрипцию на промоторах. Найдены сигнальные пути клетки, использующие BTFly.

В ходе работы был разработан метод получения высокочищенных препаратов транскрипционных белковых комплексов, содержащих определенный фактор.

Найден и выделен белковый комплекс BTFly. Он включает коактиваторы транскрипции SAYP, Brahma и TFIID. Впервые продемонстрировано объединение полноразмерных белковых транскрипционных комплексов в один суперкомплекс. Выяснено, что BTFly стабилен в отсутствие хроматиновой матрицы.

Показано, что BTFly формируется на основе коактиватора SAYP. Обнаружен домен SAY, обеспечивающий активирующий потенциал SAYP. Показано, что расположенные рядом с SAY PHD домены белка SAYP не

способны активировать транскрипцию, но стимулируют активность SAY-домена.

Изучена молекулярная структура суперкомплекса, показаны белковые домены в составе его субъединиц, на основе которых осуществляется сборка всего комплекса: SAY домен взаимодействует с белками ВАР 170 и TAF5 (WD-40 доменом последнего).

Показана локализация BTFly на промоторах активных генов. Изучены функциональные свойства BTFly в активации транскрипции: наличие всех компонентов необходимо для активации транскрипции и привлечения РНК-полимеразы.

Продемонстрировано, что SAYP, TFIID и Brahma локализуются совместно во многих сайтах генома и совместно участвуют в развитии организма.

Показано участие SAYP в экдизоновом каскаде. Найдено взаимодействие SAYP с ядерным рецептором DHR3 - компонентом экдизонового каскада. Локализованы фрагменты белков SAYP и DHR3, опосредующие найденное взаимодействие. Показана совместная экспрессия указанных факторов в развитии, совместная локализация во многих сайтах хромосом. Продемонстрировано привлечение SAYP на DHR3 -зависимые гены в организме.

Подобраны условия для активации DHR3-зависимой экспрессии в культуре клеток S2, найдены новые гены-мишени DHR3. Продемонстрировано участие BTFly в активации последних.

Изучено проявление мутации е(у)3"' (в гене, кодирующем SAYP): обнаружено нарушение пролиферации и дифференцировки клеток при развитии крыльев и оогенезе.

Показано участие SAYP в сигнальном пути Jak/Stat. Найдено взаимодействие SAYP и специфического фактора транскрипции STAT, взаимодействие осуществляется через активационный домен STAT и консервативный домен SAY-PHD. Обнаружена совместная локализация STAT и SAYP во многих сайтах хромосом, участие SAYP в активации STAT-зависимых генов и привлечение SAYP на указанные гены в организме.

Подобраны условия активации Jak/STAT пути в культуре клеток, показана положительная роль SAYP в активации генов-мишеней указанного пути. Продемонстрировано привлечение BTFly на промоторы STAT-зависимых генов и его участие в их активации.

Разработанный метод очистки белковых комплексов был применен для изучения фактора транскрипции ENY2. С помощью разработанного метода показано присутствие ENY2 во многих белковых комплексах: SAGA, АМЕХ, ТНО. Связь ENY2 с комплексом ТНО показана впервые. Найдено, что взаимодействие ENY2-THO не зависит от взаимодействий ENY2-SAGA и ENY2-AMEX.

Поскольку SAYP является консервативным фактором у высших эукариот, можно ожидать, что обнаруженный механизм является универсальными.

SAYP играет важную роль в развитии организма, поэтому полученные результаты имеют и важное практическое приложение. SAYP участвует в активации генов эмбрионального развития, генов-мишеней ряда сигнальных путей. Его гомолог у млекопитающих PHF10 необходим для поддержания статуса стволовых клеток мозга, их пролиферации и дальнейшей дифференцировки. Кроме того, изученные факторы DHR3 и STAT также имеют гомологов у млекопитающих, участвующих в дифференцировке различных типов клеток и регуляции их пролиферации. Поэтому полученные результаты могут быть важны для дальнейшего выяснения молекулярных механизмов активации генов в указанных биологических процессах.

Апробация работы. Результаты диссертации были представлены на международных российских и зарубежных конференциях: 7th International Conference on Molecular Biology (Suzdal, Russia, 2004), 6th EMBL International PhD Students Symposium "Animal Models" (Rome, Italy, 2005), Международная Конференция «Генетика в России и мире» (Москва, 2006), IV International Summer School "DNA and Chromosomes" (Cargese, France, 2006), XIX Зимняя Молодежная Научная Школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2007), Семинар российско-германской группы «Взаимодействие белков и нуклеиновых кислот» (Суздаль, 2007), FEBS-EMBO Advanced Lecture Course "Molecular Mechanisms in Signal Transduction and Cancer" (Spetses, Greece, 2007), Meeting on Mechanisms of eukaryotic transcription (Cold Spring Harbor Laboratory, NY, USA, 2007), EMBO Conference Series on Nuclear Structure and Dynamics (Montpellier, France, 2007), FEBS workshop "The biology of modular protein domains" (Tirol, Austria, 2007), Конференция молодых ученых по молекулярной биологии и генетике (Киев, Украина, 2007), EMBO workshop "Mechanisms of Nucleocytoplasmic Transport" (Taormina, Italy, 2007), 2nd Szeged Minisymposium on Histone Modifying

Complexes (Szeged, Hungary, 2008), IV Съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), 8th Young Scientist Forum and 33d FEBS Congress (Athens, Greece, 2008), IV Российский симпозиум «Белки и пептиды» (Казань, 2009), International Meeting on Nuclear Trafficking (Banff, Canada, 2009), FEBS Special Meeting, Jak-Stat Signalling: from basics to disease (Vienna, Austria, 2010), International Symposium "Control of gene expression and cancer" (Moscow, 2010), III Всероссийская научная школа-конференция «Стволовые клетки и регенеративная медицина» (Москва, 2010), XXIII Международная зимняя молодежная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2011), VII International Scientific Conference for Students and PhD Students "Youth and Progress of Biology" (Lviv, Ukraine, 2011), EMBO Conference Series on Nuclear Structure and Dynamics (L'Isle sur la Sorgue, France, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 40 печатных работ, из которых 6 в зарубежных журналах, 11 в российских журналах и 23 в сборниках материалов конференций и симпозиумов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 230 страницах и содержит 39 рисунков. Библиография включает 241 источник.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Введение

Транскрипция генов РНК-полимеразой II - первая стадия экспрессии генов — сложная цепь молекулярных событий, требующая участия большого количества факторов. Общая схема такова. Ген-специфические активаторы транскрипции связываются с регуляторными последовательностями ДНК и привлекают коактиваторы транскрипции. Последние выполняют две функции: подготовку матрицы хроматина и привлечение общих факторов транскрипции и РНК-полимеразы, которые формируют преинициаторный комплекс на промоторе. После инициации транскрипции синтезирующаяся мРНК процессируется, связывается с различными белками и затем экспортируется в цитоплазму.

В работе изучался механизм действия фактора SAYP. Фактор транскрипции SAYP является коактиватором транскрипции РНК-полимеразы II. SAYP первоначально был открыт у дрозофилы, но его гомологи существуют у всех многоклеточных животных (Shidlovskii YV, 2005). Ген е(у)3, кодирующий SAYP у дрозофилы, является незаменимым в развитии, экспрессируется начиная с эмбриональной стадии и важен для активности многих генов. Гипоморфная мутация е(у)3"' приводит к нарушениям развития лап и к стерильности самок. SAYP представляет собой мультидоменный белок массой около 250 кДа, в его составе найден новый консервативный SAY-домен и два цинковых пальца типа PHD. Механизм действия SAYP ранее не был известен.

Другой фактор транскрипции, который был изучен в работе,- ENY2 -также является консервативным коактиватором транскрипции, контролирует множество генов и незаменим в развитии (Georgieva SG, 2001). Белок ENY2 имеет массу 11 кДа. Поскольку ENY2 и SAYP были открыты в одном генетическом скрининге (Georgiev PG, 1989), то было высказано предположение об их взаимодействии на молекулярном уровне.

Ранее была показана связь фактора транскрипции ENY2 с белковыми комплексами SAGA и АМЕХ. Комплекс SAGA является гистонацетилтрансферазой, локализуется на промоторе гена и участвует в активации транскрипции. Комплекс АМЕХ локализуется вблизи комплекса ядерной поры и важен для экспорта синтезированной мРНК из ядра в цитоплазму (.Kurshakova ММ, 2007). Оставался открытым вопрос, связан ли ENY2 с другими факторами, участвующими в транскрипции.

Для изучения механизма действия факторов транскрипции были выделены белковые комплексы, в состав которых они входят. В работе был разработан новый метод очистки транскрипционных белковых комплексов. Традиционно для этой цели используют либо многоступенчатую хроматографическую очистку ядерного экстракта на различных сорбентах, либо иммунопреципитацию на антителах к изучаемому фактору. В нашей работе были соединены оба подхода, что позволило получать высокоочищенные препараты белковых комплексов, содержащих изучаемый фактор.

I. Разработка метода очистки белковых комплексов на примере комплексов, содержащих фактор ENY2

Новый подход к очистке белковых комплексов был опробован для изучения комплексов, содержащих ENY2. При разделении ядерного экстракта из эмбрионов дрозофилы на гель-фильтрации ENY2 элюируется широким профилем. Этот белок в основном найден в трех пиках, соответствующих молекулярным массам 2,0, 1,5 и 0,7 МДа (рис. 1).

Для выяснения состава трех указанных пиков были подобраны условия их разделения и составлена многоступенчатая система очистки (рис. 2А). Комплекс с молекулярной массой 0,7 МДа отделился на первой стадии, тогда как оставшиеся два высокомолекулярных комплекса шли близко друг к другу на всех последующих стадиях фракционирования. После разделения на гель-фильтрационной колонке Superóse 6 из определенных фракций была проведена иммунопреципитация на сефарозе с ковалентно пришитыми антителами к ENY2.

ИО 2.0 0.67 0.44 МДа

ТУ ▼ ▼

15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32

у—Ш

нрт ЩШШШШЯШШШШШШШ^ШШВКВШШ

Рис. 1. Профили элюции ЕЫУ2 и компонентов ТНО-комплекса на гель-фильтрации (разделение ядерного эмбрионального экстракта). ИО - исключенный объем.

ENY2 ТНОС5

Анализ полученных препаратов с помощью MALDI-TOF MS показал, что комплекс с молекулярной массой 1,5 МДа соответствует комплексу SAGA, а комплекс с молекулярной массой 0,7 МДа соответствует комплексу АМЕХ. В ЕЫУ2-содержащем комплексе с молекулярной массой 2,0 МДа содержались все субъединицы ТНО-комплекса (рис. 2Б). Последний является фактором, важным в элонгации транскрипции и созревании РНП-частиц. В полученном препарате не были обнаружены субъединицы комплексов SAGA и АМЕХ.

Для подтверждения взаимодействия ENY2-THO были получены антитела к компонентам ТНО-комплекса ТНОС5 и HPR1. ТНО элюируется на гель-фильтрации широким пиком, начиная с 2,0 МДа, и перекрывается с пиком ENY2 (рис. 1). Таким образом, общий профиль ТНО включает в себя пик ENY2, связанный с ТНО.

Взаимодействие ENY2-THO было проверено в иммунопреципитации из ядерного экстракта (рис. 2В). Антитела против ENY2 осадили компоненты ТНО, но не истощили их. Мы оцениваем, что около 10% ТНО в ядерном экстракте ассоциировано с ENY2.

SAGA, АМЕХ и ТНО, содержащие ENY2, отделились друг от друга при очистке, что говорит о том, что они существуют независимо друг от друга. Мы проверили этот факт с помощью иммунопреципитации, которая подтвердила, что комплексы ТНО, SAGA и АМЕХ не взаимодействуют друг с другом (рис. 2В). Таким образом, ТНО - новый независимый белковый комплекс, в состав которого входит ENY2.

Дальнейшее изучение взаимодействия ENY2-THO, проведенное в нашей лаборатории, продемонстрировало его функциональное значение. Полученные данные говорят о том, что ENY2 важен как минимум для трех последовательных стадий экспрессии гена: инициации транскрипции, элонгации и формирования мРНП-частиц, а также экспорта мРНК из ядра.

Полученные результаты продемонстрировали эффективность нового метода очистки в поиске новых белковых комплексов, содержащих определенный фактор транскрипции.

Эмбриональный ядерный экстракт

MonoS 16/10

ип

* -------

- ; Í : í t

0.5-0.6 М NaCI °-7мДв

■J 0.264) 32 М NaCI Superóse 6 HR

кДа

— 220 — 160

— 120

— 100

16-17 19-21 фракции 2.0 МДе 1.5 МДа

ип

тносб-

ТНОС7-

иф 5 I í пи иф.8пи

экстракт ИП ENY2 .щтШШк

Xmas-2 GCN5

Рис. 2. ENY2 взаимодействует с ТНО-комплексом. А - схема хроматографической очистки EN Y2-co держащих комплексов. Указаны сорбенты, элюция проводилась градиентом соли. Фракции анализировались с помощью вестерн-блотинга, отбирались те, что содержат ENY2. Б - окрашивание Coomasie препарата EN У2-содержащего 2 МДа-комплекса. Ниже - проверка присутствия компонентов SAGA (Gcn5) и АМЕХ (Xmas-2) с помощью вестерн-блот гибридизации. В -иммунопреципитация (ИП) на антителах к различным факторам. ИФ - исходная фракция. ENY2 соосаждает компоненты ТНО (ТНОС5, HPR1), SAGA (GCN5) и АМЕХ (Xmas-2), но указанные комплексы не соосаждаются друг с другом.

II. Выделение и характеристика белкового комплекса BTFly, содержащего SAYP

ПЛ. Очистка SA YP-содержащего комплекса

Анализ ядерного экстракта на гель-фильтрации (хроматографическая колонка Superóse 6) показал, что SAYP, в отличие от ENY2, элюируется одним узким пиком. SAYP найден во фракциях 16-17, которые содержат макромолекулы массой около 2 МДа (рис. 3). Обработка ядерного экстракта эмбрионов ДНКазой I не изменяет профиль элюции SAYP. Таким образом, SAYP входит в состав одного белкового комплекса массой не менее 2 МДа.

Для очистки SAYP-содержащего комплекса из эмбрионального ядерного экстракта была разработана многоступенчатая схема с использованием различных сорбентов (рис. 4А). Особенностью SAYP является высокая чувствительность к протеазам, что потребовало использования соответствующих ингибиторов. На последней стадии очистки использовали сорбент с ковалентно пришитыми антителами к SAYP. В полученном препарате было детектировано около 20 полос (рис. 4Б). Отдельные полосы белка в полученном препарате SAYP-содержащего комплекса анализировали с помощью фингерпринтного анализа с использованием MALDI-TOF масс-спектроскопии.

ИО 2.0 0.67 0.44 МДа

Y Y Y Y

15 16 17 19 21 23 25 27 29

і—і нч LL

а. %

SAYP TAF1

■ ■ ЙМ тт. —, ; -

Цррщнт--

zzzzzz^ —

Р-ЦШЯ9в!!5?5 — —

gggl ц.ц ^

ВАР60

Рис. 3. Гель-фильтрация ядерного экстракта эмбрионов дрозофилы на Superóse 6. Вестерн-блот анализом детектировали субъединицы TFIID комплекса (TAF1, ТВР, TAF9) и Brahma комплекса (его подсемейства РВАР - MOR, РВ, ВАР60). ИО -исключенный объем. Приведена калибровка по молекулярной массе.

А,

O-12-ч эмбрионы Drosophila *

ядерный экстракт MonoS 16/10_▼

^0.3-0.4 М NaCI Heparin Sepharose

^0.6-0.7 M NaCI

0.32-0.34 M NaCI

псм SAYP+ B^\TAF1 = |

MOR7TAF2-BAP111 Тдр4= I

TAF5-

TAF6-BAP60+TAF7-BAP55-

Actin Ж SNR1 T._n TAF9-

WM~160 ИВ) -120

-.. . "100 mm:m - so

::: Щ - во

щр - 70 60

^0.28-0.30 M NaCI Superose 6 HR Q.15 M NaCI

TAF3 TBP TAF10 TAF13

- 50

- 40

PAGE WB

^фракции 16-18 a-SAYP column

M NaCI

PAGE, MALDI-TOF

Рис. 4. Очистка SAYP-содержащего комплекса. A - Схема очистки. Указаны сорбенты, элюция проводилась градиентом соли. Фракции анализировались с помощью вестерн-блотинга, отбирались те, что содержат SAYP. Отмывку колонки с пришитыми a-SAYP антителами производили буфером, содержащим IM NaCI. Б -Анализ SAYP-содержащего комплекса на 9% ДСН-ПААГ, окраска Coomasie. SAYP и TAF1 были совместно детектированы в двух соседних полосках. Ниже приведен вестерн-блот анализ, демонстрирующий наличие четырех компонентов TFIID. Субъединцы Brahma помечены синим цветом, TFIID - красным.

Было установлено, что вместе с SAYP были выделены субъединицы хроматин-ремоделирующего комплекса Brahma (подсемейства РВАР): BRM, MOR, РВ, ВАР 170, ВАР111, ВАР60, ВАР55, актин и Snrl. Также были обнаружены все субъединицы общего фактора транскрипции TFIID (TBP и ТВР-связанные белки TAFs).

Обнаруженный белковый суперкомплекс, включающий уже известные комплексы, был назван BTFly (Brahma and TFIID in one assembly). Важно, что были детектированы полный набор субъединиц Brahma и практически полный - TFIID. В то же время каких-либо компонентов других комплексов, имеющих отношение к транскрипции, в соотносимых количествах обнаружено не было. Из экспериментов гель-фильтрации следует, что молекулярная масса выделенного комплекса составляет не менее 2 МДа, что соответствует сумме молекулярных масс его компонентов (1 МДа - Brahma, 1.3 МДа - TFIID и 0.2 МДа - SAYP).

O-12-ч эмбрионы дрозофилы ядерный экстракт

Monas 16/10

In Rowtiirouoh 1 2 3 4 5 ( 1 7 6

1*, v. МЩЯЯ.МШМй

т ■

jf мМ NaCt

SAYP

РВ

TAF1

^0.4 М Nad

иМ NaCI

Heparin Sepharose

0.7 М NaCI

MonoS 5/50 & ^ ^

& мМ NaCI

In Fl 1 2 3 4 5

"^0.32-0.34 М NaCI MonoQ 5/50 J> $ £ £

7 9 11 13 15 17

SAYP

г РВ

* » ; TAF1

<S> мМ NaCI

З 5 8 7

^ 0.28-0.30 M NaCI

Mpllijf SAYP ' PB

irr ■ - TAF1

Superose 6 HR

15 17 19 21 23 25 27 . ■«»•». ... SAYP — & Ы » fc ма PB fcg >-> W *я га -я TAF1

^ 16-18 фракции a-SAYP колонка

M NaCI

ПААГ , MALDI-TOF

Рис. 5. Подробная схема очистки комплекса, содержащего SAYP. Фракции анализировали на наличие SAYP, субъединицы TFIID - TAF1 и субъединицы Brahma - РВ. Flowthrough, Ft - фракции, не связавшаяся с сорбентом. Последняя стадия -иммунноаффинный сорбент с иммобилизованными антителами к SAYP.

Подробная схема очистки приведена на рис. 5. Можно видеть, что при очистке BTFly только часть комплексов TFIID и Brahma соочищается совместно с SAYP. Действительно, при разделении исходного ядерного экстракта с помощью гель-фильтрации профиль элюции SAYP значительно уже профиля элюции TFIID и Brahma комплексов: перекрывание происходит только в 16-17 фракциях (рис. 3).

