Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Реактивация противоопухолевого белка p53 в клетках человека, содержащих высокоонкогенный вирус папилломы

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Реактивация противоопухолевого белка p53 в клетках человека, содержащих высокоонкогенный вирус папилломы"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ им В А. ЭНГЕЛЬГАРДТА

На правах рукописи

Кочетков Дмитрий Владимирович

РЕАКТИВАЦИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО БЕЛКА р53 В КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА, СОДЕРЖАЩИХ ВЫСОКООНКОГЕННЫЙ ВИРУС ПАПИЛЛОМЫ.

Специальность 03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА-2008

ООЗ

003172208

Работа выполнена в лаборатории пролиферации клеток Института молекулярной биологии им В А Энгельгардта РАН

Научный руководитель

Научный консультант

Официальные оппоненты

Ведущая организация

кандидат биологических наук Ю Е.Кравченко

доктор биологических наук, профессор П.М.Чумаков

доктор биологических наук, профессор Б С Народицкий

доктор биологических наук Н.Л Лазаревич

ГНИИ Генетики и Селекции промышленных микроорганизмов

оО

Защита диссертации состоится 2008 г в часов на заседании

Диссертационного совета Д 002 235 01 в Институте молекулярной биологии им В А Энгельгардта РАН по адресу 119991 Москва, ул Вавилова, д 32

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им В А Энгельгардта РАН

Автореферат разослан «2 »ллО-А 2008 года

Ученый секретарь Диссертационного сое^п! Кандидат химических наук

рицын

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ.

Транскрипционный фактор р53 является важнейшим противоопухолевым белком, эффективно охраняющим клетку от приобретения мутаций и злокачественной трансформации Разнообразные стрессы, неблагоприятные факторы (ультрафиолетовое и 1 амма-облучение, повреждающие ДНК химические соединения), повреждения клеточных структур и серьезные отклонения в физиологии клетки приводят к накоплению и активации белка р53 В результате увеличения экспрессии р53-регулируемых генов происходит либо задержка клеточного цикла, дающая клетке время для восстановления повреждений, либо происходит запуск программированной клеточной смерти (Ъеуше, 1997), приводящей к удалению из организма ненормальных клеток, представляющих потенциальную опасность при последующем накоплении мутаций р53-зависимая выбраковка измененных клеток обеспечивает исключительно действенную защиту организма от развития злокачественных опухолей

Однако защитные механизмы, контролируемые геном р53, могут сами по себе подвергаться повреждениям, что снимает запрет на размножение измененных клеток, в результате чего возникают онкологические заболевания Нарушения функции р53 наблюдается практически в каждом случае зтокачественных заболеваний, причем приблизительно в половине опухолей обнаруживаются точечные мутации в самом гене р53 (НизБаш, 1998) В отличие от других опухолевых супрессоров, для которых характерны мутации, прекращающие синтез белка (делеции, образование стоп-кодонов, сдвиг кодирующей рамки, нарушения сплайсинга мРНК), подавляющее большинство мутаций гена р53 приводят к заменам аминокислот, что сопровождается не только утратой функции одного аллеля гена р53, но и приводит к подавлению активности продукта второго аллеля, за счет доминантно-негативного действия мутантного белка р53

Нарушения функции р53 происходит и при мутациях в генах, контролирующих уровень и активность белка р53 Существенную роль могут играть также ДНК-содержащие онкогенные вирусы, продукты которых способны подавлять активность р53 и тем самым обеспечивать возможность репликации вирусного генома при условии отключения р53-зависимого механизма индукции апоптоза зараженных клеток В патогенезе онкологических заболеваний человека наибольшую роль играют высокоонкогенные вирусы папиллом человека, НРУ16 и НРУ18, которые вызывают более 95% случаев рака шейки матки, и около 20% случаев опухолей области головы и шеи Продукт вирусного гена Е6 способен связываться с р53 и направлять его по пути разрушения в протеасомах, что приводит к выключению р53-зависимой выбраковки клеток, несущих вир} с папилломы Кроме того, продукты генов Е6 и Е7 вируса папилломы подавляет несколько других важных регуляторных белков, в том числе белок рКВ, способствуя опухолевому перерождению клеток и развитию злокачественного заболевания Особенность механизма подавления р53-зависимых механизмов в опухолях, вызываемых вирусом папилломы человека состоит в его обратимости при выключении экспрессии продукта гена Еб функции р53 восстанавливается и клетка подвергается апоптозу Это создает возможность для разработки подходов к терапевтической реактивации белка р53 при раках шейки матки В данной работе предпринят поиск химических соединений, обладающих способностью реактивировать транскрипционную активность р53 в культуре клеток рака шейки матки НеЬа, экспрессирующих

последовательности вируса папилтомы человека НРУ18 Такие соединения могут в дальнейшем стать прототипами для новых противоопухолевых лекарств

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью работы являлся поиск химических соединений, способных реактивировать транскрипционную активность белка р53 в клетках рака шейки матки НеЬа, а также установление механизма действия этих соединений В ходе исследования были поставлены следующие задачи

1 Разработать репортерную линию клеток НеЬа, позволяющую с высокой чувствительностью измерять активность белка р53,

2 Провести скрининг библиотеки малых молекул с целью поиска химических соединений, способных реактивировать транскрипционную активность р53 в клетках НеЬа, экспреосирующих гены вируса папилломы человека 18 типа,

3 Определить специфичность действия активных малых молекул на моделях НРУ-негативных линий клеток с различающимся функциональным статусом гена

4 Установить механизм р53-реактивирующего действия наиболее активных малых молекул,

5 Изучить влияние активных малых молекул на восстановление противоопухолевых свойств бечка р53 - индукцию апоптоза и задержку деления культур клеток рака шейки матки,

6 Изучить противоопухолевую активность малых молекул, на модели клеток рака шейки матки (клетки НеЬа), выращиваемых в виде подкожных опухолей на иммунодефицитных мышах

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ

Проведенная работа направлена на поиск новых высокоспецифичных соединений, способных реактивировать опухолевый супрессор р53 в клетках рака шейки матки Такие соединения могут стать прототипами противоопухолевых препаратов нового поколения В отличие от существующих в настоящее время химиотерапевгических противоопухочевых средств, реактиваторы р53 действуют исключительно на клетки, имеющие повреждения р53-зависимых механизмов, и поэтому они не должны действовать на нормальные клетки организма, вызывая нежелательные побочные эффекты Подход, предложенный в настоящей работе, является оригинальным, не применявшимся ранее другими авторами

