Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция транскрипции генов фактора некроза опухолей-альфа, интерлейкина-8 и р53 в моноцитах крови человека, активированных in vitro

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Регуляция транскрипции генов фактора некроза опухолей-альфа, интерлейкина-8 и р53 в моноцитах крови человека, активированных in vitro"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИ! НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

на правах рукописи

Фегединг Константин Вальдемарович

РЕГУЛЯЦИЯ ТРАНСКРИПЦИИ ГЕНОВ ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ-«, ИНТЕРЛЕИКИНА-8 и р53 В МОНОЦИТАХ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА, АКТИВИРОВАННЫХ in vitro

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1994

Работа выполнена в Гематологическом научном центре РАМН

)

Научные руководители:

доктор мед. наук Н.Н.Войтенок кандидат Оиол. наук А.Б. Судариков,

Официальные оппоненты:

доктор оиол.наук Н.И. Дризе доктор хим. наук А.Г.Габибов

Еедущая организация:

Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН.

Защита диссертации состоится

1994 г.

в/*/" час. на заседании диссертационного совета Д 001.4ij.02 при Гематологическом научном центре РАМН (Москва, Новозыковский

пр.4а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ РАМН (125167, Москва, Новозыковский цр.4а).

Автореферат разослан " № ". ^.^■У.'-.'/^______1994 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук

В.Д.Реук

Актуальность проблемны

Важная роль в регуляции иммунного ответа и эсспзления, в механизмах гатшшфобнсй устойчивости и противоопуюлевой защиты организма принадлежат ргстворимьм медиаторам, сгкретируемым акпшзрозззЕКш макрофагами - моноюшам (Durun, opp?-i&=iiE.. 1эеэ). В последние года большое внимание уделяется исслехдззпюа фактора некроза опухолзй-с (ФЮ-а), одного из макрофагальных зитокнное, его роли в интеграции иммунных, биохимических и фико логических процессов. Кзевстно, что кроус цитотокскческого эффекта на клетки некоторых опухолей ФНО-а способен оказывать рагулзруггз воздействие на метаболизм нормальных клеток (мгчгу, ■ 1эзг). йногочисленные зкспершентальнЕО данные свидетельствует о том, что 1ЯО-а является одним из важнейших воспалительных медиаторов (B=utisr & ceiami, 1990; pong s Lowry, 1990). Клинические исследования покззали. что является центральным медиатором езнгиче сксго шока при инфекционных заболеваниях, вызванных грзмстриаательш&и бактериями

(Тгасгу S Cerani, 1989).

Показано, что активированные макрофаги синтезиругт в больших количествах ИЛ-8. который является гемотаксином е активатором нейтродинов, чем способствуют вовлечению их в ъосигштеглътШ ответ

(ioshimura Т, et al., 1937; Van Damme J. et al.,1988; Durum £ -Oppenheim, 1980; Katsushina & Oppenheim; 19B9) . КЛ-В -KHSCSe С КД-1 обнарусивзется в образцах кожи пациентов с псориазом. Одной из причин этого заболевания считается нарушение нормального сиктега этих двух цктокинов. Ил-8 также участвует в воспаштзльаых процессах при артритах, поскольку было показано, что он секретируетсл СТИМуЛИрОЗаННШИ СИЕОВИаЛЬЬЫМИ КЛеТКаМИ (Golds Е-Е. et al., 1939) и ХОНДРСЦИТЗМИ (Van J. et all., 1ЭУ0).

Молекулярные механизмы быстрого выделения вйО-н и Ю1-8 моноцитами под влиянием бактериалышх эндотоксина к настоящему времени изучены недостаточно. " Исследования закономерностей синтеза ФИО—сс и ИЛ-8 коноцптгми/макрофагэми человека и животенх, вшолненные несколькими группами исследователей, проведены на клетках, выделенных в условия?: адгезии или в результате введения тиогликолята в Сршвуя полость подопытных животных. Применение таких методоз может вызывать 'активацию моноцитов и макрофагов и, следовательно, приводить к получению в экспериментах искаженных даншх о механизмах синтеза юиэкипов, а также регуляции экспрессии аншонкогена р53. Исходя из этого, был использован метод очистки ионоцитов на градиентах плотности, позволяишй свести к минтт»у возможность

активации клеток з процессе Еыдзления из доиорской крови.

Ядерный фосфопротеин р53 является одним из многофункциональных белков клетог животных. В настоящее время, основываясь на множестве дзншх, р53 принято считать антионкогеном, нарукеиш эксцресии которого, либо мутации приводят к различным видам злокачественных опухолей (Levine A.J. et ai., 1991). по-видимому p53 участвует в регуляции клеточного цикла,-поскольку известно, что количества белка в клетке, а также его мРНК меняются в зависимости от фазы цикла. Недавно было обнаружено, что активация лимфоцитов крови человека приводит к шязлении в них зрелой мРНК р53, а активация моноцитов ЛИС приводит к резкому снижению и исчезновению этой мРНК {Osipovich et ai., 1992). Считается, что такое разное поведение мРНК р53 в лимфоцитах и моноцитах обусловлено различными фазами клеточного цикла в котором эти клетки находятся б состоянии покоя, по мимо этого активалзя лимфоцитов приводит к их пролиферации, в то время как, моаоцизя не пролиферируют в ответ на активацию.

Известно, что р53 принимает участие в регуляции транскрипции гена мышечной креатин киназы; совместно с продуктом гена Ras модулирет экспрессию гена MdrI; совместно с другим антионкогеном кь блокирует транскрипцию гена ИЛ—6; активирует транскрипцию кластера генов рибосоыных . РНК; . блокирует синтез ядерного антигена пролиферации (Weintraub et al., 1991; Chin et al., 1992; Santhanam et al., 1991; Farmer et al.,1992; Mercer et al., 1991), МОЖНО

предположить, что изменение экспрессии этого "гена может прйводить'к" различным состояниям активированных клеток. Цель исследования:

Целью работы являлось исследование закономерностей транскрипции генов фактора некроза опухолей-* , интерлейкина-8 и р53 в моноцитах переферической крови человека при их активации in vitro. Задачи работа:

Г! Отработать методику выделения моноцитов из фракции мононуклеаров периферической крови человека в неактивирующих условиях на градиенте плотности Перколла.

2. Исследовать индукцию транскрипции генов ОНО-а, ИЛ-8 и р53 в моноцитах пря различных условиях инкубации in vitro.

3. Исследовать влияние циклогексимвда на скорость транскрипции генов ФНО-а, ИЛ-8,. р53 и на .накопление зрелых мРНК этих генов моноцитами крови человека in vitro. .

Научная новизна и практическая значимость работы.

В настощей работе показано, что метод разделения мононуклеаров

перй?ерст&гкэй крови человека на прзформировання градиенте плотности Перколла позволяет получить неакткзировашые мопоциты крови, которые не трзнскрибируют гены ФНО-а, т-1р л Ш-В и не содержат зрелой мРНК ФНО-с и ИЛ-8. Полученные этим методом моноциты мскно использовать в качестве модели для изучения згшномерпостег. синтеза могоюшоз в норме и патологии.

Обнаружено, что. инкубация моноцитов гп i-ii.ro приводит к активации транскрипции зтих генов.

На предложенной модели проанализирована активация транскрипции генз ФКО-а суспензией инактивированных бактериЕС гсарЫ1о=оссиз лигеия соуап г (САК). Было показано, что активация тразскрипции гена ФНО-я происходит при участии нескольких механизмов: зависящих и независящих от биосинтеза бежа в моноцитах. Определены важные временные точки активации транскрипции гена ФНО-а з моноцитах переферической крови человека при их актизацян ¿а гхгго САК.

Было показано, что инкубация моноцитов хп viz.ro в отсутствие липополисахаридов бактерий приводит к значительному синтезу иммунореактивного белка ИЛ-8. Синтез ИЛ-8 ве яндударуется к нз модулируется при активации клеток экзогенным ФНО-с.

Установлено, что ген р53 транскрибируется конститутивно в ядрах как в- свежзвыделенннх. тгк и культивируемых моношотв- Активация моноцитов САК либо обработка их циклогексжгидом (ЦЙГ) Ее изменяет скорости транскриции этого гена в моноцитах. Активашп моноцитов САК приводит-к быстрому исчезновении мРНК р53.

Получешше данные важны для понимания механизмов участия ФНО-а и ИЛ-8 е ишунорегуляцяи к иммунопатологии. Апробация диссертации.

Материалы работы были доложены на 8 Меадународном шлмувологическом конгрессе (Будапешт, Венгрия, 1992).

Работа была апробирована на заседании пробжшой комиссии "Экспериментальная гематология и биотехнология- ГШ РАМН 9 июня 1993г. Публикации.

Материалы диссертации опубликованы в 9 научных работах.

ООъеи и струкззра работы.

Диссертация включает введение, главы "обзор литературы", ••материалы и методы", "результаты", "обсуждение результатов", -выводы", "щвдожеЕия". Работа изложена на 127 страницах машинописного текста, содержит 13 рисунков и список цитированной литературы из 342 наименований.

Краткое содержание работы.

Методы исследования.

МоЕОнуювары периферической крови (ЫПК) выделяли из свежей донорской крозн, стабилизированной гепарином (20 ед/мл, "Richter"), по методу, описанному воуиш (1958). Приготовление преформированных градиентов Перкшша и выделение моноцитов из фракции МПК проводили по методу (Gtaelig-Meyiing, Waldnann, 1980) . КОЛИЧвСТВО КЛеЮК, содержащих грззулы а-яафтилацетат- зстеразы, для определения которых использовали юзгносткческий набор фирмы sigma, составляло 80,7+5,4й ;n=II). Моношты суспендировали в среде rpmi 1640 дополненной 5% термоинактивировЕННой эмбриональной телячьей сывороткой иантибиотикага (пенициллин - 100 ед/мл, стрептомицин - 100 мкг/мл), е концентрации 1,5-2 млн/мл. Суспензию staphylococcus aureus cowan l готовили как описано в работе (Kessier, 1975) и добавляли к моноцитам з конечной концентрации .0,0001%. (объем/объем). ЛзкомбянангннЗ ФНО-а (рФНО-а) (Ферментас, Вильнкс) в конечной ■■тнцвнтргшш 100 ед.биологической активности/мл добавляли к клеткам и инкуОироваяа при 37°С в 'течении указанного времени.

Для ингибирования синтеза белка использовали циклогексимид (ШГ), которкй добавляли в культуральнуи среду в концентрации 10 мкг/мл.

ФГО—« в супернатантах культур моноцитов определяли иитотоксичесзшм тестом на клетках фибробластоидной линии мыши l-929

к о if ford, 1SS3).

Определение количества синтезированного ИЛ-8 моноцитами в супернатантаг культур проводилось методом иммуноферментного анализа, описанного в работе iue-chau и соавт.(1992).

МРНК аз МОНОЦИТОВ выделяли ПО методу Chomczynski И Sacchi (1987). Количество тотальной РНКопределяли спектрофотометрией при Л=260 на спектрофотометре DU-64 (Eecknan) .

Анализ изолированной РНК irooБодали после электрофореза на 1,4% формальдегид-агарозЕОМ геле и переноса на нейлоновую мембрану (Маниатис и др., 1984).РНК фиксировали Еа мембране облучением ультрафиолетовым светом х=305 ш на трансиллшинаторе 2-3 мин. мРНК

ОНО-а , ИЛ-8 и р53 выявляли гибридизацией с одноцепочечными зондами, меченшчи по мзтоду достройки отонженого гибридизационаго праймера, согласно Ни П. U J. Messing, (J982) . ГИбрИДИЗЗЦЯЮ ПРОВОДИМ В рЗСТВОрЗ, содержащем СО» форм.эмида, 0,25М nací, 0.25М ка-фосфзшый буфер рк 7,2, 0.25Й Na-пирофэсфат, 1% sds, I мг/мл гепарина, 100-200 мкг/ил ДНК лосося, при 50°С в течение 12 часов. Отмывку производили последовательно в растворах, ssc (2х) + 0,1% sds и ssc (0,2х) + О,К sds при комнатной температуре и ssc (0,Ix) + ОДЙ sos при 65°С. Радиоавтографы проявляли после экспозиции в течгяие ночи с усиливающими экранами при -70°С.

Анализ транскрипции генов в изолированных ядрах црсзодили по мзтоду Groudine et al. (1983) с некоторыми избиениями. Ядерную РНК выделяли как описано зкпе, только в при осаждении РНК пзопропанолом к растзору добаляли 100мкг дрожжевой транспортной РНК в качестве носителя. Выделенную меченную ядерную РНК гибридизовалз с плззмидами с вДНК генами ФНО-и, ИЛ-1/з, ИЛ-8, р53 и prz-I3a в качестве не специфической ДНК. Для этого по 10 мкг каздой плазмиды денатурировали в 100 мкл 0,4M раствора наон при 37°С в те чеши 15 мин. и наносили в аппарат для дот-блоттинга Manyfoia на "нейлоновую мебрану и промывали 5оо мкл раствора ssc (х2). ДЕЗ фиксировали ультрафиолетовым гвётом на фильтре. Фильтр разрезав на полосы, содержащие интересующие гены и каждую полосу парализовали с препаратом печенной ядерной РНК при условиях, описании: выше. Результаты и их обсуждение. - • • •

Г! 1'ранскрипшя геиов ФНО-a и ИЛ-8 в сьегЕявде ченных и культивируемых моноцитах.

Эксперимента по опрзделзпию мРНК ФНО-а в моноцитах перзферической крови человека проводились совместно с научным сотрудником лаборатории молекулярной иммунологии Е2Я Переливания крови г.Минска O.A.Осиповичем "

Методом Нозерн блоттинга было обнаружено, что в езекевыделенвых моноцитах МРНК ФНО-a (рис. с В)Ы ш 3 ) и ИЛ-8 (рясJS) не детектируется.

После 3-5 часов инкубации моноцитов происходил» значительное накопление зрелой mFIIK KJI-8 (рис.й№ 4, 5) и шмуноре активного белка Ш1-3 (рис.Jé 6) в супсрнатаптах культивируемых клеток. Как известно, за 1-2' часа инкубации мсноцчтов происходит полязе осаждение моноцитов на дно пластиковой чашки Петри и их ажгезия. Таким образом, можно предположить, что адгезия моношпоз на пластик

Рисунок № I. Индукция мРНК в моноцитах крови человека при их активации САК. Результаты Нозерн-блот анализа. А) Дорожки с I ш 3 - свежевыделенные моноциты; дор. 4- инкубация 3 часа; дор. 5- инкубация 3 часа в присутствие ЦКГ; дор. 6-инкубация 3 часа в присутствие САК; дор. 7- инкубация 3 часа с САК и ЦКГ. Б) £эр. I- сважезыделенные моноциты; дор. 2- инкубация 3 часа в щясутствие САК; дор. 3- инкубация 12 часов в присутствие CAS

I * 2 3 4 5 • в-.. 7 Дооохки

Б

t 2 3 « 3 0 7 Дооохки

Рисунок № 2. Зависимость супериндукции мРНК ФНО-а в моноцитах крови человека, активированных САК от времени добавления ЦКГ. Результаты Нозерн-блот анализа.

А. Дорожка I- свежевнделенные моноциты; дор. 2- инкубация 5 часов, дор. 3 и 5- инкубация 3 часа с САК; дор. 4 - инкубация 3 часа с САК и ПКГ; дор. 6- инкубация 5 часов с САК и ЦКГ; дор. 7-инхубация 5 часов, ЦКГ добавлен через 3 часа, после начала культивации с САК. Б.Дор. I- изтзктные клетки; дор. 2- инкубация 5 час. с CAS; дор. 3- инкубация 5 час., САК и ЦКГ добавлены одновременно; дор. 4—, инкубация 5 час., ЦКГ.добавлен через 0,5 час. после СА2; дор. 5- инкубация 5 час., ЦКГ добавлен через 1,0 час. после САК; дор. 6- инкубация 5 час., ПКГ добавлен через 2,0 час. после САК; дор. 7- моноциты инкубированные 5 час., ЦКГ добавлен через 3,0 час. после САК.

вызывает их активацию, выражающуюся в- появлении мРНК ИЛ-8, ее трансляции и секреции белка ИЛ-8 в среду.

Добавление САК к выделенным моноцитам приводило к появлению мРНК ФНО-а, количество которой достигало максимума на 3-4 часу инкубации (рис. с В I по 3) з значительно снижалось на 5-6 часу инкубации ( рис. J£* 9 Б), что привело к появления значительных количеств биологически активного белка (рис.К 6). мРНК ФНО- с< полностью отсутствовала на 12 -18 часу инкубации иовсштов с САК ( рис. !ё 9 Б). В подобных экспериментах САК вызквал некоторое увеличение количества мРНК ИЛ-8 по сравнению с нзобработаншмк адгззировакшкися моноцитами (рис.йб 4, 5), но не вызавал увеличение количества самого ИЛ-8 в культурзльвой среде (рис.й 6).

Активация моноцитов САК б присутствие нейтрализукшх монсклоналышх антител против ФНС-а не приводила к изменению количеств мРНК ФНО-а (рис.КЗ) и ИЛ-8 (рис.й 4, 5) по сравнению с количеством соответствующих мРНК з активированиях САК моноцитах. Обработка этими антителами клеток приводила к полней нейтрализации синтезированного клетками ФНО-а, но не изменяла существенно количества ИЛ-8 (рис.й 6) .-

Стимуляция моноцитов рекобинантннм ФНО-а (рФНО-а) не индуцировала синтеза мЕНК ФНО-а (рис. КЗ) и не. изменяла количеств мРНК ИЛ-8 (рис .Ш С, 5) и иммунореактивного белка ИЛ-8 в культуральвой среде. Однако, биологически активней ФЙО-е практически отсутствовал в среде, из чего мояно. предположить, что добавленный к клеткам рФНО-а полностью связался со свого.я рецепторами на поверхности клеток (рис6). Обработка моноаитоз ШГ приводила к связыванию моноцитами 2/3 внесенной биологической активности. Это можно объяснить тем, что инкубация моноцитоз in vitro активирует синтез дополнительных количеств молекул рецептора ФТЮ-а клеткам.

Для предотвращения синтеза возможных регулнгорных бэлков, участвующих в процессах регуляции транскрипции и/или деградации мГНК цитокинов, в некоторые порции донорской крови был добавлен цкклогексимид (конечная концентрация ю мкг/мл). что привело к появлению MFHK ФНО-а после 3 часов их инкубации (рис Л Ik). Однако, при дальнейшей инкубации моноцитов с ПКГ в течении 18 часов мРНК ФНО-а з моноцитах исчезала (рис.й 9Б). В подобных экспериментах ПКГ не отменял синтеза мРНК ИЛ-8 (рис.№№ 4,5).

В моноцитах, выделенных в присутствие ИНГ и активированных САК, наблюдалось появление мГНК ФНО-а и ИЛ-8 на 3-5 часу активации, количество которой било значительно меньше, чем в опыте без ПКГ

(рис. № I АЛ ргс.ЯЗ).

Рисунок Я 3. Индукция м£КК—ФНО-а рекомбияантным ФНО-а в моноцитах. Результаты Нозерн-йлот анализа.

Дорожка I- вакубация 5 час; дор. 2- инкубация 5 час с рФНО-д " (ЮОзд/мл); лор. 3- инкубация 5 час, рФНО-а (100ед/мл) и анти-ФНО-а МКА (аоонг/мл) добавлены одновременно; дор. 4- инкубация 5 час, рФНО-а, ЦЕСГ ■ и САК добавлены одновременно; дор. -5- • инкубация 5 час, рФНО-а и САК добавлены одновременно; дор. 6-инкубация 5 час. анти-ФНО-а МКА и САК добавлены одновременно; дор. 7- инкубация 5 час с САК и ДКГг дор. 8- инкубация 5 час с анти-ФН0-<х ш.

1 2 3 4 5 6 7 6 9 10 И Дорожки

Рисунок К 4. Индукция МРНК Ш-8 в моноцитах. Результаты Нозерн-блот анализа.

Дорожка I инкубация 5 час.; 2- инкубация 5 час с САК; дор. 3-инкубация 5 час с САК и анти- ФНО-а МКА (200нг/мл); дор. 4-инкубашш 5 час с САК и ШГ; дор. 5- инкубация 5 час с САК, рФНО-ос (100ед/ил) и ПКГ; дор. 6- инкубация 5 час с САК, рФНО-<*. анти-ФНО-а МКА * ЦКГ; дор. 7- инкубация 5 час с рФНО-а; дор. 8-инкуОация 5 час. с рФНО-а. и анти-ФНО-а МКА; дор. 9- инкубация 5 час с рФНСНс и ЦКГ; дор. 10- инкубация 5 час. с ЦКГ; дор. II-инкубация 5 час с анти-ФНО-а МКА.

Обработка клеток ВДГ полностью отменяла синтез белка ФНО-а и ИЛ-8 (рис.» 6).

Супериндукция мРНК ФНО-а наблюдалась на 5- 6 часу инкубации моноцитов с САК, кегда ЦКГ был добавлен на 3 часу (рсс. 114 2 А,Б). Добавление ЦКГ до начала активации или шесте с САК ев приводило к суцсриндукции ( рис. Д!6 I А,Б; 2 А,Б).

, Обработка моноцитов ЦКГ после 0,5, 1,0, 2,0 часов от начала активации не приводила к увеличению количества мРНК СГО-с на 5 часу культивирования ( рис » 2 Б, доронки 4, 5, £ ).

Подавление синтеза белка после 2,5 чэсов от начала активации приводит х супериндукцзи этой мРНК (рис.» 2Б).

Поскольку неизвестно, происходит ли суперзндукция «РНК ФНО-а за счет стабилизации ( увеличение времени жизни мРНК) к/или за счет усиления транскрипции гена ФНО-а были проведены эксперименты по транскрипции этого гена в ядрах, изолированных из покоящихся и активированных моноцитов. Результаты этих экспериментов представлены на рисЛЕ» 7, 10.

Было обнаружено, что транскрипционная активность гена ФНО-а полностью отсутствует или черзззычайло мала в свежевыделенных моноцитах (рис. ДК 7, 10).

Транскрипция гена индуцировалась-.САК, достигала-максимума .в течении I часа и была постоянна в период 1-4 часов, снижаясь на 6 чьсу инкубации (рис. №Ь 7).

• - Обработка ЦКГ ыоаоцитов с качала культуры бзз активации САК вызывала усиление .транскрипции гена ФНО-а по сравнению с необработанными моноцитами (рис.» 7). Однако, уровень транскрипции гена при индукции ЦКГ был значительно нике, чем уровень транскрипции в случае индукции САК. Обработка моноцитов ЦКГ с начала культивации не блокировала индукцию транскрипции гена ФНО-а и не увеличивала скорость транскрипции при активации САК (рис.» 7).

При добавлении ЦКГ после 2,5 или 4 часов от зачала культуры моноцитов в случае активации САК или без нзе наблюдалось значительное усиление транскрипции на соогветсвенЕЗ 4 - С часу инкубации ( рис Ш 7, 10 ).

В свекеваделенньи. моноцитах транскрипция геноа НП-10, ИЛ-8 и ФНО-а отсутствовала (рис.» 7). Транскрипция ИЛ-1р к №-8 наблюдалась после 1-4 часов инкубации моноцитов. Активация ьхжлщтос САК не увеличивала уровень транскрипции генов ИЛ-1/з и ИЛ-З - (рис.» 7) по сравнению с уровнем транскрипции этих генов ( индуцированным адгезией.

Рисунок № 5. Индукция мРНК ИЛ-8 в моноцитах. Результаты Нозерн-блот анализа.

Дорожка I и 2- свежевыделенные моноциты; дор. 3- инкубация 5 час; дор. 4- инкубация 5 час с ЦКГ; дор. 5- инкубация 5 час с рйЮ-а; дор. 6- инкубация 5 час. с рФНО-а (100ед/мл) и ШГ; дор. 7-инкубация 5 час с рФНО-а и анти-ФНО-а МКА; дор. 8- инкубация 5час с САК; дор. 9- инкубация 5 час с САК и ЦКГ; дор. Ю- инкубация 5 час с САК и анти-ФНО-а МКА.

I

ИЛ-8.нг/мл 10

5 0

ФНО-а,ед/мл •100

пПп

Л

а

50

1234 5678 9 10 11

Ш-ИЛ-8 ВИ-ФНО-а

Рис. № 6 Определение иммунореактнвного белка ИЛ-8 и биологической активности ФНО-а (ед/мл) в супернагантах культур моноцитов, инкубированных 5 час.

Колонка I- интакхные клетки; колонка 2- инкубация с САК: колонка 3- инкубация с САК к анти- ФНО-а МКА (200нг/мл); колонка 4-инкубация с САК и ЦКГ; колонка 5- инкубация с САК, рФНО-а (100ед/мл) и ЦКГ; колонка 6- инкубация с СдК, рФНО-а, анти-ФНО-а МКА и ЦКГ; колонка 7- инкубация с рФНО-с; колонка 8- инкубация с рФНО-а и анш- ФНО-а МКА; колонка 9 - инкубация с рФНО-а и ЦКГ; колонка 10- инкубация с ЦКГ; колонка II- инкубация с анти-ФНО-а МКА.

Транскрипция гена ИЛ-8 ингибировалэсь при добавлении ШГ с начала культивирования моноцитов как в присутствие САК, так и без него (рис.№ 7). Транофшпшя гена Ш1-1р так же как и гена ФНО-а индуцировалась САК, когда ЩГ был добавлен с начала культивации ■моноцитов.

Усиления транскрипции генов ИЛ-8 при добавлении ЦКГ после 2,5 или 4 часов с начала культивации моноцитов как в присутсвие САК, так и без него не было; в противоположность этому наблюдалось некоторое усиление транскрипции гена ИЛ-1/з при добавлении ШГ через 4 часа как к стимулированным адгезией моноцитам, так и через 2,5 часа в случае активации их САК (рис.й 7).

Обычно в исследованиях по регуляции транскрипции генов ■ монокинов используются перевиваемые мышинные либо человеческие моноцитарные линии, так как существует множество трудностей при работе с моноцитами, такие как: невозможность применения методов генной инженерии для создания экспрессиругащх конструкций для изучения регуляции экспресии генов; высокая чуствительность МОНОЦИТОВ к активированию ЮС И адгезией ( Веий1ег & Сегапа 1989, Еагшап et.ai.1939). Поэтому исследования по изучению- регуляции транскрипции генов монокинов в моноцитах, выделенных в . неакгивируших условиях, крайне важны, для понимания механизмов,, активирующих экспрессию этих генов.

Ранее предполагалось, что быстрый синтез ФНО-а моноцитами в ответ на воздействие ЛПС в присутствие - актиномицина -Д ш пгго может быть опосредован либо трансляцией пресингезированной мРНК (

Веий1ег ей а1 1986, ШЛсЬ ей а1. 1988, Уохйепок ей а1.1989, Нап et

а1 1990), либо процессингом и секрецией пресинтезированного пре-ФНО-а ( но£зИ et а1. 1988). Однако, в моноцитах, выделенных методом адгезии и долгой культивации на пластике, методом Нозерн блоттшгэ не была обнаружена зрелая мРНК ФНО-а ( Багз.ьап et а1. 1988). Этот факт объясняли тем, что пресинтезированная мРНК ФНО-а, содержащая ли-богатую последовательность в 3'-нетранслируемой области, очень нестабильна В ОТСуТСВИе ЗКТИВаЦИОННЫХ СИГНаЛОВ ( Веий1ег & Сегаш1 1986, вЬа» 5 Кашеп 1986, 8йг1к1апсГ ей а1. 1988, Беий1ег & Сегави

1990) и может деградировать во время выделения моноцитов путем их адгезии на пластик.

Для того чтобы избежать возможной, активации моноцитов при их выделении методом адгезии на пластик, в данной работе были использован метод изопикнического центрифугирования в ^реформированных охлажденных градиентах Перколлз. При использовании

подобного метода выделения жшоцитов в них не была обнаружена ей зрелая мРНК, ни транскрипция гена ФНО-а в ядрах моноцитов, что вполне согласуется с ранее полученными данными по обнаружению мРНК ФНО-а В Образцах цельной крови ( Misuno et ¿.1.1990).

Усиление накопления мРНК ФНО-а наблюдалось при инкубации моноцитов в присутствие ЦКГ. Неожиданным оказалось то, что присутствие ГОГ лри выделении моноцитов и при активации их. САК не только не вызывало супериндукции этой мРНК, но н несколько снижало ее количество. Подобное явление наблюдалось и на уровне транскрипции данного гена. Из этого можно сделать еивод, что различные механизмы могут участвовать при инициации транскрипции гена ФНО-а в покоящихся, культивируемых и активированных моноцитах. Анализ транскрипции генов в ядрах моноцитов показал, что в свзжевыделенных моноцитах отсутствует транскрипция гена ФНО-а так же как и генов ИЛ-Iß и ИЛ-8. Наблюдаемая постоянная транскрипция гена ФНО-а в других

работах ( Jongeneel et al. 1989, Collart et al. 1990, Sung et al.

1991) может быть объяснена использованием неадекватных клеточных моделей.

В данной работе обнаружено, что просто инкубация моноцитов в отсутствие дополнительной активации индуцировала транскрипцию генов ИЛ-Iß и ИЛт8, которая не усиливалась при стимуляции САК. В случае. ИЛ-8 адгезия моноцитов на пластик вызывала также не только значительное накопление мРНК, но и синтез значительных количеств ЭТОГО белка (рис.»II) Из. литературы ( Schindler et ь-1. . 1990 ) известно, , что инкубация мононуклеарных клеток крови без дополнительных активационных стимулов, приводила к поязлепию в клетках большого количества мРНК ИЛ- Iß, но не белка ИЛ-Iß. Было предположено, что адгезия клеток на пластик в условиях эксперимента приводила к транскрипции этого гена, но только воздействие ЛПС как второго активационного сигнала снимало блок трансляции МРНК I'JI-Iß. Индуцированная адгезией транскрипция гена ИЛ-Iß в юнсцитах человека так же была недавно описана (Haskiii et ai. i98S). Из этого было сделано предположение, что в транскрипции генов ИЯ-Iß и ИЛ-8 участвуют факторы, активируемые адгезией клетск (Haskiij et ai.

1991).

В нашей работе наблюдалось' несколько эффектов действия ЦКГ ка транскрипцию генов монохивов. Добавление ЩГ одновременно с началом культивации моноцитов вызывало транскрипцию гена ФНО-а и появление малых количеств зрелой мРНК. Усиление транскрипции этого гена наблюдалось при активации моноцитов САК. Следует заметить, что

добавление САК к культуре клеток, содержащих ПКГ с начала культивирования приводило к такому же усилении транскрипции. Основываясь на этих данных, можно предположить, что некоторый посттрансляционно активируемый фактор (либо факторы) могут участвовать в активации транскрипции гена ФНО-а САК в присутсвие 1ШГ. Недавно было показано, что индукция мРНК ФНО-а и Ш1-1е стафилококковым экзотоксином не зависит от синтеза белка и, следовательно, вызывается пресинтезированным транскрипционным фактором/факторами, который активируется сигналом, прередаваемым через молекулу мембранного 1а-белка ( тгесЗе ей а1. 199х). Кандидатом в такие посттранскрипционно активируемые факторы могут быть м-кв-подобные факторы. Однако эксперименты по использованию делеционвых мутантов промоторной области гена ФНО-а для экспрессии маркерных генов и изучения участия ы£-кв в регуляции транскрипции ФНО-а на линиях клеток, могут давать данные, весоответсвуюцие ситуации в моноцитах переферической крови (кгиуз ей а1. 1992). По мимо этого, делении могут затрагивать и другие важные, не связанные с ы:с-кв и пока неизвестные последовательности, которые в норме принимают участие в регуляции экспрессии ФНО-а.

Добавление ПКГ с начала культивации моноцитов значительно . ингибировало траскрипцию гена.ШНЗ, которая .наблюдалась и при одновременной обработке клеток ВДГ и САК, из чего можно предположить, что для активации транскрипции этого гена необходим синтез специфического транскрипционного фактора/факторов. Однако сниженная активность транскрипции гена ИЛ-8 при обработке клеток ПКГ не приводила к изменению количеств зрелой мРНК по сравнению с моноцитами, активированными адгезией на пластик. Можно предположить, что ПКГ по мимо ингибирования транскрипции этого гена вызывает значительную стабилизацию его МРНК.

В отличие от ИЛ-8 транскрипция гена Ш1-1р при обработке ПКГ клеток с начала инкубации значительно усиливалась. Одновременное добавление ЩГ и САК не вызывало дальнейшего усиления. Обработка моноцитов САК в отсутствие ЩГ приводила к такому же уровню транскрипции, который вызывался просто адгезией. Эти результаты вполне согласуются С данными работы (Репйоп еЬ а1. 1987), авторы которой для объяснения этого явления предположили наличие з . не активированных моноцитах постоянно синтезируемого лабильного белкового репрессора транскрипции гена ИЛ-1/з.

Суперивдукция мРНК ФНО-а наблюдалась, когда после 2,5 и более часов инкубации с САК моноциты обрабатывались ПКГ. Добавление ПКГ

после 2,5 часов активации значительно усиливало граискрицкю гена ФНО-а в ядрах как в случае САК-актквироьашшх моноцитов, так и в случае активированных адгезией клеток. Из этого можно сделать вывод, что, то крайней мере, часть эффекта сунериндуции м?НК ФКО-а в активированных САК моноцитах не опосредована стабилизацией этой кРНК.

Очень похожая супериидукция транскрипции гена'ия-2 в присутсвие ЦКГ, добавленного после 3 часоз активации мышиных 7-клеток: была описана недавно ( zubiaga et ai. 1991). В этой работе было показано, что этот эффект ЦКГ не был опосредован состтрансляционкой активацией Nf-кв. Авторы предположили, что суперидукция транскрипции ИЛ-2 является результатом ингибировзния ЦКГ скнтеза гипотетического негативного регулятора транскрипции гена VJi-2 ЦКГ. Подобный механизм может участвовать и в супериндукции транскрипции гена ФНО-а з присутсвие ЦКГ, добавленного через 2,5 активации САК.

Следует отметить тот факт, что одновременное добавление ЦКГ и САК не вызывало супериндукции транскрипции гена ФНО-а. Таким образом, отсутствия синтеза гипотетического негативного транскрипционного элемента недостаточно, чтобы объяснить супериндукцизо транскрипции гена ФНО-а. Из необходимости биосинтеза белка в течении первых 2,5-3 часов, инкубации .моноцитов для супериндукции транскрипции, можно предположить, что за это время скнтезирется дополнительный позитивный регулятор транскрипции. Транскрипционный фактор AP-I, который <?е novo синтезируется при активации клеток ( sung et ai. is9i), монет быть кандидатом на роль позитивного регулятора транскрипции гена ФНО-а. Ранее было показано, что адгезия моноцитов на полистирол активирует индукцию мРНК c-fos -компонента AP-I ( Hasskill et al. 1983).

Активность позитивного трансрипционнонго фактора можно увидеть только при ингибировании синтеза гипотетического негативного регулятора. Это может служить ябьяснением того, что добавление ЦКГ после 2,5-4 часов к покоящимся адгезироз'авяимся моноцитам вызывало заметное усиление транскрипции гена ФКС-а по сравнения с уровнем транскрипции этого гена в моноцитах, ивкубировзЕлжхся в присутствие ЦКГ, добавленного с зачала культивирования. Исходя из этого можно предположить, что активация адгезией достаточна для индукции гипотетического транскрипционного фактора..

Схема регуляции транскрипции гена ФНО-а, объясняющая наблюдаемые в экспериментах явления, вызываемые САК и ШГ, представлена на рис ii 8.

Рисунок № 7. Транскрипция генов ФНО-а, Wl-Ie и ИЛ-8 в изолированных ядрах моноцитов, культивируемых in vitro Колонка I- свежевыделенные моноциты; колонка. 2- инкубация 4 час.; колонка 3- инкубация 4 час. с ЦКГ; колонка 4- инкубация 6 час., ЦКГ добавлен через 4 час.; колонка 5- инкубация 2 час. с САК; колонка 6- инкубация 4 час. с САК; колонка 7- инкубация 4 час. с САК и ЦКГ; колонка 8- инкубация 4 час. с САК, ЦКГ добавлен через 2,5 час.; колонка 9- инкубация 6 час. с САК; колонка 10-инкубация 2 час. с САК; ЦКГ добавлен через 4 час.

1 г з « s б

Зреия от начала активации САК (час.)

Рисунок Я 8 Факторы, предположительно участвующие в регуляции транскрипции гена ФНО-а в моноцитах переферическоЛ крови человека, при их активации САК in riera.

Таким образом, уровень транскрипции гзна ОНО-а в активированных САК моноцитах можно представить как сумму независимых рёгуляторных механизмов, вовлекающих различные факторы:

а) пресинтезированнЕй, относительно стабильный фактор, позитивно регулирующий ' транйфипшго и активирующийся САК на посттрансляционном уровне;

б) лабильный фактор,. зависящий от. биосинтеза белка в клетке и негативно регулирующий транскрипцию.

в) tie novo синтезирующийся, активирующийся адгезией, стабильный позитивный фактор. Можно предположить, что добавление ПКГ после 2,5 - 4 часов активации моноцитов САК приводит . к м?ксимг>льной транскрипции, вызываемой . одновременным действием двух факторов: пресинтезированного САК-активируемого и индуцированного адгезией, синтезированного de пого в течении 2-4 часов.

Низкий уровень транскрипции гена ФНО-а в ядрах покоящихся моноцитов, обработанных ЦКГ может быть объяснен либо наличием некоторого количества моноцитов, активированных in vivo или в процессе выделения, либо деградацией лабильного, постоянно синтезирующегося репрессора транскрипции этого гена.

ФНО-а связываясь, со своими рецепторами на поверхности различных, клеток вызывает синтез ФНО-индуцибелъных цигокинов, в том числе хемокинов (ИЛ-S и др.). Ранее считалось, что ФНО-а является одним из основных индукторов синтеза Ш1-8 клетками организма, б том числе к моноцитами периферической кроеи человека (Matsushima at al.,1989). Однако, подобные выводы были сделаны для ьюноцитарных клеточных линий и моноцитов, выделенных адгезией. Но этому для проверки справедливости этих выводов, было проведено несколько экспериментов, которые показали, что адгезия моноцитов на пластик, либо культивирование in vitro в услоеиях экспер:с,йЕта, сами по себе служат достаточными стимулами для активации транскрпции гена ИЛ-8 и секреции этого белка моноцитами. Причем экспрессия гена ю1-8 ее меняется значительно от присутствия рекомбинантного либо аутокринного ФНО-к. Кроме этого оказалось, что при этих условиях не происходит ни индукция транскрипции гена ОНО-а, ни ее модуляция. Такая разница с данными литературы может быть обусловлена разными методами выделения моноцитов. Вероятнее всего, адгезия моноцитов на пластик, которая используется в качестве стандартного метода для выделения моноцитов индуцирует их дальнейшую дифйзренцировку в макрофаги и может приводить к перестройке механизмов, регулирующих экспессию генов ФНО-а, Ш-Ip, 11Л-8.

А

Рисунок № 9. Нозерн-блот анализ мРНК р53 и ФНО-о в моноцита:', инкубированных in vitro;

А. Дорожки I и 2- свезевыделенвые моноциты; дор. 3- инкубация £ час. с САК; дор. 4- инкубация 5 час., ЦКГ добавлен через 3,0 час. после САК. Б. Дор. I- свежевыделенные моноциты; дор. 2- инкубация 0,5 час. с САК; дор. 3- инкубация I час. о САК; дор. А— -инкубация 3 час. с САК; дор. 5- инкубация 6 час. с САК; дор. 6- инкубация 3 час., ЦКГ добавлен через 3,0 час. после САК; дор. 7- инкубация 16 час. с САК; дор. 8- интактные моноциты инкубированные 18 час.; дор. 4- инкубация 18 час., ЦКГ добавлен через 3 часа после начала культивации

| 2 3" 4 5 Коясмо,

Рисунок № 10. Транскрипция генов ФНО-а и р53 в изолированных ядрах моноцитов, культивируемых i л ritro

Колонка I- свежевыделенные моноциты; колонка 2- инкубация I час. с САК; колонка 3- инкубация 2 час. с САК; колонка 4- инкубация 4 час. с САК; колонка 5- инкубация 4 час. с САК, ЦКГ добавлен через 2,5 час. после начала культивации.

2. Определение уРНХ н транскрипции гена р5Э в сзежевыделенных и культивируемых иапсцитгх .

Поскольку ген р53, вероятнее, всего утаствуэт в регуляции экспрессии генов контролируют* деление клетки, приводяеих к дальнейшей ди$ференцировке моноцитов в макрофаги, был проведен анализ транскрипции этого гена в моноцитах при их активации. В качестве контроля активации генов моноцитов/макрофагов был выбран ген ФНО-а.

В предварительных экспериментах, проведенных совместно с и./. Осиповичем, обнаружено, что свекевкделзнные моноциты содержат зрелую мРНК гена р53 (рис-JiK Э). Стимуляция моноцитов С УС вызывала резкое снижение количества мРНК р53 на 0,5-5 часу активаця* и полису ее отсутствие на IB часу (рне. Ж 9). Добавление ЦКГ к не активированным САК моноцитам приводило к исчезновению МРКК р53 на 16 часу инкубации (рис.№ 9Б). Некоторое количество мРНК р53 наблюдалось в необработанных САК клетках (рис.й ЭБ.) после IB часов инкубации. Анализ транскрипции гена р53 (рис.К Ю) покззал, что ген р53 транскрипционно активный как в свежевыдзленшк, так и в активированных САК моноцитах. Добавление ШГ через 2,5 часа после активации моноцитов не приводило к какому-либо изменению уровня .транскрипции (рис.Л 10). _ . ,

Ген ядерного фэсфопротеина р53 относится к так назывземым "генам домашнего пользования" (housekeeping genes), КОТОрые -•экспрессируются во всех .тканях организма. Мы исследовали-регуляцию транскрипции этого гена при активации моноцитов в сравнении с индуцпбельными генами цитокинов: ФНО-а, Ю1-8 и КЛ-1/з.

Изменение экспрессии гена р53 наблюдалось при дифференцировке мышиной линии зряторолейкемии (mel) и тератокарциномы f9 под действием ретиноевой кислоты (Reich et al 1эзз, Xhochbin £ Lawrence 1989), из чего последовало предположение, что этот ген • регулируется на транскрипционном уровне.

Ранее было показано, что в свежевыделенных моноцитах присутствует мРНК гена р53 ( osipovich et ai., iss2). При активации моноцитов in vitro мРНК этого гена быстро исчезала. Наш обнаружено, что в отличии от генов монокинов, транскрипция гена р53 происходит постоянно на протяжении культивирования в независимости от присутствия САК либо других стимулов. . Подобная стабильность транскрипции гена р53 наблюдалась в клетках .линии тератокарциьомы f9 во время их диффернцирозки, в то время как зрелая мРНК р53 полностью исчезала ( Dony et ai. 1985). Таким образом, исчезновение мРНК р53

во время активации моноцитов, вероятнее всего, связано с механизмом, посттранскршзциовно регулиругшм стабильность мРНК.'

Похожее исчезновение мРНК лизоцима и c-fas наблюдалась при активации адгезией моноцитов, выделенных на перкольвых градиентах

(Eierman et al. 1989, Haskill et al. 1991). ЦКГ ТЭК Ее He

предотвращал индуцированное адгезией исчезновение мРНК лизоцима (Eierman et ai.. 19S9), как и в наших экспериментах исчезновение мРНК р53 при активации САК. Поскольку мРНК р53, лизоцима и c-fcs не содержат личЗогатый участок в З'-нетранслируемой области, можно сделать вывод, что другие механизмы, не зависящие от биосинтеза Селка, участвуют в регуляции экспрессии этих генов на посттранскришиовном уровне.

Из данных этой работы видно, что изменение функциональной активности моноцитов, видимое по изменению транофишши гена ШО-а. приводило к раннему и быстром!' исчезновению мРНК р53. Совсем противоположное поведение мРПК р53 нгбюдалось в экспериментах по активации лимфоцитов пере прической кроии человека (Osipovich et. ai.). Неактивированные лимфоциты не содержат зрелой мРНК р53, которая индуцируется при активации их фятогемаглютинином. Это рззличие в экспрессии мРНК р53 в покоящихся моноцитах и лимфоцитах можно объяснить тем, что .эти клетки в норме находятся нэ разных, стадиях клеточного цикла.

Выводы:

1. Моноциты, выделенные из крови методом фракционирования на градиенте плотности Перколла не активироваш, поскольку не транскрибируют гены фактора некроза опухолей-а, иктерелейкина-Ie и интерелейкина-8 и не содержат зрелой мРНК этих генов. Полученные этим методом моноциты предложены как модель для изучения закономерностей синтеза монокинов.

2. Инкубация моноцитов in vitro приводит к активации транскрипции генов фактора некроза опухолей-а, интерелейкина-1э и интерелейгсинэ-8. Активация моноцитов экзогенным фактором некроза опухолей-а не индуцирует появление зрелой мРНК фактора некроза опухолей-а и не изменяет количества мРНК интерелейкина-8, индуцированной в моноцитах культивированием in vitro.

3. На предложенной модели . проанализирована активация транскрипции гена фактора некроза опухолей-а . Обнаружено, что активация транскрипции гена фактора некроза опухолей-а происходит при участии нескольких факторов как зависящих, так и независящих от

биосинтеза белка в моноцитах. Определены временные границы участия различных факторов в регуляции синтеза ыРНК фактора некроза опухэлеа-о при активации моноцитов in vitro.

4. Ген р53 транскрибируется коаституитивно в ядрах как в свекевыделенных так и культивируемых моноцитов. Активация моноцитов золотистым стафилококком либо обработка их циклогексимидо^ ке изменяет скорости тракскртож этого генг е моноцитах. Исчезновение мРНК р53 цри активации моноцитов опосредовано лоот'гранскрлщконноЕ регуляцией.

Благодарности.

Автор выражает благодарность сотруднику лаборатории медиаторов иммунитета и кроветворения И.К.Сазостиыу за совместное планирование и обсуждение результатов экспериментов, сотрудникам лаборатории молекулярной иммунологии КЕЛНИИПК г. Минск, Республика Беларусь: А.О.Осиповичу, Н.И.Мисуно, Т.е. Колесниковой за непосредственную помощь, оказанную при клюлвешга этой работы.

Особую благодарность автор выражает своему научному руководителю, заведующему лабораторией медиаторов иммунитета и кроветворения, к.б.п. А.Б.Сударихову за обучение навыкам работы по молекулярному клонированию и Нозерн-блот анализу, за научное руководство и .труд по .чтению и редактировании диссертации.

Автор также выражает глубокую благодарность своему научному руководителю доктору мед. наук Н.Н.Войтечку, сделавшему возможным выполнение этой работы,'за общее научное руководство и большую помощь при выполнении работы.

Основные результаты по теме диссертации опубликованы в следуищщ работах:

1. Osipovich O.A., Misuno N.T., Kolesnikova T.S., Fegedir.g K.V., Savostin I.K., Sudarikov A.B., Voitenok N.N. "The influence of cycloheximide on THF-a gene transcription in human blood monocytes activated in vitro." Abstr. Intern. Confer. Med. Biotschnol. Immunizat. AIDS.- Leningrad, 1931. P.15

2. Osipovich O.A., Misuno K.I., Kolesnikova T.S., regeding K.V., Savostin I.K., Sudarikov A.B., Voitenok K.N. "Cycloheximide dependence of THF-oc gene transcription in activated human monocytes? Abstr. Second Intern. Symp. Molacul. Biol. Hecatopoiesis. Intern. J. Cell Cloning.- 1991.- Vol. 9.- Ko 4.-P. 330.

3.' Osipovich o.A., Misuno K.I., Kolesnikova T.S., Fegedir.g K.V.,

Savostin I.K., Sudarikov A.B., Voitenok N.N. ".The difference in p53 antioncogene expression" in human monocytes and linphocytes." Abstr. Second Intern. Symp. Molecul. Biol. Hematopoiesis. Intern. J. Cell Cloning.-' 1991.- Vol. 9.- Ho 4.- P. 330.

4. Osipovich O.A., Misuno N.I., Kolesnikova T.S., Fegeding K.V., Savostin I.K., Sudarikov A.B., Voitenok N.N. "The influence of cycloheximide on TNF- a gene transcription in hussn blood monocytes activated in vitro" Abstr. 11 Eur. Immunol. Meeting. Helsinki, 1991.

5. Osipovich O.A., Misuno N.I., Kolesnikova T.S., Fegeding K.V., Savostin I.K., Sudarikov A.B., Voitenok N.N. "Cyclohexinide dependence of TNF-a gene transcription in activated human monocytes." Abstr. Third Intern. Workshop on Cytokines, cytokine, 1991, v.3, p.456.

6. Osipovich O.A., Misuno N.I., Kolesnikova T.S., Fegeding K.V., Savostin I.K., Sudarikov A.B., Voitenok N.N. "Time course and cycloheximide dependence of TNF-alfa gene transcrmptiaa in human monocytes" 2 Int. Congress on the immune consequences of trauma, shock and sepsis. Munich, 1991.

7. Osipovich O.A., Misuno N.I., Kolesnikova T.S., Fegeding K.V., Savostih I.K., Sudarikov A.B".,'Voitenok M.'N. • "The-" influence of cycloheximide on TNF-a gene transcription in huaan blood monocytes activated in vitro" Abstr. 8 Int. Congr. Immunol., Budapest, .1992, »E-25-27.- .

B. Fegeding K.V., Osipovich O.A., Misuno N.I., Kolesnikova T.S., Savostin I.K., Sudarikov .A.B., Voitenok N.N. »IL-8 gene transcription and mRNA accumulation in human monocytes are TNF-independent". Abstr.,8 Symposium Mol. Biol. Hematopoiesis. Basel, 1993.

9. Osipovich O.A., Fegeding K.V., Misuno N.I., Kolesnikova T.S., Savostin I.K., Sudarikov A.B., Voitenok N.N. "Differential action and activation stimuli on transcription of TNF-, IL-1&, IL-8 and p53 jenes in human monocytes." 1993, J.Immunol.v 150, p. 4960-4961.

Подписано к печати "¡4 >• оч 1994 Г. Отпечатано на ротапринте в Формат бумаги 30x42/4

Производствен*»! комбинате Объем 2 п. л.

Литературного фонда России Зак. ^Тир. 100