Мы оцениваем, что около 20% TFIID комплекса и несколько процентов Brahma комплекса, содержащихся в ядерном экстракте эмбрионов дрозофилы, находится в связанном с SAYP состоянии, образуя единый суперкомплекс.

Отметим, что после многоступенчатой очистки SAYP имеет такой же профиль элюции, что и в исходном экстракте, что указывает на высокую стабильность выделенного комплекса. Существование BTFly в экстракте, обработанном ДНКазой, говорит о том, что суперкомплекс - не временная ассоциация белков на хроматине, а стабильно существующий белковый комплекс.

Как было показано выше, фактор ENY2 также присутствует во фракциях 16-17. ENY2 связан с ТНО, однако в препарате белков, связанных с ENY2, также обнаружены отдельные субъединцы Brahma комплекса. Т.к. ENY2 и SAYP найдены в одном генетическом скрининге, было проверено их взаимодействие на молекулярном уровне. Иммунопреципитация показала, что изучаемые белки не связаны друг с другом (рис. 6) и входят в состав различных белковых комплексов.

II.2. Коиммунопреципитация компонентов BTFly

Для подтверждения того, что коактиватор SAYP, факторы TFIID и Brahma взаимодействуют друг с другом в составе одного комплекса, были проведены эксперименты по коиммунопреципитации из фракций 16-17, содержащих SAYP. Антитела к РВ и MOR, компонентам Brahma комплекса, соосаждали SAYP, TAF4 и TAF5, а антитела к TAF1 и TAF8, компонентам TFIID, в свою

ИП

ИФ о

t>»$$ < йй ш ят

ЯЦн

' W

Рис. 6. Иммунопреципитация из фракций 16-18 (гель-фильтрации) на антителах к ЗАУР и

ИФ - исходная фракция, ИП — осадок после иммунопреципитации.

очередь, соосаждали SAYP, РВ и MOR (рис. 7А). В то же время комплексы Brahma и TFIID не соосаждались друг с другом из фракций, не содержащих SAYP (20-21 фракции, рис. 5) (рис. 7Б). Это доказывает, что комплексы TFIID и Brahma не агрегируют неспецифично.

Ключевая роль SAYP в организации Brahma и TFIID в один комплекс была подтверждена с помощью иммуноистощения SAYP антителами из фракций 1617 после гель-фильтрации. Последующая коиммунопреципитация РВ и MOR антителами к TAF1 и TAF4 подтвердила, что истощение SAYP значительно ослабляет взаимодействие Brahma и TFIID (рис. 8).

_ИП_

ИФ SAYP РВ MOR TAF1 TAF8 IgG

1 2 3 4 5 6 7

Рис. 7. А - иммунопреципитация из фракций 16-18 (гель-фильтрации) на антителах к SAYP, РВ, MOR, TAF1, TAF8 и преимунной сыворотке (IgG). Одинаковые количества исходной фракции (ИФ) и осадка (ИП) анализировали на присутствие белков SAYP, TAF4, TAF5, РВ, MOR. Б - иммунопреципитация из фракций 20-22 на антителах к РВ и MOR. Исходную фракцию и преципитаты анализировали на присутствие РВ, TAF5 и TAF10.

ИП

ИФ н и TAF1 H И TAF9 H И

SAYP

TAF1 few Tt< ИИИИИИИИв ГГ" щ-

TAF4 •f A. ... Ш --ч рм^ *****

РВ i----

MOR Щттт * — • - —

Рис. 8. Соосаждение комплексов TFIID и Brahma зависит от наличия SAYP. Из фракций 16-17 с гель-фильтрации (ИФ) после истощения преимунной сывороткой (Н) или специфическими антителами к SAYP (И) была проведена иммунопреципитация на антителах к TAF1 и TAF9. Осадок (ИП) анализировали антителами к SAYP, TAF1, TAF4, РВ, MOR.

II.3. Определение домена белка SAYP, отвечающего за его способность активировать транскрипцию

Для изучения молекулярной структуры BTFly домены в составе SAYP были проанализированы на способность активировать транскрипцию. Была собрана плазмидная конструкция pTrAssay, которая содержала репортерный ген lacZ под контролем минимального промотора гена hsp70 и 10-ти сайтов связывания для GAL4 ДНК-связывающего домена (UAS сайты). Кроме того, в состав конструкции входила последовательность, кодирующая ДНК-связывающий домен GAL4, маркированный тройным FLAG-эпитопом под контролем конститутивного промотора актина (рис. 9А). Фрагменты ДНК, кодирующие различные домены SAYP, были встроены в эту конструкцию в рамке с GAL4 ДНК-связывающим доменом. В клетках синтезировался слитный ДНК-связывающий белок, который привлекался на UAS-сайты, в результате изучаемый домен оказывался в непосредственной близости от укороченного промотора hsp70. Если домен обладал необходимыми свойствами, то он активировал транскрипцию репортерного гена. В опытах рассчитывали удельную активность различных доменов.

Аминокислотная последовательность SAYP была разделена на несколько фрагментов для дальнейшего изучения (рис. 9Б). Были выделены М-домен, содержащий так называемый AT-hook; N-концевой домен; а также два расположенных рядом PHD домена. Ранее в составе SAYP был обнаружен новый эволюционно-консервативный домен SAY и показана его способность самостоятельно активировать транскрипцию в дрожжевой двухгибридной системе.

Из всех исследованных доменов SAYP только домен SAY обладал способностью активировать транскрипцию репортерного гена в S2 клетках (рис. 9В). В то же время слитный домен, содержащий оба консервативных домена SAY и PHD, имел в 3 раза большую удельную активность, чем SAY домен. Таким образом, PHD домены, по-видимому, важны для увеличения эффективности активации транскрипции доменом SAY.

промотор гена актина

10х UAS промотор hsp70

хні—lSAyp

800

SAY PHD

^НШІ-1

N M SAY PHD SAY-PHD Gal4 (K+) Gal4 DBD

(K-)

Рис. 9. Определение транскрипционной активности доменов SAYP. А - Схема конструкции pTrAssay. Под контролем конститутивного промотора гена актина изучаемый домен экспрессировался слитно с ДНК-связывающим доменом GAL4. Слитный белок привлекался за счет ДНК-связывающего домена к UAS сайтам, и исследуемый домен активировал транскрипцию репортерного гена. Б - Схема строения белка SAYP, указаны домены в его составе. В - Относительная удельная активность отдельных доменов белка SAYP. За 100% принята активность SAY домена. N, М, SAY, PHD, SAY-PHD - домены SAYP; Gal4 - активатор транскрипции Gal4, содержащий ДНК-связывающий и активационный домены (положительный контроль); Gal4-DBD - ДНК-связывающий домен GAL4 (отрицательный контроль).

IL4. Поиск коактиваторов, обеспечивающих активацию репортерного гена доменом SAY

Для поиска коактиваторов транскрипции, при помощи которых домен SAY осуществляет свою активаторную функцию в S2 клетках, было изучено, как снижение уровня различных коактиваторов транскрипции влияет на активацию репортерного гена доменом SAY (рис. 10А). Была получена линия S2 клеток, несущая встроенную в геном конструкцию pTrAssay, экспрессирующую SAY домен. В этой линии проводился нокдаун различных компонентов комплексов-коактиваторов транскрипции, и измерялась экспрессия репортерного гена. Значительное снижение активации было обнаружено при нокдауне компонентов общего фактора транскрипции TFIID и хроматин-ремоделирующего комплекса Brahma. В то же время снижение уровня GCN5-гистонацетилтрансферазы и ISWI-ремоделирующей АТФазы, которые также являются компонентами комплексов-коактиваторов транскрипции (семейств комплексов SAGA и ISWI соответственно), не оказало влияния на способность SA Y-домена активировать транскрипцию.

Взаимодействие домена SAY и коактиваторов TFIID и Brahma было подтверждено с помощью иммунопреципитации (рис. 10Б). Домен SAY способен соосаждать компоненты коактиваторов TFIID и Brahma и не способен соосаждать коактиваторы GCN5 и ISWI. Такими же свойствами обладал и фрагмент SAY-PHD домены, в то же время PHD домены сами по себе оказались не способными соосаждать ни один из изучаемых белков.

Взаимодействие SAY домена с комплексами TFIID и Brahma было также подтверждено экспериментами по иммуноокрашиванию клеток, стабильно трансфицированных плазмидой pTrAssay, экспрессирующей SAY домен. Известно, что трансгены в стабильных линиях S2 клеток встраиваются в геном, образуя локусы с большим количеством повторов (обычно порядка нескольких тысяч). Т.к. конструкция pTrAssay содержит также и сайты для связывания белка GAL4-SAY, локус встраивания трансгена будет нести сайты его связывания. Иммуноокрашивание клеток показало формирования скопления гиперэкспрессированного домена внутри ядра в одной точке (рис. 11). Совместная гибридизация in situ с последовательностью UAS подтвердила локализацию скопления SAY домена именно в локусе встраивания трансгена. Иммуноокрашивание клеток стабильной линии антителами к компонентам коактиваторов TFIID и Brahma показало активное привлечение последних к активированному репортерному гену.

Таким образом, было подтверждено взаимодействие SAY домена с различными компонентами общего фактора транскрипции TFIID и хроматин-ремоделирующего комплекса Brahma в результате колокализации белков на репортерном гене, активированном SAY доменом, внутри ядра клетки.

Итак, способность изучаемого нами домена SAY активировать транскрипцию репортерного гена зависит от уровня компонентов общего фактора транскрипции TFIID и хроматин-ремоделирующего коактиватора Brahma.

T.U1 ТЛИ РВАР ВЛР170 CCN5 ISWI

SAY PHD SAY-PHD Gal4BD

И® ил ИФ ип ИФ ип ИФ ИП

РВ ¡1:: ; - н

MOR Ж" 8 Í*M 1 ÍES ■

TAF1 ■В Г« " Г

TAF4 Ш- ЯШ

ТВР ш ■1 *

TAF9 Г" » ШШ 1

TAF10 -

GCN5 «¿и* I - ШЛ

ISWI н Я 1 ш

a a-flag • и mu я» mm

Рис. 10. Влияние компонентов различных коактиваторов транскрипции на активность SAY-домена. А - Уровень активации репортерного гена доменом SAY на фоне снижения уровня различных компонентов комплексов-коактиваторов транскрипции. TAF1, TAF4 - компоненты общего фактора транскрипции TFIID; РВАР, В АР 170 - компоненты хроматин-ремоделирующего комплекса Brahma; GCN5

- гистоацетилтрансфераза; ISWI - ремоделирующая АТФаза; pSK - контрольная РНК-интерференция. За 100% принято значение активации репортерного гена доменом SAY в норме. Б - Соосаждение белков-компонентов транскрипционных комплексов из клеточного лизата доменами SAYP. Все изученные домены были маркированы тройным FLAG-эпитопом, ммунопреципитацию проводили на анти-FLAG антителах. TAF1, TAF4, TAF9, TAF10, ТВР - компоненты общего фактора транскрипции TFIID; РВ, MOR - компоненты хроматин-ремоделирующего комплекса Brahma; GCN5 - гистоацетилтрансфераза; ISWI - ремоделирующая АТФаза, a-FLAG

- антитела к FLAG эпитопу.

SAY GAL4 BD наложение

А В

SAY ТВР наложение

SAY наложение

ТВР РВ наложение _

Г в щ

TAF1 РВ наложение

SAY GCN5 наложение _

Рис. 11. Совместная локализация компонентов комплексов - коактиваторов транскрипции на репортерном гене в клетках линии, стабильно экспрессирующей SAY домен в составе конструкции pTrAssay. А -совместное иммуноокрашивание антителами к FLAG (SAY домену) и гибридизация in situ последовательности UAS

(GAL4 BD). Б-Е иммуноокрашивание с

использованием антител к FLAG (маркер SAY), компонентам общего фактора транскрипции TFIID (ТВР и TAF1) и хроматин-ремоделирующего комплекса Brahma (РВ), а также антителами к

ацетилтрансферазе GCN5

(отрицательный контроль).

/7.5. Определение белков-партнеров SA YP в составе BTFly

Был произведен поиск непосредственных партнеров SAYP (его домена SAY) в составе BTFly комплекса. SAYP взаимодействует именно с РВАР-подсемейством Brahma, поэтому в качестве предполагаемых партнеров SAYP выступали два белка, характерных для этого подсемейства: ВАР 170 и РВ. Для определения партнера мы провели нокдаун РВ или ВАРІ70 и изучили ассоциацию SAY с другими компонентами комплекса Brahma (рис. 12А). Было обнаружено, что снижение уровня именно компонента ВАР 170, но не РВ, значительно нарушает взаимодействие SAY домена с основными субъединицами комплекса Brahma. Для подтверждения взаимодействия SAY-BAP 170 домен SAY (с эпитопом FLAG) и белок ВАР 170 (с эпитопом НА) были совместно экспрессированы в S2 клетках (рис. 12Б). Иммунопреципитация

показала, что белки соосаждаются друг с другом. Таким образом, SAY домен белка SAYP взаимодействует с ВАР 170 компонентом комплекса Brahma.

ИФ ИП FLAG-SAY

РНК-И

РВ

ВАР170 pSK

+ + + + + +

- т»т»

шшшл t-'il

•>-■* f* fr* k Л:: ,1Я1тт Äiip

a-FLAG

НА-ВАР170 FLAG-SAY

РВ BRM

ИФ СН ИП

llei?

— «1

— —

= sr

Рис. 12. Определение непосредственного партнера SAY в составе комплекса Brahma. А - Соосаждение SAY доменом основных компонентов Brahma комплекса при нокдауне его субъединиц РВ и ВАР 170. Б - Соосаждение доменом SAY белка ВАР 170 при совместной экспрессии в S2 клетках дрозофилы. ИФ - исходная фракция; ИП - иммунопреципитация; СН - супернатант.

При поиске партнеров SAY в составе общего фактора транскрипции TFIID основным кандидатом являлся белок TAF5, так как он был представлен в очищенном комплексе белка SAYP в наибольшем количестве. Были проведены нокдауны TAF4 и TAF5 в линии клеток, стабильно экспрессирующих SAY домен. Иммунопреципитация показала, что при пониженном уровне белка TAF5 домен SAY теряет способность соосаждать TAF4, который является одной из основных структурных субъединиц комплекса TFIID (рис. 13А). Для проверки взаимодействия TAF5-SAY оба партнера были экспрессированы в клетке. Иммунопреципитация показала их взаимодействие. В состав TAF5 входит домен WD-40, предположительно ответственный за белок-белковые взаимодействия. Мы проверили взаимодействие SAY с указанным доменом и показали, что именно он ассоциирован с SAY (рис. 13Б). Таким образом, непосредственным белковым партнером SAY домена в составе комплекса TFIID является TAF5, а именно - его WD-40 домен.

РНК-и

TAF4 TAF5 GCN5 pSK

а-НА a-FLAG

ИФ ИП FLAG-SAY ИФСН ИП ИФСН ИП

+ + + + FLAG-SAY t* -т Ä «Ц mm

+ + + + HA-TAF5 «—— Щ

а-НА

ИФСН ИП FLAG-SAY Wr — ** HA-WD-40

g-FLAB ИФСН ИП

■ЯНН

ну

Рис. 13. Определение непосредственного партнера SAYP в составе TFIID. А -Соосаждение SAY доменом основных компонентов TFIID комплекса при нокдауне субъединиц TAF4 и TAF5. Б - Соосаждение доменом SAY белка TAF5 и его WD-40 домена при их совместной экспрессии в S2 клетках. ИФ - исходная фракция; ИП - иммунопреципитация; СН - супернатант.

Для подтверждения их взаимодействия три найденных белка (SAY домен, ВАР 170 белок и WD-40 домен TAF5) были совместно экспрессированы в культуре клеток. Иммунопреципитация показала, что все три белка способны формировать единый комплекс (рис. 14).

ИП ИП ИП ИФ a-TAF5 g-BAP170 IgG

SAY + - + - + - +

Рис. 14. TAF5 и ВАР170 взаимодействуют друг с другом через SAY домен. НА-TAF5 и НА-ВАР170 были совместно экспрессированы в клетках S2 или в клетках, стабильно экспрессирующих FLAG-SAY. Иммунопреципитация была проведена на специфических антителах к TAF5 и ВАР 170, а также на преимунной сыворотке (IgG).

II.6. Привлечение BTFly на промоторы генов

С помощью хроматин-иммунопреципитации было изучено привлечение компонентов комплекса на промоторы SAYP-зависимых генов. Были выбраны три SAYP-зависимых гена {CGI 1395, CGI 1400 и globin 1), экспрессия которых

понижается в 7-10 раз после нокдауна SAYP с помощью РНК-интерференции в S2 клетках.

Хроматин-иммунопреципитация с помощью антител к SAYP, субъединицам TFIED (TAF1 и ТВР) и субъединицам Brahma (ВАР 170, РВ и MOR) выявила, что все указанные компоненты стабильно связываются с промоторной областью гена (ПР) и в значительно меньшей степени - с кодирующей областью (КО) (рис. 15).

пр

CG 11395

300 по

* 14,0 р-

SAYP ВАР170

Рис. 15. Распределение субъединиц BTFly на гене CGI 1395. Приведена схема гена. ПО промоторная область, КО кодирующая область. Приведен уровень SAYP, субъединиц TFIID (ТВР и TAF1) и субъединиц Brahma (ВАР 170, РВ, MOR) на промоторе (синие столбики) и кодирующей области (серые столбики) Результаты ChIP приведены в виде обогащения относительно рДНК.

Было изучено влияние нокдауна каждого из компонентов BTFly на привлечение других компонентов на указанных выше промоторах. Нокдаун SAYP приводит к значительному падению уровня компонентов TFIID (TAF1 и ТВР) и Brahma (ВАР 170, РВ и MOR) на промоторах всех трех генов (рис. 16). В то же время нокдаун SAYP не влияет на общий уровень ТВР и TAFs в клетке, но приводит к падению общего уровня субъединиц РВ и ВАР 170 (рис. 17). Таким образом, свободный TFIID не может связываться с промоторами SAYP-зависимых генов в отсутствие SAYP.

В качестве отрицательного контроля изучали связывание компонентов BTFly с промотором гена hsp70, который не является SAYP-зависимым геном. Нокдаун SAYP практически не влиял на количество TFIID и Brahma на промоторе hsp70.

При нокдауне субъединицы ВАР 170 комплекса Brahma происходит значительное падение уровня SAYP и субъединиц комплекса TFIID на промоторах SAYP-зависимых генов (рис. 16). В то же время общий уровень субъединиц комплексов Brahma и TFIID в S2 клетках уменьшался, но общий

уровень SAYP оставался прежним (рис. 17). Из этого можно сделать вывод, что свободный SAYP не привлекается на промоторы в отсутствие комплексов Brahma и TFIID.

Нокдаун TAF4 также оказывал сильный отрицательный эффект на связывание Brahma и SAYP с промоторами (рис. 16). Нокдаун TAF4 приводит к разрушению комплекса TFIID, но не влияет на общий уровень SAYP и Brahma (рис. 17). При этом SAYP остается связанным с Brahma (рис. 17), однако этот комплекс (Brahma-SAYP) не способен стабильно связываться с промоторами SAYP-зависимых генов. Этот результат наиболее важен, так как согласно модели последовательного привлечения транскрипционных факторов на промотор, ремоделирующий комплекс связывается с промотором первым независимо от других.