Для осуществления поиска таких соединений нами были разработаны высокочувствительные репортерные линии клеток, пригодные для количественного определения активности р53 и ее изменений, вызванных разнообразными обработками и воздействиями Репортерные линии созданы на основе линий клеток опухолей человека, различающихся по функциональному статусу гена р53, в том числе на основе линии клеток рака шейки матки НеЬа Введение в клетки репортерной кассеты, экспрессирующей фермент р-

галактозидазу под контролем р53-индуцируемого промотора, проводилась с помощью специально созданных оригинальных ретровирусных и лентивирусных векторов Применение вирусных векторов гарантирует структурную целостность вводимой репортерной кассеты, что позволяет проводить наблюдение количественных изменений транскрипционной активности р53 Репортерная конструкция вводилась в клетки с различающимся функциональным статусом белка р53, что позволило контролировать специфичность действия химических соединений в отношении реактивации р53, активность которого подавлена за счет продукта вируса папилломы человека

Создание чувствительной репортерной линии на основе клеток HeLa позволило провести высокопроизводительный скрининг коллекции малых молекул, состоящей из 46000 химических соединений Был получен ряд соединений, способных стимулировать синтез репортерного гена, контролируемого р53-зависимым промотором Из этих соединений было вычленено шесть классов малых молекул, обладавших способностью к высокоспецифичной индукции (5-галактозидазы в клетках HeLa, при этим не оказывая действия в контрольных клетках, экспрессирующих функционально активный р53 дикого типа, а также в клетках, имеющих делеции гена р53 Адекватность вывода о связи индукции репортерного гена с активацией р53 установлена путем анализа изменений экспрессии эндогенного гена-мишени белка р53 CDKN1A (p21Waf)

Дальнейшее внимание было сосредоточено на двух классах малых молекул, действие которых сопровождалось подавлением транскрипции мРНК вируса папилломы, кодирующей вирусный белок Еб Установлен механизм действия этих соединений, связанный с избирательным подавлением транскрипции вирусного генома, что приводит к высвобождению активного белка р53 за счет ослабления подав тяющего действия белка Еб Показано также, что оба класса соединений вызывают заметное подавляющее действие на ростовые свойства клеток HeLa, а также вызывают в этих клетках, индукцию апоптоза, не оказывая заметного подавления роста и выживаемости контрольных культур клеток, не экспрессирующих геном вируса папилломы человека

Наконец, в ходе работы установлено, что соединение PRESS-229 способно оказывать действие т vivo, вызывая снижение частоты образования опухолей на иммунодефицитных мышах, после подкожного введения клеток HeLa Этот результат указывает на потенциальную возможность использования данного класса малых мотекул в качестве прототипа противоопухолевого терапевтического средства Однако вопрос о пригодности таких соединений в клинике должен решаться после проведения оптимизации химического состава и дополнительных доклинических и клинических испытаний

АПРОБАЦИЯ ДИССЕРТАЦИИ

Материалы диссертационной работы были доложены на коллоквиуме лаборатории пролиферации клеток Института молекулярной биологии им В А Энгельгардта, а также на международном симпозиуме Advances m Science of Drug Development (ASDD), Волга, 2005

СТРУКТУРА II ОБЪЕМ РАБОТЫ.

Диссертация изложена на 99 страницах машинописного текста, содержит 20 рисунков и 1 таблицу, состоит из введения обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы (всего 204 ссылки)

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Разработка и оптимизация репортерной системы, позволяющей определять изменения активности р53 в клетках рака шейки матки.

Противоопухолевый белок р53 является транскрипционным фактором, активирующим гены, которые вызывают подавление пролиферации или апоптоз поврежденных или функционально измененных клеток Именно

транскрипционная активность р53 вносит критический вклад в его защитное действие Поэтому для поиска воздействий, восстанавливающих активность р53 в опухолевых клетках, мы использовали подход, позволяющий регистрировать именно транскрипционную активность р53 Для этого мы использовали созданные в нашей лаборатории ретровирусньге и ленгивирусные конструкции, содержащие репортерный ген, контролируемый высокочувствительным р53-зависимым промотором

Конструкции для определения транскрипционной активности эндогенного р53 должны были удовлетворять нескольким основным требованиям Выбранный нами репортерный ген 1ас2, кодирующий бактериальный фермент Р-галактозидазу, должен был находиться под контролем промотора, совмещенного с р53-зависимым транскрипционным элементом Уровень экспрессии репортерного гена в составе подобной конструкции должен зависеть исключительно от функционального состояния р53, и минимально зависеть от типа клеток, в которые этот конструкт введен Важно также, чтобы уровень экспрессии репортерного гена не менялся во времени при пассировании клеток, и на него не влияло место встраивания конструкции в геном клетки

Использование ретровирусных конструкций для введения репортерных кассет в клетки имеет очевидное преимущество перед традиционными методами введения плазмид с помощью трансфекции Ретровирусы способны эффективно заражать широкий спектр линий клеток При ретровирусном переносе происходит введение единичных копий неповрежденного конструкта, в отличие от метода введения с помощью Са-фосфатной трансфекции, когда происходит встраивание множества копий на клетку, которые при этом часто имеют перестройки внутри критических участков конструкции Незначительность различий в уровне экспрессии среди индивидуальных клопов позволяет работать на суммарных культурах, непосредственно после введения ретровирусных конструкций

На Рисунке 1 приведена схема самоинактивирующейся (с делецией энхансера в области ЛТР) репортерной ретровирусной конструкции, интегрированной в геном клетки

При выборе наиболее подходящего репортерного гена было испытано несколько вариантов, включая флуоресцентные белки ЕОРР и ОзКе(1, щелочную фосфатазу и ген бактериальной (З-галахтозвдазы )ас2 Набольшая чувствительность и специфичность детекции набчюдалась при использовании

гена lacZ Небольшое время жизни фермента р-галактозидазы (2-3 часа) позволяет определять кинетику изменений активации р53, причем количественное измерение активности Р-галактозидазы в культуре клеток весьма удобно в цветной реакции с производным галактозы о-нитрофенил-галактозидом (ONPG)

Для создания р53-зависимого промотора было использовано несколько компонентов Во-первых, фрагмент 20 по, который содержит консенсус высокоаффинного участка связывания белка р53 (Funk et al, 1992) Bo-

Рис 1 Ретровирусный конструкт с репортерным геном рЩТ-\\'аЮопА-1ас2-риго тСМУ

- минимальный промотор цнтомегаловируса, Н4-пр - промотор для гена устойчивости к пуромицину, р53-РЭ - р53 респонсивный эпемент, ЛТР - длинный концевой повтор, пуро

- ген устойчивости к антибиотику пуромицину

вторых, фрагмент А кластера рибосомальных генов, содержащий нескотько р53-связывающих элементов (еЮепу е1 а1, 1992) После добавления в промотор шести копий р53-связывающего элемента из гена СБКША (р21™п) (еЮеиу а1, 1993), чувствительность определения активности р53 возрастала еще в 3-4 раза Эти элементы были помещены перед минимальным промотором В качестве оптимального минимального промотора был выбран фрагмент промотора ранних генов цитомегаловируса (СМУ) размером 126 п о,

Для возможности проведения позитивной селекции клеток с введенной конструкцией был использован ген устойчивости к пуромицину (пуро), который вводился в ретровирусную конструкцию в составе отдельной экспрессирующей кассеты, контролируемой промотором гена гистона Н4 В промоторе гена Н4 отсутствуют энхансеры, способные повлиять на экспрессию репортерною гена Ьасг, что исключает его влияние на экспрессию р53-регулируемой кассеты

Для подавления влияния окружающих место интеграции конструкции участков генома и уменьшения затухания экспрессии репортерного гена в течение последующего пассирования клеток бьпо использовано две копии инсулятора глобинового гена цыпленка, расположенные вокруг экспрессирующих кассет

В дальнейшем, для создания следующего поколения репортерных конструкций репортерная кассета была перенесена в лентивирусный вектор Такие конструкции использовались для создания некоторых контрольных репортерных линий клеток Преимущество лентивирусной системы заключается в возможности быстрого заражения 100% клеток, что делает ненужным проведение селекции на антибиотике

2 Испытание репортерной системы на различных клеточных линиях после обработки ДНК-повревдающим агентом 5-фторурацилом

Ретровирусную репортерную конструкцию ри8Т-'\Уа1£опА-1ас2-риго (Рис 1) вводили в различные линии клеток человека путем заражения

m( MV

nucjisTTop (5-галактозидаза mtevmrop

pUST-WafCoriA-lacZ-puro

рекочбинантными вирионами, предварительно полученными в упаковочных клетках Использованные линии представляли типы клеток, которые а) экспрессировали «дикий» тип р53 (эмбриональные фибробласты HEF, карцинома НСТ116), б) экспрессирующие мутантный р53 (линия клеток карциномы А431, содержащая His273), клетки карциномы Н1299, лишенные р53 за счет делеции гена, и клетки рака шейки матки HeLa и SiHa, у которых р53 инактивирован с помощью продукта гена Еб вируса папилломы (HPV 18 или HPV 16, соответственно Для определения эффективности репортера эти линии в течение 24 часов обрабатывали повышающими дозами р53-активирующего соединения 5-фторурацила (5-ФУ)

-HEF

- НСТ1161

- HeLa -SiHa -Н1299 -А-431

О 25 50 75 100 концентрация 5ФУ, мкг/мл

Рис 2 Индукция Р-галактозидазы в линиях клеток НЕЙ, НСТ116, НеЬа, 51На, Н1299, А431, с введенным конструктом рШТ^аГСопА-Ысг-риго, и обработанных различными концентрациями 5-ФУ

На Рисунке 2 видно, что в линиях НЕЕ и НСТ116 наблюдается зависимая от дозы 5-ФУ индукция Р-галактозидазы, что хорошо объясняется индукцией р53 дикого типа, присутствующего в этих клетках В то же время, во всех остальных линиях клеток, дефектных по индукции р53, обработка 5-ФУ не сопровождается индукцией репортера

3. Поиск модельных условий для индукции р53-зависимого репортерного гена в НРУ-позитивных клетках рака шейки матки.

В связи с тем, что мы планировали использовать р53-зависичые репортерные линии рака шейки матки для поиска химических соединений, реактивирующих транскрипционную активность р53, необходимо было в качестве почожительного контроля использовать какие-нибудь обработки, способные оказывать действие, подобное искомым соединениям Мы протестировали помимо 5-ФУ еще несколько соединений, которые, вызывая повреждения ДНК, способны индуцировать р53 в ряде типов клеток (Рис 3) Большинство соединений подобно 5-ФУ не вызывали активацию репортера в клетках НеЬа, ЭЛа и в р53-негативной линии Н1299, хотя они демонстрировали хорошую активность в клетках НСТ116 Неожиданно оказалось, что метилметан сульфонат (ММС) вызывает сильнейшую индукцию Р-галактозидазы в клетках НеЬа и ЭЛа, но не вызывает индукции в клетках Н1299, где р53 делетирован Это указывают на то, что эффект, ММС зависит от присутствия р53 Под действием обработки ММС происходит также заметная индукция белка р53, которая сопровождается активацией р53-зависимого

HeLa

SiHaji

HCT116

HI 299

MMC 5-ФУ EMC ДОКС

Рис. 3. Индукция репортерного гена (3-галактозидазы в ответ на обработку ДНК-повреждающими соединениями метилметан сульфонатом (ММС), 5-ФУ, этилметан сульфонатом (ЕМС) и доксорубицином (ДОКС) в линиях клеток HeLa, SiHa, НСТ116 и HI299 после обработки в течение 24 часов. Окраска клеток на Р-галактозидазу при помощи субстрата X-Gal.

гена CDKN1A (p21Wa{), что подтверждено Норзерн-гибридизацией и Вестерн-анализом (Рис. 4 и Рис. 5). Хотя механизм активации гена р53 при обработке клеток HeLa и SiHa ММС остается невыясненным, мы взяли эту обработку (30 мкг/мл ММС) в качестве положительного контроля при последующем скрининге.

Н1299

НСТ116

HeLa

эдряЖЩ^ р21

Рис. 4. Вестерн-анализ экстрактов белка клеток HI299, НСТП6 и HeLa с использованием антител специфичных к белку р53 (DOI, Santa Cruz Biotech), и антителами белку p21WA!M (F-5, Santa Cruz Biotech). (К) - тотальный белковый экстракт, (5-ФУ) - белковый экстракт из клеток, обработанных 5-фторурацилом в течение 24 часов, (ММС) - белковый экстракт из клеток, обработанных метилметан сульфонатом в течение 24 часов.

HeLa

Н1299

НСТ116

К ММС 5ФУ К ММС 5ФУ К ММС 5ФУ

p21-Wafl

Рис. 5. Нозерн-гибридизация тотальной РНК из клеток HeLa, Н1299 и НСТ116. Блот гибридизовался с меченой пробой к гену CDK.N1 (р21Ша). (К) - тотальная РНК, (5-ФУ) -клетки, обработанные 5-фторурацилом в течение 24 часов, (ММС) - клетки, обработанные метилметан сульфанатом в течение 24 часов.

4 Отбор химических соединений, способных реактивировать р53 в НРУ]8-1тзитив110й линии клеток рака шейки матки.

Оптимизированная репортерная линия клеток HeLa, содержащая репортерный вектор pUST-WafConA-lacZ-puro, была использована для скрининга коллекции химических соединений (DiverSer, Chembndge, 46,000 соединений) с помощью роботизированной установки ВюМес и при участии компании Quark Biotech Inc Клетки высевались на 384-луночные планшеты, в лунки которых через 12 часов добавлялись химические соединения из коллекции в концентрации 5 мкг/мл, после чего проводилась инкубация в течение 24 часов Уровень р-галактозидазы определялся в цветной реакции с ONPG с помощью планшетного колориметра Было отобрано более 60 активных соединений, вызывающих более чем двукратное увеличение экспрессии репортера Эти соединения были затем испытаны на контрольных р53-чувствительных репортерных линиях на основе клеток НСТ116 и Н1299, для отсеивания веществ, способных вызывать либо неспецифическую активацию репортера, либо активацию р53 за счет инициации стрессовых сигнальных путей Отобранные молекулы относились по своей химической структуре к 17 классам соединений, причем некоторые классы были представлены несколькими схожими по химической формуле молекулами, различающимися по расположению боковых групп вокруг общего ароматического остова

Найденные нами активные химические соединения получили общее название PRESS (р53 reactivating Е6 suppressing substances), как молекулы, способные реактивировать р53 и подавлять продукт гена Е6 вируса папилломы человека

5 Функциональные свойства 17 классов химических соединений, способных реактивировать р53 в линии клеток HeLa.

Наиболее активные молекулы из каждого класса отобранных соединений испытывали на репортерной линии клеток HeLa с целью определения максимальной степени индукции репортерного гена и концентрации обработки, вызывающей половину максимального эффекта (индекс IC50) (Рис 6) Проверка производилась на 96-луночных планшетах, на которые предварительно высевались репортерные клетки HeLa

HeLa^53RE-Lec2

-5Ж9585 -S18!3.J -О!}?-« 431.163

О ,0 о ю и .0

концентрация соединении мг/мл Рис 6 Зависимая от дозы индукция активности репортерной р-галактозидазы в линии клеток HeLa, обработанной повышающими дозами отобранных химических соединений По оси ординат отложены значения оптической плотности (405 нм), отражающей степень превращения (ЖРв под действием р-галактозидазы Цифрами обозначены номера химических соединений в коллекции малых молекул

Основным критерием при отборе соединений, пригодных для дальнейшего изучения, была степень активации р53-зависимого промотора при минимальной дозе обработки На Рис 6 видно насколько по-разному отдельные соединения активировали репортер Некоторые соединения вызывали хорошую индукцию репортера при сравнительно низких концентрациях, однако при больших дозах наблюдались заметные токсические эффекты, приводящие к снижению экспрессии репортерного гена Было установлено, что соединения 5254229, 5541570 и 5181312 обладали наибольшей силой активации при минимальных концентрациях (1С50 на уровне 0 1-05 мкг/мл)

6. Специфичность действия активных соединений В отношении НРУ-нозитивных клеток НеЪа.

На Рис 7 и Рис 8 приведены результаты обработки контрольных репортерных линий панелью активных классов соединений Ни один из классов молекул не был способен активировать р53-зависимую экспрессию Р-галактозидазы в р53-негативной линии клеток Н1299, что подтверждает р53-зависимость их действия Однако в клетках НСТ116 некоторые химические соединения вызывали увеличение активности Р-галактозидазы, что вероятно

ИСЕ116-р53Я

- ^тгт -515С1Э

-ЕМ га

-¡З'й!® -5 4"!23

концентрация соединении мг7мл

Рис 7 Зависимая от дозы индукция активности репортерной Р-галакггозидазы в линии клеток НСТ116, обработанной повышающими дозами активных соединений

Н129Э-р53КЕ-исг

3,1,8 77 руЭрг^-а

о 10

концентрация соединении иг/мл

Рис 8 Зависимая от дозы индукция активности репортерной р-галактозидазы в р53-негативной линии клеток Н1299, обработанной повышающими дозами активных соединений

указывало на неспецифическую реакцию клеток, содержащих «дикий» р53, в ответ на обработку токсичными соединениями Такие соединения были исключены из дальнейшего анализа

7. Активация репортерного гена в клетках НеЬа коррелирует с индукции эндогенных генов-мишеней р53.

На основе вышеописанного анализа было отобрано шесть активных малых молекул, относящихся к шести химическим классам соединений Их обозначение включает наименование PRESS в сочетании с последними тремя цифрами идентификационного номера (PRESS-229, 570,990, 312,468 и 143, таблица)

X)

N

N'

>0

9 \

PRESS-229 5254229 Хлзсс I

PRESS-570 5541570 Масс II

NH,

PR-ESS-I6S 528546S Класс \ а

PRESS-G32

5470032 Kiacc Vila

PKESS-3I2 5181312 KiaccXIII

Для подтверждения способности этих веществ реактивировать р53 в HPV-позитивных клетках рака шейки матки было испытано их действие на уровень экспрессии эндогенных генов-мишеней транскрипционного фактора р53 Через 12 часов после добавления к клеткам HeLa химических соединений в дозе, соответствующей IC50, выделяли препараты РНК и анализировали методом Нозерн-гибридизации с мечеными пробами кДНК р53-регулируемых генов (C'DKNl р21Waf, HDM2 и IGFBP3)

На рисунке 9 видно, что уровень транскриптов гена CDKN1 заметно возрастает по сравнению с контролем при обработке каждым из шести соединений, что очевидно указывает на транскрипционную активацию этого гена белком р53 Наиболее сильная активация наблюдалась при обработке соединениями PRESS 229 и PRESS 570, которые относятся к I и II химическим

классам, соответственно (см. таблицу). В тоже время, заметной активации р53-регулируемых генов НОМ2 и ЮРВРЗ после обработки указанными соединениями

£ 9> Э ® N » ,*2

5 м 1«. в» «а «

О м V» т-> ^ г-

со СО СО СО СО СО

С СО 09 со со со со

о к Й ё ё ё е

¿с: й. о. о. а. а. с.

, С[ЖИ1А (р21)

тт Ш щт^ШШ нот ^ФШфтттюрвРз

ЩШ 'Щ Ш

- ф ■ Щ щ

1285

!185

Рис. 9. Нозерн-гибридизация тотальной РНК из необработанных клеток НеЬа (К), а также из клеток, обработанных шестью классами химических соединений, при концентрации 1С5о. Блот гибридизовали с меченной пробой к генам СОКЫ1, НОМ2 и ЮРВРЗ. В качестве контроля количества тотальной РНК представлена фотография агарозного геля после окрашивания бромистым этидием.

не наблюдалось, хотя под действием соединений РЛЕ85-990 и РИЕБ8-312 регистрировалось некоторое увеличение транскрипции гена ЮРВРЗ. Некоторые из соединений вызывали даже снижение уровня транскрипции генов НОМ2 и ЮРВРЗ. Это говорит о том что, возможно некоторые соединения, помимо активации р53, оказывают дополнительное действие на транскрипцию ряда генов. Возможно также, что реактивируемый белок р53 обладает несколько измененными свойствами и не способен активировать некоторые из р53-регулируемых генов.

8. Реактивации р53 некоторыми из активных соединений связана с подавлением транскрипции вируса папилломы человека.

Следующий этап нашей работы был направлен на выяснение возможного механизма действия отобранных химических веществ. Известно, что белок Е6 взаимодействует с опухолевым супрессором р53, способствуя его ускоренному убиквитин-зависимому разрушению в протеасомач. Продукт гена Е6 вируса папилломы способен к образованию белок-белковых комплексов как с р53, так и с убиквитиновой лигазой Е6АР, способствуя убиквитинированию и последующему разрушению р53. Таким образом, предотвращение связывания продукта гена Еб и р53 может вызвать активацию р53. Подавление этого взаимодействия может осуществляться различными путями. Первый путь - через репрессию транскрипции вирусоспецифических продуктов. Второй - прямое разрушение белковых комплексов Е6/р53, Е6АР/Е6 или Е6АР/р53. К реактивации р53 может привести также угнетение трансляции продуктов вирусных генов, приводящее к подавлению разрушения р53 под действием белка Е6.

Транскрипция генома вируса папилломы приводящая к синтезу мРНК для белка Е6, происходит таким образом, что синтезируется две изоформы мРНК, причем большая по размеру мРНК одновременно кодирует белки Еб и Е7. Обе изоформы транскрибируются с общего промоторного участка LCR ДНК вируса папилломы. Для определения влияния химических соединений на транскрипцию вирусного генома мы провели Нозерн гибридизацию РНК из необработанных клеток HeLa, а также из клеток HeLa, обработанных в течение 12 часов шестью различными соединениями в концентрации, соответствующей IC50 (Рис. 10). Видно, что два из шести соединений вызывают подавление обеих форм мРНК, кодирующих белок Е6. Наиболее активное соединение PRESS-229 далее испытывали при различных концентрациях и времени обработки (Рис. 10). Видно, что практически полное подавление вирусной полицистронной матрицы

О ГЧ О) о со «

0 9 <V Ч Щ ? PRESS-229 PRESS-22S

1 S S S 5 S 8 (МКГ/МЛ) 2МКГ/ИП

I ш ш ш ш ш ш

О а. О. К и. К К О 0.1 0.2 0.4 0.8 2.0 0 5ч 14ч 24ч 36ч

ьй а. о. а а. а о.

тшттшш Р21 тттфщ Р21 . тштт т

т т т Шт

Щ Ш- * 4P w

Ül Шт M

Wgr- Щт 'Щ

Е6/Е7

Ü • ф.

28S

Е6/Е7

ш

Е6\Е7

Рис. 10 . Нозерн-гибридизация тотальной РНК из клеток НеЬа, обработанных активными РКЕ58-соединениями. Левая панель - обработка в течение 12 часов шестью соединениями при концентрации 1С50. Средняя панель - зависимость эффекта от концентрации РК£58-229 при обработке 12 часов. Правая панель - зависимость эффекта 2 мкг/мл РКЕ53-229 от времени обработки. Гибридизация с меченой пробой кДНК гена СОКЪ/1А (сверху) и с кДНК вирусного онкогена Еб (посередине). В качестве контроля нанесения РНК приведена фотография агарозного геля после окраски бромидом этидия.

Е6/Е7 происходит уже через 14 часов после обработки Р11Е88-229, начиная с концентрации 0.8 мкг/мл. Одновременно происходит значительное увеличение уровня транскрипции гена СБКША р21.

Для проверки специфичности действия соединений на промоторную область ДНК вируса папилломы в качестве контроля использовали клетки эмбриональных фибробластов человека (НЕЕ), в которые при помощи ретровирусной трансфекции была введена кДНК онкогена Еб под контролем СМУ-промотора. В этих клетках обработка соединениями PRESS-229 и

РК£88570 не сопровождалась угнетением транскрипции искусственной мРНК онкогена Еб, причем транскрипция СОКЫ1А р21 не повышалась, а, напротив, снижалась (Рис. 11). В то же время, при обработке четырьмя другими РЯЕЗБ-соединениями отмечалось усиление транскрипции р21 без изменения

Не!_а HEF.CMV.E6

НРУ18 Е6

Рис, 11. Нозерн-гибридизация тотальной РНК клеток НеЬа (две дорожки слева) без обработки, или обработанных РКЕ88-229, а также клеток НЕЕ, экспрессирующих рекомбинантный онкоген Еб под контролем СМУ промотора, обработанных шестью активными РКЕББ-соединениями при концентрации 1С5о. Блот гибридизовали с меченными пробами к генам СОКЬП (сверху) и Е6. В качестве контроля нанесения тотальной РНК представлена фотография агарозного геля после окраски бромидом этидия.

транскрипции мРНК онкогена Еб. Можно предположить, что действие этих соединений не опосредовано выключением транскрипции мРНК Еб, а осуществляется за счет иных механизмов.

9. Соединения Р1Ж88-229 и РТ$Е8Я-570 снижают уровень экспрессии белка Еб.

Поскольку некоторые из активных соединений могли влиять на трансляцию вирусных белков, снижая уровень белка Еб, мы решили проверить это Вестерн-анализом белковых экстрактов клеток НеЬа после обработки шестью активными РНЕвв-соединениями.

На Рис. 12 видно, что уменьшение количества белка Е6 происходит только при обработке соединениями Р11Е88-229 и РЯЕ38-570. По всей видимости это происходит вследствие подавления мРНК гена Еб вируса папилломы. Все остальные вещества не вызывают уменьшения уровня белка Еб по сравнению с контролем. Не исключено, что некоторые из этих соединений могут действовать путем вытеснения белка Еб из комплекса с р53 или из комплекса с белком Е6АР. Однако проверить такую возможность нам не удалось в связи с коротким

временем жизни р53, находящегося в комплексе с белками Е6 и Е6АР, что препятствует проведению опытов по коиммунопрецилитации белков.

Л О) о СЧ со о со

ш см О) т- -ч- г- <£>

о <9 <7 т- <Я Ч?

О. <0 со со (Я №

1- ся со « (Л ф СГ)

I ш ш ш ш ш ш

о ос ас ОС ос к ОС

0. 0. 0. а а.

р21

Рис. 12. Вестерн-анализ белковых экстрактов клеток НеЬа, с использованием антител специфичных к белкам р21 и Е6. Клетки НеЬа обрабатывали химическими соединениями в концентрациях Ю50 в течение 24 часов.

10. РКЕвв-соединения специфически снижают выживаемость НРУ-позитивных клеток рака шейки матки НеЬа.

Для определения способности отобранных химических соединений тормозить пролиферацию НРУ-позитивных опухолевых клеток НеЬа проводили их обработку различными дозами веществ в течение трех суток. В качестве контролей на специфичность использовали несколько линий клеток: (а) клетки эпидермальной карциномы А431, которые также имеют подавление р53-зависимых путей за счет мутации 273 ко дона белка р53; (б) клетки карциномы толстого кишечника НСТ116, экспрессирукяцие р53 дикого типа; (в) клетки карциномы рака легкого Н1299, не экспрессирующие р53 за счет делеции всего гена. Скорости пролиферации клеток НеЬа, А431, НСТ116 и Н1299 приблизительно одинаковы, что упрощает сравнение действия соединений. После обработки изменение жизнеспособности клеток оценивали по реакции превращения живыми клетками бесцветного субстрата ХТТ в соединение оранжевого цвета. Результаты представлены на Рисунке 13.

При обработке различными соединениями клеток НеЬа наблюдалось варьирующее по интенсивности угнетение их жизнеспособности (Рис. 13). Наибольший эффект был отмечен при обработке соединениями РТ1Е88-229 и Р11Е88-570, что согласуется с максимальной индукцией р53, отмечаемых после обработки именно этими соединениями. Напротив, клетки А431 при использованных концентрациях оказались полностью устойчивыми к данным соединениям. В клетках Н1299 наблюдалось лишь незначительное торможение жизнеспособности, причем минимальное торможение было отмечено для соединений РК.Е85-229 и РКЕ88-570. В клетках НСТ116, экспрессирующих р53

дикого типа, максимальное угнетение пролиферации происходило под действием соединений РЯЕЗБ-МЗ и РЯЕ58-312. Поскольку именно эти соединения вызывают наибольшую неспецифическую индукцию р53 в клетках НСТ116, мы

PRESSES -PRESS-MS -PRESS-312 -PRESSSSO - PRESS-570 -PRESS-Ш

- PRE5S-S6S -PR6$S-i29 -PRESS-312 -PRESS-SSK>

- PRESS .«3

HeLa-p53RE-LacZ

A431-p53RE-LacZ

H1299-p 53RE-LacZ

0 2 4

HCT116-p53RE-i-acZ

Рис. 13. Определение жизнеспособных клеток в реакции с субстратом ХТТ на линиях клеток НеЬа, Л431, Н1299 и НСТ116 после обработки шестью химических соединениями в течение трех суток. По оси ординат отложены значения оптической плотности (490 нм), отражающей количество цветного производного ХТТ, превращенного под действием митохондриальных ферментов живых клеток.

предполагаем что токсический эффект может быть связан с р53-зависимым торможением их пролиферации.

Полученные результаты указывают на хорошую корреляцию токсичности соединений на клетках HeLa с их способностью реактивировать р53. Действие соединений PRESS-229 и PRESS-570 высоко специфично в отношении клеток HeLa, экспрессирующих вирус папилломы человека.

11. PRESS-229 индуцирует апоптоз в HPV-позитивных клетках HeLa.

На основании вышеописанных тестов мы выбрали для дальнейшей работы наиболее активное и специфичное соединение PRESS-229. Поскольку это соединение специфически тормозит пролиферацию клеток HeLa, мы решили посмотреть его способность индуцировать программированную клеточную смерть, апоптоз. Расщепление под действием каспаз белка PARP (Poly ADP-ribose polymerase) является удобным и наглядным тестом на апоптоз. Белок PARP имеет массу 113 кДа, но под действием каспаз расщепляется на 89 кДа и 24 кДа. Больший из фрагментов может регистрироваться методом Вестерн-анализа после прокраски моноклональными антителами к PARP. На Рис. 14 представлены

результаты двух экспериментов Вестерн-анализа экстрактов из клеток НеЬа, Н1299, НСТ116 и А431 обработанных в течение трех суток РКЕ88-229 при концентрации, соответствующей 1С.ад.

I -Г- 1 I I

HeLa НСТ116 Н1299 А431 HeLa

Рис. 14. Вестерн-анализ белковых экстрактов из клеток HeLa, Hl 299, НСТ116, и А431 после обработки PRESS-229 в течение трех суток. В качестве контрольного индуктора апоптоза использована обработка 200 нг/мл этопозида в течение трех суток. Окраска производилась с использованием антител к PARP (F-2, Santa Cruz Biotech).

Характерное для апоптозной смерти расщепление белка PARP наблюдалось только в клетках HeLa, причем под действием PRESS-229 образовывалось даже больше продуктов расщепления, чем при контрольной обработке ДНК - повреждающим препаратом этопозидом. На основании этого опыта можно сделать вывод о высокоспецифичной индукции апоптоза в клетках HeLa под действием р53-реактивирующего соединения PRESS-229.

12. Противоопухолевая активность р53-реактивирующего соединения PRESS-229.

Конечной целью реактивации подавленного р53 является избирательное торможение делений и индукция смерти опухолевых клеток. Мы установили, что соединение PRESS-229 способно подавлять транскрипцию генома вируса папилломы, снижать уровень белка Е6 и вызывать мощную индукцию активности р53 в клетках HeLa. Это же соединение угнетает пролиферацию клеток HeLa и вызывает их апоптоз in vitro. Для установления возможности использования данного класса соединений в качестве прототипа противоопухолевых препаратов мы испытали его противоопухолевые свойства на модели иммунодефицитных бестимусных мышей, привитых клетками HeLa. При подкожном введении 5x105 клеток HeLa через 5-7 дней наблюдается формирование видимых опухолей, которые быстро растут и убивают мышь в течение трех недель. На следующий день после введения клеток HeLa мыши получали 5-дневный курс внутрибрюшинных инъекций 0.4 мг PRESS-229, с интервалом 12 часов. Для установления возможности комбинированного лечения опухолей отдельная группа мышей дополнительно получала дозу облучения из источника гамма-излучения на 3 и 5 день после подкожного введения клеток HeLa. Образование

подкожных опухолей определяли пальпацией и фиксировали время их появления (Рис. 15).

20

1}

Ю

А

контроль

*

5 5

X

=г

лечение *4

т тттт

ВШЙП_

15

10

в

контроль

+ облучение

№Е55-2» : •

ши

шгГщ]

"ГГ. I ......I.

0 5 Ю 15 20 дней 0 5 Ю 15 го дней

Рис. 15. Влияние РЯ£83-229 и гамма-излучения на подавление формирования опухолей после подкожного введения бестимусным мышам 5x105 клеток НеЬа. Стрелками показано время внутрибрюшинного введения РКЕ55-229. Верхняя линия соответствует контрольной группе мышей, не получавших терапии, нижняя - мышам, получившим соответствующую обработку. На левом графике приведены результаты комбинированной обработки РКЕ58-229 и гамма-излучением.

В контрольной группе мышей, не получавших РЯЕ88-229, образование опухолей фиксировалось, начиная с пятого дня после инокуляции, и к 20 дню опухоли образовывались в месте каждого введения клеток НеЬа. Облучение мышей из источника гамма-излучения без Р11Е88-229 практически не влияло на число опухолей и время их образования. В то же время, введение Р11Е88-229 значительно замедляло и снижало число образовавшихся опухолей. На фоне облучения действие Р11Е88-229 было наиболее существенным, что указывает на возможность применения этого соединения в комбинации с существующими методами терапии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

В результате поиска химических соединений, способных восстанавливать транскрипционную активность р53 в НР\'-позитивной линии клеток рака шейки матки человека НеЬа, нами было идентифицировано и исследовано около 17 классов химических соединений. Последующее испытание этих соединений на ряде контрольных линий клеток, различающихся по статусу гена р53, позволило сократить число перспективных молекул до шести. Из них два наиболее активных соединения (РКЕ88-229 и РКЕ85-570) были способны избирательно угнетать транскрипцию встроенного генома вируса папилломы человека. Это угнетение выбывало снижение уровня экспрессии белка Еб вируса папилломы, что приводило к стабилизации и накоплению транскрипционно-активного р53. В результате происходила активация как репортерного гена, находящегося под контролем синтетического р53-зависимого промотора, так и некоторых эндогенных мишеней р53. Реактивация р53 приводила к заметному и специфическому для НРУ-позитивных клеток НеЬа угнетению пролиферации, а также к индукции апоптоза. При внутрибрюшинном введении соединение РКЕЭЗ-229 было способно снижать опухолеобразование у бестимусных мышей, которым

были введены клетки НеЬа Терапевтическое действие РЮЕ88-229 было особенно выражено при его комбинированном применении вместе с гамма облучением Проведенные эксперименты указывают на возможность создания на основе соединений, родственных Р11Е88-229, новых противоопухолевых препаратов, которые будут обладать терапевтическим действием в отношении опухолей человека, вызванных вирусами папиллом

выводы

1 Разработана репортерная система, позволяющая определять транскрипционную активность белка р53 Преимущество системы заключается в удобстве измерения активности репортерного гена по цветной реакции с ООТО, а также ее относительная дешевизна и простота тестов

2 Обнаружено, что обработка НРУ-позитивных клеток НеЬа и БДа метилметан сульфонатом (ММС) вызывает мощную активацию р53 Обработка ММС была использована в качестве положительного контроля при проведении скрининга коллекции малых молекул с целью поиска соединений, способных реактивировать р53 в клетках НеЬа

3 Получено и исследовано 17 классов химических соединений, способных повышать транскрипционную активность противоопухолевого белка р53 в клетках НеЬа Отобрано шесть наиболее перспективных классов химических соединений, обладающих максимальной специфичностью На основе этих молекул может быть проведена дальнейшая оптимизация их свойств с целью создания лекарственных препаратов

4 Обнаружено, что соединения РЯЕ88-229 и РЯЕ88-570 способны избиратетьно подавлять транскрипцию интегрированного генома вируса папилломы и снижать уровень вирусного бетка Еб в клетках НеЬа

5 Соединения РЯЕ88-229 и РКЕ88-570 избирательно угнетают пролиферацию клеток НеЕа, не оказывая заметного действия на клетки, не несущие геном вируса папилломы чечовека

6 Соединение РК£85-229 приводит к апонтозу клеток НеЬа, но не токсично для контрольных клеток

7 Соединение Р11Е88-229 способно оказывать противоопухолевое действие в отношении опухолей, образующихся после подкожного введения клеток НеЬа бестимусным мышам

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ ИЗЛОЖЕНО В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ:

Статьи:

1 Д В Кочетков, Г В Ильинская, П Г Комаров, Е Стром, Л С Агапова,

А В Иванов, А В Буданов, Е И Фролова, П М Чумаков (2007) Подавление транскрипции вируса папилломы человека восстанавливает функции опухолевого супрессора р53 в клетках рака шейки матки Молекулярная биология, 41 515-523

2 В П Алмазов, Д В Кочетков, П М Чумаков (2007) р53 - инструмент для терапии злокачественных заболеваний человека Мочекулярная биология, 41 947-963

3 Rravchenko JE, Ilyinskaya GV, Komarov PG, Agapova LS, Kochetkov DV, Strom E, Frolova EI, Kovnga I, Gudkov AV, Femstein E, Chumakov PM (2008) Small molecule RETRA suppresses mutant p53-beanng cancer cells through a p73 dependent salvage pathway Proc Natl Acad Sci USA, 105 6302-6307

Тезисы

4 Chumakov PM, Komarov PG, Ilyinskaya GV, Kochetkov DV, Kravchenko JE, Frolova EI, Femstein E (2005) Pharmacological reactivation of transcriptional activity of p53 tumor suppressor in cancer cells Материалы симпозиума ASDD Symposium "Advances in Science of Drug Discovery", Москва-Санкт-Петербург, июль 2005, стр 44

5 Kravchenko JE, Ilyinskaya GV, Kochetkov DV, Frolova EI, Chumakov PM (2008) Small molecule RETRA kills mutant p53-beanng cancer cells through a p73 dependent salvage pathway Материалы отчетной конференции, Meeting of International Research Scholars, Howard Hughes Medical Institute, Lisbon 2008

Подписано в печать 12 05 200S г Печать трафаретная

Заказ № 389 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495)975-78-56, (499)788-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кочетков, Дмитрий Владимирович

Содержание ^ Список принятых сокращений

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Реактивация противоопухолевого белка p53 в клетках человека, содержащих высокоонкогенный вирус папилломы"

1.1 Общая характеристика фактора р53 7

1.1.1 Молекулярная организация гена р53 71.1.2 Доменная организация белка р53 81.2 Стабилизация и активация р53 91.2.1 Ингибирование р53 при помощи убиквитиновой лигазы MDM2 91.2.2 Посттрансляционные модификации белка р53 101.3 Латентная и активная формы р53 131.4 Клеточные и тканеспецифичные эффекты белка р53 141.4.1 Гены необходимые для ареста клеточного цикла 161.4.2 Гены участвующие в репарации ' 161.4.3 Гены кодирующие ингибиторы ангиогенеза и другие секретируемые факторы 171.4.4 Тканеспецифичность клеточного супрессора р53 171.4.5 р53-индуцируемый апоптоз 171.4.6 Выбор между апоптозом и арестом клеточного цикла 191.5 Белок - белковые взаимодействия р53 21 1.5.1 Взаимодействие р53 с клеточными белками 211.5.1.1 Взаимодействие р53 с ТАТА-связывающим белком (ТВР) и ТВР-связанными факторами (TAF) 221.5.1.2 Взаимодействие р53 с РНК-полимеразой И, а также с элонгационным фактором ELL 231.5.1.3 Комплекс р53 с CREB-связывающим белком (СВР) и рЗОО 24О-/1.5.1.4 Взаимодействие р53 с белком репарационной системы hRad 51 251.5.1.5 Роль транскрипционного фактора р53 в контроле пролиферации клеток эпителия 25 1.5.2 Взаимодействие фактора р53 с вирусными белками 261.5.2.1 Взаимодействие с аденовирусными белками 261.5.2.2 Связывание с белками вируса гепатита В 271.5.2.3 Механизм взаимодействия с ретровирусными белками 281.5.2.4 Связывание р53 с большим Т-антигеном вируса SV-40 281.5.2.5 Взаимодействие с белками папилломавируса человека (HPV-16) 292.1 Характеристика генома папилломавирусов 302.1.1 Геном HPVs 302.1.2 Роль белка Е7 312.1.3 Трансформирующая роль белка Е5 332.1.4 Белок Е6 и его функции 342.1.4.1 Структура белка Е6 342.1.4.2 Взаимодействие клеточных белков и вирусного онкогена Е6 352.1.4.3 Взаимодействие Е6 и р53 40 Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ2.1. Используемые клеточные линии, их культивирование и обработка 452.2 Лизис клеток и приготовление ядерных экстрактов 452.3 Измерение концентрации белка по методу Бредфорд 462.4 Фракционирование белков в полиакриламидном геле 462.5 Перенос белков из гелей на фильтры и имму но детекция 472.6 Норзерн блот анализ 472.7 ОТ-ПЦР анализ 482.8 Выделение геномной ДНК из клеток эукариот 482.9 Получение компетентных клеток E.coli и трансформация 492.10 Препаративное и аналитическое выделение плазмидной ДНК 502.11 Обработка ДНК рестрикционными эндонуклеазами 512.12 Фракционирование и извлечение ДНК из агарозных гелей 512.13 Реакция лигирования 512.14 Трансфекция лентивирусных и плазмидных конструктов и получение клеточных линий 522.15 Окрашивание клеток с помощью реагента ONPG для количественного определения эффективности работы репортсрного гена (3-галактозидазы. 532.16 Окраска клеток на X-Gal 54 Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ3.1 Разработка и оптимизация репортерной системы, позволяющей определять изменения активности р53 в клетках рака шейки матки. 563.2 Испытание репортерной системы на различных клеточных линиях после обработки ДНК-повреждающим агентом 5-фторурацилом. 583.3 Поиск модельных условий для индукции р53-зависимого репортерного гена в HPV-позитивных клетках рака шейки матки. 593.4 Отбор химических соединений, способных реактивировать р53 в НРУ18-позитивной линии клеток рака шейки матки. 623.5 Функциональные свойства 17 классов химических соединений, способных реактивировать р53 в линии клеток HeLa. 663.6 Специфичность действия активных соединений в отношении HPV-позитивных клеток HeLa. 673.7 Активация репортерного гена в клетках HeLa коррелирует с индукции эндогенных генов-мишеней р53. 683.8 Реактивация р53 некоторыми из активных соединений связана с подавлениемтранскрипции вируса папилломы человека. 713.9 Соединения PRESS-229 и PRESS-570 снижают уровень экспрессии белка Е6. 74ЗЛО PRESS-соединения специфически снижают выживаемость HPV-позитивных клетокрака шейки матки HeLa. 753.11 PRESS-229 индуцирует апоптоз в HPV-позитивных клетках HeLa. 783.12 Комплиментарное взаимодействие 5 классов химических веществ с соединением PRESS-229 в различных концентрациях, на клеточной линии HeLa 793.13 Противоопухолевая активность р53-реактивирующего соединения PRESS-229. 82 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 83 ВЫВОДЫ 84 БЛАГОДАРНОСТИ 86 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 88СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Кочетков, Дмитрий Владимирович

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

В результате поиска химических соединений, способных восстанавливать транскрипционную активность р53 в НРУ-позитивной линии клеток рака шейки матки человека НеЬа, нами было идентифицировано и исследовано около 17 классов химических соединений. Последующее испытание этих соединений на ряде контрольных линий клеток, различающихся по статусу гена р53, позволило сократить число перспективных молекул до шести. Из них два наиболее активных соединения (РЫЕ88-229 и Р11Е88-570) были способны избирательно угнетать транскрипцию встроенного генома вируса папилломы человека. Это угнетение вызывало снижение уровня экспрессии белка Е6 вируса папилломы, что приводило к стабилизации и накоплению транскрипционно-активного р53. В результате происходила активация как репортерного гена, находящегося под контролем синтетического р53-зависимого промотора, так и некоторых эндогенных мишеней р53. Реактивация р53 приводила к заметному и специфическому для НРУ-позитивных клеток НеЬа угнетению пролиферации, а также к индукции апоптоза. При внутрибрюшинном введении соединение Р11Е88-229 было способно снижать опухолеобразование у бестимусных мышей, которым были введены клетки НеЬа. Терапевтическое действие РЯЕ88-229 было особенно выражено при его комбинированном применении вместе с гамма облучением. Проведенные эксперименты указывают на возможность создания на основе соединений, родственных • Р11Е88-229, новых противоопухолевых препаратов, которые будут обладать терапевтическим действием в отношении опухолей человека, вызванных вирусами папиллом.