Структура поверхности эпителиальных клеток шейки матки, инфицированных вирусом папилломы человека

Яковлева, Валерия Анатольевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структура поверхности эпителиальных клеток шейки матки, инфицированных вирусом папилломы человека
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Структура поверхности эпителиальных клеток шейки матки, инфицированных вирусом папилломы человека"

На правах рукописи

ШИН

ООЭ462825

ЯКОВЛЕВА Валерия Анатольевна

СТРУКТУРА ПОВЕРХНОСТИ ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК ШЕИКИ МАТКИ, ИНФИЦИРОВАННЫХ ВИРУСОМ ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА

Специальность - 03.00.06 - Вирусология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

, ■ • о "Г.Э

Москва - 2009 г.

Работа выполнена в ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН совместно с ФГУЗ МСЧ № 170 ФМБА России

Научный руководитель:

Доктор биологических наук Маныкин Анатолий Анатольевич Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Шапиро Наум Абрамович Доктор биологических наук Иванова Валерия Тимофеевна

Ведущее учреждение:

ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН

Защита состоится « ЛЬ » (УчО>/10 уу\ 2009 года в 1р часов на заседании Диссертационного совета Д.001.020.01 при ГУ НИИ Вирусологии им. Ивановского РАМН по адресу: 123098 г. Москва, ул. Гамалеи, д. 16, в конференц-зале

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке При ГУ НИИ Вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН

Автореферат разослан «

>С1Л&/2009 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Д.001.020.01

Доктор медицинских наук

Бурцева Елена Ивановна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Папилломавирусная инфекция (ПВИ) широко распространена среди людей, животных, вызывая тяжелые патологии слизистых оболочек и кожи. В основном это кондиломы и папилломы слизистых оболочек, бородавки и папилломы кожи - опухоли или опухолеподобные образования различной локализации. Как было установлено Цурхаузеном в 1976 году, именно инфицирование эпителия шейки матки вирусом папилломы человека (ВПЧ) 16 типа создает условия развития рака шейки матки.

По данным Международного агенства по изучению рака, ежегодно в мире регистрируется более 370000 новых случаев рака шейки матки, умирает от него около 190 000 женщин (Прилепская В.Н., 2004). Наряду с доброкачественными опухолепо-добными разрастаниями, вызываемыми папилломавирусами низкой онкогенности (6, 11 типы и другие), папилломавирусы, вызывающие развитие рака шейки матки, относятся к высокоонкогенным вирусам (16, 18, 31, 45 типы) (Молочков В.А., 2005). Еще в 1996 году в информационном бюллетене Всемирной организации здравоохранения было официально отмечено, что вирусы папилломы человека 16 и 18 типов являются особо канцерогенными (Прилепская В.Н., 2004), поэтому диагностика папилломави-русной инфекции (ПВИ) была и остается актуальной.

Существуют различные методы диагностики ПВИ, среди которых особое место занимает скрининговый цитологический метод, получивший широкое распространение, как в России, так и за рубежом. Он позволяет выявлять морфологические признаки ПВИ, дисплазии и рак. При этом метод прост в исполнении, не требует длительного времени для постановки диагноза и дорогостоящей аппаратуры. Цитологический метод высокоспецифичен, так как в цитологическом препарате при выявлении койлоцитов наличие ПВИ подтверждалось в 95-98% случаев (Роговская С.И., 2004). Однако выявляемость койлоцитоза - основного морфологического признака ПВИ, низкая - до 30% (Киселев В.И. 2004, Kremer H.A., 1999).

щих вирусную ДНК, так и о степени патологических изменений эпителия. Поэтому следует иметь в виду, что молекулярно-биологические методы не заменяют цитологический метод, а применяются комплексно, в сочетании с ним, что позволяет поставить наиболее полный и обоснованный диагноз. Вместе с тем, сами морфологические методы диагностики ПВИ - цитологический и, в меньшей степени, гистологический метод не дают полную информацию об изменении клеточных структур под воздействием вируса. Это связано с тем, что анализу подвергается двухмерное изображение клеток эпителия, пораженного вирусом, и в рассмотрение не включается объемное изменение поверхности таких клеток, что могло бы дать дополнительные морфологические критерии оценки. В связи с этим возникает необходимость в модификации цитологического метода с целью получения дополнительных критериев характеристики исследуемого объекта. Очевидно, чтобы улучшить качество диагностики, необходимо углублять наши знания по объекту исследования, а именно по топографии эпителиальной клетки, инфицированной вирусом.

Как известно, для исследования трехмерной структуры поверхности клетки используют сканирующую электронную микроскопию (Aragawa М., 19 77, Steven N, 1981). Однако это очень дорогостоящий метод и к тому же требующий длительной подготовки образцов. Это затрудняет его широкое использование в практической медицине. В настоящее время все большее применение находит метод атомно-силовой микроскопии (АСМ), позволяющий получить трехмерное изображение клетки и изучить топографию ее поверхности. Этот метод, несомненно, было бы целесообразно использовать для исследования поверхности эпителиальных клеток с цитоморфоло-гическими признаками ПВИ.

Цели и задачи исследования

Цитоморфологическое исследование клеток плоского эпителия шейки матки в норме и при папилломавирусной патологии, структурное изучение их поверхности с помощью метода атомно-силовой микроскопии.

контрольными клетками при учете клинических данных. Использование при этом в материале для контроля на наличие ВПЧ методов молекулярной биологии: полиме-разной цепной реакции, гибридизации in situ.

2. Получение АСМ-изображений поверхности клеток с морфологическими признаками ПВИ и нормальных клеток плоского эпителия.

3. Создание усредненных моделей структуры поверхности клеток с морфологическими признаками ПВИ, клеток без признаков патологии по результатам АСМ-исследования и сопоставление их с данными цитологического анализа.

4. Получение АСМ-изображений поверхности клеток с морфологическими признаками плоскоклеточного рака с ороговением и создание усредненной модели структуры поверхности этих клеток.

5. Изучение гистоморфологии и ультраструктуры клеток поверхностного и промежуточного слоев плоского эпителия шейки матки, инфицированного ВПЧ.

Научная новизна работы

Нами впервые применен и адаптирован к клеткам плоского эпителия в норме и патологии метод АСМ, позволивший исследовать структуру поверхности клеток нормы, с цитоморфологическими признаками вирусной и раковой патологии. Обнаружены существенные топографические различия структуры поверхности таких клеток, по которым можно определять степень поражения клетки. Практическая значимость

В работе показана важность способа и зоны получения материала для цитологической диагностики ПВИ гениталий. При этом цитоморфологические признаки ПВИ (койлоцитоз, дискератоз, паракератоз, гиперкератоз) можно дополнить анализом тех же самых цитологических препаратов методом АСМ. Разработаны трехмерные модели структуры поверхности клеток с цитоморфологическими признаками ПВИ, которые позволяют сопоставлять исследуемые клетки с ними и выявлять клетки с вирусной патологией.

Апробация работы

Результаты работ были представлены на съездах и пленумах:

- 3-й съезд Клинических цитологов России (Самара, июнь 1999);

- международная конференция «Microbiología», (Вашингтон, 13-16 марта 2000);

- 3-я Всероссийская научно-практическая конференция «Генодиагностика в современной медицине» отдела молекулярной биологии (Москва, 25 - 27 января 2000);

- заседание Пленума Ассоциации клинических цитологов России (Москва, 2006);

- заседание Первой Всероссийской Школы-семинара «Современные достижения био-наноскопии» (Москва, МГУ, 11-17 июня 2007);

- заседание Пленума Центрального Исполнительного Совета Ассоциации Клинических цитологов России (Черноголовка, 6 -7 декабря 2008);

- заседание Международного форума по нанотехнологии (Москва, 3-5 декабря 2008).

В завершенном виде результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на совместном заседании отдела молекулярной вирусологии и совета по предварительной экспертизе диссертационных работ ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН от 29 января 2009.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Оптимизация и адаптация метода АСМ к исследованию поверхности клеток плоского эпителия шейки матки в норме и при вирусной патологии.

2. Изучение и сопоставление топографических изменений клеток плоского эпителия в норме и при патологии.

3. Разработка трехмерных моделей структуры поверхностей клеток с цитоморфологи-ческими признаками признаками ПВИ: койлоцит, дискератоцит, паракератоцит, безъядерная чешуйка - элемент гиперкератоза.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 17 работ: 10 тезисов докладов в сборниках российских и международных конференций и 7 статей в реферируемых российских научных журналах, три из которых причисляются к списку BAAK. Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, 3 глав собственных исследований, заключения и выводов. Список литературы включает в себя 117 отечественных и зарубежных источников. Диссертация изложена на 108 страницах машинописного текста, включая 14 таблиц и 64 рисунка.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Кольпоскопия

При интраэпителиальных формах ПВИ при кольпоскопии на и вне зоны трансформации отмечался белый (ацетобелый) эпителий - зоны побеления после аппликации 3% уксуса (это не лейкоплакия), «мозаика» («поля») - сеть бледных красных линий, островков, борозд после аппликации 3 % уксусом, пунктуация («точечность») -атипическая васкуляризация - множественные красноватые точки на определенном участке эпителия. Остроконечные кондиломы после пробы уксусом имеют жемчужный блеск (отличие от эктопии). Гинекологический кольпоскоп - фирмы Opton.

Традиционный цитологический метод

В отличие от общей цитологии методической основой клинической цитологии является морфологическое изучение клеточного состава патологических процессов Здесь уже не стоят в центре внимания структура клетки и вопросы цитофизиологии. Основными объектами исследования в клинической цитологии являются как единичные клетки, так и их комплексы, получаемые из области патологического процесса.

Мазок для цитологического исследования получали с поверхности шейки матки, влагалища с помощью шпателя, из цервикального канала - с помощью специальной цервикс-щеточки - «cervix-brush». Традиционно после взятия материала для цитологического исследования гинекологи распределяли его тонким слоем на предметном стекле. Затем материал высушивался на воздухе (за рубежом распространены методы влажной фиксации). После фиксации в этаноле материал окрашивался смесью щелочных и кислых красителей - гематоксилином эозином. Существуют разные варианты приготовления окраски гематоксилина. Мы использовали гематоксилин по Ка-рацци. В связи с длительностью приготовления краски, мы использовали готовую производственную краску гематоксилина Карацци Bi-Vitrum (Санкт-Петербург). Окраска гематоксилином и эозином дает максимально прозрачные препараты и наиболее четкие морфологические характеристики клеток плоского эпителия, в первую очередь структуру хроматина ядер. Морфологический анализ препаратов проводился с помощью световых микроскопов Laboval-4, Axiostar plus с фотонасадкой Canon PC 1252. Увеличение светового микроскопа приблизительно оценивают как произведение увеличения объектива (10,100) и увеличения окуляра (10,18).