Нокдаун SAYP, ВАР 170 или TAF4 также значительно понижали уровень РНК-полимеразы II на промоторах изучаемых SAYP-зависимых генов (рис. 16), подтверждая, что присутствие SAYP, TFIID и Brahma на промоторах является необходимым условием для привлечения Pol II и активации транскрипции.

промотор гена CG11395

TAF1 ТВР SAYP ВАР 170 РВ MOR

Pol II

Рис. 16. SAYP, Brahma и TFIID совместно привлекаются на промоторы. Уровень SAYP, компонентов TFIID и Brahma комплексов, а также РоШ на промоторе гена CG11395 был изучен на нормальных S2 клетках (синие столбики), после нокдауна SAYP (зеленые столбики), ВАР 170 (красные столбики) или TAF4 (желтые столбики).

Рис 17. Нокдаун SAYP. А - общий уровень SAYP и субъединиц комплексов Brahma (РВ, ВАР 170, MOR) и TFIID (TAF1, TAF4, ТВР) в нормальных S2 клетках (82кл-норм) и после нокдауна (РНКи) SAYP, ВАР 170, TAF4; выравнивание проводили по тубулину. Б -в отсутствии TFIID SAYP соосаждается комплексом Brahma.

Иммунопреципитация на антителах к SAYP выполнена из экстракта S2 клеток после нокдауна TAF4. ИФ - исходная фракция, ИП - иммунопреципитация.

II. 7. SA YP, Brahma и TFIID совместно локализуются во многих локусах Ранее было показано, что SAYP локализуется во многих сайтах совместно с Pol II и Brahma на политенных хромосомах из слюнных желез личинок дрозофилы. Для проверки совместной локализации SAYP и TFIID было проведено иммуноокрашивание хромосом антителами к SAYP и TAF1 (рис. 18). Наложение показало, что сайты локализации TAF1 и SAYP совпадают. Таким образом SAYP, TFIID и Brahma совместно локализуются на хромосомах во многих сайтах активной транскрипции.

TAF1 SAYP

наложение

Рис 18. Иммуноокрашивание политенных хромосом дрозофилы антителами против ТАР1 и 8АУР. Приведены два фрагмента хромосом. Показано наложение сайтов локализации ТАР1 и в АУР.

РНКи

А BAP17I SAYP 2 |l < (Nr p wt

SAYP ■■

РВ ■■

ВАР 170 II

MOR fftt

иф ип

TAF4

II.8. SAYP, Brahma и TFIID взаимодействуют в развитии

Гипоморфная мутация е(у)3"' в гене, кодирующем SAYP, приводит к снижению выживаемости на 20% у самцов, гемизиготных по этой мутации, а у 10% таких самцов наблюдается нарушение в формировании бедра (образование перетяжки). Мы изучили генетическое взаимодействие мутации е(у)Зи1 с мутациями в генах, кодирующих TFIID и Brahma. Последние не имели фенотипического проявления в гетерозиготе. Однако эти же мутации в гетерозиготе в присутствии мутации е(у)3"' в гемизиготном состоянии значительно усиливали проявление последней: снижалась как выживаемость, так и доля мух с нарушением развития (рис. 19). Было проверено действие мутаций в генах tafl, taf4, tafô, taf9, brm, mor, osa. Комбинация мутаций e(y)3ul ta/91 детальна. Таким образом, даже в гетерозиготе мутации компонентов TFIID и Brahma усиливают проявление слабой мутации е(у)Зи1. Мутации в гене, кодирующем субъединицу OSA (маркер ВАР-подсемейства Brahma), не взаимодействовали с мутацией е(у)Зи1.

100%-90 -80 -70 -

60 -I

50 -40 30 -20 -10 -0 -

Рис. 19. Генетическое взаимодействие мутации е(у)Зи1 и мутаций в генах, кодирующих субъединицы TFIID и Brahma. Приведена доля самцов, гемизиготных по е(у)Зи1, несущих перетяжку на бедре (светлые столбики) и их выживаемость (темные столбики), в присутствии различных мутаций.

e(y)3[u1]

e(y)3[u1]; taf1[1]

С£Щ!И BPf

яи

Щ0ШШМ шш я шш

1 1 1V V ж

ils ш

1 щ - \

■ : Ужё ш

e(y)3[u1 ]; e(y)3[u1); taf4[1] I taf6[1]

e(y)3[u1) taf9[1]

e(y)3[u1] brm[2]

e<y)3[u1]; morfl]

e(y)3(u1]; osa[3081

II.9. Структура BTFly и его функциональные особенности

На основании полученных данных можно предложить следующую модель организации BTFly. Коактиватор SAYP служит фактором, объединяющим комплексы Brahma и TFIID в единое целое. Консервативный домен SAY

непосредственно взаимодействует с субъединицами В АР 170 и TAF5 указанных комплексов.

BTFly привлекается на промоторы определенных генов и активирует их транскрипцию путем привлечения РНК-полимеразы II. Суперкомплекс представляет собой функционально неделимую единицу: составляющие части BTFly не способны по-отдельности связываться с промотором и активировать транскрипцию (рис. 20).

Рис 20. ВТР1у. Показана структура суперкомплекса и его участие в активации транскрипции. ВТР1у связывается с промотором (рг), способен локально ремоделировать матрицу хроматина (смещать нуклеосому с промотора) и привлекать общие факторы транскрипции и РНК-полимеразу II на открытый промотор гена.

Следующая задача - поиск ген-специфических активаторов и контролируемых ими генов, которые используют найденный коактиваторный комплекс ВТР1у в активации транскрипции. В дальнейшей работе нами были найдены такие активаторы.

III. Участие коактиватора SAYP и комплекса BTFIy в активации генов экдизонового пути

111.1. SAYP взаимодействует с ядерным рецептором DHR3

Для поиска возможных белковых партнеров SAYP был проведен двухгибридный скрининг с использованием библиотеки кДНК эмбрионов Drosophila. Белок SAYP был разделен на несколько фрагментов, каждый из которых был использован в качестве индивидуальной пробы для скрининга. Одним из найденных партнеров для AT Ьоок-домена SAYP (аминокислоты 644-889) был С-концевой участок ядерного рецептора DHR3 (аминокислоты 111-487), содержащий лиганд-связывающий домен (LBD) (рис. 21 А), который обычно отвечает за взаимодействие ядерных рецепторов с транскрипционными корегуляторами. Более того, было обнаружено, что АТ-участок SAYP содержит последовательность LnkHL, совпадающую с консенсусом LXXLL, или NR-боксом, который часто отвечает за обеспечение взаимодействия кофактора и ядерного рецептора. Найденный рецептор DHR3 является компонентом экдизонового каскада дрозофилы, его экспрессия непосредственно стимулируется экдизоном.

Взаимодействие SAYP и DHR3 проверено биохимически. Были получены антитела к DHR3. DHR3 экспрессируется в основном в начале метаморфоза, но также и на эмбриональной стадии. Гель-фильтрация ядерного эмбрионального экстракта показала, что профили элюции SAYP и DHR3 частично перекрываются. DHR3, помимо поздних фракций, был найден и во фракциях 16-17, содержащих SAYP (рис. 21 Б). Похожее распределение было получено при фракционировании экстракта из предкуколок. Опыты по иммунопреципитации показали, что антитела против DHR3 копреципитируют SAYP из экстрактов эмбрионов и предкуколок (рис. 21В). Таким образом, DHR3 ассоциирован с BTFIy на стадиях эмбриона и куколки.

111.2. SAYP и DHR3 имеют сходный профиль экспрессии, совместно локализуются в геноме, и взаимодействуют в развитии

Профили экспрессии генов, кодирующих DHR3 и SAYP (DHR3 и е(у)3), были проанализированы с помощью нозерн-блот гибридизации (Рис. 22А). Оба гена имеют слабый уровень экспрессии на стадии эмбриона и высокий - на стадии средней куколки. Корреляция в уровнях экспрессии обоих белков указывает на их возможное взаимодействие.

LnkHL

644 889 2008

SAYP v

DHR3

Б Г эмбрион V V

0.7

0.4

MDa

[Л 14 16 16 17 18 19 20 21 22 23 24 26 2627 26 29 30 31 32 3334 35 3637

SAYP • pp DHR31

ИП

SAYP

DHR3 fr, -

Su(Hw) аш ,.

ИФ a-DHR3 IgG

эмбрион

куколка

Рис. 21. Взаимодействие SAYP-DHR3. А - схематическое строение белков SAYP и DHR3. Прямоугольниками обозначены фрагменты SAYP и DHR3, которые взаимодействуют друг с другом. Б - анализ фракций с гель-фильтрации ядерных экстрактов эмбрионов и куколок. DHR3 обнаружен не только в свободном состоянии (фракции 33-34), но и ещё в высокомолекулярном SAYP-содержащем комплексе (фракции 16-17). В - иммунопреципитация на антителах к DHR3 из ядерных экстрактов эмбрионов и куколок. ИФ - исходная фракция. IgG - преимунная сыворотка, Su(Hw) был взят как отрицательный контроль.

На стадии предкуколки в политенных хромосомах было обнаружено несколько сотен сайтов связывания DHR3 (рис. 22Б). Ранее было показано, что SAYP имеет многочисленные сайты связывания на политенных хромосомах и локализуется совместно с Pol II в транскрипционно активном эухроматине. Сравнение распределения сайтов локализации этих белков на политенных хромосомах показало их значительное перекрывание, что указывает на их совместное участие в регуляции одного набора генов.

Чтобы подтвердить данное предположение, мы проверили их наличие на промоторах некоторых SAYP-зависимых генов на стадии куколки с помощью хроматин-иммунопреципитации (Рис. 22В). Обнаружено значительное количество DHR3 на промоторах SAYP-зависимых генов yellow, CGI 1395 и

Сур12а5. Это говорит о том, что ПНЯЗ участвует в регуляции транскрипции этих генов.

Е L1 L2L3eL3IPePm PI М F

DHR3 і

е(у)3 —

yellow tubulin

ChIP в куколках

3.5 Н 3

2.5 Н 2 1.5 1

0.5 0

OCG11395 о Сур12а5 ■ yellow I intergenic

г}™|

It L

DHR3 merge • *

SAYP » DAPI Kf

DHR3

SAYP

Poll!

выживаемость

e(y)3[u1]/Y;+/ + е(у)3[и1] / Y; DHR3[KG00850] / + е(у)3[и1] / Y; DHR3[EY05451] / +

80% 24% 8%

цвет щетинок

y[2] + /Y; DHR3[BG00585]/ + y[2]e(y)3[u1]/Y;+/ + y[2] e(y)3[u1] / Y; DHR3[BG00585] / +

+5 +4 0

Рис. 22. Совместная роль SAYP и DHR3. A - Нозерн-блот анализ РНК с последовательных стадий развития дрозофилы. Б - иммунноокрашивание политенных хромосом на стадии предкуколки антителами против SAYP (зеленый цвет) и DHR3 (красный). Показано их наложение друг на друга и окраска DAPI. В -уровень DHR3, SAYP и PolII на промоторах указанных генов и в межгенной области на стадии куколки. Г - выживаемость мух и цвет щетинок (уровень экспрессии yellow) у мутантов по е(у)3"' и DHR3.

Функциональное взаимодействие DHR3 и SAYP показано в генетических экспериментах. Самцы, гемизиготные по мутации е(у)3"' имеют сниженную выживаемость (80%). У мух, несущих комбинацию мутации е(у)Зи' с одной из мутаций DHR3kg00850 или DHR3EY0545' в гетерозиготе, уровень выживаемости падает до 24% и 8% соответственно (Рис. 22Г). Мутация е(у)3"' была обнаружена вследствие ее влияния на экспрессию гена yellow. Как было показано ранее, частичное снижение экспрессии гена е(у)3 при мутации е(у)3"' приводит к снижению пигментации в щетинках с уровня +5 до уровня +4. Мутации DHR3CB'5644'3 и DHR3BG00585 не влияют на пигментацию щетинок, однако самцы, гемизиготные по мутации е(у)3"' и гетерозиготные по какой-либо из указанных мутаций гена DHR3, имеют пигментацию щетинок 0 (Рис. 18). Таким образом, одновременное снижение уровня SAYP и DHR3 приводит к сильному изменению экспрессии гена yellow. Исходя из того, что оба эти фактора на стадии куколки были обнаружены на промоторе гена yellow, можно судить об их взаимодействии во время активации этого гена. Эти данные свидетельствуют о связи SAYP и DHR3 в регуляции процесса транскрипции.

IIL3. DHR3 активирует гены посредством взаимодействия с BTFly

Для дальнейшего изучения роли SAYP в регуляции транскрипции DHR3-зависимых генов, были проведены эксперименты по активации гена DHR3 путем добавления экдизона к культуре клеток Schneider Drosophila (S2).

Обработка экдизоном приводит к накоплению DHR3 в культуре клеток (рис. 23). Хроматин-иммунопреципитация показала, что DHR3 привлекается на промоторы нескольких SAYP-зависимых генов. Это указывает на прямое участие DHR3 в регуляции их экспрессии. Для подтверждения этого мы детально изучили два SAYP-зависимых гена: CGI 1395 и Сур12а5. После обработки экдизоном транскрипция обоих генов увеличивается. При нокдауне SAYP и активации экдизоном активация генов уже не достигала нормального уровня (рис. 24А). Хроматин-иммунопреципитация показала, что после активации SAYP привлекается на промоторы указанных генов (рис. 24Б). Эти данные указывают на роль DHR3 и SAYP в активации изучаемых генов. Нокдаун SAYP приводит к снижению его уровня на промоторах, однако остаточный уровень SAYP может обеспечивать активацию генов.

А зо»

DHR3

250 200 150

DHR3 на промоторах

ЭКДИЭОН

DHR3

100

СС11400 д/оЬіпІ Cyp12eS CGM395 Intergenic

тубулин шшлт

Рис. 23. Активация DHR3 в культуре клеток S2. А - накопление DHR3 в клетках после их обработки экдизоном (показан уровень транскриптов и белка). Б - уровень DHR3 на промоторах различных генов до и после обработки клеток экдизоном (белые и черные столбцы соответственно).

Мы изучили, привлекает ли DHR3 весь комплекс BTFly. Хроматин-иммунопреципитация показала, что активация экдизоном приводит к привлечению на промоторы компонентов комплекса BTFly, а также Pol II (рис. 24В). При нокдауне SAYP в активированном состоянии наблюдается значительное снижение уровня всех этих компонентов и Pol II по сравнению с нормальными клетками. Однако нокдаун SAYP практически не влияет на уровень DHR3 на промоторах. Это говорит о том, что SAYP не является необходимым фактором для привлечения DHR3 на промотор.

Полученные данные позволяют предложить следующую модель (рис. 24Г). DHR3 привлекается на определенные промоторы, непосредственно взаимодействует с SAYP, а через него - со всем комплексом BTFly. Последний активирует транскрипцию гена. Таким образом, SAYP действует как классический коактиватор, который привлекается активатором и важен для нормальной высокой транскрипции гена.

Для DHR3 ранее был описан единственный ген-мишень (ген ftz-fl), однако наши результаты указывают на широкий круг генов, активируемых DHR3 посредством BTFly.

б 5 4

г 1

Б 1.2

1 0.8 0.6 0.4 0.2

CG11395

3 2.5

Сур 12а5

CG11395 промотор

2 1.5 1

0.5 -I-0

CG11395 прОМОТОр Сур12а5 промотор 0.7 ■

•-

-л

0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0

SAYP

контроль□

ЭКДИ30Н □

RNAi SAYP ■ экдизон-RNAi SAYP ■

RNAi SAYP

DHR3

DHR3 TAF1 TBP PB Мог Cyp12a5 ПрОМОТОр

DHR3 TAF1

Рис. 24. SAYP важен в активации DHR3-зависимых генов. А - уровень транскрипции генов указанных генов при активации экдизоном (белые и светлосерые столбцы) в контрольных клетках и в клетках с нокдауном SAYP (тёмно-серые и черные столбцы). Для нормализации использовали уровень актина. Б - уровень SAYP на промоторах двух генов в четырёх указанных состояниях. Серым цветом указано количество SAYP в межгенной области (фоновый уровень). В - уровень DHR3, TFIID (TAF1 и TBP), Brahma (РВ и Moira) и PolII на промоторах двух генов в трех состояниях. Г - модель активации генов белками DHR3 и SAYP (показаны только ОНКЗ-зависимые события). На первом этапе DHR3 садится на промотор, далее он привлекает комплекс BTFly и РоШ, что запускает транскрипцию. При отсутствии SAYP привлекается DHR3, но активации транскрипции не происходит.

IV. Участие коактиватора SAYP и комплекса BTFly в активации генов сигнального пути Jak/Stat

IV. 1. Фенотипические проявления мутации e(y)3uI сходны с проявлениями мутации Jak/Stat пути

Для поиска активаторов, взаимодействующих с SAYP, был тщательно проанализирован фенотип мух, геми- или гомозиготных по мутации е(у)Зи1. У взрослых мух на крыльях были обнаружены дополнительные жилки в области дальней поперечной жилки (рис. 25А). Сходный фенотип ранее описан для мутации транскрипционного фактора STAT, конечного фактора в Jak/Stat сигнальном пути.

Т.к. самки, гомозиготные по е(у)3"', стерильны, мы проанализировали строение яичников у мутантных самок. Анализ показал изменение паттерна экспрессии фасциклина 3 (маркер фолликулярных клеток ранних стадий оогенеза): его экспрессия не подавляется, как в нормальных мухах, но сохраняется до более поздних стадий. Также наблюдается формирование слитых яйцевых камер на более поздних стадиях (рис 25Б, В). Jak/Stat сигнальный путь играет важную роль в оогенезе дрозофилы, и сходные проявления были описаны для мутаций компонентов этого пути.

Описанный фенотип мутации е(у)3"' связан, по-видимому, с нарушением пролиферации и дифференцировки клеток в имагинальных дисках (нарушение жилкования крыльев) и в яичниках (фолликулярный эпителий). Таким образом, SAYP участвует в указанных биологических процессах.

Комбинация мутации гена Stat и мутации е(у)3"' приводит к усилению фенотипических проявлений последней (рис. 25Г). Обнаружено сильное подавление экспрессии гена yellow и увеличение частоты формирования сломанной лапы (перетяжка на бедре, характерная для мутации e(y)3ul). Таким образом, наблюдается генетическое взаимодействие мутаций е(у)3"' и мутации Stat.

IV.2. SAYP взаимодействует с фактором STAT

Было проверено взаимодействие SAYP и STAT биохимическими методами. Определенная доля белка STAT элюируется с гель-фильтрационной колонки во фракциях 16-17, в которых также элюируется SAYP (рис. 26А). Иммунопреципитация из указанных фракций показала, что SAYP и STAT соосаждаются друг с другом. Кроме того, STAT соосаждает компоненты TFIID и Brahma. Таким образом, часть белка STAT ассоциирована с BTFly (рис. 26Б,В).

DNA ¡ь

•

■Л. - ;

Fas III

е(у)3[и1]

DNA {S.''

..-'О . J . С.-»*'-

■ у;- f- -- .-,>':>

Fas III

DNA В Fas3 В merge

цвет щетинок

y[2] +/Y; Stat92E[06346]I + ••••• +5 y[2] e(y)3[u1]/У/+/+ •••• +4 y[2]e(y)3[u1]/Y;Stat92E[06346]/ + • +1

нарушения развития лапы e(y)3[u1]/ Y; + /+ ЯШ 10%

e(y)3[u1] / Y; Stat92E[06346] / + BHBBH 30%

Рис. 25. Проявления мутации e(y)3"'. A - Жилкование крыльев у мутантов е(у)3"' и в норме. Стрелки указывают на дополнительные жилки у мутантов. Б - Овариолы нормальных мух и мутантов е(у)3"'. Иммуноокрашивание антителами к фасциклину 3 (красный цвет) и DAPI (зеленый). Стрелки указывают на яйцевые камеры стадии 3-4 с нарушенной экспрессией фасциклина 3. В - Слитые яйцевые камеры с инвазией фолликулярного эпителия (указан стрелкой с линией) и отдельными островками фолликулярных клеток (указан стрелкой) у мутантов. Г - Окрашивание щетинок и нарушения в развитии лапы у различных мутантов. Введение мутации Stat усиливает проявление мутации е(у)Зи1.

Для проверки прямого взаимодействия, рекомбинантные белки STAT и SAYP, с эпитопами НА и Flag соответственно, были совместно наработаны в культуре клеток. Иммуопреципитация показала, что белки взаимодействуют (рис. 26Г).

Д ИО 2 MDa 100kDa

SAYP STAT

16 18 20

ип ип r HJTFLAG ИНЫЛ

В —— I

ИФ ИФ ИФ x4 > ¿О X-

SAYP m Р.ЯВ MOR m - HA-STAT И

STAT К И1""* TAF1 В FLAG-SAYP Я

iflSAYP

—1 '2008

AD.

i STAT

'762

ИП-НА ИФ x^^

ИП-FLAG ифх^Г

HA-STAT-AD HA-STAT —

ЯННИНИННмПННК

FLAG-SP*fW

FLAG-N pi FLAG-M Щ i FLAG-SP

FLAG-C Ш FLAG-Gal4 fll MOR TAF4 HA-STAT-AD

Рис. 26. Взаимодействие SAYP и STAT. A - Анализ фракций с гель-фильтрации (разделение ядерного эмбрионального экстракта). SAYP и STAT совместно элюируются в 16-18 фракциях. Б - STAT и SAYP коиммунопреципитируются друг с другом (ИП из фракций 16-17). ИФ - исходная фракция, ИП - иммунопреципитация, pi - преимунная сыворотка. В - антитела к STAT соосаждают компоненты TFIID и Brahma (ИП из фракций 16-17). Г - коиммунопреципитация рекомбинантных Flag-SAYP и HA-STAT из клеточного лизата (-FLAG, -НА — контрольная иммунопреципитация из лизата клеток, в которых не был экспрессирован соответствующий белок). Д - схемы белков SAYP и STAT, указаны домены, проверенные на взаимодействие друг с другом. Е - соосаждение различных доменов SAYP (маркированы Flag-Gal4) с АД STAT (маркирован НА). В обратной ИП было проверено соосаждение Flag-SAY-PHD с HA-STAT и HA-STAT АД.

Для локализации доменов, отвечающих за взаимодействие STAT и SAYP, отдельные домены SAYP были наработаны в культуре клеток (рис. 26Д). Одновременно с ними был экспрессирован активационный домен (АД) STAT. Из всех проверенных доменов SAYP только SAY-PHD фрагмент соосаждался с АД STAT (рис. 26Е). Мы проверили, что АД STAT взаимодействует в составе BTFly именно с SAYP, но не с Brahma или TFIID. Иммунопреципитация подтвердила, что найденное взаимодействие не опосредуется последними. Таким образом, подтверждено прямое взаимодействие SAYP-STAT и найдены домены в составе STAT и SAYP, обеспечивающие это взаимодействие.

IV.3. SA YP и STAT совместно регулируют экспрессию генов

На препаратах политенных хромосом слюнных желез личинок была проверена локализация факторов STAT и SAYP. Ранее было показано, что Jak/Stat путь активен в слюнных железах личинки. Для дополнительной активации пути слюнные железы обрабатывали перванадатом, стимулирующим указанный путь. Было обнаружено, что STAT локализуется во многих сайтах, совместно с ним часто присутствует SAYP (рис. 27А).

Jak/Stat сигнальный путь активно работает в яичниках. Мы проверили влияние гипоморфной мутации е(у)3"' на активность STAT-зависимых генов в яичниках. Мутация е(у)3"' вызывает снижение уровня SAYP, но не влияет на уровень экспрессии генов hop и stat (гены, кодирующие два важнейших компонента изучаемного пути). В то же время мы обнаружили снижение уровня активности STAT-зависимых генов у мутантов (рис. 27Б). Таким образом, достаточный уровень SAYP необходим для нормальной активности ряда STAT-зависимых генов.

IV.4. BTFly привлекается на STAT-зависимые гены

Мы использовали культуру клеток S2 для дальнейшего изучения найденного взаимодействия. В клетках S2 обнаружены все компоненты изучаемого пути. Обработка клеток перванадатом стимулирует экспрессию STAT-зависимых генов (рис. 28А). Мы проверили, важен ли SAYP для активации STAT-зависимых генов. Для этого мы либо повышали его количество с помощью экспрессии рекомбинантного белка, либо проводили его нокдаун. Мы обнаружили, что повышение количества SAYP стимулирует активацию STAT-зависимых генов, а его нокдаун - подавляет.

SAYPl

идя

mergi

Б относительная активность генов м.----------e(y)3[u1]/wt

я *

Рис. 27. SAYP и STAT совместно контролируют экспрессию генов. А -иммуноокрашивние политенных

хромосом антителами к SAYP и STAT, также дано наложение. Приведен фрагмент хромосомы. Б - Уровень экспрессии STAT-зависимых генов в яичниках у мутантов е(у)3 относительно нормального уровня. Уровень экспрессии генов актина и гистона взят в качестве контроля, ген CG11400 - контрольный SAYP-зависимый ген.

С помощью хроматин-иммунопреципитации было измерено привлечение STAT, SAYP, TFIID, Brahma и PolII на промоторы некоторых STAT-зависимых генов (рис. 28Б). При активации пути перванадатом происходило повышение уровня указанных факторов на промоторах. Нокдаун SAYP приводил к нарушению привлечения TFIID, Brahma, и значительно снижал уровень PolII, однако не приводил к снижению уровня STAT.

Привлечение BTFly на промоторы STAT-зависимых генов было проверено также в организме. Хроматин-иммунопреципитация из эмбрионов подтвердила наличие компонентов BTFly на промоторах STAT-зависимых генов (рис. 29А).

индукция генов PV

SOCS36E eve

SOCS36E second promoter

□ S2 □ S2 + PV ■ SAYPRNAi ■ SAYP RNAi + P1

■ ! J

STAT SAYP MOR PBAP TBP

Рис. 28. Активация STAT-зависимых генов в культуре клеток S2. А - Относительная индукция транскрипции нескольких STAT-зависимых генов после 2 ч обработки перванадатом.

Измерения проводились в нормальных клетках (белые столбики), клетках с 5-кратной оверэкспрессией SAYP (серые столбики) и нокаутом SAYP (черные столбики). Б - Уровень различных факторов на промоторах трех указанных STAT-зависимых генов в нормальных клетках и в клетках с нокаутом SAYP. Фоновый уровень (уровень на рДНК) дан в виде серой заливки.

buffy promoter

STAT SAYP MOR PBAP TBP

На основе полученных данных мы предполагаем следующую модель (рис. 29Б). Под действием внешних сигналов в клетке активируется фактор транскрипции STAT, который привлекается на определенные гены-мишени. Далее STAT посредством активационного домена взаимодействует с коактиватором SAYP, а через него - со всем комплексом BTFly. Последний инициирует транскрипцию.

Важно, что найденное нами взаимодействие STAT-SAYP осуществляется посредством консервативных доменов в обоих белках. Это указывает на то, что найденный механизм может использоваться и в других организмах, в частности, в организме человека.

СЫР на эмбрионах

срр □

dm а eveQ аролНсП асе/л В hspTO ■

SAYP

STAT

Рис. 29. BTFly активирует STAT-зависимые гены. А - хроматин-иммунопреципитация из 0-6 ч эмбрионов. Показан уровень различных факторов на промоторах указанных STAT-зависимых генов, промоторы генов actin, hsp70 даны в качестве отрицательного контроля (гены, не контролируемые STAT или SAYP). Б -модель участия BTFly в Jak/Stat сигнальном пути.

V. Новый механизм активации транскрипции генов

В работе был открыт и охарактеризован коактиваторный суперкомплекс BTFly, объединяющий хроматин-ремоделирующий фактор Brahma и фактор инициации транскрипции TFIID. Сборка BTFly осуществляется независимо от присутствия хроматиновой матрицы, а целостность структуры BTFly важна для его привлечения на промотор.

BTFly объединяет хроматин-ремоделирующую активность и способность инициировать транскрипцию. Эти активности являются важнейшими в индуцированной транскрипции генов, что указывает на то, что BTFly -эффективная молекулярная машина, осуществляющая запуск транскрипции. Мы предполагаем, что после привлечения на промотор Brahma в составе BTFly смещает нуклеосому с промотора и открывает последний для взаимодействия с общими факторами транскрипции. Затем TFIID в составе BTFly связывается с промотором, запускает сборку преинициаторного комплекса, и в конечном итоге - привлекает РНК-полимеразу II (рис. 30).

Открытый в данной работе ядерный суперкомплекс является первым известным примером объединения полных транскрипционных комплексов, включающих весь набор субъединиц. В литературе уже описаны примеры подобных суперкомплексов: холофермент РНК-полимеразы II (Parvin JD, 1998); белковые комплексы, содержащие факторы группы поликомб (Saurín AJ, 2001) и триторакс (Nakamura Т, 2002). Однако их общим главным недостатком является наличие лишь отдельных субъединиц из большого набора различных комплексов (так, они содержат лишь отдельные белки TAF, отдельные субъединицы различных хроматин-ремоделирующих комплексов и множество других белков). Возможное объяснение - разрушение больших суперкомплексов в процессе выделения. Вероятно, BTFly - один из наиболее простых по строению суперкомплексов, которые возможно очистить обычными хроматографическими методами.

Существование суперкомплексов - проявление модульности строения транскрипционного аппарата: факторы и комплексы используются как структурные модули для сборки крупных молекулярных машин, объединяющих несколько активностей. Модульность позволяет из небольшого набора структурных блоков создавать транскрипционные комплексы, имеющие, например, различные функциональные особенности и контролирующие различный набор генов. Кроме того, можно предположить, что суперкомплексы, объединяющие нескольких активностей, способны эффективно и точно регулировать экспрессию генов. Точная регуляции

экспрессии генов особенно важна в онтогенезе, поэтому суперкомплексы, скорее всего, особенно важны для нормального развития организма.

Как описанные в литературе суперкомплексы, так и открытый нами BTFly функционально не могут быть заменены составляющими их компонентами. Благодаря этому они регулируют работу генов с высокой специфичностью.

Основная роль в привлечении коактиваторного комплекса BTFly на промотор, как мы предполагаем, принадлежит ген-специфичными активаторам. В то же время BTFly и сам по себе способен взаимодействовать с ДНК и белками хроматина посредством многочисленных белковых доменов, входящих в его состав. Эти взаимодействия могут играть роль в стабилизации связи BTFly с хроматином.

Мы предполагаем, что активаторы взаимодействуют в основном со специфичной субъединицей BTFly - SAYP. Таким образом, SAYP играет важную роль как в создании структуры BTFly, так и в его привлечении на определенные сайты в геноме.

В работе найдены специфические активаторы, взаимодействующие с SAYP: компонент экдизонового каскада ядерный рецептор DHR3 и фактор пути Jak/Stat активатор STAT. Имеются данные об участии SAYP в других сигнальных путях. Можно предположить, что BTFly - высокоспецифичный фактор, запускающий транскрипцию генов-мишеней различных сигнальных путей. Быстрая и эффективная активация транскрипции указанных генов важна в процессе онтогенеза.

SAYP

ремоделирование хроматина

инициация транскрипции

внешнии стимул

Рис. 30. Модель функционирования SAYP. Объяснение в тексте. BTFly способен взаимодействовать с активаторми, ДНК и гистонами. А - ген-специфичный транскрипционный активатор. GTFs - общие факторы транскрипции, РоШ - РНК-полимераза II.

выводы

1. Очищен белковый суперкомплекс BTFly, состоящий из комплексов Brahma, обеспечивающего ремоделинг хроматина, и TFIID, инициирующего сборку комплекса РНК-полимеразы II на промоторе.

2. Впервые показано существование стабильного транскрипционного суперкомплекса, состоящего из полноразмерных мультисубъединичных комплексов.

3. Показано, что объединение Brahma и TFIID в BTFly осуществляет транскрипционный коактиватор SAYP посредством консервативного домена SAY. Последний непосредственно взаимодействует с субъединицей Brahma ВАР 170 и с доменом WD-40 субъединицы TAF5 комплекса TFIID.

4. Продемонстрирована функциональная неделимость BTFly в активации транскрипции: наличие всех компонентов SAYP, TFIID и Brahma необходимо для его функционирования. Описан новый механизм одновременного привлечения двух активностей на промотор гена. Показано, что найденный механизм используется на большом числе генов.

5. Установлено взаимодействие SAYP и ядерного рецептора DHR3, компонента экдизонового каскада. DHR3 взаимодействует с областью SAYP, специфичной для дрозофилы. При активации экдизоном BTFly активирует транскрипцию ОНЯЗ-зависимых генов.

6. Найдено взаимодействие SAYP и фактора транскрипции STAT, компонента сигнального пути Jak/STAT. STAT взаимодействует с консервативной областью SAYP. BTFly важен для активации STAT-зависимых генов.

7. Показано присутствие транскрипционного фактора ENY2 в трех основных белковых комплексах SAGA, АМЕХ, ТНО. Обнаружена новая функция ENY2 как компонента ТНО. Показана независимость взаимодействия ENY2-THO от ENY2-SAGA и ENY2-AMEX.

8. Разработан новый метод выделения белковых транскрипционных комплексов, позволяющий получать выскоочищенные препараты белков, связанных с определенным фактором.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

Статьи

1) Шидловский Ю.В.. Марданов П.В., Федорова О.Н., Набирочкина Е.Н. Молекулярный аппарат инициации транскрипции РНК-полимеразой II. Генетика (2005) 41(4): 493-507

2) Шидловский Ю.В.. Набирочкина Е.Н. Влияние ремоделирования и модификации хроматина на процесс инициации транскрипции РНК-полимеразой II. Генетика (2005) 41(7): 884-93

3) Шидловский Ю.В.. Копытова Д.В., Куршакова М.М., Набирочкина Е.Н. Принципы функционирования аппарата инициации транскрипции РНК-полимеразой II. Генетика (2005) 41(9): 1157-69

4) Сошникова Н.В., Воробьева Н.Е., Краснов А.Н., Георгиева С.Г., Набирочкина Е.Н., Ильин Ю.В., Шидловский Ю.В. Взаимодействие коактиваторов на промоторе. Доклады АН (2008), 423 (4): 561-3

5) Воробьева Н.Е., Сошникова Н.В., Николенко Ю.В., Набирочкина Е.Н., Георгиева С.Г., Шидловский Ю.В. Новый эволюционно консервативный белковый домен, активирующий транскрипцию. Доклады АН (2008), 423 (5): 694-6

6) Vorobyeva NE, Soshnikova NV, Nikolenko JV, Kuzmina JL, Nabirochkina EN, Georgieva SG and Shidlovskii YV. Transcription coactivator SAYP combines chromatin remodeler Brahma and transcription initiation factor TFIID into a single supercomplex. Proc Natl Acad Sci USA (2009); 106(27): 11049-54.

7) Vorobyeva NE, Soshnikova NV, Kuzmina JL, Kopantseva MR, Nikolenko JV, Nabirochkina EN, Georgieva SG, Shidlovskii YV. The novel regulator of metazoan development SAYP organizes a nuclear coactivator supercomplex. Cell Cycle (2009); 8(14):2152-6.

8) Сошникова H.B., Воробьева H.E., Краснов A.H., Георгиева С.Г., Набирочкина Е.Н., Шидловский Ю.В. Новый комплекс, образуемый коактиватором транскрипции SAYP. Молекулярная биология (2009), 43(6): 1055-62.

9) Kopytova DV, Orlova AV, Krasnov AN, Gurskiy DY, Nikolenko JV, Nabirochkina EN, Shidlovskii YV. and Georgieva SG. Multifunctional factor ENY2 is associated with the THO complex and promotes its recruitment onto nascent mRNA. Genes and Development (2010); 24:86-96.

10) Kopytova DV, Orlova AV, Krasnov AN, Gurskiy DY, Nabirochkina EN, Georgieva SG and Shidlovskii YV. ENY2: couple, triple... More? Cell Cycle (2010); 9(3):479-81.

11) Воробьева H.E., Сошникова H.B., Николенко Ю.В., Кузьмина Ю.Л., Набирочкина Е.Н., Георгиева С.Г., Шидловский Ю.В. Новый консервативный домен коактиватора SAYP опосредует взаимодействие транскрипционных комплексов TFIID и Brahma. Молекулярная биология (2010); 44 (5):867-875.

12) Кузьмина Ю.Л., Панов В.В., Воробьева Н.Е., Сошникова Н.В., Копанцева М.Р., Николенко Ю.В., Набирочкина Е.Н., Георгиева С.Г., Шидловский Ю.В. SAYP - новый регулятор развития многоклеточных организмов. Генетика (2010); 46 (8), 1033-40.

13) Гурский Д.Я., Набирочкина Е.Н., Копытова Д.В., Николенко Ю.В., Ильин Ю.В., Георгиева С.Г., Шидловский Ю.В. Белок ENY2 входит в состав ТНО-комплекса Drosophila melanogaster. Доклады АН (2010); 433 (6):831-4.

14) Гурский Д.Я., Орлова А.В., Копытова Д.В., Краснов А.Н., Набирочкина Е.Н., Георгиева С.Г., Шидловский Ю.В. Мультифункциональный фактор ENY2 интегрирует различные этапы экспрессии генов. Генетика (2010) 46 (12), 17003.

15) Vorobyeva NE, Nikolenko JV, Krasnov AN, Kuzmina JL, Panov W, Nabirochkina EN, Georgieva SG, Shidlovskii YV. SAYP interacts with DHR3 nuclear receptor and participates in ecdysone-dependent transcription regulation. Cell Cycle (2011) 10(11): 1821-7.

16) Panov VV, Kuzmina JL, Doronin SA, Kopantseva MR, Nabirochkina EN, Georgieva SG, Vorobyeva NE, Shidlovskii YV. Transcription coactivator SAYP mediates the action of STAT activator. Nucleic Acids Research (2012) 40(6): 244553.

17) Воробьева H.E., Николенко Ю.В., Краснов A.H., Кузьмина Ю.Л., Панов В.В., Набирочкина Е.Н., Георгиева С.Г., Шидловский Ю.В. Коактиватор SAYP взаимодействует с ядерным рецептором DHR3 и контролирует экдизон-зависимую транскрипцию. Генетика (2012) 48 (1), 21-29.

Тезисы конференций

1) Molecular characterization of novel transcription factor SAYP. Shidlovskii Y.V., Fedorova O.N., Nabirochkina E.N., Georgieva S.G. 7th International Conference on Molecular Biology, Suzdal, Russia, 28.11-2.12.2004, Abstract book, p. 11

2) Novel transcription coactivator SAYP. Shidlovskii Y., Nikolenko J., Krasnov A., Fedorova O., Lebedeva L., Nabirochkina E., Georgieva S.lst International EMBL-Monterotondo (6th EMBL) International PhD Students Symposium "Animal Models", Rome, Italy, May 12-14,2005, Symposium handbook, p.54

3) Роль доменов транскрипционного коактиватора SAYP при активации транскрипции в эукариотической системе. Воробьева Н.Е., Шидловский Ю.В., Николенко Ю.В., Набирочкина Е.Н., Георгиева С.Г. Международная Конференция «Генетика в России и мире», 28 июня - 2 июля 2006, Москва, Россия, Материалы, стр. 37

4) Novel multidomain transcription coactivator SAYP possesses repressor properties in heterochromatin. Shidlovskii Y., Krasnov A., Nikolenko J., Lebedeva L., Kopantseva M., Nabirochkina E., Georgieva S. IV International Summer School "DNA and Chromosomes", Cargese, France, June 19 - July 1,2006, Abstract book, p. 21

5) Структурно-функциональный анализ коактиватора транскрипции SAYP. Воробьева Н.Е., Шидловский Ю.В., Николенко Ю.В., Набирочкина Е.Н., Георгиева С.Г. XIX Зимняя Молодежная Научная Школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, Россия, 7-9 февраля 2007, Тезисы докладов и стендовых сообщений, стр. 25

6) SAYP, новый коактиватор РНК-полимеразы II у высших эукариот. Шидловский Ю.В., Николенко Ю.В., Воробьева Н.Е., Лебедева JI.A., Набирочкина Е.Н., Георгиева С.Г. Семинар российско-германской группы «Взаимодействие белков и нуклеиновых кислот», Суздаль, Россия, 20-24 июня, 2007, Тезисы докладов, стр. 30

7) Novel transcription coactivator SAYP. Shidlovskii YV, Vorobyeva NE, Soshnikova NV, Kopantseva MR, Moshkin YM, Georgieva SG, Ilyin YV FEBS-EMBO Advanced Lecture Course "Molecular Mechanisms in Signal Transduction and Cancer", Spetses, Greece, 15-24 August 2007, Abstract book, p. 21

8) Novel mechanism of coupling of chromatin remodeling, transcription activation and mRNP formation. Shidlovskii YV, Vorobyeva NE, Soshnikova NV, Ivliev AE, Nikolenko JV, Nabirochkina EN, Moshkin YM, Verrijzer CP, Georgieva SG, Ilyin YV Meeting on Mechanisms of eukaryotic transcription, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, USA, 29 August - 2 September 2007, Abstract book, p. 214

9) Novel mechanism of coupling of chromatin remodeling, transcription activation and mRNA export. Shidlovskii YV, Vorobyeva NE, Soshnikova NV, Nikolenko JV, Ivliev AE, Lebedeva LA, Georgieva SG. EMBO Conference Series on Nuclear Structure and Dynamics, Montpellier, France, 1-5 September 2007, Abstract book, p-043

10)Structural and functional study of domains of novel transcription coactivator SAYP. Vorobyeva N.E., Soshnikova N.V., Georgieva S.G., Shidlovskii Y.V., Ilyin Y.V. FEBS workshop "The biology of modular protein domains", Tirol, Austria, 8-13 September, 2007, Abstract book, p. 122

11)Новый транскрипционный фактор SAYP объединяет аппарат ремоделинга хроматина и инициации транскрипции. Сошникова Н.В., Воробьева Н.Е., Георгиева С.Г., Шидловский Ю.В., Ильин Ю.В. Конференция молодых ученых по молекулярной биологии и генетике, посвященная 120-летию Н.И. Вавилова, Украина, Киев, 20-22 сентября 2007, Тезисы докладов, стр. 92

12)Novel export complex is responsible for efficient transcription and mRNA transport through nuclear pore. Yulii V. Shidlovskii, Maria M. Kurshakova, Alexey N. Krasnov, Daría V. Kopytova, Julia V. Nikolenko, Elena N. Nabirochkina, Lászlo Tora and Sofia G. Georgieva. EMBO workshop "Mechanisms of Nucleocytoplasmic Transport", Taormina, Italy, 27-31 October, 2007, Abstract book, p. 97

13)Transcription coactivators E(y)2 and SAYP couple different stages of gene expression in the nucleus. Yulii Shidlovskii, Sofia Georgieva. 2nd Szeged Minisymposium on Histone Modifying Complexes, Szeged, Hungary, May 2,2008, Abstract book, p. 2

14)Новый коактиваторный комплекс BTFly координирует ключевые этапы транскрипции генов. Шидловский Ю. В., Воробьева Н. Е., Сошникова Н. В., Николенко Ю. В., Набирочкина Е.Н., Георгиева С.Г. IV Съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, Россия, 11-15 мая 2008 г., Материалы, стр. 134

15)Novel export complex is responsible for efficient transcription and mRNA transport through the nuclear pore. Shidlovskii Y, Kurshakova M, Krasnov A, Kopytova D, Nikolenko J, Nabirochkina E, Spehner Daniele, Schultz P, Lászlo T and Georgieva S. 8th Young Scientist Forum and 33d FEBS Congress, Athens, Greece, 26.06-3.07.2008, Abstact book, p.131

16)Мультидоменный фактор SAYP координирует процессы на промоторе активных генов. Шидловский Ю.В., Воробьева Н.Е., Сошникова Н.В., Георгиева С.Г. IV Российский симпозиум «Белки и пептиды», Казань, Россия, 23-27.06.2009, Сборник тезисов, стр. 354.

17)Multifunctional factor ENY2 is associated with THO complex and is required for its recruitment onto mRNA in Drosophila. Shidlovskii Y. International Meeting on Nuclear Trafficking, Banff, Canada, 24-29.08.2009, Abstract book, p. 48.

18) SAYP is the novel regulator of Jak/Stat pathway. Shidlovskii YV, Kuzmina JK, Panov W, Georgieva SG. FEBS Special Meeting, Jak-Stat Signalling: from basics to disease, Vienna, Austria, 10-13.02.2010, Abstract book, p.133

19)Mechanism of transcription activation by factor SAYP. Shidlovskii YV, Kuzmina JL, Panov VV, Vorobyeva NE, Soshnikova NV, Georgieva SG, Ilyin YV. International

Symposium "Control of gene expression and cancer", Moscow, Russia, 21-25.06.2010, Abstract book, p. 15

20)Новый участник JAK/STAT пути коактиватор транскрипции SAYP/PHF10 важен для поддержания плюрипотентного статуса стволовых клеток. Панов В.В., Кузьмина Ю.Л., Шидловский Ю.В. III Всероссийская научная школа-конференция «Стволовые клетки и регенеративная медицина», Москва, Россия, 25-28 октября 2010. стр. 55

21) Коактиватор транскрипции SAYP - новый участник Jak/Stat пути. Панов В.В., Кузьмина Ю.Л., Шидловский Ю.В. XXIII Международная зимняя молодежная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, Россия, 7-10 февраля 2011, Тезисы докладов, стр. 16

22) SAYP is a novel member of Jak/Stat pathway. Panov VV, Kuzmina JL, Shidlovskii YV. VII International Scientific Conference for Students and PhD Students "Youth and Progress of Biology", Lviv, Ukraine, April 5-8,2011, Abstract book, p. 306

23) Novel mechanism of genes activation by SAYP/PHF10 coactivator is important in signaling pathways. Panov VV, Kuzmina JL, Doronin SA, Vorobyeva NE, Soshnikova NV, Georgieva SG, Shidlovskii YV. EMBO Conference Series on Nuclear Structure and Dynamics, L'Isle sur la Sorgue, France, September 28 - October 2, 2011, Abstract book, P-098

Список цитированной литературы

Georgiev PG, Gerasimova TI. (1989) Novel genes influencing the expression of the yellow locus and mdg4 (gypsy) in Drosophila melanogaster. Mol. Gen. Genet. 220:121-126

Georgieva S et al. (2001) The novel transcription factor e(y)2 interacts with TAF(II)40 and potentiates transcription activation on chromatin templates. Mol. Cell Biol. 21:52235231.

Kurshakova MM et al. (2007) SAGA and a novel Drosophila export complex anchor efficient transcription and mRNA export to NPC. EMBO J. 26:4956-4965.

Nakamura T et al. (2002) ALL-1 is a histone methyltransferase that assembles a supercomplex of proteins involved in transcriptional regulation. Mol. Cell 10:1119-1128.

Parvin JD, Young RA (1998) Regulatory targets in the RNA polymerase II holoenzyme. Curr. Opin. Genet. Dev. 8:565-570.

Saurin AJ et al. (2001) A Drosophila Polycomb group complex includes Zeste and dTAFII proteins. Nature 412:655-660.

Shidlovskii YV et al. (2005) A novel multidomain transcription coactivator SAYP can also repress transcription in heterochromatin. EMBO J. 24: 97-107.

Аббревиатуры и обозначения АМЕХ - фактор экспорта мРНК (mRNA EXport complex, включает белок Xmas-2) Brahma - хроматин-ремоделирующий комплекс (включает белки BRM, МО R, PB, ВАР170, ВАР111, ВАР60, ВАР55 и Snrl)

BTFly - транскрипционный коактиваторный суперкомплекс, включающий Brahma,

TFIID и SAYP (Brahma and TFIID in one assembly)

ENY2 - транскрипционный коактиватор (ENhancer of Yellow 2)

GTFs - общие факторы транскрипции РНК-полимеразы II (General Transcription Factors)

ISWI - субъединица хроматин-ремоделирующего комплекса (Imitation SWI)

MALDI-TOF MS - матричная лазерная десорбционная времяпролетная масс-

спектрометрия (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization - Time Of Flight Mass

Spectrometry)

PoIII - РНК-полимераза II

Pr — промотор

PV - перванадат

RNAi- нокдаун, проведенный методом РНК-интерференции (RNA interference) S2 - культура клеток Drosophila (Schneider 2 cells)

SAGA - гистон-ацетилтрансферазный комплекс (Spt-Ada-Gcn5 Acetyltransferase, включает белок GCN5)

SAYP - транскрипционный коактиватор (Supporter of Activation of Yellow Protein) TFIID - фактор инициации транскрипции РНК-полимеразы II (Transcription Factor II D, включает ТАТА-связывающий белок ТВР и связанные с ним факторы TAF1-14) ТНО - фактор созревания мРНП-частиц (включает белки ТНОС5, HPR1)

Благодарности

Автор выражает глубокую благодарность коллегам за совместное проведение исследований и обсуждение полученных результатов. Исследования проводились при участии сотрудников Лаборатории регуляции экспрессии генов Надежды Воробьевой, Наталии Сошниковой, Дарии Копытовой, Юлии Николенко, Алексея Краснова, Елены Набирочкиной, Юлии Кузьминой, Владислава Панова, Александра Бречалова, Александра Ивлиева, Семена Доронина, Дмитрия Гурского, Анастасии Орловой, Александра Шапошникова, Заура Качаева, Ильи Комарькова. Автор отмечает важный вклад Марины Копанцевой и Антона Головнина. Автор выражает глубокую признательность научному консультанту Софии Георгиевне Георгиевой и научному руководителю ИБГ РАН Георгию Павловичу Георгиеву, Лидии Павловне Сащенко и сотрудникам лаборатории молекулярной иммуногенетики рака, а также всему научному коллективу и дирекции Института биологии гена РАН. Автор благодарит оппонентов и рецензента Олега Леонидовича Поляновского.

Автор благодарит своих учителей Алексея Шульгу и Ярослава Ермолюка; Татьяну Андреевну Арсеньеву, привившую автору интерес к изучению живых систем, Светлану Алексеевну и Павла Макаровича Бурдак, Лидию Юрьевну Голубеву. Автор выражает благодарность маме за неоценимую помощь; а также всем, поддержавшим автора.

Заказ № 387-1/06/2012 Подписано в печать 09.06.2012 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 2,4

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-тай:zak@cfr.ru

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Шидловский, Юлий Валерьевич

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

I. Транскрипция у эукариот.

1. Инициация транскрипции. РНК-полимеразы.

2. Области контроля транскрипции.

3. Хроматин и транскрипция.

II. Транскрипционные факторы.

1. Компоненты транскрипционного аппарата.

2. Общие факторы транскрипции (GTFs).

3. Активаторы и репрессоры.

III. Коактиваторы транскрипции.

1. Классификация корегуляторов транскрипции.

2. Хроматин-ремоделирующие комплексы.

3. Хроматин-модифицирующие комплексы.

4. Взаимодействие хроматин-ремоделирущих и модифицирующих комплексов.

IV. Активация транскрипции РНК-полимеразой II.

1. Модель сборки преинициаторного комплекса РНК-полимеразы II на ДНК in vitro.

2. Взаимодействие коактиваторов на промоторе.

3. Активация генов in vivo: последовательное привлечение факторов.

4. Модель одновременного привлечения факторов транскрипции на промотор.

V. Элонгация транскрипции, созревание и экспорт мРНП.

1. Транскрипционная пауза. Элонгация и терминация транскрипции.

2. Созревание мРНП. Комплекс ТНО и TREX.

VI. Регуляция транскрипции.

1. Модульная структура транскрипционного аппарата.

2. Комбинаторная модель регуляции транскрипции. Синергизм действия и контекст-зависимая активность факторов транскрипции.

3. Регуляция транскрипции.

4. Регуляция активности транскрипционных факторов.

5. Репрессия транскрипции и сайленсинг.

6. Организация ядра и транскрипция.

VII. Сигнальные пути и их связь с аппаратом транскрипции.

1. Передача сигнала внутри клетки.

2. Сигнальный путь JAK/STAT: основные компоненты.

3. Связь JAK/STAT-пути с аппаратом транскрипции.

4. Роль JAK/STAT пути в онтогенезе.

5. Экдизоновый каскад.

6. Ядерные рецепторы.

7. Ядерный рецептор DHR3.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ОБЪЕКТ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Гены группы е(у)Ы.

Ген е(у)3 и коактиватор Б АУР.

Ген е(у)2 и фактор ЕМУ2.

Цели и задачи исследования.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Материалы.

Реактивы.

Клеточные линии, штаммы. Плазмиды.

Антитела.

Праймеры.

Программное обеспечение.

Методы работы с ДНК и РНК.

Приготовление компетентных клеток Е.соН и трансформация. Выделение плазмидной ДНК. Рестрикция, лигирование, переосаждение ДНК, гель-электрофорез. ПЦР. Нозерн-блот анализ. Секвенирование.

Создание конструкции рТгАвэау.

Выделение тотальной РНК, получение кДНК и измерение уровня экспрессии гена.

Получение двухцепочечной РНК.

Методы работы с белками.

Эмбриональный ядерный экстракт. Экстракт из клеток Б2.

Очистка белковых комплексов. МА1Л31-ТОР.

Гель-фильтрация ядерного экстракта.

Белковый гель-электрофорез. Western-блот анализ.

Иммунопреципитация.

Экспрессия и очистка рекомбинантных белков. Получение антител.

Методы работы с культурой клеток S2.

РНК интерференция.

Трансфекция клеток.

Активация сигнальных путей.

Определение транскрипционной активности белков.

Генетические методы.

Работа с дрожжами.

Иммуноокрашивание.

Иммуноокрашивание S2 клеток.

Иммуноокрашивание политенных хромосом.

Иммуноокрашивание яичников.

Хроматин-иммунопреципитация (ChIP).

РЕЗУЛЬТАТЫ.

I. Разработка метода очистки белковых комплексов на примере комплексов, содержащих фактор ENY2.

II. Выделение и характеристика белкового комплекса BTFly, содержащего SAYP.

11.1. Очистка SAYP-содержащего комплекса.

11.2. Коиммунопреципитация компонентов BTFly.

11.3. Определение домена белка SAYP, отвечающего за его способность активировать транскрипцию.

11.4. Поиск коактиваторов, обеспечивающих активацию репортерного гена доменом SAY.

11.5. Определение белков-партнеров SAYP в составе BTFly.

11.6. Привлечение BTFly на промоторы генов.

11.7. SAYP, Brahma и TFIID совместно локализуются во многих локусах.

11.8. SAYP, Brahma и TFIID взаимодействуют в развитии.

11.9. Структура BTFly и его функциональные особенности.

III. Участие коактиватора SAYP и комплекса BTFly в активации генов экдизонового пути.

III. 1. SAYP взаимодействует с ядерным рецептором DHR3.

111.2. SAYP и DHR3 имеют сходный профиль экспрессии, совместно локализуются в геноме, и взаимодействуют в развитии.

111.3. DHR3 активирует гены посредством взаимодействия с BTFly.

IV. Участие коактиватора SAYP и комплекса BTFly в активации генов сигнального пути Jak/Stat.

IV. 1. Фенотипические проявления мутации е(у)Зи| сходны с проявлениями мутации Jak/Stat пути.

IV.2. SAYP взаимодействует с фактором STAT.

IV.3. SAYP и STAT совместно регулируют экспрессию генов.

IV.4. BTFly привлекается на STAT-зависимые гены.

V. Новый механизм активации транскрипции генов.

Новый механизм активации транскрипции.

Использование найденного механизма в геноме.

Ядерные суперкомплексы.

ВЫВОДЫ.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизм действия белкового суперкомплекса, содержащего фактор транскрипции SAYP"

Экспрессия генов - фундаментальный процесс, лежащий в основе жизнедеятельности организма. Изучение механизмов регуляции активности генов -важнейшая задача как для фундаментальных, так и прикладных исследований.

В работе изучался механизм действия фактора транскрипции высших эукариот БАУР. Гомологи ЭАУР найдены у всех многоклеточных животных, они являются незаменимыми в развитии. Было обнаружено, что БАУР координирует два этапа экспрессии генов посредством нового механизма. Также выяснена роль этого механизма в работе некоторых сигнальных путей.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. Транскрипция у эукариот. Инициация транскрипции. РНК-полимеразы.

Реализация наследственной информации клетки начинается со стадии транскрипции. Этот первый этап является наиболее подверженным регуляции среди всех стадий экспрессии гена. Основными факторами, участвующими на этой стадии, являются ДНК-зависимые РНК-полимеразы. Они осуществляют свои функции при участии многочисленных факторов транскрипции. Факторы транскрипции взаимодействуют с регуляторными последовательностями ДНК, друг с другом, а также с другими факторами клетки. В результате формируется достаточно сложная сеть молекулярных взаимодействий, контролирующих работу генов клетки.

Первый этап транскрипции - ее инициация, т.е. привлечение факторов транскрипции к регуляторным последовательностям и посадка РНК-полимеразы не промотор гена. Общая схема инициации транскрипции такова. Ген-специфические регуляторы транскрипции (активаторы и репрессоры) привлекаются на определенные регуляторные сайты ДНК, что стимулирует сборку т.н. преинициаторного комплекса на промоторе гена. Последний состоит из общих факторов транскрипции и содержит молекулу РНК-полимеразы. Такая транскрипция называется активированной (индуцированной). Другой тип - базальная транскрипция - осуществляется без участия активаторов при участии только полимеразы и общих факторов транскрипции. Уровень базальной транскрипции обычно значительно ниже активированной (1,2).

РНК-полимеразы эукариот являются достаточно сложными белковыми комплексами, состоящими из множества субъединиц. Сложное строение позволяет точно контролировать их работу посредством взаимодействия с многочисленными факторами транскрипции. Это, в свою очередь, позволяет очень тонко регулировать активность генов.

Важная особенность эукариот - существование нескольких типов РНК-полимераз, каждая из которых контролирует определенный круг генов-мишеней. У эукариот выделяют три основные формы РНК-полимераз. РНК-полимераза I транскрибирует гены рРНК, осуществляя синтез предшественников 18S, 28S и 5,8S рРНК. РНК-полимераза III осуществляет транскрипцию генов тРНК, 5S и некоторых малых ядерных РНК. Гены, кодирующие белки, а также ряд генов малых ядерных РНК транскрибируются РНК-полимеразой II. Указанные формы полимераз могут быть разделены с помощью ионообменной хроматографии на носителе DEAE. Кроме того, они отличаются по чувствительности к действию пептида а-аманитина, который блокирует их работу. Полимераза I нечувствительна, полимераза II очень чувствительна (активность ингибируется на 50% при концентрации пептида 0,02 мкг/мл), а полимераза III обладает промежуточной чувствительностью к этому пептиду (50% потеря активности при концентрации 20 мкг/мл) (3).

Полимеразы сходны по своей структуре и представляют собой белковые комплексы, состоящие из двух больших (120-220 кДа) и 10-14 малых (10-100 кДа) субъединиц (1,4).

У растений также описана РНК-полимераза IV, вовлеченная в РНК-зависимое метилирование и сайленсинг (3). У человека также описана ядерная РНК-полимераза, состоящая из одного белка, и транскрибирующая гены мРНК (5).

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Шидловский, Юлий Валерьевич

выводы

3. Показано, что объединение Brahma и TFIID в BTFly осуществляет транскрипционный коактиватор SAYP посредством консервативного домена SAY. Последний непосредственно взаимодействует с субъединицей Brahma В АР 170 и с доменом WD-40 субъединицы TAF5 комплекса TFIID.

БЛАГОДАРНОСТИ

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Шидловский, Юлий Валерьевич, Москва

1. Патрушев, Л.И. (2000) Экспрессия генов. Наука, Москва.

2. Carey, М. (1998) The enhanceosome and transcriptional synergy. Cell, 92, 5-8.

3. Thomas, M.C. and Chiang, C.M. (2006) The general transcription machinery and general cofactors. Critical reviews in biochemistry and molecular biology, 41, 105178.

4. Lodish, H., Berk, A., Matsudaira, P., Kaiser, C.A., Krieger, M., Scott, M.P., Zipursky, L. and Darnell, J.E., Jr. (2003) Molecular Cell Biology. W.H.Freeman & Co.

5. Kravchenko, J.E., Rogozin, I.B., Koonin, E.V. and Chumakov, P.M. (2005) Transcription of mammalian messenger RNAs by a nuclear RNA polymerase of mitochondrial origin. Nature, 436, 735-739.

6. Juven-Gershon, T. and Kadonaga, J.T. (2010) Regulation of gene expression via the core promoter and the basal transcriptional machinery. Developmental biology, 339, 225-229.

7. Smale, S.T. and Kadonaga, J.T. (2003) The RNA polymerase II core promoter. Annu Rev Biochem, 72,449-479.

8. Woychik, N.A. and Hampsey, M. (2002) The RNA polymerase II machinery: structure illuminates function. Cell, 108,453-463.

9. Verrijzer, C.P., Chen, J.L., Yokomori, K. and Tjian, R. (1995) Binding of TAFs to core elements directs promoter selectivity by RNA polymerase II. Cell, 81, 11151125.

10. Ohler, U., Liao, G.C., Niemann, H. and Rubin, G.M. (2002) Computational analysis of core promoters in the Drosophila genome. Genome Biol, 3, RESEARCH0087.

11. Lee, D.H., Gershenzon, N., Gupta, M., Ioshikhes, I.P., Reinberg, D. and Lewis, B.A. (2005) Functional characterization of core promoter elements: the downstream core element is recognized by TAF1. Molecular and cellular biology, 25, 9674-9686.

12. Lim, C.Y., Santoso, B., Boulay, T., Dong, E., Ohler, U. and Kadonaga, J.T. (2004) The MTE, a new core promoter element for transcription by RNA polymerase II. Genes & development, 18,1606-1617.

13. Gershenzon, N.I., Trifonov, E.N. and Ioshikhes, I.P. (2006) The features of Drosophila core promoters revealed by statistical analysis. BMC genomics, 7,161.

14. Ohler, U. (2006) Identification of core promoter modules in Drosophila and their application in accurate transcription start site prediction. Nucleic acids research, 34, 5943-5950.

15. Carey, M. and Smale, S.T. (2000) Transcriptional regulation in eucariotes. CSHL Press, New York.

16. Green, M.R. (2000) TBP-associated factors (TAFIIs): multiple, selective transcriptional mediators in common complexes. Trends in biochemical sciences, 25, 59-63.

17. Cang, Y. and Prelich, G. (2002) Direct stimulation of transcription by negative cofactor 2 (NC2) through TATA-binding protein (TBP). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 99, 12727-12732.

18. Lewis, B.A., Sims, R.J., 3rd, Lane, W.S. and Reinberg, D. (2005) Functional characterization of core promoter elements: DPE-specific transcription requires the protein kinase CK2 and the PC4 coactivator. Molecular cell, 18, 471-481.

19. Martinez, E., Ge, H., Tao, Y., Yuan, C.X., Palhan, V. and Roeder, R.G. (1998) Novel cofactors and TFIIA mediate functional core promoter selectivity by the human TAFII150-containing TFIID complex. Molecular and cellular biology, 18, 6571-6583.

20. Burke, T.W. and Kadonaga, J.T. (1996) Drosophila TFIID binds to a conserved downstream basal promoter element that is present in many TATA-box-deficient promoters. Genes & development, 10, 711-724.

21. Emami, K.H., Jain, A. and Smale, S.T. (1997) Mechanism of synergy between TATA and initiator: synergistic binding of TFIID following a putative TFIIA-induced isomerization. Genes & development, 11, 3007-3019.

22. George, C.P., Lira-DeVito, L.M., Wampler, S.L. and Kadonaga, J.T. (1995) A spectrum of mechanisms for the assembly of the RNA polymerase II transcription preinitiation complex. Molecular and cellular biology, 15,1049-1059.

23. Levine, M. and Tjian, R. (2003) Transcription regulation and animal diversity. Nature, 424,147-151.

24. Ayoubi, T.A. and Van De Ven, W.J. (1996) Regulation of gene expression by alternative promoters. FASEBJ, 10,453-460.

25. Gaszner, M. and Felsenfeld, G. (2006) Insulators: exploiting transcriptional and epigenetic mechanisms. Nature reviews. Genetics, 7, 703-713.

26. Valenzuela, L. and Kamakaka, R.T. (2006) Chromatin insulators. Annual review of genetics, 40,107-138.

27. Amouyal, M. (2010) Gene insulation. Part II: natural strategies in vertebrates. Biochemistry and cell biology = Biochimie et biologic cellulaire, 88, 885-898.

28. Amouyal, M. (2010) Gene insulation. Part I: natural strategies in yeast and Drosophila. Biochemistry and cell biology Biochimie et biologie cellulaire, 88, 875884.

29. Oki, M., Valenzuela, L., Chiba, T., Ito, T. and Kamakaka, R.T. (2004) Barrier proteins remodel and modify chromatin to restrict silenced domains. Molecular and cellular biology, 24, 1956-1967.

30. Fourel, G., Magdinier, F. and Gilson, E. (2004) Insulator dynamics and the setting of chromatin domains. Bioessays, 26, 523-532.

31. Жимулев, И.Ф. and Беляева, E.C. (2003) Гетерохроматин, эффект положения гена и сайленсинг гена. Генетика, 39, 187-201.

32. Narlikar, G.J., Fan, H.Y. and Kingston, R.E. (2002) Cooperation between complexes that regulate chromatin structure and transcription. Cell, 108,475-487.

33. Grunstein, M. (1992) Histones as regulators of genes. SciAm, 267, 68-74B.

34. Naar, A.M., Lemon, B.D. and Tjian, R. (2001) Transcriptional coactivator complexes. Annu Rev Biochem, 70,475-501.

35. Cosma, M.P. (2002) Ordered recruitment: gene-specific mechanism of transcription activation. Molecular cell, 10, 227-236.

36. Morse, R.H. (2007) Transcription factor access to promoter elements. Journal of cellular biochemistry, 102, 560-570.

37. Mason, P.B. and Struhl, K. (2003) The FACT complex travels with elongating RNA polymerase II and is important for the fidelity of transcriptional initiation in vivo. Molecular and cellular biology, 23, 8323-8333.

38. Alvarez, M., Rhodes, S.J. and Bidwell, J.P. (2003) Context-dependent transcription: all politics is local. Gene, 313,43-57.

39. Tupler, R., Perini, G. and Green, M.R. (2001) Expressing the human genome. Nature, 409, 832-833.

40. Lemon, B. and Tjian, R. (2000) Orchestrated response: a symphony of transcription factors for gene control. Genes & development, 14, 2551-2569.

41. Nedialkov, Y.A. and Triezenberg, S.J. (2004) Quantitative assessment of in vitro interactions implicates TATA-binding protein as a target of the VP16C transcriptional activation region. Arch Biochem Biophys, 425, 77-86.

42. Kadonaga, J.T. (2004) Regulation of RNA polymerase II transcription by sequence-specific DNA binding factors. Cell, 116,247-257.

43. Veenstra, G.J. and Wolffe, A.P. (2001) Gene-selective developmental roles of general transcription factors. Trends in biochemical sciences, 26, 665-671.

44. Orphanides, G. and Reinberg, D. (2002) A unified theory of gene expression. Cell, 108,439-451.

45. Orphanides, G., Lagrange, T. and Reinberg, D. (1996) The general transcription factors of RNA polymerase II. Genes & development, 10, 2657-2683.

46. Roeder, R.G. (1996) The role of general initiation factors in transcription by RNA polymerase II. Trends in biochemical sciences, 21, 327-335.

47. Chapman, R.D., Heidemann, M., Albert, T.K., Mailhammer, R., Flatley, A., Meisterernst, M., Kremmer, E. and Eick, D. (2007) Transcribing RNA polymerase II is phosphorylated at CTD residue serine-7. Science, 318, 1780-1782.

48. Egloff, S., O'Reilly, D., Chapman, R.D., Taylor, A., Tanzhaus, K., Pitts, L., Eick, D. and Murphy, S. (2007) Serine-7 of the RNA polymerase II CTD is specifically required for snRNA gene expression. Science, 318, 1777-1779.

49. Xu, Y.X. and Manley, J.L. (2007) Pinl modulates RNA polymerase II activity during the transcription cycle. Genes & development, 21, 2950-2962.

50. Nikolov, D.B. and Burley, S.K. (1997) RNA polymerase II transcription initiation: a structural view. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 94,15-22.

51. Mitsiou, D.J. and Stunnenberg, H.G. (2003) p300 is involved in formation of the TBP-TFIIA-containing basal transcription complex, TAC. The EMBO journal, 22, 45014511.

52. Johnson, S.A., Dubeau, L., White, R.J. and Johnson, D.L. (2003) The TATA-binding protein as a regulator of cellular transformation. Cell Cycle, 2, 442-444.

53. Muller, F. and Tora, L. (2004) The multicoloured world of promoter recognition complexes. The EMBO journal, 23, 2-8.

54. Pugh, B.F. (2000) Control of gene expression through regulation of the TATA-binding protein. Gene, 255,1-14.

55. Xing, H., Vanderford, N.L. and Sarge, K.D. (2008) The TBP-PP2A mitotic complex bookmarks genes by preventing condensin action. Nature cell biology, 10, 1318-1323.

56. Jacobi, U.G., Akkers, R.C., Pierson, E.S., Weeks, D.L., Dagle, J.M. and Veenstra, G.J. (2007) TBP paralogs accommodate metazoan- and vertebrate-specific developmental gene regulation. The EMBO journal, 26, 3900-3909.

57. Kouskouti, A., Scheer, E., Staub, A., Tora, L. and Talianidis, I. (2004) Gene-specific modulation of TAF10 function by SET9-mediated methylation. Molecular cell, 14, 175-182.

58. Demeny, M.A., Soutoglou, E., Nagy, Z., Scheer, E., Janoshazi, A., Richardot, M., Argentini, M., Kessler, P. and Tora, L. (2007) Identification of a small TAF complex and its role in the assembly of TAF-containing complexes. PloS one, 2, e316.

59. Sanders, S.L., Garbett, K.A. and Weil, P.A. (2002) Molecular characterization of Saccharomyces cerevisiae TFIID. Molecular and cellular biology, 22, 6000-6013.

60. Leurent, C., Sanders, S.L., Demeny, M.A., Garbett, K.A., Ruhlmann, C., Weil, P.A., Tora, L. and Schultz, P. (2004) Mapping key functional sites within yeast TFIID. The EMBO journal, 23, 719-727.

61. Grob, P., Cruse, M.J., Inouye, C., Peris, M., Penczek, P.A., Tjian, R. and Nogales, E.2006) Cryo-electron microscopy studies of human TFIID: conformational breathing in the integration of gene regulatory cues. Structure, 14, 511-520.

62. Deato, M.D. and Tjian, R. (2007) Switching of the core transcription machinery during myogenesis. Genes & development, 21, 2137-2149.

63. Verrijzer, C.P. and Tjian, R. (1996) TAFs mediate transcriptional activation and promoter selectivity. Trends in biochemical sciences, 21, 338-342.

64. Chen, B.S. and Hampsey, M. (2002) Transcription activation: unveiling the essential nature of TFIID. Current biology: CB, 12, R620-622.

65. Wassarman, D.A., Aoyagi, N., Pile, L.A. and Schlag, E.M. (2000) TAF250 is required for multiple developmental events in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 97, 1154-1159.

66. Bhattacharya, S., Takada, S. and Jacobson, R.H. (2007) Structural analysis and dimerization potential of the human TAF5 subunit of TFIID. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Stales of America, 104, 1189-1194.

67. Svejstrup, J.Q., Vichi, P. and Egly, J.M. (1996) The multiple roles of transcription/repair factor TFIIH. Trends in biochemical sciences, 21, 346-350.

68. Zurita, M. and Merino, C. (2003) The transcriptional complexity of the TFIIH complex. Trends Genet, 19, 578-584.

69. Bushmeyer, S., Park, K. and Atchison, M.L. (1995) Characterization of functional domains within the multifunctional transcription factor, YY1. The Journal of biological chemistry, 270, 30213-30220.

70. Majello, B., De Luca, P. and Lania, L. (1997) Sp3 is a bifunctional transcription regulator with modular independent activation and repression domains. The Journal of biological chemistry, 212,4021-4026.

71. Sauer, F., Fondell, J.D., Ohkuma, Y., Roeder, R.G. and Jackie, H. (1995) Control of transcription by Kruppel through interactions with TFIIB and TFIIE beta. Nature, 375, 162-164.

72. Kaiser, K. and Meisterernst, M. (1996) The human general co-factors. Trends in biochemical sciences, 21, 342-345.

73. Maldonado, E., Hampsey, M. and Reinberg, D. (1999) Repression: targeting the heart of the matter. Cell, 99,455-458.

74. Anderson, M.G., Scoggin, K.E., Simbulan-Rosenthal, C.M. and Steadman, J.A. (2000) Identification of poly(ADP-ribose) polymerase as a transcriptional coactivator of the human T-cell leukemia virus type 1 Tax protein. J Virol, 74, 2169-2177.

75. Ge, H. and Roeder, R.G. (1994) Purification, cloning, and characterization of a human coactivator, PC4, that mediates transcriptional activation of class II genes. Cell, 78, 513-523.

76. Halle, J.P., Stelzer, G., Goppelt, A. and Meisterernst, M. (1995) Activation of transcription by recombinant upstream stimulatory factor 1 is mediated by a novel positive cofactor. The Journal of biological chemistry, 270, 21307-21311.

77. Chiang, C.M, Ge, H., Wang, Z„ Hoffmann, A. and Roeder, R.G. (1993) Unique TATA-binding protein-containing complexes and cofactors involved in transcription by RNA polymerases II and III. The EMBO journal, 12, 2749-2762.

78. Malik, S., Gu, W., Wu, W., Qin, J. and Roeder, R.G. (2000) The USA-derived transcriptional coactivator PC2 is a submodule of TRAP/SMCC and acts synergistically with other PCs. Molecular cell, 5, 753-760.

79. Lewis, B.A. and Reinberg, D. (2003) The mediator coactivator complex: functional and physical roles in transcriptional regulation. J Cell Sci, 116, 3667-3675.

80. Malik, S. and Roeder, R.G. (2000) Transcriptional regulation through Mediator-like coactivators in yeast and metazoan cells. Trends in biochemical sciences, 25, 277-283.

81. Borggrefe, T., Davis, R., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P. and Kornberg, R.D. (2002) A complex of the Srb8, -9, -10, and -11 transcriptional regulatory proteins from yeast. The Journal of biological chemistry, 277, 44202-44207.

82. Myers, L.C., Gustafsson, C.M., Bushnell, D.A., Lui, M., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P. and Kornberg, R.D. (1998) The Med proteins of yeast and their function through the RNA polymerase II carboxy-terminal domain. Genes & development, 12, 45-54.

83. Taatjes, D.J., Naar, A.M., Andel, F.r., Nogales, E. and Tjian, R. (2002) Structure, function, and activator-induced conformations of the CRSP coactivator. Science, 295, 1058-1062.

84. Boube, M., Faucher, C., Joulia, L., Cribbs, D.L. and Bourbon, H.M. (2000) Drosophila homologs of transcriptional mediator complex subunits are required for adult cell and segment identity specification. Genes & development, 14, 2906-2917.

85. Gu, J.Y., Park, J.M., Song, E.J., Mizuguchi, G., Yoon, J.H., Kim-Ha, J., Lee, K.J. and Kim, Y.J. (2002) Novel Mediator proteins of the small Mediator complex in Drosophila SL2 cells. The Journal of biological chemistry, 277,27154-27161.

86. Asturias, F.J., Jiang, Y.W., Myers, L.C., Gustafsson, C.M. and Kornberg, R.D. (1999) Conserved structures of mediator and RNA polymerase II holoenzyme. Science, 283, 985-987.

87. Boube, M., Joulia, L., Cribbs, D.L. and Bourbon, H.M. (2002) Evidence for a mediator of RNA polymerase II transcriptional regulation conserved from yeast to man. Cell, 110, 143-151.

88. Baek, H.J., Malik, S., Qin, J. and Roeder, R.G. (2002) Requirement of TRAP/mediator for both activator-independent and activator-dependent transcription in conjunction with TFIID-associated TAF(II)s. Molecular and cellular biology, 22, 2842-2852.

89. Gustafsson, C.M. and Samuelsson, T. (2001) Mediator-a universal complex in transcriptional regulation. Mol Microbiol, 41, 1-8.

90. Becker, P.B. and Horz, W. (2002) ATP-dependent nucleosome remodeling. Annu Rev Biochem, 71,247-273.

91. Mohrmann, L. and Verrijzer, C.P. (2005) Composition and functional specificity of SWI2/SNF2 class chromatin remodeling complexes. Biochimica et biophysica acta, 1681, 59-73.

92. Holstege, F.C., Jennings, E.G., Wyrick, J.J., Lee, T.I., Hengartner, C.J., Green, M.R., Golub, T.R., Lander, E.S. and Young, R.A. (1998) Dissecting the regulatory circuitry of a eukaryotic genome. Cell, 95, 717-728.

93. Tsukiyama, T. (2002) The in vivo functions of ATP-dependent chromatin-remodelling factors. Nature reviews. Molecular cell biology, 3, 422-429.

94. Dimova, D., Nackerdien, Z., Furgeson, S., Eguchi, S. and Osley, M.A. (1999) A role for transcriptional repressors in targeting the yeast Swi/Snf complex. Molecular cell, 4, 75-83.

95. Vignali, M., Hassan, A.H., Neely, K.E. and Workman, J.L. (2000) ATP-dependent chromatin-remodeling complexes. Molecular and cellular biology, 20, 1899-1910.

96. Armstrong, J.A., Papoulas, O., Daubresse, G., Sperling, A.S., Lis, J.T., Scott, M.P. and Tamkun, J.W. (2002) The Drosophila BRM complex facilitates global transcription by RNA polymerase II. The EMBO journal, 21, 5245-5254.

97. Kennison, J.A. and Tamkun, J.W. (1988) Dosage-dependent modifiers of polycomb and antennapedia mutations in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 85, 8136-8140.

98. Kai, A.J., Mahmoudi, T., Zak, N.B. and Verrijzer, C.P. (2000) The Drosophila brahma complex is an essential coactivator for the trithorax group protein zeste. Genes & development, 14, 1058-1071.

99. Collins, R.T., Treisman, J. E. (2000) Osa-containing Brahma chromatin remodeling complexes are required for the repression of wingless target genes. Genes Dev, 14(24), 3140-3152.

100. Marenda, D.R., C. B. Zraly, et al. . (2004) The Drosophila Brahma (SWI/SNF) chromatin remodeling complex exhibits cell-type specific activation and repression functions. Dev Biol 267(2), 279-293.

101. Carrera, I., Zavadil, J. and Treisman, J.E. (2008) Two subunits specific to the PBAP chromatin remodeling complex have distinct and redundant functions during drosophila development. Molecular and cellular biology, 28, 5238-5250.

102. Bultman, S.J., Gebuhr, T.C., Pan, H., Svoboda, P., Schultz, R.M. and Magnuson, T. (2006) Maternal BRG1 regulates zygotic genome activation in the mouse. Genes & development, 20,1744-1754.

103. Trotter, K.W. and Archer, T.K. (2008) The BRG1 transcriptional coregulator. Nuclear receptor signaling, 6, e004.

104. Ryme, J., Asp, P., Böhm, S., Cavellan, E. and Farrants, A.K. (2009) Variations in the composition of mammalian SWI/SNF chromatin remodelling complexes. Journal of cellular biochemistry, 108, 565-576.

105. Moshkin, Y.M., Mohrmann, L., van Ijcken, W.F. and Verrijzer, C.P. (2007) Functional differentiation of SWI/SNF remodelers in transcription and cell cycle control. Molecular and cellular biology, 27, 651-661.

106. Kasten, M.M., Ciapier, C.R. and Cairns, B.R. (2011) SnapShot: Chromatin remodeling: SWI/SNF. Cell, 144,310 e311.

107. Corona, D.F. and Tamkun, J.W. (2004) Multiple roles for ISWI in transcription, chromosome organization and DNA replication. Biochimica et biophysica acta, 1677, 113-119.

108. Lusser, A. and Kadonaga, J.T. (2003) Chromatin remodeling by ATP-dependent molecular machines. Bioessays, 25,1192-1200.

109. Kouzarides, T. (2003) Wellcome Trust Award Lecture. Chromatin-modifying enzymes in transcription and cancer. Biochemical Society transactions, 31, 741-743.

110. Jenuwein, T. and Allis, C.D. (2001) Translating the histone code. Science, 293, 10741080.

111. Bannister, A.J., Zegerman, P., Partridge, J.F., Miska, E.A., Thomas, J.O., Allshire, R.C. and Kouzarides, T. (2001) Selective recognition of methylated lysine 9 on histone H3 by the HP1 chromo domain. Nature, 410,120-124.

112. Champagne, K.S. and Kutateladze, T.G. (2009) Structural insight into histone recognition by the ING PHD fingers. Curr Drug Targets, 10,432-441.

113. Clayton, A.L., Rose, S., Barratt, M.J. and Mahadevan, L.C. (2000) Phosphoacetylation of histone H3 on c-fos- and c-jun-associated nucleosomes upon gene activation. The EMBO journal, 19, 3714-3726.

114. Kim, J., Daniel, J., Espejo, A., Lake, A., Krishna, M., Xia, L., Zhang, Y. and Bedford, M.T. (2006) Tudor, МВТ and chromo domains gauge the degree of lysine methylation. EMBO reports, 7, 397-403.

115. Mujtaba, S., Zeng, L. and Zhou, M.M. (2007) Structure and acetyl-lysine recognition of the bromodomain. Oncogene, 26, 5521-5527.

116. Stucki, M., Clapperton, J.A., Mohammad, D., Yaffe, M.B., Smerdon, S.J. and Jackson, S.P. (2005) MDC1 directly binds phosphorylated histone H2AX to regulate cellular responses to DNA double-strand breaks. Cell, 123,1213-1226.

117. Shi, X., Hong, T., Walter, K.L., Ewalt, M., Michishita, E., Hung, T., Carney, D., Pena, P., Lan, F., Kaadige, M.R. et al. (2006) ING2 PHD domain links histone H3 lysine 4 methylation to active gene repression. Nature, 442, 96-99.

118. Ng, S.S., Yue, W.W., Oppermann, U. and Klose, R.J. (2009) Dynamic protein methylation in chromatin biology. Cell Mol Life Sci, 66,407-422.

119. Bannister, A.J. and Kouzarides, T. (2011) Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Res, 21,381-395.

120. Berger, S.L. (2002) Histone modifications in transcriptional regulation. Current opinion in genetics & development, 12,142-148.

121. Oki, M., Aihara, H. and Ito, T. (2007) Role of histone phosphorylation in chromatin dynamics and its implications in diseases. Subcell Biochem, 41, 319-336.

122. Featherstone, M. (2002) Coactivators in transcription initiation: here are your orders. Current opinion in genetics & development, 12,149-155.

123. Maile, T., Kwoczynski, S., Katzenberger, R.J., Wassarman, D.A. and Sauer, F. (2004) TAF1 activates transcription by phosphorylation of serine 33 in histone H2B. Science, 304,1010-1014.

124. Zhang, Y. (2003) Transcriptional regulation by histone ubiquitination and deubiquitination. Genes & development, 17, 2733-2740.

125. Wang, H., Wang, L., Erdjument-Bromage, H., Vidal, M., Tempst, P., Jones, R.S. and Zhang, Y. (2004) Role of histone H2A ubiquitination in Polycomb silencing. Nature, 431, 873-878.

126. Jason, L.J., Moore, S.C., Lewis, J.D., Lindsey, G. and Ausio, J. (2002) Histone ubiquitination: a tagging tail unfolds? Bioessays, 24, 166-174.

127. Seeler, J.S. and Dejean, A. (2003) Nuclear and unclear functions of SUMO. Nature reviews. Molecular cell biology, 4, 690-699.

128. Rouleau, M., Aubin, R.A. and Poirier, G.G. (2004) Poly(ADP-ribosyl)ated chromatin domains: access granted. JCellSci, 117, 815-825.

129. Hassa, P.O., Haenni, S.S., Elser, M. and Hottiger, M.O. (2006) Nuclear ADP-ribosylation reactions in mammalian cells: where are we today and where are we going? Microbiol Mol Biol Rev, 70, 789-829.

130. Krishnakumar, R. and Kraus, W.L. (2010) PARP-1 regulates chromatin structure and transcription through a KDM5B-dependent pathway. Molecular cell, 39,736-749.

131. Dion, M.F., Altschuler, S.J., Wu, L.F. and Rando, O.J. (2005) Genomic characterization reveals a simple histone H4 acetylation code. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 102, 5501-5506.

132. Kurdistani, S.K., Tavazoie, S. and Grunstein, M. (2004) Mapping global histone acetylation patterns to gene expression. Cell, 117, 721-733.

133. Eberharter, A. and Becker, P.B. (2002) Histone acetylation: a switch between repressive and permissive chromatin. Second in review series on chromatin dynamics. EMBO reports, 3, 224-229.

134. Yamagoe, S., Kanno, T., Kanno, Y., Sasaki, S., Siegel, R.M., Lenardo, M.J., Humphrey, G., Wang, Y., Nakatani, Y., Howard, B.H. et al. (2003) Interaction of histone acetylases and deacetylases in vivo. Molecular and cellular biology, 23, 10251033.

135. Trojer, P. and Reinberg, D. (2007) Facultative heterochromatin: is there a distinctive molecular signature? Mol Cell, 28, 1-13.

136. Hon, G.C., Hawkins, R.D. and Ren, B. (2009) Predictive chromatin signatures in the mammalian genome. Hum Mol Genet, 18, R195-201.

137. Barski, A., Cuddapah, S., Cui, K., Roh, T.Y., Schönes, D.E., Wang, Z., Wei, G., Chepelev, I. and Zhao, K. (2007) High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell, 129, 823-837.

138. Bannister, A.J., Schneider, R., Myers, F.A., Thorne, A.W., Crane-Robinson, C. and Kouzarides, T. (2005) Spatial distribution of di- and tri-methyl lysine 36 of histone H3 at active genes. The Journal of biological chemistry, 280,17732-17736.

139. Ng, H.H., Robert, F., Young, R.A. and Struhl, K. (2003) Targeted recruitment of Setl histone methylase by elongating Pol II provides a localized mark and memory of recent transcriptional activity. Molecular cell, 11, 709-719.

140. Xiao, T., Hall, H., Kizer, K.O., Shibata, Y., Hall, M.C., Borchers, C.H. and Strahl, B.D. (2003) Phosphorylation of RNA polymerase II CTD regulates H3 methylation in yeast. Genes & development, 17, 654-663.

141. Doyen, C.M., Montel, F., Gautier, T., Menoni, H., Claudet, C., Delacour-Larose, M., Angelov, D., Hamiche, A., Bednar, J., Faivre- Moskalenko, C., et al. (2006)

142. Dissection of the unusual structural and functional properties of the variant H2A.Bbd nucleosome. EMBOJ., 18, 4234-4444.

143. Henikoff, S., and Ahmad, K. . (2005) Assembly of variant histones into chromatin. Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 21, 133-153.

144. Park, Y.J., Chodaparambil, J.V, Bao, Y., McBryant, S.J., and Luger, K. (2005) Nucleosome assembly protein 1 exchanges histone H2A-H2B dimers and assists nucleosome sliding. J. Biol. Chem. , 280, 1817- 1825.

145. Sterner, D.E. and Berger, S.L. (2000) Acetylation of histones and transcription-related factors. Microbiol Mol Biol Rev, 64,435-459.

146. Nagy, Z. and Tora, L. (2007) Distinct GCN5/PCAF-containing complexes function as co-activators and are involved in transcription factor and global histone acetylation. Oncogene, 26, 5341-5357.

147. Yang, X.J. and Seto, E. (2007) HATs and HDACs: from structure, function and regulation to novel strategies for therapy and prevention. Oncogene, 26, 5310-5318.

148. Suganuma, T, Gutierrez, J.L, Li, B., Florens, L., Swanson, S.K, Washburn, M.P, Abmayr, S.M. and Workman, J.L. (2008) AT AC is a double histone acetyltransferase complex that stimulates nucleosome sliding. Nat Struct Mol Biol, 15, 364-372.i

149. Koutelou, E., Hirsch, C.L. and Dent, S.Y. (2010) Multiple faces of the SAGA complex. Curr Opin Cell Biol, 22, 374-382.

150. Huisinga, K.L. and Pugh, B.F. (2004) A genome-wide housekeeping role for TFIID and a highly regulated stress-related role for SAGA in Saccharomyces cerevisiae. Molecular cell, 13, 573-585.

151. Kurdistani, S.K. and Grunstein, M. (2003) Histone acetylation and deacetylation in yeast. Nature reviews. Molecular cell biology, 4, 276-284.

152. Thiagalingam, S., Cheng, K.H., Lee, H.J., Mineva, N., Thiagalingam, A. and Ponte, J.F. (2003) Histone deacetylases: unique players in shaping the epigenetic histone code. Ann N YAcadSci, 983, 84-100.

153. DiRenzo, J., Shang, Y., Phelan, M., Sif, S., Myers, M., Kingston, R. and Brown, M. (2000) BRG-1 is recruited to estrogen-responsive promoters and cooperates with factors involved in histone acetylation. Molecular and cellular biology, 20, 75417549.

154. Syntichaki, P., Topalidou, I. and Thireos, G. (2000) The Gcn5 bromodomain coordinates nucleosome remodelling. Nature, 404,414-417.

155. Chandy, M., Gutierrez, J.L., Prochasson, P. and Workman, J.L. (2006) SWI/SNF displaces SAGA-acetylated nucleosomes. Eukaryotic cell, 5, 1738-1747.

156. Kim, J.H., Saraf, A., Florens, L., Washburn, M. and Workman, J.L. (2010) Gcn5 regulates the dissociation of SWI/SNF from chromatin by acetylation of Swi2/Snf2. Genes & development, 24,2766-2771.

157. Fuda, N.J., Ardehali, M.B. and Lis, J.T. (2009) Defining mechanisms that regulate RNA polymerase II transcription in vivo. Nature, 461, 186-192.

158. Asturias, F.J. (2004) RNA polymerase II structure, and organization of the preinitiation complex. Curr Opin Struct Biol, 14, 121-129.

159. Svejstrup, J.Q. (2004) The RNA polymerase II transcription cycle: cycling through chromatin. Biochimica et biophysica acta, 1677, 64-73.

160. Venters, B.J. and Pugh, B.F. (2009) How eukaryotic genes are transcribed. Critical reviews in biochemistry and molecular biology, 44, 117-141.

161. Johnson, K.M., Wang, J., Smallwood, A., Arayata, C. and Carey, M. (2002) TFIID and human mediator coactivator complexes assemble cooperatively on promoter DNA. Genes & development, 16, 1852-1863.

162. Black, J.C., Choi, J.E., Lombardo, S.R. and Carey, M. (2006) A mechanism for coordinating chromatin modification and preinitiation complex assembly. Molecular cell, 23, 809-818.

163. Marr, M.T., 2nd, Isogai, Y., Wright, K.J. and Tjian, R. (2006) Coactivator cross-talk specifies transcriptional output. Genes & development, 20, 1458-1469.

164. Matangkasombut, O., Auty, R. and Buratowski, S. (2004) Structure and function of the TFIID complex. Advances in protein chemistry, 67, 67-92.

165. Liu, X., Vorontchikhina, M., Wang, Y.L., Faiola, F. and Martinez, E. (2008) STAGA recruits Mediator to the MYC oncoprotein to stimulate transcription and cell proliferation. Molecular and cellular biology, 28, 108-121.

166. Kuras, L., Borggrefe, T. and Kornberg, R.D. (2003) Association of the Mediator complex with enhancers of active genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 100,13887-13891.

167. Ghosh, S. and Pugh, B.F. (2011) Sequential recruitment of SAGA and TFIID in a genomic response to DNA damage in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and cellular biology, 31,190-202.

168. Mitra, D., Parnell, E.J., Landon, J.W., Yu, Y. and Stillman, D.J. (2006) SWI/SNF binding to the HO promoter requires histone acetylation and stimulates TATA-binding protein recruitment. Molecular and cellular biology, 26, 4095-4110.

169. Sharma, V.M., Li, B. and Reese, J.C. (2003) SWI/SNF-dependent chromatin remodeling of RNR3 requires TAF(II)s and the general transcription machinery. Genes & development, 17, 502-515.

170. Emerson, B.M. (2002) Specificity of gene regulation. Cell, 109,267-270.

171. Perissi, V. and Rosenfeld, M.G. (2005) Controlling nuclear receptors: the circular logic of cofactor cycles. Nature reviews. Molecular cell biology, 6, 542-554.

172. Hassan, A.H., Neely, K.E., Vignali, M., Reese, J.C. and Workman, J.L. (2001) Promoter targeting of chromatin-modifying complexes. Front Biosci, 6, D1054-1064.

173. Yudkovsky, N., Ranish, J.A. and Hahn, S. (2000) A transcription reinitiation intermediate that is stabilized by activator. Nature, 408,225-229.

174. Kimura, H., Sugaya, K. and Cook, P.R. (2002) The transcription cycle of RNA polymerase II in living cells. The Journal of cell biology, 159, 777-782.

175. Metivier, R., Reid, G. and Gannon, F. (2006) Transcription in four dimensions: nuclear receptor-directed initiation of gene expression. EMBO reports, 7,161-167.

176. Maniatis, T. and Reed, R. (2002) An extensive network of coupling among gene expression machines. Nature, 416, 499-506.

177. Parvin, J.D. and Young, R.A. (1998) Regulatory targets in the RNA polymerase II holoenzyme. Current opinion in genetics & development, 8, 565-570.

178. Saurin, A.J., Shao, Z., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P. and Kingston, R.E. (2001) A Drosophila Polycomb group complex includes Zeste and dTAFII proteins. Nature, 412, 655-660.

179. Fraser, P. (2006) Transcriptional control thrown for a loop. Current opinion in genetics & development, 16,490-495.

180. Fraser, P. and Engel, J.D. (2006) Constricting restricted transcription: the (actively?) shrinking web. Genes & development, 20,1379-1383.

181. Vasiljeva, L., Kim, M., Mutschler, H., Buratowski, S. and Meinhart, A. (2008) The Nrdl-Nab3-Senl termination complex interacts with the Ser5-phosphorylated RNA polymerase II C-terminal domain. Nat Struct Mol Biol, 15, 795-804.

182. Hieb, A.R., Baran, S., Goodrich, J.A. and Kugel, J.F. (2006) An 8 nt RNA triggers a rate-limiting shift of RNA polymerase II complexes into elongation. The EMBO journal, 25,3100-3109.

183. Margaritis, T. and Holstege, F.C. (2008) Poised RNA polymerase II gives pause for thought. Cell, 133, 581-584.

184. Fujita, T. and Schlegel, W. (2010) Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: an opportunity to regulate gene transcription. Journal of receptor and signal transduction research, 30, 31-42.

185. Nechaev, S. and Adelman, K. (2011) Pol II waiting in the starting gates: Regulating the transition from transcription initiation into productive elongation. Biochimica et biophysica acta, 1809, 34-45.

186. Luna, R., Gaillard, H., Gonzalez-Aguilera, C. and Aguilera, A. (2008) Biogenesis of mRNPs: integrating different processes in the eukaryotic nucleus. Chromosoma, 117, 319-331.

187. Boettiger, A.N. and Levine, M. (2009) Synchronous and stochastic patterns of gene activation in the Drosophila embryo. Science, 325, 471-473.

188. Peterlin, B.M. and Price, D.H. (2006) Controlling the elongation phase of transcription with P-TEFb. Molecular cell, 23, 297-305.

189. Yamada, T., Yamaguchi, Y., Inukai, N., Okamoto, S., Mura, T. and Handa, H. (2006) P-TEFb-mediated phosphorylation of hSpt5 C-terminal repeats is critical for processive transcription elongation. Molecular cell, 21,227-237.

190. Sims, R.J.r., Belotserkovskaya, R. and Reinberg, D. (2004) Elongation by RNA polymerase II: the short and long of it. Genes & development, 18,2437-2468.

191. Ahn, S.H., Kim, M. and Buratowski, S. (2004) Phosphorylation of serine 2 within the RNA polymerase II C-terminal domain couples transcription and 3' end processing. Molecular cell, 13, 67-76.

192. Rosonina, E., Kaneko, S. and Manley, J.L. (2006) Terminating the transcript: breaking up is hard to do. Genes & development, 20, 1050-1056.

193. Krishnamurthy, S., He, X., Reyes-Reyes, M., Moore, C. and Hampsey, M. (2004) Ssu72 Is an RNA polymerase II CTD phosphatase. Molecular cell, 14, 387-394.

194. Bjork, P. and Wieslander, L. (2011) Nucleocytoplasmic mRNP export is an integral part of mRNP biogenesis. Chromosoma, 120,23-38.

195. Kohler, A. and Hurt, E. (2007) Exporting RNA from the nucleus to the cytoplasm. Nature reviews. Molecular cell biology, 8, 761-773.

196. Brown, C.R. and Silver, P.A. (2007) Transcriptional regulation at the nuclear pore complex. Current opinion in genetics & development, 17, 100-106.

197. Jimeno, S. and Aguilera, A. (2010) The THO complex as a key mRNP biogenesis factor in development and cell differentiation. J Biol, 9, 6.

198. Aguilera, A. (2005) Cotranscriptional mRNP assembly: from the DNA to the nuclear pore. Curr Opin Cell Biol, 17,242-250.

199. Masuda, S., Das, R., Cheng, H., Hurt, E., Dormán, N. and Reed, R. (2005) Recruitment of the human TREX complex to mRNA during splicing. Genes & development, 19,1512-1517.

200. Rehwinkel, J., Herold, A., Gari, K., Kocher, T., Rode, M., Ciccarelli, F.L., Wilm, M. and Izaurralde, E. (2004) Genome-wide analysis of mRNAs regulated by the THO complex in Drosophila melanogaster. Nat Struct Mol Biol, 11, 558-566.

201. Cheng, H., Dufu, K., Lee, C.S., Hsu, J.L., Dias, A. and Reed, R. (2006) Human mRNA export machinery recruited to the 5' end of mRNA. Cell, 127,1389-1400.

202. Lai, E. and Darnell, J.E. (1991) Transcriptional control in hepatocytes: a window on development. Trends in biochemical sciences, 16, 427-430.

203. Babb, R, Cleary, M.A. and Herr, W. (1997) OCA-B is a functional analog of VP16 but targets a separate surface of the Oct-1 POU domain. Molecular and cellular biology, 17,7295-7305.

204. Kim, T.K. and Maniatis, T. (1997) The mechanism of transcriptional synergy of an in vitro assembled interferon-beta enhanceosome. Molecular cell, 1, 119-129.

205. Wyrick, JJ. and Young, R.A. (2002) Deciphering gene expression regulatory networks. Current opinion in genetics & development, 12, 130-136.

206. Lee, T.I, Rinaldi, N.J., Robert, F, Odom, D.T, Bar-Joseph, Z., Gerber, G.K., Hannett, N.M, Harbison, C.T., Thompson, C.M, Simon, I. et al. (2002)

207. Transcriptional regulatory networks in Saccharomyces cerevisiae. Science, 298, 799804.

208. Komili, S. and Silver, P.A. (2008) Coupling and coordination in gene expression processes: a systems biology view. Nature reviews. Genetics, 9, 38-48.

209. Bjorklund, S., Almouzni, G., Davidson, I., Nightingale, K.P. and Weiss, K. (1999) Global transcription regulators of eukaryotes. Cell, 96, 759-767.

210. Raj, A., Peskin, C.S., Tranchina, D., Vargas, D.Y. and Tyagi, S. (2006) Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells. PLoS biology, 4, e309.

211. Nelson, D.E., See, V., Nelson, G. and White, M.R. (2004) Oscillations in transcription factor dynamics: a new way to control gene expression. Biochemical Society transactions, 32, 1090-1092.

212. Whitmarsh, A.J. and Davis, R.J. (2000) Regulation of transcription factor function by phosphorylation. Cell Mol Life Sci, 57,1172-1183.

213. Muratani, M. and Tansey, W.P. (2003) How the ubiquitin-proteasome system controls transcription. Nature reviews. Molecular cell biology, 4, 192-201.

214. Ferdous, A., Sikder, D., Gillette, T., Nalley, K., Kodadek, T. and Johnston, S.A. (2007) The role of the proteasomal ATPases and activator monoubiquitylation in regulating Gal4 binding to promoters. Genes & development, 21,112-123.

215. Gill, G. (2003) Post-translational modification by the small ubiquitin-related modifier SUMO has big effects on transcription factor activity. Current opinion in genetics & development, 13, 108-113.

216. Thiel, G., Lietz, M., Bach, K., Guethlein, L. and Cibelli, G. (2001) Biological activity of mammalian transcriptional repressors. Biol Chem, 382, 891-902.

217. Nibu, Y., Senger, K. and Levine, M. (2003) CtBP-independent repression in the Drosophila embryo. Molecular and cellular biology, 23, 3990-3999.

218. Moazed, D. (2001) Common themes in mechanisms of gene silencing. Molecular cell, 8, 489-498.

219. Dellino, G.I., Schwartz, Y.B., Farkas, G., McCabe, D., Elgin, S.C. and Pirrotta, V. (2004) Polycomb silencing blocks transcription initiation. Molecular cell, 13, 887893.

220. Berezney, R. (2002) Regulating the mammalian genome: the role of nuclear architecture. Adv Enzyme Regul, 42, 39-52.

221. Structure andfunctional organization of the nuclear matrix. Academic Press.

222. Spector, D.L. (2001) Nuclear domains. J Cell Sci, 114,2891-2893.

223. Ezzat, S., Yu, S. and Asa, S.L. (2003) Ikaros isoforms in human pituitary tumors: distinct localization, histone acetylation, and activation of the 5' fibroblast growth factor receptor-4 promoter. Am J Pathol, 163,1177-1184.

224. Belmont, A. (2003) Dynamics of chromatin, proteins, and bodies within the cell nucleus. Curr Opin Cell Biol, 15, 304-310.

225. Сьяксте, Н.И. and Сьяксте, Т.Г. (2001) Транскрипционные факторы и ядерный матрикс. Молекулярная биология, 35, 739-749.

226. Zobeck, K.L., Buckley, M.S., Zipfel, W.R. and Lis, J.T. (2010) Recruitment timing and dynamics of transcription factors at the Hsp70 loci in living cells. Molecular cell, 40,965-975.

227. Kisseleva, Т., Bhattacharya, S., Braunstein, J. and Schindler, C.W. (2002) Signaling through the JAK/STAT pathway, recent advances and future challenges. Gene, 285, 124.

228. Arbouzova, N.I. and Zeidler, M.P. (2006) JAK/STAT signalling in Drosophila: insights into conserved regulatory and cellular functions. Development, 133, 26052616.

229. Shi, S., Larson, K., Guo, D., Lim, S.J., Dutta, P., Yan, S.J. and Li, W.X. (2008) Drosophila STAT is required for directly maintaining HP1 localization and heterochromatin stability. Nature cell biology, 10,489-496.

230. Dawson, M.A., Bannister, A.J., Gottgens, B., Foster, S.D., Bartke, T., Green, A.R. and Kouzarides, T. (2009) JAK2 phosphorylates histone H3Y41 and excludes HP 1 alpha from chromatin. Nature, 461, 819-822.

231. Levy, D.E. and Darnell, J.E., Jr. (2002) Stats: transcriptional control and biological impact. Nature reviews. Molecular cell biology, 3, 651-662.

232. Wright, V.M., Vogt, K.L., Smythe, E. and Zeidler, M.P. (2011) Differential activities of the Drosophila JAK/STAT pathway ligands Upd, Upd2 and Upd3. Cellular signalling, 23,920-927.

233. Baeg, G.H., Zhou, R. and Perrimon, N. (2005) Genome-wide RNAi analysis of JAK/STAT signaling components in Drosophila. Genes & development, 19, 18611870.

234. Muller, P., Kuttenkeuler, D., Gesellchen, V., Zeidler, M.P. and Boutros, M. (2005) Identification of JAK/STAT signalling components by genome-wide RNA interference. Nature, 436, 871-875.

235. Harrison, D.A., McCoon, P.E., Binari, R., Gilman, M. and Perrimon, N. (1998) Drosophila unpaired encodes a secreted protein that activates the JAK signaling pathway. Genes & development, 12, 3252-3263.

236. Brown, S., Hu, N. and Hombria, J.C. (2001) Identification of the first invertebrate interleukin JAK/STAT receptor, the Drosophila gene domeless. Current biology : CB, 11,1700-1705.

237. Calo, V., Migliavacca, M., Bazan, V., Macaluso, M., Buscemi, M., Gebbia, N. and Russo, A. (2003) STAT proteins: from normal control of cellular events to tumorigenesis. Journal of cellular physiology, 197, 157-168.

238. Horvath, C.M. (2000) STAT proteins and transcriptional responses to extracellular signals. Trends in biochemical sciences, 25,496-502.

239. Ekas, L.A., Cardozo, T.J., Flaherty, M.S., McMillan, E.A., Gonsalves, F.C. and Bach, E.A. (2010) Characterization of a dominant-active STAT that promotes tumorigenesis in Drosophila. Developmental biology, 344, 621-636.

240. Gronholm, J., Ungureanu, D., Vanhatupa, S., Ramet, M. and Silvennoinen, O. (2010) Sumoylation of Drosophila transcription factor STAT92E. Journal of innate immunity, 2,618-624.

241. Li, X„ Leung, S., Burns, C. and Stark, G.R. (1998) Cooperative binding of Statl-2 heterodimers and ISGF3 to tandem DNA elements. Biochimie, 80, 703-710.

242. Shuai, K. (2000) Modulation of STAT signaling by STAT-interacting proteins. Oncogene, 19,2638-2644.

243. Bhattacharya, S., Eckner, R., Grossman, S., Oldread, E., Arany, Z., D'Andrea, A. and Livingston, D.M. (1996) Cooperation of Stat2 and p300/CBP in signalling induced by interferon-alpha. Nature, 383, 344-347.

244. Paulson, M., Press, C., Smith, E., Tanese, N. and Levy, D.E. (2002) IFN-Stimulated transcription through a TBP-free acetyltransferase complex escapes viral shutoff. Nature cell biology, 4, 140-147.

245. Giraud, S., Hurlstone, A., Avril, S. and Coqueret, O. (2004) Implication of BRG1 and cdk9 in the STAT3-mediated activation of the p21wafl gene. Oncogene, 23, 73917398.

246. Huang, M., Qian, F., Hu, Y., Ang, C., Li, Z. and Wen, Z. (2002) Chromatin-remodelling factor BRG1 selectively activates a subset of interferon-alpha-inducible genes. Nature cell biology, 4, 774-781.

247. Wurster, A.L. and Pazin, M.J. (2008) BRGl-mediated chromatin remodeling regulates differentiation and gene expression of T helper cells. Molecular and cellular biology, 28, 7274-7285.

248. Xu, R., Spencer, V.A. and Bissell, M.J. (2007) Extracellular matrix-regulated gene expression requires cooperation of SWI/SNF and transcription factors. The Journal of biological chemistry, 282, 14992-14999.

249. Cantwell, C.A., Sterneck, E. and Johnson, P.F. (1998) Interleukin-6-specific activation of the C/EBPdelta gene in hepatocytes is mediated by Stat3 and Spl. Molecular and cellular biology, 18,2108-2117.

250. Zhang, X., Wrzeszczynska, M.H., Horvath, C.M. and Darnell, J.E., Jr. (1999) Interacting regions in Stat3 and c-Jun that participate in cooperative transcriptional activation. Molecular and cellular biology, 19, 7138-7146.

251. Stocklin, E., Wissler, M., Gouilleux, F. and Groner, B. (1996) Functional interactions between Stat5 and the glucocorticoid receptor. Nature, 383, 726-728.

252. Zhu, M., John, S., Berg, M. and Leonard, W.J. (1999) Functional association of Nmi with Stat5 and Statl in IL-2- and IFNgamma-mediated signaling. Cell, 96,121-130.

253. Goenka, S. and Boothby, M. (2006) Selective potentiation of Stat-dependent gene expression by collaborator of Stat6 (CoaSt6), a transcriptional cofactor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 103, 4210-4215.

254. Kwon, M.C., Koo, B.K., Moon, J.S., Kim, Y.Y., Park, K.C., Kim, N.S., Kwon, M.Y., Kong, M.P., Yoon, K.J., Im, S.K. et al. (2008) Crifl is a novel transcriptional coactivator of STAT3. The EMBO journal, 27, 642-653.

255. Snyder, M., He, W. and Zhang, J.J. (2005) The DNA replication factor MCM5 is essential for Statl-mediated transcriptional activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 102,14539-14544.

256. Karsten, P., Hader, S. and Zeidler, M.P. (2002) Cloning and expression of Drosophila SOCS36E and its potential regulation by the JAK/STAT pathway. Mech Dev, 117, 343-346.

257. Reed, J.C., Nowell, P.C. and Hoover, R.G. (1985) Regulation of c-myc mRNA levels in normal human lymphocytes by modulators of cell proliferation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 82,4221-4224.

258. Beccari, S., Teixeira, L. and Rorth, P. (2002) The JAK/STAT pathway is required for border cell migration during Drosophila oogenesis. Mech Dev, 111, 115-123.

259. Lopez-Onieva, L., Fernandez-Minan, A. and Gonzalez-Reyes, A. (2008) Jak/Stat signalling in niche support cells regulates dpp transcription to control germline stem cell maintenance in the Drosophila ovary. Development, 135, 533-540.

260. Starz-Gaiano, M., Melani, M., Meinhardt, H. and Montell, D. (2009) Interpretation of the UPD/JAK/STAT morphogen gradient in Drosophila follicle cells. Cell Cycle, 8, 2917-2925.

261. Mertens, C. and Darnell, J.E., Jr. (2007) SnapShot: JAK-STAT signaling. Cell, 131, 612.

262. Luo, H. and Dearolf, C.R. (2001) The JAK/STAT pathway and Drosophila development. Bioessays, 23, 1138-1147.

263. Yan, R., Luo, H., Darnell, J.E., Jr. and Dearolf, C.R. (1996) A JAK-STAT pathway regulates wing vein formation in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 93, 5842-5847.

264. McGregor, J.R., Xi, R. and Harrison, D.A. (2002) JAK signaling is somatically required for follicle cell differentiation in Drosophila. Development, 129, 705-717.

265. Baksa, K., Parke, T., Dobens, L.L. and Dearolf, C.R. (2002) The Drosophila STAT protein, stat92E, regulates follicle cell differentiation during oogenesis. Developmental biology, 243, 166-175.

266. King-Jones, K. and Thummel, C.S. (2005) Nuclear receptors~a perspective from Drosophila. Nature reviews. Genetics, 6, 311-323.

267. Kozlova, T. and Thummel, C.S. (2003) Essential roles for ecdysone signaling during Drosophila mid-embryonic development. Science, 301, 1911-1914.

268. Schwedes, C.C. and Carney, G.E. (2012) Ecdysone signaling in adult Drosophila melanogaster. Journal of insect physiology, 58, 293-302.

269. Yao, T.P., Forman, B.M., Jiang, Z., Cherbas, L., Chen, J.D., McKeown, M., Cherbas, P. and Evans, R.M. (1993) Functional ecdysone receptor is the product of EcR and Ultraspiracle genes. Nature, 366, 476-479.

270. Gilbert, L.I., Rybczynski, R. and Warren, J.T. (2002) Control and biochemical nature of the ecdysteroidogenic pathway. Annual review of entomology, 47, 883-916.

271. Spindler, K.D., Honl, C., Tremmel, C., Braun, S., Ruff, H. and Spindler-Barth, M. (2009) Ecdysteroid hormone action. Cell Mol Life Sci, 66, 3837-3850.

272. Ruaud, A.F., Lam, G. and Thummel, C.S. (2010) The Drosophila nuclear receptors DHR3 and betaFTZ-Fl control overlapping developmental responses in late embryos. Development, 137, 123-131.

273. Thummel, C.S. (2002) Ecdysone-regulated puff genes 2000. Insect biochemistry and molecular biology, 32, 113-120.

274. Altucci, L. and Gronemeyer, H. (2001) Nuclear receptors in cell life and death. Trends Endocrinol Metab, 12,460-468.

275. Aagaard, M.M., Siersbaek, R. and Mandrup, S. (2011) Molecular basis for gene-specific transactivation by nuclear receptors. Biochimica et biophysica acta, 1812, 824-835.

276. Bain, D.L., Heneghan, A.F., Connaghan-Jones, K.D. and Miura, M.T. (2007) Nuclear receptor structure: implications for function. Annu Rev Physiol, 69,201-220.

277. Baumann, C.T., Lim, C.S. and Hager, G.L. (1999) Intracellular localization and trafficking of steroid receptors. Cell Biochem Biophys, 31, 119-127.

278. Cohen, R.N., Putney, A., Wondisford, F.E. and Hollenberg, A.N. (2000) The nuclear corepressors recognize distinct nuclear receptor complexes. Mol Endocrinol, 14, 900914.

279. Giguere, V. (1999) Orphan nuclear receptors: from gene to function. Endocr Rev, 20, 689-725.

280. Koelle, M.R., Segraves, W.A. and Hogness, D.S. (1992) DHR3: a Drosophila steroid receptor homolog. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 89, 6167-6171.

281. Lam, G.T., Jiang, C. and Thummel, C.S. (1997) Coordination of larval and prepupal gene expression by the DHR3 orphan receptor during Drosophila metamorphosis. Development, 124, 1757-1769.

282. Lam, G., Hall, B.L., Bender, M. and Thummel, C.S. (1999) DHR3 is required for the prepupal-pupal transition and differentiation of adult structures during Drosophila metamorphosis. Developmental biology, 212,204-216.

283. White, K.P., Hurban, P., Watanabe, T. and Hogness, D.S. (1997) Coordination of Drosophila metamorphosis by two ecdysone-induced nuclear receptors. Science, 276, 114-117.

284. Georgiev, P.G., Gerasimova, T.I. . (1989) Novel genes influencing the expression of the yellow locus and mdg4 (gypsy) in Drosophila melanogaster. Mol Gen Genet, 220(1), 121-126.

285. Georgieva, S.G., Nabirochkina, E.N., Georgiev, P.G., Soldatov, A.V. (2000) Gene enhancer of yellow 1 of Drosophila melanogaster codes for protein TAFII40. Dokl Biochem, 375,228-230.

286. Grzybowska, E.A., Wilczynska, A. and Siedlecki, J.A. (2001) Regulatory functions of 3'UTRs. Biochemical and biophysical research communications, 288, 291-295.

287. Georgiev, P.G. and Gerasimova, T.I. (1989) Novel genes influencing the expression of the yellow locus and mdg4 (gypsy) in Drosophila melanogaster. Molecular & general genetics: MGG, 220,121-126.

288. Mellor, J. (2006) It takes a PHD to read the histone code. Cell, 126,22-24.

289. Banga, S.S, Peng, L, Dasgupta, T, Palejwala, V. and Ozer, H.L. (2009) PHF10 is required for cell proliferation in normal and SV40-immortalized human fibroblast cells. Cytogenetic and genome research, 126, 227-242.

290. Pascual-Garcia, P. and Rodríguez-Navarro, S. (2009) A tale of coupling, Susl function in transcription and mRNA export. RNA Biol, 6,141-144.

291. Krasnov, A.N, Kurshakova, M.M, Ramensky, V.E, Mardanov, P.V, Nabirochkina, E.N. and Georgieva, S.G. (2005) A retrocopy of a gene can functionally displace the source gene in evolution. Nucleic acids research, 33,6654-6661.

292. Kohler, A., Schneider, M., Cabal, G.G., Nehrbass, U. and Hurt, E. (2008) Yeast Ataxin-7 links histone deubiquitination with gene gating and mRNA export. Nature cell biology, 10, 707-715.

293. Soldatov, A., Nabirochkina, E., Georgieva, S., Belenkaja, T. and Georgiev, P. (1999) TAFII40 protein is encoded by the e(y)l gene: biological consequences of mutations. Molecular and cellular biology, 19, 3769-3778.

Информация о работе

Шидловский, Юлий Валерьевич
доктора биологических наук
Москва, 2012
ВАК 03.01.03

Диссертация

Механизм действия белкового суперкомплекса, содержащего фактор транскрипции SAYP - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы