Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ ДНК-связывающих свойств белка Р53

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Анализ ДНК-связывающих свойств белка Р53"

российская академия наук институт молекулярной биологии им. ваэнгельгардта

На правах рукописи удк 577.21

КУЗНЕЦОВ Николай Владимирович АНАЛИЗ ДНК-СВЯЗЫВАЮЩИХ СВОЙСТВ БЕЛКА Р53

(03.00.03 - молекулярная биология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -1995

' ь Он

Работа выполнена в лаборатории пролиферации клеток Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН.

Научный руководитель: доктор биологических наук

П.М.Чумаков

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, академик РАЕН, профессор доктор химических наук, профессор

А.Д.Альтштейн С.Н.Кочетков

Ведущая организация:

Институт канцерогенеза Всеросийского онкологического центра им. Н.Н.Блохина РАМН

Защита диссертации состоится : _ 19-02 1996 г. в 12. час, на заседании диссертационного совета Д 002.79.01 адресу: 117984, Москва, ул. Вавилова, д.32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им.В.АЭнгельгардта РАН.

Автореферат разослан : -01 1995 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук

С

'/Р/^У

А.М.Крицын

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

актуальность проблемы

С момента открытия в 1979 г ядерный фосфопротеин р53 и кодирующий его ген являются обьектами пристального изучения. Об актуальности проблемы в настоящее время свидетельствует тот факт, что в 1994 году журналом "Science" р53 был отмечен как 'молекула года". Сейчас стало очевидным, что р53 находится на перекрестке сигнальных, регуляторных и метаболических путей в клетке и играет существенную роль в ансамбле клеточных процессов.

Белок р53 дикого типа человека является сиквенс-специфическим ДНК-связывающим гетрамерным транскрипционным фактором, каждая субьединица которого содержит 393 аминокислотных остатка (а.о.). ДНК-связывающий домен мономера белка расположен между 90 и 290 а.о., N-концевая область белка содержит трансактивационный домен, а С-концевая область содержит олигомеризационный домен, несколько сигналов ядерной локализации, а также регулирует ДНК-связывающую активность белка.

р53 способен специфически узнавать в регуляторных областях генов и связываться с цимерами палиндромных последовательностей типа: 5'-RRRCWWGYYY-3" (El-Deiry et al,92; Funk et al,92), получившими название р53-респонсивных элементов. В настоящее время подобные последовательности обнаружены почти в двух десятках различных генов. Одно из направлений данной работы заключалось в поиске и функциональном анализе канонических р53-респонсивных элементов в генах - потенциальных мишенях р53.

р53 дикого типа, но не мутантный р53 способен подавлять клеточную трансформацию in vitro и in vivo, что позволило считать ген р53 геном-супрессором злокачественного роста (Lane et al.,1990). С этой биологической ролью белка р53 можно связать по крайней мере две его важных активности, проявляющихся, в частности, при повреждениях клеточной ЦНК.

Во-первых, когда масштабы таких повреждений не слишком значительны, р53 способен арестовывать клетки на границе Gi-фазы и S-фазы клеточного цикла (Mercer et al., 1990), тем самым позволяя репарационным механизмам ликвидировать повреждения в ДНК прежде, чем начнется репликация клеточного генома. За данную функцию р53 в частности ответственна его способность позитивно регулировать экспрессию гена, кодирующего белок WAF1 - ингибитор Gi -циклинэависимых протеинкиназ (El-Deiry et al, 1993), причем длительность Gi -ареста клеточного цикла по-видимому может зависеть от регуляции экспрессии белком р53 другой его мишени - гена mdm2, белковый продукт которого способен взаимодействовать с р53 и тем самым блокировать часть активного р53 в клетке.

Во-вторых, когда такие повреждения, вызванные например радиацией или химиотерапевтическими агентами слишком обширны, чтобы быть отрепарированными, белок р53 может индуцировать программированную клеточную смерть (апоптоз) (Fisher, 1994). Возможно, что эта функция р53 опосредована координированной активацией/репрессией экспрессии р53-респонсивных генов Ьах и bcl-2, кодирующих гомологичные белки с антагонистическими функциями, первый из которых ускоряет, а второй блокирует апоптоз (Reed et al.,1995).

Таким образом, потеря р53 может приводить к дестабилизации клеточного генома являющейся результатом как накопления мутаций при репликации неотрепарированно! ДНК, так и повышения выживаемости клеток с изменениями в геноме.

Инактивация или мутация гена р53 является наиболее общим изменением в геноме npi туморогенезе (Hollstein et al., 1991), которое наблюдается более чем в половине случае! опухолей у человека (Friend et al., 1994). Наиболее частыми изменениями гена р53 i опухолях являются миссенс-мутации, т.е. замены одного аминокислотного остатка h¡ другой, что может быть связано с появлением у таких мутантных вариантов белка р5: одной или нескольких новых функциональных активностей, не характерных для р53 дикоп типа.

Анализ спектров миссенс-мутаций р53 из различных опухолей выявил, чп подавляющее большинство аминокислотных замен происходит в консервативны: областях белка, формирующих ДНК-связывающий домен р53 (Cho et al., 1994). Пс видимому, именно изменения специфической ДНК-связывающей активности как ключево! функции р53 могут быть причиной аномальных биологических свойств мутантов р53 npi туморогенезе. Результатом таких изменении ДНК-связывания может быть как смен: спектра последовательностей ДНК, узнаваемых р53, проявляющаяся например i появлении способности мутантов связываться с новыми классами респонсивны элементов, так и понижение или повышение аффинности мутантного белка к известны» р53-респонсивным элементам с канонической последовательностью.

В связи с этим одним из направлений данной работы было с одной сторонь рассмотрение взаимодействия р53 дикого типа с рядом р53-респонсивных элементов и известных генов - мишеней р53, а с другой - исследование взаимодействия различны мутантных вариантов белка с консенсусной последовательностью р53-респонсивноп элемента.

Способность к взаимодействию белка р53 с ДНК зависит от ряда структурно функциональных характеристик белка, к которым кроме мутационных изменени структуры относятся конформационное состояние молекулы, способность р53 переходит в неактивное мультимерное состояние (Hupp et al., 1992), а также внутримолекулярно взаимодействие с ингибиторным доменом (Clore et al.,1994). Две последние возможност связаны в основном с соответствующими структурами С-концевой области белка р53 по-видимому могут быть блокированы различными агентами, например монокпональным антителами к С-концу молекулы (Hupp et al.,1992). Часть настоящей работы посвящен исследованию влияния этих свойств р53 на его взаимодействие с ДНК.

Поскольку биологические эффекты р53 как супрессора клеточной трансформаци опосредованы его ключевой биохимической активностью - специфически! взаимодействием с ДНК, то с коррекцией данной активности могут быть связаны терапевтические аспекты проблемы онкогенеза. Такой генотерапевтический подход може включать в себя введение в регуляторные области определенных генов р5: респонсивных элементов с различными функциональными свойствами, блокировани известных регуляторных р53-респонсивных сайтов антисмысловыми полинукпеотидамь использование генноинженерных вариантов белка р53 или его фрагментов модифицированной ДНК-связывающей активностью, а также применение биохимически зондов на основе моноклонапьных антител к р53.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью данной работы являлось изучение различных аспектов специфического >заимодействия белка р53 с ДНК in vitro. В частности были поставлены следующие адачи:

- выявить новые потенциальные р53-зависимые гены, содержащие канонические р53-вязывающие последовательности ДНК;

охарактеризовать взаимодействие белка р53 дикого типа с р53-респонсивными ДНК-лементами из регуляторных областей различных генов-мишеней р53, а также с юкусственными вариантами р53-респонсивного элемента; изучить с помощью панели различных моноклонапьных антител к р53: а) влияние модификации антителами С-концевой области белка на регуляцию его ДНК-зязывающей активности;

б) зависимость ДНК-связывающих свойств белка р53 от его конформационного остояния, детектируемого антителами, специфичными к конкретным конформациям ¡елка;

исследовать ДНК-связывающую активность некоторых мутантных вариантов белка р53.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ

Впервые обнаружен и функционально охарактеризован р53-респонсивный элемент из -го интрона гена человека, кодирующего фермент аденозиндезаминаэу.

Проведен анализ взаимодействия р53 с р53-респонсивными элементами из различных енов и искусственными вариантами консенсусной последовательности. Выявлена мквенс-зависимость интенсивности взаимодействия р53 дикого типа с респонсивными цементами из различных генов-мишеней р53, что предполагает существование иерархии 1НК-элементов, специфически взаимодействующих с р53.

Разработана методика подробного титрования р53-содержащих ДНК-белковых омплексов в нукпеопротеиновом геле, позволяющая анализировать влияние различных гонокпональных антител к р53 на взаимодействие р53 с ДНК. Получены данные о влиянии онформационного состояния р53 и модификации С-концевой области р53 юнокпональными антителами на его ДНК-связывающие свойства. Получен ряд клонов рансформированных N-ras фибробластов мыши, экспрессирующих активные в сношении ДНК-связывания мутанты р53. Обнаружена способность ряда мутантов р53 к пецифическому взаимодействию с ДНК in vitro, а также повышенная по сравнению с 1ругими мутантами интенсивность взаимодействия с ДНК мутанта р53 175(Arg->His), что щляется существенным для понимания функциональных особенностей некоторых (утантов р53 при туморогенезе.

АПРОБАЦИЯ ДИССЕРТАЦИИ

Материалы диссертации были изложены на межлабораторном коллоквиуме 1аборатории пролиферации клеток Института молекулярной биологии им. ¡.А.Энгельгардта РАН и лаборатории цитогенетики опухолей Института канцерогенеза ¡серосийского онкологического центра им. Н. Н. Блохина РАМН (Москва, 1995 г.),

на молодежной научной школе "Молекулярная биология конец XX века (г. Черноголовка,1995 г.), на 7-м Международном научном симпозиуме по р53 (Канада

1994 г.), на международном семинаре молодых ученых: "Детекция молекулярны взаимодействий, контролирующих экспрессию генов " (Швеция, 1994 г.), н международном семинаре молодых ученых по проблемам клеточной биологии (Дания

1995 г.).

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ

Диссертация изложена на страницах машинописного текста, иллюстрирован

YS рисунками, / таблицами и включает обзор литературы, практическуь часть, состоящую из результатов и их обсуждения, выводы и список литературы (всего

0.2.4 источника).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Ген человека, кодирующий фермент аденозиндезаминазу содержит р53 респонсивный элемент.

С помощью компьютерной базы данных GenBank в 1-м интроне гена человеке кодирующего фермент аденозиндезаминазу (АДА) (КФ 3.5.4.4), была обнаружена 21 п.н последовательность: 5'-AAACTTGCCCAAGACATGCCC-3', удовлетворяюща каноническому консенсусу р53-респонсивного элемента.

Ранее было показано, что изменение уровня активности этого фермента пуриновог обмена является критическим для процессов биосинтеза нуклеиновых кислот и клеточно пролиферации. Снижение ферментативной активности АДА детектировалось в некоторы случаях рака у человека (Sufrin et al., 1977; Russo et al., 1984), а при лейкозе наблюдалас повышенная активность АДА, вызванная увеличением уровня синтеза фермента (Morrisal et al., 1985).

Для проверки возможности взаимодействия белка р53 дикого типа с данным элемента из гена АДА был проведен эксперимент по анализу сдвига электрофоретической (Э<5 подвижности меченого олигонуклеотида, имеющего соответствующу!

последовательность.

Олигонуклеотид метили стандартной прямой полинуклеотидкиназной реакцие! Меченный олигонуклеотид очищался разгонкой в 12% полиакриламидном геле (ПААГ) в 1 трис-боратном ЭФ-буфере с последующей элюцией из ПААГ. Элюат наносился на колонк с ДЕАЕ-фильтром и затем абсорбированный олигонуклеотид смывался с ДЕАЕ-фильтра переосаждапся в 96% этаноле с тРНК.

В качестве источника белка р53 был взят ядерный экстракт клеток COS1 (клетки почк обезьяны, трансформированные ранней областью генома вируса SV40). Клетки COS представляют собой удобную модельную систему, характеризующуюся повышеннЪн содержанием стабилизированного под влиянием большого Т-антигена вируса SV40, белк р53, что подтверждается результатами сравнительного анализа количеств функционально активного белка р53 из ядерных экстрактов различных клеточных линий помощью метода сдвига ЭФ-подвижности олигонуклеотида в геле (рис.1).

IT)

— I ™ г Г- i - Я \ У O o £ o ё o со r—. i-4

f 1 1 W j _1 íft h*

РаЫ22 (800ng) + 1 + ! -f ■f +

комплекс i i

олигоиуклеотида CON с p53 и РАЫ22

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

комплекс олигонуклеотида CON с р53__„

Щ

■ Х-:: Ч»

Рис.1: Сравнительный анализ количества функционально-активного белка р53 в ядерных экстрактах из различных клеточных линий с помощью метода сдвига ЭФ-подвижности олигонуклеотида в геле. Использовались клетки: COS1 (дор.1,2); UM1215 'дор.3,4); SW480 (дор.5,6); IMR32(dop.7,8); НТ1080 (дор.9,10); 10(1) (дор.11,12). Пробы 2, 4, 5, 8, 10, 12 были проинкубированы с моноклональным антителом РАЫ22, усиливающим QHK-связывание р53.

Инкубация ядерного экстракта с меченным олигонуклеотидом проводилась i буфере: ЮОтМ NaCI, 20тМ HEPES (рН7,5), 1,5шМ MgCI , ЮтМ DTT, 0,1% Triton Х-10С 20% глицерин. (Содержание тотального белка в экстракте определялось колориметрией i кумасси R-250 и составляло 1,95-2,10 мг/мл.). Затем в пробу вносились препарать антител с варьирующими концентрациями в обьеме 1 мкл. Пробы инкубировались 10 ми) (к.т.) и наносились на 5% ПААГ. Электрофорез проводился в Jx трис-боратном ЭФ-буфер| при силе тока 40 тА и постоянном напряжении 300 V при 4 С в течение 3 часов. ПАА1 высушивался на установке для сушки гелей (Slab Dryer (Model 483, США] Электрофореграммы получены экспонированием фоточувствительной пленки (Fuji Medice X-Ray Film) с высушенным гелем в течение 24-48 часов.

Полученные результаты подтвердили способность белка р53 специфичесю взаимодействовать с данной последовательностью ДНК (рис.2), что позволяв рассматривать ген аденозиндезаминазы как потенциальную мишень регуляторно! активности белка р53.

2. Взаимодействие белка р53 с р53-респонсивными элементами из генов-мишене| р53 и их искусственными аналогами.

2.1. Функциональная гетерогенность р53-респонсивных элементов из различных генов-мишеней р53.

Рис.2: Взаимодействие белка р53 с рБЗ-респонсивными элементами из различных гено( мишеней: АО (дор.1-4); САй045 (дор.5-8); тс!т2-1 (дор.9-12); тбт2-2 (дор. 13-16): \NAF-(дор.17-20). Пробы 2-4; 6-8; 10-12; 14-16; 18-20 инкубировались с антителами РАЫ22.

С помощью метода задержки электрофоретической подвижности в геле была ¡роанализирована интенсивность взаимодействия белка р53 из ядерного экстракта клеток ¡031 с рядом олигонукпеотидов (табл.1), имеющих последовательности р53-|еспонсивных элементов из различных генов-мишеней р53. Такое взаимодействие было тносительно сильным для одних и относительно слабым для других р53-респонсивных лементов (рис.2; табл.1).

'аблица 1. Характеристика взаимодействия \/\/Тр53 с различными опигонуклеотидами.

название и 5' - 3' -последовательность интенсивность

олигонуклеотида связывания с р53

»дтЗЗАСАТОСССССССАТетсСаааса +++•+

;ОЫ(АТ/ТА) 1д ШС С АСАТС С С С АТС С С С АТйТС Саааса +

>С адсМСАСАТвССТАСАСАТСССТа ++*+

^А АААСТТССССаАЭАСАТСССС +

5АОР45 СААСАТСТСТААЭСАТССТд ++

1ат2-1 СИСААСТТдССАСАсЗТСС +

1с1т2-2 САССТаАСТССТСАСАТСТСТ +

УАР1 СААСАЮТССсААСАТСТТд +++■

фланкирующие и спейсерные последовательности, а также вариации от оследовательности консенсуса отмечены строчными символами)

К первому типу могут быть отнесены соответствующие последовательности из гено1 WAF1 и GADD45, а также искусственные варианты консенсусной последовательное CON (Funk et al., 1992) и PG (Hupp et al.,1992), которые не обнаружены в геноме. I относительно слабо взаимодействующим с р53 последовательностям могут быт отнесены респонсивный элемент из гена ADA, 1-й и 2-й сайты связывания с р53 из ген; mdm2, а также искусственый вариант консенсуса СО|\|(АТЯА), отличающийся о последовательности CON наличием двухнуклеотидного спейсера между 1С нуклеотидными полусайтами.

Совместно с Р.В.Кондратовым было обнаружено, что р53-респонсивньп элементы из генов WAF1, GADD45, ADA и mdm2, будучи помещены пере, тимидинкиназным промотором вызывают активацию транскрипции репортерного гена СА' в векторе рСАТ-ТКО. По трансактивирующей способности эти р53-респонсивные элемент* отличались гетерогенностью, коррелирующей с интенсивностью их взаимодействия с ДН в экспериментах по сдвигу ЭФ-подвижности в геле (рис.3), из чего можно предполагат существование иерархии регуляторных элементов генома, специфическ взаимодействующих с р53.

/ 1

штщ

Ш Ш

■• иятенсивмс-^г» полось: сдвига ЭФ-подзижкости сянго>-у^лвогидя

- по;«?;»: суиврелвигз

ЭФ-подамжиссти олигснуклестяя«

интеисианэсть тйамгча-ттизаййи р"---чч "л-.ч'-.'«"- и ■> i< V

\

IP iiflfl .....If

ЩЩШШШШШшШШ > í.

• l|iilliil|plii|i|il¡lll

. шшшшщштшшшшщшшя • pilotó

■щщша

;<■ л, " 5 <>•:.''/■ - ¡?

WAF1

AD

mdm2-1 mcim2»2

вА0045

Рис.3: Корреляция между ДНК-связывающей и трансактивационной активностями белка р53 для различных р53-респонсивных элементов.

На основе данных о различной аффинности белка р53 к р53-респонсивным элементам из некоторых генов-мишеней р53, данных о различной трансактивационной способности этих респонсивных элементов, а также данных 1.еу1пе е1 а1.,1993 об авторегуляции экспрессии гена р53 путем образования комплекса белка р53 с инактивирующим его белковым продуктом р53-реслонсивного гена тс1т2 по принципу петли отрицательной обратной связи мы предлагаем схему координированной регуляции белком р53 экспрессии этих генов-мишеней (рис.4).

Рис.4: Схема координированной регуляции белком р53 экспрессии некоторых р53-оеспонсивных генов.

2.2. Введение спейсера в канонический консенсус ослабляет специфическое ДНК-связывание.

Канонический консенсус связывания белка р53, выявленный в 1992 году El-Deiry et al. и: фрагментированной геномной ДНК человека с помощью нескольких раундоЕ последовательной инкубации с транслированным in vitro белком р53, иммунопрепитации ь ПЦР-амплификации состоит из двух аналогичных полусайтов 5-RRRCWWGYYY-3' разделенных спейсером длиной 0-13 п.н. Однако практически во всех обнаруженных i настоящему моменту р53-респонсивных элементах генов-мишеней белка р53 такоС спейсер отсутствует. Введение "спейсерных" нуклеотидных пар должно как раздвигать полусайты консенсуса, так и разворачивать их друг относительно друга вдоль оси двойноР спирали ДНК (соответственно, на 1,7 А и 36 градусов на каждую пару нуклеотидов для В-типа двойной спирали ДНК). Очевидно, что способность белка р53 взаимодействовать с консенсусом, содержащим варьирующий по длине спейсерный участок предполагает определенную гибкость белковой структуры и/ипи возможность локального плавление двухцепочечной ДНК в зоне спейсера. Зависимость данного ДНК-белковогс взаимодействия от гибкости структуры белка накладывает определенные ограничения нг длину спейсерного участка, причем качество взаимодействия в этих пределах должнс меняться. Это предположение согласуется с нашим наблюдением о том, что вставка дву> нуклеотидных пар между полусайтами консенсуса приводит к значительному сниженик интенсивности как полос сдвига ЭФ-подвижности, так и полос суперсдвига (рис.5).

Рис.5. Двухнуклеотидный спейсер AI ПА, помещенный между полусайтами консенсуса ослабляет ДНК-связывание.

А

олигонуклеотид

РаЫ22 (/jg)

комплекс ------

олигонуклеотида с р53 и РАЫ22

комплекс ___________

олигонуклеотида с р53

Полученные данные и проведенный анализ нуклеотидных последовательностей р53-респонсивных элементов (табл.1.) позволяют предположить, что:

1) интенсивность взаимодействия р53 с ДНК незначительно снижается по сравнению с безошибочным вариантом консенсуса, если отличия от консенсуса затрагивают крайние положения 10 п.н.-полусайтов респонсивных элементов (например, в случаях элементов из генов WAF1 и GADD45);

2) интенсивность взаимодействия р53 с ДНК значительно снижается: а) при наличии вариаций от последовательности консенсуса в центральной ("коровой") 8 п.н.-области полусайтов респонсивных элементов (например, в случаях сайтов из гена mdm2); б) при наличии между "безошибочными" полусайтами вставки в 1-2 п.н. (в случаях р53-связывающего сайта из гена ADA и искусственного варианта консенсуса, содержащего между полусайтами 2 п.н.-вставку).

3. Влияние моноклональных антител к белку р53 на его взаимодействие с ДНК.

Для исследования влияния различных антител к р53 на его специфическое взаимодействие с ДНК in vitro были проведены эксперименты по титрованию препаратами антител олигонуклеотид-содержащих комплексов р53 и анализу задержки электрофоретической подвижности соответствующих комплексов в нативном акрипамидном геле. В данных экспериментах использовались меченный олигонуклеотид CON: 5'-TGTTTGGACATGCCCGGGCATGTCCAAACA- 3', содержащий р53-связывающую последовательность и панель моноклональных антител к р53, полученных из соответствующих гибридом. В качестве источника белка р53 был взят ядерный экстракт клеток COS1.

3.1. Зависимость ДНК-связывающей активности р53 от модификации монокпональными антителами С-концевой области белка.

Титрование комплекса р53 с ДНК монокпональными антителами РАМ 22 и РАЬ421, направленными на С-концевые эпитопы белка р53 (371-380 а.о.), смежные с областью, ответственной за олигомеризацию белка, выявило образование двух полос суперсдвига ЭФ-подвижности комплекса, причем полоса с меньшей подвижностью отличалась большей интенсивностью и максимуму интенсивности этой полосы соответствовало большее количество добавленного в пробу антитела по сравнению с более подвижной полосой суперсдвига (рис.ба). Последняя соответствует ранее не детектировавшейся интермедиаторной форме ДНК-содержащего комплекса р53 с С-концевым антителом. Повышенная интенсивность полосы тяжелого ДНК-белкового комплекса по сравнению с полосой комплекса олигонукпеотид-р53 свидетельствует об активации ДНК-связывающей активности р53 при реакции с С-концевыми антителами.

Рис.6: а) титрование комплекса олигонуклеотида CON с р53 моноклональным антителом РАМ22 к С-концевой области р53;

б) влияние моновалентных Fab-фрагментов моноклональных антител к р53 на прочность связывания ДНК комплексом РаЫ22 с р53;

в) контрольное титрование комплекса олигонуклеотида CON с р53 препаратом тотальных иммуноглобулинов человека

<Г:>-'0- -----.

COÍJ и d5J

: ' \ íí 1 äu-ri

«■ . . V г- r> Í:

^ ч*;: • ?■■ <• Í-У •::

? I У.'-. ■ - 'i

».;* : ::. c

<•; <•; ... 'l! ^ • o :: s> :: sf ¿ •-* к

.....-*

ООН с >;- >3

ГайМО ÍZ.JAiá)

+ + * i

CON ;< 'yS ¡ f. Pr>i-

llljfliP^

......' i.;,,,

о^лгонулг.еотадз

» * *

Ь

В

«.ivis';: о о-

СО» и с Ра&тгг --

.......

-•ук^О^ВДЛ

?.: к

-, ;r ;; s ïïïï.

Б

Одно из возможных обьяснений данного эффекта заключается в блокировании данными антителами С-концевых структур, ответственных за мультимеризацию и связанную с ней инактивацию белка р53 (Hupp et al.,1992) (рис.7а). Другая возможность связана с наличием на С-конце молекулы р53 предполагаемого ингибиторного домена (Prives et al., 1993), способного снижать эффективность данного ДНК-белкового взаимодействия путем маскирования ДНК-связывающего домена р53 (Clore et al., 1994) или неспецифической ДНК-связывающей активности (Bayle et al.,1995). В этом случае взаимодействие р53 с С-концевыми антителами блокирует ингибиторный домен и экспонирует ДНК-связывающий домен р53 (рис.7в). Интересно, что повышенная интенсивность характерна только для полосы более тяжелых ДНК-белковых комплексов, но не для интермедиаторной полосы. Если интермедиаторная полоса соответствует комплексу одной молекулы антитела с одной молекулой белка р53, то возможно, что для активации ДНК-связывания необходимо взаимодействие р53 с двумя и/или более молекулами антител (рис.7г).

Критической для эффекта активации является бивапентность антитела РАМ 22, покольку при добавлении соответствующего количества моновалентного FAb-фрагмента этого антитела ДНК-связывание заметно ослабляется (рис.66). Известно, что наибольшая аффинность к ДНК характерна для тетрамерной формы р53 (Hainaut et al., 1994). Вероятно, С-концевые антитела выполняют роль сшивки в области тетрамеризационного домена р53, стабилизирующей данную форму белка (рис.7б).

Рис.7: Возможные механизмы активации ДНК-связывающей активности белка р53 моноклональными антителами, взаимодействующими с С-концевой областью белка.

a) AT блокируют С-концевые структуры белка р53, ответственные за его олигомеризацию и переход в неактивное состояние (по Hupp et al., 1992);

б) бивалентные AT стабилизируют активную тетрамерную форму белка р53, тогда как моновалентные Fab-фрагменты этих антител вызывают диссоциацию комплекса;

в) AT блокируют С-концевой ингибиторный домен р53, ослабляющий специфическое взаимодействие ДНК-связывающего домена р53 с ДНК;

г) р53 переходит в активную ДНК-связывающую конформацию при взаимодействии с двумя молекулами А Т.

3.2. Зависимость ДНК-связывающей активности р53 от взаимодействия с конформационно - специфическими моноклональными антителами.

Титрование антителом РаЬ240 приводит к исчезновению полосы, соответствующей комплексу белка р53 с олигонуклеотидом CON, которое не сопровождается появлением каких-либо полос, соответствующих более высокомолекулярным комплексам (рис.8а). Однако, при изменении условий, таких как уменьшение напряжения и времени проведения электрофореза удается выявить ДНК-содержащий комплекс WT р53 с антителом РаЬ240 (рис.8б). Считается, что экспонирование эпитопа РаЬ240 характерно для мутантной конформации и проявляется у ряда мутантов р53. Наличие данного эпитопа у р53 дикого типа, находящегося в комплексе с ДНК позволяет предположить, что связывание ДНК вызывает конформационные изменения в белке р53, сопряженные с появлением эпитопа РаЬ240. Возможно, взаимодействие ДНК с WT р53 переводит последний в мутант-подобную конформацию РаЬ240 , что согласуется и с данными Halazonetis et al., 1993.

При повышении количества добавляемого РаЬ240 до 2900 ng наблюдается эффект ослабления ДНК-связывания р53, а при добавлении в пробу 8800 ng Pab240 ДНК-связывание р53 полностью снимается. (рис.8а). Аналогичное ослабление и снятие ДНК-связывания р53 наблюдалось и при добавлении к комплексу р53-олигонуклеотид антитела РаЫ620 в количествах 650 ng и 3900 ng на пробу, соответственно (рис.8в). Эпитопы РаЬ240 (212-217 а.о.) и РаЫ620 (88-109 а.о.) расположены в области р53, ответственной за специфическое ДНК-связывание (Cho et al., 1994). По-видимому, при достижении определенных критических концентраций данные антитела либо стерически конкурируют с ДНК за связывание с р53, либо вызывают конформационные изменения комплекса ДНК-р53, приводящие к его диссоциации.

Специфичность эффектов влияния моноклонапьных антител на связывание р53 с ДНК подтверждается данными контрольного титрования комплекса р53-олигонуклеотид тотальными иммуноглобулинами человека, которое не выявляет заметного влияния lg на ДНК-связывание в диапазоне внесенных в пробу количеств lg от 350 ng до 50000 ng (рис.бв).

i'AbiG?!'!

\

........i

¿WWS'^Wy.s.-l

I I

f

г; ¿

I

Vr^-nosi"; CON riS'i

m

■ ■

Ы

Рис. 8 :Титрование комплекса олигонуклеотида с р53 конформационнно-специфичными моноклональными антителами: а) РаЬ240; в) РАМ 620;

б) выявление мутантного зпитопа РаЬ240 + у р53 дикого типа из клеток COS1, находящегося в комплексе с олигонуклеотидом CON.

4. ДНК-связывающая активность мутантных вариантов белка р53.

Первоначально считалось, что способность к специфическому связыванию с ДНК является одним из тех признаков, которые отличают биологическую активность р53 дикого типа от активностей мутантов р53. Позже специфическая ДНК-связывающая активность была обнаружена и у ряда мутантов (Zhang et al.,1993). В настоящей работе образование комплексов с меченным олигонуклеотидом CON наблюдалось для некоторых мутантных вариантов р53. Данные мутанты экспрессировапись в клетках 10(3) (фибробласты мыши, лишенные эндогенного р53), предварительно трансформированных онкогеном N-ras и прошедших селекцию на среде с антибиотиком (рис.9). Введение в клетки 10(3) онкогена N-ras вероятно могло оказывать стабилизирующее влияние на р53, а также моделировало реальную ситуацию, часто наблюдающуюся in vivo в ряде клеточных линий, трансформированных белковым продуктом этого онкогена. Присутствие белка в данных клетках детектировалось методами Вестерн-блоттинга и анализа сдвига ЭФ-подвижности в геле (рис.10).

трансфекция pPS hygro/xas

инфекция

трансфекция

селекция на антибиотике

трансфекция pPS neo/p53wt

pPS neo/p53mut

инфекция

селекция на антибиотике

лизис клеток

Вестерн-блоттинг

анализ ДНК-связывания

Рис. 9: Схема получения клонов /\i-Ras трансформированных фибробластов мыши линии 10(3), экспрессирующих мутантные варианты белка р53.

18

Мутанты р53 Н1э175, Тгр248 и Н|э273 связывали ДНК как в присутствии антитела РаЫ22, так и без него (рис.1 Оа). Наибольшая интенсивность полосы сдвига ЭФ-подвижности в отсутствие РаЫ22 характерна для мутанта Тгр248 (рис.1 Оа дор.5). Мутант р53 Н[э175 отличается повышенной по сравнению с другими мутантами интенсивностью полосы суперсдвига ЭФ-подвижности. Все три мутантных белка реагируют со специфичным к мутантной конформации р53 антителом РАЬ240, что детектируется по исчезновению полосы сдвига ЭФ-подвижности и появлению специфической полосы суперсдвига (рис.Юа дор.3,7,11). Взаимодействие мутантов р53 с антителом РАМ620 приводит к исчезновению полосы сдвига ЭФ-подвижности, но при этом не наблюдается появления каких-либо других специфических полос (рис.10 дор.4,8,12).

Рис.10: а) ДНК-связываюьцая активность мутантных вариантов белка р53: 175(Arg->His) - (дор. 1-4); 248(Arg->Trp) - (дор. 5-8); 273(Arg->HÍs)-(дор.9-12);

б) детекция экспрессии мутантов р53 в ядерных экстрактах из N-Ras трансформированных клеток линии 10(3) методом Вестерн-блоттинга.

Интересно, что в случае мутанта Н1э175 имеет место дополнительна? высокомолекулярная минорная полоса, которая наблюдается как в присутствии антителг РАМ 22, так и без него. Эта полоса вместе со специфической полосой суперсдвигг образует характерный дублет (дор.З) в присутствии РАЬ240 и исчезает в присутств№ РАМ 620 (дор.4). Вероятно, р53, входящий в состав этого комплекса маскирует свой С концевой эпитоп для РАМ 22, но способен взаимодействовать с антителом РАМ 620 специфичным к конформации р53 дикого типа. По-видимому, соответствующий это1 полосе р53-содержащий ДНК-белковый комплекс демонстрирует характерное для данногс мутанта р53 взаимодействие, что может быть связанно с появлением индуцированны> мутацией новых биологических свойств белка и требует дальнейших исследований.

ВЫВОДЫ:

1.Обнаружен и функционально охарактеризован р53-респонсивный элемент из 1-го 1нтрона гена человека, кодирующего фермент аденозиндезаминазу. Данный ген может рассматриваться как потенциальная мишень транскрипционно-регуляторной активности эелка р53.

2.Белок р53 дикого типа ядерного экстракта клеток COS1 обладает различной аффинностью к р53-респонсивным элементам из регуляторных областей различных енов-мишеней р53, что предполагает существование иерархии ДНК-элементов генома, гпецифически взаимодействующих с р53. Выявлены некоторые закономерности 1уклеотидных последовательностей р53-связывающих элементов, влияющие на их ¡родство к белку р53. Предложена схема регуляции экспрессии ряда р53-респонсивных енов.

3.Проанализировано влияние различных монокпонапьных антител к белку р53 на его ззаимодействие с ДНК. Показано, что эффект активации ДНК-связывания р53 под алиянием монокпональных антител к С-концевой области белка определяется 5ивалентностью данных антител. Обнаружена интермедиаторная форма ДНК-содержащих сомплексов данных антител с р53.

4.У р53 дикого типа, находящегося в комплексе с ДНК как и у ряда мутантов р53 зыявлено экспонирование эпитопа РаЬ240, характерного для мутантной конформации. Появление данного эпитопа позволяет предположить, что взаимодействие ДНК с WT р53 1ереводит последний в мутант-подобную конформацию.

5.Получен ряд клонов трансформированных N-ras фибробластов мыши, жспрессирующих активные в отношении ДНК-связывания мутанты р53, что является ¡ущественным для определения функциональных активностей мутантов р53 при гуморогенезе.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ ИЗЛОЖЕНО В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ:

1.3айчук Т.А., Кузнецов Н.В., Осовская B.C., Копнин Б.П., Чумаков П.М Специфические ДНК-связывающие свойства онкобелка р53 в опухолевых клетка; человека. Доклады РАН, 1993, т.ЗЗО, стр.386-389.

2. V.S.Ossovskaya, B.P.Kopnin, R.V.Kondratov, N.V.Kuznetsov, T.P.Stromskaya N.P.GIushankova, P.M.Chumakov. 7th p53 Workshop, Canada, 1994, p.12.

3. Кондратов Р.В., Пугачева E.H., Кузнецов Н.В., Прасолов B.C., Копнин Б.П. Чумаков П.М. Ген аденозиндезаминазы человека содержит р53-респонсивный элемент Доклады РАН, 1995, т^стр.¡66-270

4. Кондратов Р.В., Кузнецов Н.В., Пугачева E.H., Алмазов В.П., Прасолов B.C., Копнш Б.П., Чумаков П.М. Функциональная гетерогенность р53-респонсивных элементов Молекулярная биология, 1995, т.З^стр.

5. Кузнецов Н.В., Чумаков П.М. Иммунохимический анализ взаимодействия белка р53 < ДНК. Молекулярная биология, 1996, т. стр.