В работе использовались методы описательной статистики (Лакин Г.Ф., 1990), вычисления производили с помощью программы MS Exel.

Метод жидкостной цитологии с использованием системы «Цитоспин»

1. Полученный материал из шейки матки посредством щеточки смыть в стабилизирующий раствор. При этом все клетки переходят в суспензию.

2. Суспензию клеток поместить в центрифугу Cytospin 3 и центрифугировалась 5 минут при скорости 1000 об/мин. В результате были получены на предметных стеклах тонкие монослойные препараты.

3. Фиксировать в 4% параформальдегиде 2 часа при комнатной температуре.

4. Промыть стекла в свежей дистиллированной воде 2 раза по 2 минуты.

5. Провести через серию спиртов - 50%-100%

6. Нанести на материал гибридизационный раствор.

Для работы использовались зонды для большинства типов ВПЧ общий ENSO и на конкретные типы ВПЧ: 16/18,31/33,6/11. Гистоморфологический метод

1. Фиксация в забуференном формалине - 24 часа

2. Промывка проточной водой - 24 часа.

3. Обезвоживание в спиртах концентрации от 60% до 100%.

4. Три смены ксилола при 37°С по 20 минут.

5. Заливка парафином.

6. Приготовление серийных и отдельных срезов для световой микроскопии.

7. Монтаж срезов для световой микроскопии на предметное стекло.

8. Окраска гематоксилином.

Метод гибридизации in situ

1. Фиксация в 10% нейтральном формалине - 24 часа.

2. Помещение биоптата в парафин.

3. Приготовление срезов 5 мкм.

4. Депарафинизация срезов в термостате 5-10 минут при 60°С.

5. Промывка в ксилоле - 3 раза по 2 минуты.

6. Промывка в 100% спирте 2 раза по 3 минуты.

7. Высушивание срезов - 5 минут при 37°С и обработка раствором протеиназы (ENZO).

8. Нанесение 10 мкл гибридизационного раствора.

9. Покрытие тщательно промытым покровным стеклом.

10. Денатурация ДНК - 10 минут при 94°С в термоциклере.

11. Гибридизация во влажной камере 37°С - 1,5 часа.

12. Использование для детекции сигнала набор PathoGene HPV(na основе щелочной фосфатазы) - 30 минут при 37°С в темной камере.

13. Промывка срезов на предметных стеклах в буфере.

14. Нанесение на срезы коньюгат-стрептоавидин-биотинированной щелочной фосфатазы и инкубация -30 минут при 37° С.

15. Специфическое окрашивание Nitroblue tetrazolium, Bromochromdolyl phosphate. Промывка срезов на предметных стеклах в буфере.

16. Заключение срезов в водорастворимую среду «Permount».

17. Проведение световой микроскопии при помощи микроскопа «Leica» DMRB, изображение препаратов подвергали компьютерной регистрации и обработке с использованием систем анализа изображения «Leica QWIN 550 IW» и видиокамеры высокого разрешения «ProgRes 3012». Усиление насыщенности цветов проводилось при помощи программы «Adobe Photoshop Elements 5.01».

Подготовка материала для исследования методом полимеразнойцепной реакции (ПЦР)

Полимеразно-цепная реакции проводилась с использованием праймеров MY 09/MY 11 к участку гена LI, кодирующего капсидный белок LI. Анализ ПЦР продуктов проводили методом электрофореза в 1,5% агарозном геле, содержащем этидиум бромид, PERKIN ELMER Gene Amp PCR 2400. Детекцию ампликонов (накопленных амплифицированных молекул ДНК) выполняют методом электрофореза или с помощью ДНК-ИФА. Использовали наборы «ДНК технология» для детекции ДНК вируса папилломы типов: 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39 и общие праймеры. В каждом детекци-онном наборе был положительный и отрицательный контроль.

Подготовка препаратов для исследовании методом трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ)

При электронной микроскопии пучок электронов, изучаемый катодной нитью и фокусируемый кольцевыми магнитами, проходит через подготовленный образец. Проходящие через образец электроны фокусируют, наблюдают на флюоресцирующем экране и регистрируют при помощи фотопластинки.

1. Фиксация материала по Ito.

2. Дофиксация - образцы проведены через 1% тетрахлорид осмия.

3. Обезвоживание материала этиловым возрастающей концентрации 50% - 100% (3 порции по 10 минут).

4. Обработка промежуточной жидкостью диоксидом пропилена - 2 смены по 5 минут.

5. Полимеризация - помещение закрытых капсул с образцами в термостат на 12 часов при 35°С, на 12 часов при 45°С, на 12 часов при 60°С.

6. Получение срезов на ультрамикротоме LKB-Broma толщиной 500-600 нм.

7. Помещение срезов на сетке с подложкой и окрашивание 5% раствором уранил-ацетата на 70% метаноле и цитратом свинца.

8. Просмотр материала производили с помощью электронного микроскопа JEOL 100S.

Подготовка препаратов для исследования методом сканирующей электронной микроскопии

Метод заключается в том, что электронный пучок сканирует по поверхности и изображение формируется за счет отраженных электронов от объекта. Это дает возможность изучать трехмерное изображение клетки. Этапы подготовки образцов

1. Фиксация 2,5-3% глутарапьдегидом - 18-24 часа. Эта фиксация характеризуется быстрым проникновением его в ткани и ровной стабилизацией мембран в клетках.

2. Фиксация 1 % тетраоксидом осмия - 1 часа. Осмиевый фиксатор прежде всего взаимодействует с липидами и белками по месту двойных связей и при длительной фиксации в тетраоксиде осмия продукты реакций многих белков и липидов легко растворяются в воде и могут быть удалены. Поэтому целесообразно фиксировать образцы в течение непродолжительного периода времени.

3. Дегидратация в серии спиртов (50, 70, 80, 90, 96, 100%). Спирт тоже может растворять липиды, поэтому процедуру обезвоживания необходимо проводить быстро.

4. Погружение в ацетат изоамила - 30 мин.

5. Высушивание в критической точке с помощью системы dry ice.

6. Напыление платиной.

7. Просмотр объектов под микроскопом Hitachi - Н 600.

Подготовка препаратов для исследования поверхности клеток методом атомно-силовой микроскопии

Использование окрашенного материала

Принцип функционирования АСМ: микроскоп сканирует поверхность образца при помощи острой иглы (1-2 микрона, d < 100 Ангстрем). Игла располагается на свободном конце треугольной микробалки (кантеливера), которая покрыта отражающим материалом, чаще золотом. Кантеливеры обычно имеют длину от 100 до 200 микрон, ширину от 10 до 40 микрон, толщину от 0,3 до 2 микрон. Следует отметить, что кантеливер со встроенной в него иглой является важнейшим компонентом АСМ, так как он фиксирует силу, прилагаемую к образцу. Детектор измеряет степень отклонения кантеливера по смещению отраженного от его зеркальной поверхности лазерного луча, по мере то, как игла проходит над образцом. На основании этих данных компьютер составляет карту топографии поверхности исследуемого объекта.

Для исследования использовали цитологические препараты из мазков, окрашенных гематоксилин эозином по Карацци:

1. Фиксация мазков спиртом - 95% - 30 минут.

2. Промывка водой и сушка на воздухе.

3. Окраска гематоксилином - 30-40 минут.

4. Окраска 0,1% раствором эозина - 1 минута.

5. Промывка и сушка.

Мазки были взяты с шейки матки - зоны трансформации (зоны стыка шейка матки - цервикальный канал) 4 пациенток со следующей патологией: 2 женщины -кондиломатозный вульвовагинит, 1 женщина - патология шейки матки, 1 женщина -миома матки. Эти мазки были использованы для исследования цитологическим методом с помощью светового микроскопа и методом атомно-силовой микроскопии. При проведении исследований цитологических окрашенных препаратов методом атомно-силовой микроскопии возникали некоторые трудности, так как данный материал использовался для АСМ исследования впервые.

Использование неокрашенного материала

Для изучения поверхности человека фибробластов использовали культуру фибробластов человека, фиксированную в различные интервалы времени 0.2 и 0,02% водного раствора глютаральдегида.

После фиксации образцы помещали либо в буферный раствор ТРИС, либо пропускали через серию спиртов (50%, 70%, 96%, 100%) и хранили в эксикаторе при температуре +4°С. В работе использовали стандартные предметные стекла с культурой клеток. Препараты не подвергались окраске красителями. Использовали контактную моду сканирования и тейпинг-моду, заключающуюся в наложении модуляции на сканирующий датчик. Исследование проводилось с помощью атомно-силового микроскопа Solver 47 Bio с использованием кантеливеров Golden Siliicon canteliver NSGOOl.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе представлены обобщенные результаты за 3,5 года цитоморфологиче-ских исследований 191 пациентки, инфицированных вирусом папилломы человека (ВПЧ), в возрасте от 20 и старше 60 лет (таблица 1).

Таблица 1. Возрастная характеристика ВПЧ-инфицированных пациенток

Возраст До 20 лет 20-30 30-40 40-50 50-60 Старше

лет лет лет лет 60 лет

Кол-во 2 71 54 43 20 1

человек

Итого 191

Предварительно пациентки были обследованы кольпоскопическим методом. При выявлении методом световой микроскопии основных и второстепенных цитологических признаков папилломавирусной инфекции (ПВИ) учитывались: день менструального цикла, зона получения материала для цитологического исследования, клинические данные, онкогенность ВПЧ. Сопоставлена выявленная патология с онкоген-ностью ВПЧ. Результативность цитологического исследования на 95% зависит от методики (качества) получения материала. Произвольно выбрана группа ПЦР позитивных женщин из 60 человек (различные типы ВПЧ 6, 11, 16, 18, 31, 33, 39,) в возрастной категории от 20 до 53 лет в различные дни менструального цикла (таблица 2).

Таблица 2. Соотношение койлоцитоза в зависимости от способа получения материала

30 женщин: материал получен "жестким соскобом" (топические мазки: шейка матки, цервикальный канал, влагалище) 30 женщин: материал получен без применения "жесткого соскоба"

Койлоциты выявлены в 14 случаях (46%): - с шейки матки - 3 (22%); - из влагалища - 2 (14%); - из цервикального канала + шейка матки - 4 (28%); - цервикальный канал + влагалище - 1 (8%). Койлоциты выявлены в 2-х случаях (6%): - из цервикального канала - 1 (3%); - с шейки матки - 1 (3%).

Из таблицы наглядно видно, что наиболее информативный материал получался при применении «жесткого» соскоба. Мы сопоставили клинические данные исследуемых пациенток с койлоцитозом, выявлении в цитологических препаратах (табл.3). Таблица 3. Частота встречаемости койлоцитоза при различных клиниче-

ских проявлениях

Клиническая картина Койлоцитоз выявлен Койлоцитоз не выявлен

Острые кондиломы 24/68 (35,29%) 44/68 (64,71%)

Эктопия шейки матки 7/31 (25,58%) 24/31 (77/42%)

Эктопия шейки матки Острые кондиломы 8/19(42,11%) 11/19 (57,89%)

Лейкоплакия вульвы, шейки матки 4/12 (33,33%) 8/12 (66,67%)

Лейкоплакия шейки матки Острые кондиломы 4/10 (40,00%) 6/10 (60,00%)

Лейкоплакия, эктопия шейки матки 1/6 (16,67%) 5/6 (83,33%)

Полипоз шеечного канала 3/13 (23,08%) 10/13 (76,92%)

Гиперплазия эндометрия 1/6 (16,67%) 5/6 (83,33%)

Миома матки. Острые кондиломы 2/6 (33,33%) 4/6 (66,67%)

Сочетание более двух патологий гениталий 11/20 (55,00%) 9/20 (45,00%)

Итого 65/191 (34,03%) 126/191 (65,67%)

Выявляемость койлоцитоза при различной клинической картине в данной группе пациенток (п=191) колеблется в пределах от 16,67% при лейкоплакии шейки матки в сочетании с эктопией шейки матки и наиболее чаще - до 55%, отмечались койлоциты при сочетании более 2-х выше перечисленных патологий гениталий. Вероятно, данные пациентки имели более ослабленный иммунитет, что способствовало повышению вирусной активности, и поэтому мы чаще отмечали в препаратах цитоморфоло-гические признаки ПВИ. При исследовании цитологических препататов были выявлены цитоморфологические признаки ПВИ. Результаты наших исследований представлены в таблице 4.

Таблица 4. Сопоставление выявленных цитоморфологических признаков

с онкогенностью типов ПВИ

Онкогенность Койлоцитоз Диске- Параке- Гипер- Отсутствие

ВПЧ ратоз ратоз кератоз признаков ВПЧ

Низкоонко генные 21/77 2/77 1/77 6/77 47/77

Типы: 6, 11 (27%) (3%) (1%) (8%) (61%)

Высокоонкогенные 29/66 2/66 1/66 2/66 32/66

типы: 16, 18,31,33, (44%) (3%) (2%) (3%) (48%)

35, 39

Нетипированные 15/48 4/48 - 3/48 26/48

(32%) (8%) (6%) (54%)

Итого 65/191 8/191 2/191 11/191 105/191

(34%) (4%) (1%) (6%) (55%)

Из 191 инфицированной ВПЧ пациентки койлоцитоз в сочетании с другими цитоморфологическими признаками ПВИ отмечался у 65 пациенток (34%), а дискера-тоз, без койлоцитоза у 8 пациенток (4%), хотя некоторые авторы отмечают, что дис-кератоз без койлоцитоза отмечается чаще (КиэШБОУ У., 2008). Второстепенные признаки - паракератоз у 2 пациенток (1%), гиперкератоз у 11 (6%), при отсутствии койлоцитоза и дискератоза. У остальных пациенток - 105 случаев (55%) - отсутствовали какие-либо цитоморфологические признаки ПВИ. При использовании критерия Стьюдента было установлено, что у пациентов с высокоонкогенными типами ВПЧ койлоцитоз встречался достоверно чаще, чем с низкоонкогенными типами ВПЧ -

44% против 27% (р=0,04, то есть р меньше 0,05). При морфологическом анализе 382 цитологических препаратов были выделены 12 объектов (клеток) для дальнейшего исследования методом атомно-силовой микроскопии: клетки плоского эпителия без патологии и с вирусной и раковой патологией.

На рис. 1 представлено АСМ-изображение клетки плоского эпителия поверхностного слоя без патологических изменений. На плоском АСМ-изображении видны четкие контуры ядра, цитоплазмы; плотность поверхности неоднородна, что свидетельствует о наличии выраженного рельефа в цитоплазме и ядре. Белая горизонтальная линия, пересекающая клетку через цитоплазму и ядро, представляет путь, по которому проводили графический анализ рельефа клетки (график рельефа справа, ось абцесс - длина клетки, ось ординат - высота клетки). На графике, в центральной части отмечается значительная выпуклость (пик), до 1000 нм, площадь которого по отношению к площади клетки незначительна; при этом остальная часть клетки имеет малый угол понижения. Высота цитоплазмы составляла 150 нм. Трехмерное АСМ -изображение той же клетки без патологических изменений показывает, как плоскостные характеристики рельефа ядра и цитоплазмы преобразуются в четкую шероховатую поверхность клетки. При этом высота рельефа четко коррелирует с цветом (белым цветом проявляется более высокий рельеф клетки). Ядро другой клетки без патологии также была представлено центральной выпуклостью. Сопоставляя результаты плоского и трехмерного АСМ-изображения с цитологической картиной этой же клетки, мы считаем, что центральная выпуклость соответствует клеточному ядру (рис. 2, усредненная модель клетки плоского эпителия без патологии).

При цитологической диагностике препаратов с шейки матки были выявлены как основные признаки ПВИ (койлоцитоз, дискератоз), так и второстепенные признаки (паракератоз, гиперкератоз). При АСМ-исследовании койлоцита мы отмечали провал вокруг ядра (глубиной до 300 нм), в зоне уплотнения отмечался подъем высоты до 850 нм, высота поверхности в зоне ядра составляла 900 нм. Путь графического анализа рельефа проходил через ядро и цитоплазму (рис.3). На основании полученных измерений построена усредненная модель койлоцита (рис. 4). У других койлоци-тов также отмечался широкий пик (на графическом анализе высот) в зоне ядра, понижение рельефа в околоядерной зоне и подъем высоты по всей периферии клетки.

На АСМ-изображении дискератоцита имеется хаотичное чередование полей светлых и темных участков. При анализе графического изображения отмечаются подъем высоты цитоплазмы в одних участках до 1400 нм, а в других участках - снижение высоты до 800 нм, в зоне ядра высота поверхности клетки 1250 нм (рис. 5). На усредненной модели наглядно виден небольшой перепад высот поверхности дискератоцита (рис. 6). АСМ-изображение паракератоцитов характеризуется высокими значениями высоты всей клетки. На графическом изображении паракератоцита не отмечалось резких перепадов высоты между ядром (1550 нм) и цитоплазмой (1450 нм). В безъядерной чешуйке на плоском АСМ-изображении выявлялись более светлые и более темные участки, показывающие неоднородность рельефа цитоплазмы. При сопоставлении с графическим изображением поверхности было выявлено, что перепады высоты в различных участках чешуйки составляют от 800 нм до 500 нм. Полученные данные по АСМ-исследованию представлены в таблице 5.

Таблица 5. Сопоставление нормальных клеток плоского эпителия

Клетка Размер, мкм Высота зоны ядра, hi,HM Высота зона цитоплазмы, ll2, нм Разность высот hi-h2

Клетка без патологии 2 Клетка - 48x25 Ядро - 1,5x2 790 370 420

Койлоцит1 Клетка - 14x10 Ядро - 5x7 1608 Зона уплотнения цитоплазмы - 1087 Зона просветления цитоплазмы - 969 118

Койлоцит 2 Клетка - 14x11 Ядро - 8x5 1400 Зона уплотнения.-1300 Зона просветления-300 1 00 1100

Койлоцит 3 Клетка 54x48 Ядро 7,5x5 900 Зона уплотнения.- 850 Зона просветления -300 50 600

Дискератоцит Клетка -7x9 Ядро 9x5 1250 Плотные участки -1400, Менее плотные - 800 150 450

Паракератоцит Клетка - 3x3,6 Ядро - 1x1 1550 1450 100

Чешуйка Клетка - 20x20 - 500-800 -

При АСМ-сканировании клетки плоскоклеточного рака с ороговением, на рис. 7 - трехмерное (слева) и плоское (справа) АСМ-изображение раковой клетки, просматриваются более светлые участки в области отростка цитоплазмы. Эти участки характеризуются подъемом высоты до 2526 нм, что соответствует изображению на световом микроскопе зоны выраженного ороговения. В более темных участках цитоплазмы высота поверхности клетки - 884 нм, что является зоной менее выраженного ороговения. Высота в зоне ядра составляла 2754 нм (рис. 8 - графическое изображение, рис. 9 -усредненная модель полученных данных). Участок цитоплазмы с ороговением имеет более выраженный рельеф на плоском и трехмерном АСМ-изображении.

На графике четко видны два пика: левый соответствует ядру (смотри линию графического анализа), правый - зоне цитоплазмы с ороговением (рис. 8). Зона цитоплазмы без ороговения в верхней части клетки характеризуется низкими значениями высоты. Такие же перепады высот в зонах цитоплазмы с различной степенью ороговения отмечались и в других раковых клетках, где высота зоны ядра почти в 3 раза превышает ядерную зону нормальной клетки плоского эпителия, а высота зоны цитоплазмы превышает норму в 16 раз. Полученные данные АСМ-исследований клеток плоскоклеточного рака с ороговением представлены в таблице 6.

Таблица 6. Сравнение характеристик клеток без атипии и клеток злокачественной опухоли

Характеристики Размер, мкм Высота цитоплазма- Высота зоны Разность

клеток тической части, hi, нм ядра, h2, нм hi-h2, нм

Клетка без пато- Клетка-50x54 150 1000 850

логии -1 Ядро -3x3

Клетка рака -1 Клетка-28 х 12 Зона невыраженного 2207 1904

(верхняя) Ядро-10x7 ороговения - 303

Клетка рака - 2 Клетка - 26 х 8 Зона невыраженного 2894 2210

(нижняя слева) Ядро - 11 х 7 ороговения - 684

Клетка рака - 3 Клетка-20 х 9 Зона умеренного 3064 1816

(нижняя справа) Ядро-11x8 ороговения -1248

Клетка рака - 4 Клетка-40 х 19 Зона невыраженного 2754 1870

(одиночная) Ядро-13x9 ороговения - 884, Зона выраженного ороговения - 2526 228

Итак, при цитологическом исследовании в эпителиальных слоях, инфицированных вирусом папилломы человека можно выделить различные морфологические варианты клеток, характеризующих как трансформацию, так и вирусную патологию. Как было нами показано в главе 4.2.2 (стр. 75 - 92), такие клетки могут иметь не только четкие цитомофологические признаки, но и характерные изменения поверхности клетки при ее объемном изображении.

Нам представлялось интересным исследование гистоморфологии и ультраструктуры клеток плоского эпителия в норме и при папилловирусной патологии. При ультраструктурном исследовании клеток поверхностного и промежуточного слоев, инфицированных вирусом папилломы, как правило, мы отмечали: неровные контуры ядра, крупные скопления хроматина, неравномерную перинуклеарную зону. Цитоплазма заполнена мелко грануллированным материалом, отмечались зоны просветления. На наш взгляд, клетки с просветленной цитоплазмой и сильно деформированным ядром относятся, скорее всего, к поверхностному слою, так как сильно нарушены межклеточные контакты, и четко выражена зона просветления, что в целом напоминает койлоцит.

Клетки, где видна четко цитоплазматическая мембрана, ядро менее деформировано, а зона просветления незначительна, можно отнести к промежуточному слою плоского эпителия.

Рисунок-схема 10 из работы автора Окадаки (ТакаяЫ Ока£акл М.О, 1978), наглядно иллюстрирует результаты наших исследований. Здесь представлены клетки поверхностного и промежуточного слоев плоского эпителия с койлоцитозом, показаны этапы изменения ядра, образование зоны просветления вокруг ядра. Завершается этот процесс появлением клеток с сильно деформированным ядром и свободной от органелл цитоплазмой. По-видимому, при приготовлении даже цитологического препарата, клетки самого верхнего слоя разрушаются, а мы анализируем клетки, расположенные ниже, более сохранные - типичные койлоциты.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

(п=191). Сравнивая наши данные с литературными, мы можем отметить, что по выявляемое™ койлоцитоза полученные результаты коррелируют с опубликованными (Киселев В.И., 2004, Kremer H.A., 1999), в то время как по другим цитоморфологическим критериям ПВИ статистической информации мало опубликовано и поэтому ее трудно сопоставлять.

При этом для того чтобы получить адекватный мазок с выраженными признаками койлоцитоза, мы проводили забор материала с зоны стыка шейки матки и церви-кального канала с использованием «жесткого» соскоба. Впервые нами это было отмечено в 1999 году и доложено на 3 Всеросийском съезде Ассоциации Клинических цитологов России в Самаре. Позднее аналогичные результаты были опубликованы другими авторами (Прилепская В.Н., 2005, Сопко Н.И., 2006). Характерным моментом, влияющим на выявление койлоцитов, является, как известно из литературы, тип ВПЧ. Одни авторы утверждают, что койлоциты характерны для поражений с низким онко-генным типом ВПЧ (Бебнева Т.Н., 2001), по результатам других авторов койлоцитоз чаще отмечался при высокоонкогенных типах ВПЧ (Cramer H.A., 1999).

Наши данные говорят о том, что особенно сильное влияние на этот процесс оказывает онкогенность конкретного типа ВПЧ. Для высокоонкогенных типов койлоциты выявлены в 44%, а для низкоонкогенных типов - в 27% от общего количества обследованных пациенток. В целом, как показывают наши данные, койлоцитоз выявляется чаще не только при высокой онкогенности, но и при сочетанной патологии матки.

Примененный нами метод атомно-силовой микроскопии к анализу поверхности с морфологическими признаками ПВИ позволил получить оригинальные результаты по структуре поверхности таких клеток и построить их трехмерные модели. Из литературы известно о применении атомно-силовой микроскопии в изучении клеток крови, кардиомиоцитов крыс (Саликова С.П. 2003, Матюхина Т.Г., 2004, Кухаренко JIB., 2007,, Никитина И.А., 2007). Однако нами впервые был применен этот метод к клеткам эпителиальной ткани с вирусной и раковой патологией. В результате этих исследований впервые появилась возможность сопоставить топографические изменения эпителиальной клетки с ее плоскостными изменениями, которые наблюдаются в цитологических препаратах. Развитие таких исследований дальше может повысить ка-

чество морфологической диагностики ПВИ и предрака шейки матки за счет дополнительной информации об исследуемом объекте.

Наши ультраструктурные исследования клеток плоского эпителия поверхностного и промежуточного слоев при вирусной патологии четко показали поэтапное появление околоядерного гало и значительную деформацию ядра. Нам не удалось выявить зрелые вирионы ВПЧ в таких искаженных ядрах. Однако в литературе есть единичные работы, авторы которых наблюдали вирусоподобные частицы (М. Casas -Cordero, 1981). На основании полученных нами результатов, а также анализа литературы, мы пришли к заключению, что скрининговая диагностика ПВИ, основанная на выявлении вирионов ВПЧ, с помощью ПЭМ, не может быть эффективной, так как зрелые вирионы появляются в клетке в момент ее активной деструкции, что ведет к потере материала.

Полученные нами результаты показывают эффективность применения АСМ-метода при исследовании структуры поверхности эпителиальных клеток при вирусной и раковой патологии. В дальнейшем потребуется продолжение таких исследований для того, чтобы улучшить качество цитологической диагностики ПВИ за счет включения объемных характеристик патологически измененной клетки.

ВЫВОДЫ

1. При цитологическом исследовании соскобов с шейки матки выявлены клетки с морфологическими признаками ПВИ: койлоциты, дискератоциты, паракератоциты, элементы гиперкератоза. Осуществлена модификация способа получения материала, позволяющая обогатить его такими клетками.

2. Койлоцитоз отмечается чаще у ВПЧ-инфицированных пациенток с сочетанной патологией матки в 55,0% от общего числа исследуемых пациенток.

3. Выявлено, что койлоцитоз, в зависимости от онкогенности типов ВПЧ (данные ПЦР), встречается достоверно чаще у пациенток с высокоонкогенными типами (44%) , чем у пациенток с низкоонкогенными типами (27%) (п=191).

4. Впервые метод атомно-силовой микроскопии был применен и адаптирован к изучению структуры поверхности клеток плоского эпителия в норме и с папилломави-русной патологией.

5. Получены АСМ-изображения поверхности клеток с морфологическими признаками ПВИ, которые были сопоставлены с данными цитологического анализа. Впервые построены усредненные модели структуры поверхности таких клеток, которые дают дополнительную информацию о патологических изменениях клеток.

6. При цитологическом исследовании были выявлены клетки плоскоклеточного рака с ороговением. Получены АСМ-изображения поверхности этих клеток и создана усредненная модель структуры поверхности.

7. Показано, что сигнал гибридизации in situ на гистологических препаратах, свидетельствующий о наличии вирусной ДНК, отмечался как в клетках с морфологическими признаками ПВИ, так и без них. Последнее показывает на то, что процесс патологических изменений в этих клетках находится в начальной стадии.

8. Установлено, что метод просвечивающей электронной микроскопии, как скринин-говый, при диагностике ПВИ малоперспективен, так как вирионы, по которым определяют инфекцию, созревают на завершающей стадии дифференцировки клетки эпителия, в тот момент, когда начинается активная деструкция последней, что приводит к потере материала, необходимого для анализа.

Список публикаций по теме диссертации

1. Яковлева В.А., СамсоноваЛ.В., КонышеваТ.А., Демкин В.В. Возможности цитологической диагностики папилломавирусной инфекции.// Новости клинической цитологии России, Т. 3, №1-2/99,77.

2. Круглова А.И., Яковлева В.А., Карлина В.П., Самсонова JI.B., Конышева Т.А.. Демкин В.В. Сравнительный анализ цитологических и ПЦР исследований в диагностике генитальной папилломавирусной инфекции человека.// Генодиагностика в современной медицине. Сборник тезисов докладов 3-й Всероссийской научно-практической конференции. Москва, 2000 год, 115-117.

3.Tarantul V., Kruglova A., Yakovleva V., Karlina V., Demkin V. Citological and PCR analysis of genital papilloma virus infection. // Microbicides 2000, Conference Abstracts, March 13-16, Hilton Alexandria Mark Center, Washington, DC, 2000, 30.

4. Маныкин А. А., Завалишина JI. Э., Франк Г. А., Андреева Ю. Ю., Яковлева В. А., Лисицын Ф.В., Ефремова Е.В. Сравнительное исследование по выявлению ДНК вирусов папилломы человека методам ПЦР и In Situ гибридизации на цитологическом и гистологическом материале.// Генодиагностика инфекционных заболеваний. Сборник тезисов 4-й Всероссийской научно-практической конференции. Москва, 2002,53.

5. Маныкин A.A., Цилинский Я.Я., Ефимов А.Е., Лисицын Ф.В., Яковлева В.А. Изучение поверхности фибробластов человека методом атомной силовой микроскопии.// Новости клинической цитологии России, М., 2002, т.6, № 3-4,. 15-16.

6. Яковлева В.А., Лисицын Ф.В., Маныкин A.A., Завалишина Л.Э. Анализ цитологических препаратов пациенток с различной патологией матки методом атомно-силовой микроскопии.// Новости клинической цитологии России, М., 2004, т.8, № 3-4, 70-71.

9. Лисицын Ф.В., Маныкин A.A., Франк, Завалишина Л.Э., Гущина Е.А., Яковлева В.А. и др. Детекция ДНК вируса папилломы человека методом гибридизация in situ в тканях шейки матки, гортани и мочевого пузыря с различной патологией этих органов, Молекулярная медицина. // 2004, №1, 32-47.

7. Яковлева В.А., Маныкин A.A. Эволюция цитоморфологического метода индикации вируса папилломы человека.// Новости клинической цитологии России, 2005, Т.9, №1-2- 41-46.

8. Яковлева В.А., Лисицын Ф.В., Маныкин A.A., Завалишина Л.Э. Применение метода атомно-силовой микроскопии в исследованиях цитологических препаратов паци-

енток с различной патологией гениталий.// Материалы 9-го Всероссийского съезда дерматовенерологов, Москва, 2005, Т.2,44.

10. Яковлева В.А., Лисицын Ф.В., Маныкин A.A., Завалишина Л.Э. Исследование структуры поверхности клеток плоского эпителия с признаками вируса папилломы человека методом атомно-силовой микроскопии.// Русский журнал СПИД, рак и общественное здоровье, 2005, Т. 9, № 2, 92, 133-134.

11. Яковлева В.А., Лисицын Ф.В., Маныкин A.A., Конышева Т.А. Анализ цитологических препаратов пациенток с различной патологией гениталий методом атомно-силовой и сканирующей электронной микроскопии.// Со временные микроскопические исследования в биологии и медицине, Москва, 2006, 182-183.

12. Яковлева В.А., Лисицын Ф.В., Маныкин A.A., Конышева Т.А. Опыт применения атомно-силовой микроскопии при исследовании цитологических препаратов у женщин с папилломавирусными поражениями и опухолями гениталий.// Новости клинической цитологии России, 2007, T.l 1, № 1-2, 35-37.

13. Лисицын Ф.В., Яковлева В.А., Маныкин A.A., Науменко В.А. Опыт применения атомно-силовой микроскопии к изучению клеток, инфицированных вирусами иммунодефицита человека и некоторыми другими.// Первая Всероссийская Школа-семинар, 11-17 июня 2007, Москва, МГУ, сборник тезисов, 31.

14. Яковлева В.А., Маныкин A.A., Конышева Т.А., Богатырев В.Н. Результаты цито-морфологического исследования мазков из экто-, эндоцервикса и влагалища пациенток, инфицированных вирусом папилломы человека.// Вестник РОНЦ им. H.H. Бло-хина РАМН, 2007, Т. 18, № 3, 74-77.

15. Яковлева В.А., Маныкин A.A., Лисицын Ф.В., Конышева A.A. - Возможности использования световой микроскопии в сочетании с атомно- силовой микроскопией для цитологической диагностики папилломавирусной инфекции. //Медицина экстремальных проблем, 2008,4(26), 13-42.

16. Яковлева В.А., Маныкин A.A., Лисицын Ф.В., Конышева Т.А. Использование атомно-силовой микроскопии для исследования цитоморфологических признаков папилломавирусной инфекции.// Вопросы вирусологии, 2009.

17. Яковлева В.А., Маныкин A.A., Лисицын Ф.В., Гущина Е.А., Худицкая В.Н. Электронно-микроскопическое изучение клеток плоского эпителия шейки матки, пора-

женных папилломавирусной инфекцией.// Новости клинической цитологии России, 2009, №1-2.

Рис. 1. Атомно-силовое изображение клетки плоского эпителия без патологии. Графическое изображение этой же клетки

Примечание. Стрелка показывает путь графического анализа рельефа. На графике 1 - зона ядра, 2 - зона цитоплазмы

Рис. 2. Усредненная модель клетки плоского эпителия без патологии. Сопоставление нормы и клеток с цитоморфологическими признаками ПВИ

Рис. 3. ACM изображение и графический анализ высот поверхности двуядерного койлоцита

Примечание. Стрелка показывает путь графического анализа рельефа. На графике показаны:! - зона ядра: 2 - зона цитоплазмы

Рис.4. Усредненная модель измерений двуядерного койлоцита

Рис. 5. Графический анализ высот дискератоцита

Примечание. На графике показаны:! - зона ядра: 2 - зона цитоплазмы

Рис. 6. Модель усредненных измерений дискератоцита. Сравнение характеристик клеток без атипии и клеток злокачественной опухоли

Рис. 7. Трехмерное и плоское АСМ-изображение раковой клетки

Примечание. Стрелка показывает путь графического анализа рельефа

сосс ■

£ «1» 1

ох ■У- 1 2

.«•СО 'иг аюсо ачп) чот вдадо зоттэ ешш ти юттнягол ЯШМООГОЗДЭДОгакй иПТИ 1ЛППЯЧге.чЦП.;-иихеэтгп- !• •. . 1П-ЧПТХ1.1 7ЭЭТБИПТ

Рис. 8. Графический анализ высот поверхности раковой клетки

Примечание. На графике 1 - зона ядра, 2 - зона цитоплазмы

Рис. 9. Модель усредненных измерений клетки плоскоклеточного рака с ороговением

V- наиболее вероятное место нахождения вируса, Tf-тонофиламенты, D - десмосомы

Рис.10. Схематическая иллюстрация процесса койлоцитоза

Список используемых сокращений

ВПЧ - вирус папилломы человека

ПВИ - папилломавирусная инфекция

АСМ - атомносиловая микроскопия

СЭМ - сканирующая электронная микроскопия

ПЭМ - просвечивающая электронная микроскопия

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

РНК - рибонуклеиновая кислота

я/ц - ядерно-цитоплазматическое соотношение

Бумага для множительных аппаратов. Печать офсетная. Формат 60x84/16. Тираж 100 экз.

Типография ООО "ФЭД+", Москва, ул. Кедрова, д. 15, тел. 774-26-96

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Яковлева, Валерия Анатольевна

СОДЕРЖАНИЕ.

Список используемых сокращений

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. ОСНОВНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПАПИЛЛОМАВИРУСОВ. 1О

1.1. Общие сведения о вирусе папилломы.Ю

1.2. Структура и организация генома.

1.3.Репликация вируса в эпителиальных клетках.

ГЛАВА 2. ИЗМЕНЕНИЕ МОРФОЛОГИИ КЛЕТКИ ПОД ВЛИЯНИЕМ

ПАПИЛЛОМАВИРУСОВ.

2.1. Цитоморфология и гистоморфология нормального плоского эпителия.

2.2. Цитоморфология и гистоморфология клеток плоского эпителия, инфицированных вирусом папилломы.

2.3. Цитологические и гистологические критерии злокачественности.

ГЛАВА 3. УЛЬТРАСТРУКТУРА КЛЕТОК В НОРМЕ ПАТОЛОГИИ.

3.1. Просвечивающая электронная микроскопия клеток плоского эпителия в норме и при вирусной патологии.

3.2. Сканирующая электронная микроскопия. Плоский эпителий.

3.3. Атомно-силовая микроскопия.

3.3.1. Принцип метода атомно-силовой микроскопии.

3.3.2. Атомно-силовое исследование биологических объектов.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1.1. Материалы.

1.2. Кольпоскопия.

1.3. Цитоморфологический метод.

1.3.1. Традиционный цитологический метод.

1.3.2. Метод жидкостной цитологии с применением системы «Цитоспин».

1.4. Гистоморфологический метод.

1.4.1. Подготовка препаратов для гибридизации in situ.

1.5. Подготовка материала для исследования методом полимеразной цепной реакции.

1.6. Подготовка препаратов для исследования методом просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ).

1.7. Подготовка препаратов для исследования методом сканирующей электронной микроскопии.

1.8. Подготовка препаратов для исследования поверхности клеток методом атомно-силовой микроскопии.

1.8.1. Использование окрашенного материала.

1.8.2. Использование неокрашенного материала.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

ГЛАВА 2. ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

В СОПОСТАВЛЕНИИ С КЛИНИЧЕСКИМИ ДАННЫМИ.

2.1. Характеристика клинических данных исследуемых пациенток и выявляемость койлоцитоза.

2.2. Анализ способов получения материала.

2.3. Выявление цитоморфологических признаков ПВИ и сопоставление с результатами молекулярно-биологических методов.

2.4. Определение степени патологических изменений плоского эпителия.

ГЛАВА 3. ЦИТОМОРФОЛОГИЯ КЛЕТОК ПЛОСКОГО ЭПИТЕЛИЯ

В СОЧЕТАНИИ С АТОМНО-СИЛОВЫМ ИССЛЕДОВАНИЕМ.

3.1. Контрольные образцы - цитология, атомно-силовая микроскопия, сканирующая электронная микроскопия.

3.2. Плоский эпителий, измененный папилломавирусной инфекцией -цитология, атомно-силовая микроскопия.

3.3. Клетки плоскоклеточного рака с ороговением - цитология,

АСМ-исследование.

ГЛАВА 4. ГИСТОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И УЛЬТРАСТРУКТУРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОГГГ АТОВ.

4.1. Гистологическое исследование биопсий.

4.2. Ультраструктурное исследование биопсий.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структура поверхности эпителиальных клеток шейки матки, инфицированных вирусом папилломы человека"

Актуальность проблемы Папилломавирусные инфекции (ПВИ) широко распространены среди людей, животных, вызывая тяжелые патологии слизистой оболочки и кожи. В основном это кондиломы и папилломы слизистых оболочек, бородавки и папилломы кожи, опухоли или опухолеподобные образования различной локализации. Как было установлено Н. Цурхаузеном в 1976 году [30], именно инфицирование эпителия шейки матки вирусом папилломы человека (ВПЧ) 16 типа создает условия развития рака этого органа.

По данным Международного агенства по изучению рака, ежегодно в мире регистрируется более 370 ООО новых случаев рака шейки матки, умирает от него около 190000 женщин [48]. Каждый день в России от рака шейки матки умирает 17 человек [60]. Наряду с доброкачественными опухолеподобными разрастаниями, вызываемыми папилломавирусами низкой онкогенной группы (6, 11 типы и другие), папиллома-вирусы, вызывающие развитие рака шейки матки, относятся к высокоонкогенным вирусам (16, 18, 31, 45 типы) [39]. Еще в 1996 году в информационном бюллетене Всемирной организации здравоохранения было официально отмечено, что вирусы папилломы человека 16 и 18 типов являются особо канцерогенными [48], поэтому диагностика папиллома вирусной инфекции (ПВИ) была и остается актуальной.

Существуют различные методы диагностики ПВИ, среди которых особое место занимает скрининговый цитологический метод, получивший широкое распространение, как в России, так и за рубежом, который позволяет выявлять как морфологические признаки ПВИ, дисплазии и рак. Метод прост в исполнении, не требует длительного времени для постановки диагноза и дорогостоящей аппаратуры. Цитологический метод высокоспецифичен, то есть в цитологическом препарате при выявлении койло-цитов, наличие ПВИ подтверждалось в 95-98% случаев (51). Однако выявляемость койлоцитоза — основного морфологического признака ПВИ, низкая - до 30% [15, 95].

С другой стороны, существующие в настоящее время молекулярно-биологические методы диагностики ПВИ: полимеразная цепная реакция (ПЦР), метод Hybrid Capture («Digene-TecT») и другие выявляют наличие ДНК ВПЧ в материале, от больных с высокой точностью и чувствительностью [58, 16], но при этом теряется информация, как о локализации отдельных клеток, несущих вирусную ДНК, так и о степени патологических изменений эпителия. Поэтому следует иметь в виду, что молекулярно-биологические методы не заменяют цитологический метод, а применяются комплексно, в-сочетании с ним, что позволяет поставить наиболее полный и обоснованный диагноз. Вместе с тем, сами, морфологические методы диагностики ПВИ- цитологический и, в меньшей! степени, гистологический метод не дают полную информацию об изменении клеточных структур под воздействием вируса: Это связано с тем, что анализу подвергается двухмерное изображение клеток эпителия, пораженного вирусом, и не включается в рассмотрение объемное изменение поверхности таких клеток, что могло бы дать дополнительные морфологические критерии оценки. Поэтому возникает необходимость в модификации цитологического метода, с целью получения дополнительных критериев характеристики исследуемого объекта. Очевидно, чтобы улучшить качество диагностики необходимо углублять наши знания по объекту исследования, а именно по топографии эпителиальной клетки, инфицированной вирусом.

Как известно, для исследования поверхности клетки используют сканирующую электронную микроскопию [82, 113], однако это дорогостоящий метод и к тому же к-1* требующий длительной подготовки образцов, что затрудняет его широкое использование в практической медицине. В настоящее время все большее применение находит, метод атомно-силовой микроскопии, позволяющий получить трехмерное изображение клетки, и изучить топографию ее поверхности. Этот метод, несомненно, было бы целесообразно использовать для исследования поверхности эпителиальных клеток с

Гц . цитоморфологическими признаками ПВИ:

Цели и задачи исследования

Исходя из этого, были поставлены следующие задачи: 1. Проведение цитологического анализа мазков с шейки матки пациенток, инфицированных вирусом папилломы человека (ВПЧ) и выявление клеток с морфологическими? признаками ПВИ: койлоциты, дискератоциты, паракератоциты, элементы пшеркера-тоза (чешуйки плоского эпителия, клетки с «тающими» ядрами) и сопоставление их с контрольными клетками при- учете клинических данных. Использование при этом в контрольными клетками при учете клинических данных. Использование при этом в материале для контроля на наличие ВПЧ методов молекулярной биологии: полиме-разной цепной реакции, гибридизации in situ.

3. Создание усредненных моделей структуры поверхности клеток с морфологическими признаками ПВИ и клеток без признаков патологии по результатам АСМ-исследования и сопоставление их с данными цитологического анализа.

Научная новизна работы Нами впервые применен и адаптирован к клеткам плоского эпителия в норме и патологии метод АСМ, позволивший исследовать структуру поверхности клеток нормы, с цитоморфологическими признаками вирусной и раковой патологии. Обнаружены существенные топографические различия структуры поверхности таких клеток, по которым можно определять степень поражения клетки.

Практическая значимость работы В работе показана важность способа и зоны получения материала для цитологической диагностики ПВИ гениталий. При этом цитоморфологические признаки ПВИ (койлоцитоз, дискератоз, паракератоз, гиперкератоз) можно дополнить анализом тех же самых цитологических препаратов методом АСМ. Разработаны трехмерные модели структуры поверхности клеток с цитоморфологическими признаками ПВИ, которые позволяют сопоставлять исследуемые клетки с ними и выявлять клетки с вирусной патологией.

Апробация работы Результаты работ были представлены на следующих съездах и пленумах:

- 3-й съезд Клинических цитологов России (Самара, июнь 1999 г);

- Международная конференция «Microbicides», (Вашингтон, 13-16 марта 2000 г);

- 3-й Всероссийская научно-практическая конференция «Генодиагностика в современной медицине» отдела молекулярной биологии (г. Москва, 25 - 27 января 2000 г);

- Заседание Пленума Ассоциации клинических цитологов России (Москва, 2006 г.);

- Заседание Первой Всероссийской Школы-семинара «Современные достижения био-наноскопии» (Москва, МГУ, 11-17 июня 2007 г.);

- Заседание Пленума Центрального Исполнительного Совета Ассоциации Клинических цитологов России (г. Черноголовка, 6 -7 декабря 2008 г);

- Заседание Форума по нанотехнологии (Москва, 3-5 декабря 2008 г).

Основные положения, выносимые на защиту

1. Оптимизация и адаптация метода АСМ к исследованию поверхности клеток плоского эпителия в норме и при вирусной патологии.

2. Изучение и сопоставление топографических изменений клеток плоского эпителия в норме и при патологии.

3. Разработка трехмерных моделей структуры поверхностей клеток с цитоморфологи-ческими признаками ПВИ: койлоцит, дискератоцит, паракератоцит, безъядерная чешуйка — элемент гиперкератоза

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 17 работ, в том числе 7 статей в реферируемых российских научных журналах и тезисы докладов в сборниках российских и международных конференций, три из которых причисляются к списку ВАК.

Объем и структура диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, 3 глав собственных исследований, заключения и выводов. Список литературы включает в себя 117 отечественных и зарубежных источников. Диссертация изложена на 108 страницах машинописного текста, включая 14 таблиц и 64 рисунка.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Яковлева, Валерия Анатольевна

ВЫВОДЫ

1. При цитологическом исследовании соскобов с шейки матки выявлены клетки с морфологическими признаками ПВИ: койлоциты, дискератоциты, паракератоци-ты, элементы гиперкератоза. Осуществлена модификация способа получения материала, позволяющая обогатить его такими клетками.

2. Койлоцитоз отмечается чаще у ВПЧ-инфицированных пациенток с сочетан-ной патологией матки в 55,0% от общего числа исследуемых пациенток.

3. Выявлено, что койлоцитоз, в зависимости от онкогенности типов ВПЧ (данные ИТ TP), встречается достоверно чаще у пациенток с высокоонкогенными типами (44%) , чем с низкоонкогенными типами (27%) (п=191).

4. Впервые метод атомно-силовой микроскопии был применен и адаптирован к изучению структуры поверхности клеток плоского эпителия в норме и с папиллома-вирусной патологией.

6. При цитологическом исследовании были выявлены клетки плоскоклеточного рака с ороговением. Получены АСМ-изображения поверхности этих клеток, создана усреднённая модель структуры поверхности.

7. Показано, что сигнал гибридизации in situ на гистологических препаратах, свидетельствующий о наличии вирусной ДНК, отмечался как в клетках с морфологическими признаками ПВИ, так и без них. Последнее свидетельствует о том, что процесс патологических изменений в этих клетках находится в начальной стадии.

8. Установлено, что метод просвечивающей электронной микроскопии, как скрининговый при диагностике ПВИ, малоперспективен, так как вирионы, по которым определяют инфекцию, созревают на завершающей стадии дифференцировки клетки эпителия, в тот момент, когда начинается активная деструкция последней. Это приводит к потере материала, необходимого для анализа.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Мы показали в нашей работе, что при исследовании цитологическим методом мазков с шейки матки койлоцитоз отмечался в 34%, дискератоз в 4%, паракератоз в 1% и гиперкератоз в 4% случаев от общего количества исследуемых пациенток (п-191). Сравнивая наши данные с литературными, мы можем отметить, что по выявляемое™ койлоцитоза полученные результаты коррелируют с опубликованными [15, 95], в то время как по другим цитоморфологическим критериям ПВИ статистической информации мало опубликовано и поэтому ее трудно сопоставлять. При этом для того, чтобы получить адекватный мазок с выраженными признаками койлоцитоза, мы проводили забор материала с зоны стыка шейки матки и цервикального канала с использованием «жесткого» соскоба. Впервые нами это было отмечено в 1999 году и доложено на 3-м Всероссийском съезде Ассоциации Клинических цитологов России в Самаре. Позднее аналогичные результаты были опубликованы другими авторами [49, 59]. Характерным моментом, влияющим на выявление койлоцитов, является, как известно из литературы, тип ВПЧ.

Одни авторы утверждают, что койлоциты характерны для поражений с низким онкогенным типом ВПЧ [3], по результатам других авторов койлоцитоз чаще отмечался при высокоонкогенных типах ВПЧ [86]. Наши данные говорят о том, что особенно сильное влияние на этот процесс оказывает онкогенность конкретного типа ВПЧ. Для высокоонкогенных типов койлоциты выявлены в 44%, а для низкоонкоген-ных типов — 27% от общего количества обследованных пациенток. В целом, как показывают наши данные, койлоцитоз выявляется чаще пе только при высокой онкоген-ности, но и при сочетанной патологии матки.

Примененный нами метод атомно-силовой микроскопии к анализу поверхности с морфологическими признаками ПВИ позволил получить оригинальные результаты по структуре поверхности таких клеток и построить их трехмерные модели. Из литературы известно о применении атомно-силовой микроскопии к изучению клеток крови, кардиомиоцитов крыс [24, 29, 35, 46]. Однако нами впервые был применен этот метод к клеткам эпителиальной ткани с вирусной и раковой патологией. В результате этих исследований впервые появилась возможность сопоставить топографические изменения эпителиальной клетки с ее плоскостными изменениями, которые наблюдаются в цитологических препаратах. Развитие таких исследований дальше может повысить качество морфологической диагностики ПВИ и предрака шейки матки за счет дополнительной информации об исследуемом объекте.

Наши ультраструктурные исследования клеток плоского эпителия поверхностного и промежуточного слоев при вирусной патологии четко показали поэтапное появление околоядерного гало и значительную деформацию ядра. Нам не удалось выявить зрелые вирионы ВПЧ в таких искаженных ядрах, однако, в литературе есть единичные работы, авторы, которых наблюдали вирусоподобные частицы [84, 114]. На основании полученных нами результатов, а также анализа литературы, мы пришли к заключению, что скрининговая диагностика ПВИ, основанная на выявлении вирио-нов ВПЧ, с помощью ПЭМ, не может быть эффективной, так как зрелые вирионы появляются в клетке в момент её активной деструкции, что ведет к потере материала.

Полученные нами результаты показывают эффективность применения АСМ-метода при исследовании структуры поверхности эпителиальных клеток при вирусной и раковой патологии. В дальнейшем потребуется продолжение таких исследований, для того чтобы улучшить качество цитологической диагностики ПВИ за счет включения объемных характеристик патологически измененной клетки.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Яковлева, Валерия Анатольевна, Москва

1. Башмакова М.А. Папилломавирусная инфекция.// Н. Новгород, 2002, 5-8.

2. Башмакова М.А., Савичева A.M. Папилломавирусная инфекция//. Москва, 2004,15.

3. Бебнева Т.Н., Прилепская В.Н. Папилломавирусная инфекция и патология шейки матки.// http://old.consolium-medicum.cjm/media/gynecology/01 -ОЗ/77/shtml/ 2001.

4. Бойчук Н.В., Исламов P.P. и другие Гистология.//Москва, Геотар-Мед, 2001, 78102, 466-483.

5. Болотова JI.C., Туганова Т.Н., Воробьева Л.И. и др. Цитологический скрининг рака шейки матки// Киев, 2007, стр.65-75, 110-115.

6. Большакова А.В. Сканирующая зондовая микроскопия бактериальных клеток// bol-shakova@genebee.msu.ru. Сборник тезисов. Первая Всероссийская Школа-семинар, Москва, МГУ, 11-17 июня 2007, 7.

7. Боровик А.С., Тарасова А.С., Яминский И.В. Использование атомно-силовой микроскопии для изучения живых клеток. Успехи современной биологии//, 2000, Т. 120, 2,217-224.

8. Васильев М.М., Богатырева ИИ, Котова JI.K., Белавин А.С. Современные аспекты папилломавирусной инфекции урогенитального тракта (клиника, диагностика, лечение)// ЦНИКВИ МЗ РФ, Москва, 2454.g23@g23.relcom.ru. Сентябрь 2001.

9. Гуменюк Е.К., д.м.н., зав. кафедры акушерства и гинекологии Петербургского ГУ. Роль вируса папилломы человека в возникновении гинекологической и онкологической naTonorHH.//ttp://roddom.oncgo.ru/doc/lee.htm. 09.05.2005.

10. Дубровин Е.В., Яминский И.В., Дрыгин Ю.Ф. Использование атомно-силовой микроскопии для исследования вирусов.// dubrovin@polli.phys.msu.ru, 2007, 9.

11. Заварзин А.А., Харазова А.Д. Основы общей цитологии.// Ленинград, 1982, 37-54.

12. Исаакян В.А. Микроскопия вчера, сегодня, завтра. Материал для конференций.// Москва, 2001.

13. Калантаевская К.А. Морфология и физиология кожи человека.// Киев, Здоровья, 1972, 30-52.

14. Киселев В.И. Вирусы папилломы человека в развитии рака шейки матки.// Москва, 2004., 28-32.

15. Киселев Г.А. Микромеханические биосенсоры на основе атомно-силовой микро-cKonHH//.kiselev@biosensoracademy.com, 2007, 11.

16. Клинов Д.В. Зондовая микроскопия ДНК и ДНК-белковых комплексов klinov@ibch.ru, 2007, 12.

17. Кравченко А.Т. (редакция). Атлас морфологии вирусов//Москва, 1951, 47.

18. Краевский Н.А. и др. (редакция) Патолого-анатомическая диагностика опухолей человека.//Москва, Медицина, 1993, 198-259.

19. Краевский С.В., Волошин А., Дубровин Е.В. Изучение влияния бактериофагов на бактерии с помощью АСМ// skraevky@mail.ru, 2007, 29.

20. Кухаренко JI.B., Гелис Л.Г., Лазарева И.В. Визуализация процессов адгезии и агрегации тромбоцитов методами// АСМ. lvk@europe.com, 2007, 30.

21. Кухаренко JI.B., Циркунова Н. Г., Шман Т.В. Исследование поверхностной морфологии эритроцитов методами АСМ при остром лимфобластном лейкозе.// Natali813@yandex.ru, 2007, 60.

22. Лисицын Ф.В. Индикация ДНК вируса папилломы человека при кондиломатозе гениталий, папилломатозе гортани и мочевого пузыря, а также в опухолях этих органов// Диссертация, Москва, 2002, 42-45.

23. Мазуренко Н.Н. Роль вирусов папиллом в канцерогенезе шейки матки; Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва. // http://www.con-med.rU/media/onkology/0301/7.shtml

24. Маныкин А.А. Папилломавирусы. Медицинская вирусология. //Под ред. Д.К. Львова Москва, 2008, 269-276.

25. Маныкин А.А., Цилинский Я.Я., Ефимов А.Е., Лисицын Ф.В., Яковлева В.А. Изучение поверхности фибробластов человека методом атомной силовой микроскопии.// Новости клинической цитологии России, М., 2002, т.6, 3-4, 15-16.

26. Масюкова С.А., д.м.н., вед.науч.сотр. ЦНИКВИ. Инфекции, передаваемые половым путем// Фармацевтический вестник, май 2000, 17, 168,.

27. Матюхина Т.Г., Пантелей С.О., Кузнецова Т.А. Атомно-силовая микроскопия эритроцитарных мембран//БелСЗМ-6, Минск, 12-15 октября 2004, 97-101.

28. Мацко Н. Б. Исследование вирусов и антивирусных препаратов методами атомной силовой и просвечивающей электронной микроскопии.// Диссертация, Москва, 2001, 23-24, 47-50.

29. Меркулов Г.А. Курс патолого-гистологической техники//Ленинград, 1960, 5-20.

30. Михайлов А.Г., Демин В.В., Прохоров В.В. и др. Измерение персистентных длин молекул ДНК методами сканирующей зондовой микроскопии.// andrian@list.ru, 2007,39.

31. Молочков В.А., Киселев В.И, Рудых И.В Папилломавирусная инфекция, пособие для врачей.// Москва, 2005, 5-29.

32. Невзорова Т.А., Коновалова О.А., Городничева Е.С. Исследование взаимодействия ДНК-гидролизиругощих антител с нуклеиновыми кислотами методом атомно-силовой микроскопии// Tatyana.Nevzorova@ksu.ru, 2007, 42.

33. Никитина И.А., Стародубцева М.Н., Кузнецова Т.Г. Исследование атомно-силовой микроскопии для изучения структур поверхностных слоев лимфоцитов человека.// marysta@mail.ru, 2007, 54.

34. Павлович С.А. Основы вирусологии.//Минск 2001, 171-172.

35. Петрова А.С., Птохова М.П. Руководство по цитологической диагностике опухолей человека// Москва, Медицина, 1976 , 8-9, 126-134.

36. Петрова А.С. Цитологическая диагностика опухолей и предопухолевых процессов.//Москва, Медицина, 1985, 5-6, 158-165.

37. Петрова А.С., Полонская Н.Ю. Практическая клиническая цитология.// Москва, 1997, 5-15.

38. Петрова С.В., Райхлина Н.Т. Руководство по иммунно-гистохимической диагностике опухолей человека// Казань, 2000, 26-30.

39. Пирс Э. Гистохимия.//Москва, 1956, 5-437.

40. Прилепская В.Н., Козаченко В.П. Роль вирусной инфекции в возникновении рака шейки матки// Сборник статей, Москва, 2004, 103-125.

41. Прилепская И.Н., Кондриков Н.И., Бебнева Т.Н. Папилломавирусная инфекция.// http://forum.womantalk.ru/index.php. 2005.

42. Райчев Р., Андреев В. Злокачественные опухоли кожи.// София, Медицина и физкультура, 1965., 5-6.

43. Савватеев М.Н. Особенности исследования биологических макромолекул методом атомно-силовой микроскопии// mihail.savvateev@mail.ru, 2007, 47.

44. Саликова С.П., Стадников А.А., Никиян А.Н. Атомно-силовая микроскопия новая возможность в изучении кардиомиоцитов.//Вестник ОГУ, 1, 2003, 59-62.

45. Сальников А.С., Зайцев Б.Н., Рыжиков А.Б. Изучение взаимодействия вируса гриппа с аналогом клеточного рецептора белком фетуином с помощью атомно-силовой микроскопии.// sassalnicov@mailru, 2007, 49.

46. Саркисова Д.С., Перова Ю.Л. Микроскопическая техника, руководство.// Москва, 1996, 544.

47. Сахарова О.В., Нечушкин М.И. Роль вирусов папиллом человека в патогенезе шейки матки// http://images.nature.ru/pubd/2001/01/05/0001158683.

48. Сенчук АЛ., Дубоссарская З.М. Перинатальные инфекции// Москва, 2005, 159161.

49. Сопко Н.И., Максимова В.В. Современные представления о папиллломавирусной инфекции.// ttp://woman.health.ua.com/article\30.html/ 2006/

50. Союз педиаторов России. Злокачественные новообразования в России в 2006 году (заболеваемость и смертность.)// Москва, 2008, www.hpv-vaccine.ru.

52. Улумбекова Э.Г. Челышева Ю.А., Гистология.// 2001. 5-19, 40-44.

53. Цветкова Г.М., Мордовцева В.Н. Пато-морфологическая диагностика заболеваний кожи.// Москва, Медицина, 1986, 42-43, 262.

54. Ченцов Ю.С. Общая цитология// Москва, Издательство МГУ, 1995, 182-346.

55. Чиссов В.И. Давыдов М.И. Старинский В.В. Методология и организация скрининга рака шейки матки// Пособие для врачей, Москва, 2004, 3-29.

56. Шабалова И.П. Критерии диагностики заболеваний шейки матки.// Цитологический атлас, Москва, 2001, 69-73, 74-93.

57. Шабалова И.П., Касоян К.Т. Цитологическая диагностика заболеваний шейки матки.// Москва, Триада, 2006, 94-135.

58. Шапиро Н.А. Принципы цитологической диагностики злокачественных опухолей.//Москва, 2008, 168-170.

59. Шиллер-Волкова Н.Н., Никитина Н.И., Агамова К.А., Брин M.JI. Атлас Цитологическая диагностика злокачественных новообразований// Медицина, Москва, 1964., 9-16.

60. Яковлева В.А., Лисицын Ф.В., Маныкин А.А., Завалишина Л.Э. Анализ цитологических препаратов пациенток с различной патологией матки методом атомно-силовой микроскопии//. Новости клинической цитологии России, М., 2004, т.8, № 3-4, 70-71.

61. Яковлева В.А., Маныкин А.А. Эволюция цитоморфологического метода индикации вируса папилломы человека// Новости клинической цитологии России, 2005, т.9, №1-2,41-46.

62. Яковлева В.А., Маныкин А.А., Лисицын Ф.В., Конышева А.А. Возможности использования световой микроскопии в сочетании с атомно- силовой микроскопией для цитологической диагностики папилломавирусной инфекции// Медицина экстремальных проблем, 2008.

63. Яковлева В.А., Маныкин А.А., Лисицын Ф.В., Конышева Т.А. Использование атомно-силовой микроскопии для исследования цитоморфологических признаков папилломавирусной инфекции.// Вопросы вирусологии, 2009, №4.

64. Яковлева В.А., Маныкин А.А., Лисицын Ф.В., Гущина Е.А., Худицкая В.Н. Электронно-микроскопическое изучение клеток плоского эпителия шейки матки, пораженных папилломавирусной инфекцией, 2009, 1-2.

65. Яковлева В.А., СамсоноваЛ.В., КонышеваТ.А., Демкин В.В. Возможности цитологической диагностики папилломавирусной инфекции.// Новости клинической цитологии России, Том 3, №1-2/1999, 77.

66. Яминский И.В., Филонов А.С., Галлямов М.О. и др. Зондовая микроскопия: методы аппаратура и построение изображений. Сканирующая зондовая микроскопия биополимеров.//Москва, 1997 , Выпуск 1, 13-80.

67. Arakawa, М., Edanaga , М. and Tocunaga, J. The application of scanning electron microscopy to the histological diagnosis of renal biopsy specimens. In Scanning Electron Microscopy.// Chicago, IIT Research Institute, 1977, 171-178.

68. Boon Mathilde E.,Cecil H. Fox. Simultaneous Condyloma Acuminatum and Dysplasia of the Uterine Cervix// Acta Cytologica, 1981, v.25, n.4, 393-399.

69. M. Casas-Cordero and other. Origin of the Koilocyte in Condylomata of the Human Cervix.// Acta Cytologica, 1981, v. 25, 387-391.

70. Colin R. Laverty and other. The Significance of Noncondylomatous Wart Virus Infection of the Cervical Transformation Zone. A Review with Discussion of Two Illustrative Cases.//Acta Cytologica, 1978, v. 22, 195-201.

71. Cramer Hervey M., M.D., Skinner-Wannemuehler, B.S., C.T. (ASCP) and other. Cyto-morphologic Corrrelates of Human Papillomavirus Infection in the Normal Cervicovaginal Smear.//Acta Cytologica, 1999, V41, N.2, 261-268.

72. Saul Friedlander, M.D., New Method for Detecting Changes in the Surfaces of Human Exfoliated Cervical Cells with the Scanning Electron Microskope against Cervical Cance.r// Acta cytologyca, 1969, v 13, 288-281.

73. Georg Feichter, M.D., MIAC. Professor of Pathology, Specialist of Pathology. International Consensus Conference on the Figh. Obstetrics and Gynecology, Division of Gynecology.// Institute of Pathology ,Universitu Clinics, Basel, Swidzerland, 1999.

74. Grace T Mc Kee Ba, MB, B.S.Head of the Departament of Cytopathology Cytopatholo-gy Royal Surrey// County Hospital Coildhord, Surrey. 1997, Mosby-Wolfe.

75. Hills Ellen, B. Sc., Laverty Colin R, M.B., B.Sc., M.I.A.C. Electron Microscopic Detection of Papilloma Virus Particles in Selected Koilocytotic Cells in a Routine Cervical Smear.//Acta Cytologica, 1979, v.23, 53-56.

76. Howley P.M., Lowy D.R. Papillomaviruses and Their Replication.// Fied's Virology. 2001. Vol 2, Chapter 65. 2197-2228.

77. Howley P.M., Lowy D.R. Papillomaviruses.// Fied's Virology. 2001. Vol. 2, Chapter 66. 2229-2264.

78. Kaneshima S., M.D., F.I.A.C. An Application of Scanning Electron Microscopy to Cy-todiagnosis of Pleural and Peritoneal Fluids.// Acta Cytologica, 1978, v. 22, 490-499.

79. Kjaergaard J., M.D., Poulsen E.F., M.D. Scanning Electron Microscopy of Cotton Swab Smears From Ectocervix.// Acta Cytologica, 1977, v.21, p.68-71.

80. Dr. H.A.Kremer. Von der Displasie zum Carcinoma in situ. Referat 17.06.99 UFK Bo-chum.// http://www.zyto-labor.de/publicationen/hpv-informationen/hpv-rererat-bochum.html

81. Kusnetsov Y, Gershon P.D. and Mcpheterson A. Atomic Forse Microscopy Investigation of Vaccina Virus Structure Y.// Virol., August 1, 2008, 82(15), 7551.

82. Kuznetsov Yu.G., Malkin A.Y., Lucas R.W. Imaging of viruses by atomic forse microscopy.// Yurnal of General Virologi (2001), 82, 2025-2034. 2001. Society for General Microbiology.

83. Lai R, Laird S.A., Arnsdorf M.F. Heart gap junction preparation reveal hemiplaques by atomic forse microscopy.// J. Amer. Physiol. Society. 1995., Vol. 68, 967-977.

84. Landosch Milde K; Riethdorf S; Park TW Naturlicher Verlauf der HPV-Infektion. Nut-zen der HPV-Analitik in der Zervixdiagnostik.// Abt. Ginakopathogie, Universitetskranken-haus Eppendorf, Hamburg. Phatologe 1999 Jan; 20(1), 15-24.

85. Llanes A.T., M.D., Farre C.B., M.D. and other. Scanning Electron Microscopy of Normal Exfoliated Squamous Cervical Cells.// Acta Cytologyca, 1973, v.17, 507-509.

86. Letters to the Editors. Human Papilloma Virus Infection of the Uterine Cervix.// Acta Cytologica, 1980, v. 1980, 82-84.

87. Meisels A., Roy M. and other. Human Papillomavirus Infection of the Cervix.//Acta Cytologica, 1981, v. 25, n.l, 7-16.

88. Alexander Meisels, M.D., FIAC. Internacional Consensuns Conference on the Fight against Cervical Cancer.// Treasurer,International Academy of Cytology, Professor Emeritus of Pathology, Laval University, Quebec, Canada, 1999.

89. Meisels A., Morin C. Morpfology of lesions of the uterine cervix related tu human papillomavirus (HPV).//http://www.aixcyto.de/Literatur/literatur.html., 2001.

90. Maria Odete o. Carvalbo, Ricardo W. Almeida, and other. Detection of human papillomavirus DNA by the hybrid capture assay.// http:// www.scielo. Braz J Jnfekt Dis vol. 7 no 2. Salvador Apr. 2003.

91. Oliveira M.C., Andrade M. and other Aspectos Morfologicos que Sugerem a Presenca do Papilomavirus Humano (HPV) em Lesoes do Epitelio De Revestimento da Mucosa Oral.// http://www.patologiaoral.com.br/texto25.asp, 2004.

92. Acta Ralf M.Richart,Shahla Masood et al. Human papillomavirus.// Cytologica 1998, 42, 50-58.

93. Ann Roman and Kenneth H. Fife. Human Papillomaviruses: Are We Ready to Type?.// Clinical Microbiologi Reviews. Apr. 1989., p 166-190. 1893-8512/89/020166-25502.00/0. Copyright @ 1989, American Society for Microbiology.

94. C.A. Rubio, M.D., F.I.A.C., and I. Kranz . The Exfoliating Cervical Epithelial Surface in Dysplasia, Carcinoma in situ and Squamous Carcinoma. Scanning Electron Microscopic Study.//Acta Cytologica, 1976,v 20, 144-150.

95. Sanjeev G. Shroff, Donald R. Saner et al. Dinamic micromechanical properties of cu-tured rat atrial myocytes measured by atomic forse microscopy.// Am Physiol. Society.-1995. 269. Cell Physiol. 38, 286-329.

96. Steven N. Beker, M.D., Jick Y. Wong, M.S. and other. Skanning Electron Microskopi of Alcohol-Fixed Cytopatology Specimens.// Acta Cytologika, 1981, 578-584.

97. Takashi Okagaki, M.D., Ph.D., Barbara A. Clark and other. Koilocytosis in Displastic and Reactive Cervical Squamous Epithelium. An Ultrastructural Stud.// Acta Cytologica, 1978, v.22, 95-98.

98. Tarantul V., Kruglova A., Yakovleva V., Karlina V., Demkin V. Citological and PCR analysis of genital papilloma virus infection.// Microbicides 2000, Conference Abstracts, March 13-16, Hilton Alexandria Mark Center, Washington, DC, 2000, 30.

99. The Association of Reproductive Health Professionals. Management of the abnormal Pap.WUpdated on March 30, 2000.http://www.arhp.org/healthcarcproviders/onlinepublications/clinicalproceedings.108

100. The Medical University of South Carolina // Human papilloma Virus: Cytologic Features and Differential Diagnosis.W ttp://www.musc.edu/chp/cyto/downloads/humanpap.pdf, 1999.

Информация о работе

Яковлева, Валерия Анатольевна
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.06

Диссертация

Структура поверхности эпителиальных клеток шейки матки, инфицированных вирусом папилломы человека - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы