Молекулярные маркеры онкогенной активности вируса папилломы человека

Золотоверхая, Екатерина Андреевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярные маркеры онкогенной активности вируса папилломы человека
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярные маркеры онкогенной активности вируса папилломы человека"

На правах рукописи

ЗОЛОТОВЕРХАЯ Екатерина Андреевна

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МАРКЕРЫ ОНКОГЕННОЙ АКТИВНОСТИ ВИРУСА ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА

03.00.06 - вирусология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Я 0 д [1 р 2229

Санкт-Петербург 2009

003468203

Работа выполнена в Государственном учреждении Научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Савичева Алевтина Михайловна Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Жилинская Ирина Николаевна доктор биологических наук Мурина Елена Александровна

Ведущая организация:

ГОУ ВПО Российская Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова Министерства обороны РФ

Защита состоится « _2009 года в ^^ часов на

заседании специализированного диссертационного совета Д 001.043.01 при ГУ Научно-исследовательский институт гриппа РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. проф. Попова, 15/17.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Научно-исследовательского института гриппа РАМН.

Автореферат разослан _2009 года

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 001.043.01 л Г~~)

кандидат медицинских наук Суховецкая В.Ф.

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Установление этиологической роли онкогенных типов вируса папилломы человека (ВПЧ) в развитии рака шейки матки (РШМ) привело к появлению новых стратегий профилактики этого заболевания. К ним относятся разработка вакцин против онкогенных типов ВПЧ и включение теста на ВПЧ в скрининг. Полученные и накапливаемые в настоящее время данные позволяют рассматривать вакцинацию как вполне реальный путь борьбы с раком шейки матки. Именно поэтому профилактическая массовая вакцинация против ВПЧ высокого риска дает обоснованную надежду и может быть эффективной в борьбе с раком шейки матки в глобальном масштабе. Между тем, профилактическая вакцинация может не повлиять на заболеваемость цервикальным раком в поколении женщин, уже инфицированных ВПЧ и имеющих цитологические изменения, для которых единственным профилактическим мероприятием остается скрининг.

Раку шейки матки предшествуют цервикальные интраэпителиальные неоплазии, которые по степени тяжести принято разделять на легкую, умеренную и тяжелую дисплазии. В большинстве случаев легкой и умеренной дисплазии происходит их спонтанная регрессия, и только в 10-20% случаев заболевание прогрессирует до РШМ [Буфпеп К.!, 1997]. Многочисленные исследования продемонстрировали, что тест на ВПЧ обладает гораздо более высокой чувствительностью для выявления цервикальных интраэпительных неоплазий, чем традиционное цитологическое исследование [БаЫеш V., 2006]. Однако тест на ВПЧ имеет достаточно низкие показатели специфичности и прогностической значимости положительных результатов, так как у большинства женщин, особенно молодых, папилломавирусная инфекция (ПВИ) носит транзиторный характер.

По мнению экспертов, на сегодняшний день самым надежным прогностическим индикатором прогрессии заболевания является выявление у

женщины персистирующей ПВИ. Показано, что риск персистендии и последующей прогрессии выше в случаях ПВИ с более высокой вирусной нагрузкой ВПЧ [БаЫеш V., 2003]. Однако использование в клинической практике высокой вирусной нагрузки как фактора неопластической прогрессии в настоящее время остается проблематичным по ряду причин. Во-первых, зависимость степени дисплазии от вирусной нагрузки в достаточной мере описана только для ВПЧ 16 типа, а во-вторых, по причине отсутствия стандартизованной методологии определения количества вирусной ДНК нельзя установить пороговое значение, выше которого она может считаться клинически значимой.

Ключевым событием в злокачественной трансформации эпителиальных клеток считается интеграция вирусной ДНК в ДНК клетки-хозяина. Процесс интеграции сопровождается разрушением открытых рамок считывания генов вируса Е1 и Е2, продукты которых участвуют в регуляции экспрессии онкогенных белков вируса Е6 и Е7 [1еоп Б., 1995]. Считается, что следствием интеграции вирусной ДНК в ДНК хозяина является значительное повышение экспрессии белков Е6 и Е7, которые выводят из строя два ключевых белка (р53 и рШэ), регулирующих клеточный цикл.

Несмотря на то, что явление интеграции вирусной ДНК в геном хозяина активно изучается, имеющиеся данные не позволяют однозначно оценить его клиническое значение. Как правило, на ранних стадиях опухолевого процесса вирусная ДНК выявляется в эписомной форме, тогда как на поздних - в интегрированной [Юаев К., 1999]. Недавно был предложен высокочувствительный метод определения физического статуса ВПЧ 16 типа с применением ПЦР в реальном времени, с помощью которого интегрированная форма вируса была обнаружена на самых ранних стадиях заболевания, когда еще не было цитологических доказательств неопластических изменений [Ре^аго Р., 2002].

Многие авторы оценивают определение вирусной нагрузки и интегрированной формы вирусной ДНК ВПЧ как молекулярные маркеры

трансформирующей активности ВПЧ, однако, возможность их использования в клинической практике еще предстоит оценить.

Целью данного исследования является изучение вирусной нагрузки, персистенции ВПЧ и интеграции вирусной ДНК в геном клетки хозяина как индикаторов прогрессии цервикальных поражений.

Для достижения поставленной цели планировалось решить следующие задачи:

1. Разработать методику определения вирусной нагрузки ВПЧ 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45 и 56 типов на основе метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени

2. Разработать методику определения физического статуса ВПЧ 16 и 18 типов на основе метода ПЦР в реальном времени

3. Исследовать на наличие ДНК ВПЧ типов высокого онкогенного риска, взятые от пациенток с патологией шейки матки, и оценить распространенность онкогенных типов вируса в данной популяции, а также изучить ассоциацию выявления нескольких типов ВПЧ со степенью нсоплазии

4. Определить вирусную нагрузку в пробах, содержащих ВПЧ 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45 и 56 типов, и изучить ассоциацию вирусной нагрузки со степенью дисплазии эпителия цервикального канала

5. Определить статус вирусной ДНК в пробах, содержащих ВПЧ 16 и 18 типов, и исследовать связь между интеграцией вирусной ДНК в ДНК человека и степенью неопластических изменений

6. Оценить персистенцшо ВПЧ в эпителии цервикального канала как фактор неопластической прогрессии.

Научная новизна работы

- Разработана методология определения вирусной нагрузки ВПЧ 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45 и 56 типов, позволяющая определять концентрацию ДНК вируса, нормированную на количество клеток в клинической пробе.

- Разработана методология определения физического статуса ВПЧ 16 и 18 типов на основе метода количественной ПЦР в реальном времени.

- Показано, что при одновременном выявлении нескольких типов ВПЧ 16 тип существенно доминирует над остальными типами.

- Выявлено, что высокая вирусная нагрузка ВПЧ 16 типа ассоциирована с повышенным риском развития неоплазии.

- Установлена ассоциация степени интеграции ДНК вируса в ДНК человека со степенью неопластических изменений при инфицировании ВПЧ 16 и 18 типа.

- Показано, что персистенция ВПЧ, определяемая как выявление одного и того же типа вируса при повторных исследованиях с интервалом 6 месяцев, может применяться в качестве подхода, увеличивающего специфичность теста на ВПЧ в скрининге РШМ

Научно-практическая значимость работы

- Разработана методология определения концентрации ДНК ВПЧ 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45 и 56 типов, нормированная на количество клеток в клинической пробе, которая может быть использована для дальнейшего изучения связи вирусной нагрузки с прогрессией цервикальных неопластических изменений.

- Показано, что основными типами вируса папилломы человека, обнаруживаемыми при раке шейки матки, являются 16, 18, 31, 33 и 45 типы, что позволяет определить группу повышенного риска развития неопластических изменений.

- Показано, что определение вирусной нагрузки при инфицировании ВПЧ 16 типа может использоваться для оценки риска развития дисплазии.

- Разработана методология определения физического статуса ВПЧ 16 и 18 и показано, что степень интеграции вирусной ДНК в ДНК клетки хозяина может быть использована в качестве одного из маркеров развития цервикальных интраэпителиальных неоплазий при инфицировании ВПЧ 16 и 18 типа.

- В качестве подхода, увеличивающего специфичность теста на ВПЧ в скрининге РШМ, предложено использовать персистенцию ВПЧ, определяемую

как выявление одного и того же типа вируса при повторных исследованиях с интервалом 6 месяцев.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. В популяции женщин с патологией шейки матки 16 тип ВПЧ существенно доминирует над остальными типами, а основными типами, обнаруживаемыми при раке шейки матки, являются 16, 18, 31, 33 и 45 типы.

2. Высокая вирусная нагрузка ВПЧ 16 типа может использоваться в качестве прогностического маркера, хотя низкая нагрузка не исключает прогрессию заболевания. Для остальных типов зависимости тяжести поражений от вирусной нагрузки не установлено.

3. Определение физического статуса вирусной ДНК может использоваться как один из критериев прогноза прогрессии заболевания.

4. Персистенция ВПЧ, определяемая как выявление одного и того же типа ВПЧ при повторных исследованиях с интервалом 6 месяцев, может применяться в качестве подхода, увеличивающего специфичность теста на ВПЧ в скрининге РШМ.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 14 работ.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на 5-ой Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (Москва, 2004), Международной конференции, посвященной 80-летию лаборатории микробиологии ГУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН «Репродуктивно значимые инфекции: Европейские стандарты диагностики, терапии и профилактики» (Санкт-Петербург, 2006), Всероссийской научной конференции «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний» (Санкт-Петербург, 2008), Международной научно-практической конференции «Профилактика рака шейки матки: взгляд в будущее» (Москва, 2008).

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (материалы и методы исследования и результаты), обсуждения результатов, выводов и практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 14 таблицами и 15 рисунками; библиографический указатель включает 169 публикаций.

Работа поддержана грантом Санкт-Петербурга в сфере научной и научно-технической деятельности № 50/06 от 26 мая 2006 года.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и основные методы исследования

Схема исследования: Данное исследование было проведено в два этапа. Первый этап включал разработку методологии определения вирусной нагрузки ВПЧ 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45 и 56 типов и определения физического статуса ВПЧ 16 и 18 типов на основе метода количественной ПЦР в реальном времени. Данный этап проводился в сотрудничестве с коллегами из научно-производственной лаборатории по разработке и производству препаратов для диагностики инфекционных заболеваний человека и животных ЦНИИ Эпидемиологии, Москва (руководитель к.б.н. Г.А. Шипулин). Второй этап заключался в изучении вирусной нагрузки, персистенции ВПЧ и интеграции вирусной ДНК в геном клетки хозяина как индикаторов прогрессии цервикальных поражений.

В исследование были включены небеременные пациентки (ГУ НИИАГ им. Д.О. Отта РАМН и ФГУ НИИ онкологии им. H.H. Петрова Росмедтехнологии) в возрасте от 18 до 65 лет, у которых была выявлена ДНК ВПЧ высокого онкогенного риска - всего 412 пациенток. По данным цитологического исследования, все пациентки были разделены на 4 группы. Численность группы с цитологической нормой составила 157 человек (группа I), LSIL - 53 человека (группа II), HSIL - 110 человек (группа III). Группу с диагнозом рака шейки матки составили 92 пациентки (группа IV). Пациентки с

положительным тестом на наличие ДНК ВПЧ онкогенных типов, у которых при цитологическом исследовании не было обнаружено явлений дисплазии эпителия цервикального канала или была обнаружена легкая степень дисплазии, были приглашены на повторное обследование через 6 месяцев (57 пациенток).

Клиническим материалом для исследования служили соскобы эпителия цервикального канала, которые собирали дакроновыми щеточками в пробирки Эппендорф объемом 1,5 мл, содержащие 300 мкл транспортной среды (ЦНИИ эпидемиологии, Москва).

Цитологические исследования соскобов эпителия цервикального канала проводились в лабораториях патоморфологии НИИАГ (зав. лаб. профессор Кветной И.М.) и НИИ онкологии им. H.H. Петрова Росмедтехнологии (зав. лаб. профессор Мацко Д.Е.). Препарат окрашивали по Папаниколау согласно стандартной методике. Для представления результатов цитологического исследования была использована терминологическая система Бетесда [Solomon D., 2002; WHO, 2006].

Выделение нуклеиновых кислот из клинических проб проводили с применением тест-системы NucliSens® Isolation Reagents (BioMerieux, Netherlands), основанной на методе R. Boom и соавт. [Boom R„ 1990], в соответствии с инструкцией производителя.

Для выявления и дифференциации ДНК вирусов папилломы человека высокого канцерогенного риска (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 52, 56, 58, 59, 66) в соскобах эпителия цервикального канала использовали тест-системы «АмплиСенс ВПЧ ВКР генотип» (ЦНИИ Эпидемиологии, Москва).

Приготовление компетентных клеток Escherichia coli штамм JM107 и трансформацию их плазмидой, содержащей геном ВПЧ, проводили в соответствии с методикой, описанной Inoue H. [Inoue H., 1990]. Для количественного анализа ДНК ВПЧ использовали следующие клоны ВПЧ: ВПЧ 16, 18 и 45 типов (любезно предоставлены доктором Е.М. de Villiers, Германия), 31, 35 и 56 типов (любезно предоставлены доктором A. Lorincz, США), 33 и 39

типов (любезно предоставлены доктором G. Orth, Франция). Для определения количества клеток в пробе использовали разведения рекомбинантной ДНК, содержащей фрагмент гена Р-глобина человека (любезно предоставлен старшим научным сотрудником ФГУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора О.Ю. Шипулиной, Россия).

Для выделения плазмидной ДНК использовали методику, предложенную Lee S.Y. и соавт. [Lee S.Y., 1998]. Концентрацию ДНК измеряли на спектрофотометре Smart Spec 3000 (Bio-Rad, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ Разработка методологии определения вирусной нагрузки и физического статуса ВПЧ

На первом этапе исследования нами была разработана методика определения вирусной нагрузки ВПЧ 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45 и 56 типов, нормированной на 105 клеток человека, а также алгоритм определения физического статуса ДНК ВПЧ 16 и 18 типов по соотношению числа копий генов вируса Е2 и Е7. Для определения вирусной нагрузки ВПЧ методом ПЦР в реальном времени требуется построение стандартных кривых количественных стандартов ДНК ВПЧ, а также стандартной кривой для количественного определения Р-глобинового гена человека. С целью намножения плазмид, содержащих полноразмерные геномы ВПЧ 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45 и 56 типов, и использования плазмидной ДНК в качестве количественных стандартов для ПЦР в реальном времени была проведена трансформация компетентных клеток Escherichia coli плазмидами с последующим выделением плазмидной ДНК из чистой культуры Escherichia coli и определением концентрации полученной ДНК. Данные методические разработки легли в основу следующего этапа нашей работы - оценке молекулярных маркеров ВПЧ в ранней диагностике цервикальных неоплазий.

Частота встречаемости онкогенных типов вируса папилломы человека при патологии шейки матки

ВПЧ 16 типа был обнаружен у 236 пациенток (57%). Остальные типы распределились по распространенности следующим образом: 31 (24%), 33 (24%), 56 (18%), 52 (14%), 45 (12%), 18 (10%), 58 (7%), 39 (5%), 35 (4%), 59 (3%) (рис.1).

70% 1

60%--

50% 40% 30% 20% 10% 0%

Рис. 1. Частота выявления ВПЧ онкогенных типов у женщин с патологией

шейки матки

Результаты определения типов ВПЧ высокого онкогенного риска у пациенток с различной степенью тяжести цервикальных поражений представлены в таблице 1. Для анализа ассоциации частоты встречаемости с тяжестью заболевания использовали критерий со степенью свободы к=3. Частота встречаемости 16 типа ВПЧ была ассоциирована со стадией заболевания (р<0,001): при цитологической норме она составила 40% (63 случая из 157), при LSIL - 62% (33 случая из 53), при HSIL - 70% (77 случаев из 1 10), при плоскоклеточной карциноме - 68% (63 случая из 92). Частота встречаемости ВПЧ 33 типа также значимо возрастала с ростом тяжести заболевания (р=0,0183). Частота встречаемости ВПЧ 39 типа, наоборот, значимо убывала с ростом тяжести заболевания (р=0,0291). Для остальных типов ВПЧ не было отмечено значимого изменения частоты встречаемости.

Таблица 1

Частота выявления онкогенных типов ВПЧ в группах с различной тяжестью цервикальных поражений Норма ШЬ ШЕ РШМ

Уровень

Тип (п=157) (п=53) (п=110) (п=92)

значимости

I группа II группа III группа IV группа

ВПЧ Кол-во % Кол-во % Кол-во % Кол-во %

16 63 40 33 62 77 70 63 68 <0,001

18 15 10 7 13 6 5 14 15 0,1201

31 33 21 11 21 32 29 23 25 0,4433

33 26 17 10 19 32 29 29 32 0,0183

35 6 4 0 0 9 8 2 2 0,0508

39 14 9 4 8 2 2 2 2 0,0291

45 22 14 2 4 11 10 15 16 0,1133

52 21 13 12 23 16 15 10 11 0,2611

56 30 19 10 19 19 17 17 18 0,9848

58 14 9 3 6 6 5 5 5 0,6138

59 7 4 2 4 2 2 1 1 0,3891

Таким образом, частота выявления 16 и 33 типов ВПЧ существенно увеличивается с увеличением степени дисплазии эпителия шейки матки, при этом частота выявления 39 типа существенно уменьшается. У 50% пациенток (207 из 412) было обнаружено два и более типа ВПЧ. Инфицирование несколькими типами ВПЧ не было ассоциировано с тяжестью цервикальных поражений (%2=2, к=3, р=0,57): если в группе пациенток без атипии частота одновременного выявления нескольких типов вирусов составила 43% (67 из 157), то в группах пациенток с ЬБШ, Ш1Ь и раком она равнялась 53% (28 из 53), 56% (62 из 110) и 54% (50 из 92), соответственно.

Оценка вирусной нагрузки у женщин с патологией шейки матки

Для оценки значения определения количества вируса мы определяли вирусную нагрузку для каждого типа ВПЧ в группах женщин с разной степенью патологии шейки матки.

На рисунке 2 представлены показатели вирусной нагрузки для различных типов ВПЧ.

100% 80% 60% 40% 20% 0%

Рис. 2. Показатели вирусной нагрузки ВПЧ 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45 и 56

типов

Очевидно, что распределение числа копий ДНК ВПЧ имеет ассиметричный вид, поэтому для описания данных вирусной нагрузки использовалось понятие медианы. Медиана числа копий ДНК ВПЧ 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45 и 56 представлена в таблице 2. Для анализа зависимости медианы количества ДНК ВПЧ от тяжести заболевания использовали критерий Джонкхиера 1 с уровнем значимости р и степенью свободы к. Медиана количества копий ДНК ВПЧ 16 типа возрастала с увеличением степени дисплазии (1=6, р=0,0204, к=4,4): если в случаях цитологической нормы она составляла 1,1x105 копий вирусной ДНК, то у пациентов с ЦЗЕЬ - 2,8x105, а у пациенток с Н81Ь и раком - 1,2x10б и 4,7x10б, соответственно. Для остальных типов зависимости тяжести поражений от вирусной нагрузки не установлено.

Распределение числа копий

— 1 —

...........I 1 1

16 18 31 33 35 39 45 56

■ <100 в 100-10000 □ 10000-1000000 □ >1000000

Таблица 2

Медиана числа копий ДНК ВПЧ 16, 18, 31, 33, 35, 39,45 и 56 типов в группах с различной тяжестью цервикальных поражений

Норма LS IL HSIL РШМ

Тип ВПЧ (п=157) (n=53) (п=110) (п=92)

I группа II группа III группа IV группа

16 1,1 х 105 2,8xl05 1,2x10Ö 4,7x10°

18 5,4x104 1,8х105 2,4x104 7,3x104

31 1,5х104 1,7x103 1,2x103 1,5х102

33 1,3х104 3,2x102 1,8x103 3,4x102

35 2,6x104 - 1,9x104 5,0x106

39 8,7x103 6,5x105 5,5x103 1,1x10'

45 7,7x103 4,0x102 9,8x10' 2,5x104

56 5,4x102 7,4x103 I, I хI О2 4,1x10'

Анализ распространенности типов ВПЧ по превалирующему типу (типу -представленному в большем количестве) в случаях одновременного выявления нескольких типов ВПЧ показал, что 16 тип существенно доминирует над остальными типами, а основными типами, обнаруживаемыми при раке шейки матки, являются 16, 18, 31, 33 и 45 типы - вместе они отвечают за 98% случаев рака шейки матки (табл. 3).

Таблица 3

Распространенность онкогенных типов ВПЧ по превалирующему типу

Норма LS IL HSIL РШМ Тип (п=157) (п=53) (п=110) (п=92) I группа_II группа_III группа_IV группа

ВПЧ Кол-во % Кол-во % Кол-во % Кол-во %

16 58 37% 30 57% 70 64% 57 62%

18 12 8% 4 8% 1 1% 10 11%

31 20 13% 2 4% 15 14% 9 10%

33 15 10% 5 9% 12 11% 8 9%

35 4 3% 0 0% 5 5% 1 1%

39 8 5% 3 6% 0 0% 0 0%

45 11 7% 0 0% 3 3% 6 7%

56 29 18% 9 17% 4 4% 1 1%

Статус ДНК вируса папилломы человека при различных стадиях заболевания шейки матки

Физический статус ДНК ВПЧ был определен для 16 и 18 типов. ВПЧ 16 типа был обнаружен в 236 пробах: 63 пробы были получены от пациенток без атипии, 33 - от пациенток с ЬБГЬ, 77 - от пациенток с Н81Ь, 63 - от пациенток с РШМ. Результаты определения статуса ДНК ВПЧ 16 типа в клинических пробах представлены в таблице 4.

Таблица 4

Статус ДНК ВПЧ 16 типа в клинических пробах во всех случаях

инфицирования 16 типом

Количество проб

Е2/Е7 Статус Норма Ш1Ь РШМ

ДНК* (п=63) (п=33) (п=77) (п=63)

I группа II группа II группа IV группа

1 Э 27 5 13 11

0,9 Э 10 7 9 6

0,8 Э+И 9 11 13 6

0,7 Э+И 6 3 8 2

0,6 Э+И 7 2 7 8

0,5 Э+И 1 0 4 3

0,4 Э+И 2 1 8 4

0,3 Э+И 1 2 6 4

0,2 Э+И 0 1 2 3

0,1 И 0 1 1 2

0 И 0 0 6 14

*Э - эписомная форма ДНК; Э+И - сочетание эписомной и интегрированной формы ДНК; И - интегрированная форма ДНК

У женщин с цитологической нормой эписомную форму ДНК вируса 16 типа выявили в 37 случаях из 63 (59%), смешанную - в 26 (41%). В пробах, полученных от женщин с цитологической нормой, интегрированная форма вируса не встречалась. В случаях легкой дисплазии эписомная форма ДНК была обнаружена в 12 пробах из 33 (36%), смешанная - в 20 (61%), интегрированная в 1 (3%). При умеренной и тяжелой дисплазии эписомная форма ВПЧ была обнаружена в 22 случаях из 77 (29%), смешанная - в 48 (62%),

и в 7 пробах (9%) была выявлена интегрированная форма ДНК. У женщин с РШМ эписомная форма вируса была выявлена в 17 случаях из 63 (27%), смешанная - в 30 (48%), интегрированная - в 16 (25%) (рис. 3).

100% -

норма 151 НЭП РШМ

Рис. 4. Статус ДНК ВПЧ 16 типа во всех случаях инфицирования 16 типом. И - интегрированная форма ДНК, Э+И - сочетание эписомной и интегрированной форм ДНК, Э - эписомная форма ДНК

При анализе зависимости коэффициента интеграции ДНК ВПЧ 16 типа, определяемой отношением количества копий гена Е2 к количеству копий гена Е7, от степени дисплазии с использованием критерия Джонкхиера (I) было показано значимое уменьшение коэффициента интеграции с увеличением степени дисплазии (р<0,001), т.е. степень интеграции увеличивается с ростом тяжести заболевания. При этом приближенный критерий Данна показал, что различия между группами с нормальной цитологией и ЬБЕЬ, НБГЬ, РШМ, значимы (р=0,05). Таким образом, физический статус ДНК ВПЧ 16 типа может использоваться как маркер неопластической прогрессии.

Степень интеграции ВПЧ 18 типа была определена для 42 проб. Результаты анализа степени интеграции 18 типа представлены в таблице 5. При цитологической норме в 11 (73%) из 15 проб ДНК ВПЧ 18 типа была выявлена

в эписомной форме, в трех (20%) - в смешанной и в одном случае (7%)- в интегрированной форме.

В трех (43%) из 7 случаев легкой дисплазии ВПЧ 18 типа был обнаружен в эписомной форме, в 4 (57%) - в смешанной. В пробах, полученных от женщин с легкой степенью дисплазии, интегрированная форма вируса не встречалась. При умеренной и тяжелой дисплазии эписомная форма ВПЧ была обнаружена в двух случаях (33%) из 6, смешанная - в трех (50%), и в одной пробе (17%) была выявлена интегрированная форма ДНК. У женщин с РШМ интегрированная форма вирусной ДНК была выявлена в 7 случаях (50%) из 14, в 4 (29%) - смешанная и в трех (21 %) - эписомная (рис. 4).

Таблица 5

Статус ДНК ВПЧ 18 типа в клинических пробах во всех случаях инфицирования 18 типом

Количество проб

Е2/Е7 Статус Норма НБИ РШМ

ДНК* (п=15) (п=7) (п=6) (п= 14)

I группа II группа III группа IV группа

1 Э 9 2 1 2

0,9 э 2 1 1 1

0,8 Э+И 3 4 2 1

0,7 Э+И 0 0 0 0

0,6 Э+И 0 0 1 0

0,5 Э+И 0 0 0 0

0,4 Э+И 0 0 0 1

0,3 Э+И 0 0 0 1

0,2 Э+И 0 0 0 1

0,1 и 0 0 0 0

0 и 1 0 1 7

*Э - эписомная форма ДНК; Э+И - сочетание эписомной и интегрированной формы ДНК; И - интегрированная форма ДНК

Рис. 4. Статус ДНК ВПЧ 18 типа во всех случаях инфицирования 18 типом. И - интегрированная форма ДНК, Э+И - сочетание эписомной и интегрированной форм ДНК, Э - эписомная форма ДНК

При анализе физического статуса ДНК ВПЧ 18 типа было показано значимое уменьшение коэффициента интеграции с увеличением степени дисплазии (р<0,001), т.е. степень интеграции увеличивается с ростом тяжести заболевания.

Типоспецифическая персистенция ВПЧ

Для выявления персистенции ПВИ проанализировали результаты исследований на ВПЧ у 57 пациенток, от которых были получены соскобы эпителия цервикального канала через 6 месяцев после первого визита. Из исследования были исключены пациентки, которым в ходе исследования было проведено лечение по поводу цервикальной интраэпителиальной дисплазии. Персистенцию ВПЧ высокого риска определяли по нахождению одного и того же типа (типов) ВПЧ в цервикальных образцах через 6 месяцев. Персистенция ДНК ВПЧ высокого онкогенного риска была выявлена у 25 из 57 (44%) пациенток. ВПЧ 16 типа персистировал у 17 из 30 (57%) пациенток, ВПЧ 18 - у двух из 7 (29%), ВПЧ 31 - у 5 из 12 (42%), ВПЧ 33 - у 4 из 7 (57%), ВПЧ 35 - у

двух из 2 (100%), ВПЧ 45 - у трех из 5 (60%), ВПЧ 52 - у трех из 8 (38%), ВПЧ 56 - у одной из 10 (10%). Также мы не обнаружили случаев персистенции ВПЧ 39, 58, 59 типов, что может быть объяснено, однако, небольшим размером выборки.

У 9 из 25 (36%) пациенток с персистирующей папилломавирусной инфекцией наблюдалась прогрессия неопластических изменений инфицированного эпителия. В 5 случаях заболевание прогрессировало от цитологической нормы до ЬБ1Ь: в 4 случаях в нескольких последовательных образцах выявляли ВПЧ 16 типа, в одном - ВПЧ 16 и 45 типов. В двух случаях заболевание прогрессировало от ЬБВЬ до НБШ: в нескольких последовательных образцах выявляли ВПЧ 16 типа. В двух образцах одной пациентки, взятых с интервалом в 9 месяцев, был выявлен ВПЧ 35 и 45 типов: в данном случае заболевание прогрессировало от цитологической нормы до Ш1Ь. В одном случае заболевание в течение двух лет прогрессировало с ЬБ1Ь до РШМ, во всех пробах от этой пациентки был выявлен ВПЧ 16 типа.

В случае цитологической нормы при наличии ВПЧ транзиторная инфекция наблюдалась у 32 пациенток из 50 (64%). Персистирующая ПВИ наблюдалась в 12 случаях из 50 (24%), а прогрессия заболевания - в 6 из 50 (12%).

Показатели элиминации вируса, персистенции и прогрессии заболевания при обнаружении ЬБП. составили 0% (0 из 6), 83% (5 из 6) и 17% (1 из 6), соответственно.

Ни в одном из случаев транзиторной ВПЧ инфекции развитие цервикальной неоплазии не наблюдалось.

Для оценки степени интеграции ДНК ВПЧ 16 типа как прогностического фактора развития цервикальных дисплазий мы проанализировали связь физического статуса ДНК ВПЧ 16 типа и развития заболевания. Течение ПВИ 16 типа наблюдалось у 30 пациенток. У 13 из них произошла элиминация вируса, у 10 была отмечена персистенция вируса, прогрессия заболевания отмечена у 7 пациенток. Поскольку распределение коэффициента интеграции в

группах ассиметричны, для описания числовых характеристик коэффициента интеграции использовали медиану и квартили (рис. 5).

1,1 1,0 0,9

Ь 0,8

й ш

з" го о.

ш 0,6 X

£ 0,5

I- 0,4 о

* 0,3

0,2 0,1 0,0

Прогрессия Элиминация

Персистенция

□ Медиана О 25%-75% ~Т~ Диапазон

Рис. 5. Статус ДНК ВПЧ 16 типа при прогрессии заболевания, персистенции и

элиминации вируса

В группе с прогрессией заболевания медиана коэффициента интеграции составила - 0,7, а квартили - [0,3; 1], в группе с персистенцией вируса - 0,8 [0,8; 1], а в группе с элиминацией вируса - 1 [0,9; 1]. Для сравнения коэффициента интеграции в группах с прогрессией заболевания, персистенцией и элиминацией вируса использовали критерий Джонкхиера (I), который не показал значимого нарастания коэффициента интеграции, что может быть связано с малым размером выборки. Однако при сравнении групп пациенток с прогрессией заболевания и с элиминацией вируса с помощью критерия Джонкхиера 0=68,5) были показаны значимые различия степени интеграции в группах (р=0,0341), то есть при прогрессии заболевания степень интеграции

ВПЧ 16 типа значимо превышает степень интеграции ВПЧ 16 типа при элиминации вируса. Интересно отметить, что коэффициент интеграции меньший 0,6 встречался только в группе с прогрессирующим заболеванием.

Течение ПВИ 18 типа наблюдалось у 7 пациенток. У 5 из 7 произошла элиминация вируса, а у двух была отмечена псрсистенция вируса, однако прогрессии заболевания отмечено не было, поэтому при анализе связи физического статуса ВПЧ 18 типа с развитием заболевания рассматривали только группы с персистенцией инфекции и с элиминацией вируса (рис. 6). В группе с персистенцией инфекции медиана коэффициента интеграции составила - 0,4, а квартили - [0; 0,8], в группе с элиминацией вируса - 1 [0,8; 1].

1,1

1,0

0,9

ш 0,8 ?3 ш

1 0,7

(О О.

а> 0,6

I 0,5

0 £

1 0,4

•8-о

£ 0,3 0,2 0,1 0,0

Персистенция Элиминация

Д Медиана I I 25%-75% С Диапазон

Рис. 6. Статус ДНК ВПЧ 18 типа при персистенции и элиминации вируса

Анализ физического статуса для ВПЧ 16 и 18 типа в группах пациенток с различными стадиями цервикальной дисплазии показал значимое увеличение степени интеграции с увеличением степени дисплазии. А анализ связи физического статуса ДНК ВПЧ 16 и 18 типов и течения ПВИ показали

значимое увеличение степени интеграции при прогрессии и персистенции заболевания по сравнению с элиминацией вируса. Таким образом, высокая степень интеграции ДНК ВПЧ 16 и 18 типа может служить прогностическим фактором развития заболевания.

ВЫВОДЫ

1. Разработана методология определения концентрации ДНК ВПЧ 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45 и 56 типов, нормированная на количество клеток в клинической пробе.

2. Разработана методология определения физического статуса ВПЧ 16 и 18 типов.

3. Анализ распространенности типов ВПЧ по превалирующему типу в - случаях множественной ВПЧ инфекции показал, что 16 тип существенно

доминирует над остальными типами, а основными типами, обнаруживаемыми при раке шейки матки, являются 16 (62%), 18 (11%), 31 (10%), 33 (9%) и 45 (7%) типы.

4. Показано, что определение вирусной нагрузки при инфицировании ВПЧ 16 типа может использоваться для оценки риска развития дисплазии эпителий цервикального канала шейки матки (р<0,001).

5. Установлена ассоциация степени интеграции ДНК вируса в ДНК человека со степенью неопластических изменений при инфицировании ВПЧ 16 и 18 типа (р<0,001). Высокая степень интеграции ДНК ВПЧ 16 и 18 типа может служить прогностическим фактором развития заболевания

6. Показано, что персистенция ВПЧ, определяемая как выявление одного и того же типа ВПЧ при повторных исследованиях с интервалом 6 месяцев, может использоваться в качестве подхода, повышающего специфичность тсста на ВПЧ в скрининге РШМ.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Разработанная методология определения концентрации ДНК ВПЧ 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45 и 56 типов, нормированная на количество клеток в

клинической пробе, может быть использована для дальнейшего изучения связи вирусной нагрузки с прогрессией цервикальных неопластических изменений.

2. При выявлении ВПЧ 16 типа предлагается использовать определение вирусной нагрузки для оценки риска развития дисплазии.

3. В качестве одного из маркеров развития цервикальных интраэпителиальных неоплазий при инфицировании ВПЧ 16 и 18 типа может быть использована степень интеграции вирусной ДНК в ДНК клетки хозяина с применением разработанной нами методологии.

4. В качестве подхода, увеличивающего специфичность теста на ВПЧ в скрининге РШМ, рекомендуется оценивать персистенцию ВПЧ, определяемую как выявление одного и того же типа вируса при повторных исследованиях с интервалом 6 месяцев.

5. Основными типами вируса папилломы человека, обнаруживаемыми при раке шейки матки являются 16, 18, 31, 33 и 45 типы, что позволяет определить группу повышенного риска развития неопластических изменений.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Определение вирусной нагрузки и статуса ДНК вируса папилломы человека 16 типа методом ПЦР в реальном времени // Журнал акушерства и женских болезней,- 2004.-T.LIII, № 4,-С.26-32. (соавт. Шипицына Е.В., Бабкина К.А., Савичева A.M., Микая H.A., Орлова О.О., Юркова И.К.)

2. Папилломавирусная инфекция: факторы риска цервикальной неопластической прогрессии // Журнал акушерства и женских болезней,- 2004,-T.LIII, №3, -С.34-45. (соавт. Шипицына Е.В., Бабкина К.А., Савичева A.M.)

3. Факторы риска развития рака шейки матки: интеграция ДНК вируса папилломы человека в ДНК клетки // Патология шейки матки. Генитальные инфекции.-2005, №1,-С.54-59. (соавт. Шипицына Е.В., Микая H.A., Юркова И.К., Орлова О.О., Чхартишвили М.Г., Селимян Н.К., Ширшова Н.Ю., Бабкина К.А., Савичева A.M.)

4. Маркеры папилломавирусной инфекции в скрининге рака шейки матки // Журнал акушерства и женских болезней,- 2008.-T.LVII, №4, -С.31-39. (соавт. Шипицына Е.В., Юшманова Е.С.., Савичева A.M.)

5. Применение метода ПЦР в реальном времени для определения вирусной нагрузки и статуса ДНК вируса папилломы человека 16 типа // Сборник трудов 5-ой Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней».-М„ 2004.-Т. 1,-С.341-343. (соавт. Шипицына Е.В., Микая Н.А., Савичева A.M.)

6. Papillomaviral infection and pathology of the cervix // Book of Abstracts of the 1st Euro-Asian Congress "The Events of the Year in Gynecology and Obstetrics".-SPb., 2004.-P.46-47. (соавт. Shipitsyna E.V., Savicheva A.M., Yurkova I.K., Mikaya N.A.)

7. Выявление интегрированной формы вируса папилломы человека 16 типа методом полимеразной цепной реакции в реальном времени // Тезисы Российской научно-практической конференции «Санкт-Петербургские дерматологические чтения».-СПб, 2005,-С.91. (Шипицына Е.В., Савичева A.M.)

8. Интеграция ДНК вируса папилломы человека как фактор неопластической прогрессии // Материалы международной конференции «Репродуктивно значимые инфекции: Европейские стандарты диагностики, терапии и профилактики», посвященной 80-летию лаборатории микробиологии ГУ НИИАГ им. Д.О. Отта РАМН/ Журнал акушерства и женских болезней.- 2006.-T.LV, специальный выпуск,-С.35-36. (соавт. Савичева A.M., Шипицына Е.В.)

9. Значение папилломавирусной инфекции в возникновении заболеваний шейки матки // Материалы международной конференции «Репродуктивно значимые инфекции: Европейские стандарты диагностики, терапии и профилактики», посвященной 80-летию лаборатории микробиологии ГУ НИИАГ им. Д.О. Отта РАМН / Журнал акушерства и женских болезней,- 2006,-T.LV, специальный выпуск,-С.88. (соавт. Юшманова Е.С., Веснина Е.Л., Шипицына Е.В., Савичева A.M.)

10. Type-specific persistence of high-risk human papillomavirus DNA as a factor of cervical neoplastic progression // Abstracts of the 6lh International Multidisciplinary Congress "Eurogen".-Paris, 2006.-P.137. (соавт Shipitsyna E„ Yushmanova E„ Savicheva A.)

11. Роль вирусологических факторов в развитии рака шейки матки у женщин репродуктивного возраста // Тезисы докладов 3-го международного научного конгресса «Новые технологии в акушерстве и гинекологии», посвященного 210-летию НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН, Журнал акушерства и женских болезней.-2007. T.LVII, специальный выпуск,-С.153-154. (соавт. Евстигнеева Л.А., Бахидзе Е.В., Семиглазов В.В., Шипицына Е.В.)

12. Маркеры папилломавирусной инфекции в скрининге рака шейки матки // Тезисы докладов 6-й Всероссийской научно-практической конференции «Молекулярная диагностика-2007»,-М. 2007.-T.III. С. 91-93 (соавт. Шипицына Е.В., Юшманова Е.С., Савичева А.М.)

13. Распространенность онкогенных типов вируса папилломы человека у женщин с патологией шейки матки // Материалы международной научно-практической конференции «Профилактика рака шейки матки: взгляд в будущее». -М.-2008. С.50-51. (соавт. Шипицына Е.В., Юшманова Е.С., Евстигнеева Л.А., Савичева А.М.)

14. Диагностика папилломавирусной инфекции в скрининге рака шейки матки // Материалы международной конференции «Охрана репродуктивного здоровья в рамках реализации национального проекта «Здоровье», -СПб./ Журнал акушерства и женских болезней.-2007.- T.LVI, спецвыпуск, С.72-75. (соавт. Шипицына Е.В., Юшманова Е.С., Савичева А.М.)

Подписано в печать 09.04.2009г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,4. Тираж 100 экз. Заказ № 1167.

Отпечатано в ООО «Издательство "ЛЕМА"»

199004, Россия, Санкт-Петербург, В.О., Средний пр., д.24, тел./факс: 323-67-74 e-mail: izd_lema@mail.ru http://www.lemaprint.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Золотоверхая, Екатерина Андреевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Роль ВПЧ в этиологии рака шейки матки.

1.2 Профилактика рака шейки матки.

1.2.1 Вакцинация.

1.2.2 Скрининг женщин на рак шейки матки.

1.2.2.1 Классификация цервикальных цитологических поражений

1.2.2.2 Скрининговые технологии.

1.3 Биология вируса папилломы человека.

1.3.1 Классификация вируса папилломы человека.

1.3.2 Жизненный цикл вируса папилломы человека.

1.3.3 Организация генома вируса папилломы человека.

1.3.4 Роль ранних белков вируса папилломы человека в онкогенной трансформации эпителиальных клеток.

1.3.5 Молекулярные основы типоспецифических различий в трансформирующей активности вируса папилломы человека.

1.3.6 Значение интеграции ДНК вируса папилломы человека в геном хозяина для онкогенной трансформации клеток.

1.4. Факторы риска цервикальной неопластической прогрессии, ассоциированные с вирусом папилломы человека.

1.4.1 Инфицирование онкогенными типами и молекулярными вариантами вируса папилломы человека.

1.4.2 Множественная папилломавирусная инфекция.

1.4.3 Высокая вирусная нагрузка.

1.4.4 Персистенция папилломавирусной инфекции.

1.4.5 Нерегулируемая экспрессия вирусных онкогенов.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1 Схема исследования.

2.2 Клинический материал.

23 Цитологические исследования!.

• 2.4 Выделение нуклеиновых кислот из клинического материала

2.5 Полимеразная цепная реакция с типоспецифическими праймерами.

2.6 Приготовление компетентных клеток

2.7 Выделение плазмиднойДНК;.

2.8 . Полимеразная цепная реакция в реальном времени.

2.9 Статистическая обработка данных.

РЕЗУЛЬТАТЫ;СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.:.

ГЛАВА 3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИРУСНОЙ НАГРУЗКИ И ФИЗИЧЕСКОГО СТАТУСА ВИРУСА ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА.

3.1 Количес твенная полимеразная цепная реакция в реальном времени.

3.2 Методика определения физического статуса ДНК вирусов папилломы человека 16 и 18 типов.

ГЛАВА 4. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МАРКЕРЫ ВИРУСА ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА В РАННЕЙ ДИАГНОСТИКЕ ЦЕРВИКАЛЬНЫХ НЕОПЛАЗИЙ

4.1 Частота встречаемости онкогенных типов вируса папилломы человека при патологии шейки матки

4.2 оцг.нка вирусной нагрузки у женщин с патологией шейки матки:.

4.3 Физический статус ДНК вируса папилломьг человека при различных стадиях заболевания шейки матки

4.4 типоспецифическая персистенция ВПЧ.

ГЛАВА 5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярные маркеры онкогенной активности вируса папилломы человека"

Одним из важнейших достижений в области изучения рака является установление этиологической роли некоторых типов вируса папилломы человека (ВПЧ) в развитии рака шейки матки (РШМ) [1]. В настоящее время охарактеризовано более 80 типов ВПЧ и показано, что около 40 типов могут вызывать заболевания аногенитального тракта [2]. На основании данных эпидемиологических и молекулярно-биологических исследований типы ВПЧ, инфицирующие слизистые оболочки аногенитального тракта, разделяют на группы низкого и высокого онкогенного риска [3]. Самыми распространенными типами ВПЧ высокого онкогенного риска являются 16 и 18 типы — их обнаруживают в 60-80% всех случаев РШМ [4].

Раку шейки матки предшествуют цервикальные интраэпителиальные неоплазии, которые по степени тяжести принято разделять на легкую, умеренную и тяжелую дисплазии. В большинстве случаев легкой и умеренной дисплазии происходит их спонтанная регрессия, и только в 1020% случаев заболевание прогрессирует до РШМ [5]. Установление центральной роли онкогенных типов ВПЧ в этиологии РШМ привело к появлению новых стратегий профилактики этого заболевания. К ним относятся разработка вакцин против онкогенных типов вируса и включение теста на ВПЧ в скрининг РШМ. Многочисленные исследования продемонстрировали, что тест на ВПЧ обладает гораздо более высокой чувствительностью для выявления цервикальных интраэпительных неоплазий, чем традиционное цитологическое исследование [6]. Однако тест на ВПЧ имеет достаточно низкие показатели специфичности и прогностической значимости положительных результатов, так как у большинства женщин, особенно молодых, папилломавирусная инфекция (ПВИ) носит транзиторный характер.

По мнению экспертов, на сегодняшний день самым надежным прогностическим индикатором прогрессии заболевания является выявление у женщины персистирующей ПВИ. Показано, что риск персистенции и последующей прогрессии выше в случаях ПВИ с более высокой вирусной нагрузкой ВПЧ [7]. Однако использование в клинической практике высокой вирусной нагрузки как фактора неопластической прогрессии в настоящее время остается проблематичным по ряду причин. Во-первых, зависимость степени дисплазии от вирусной нагрузки в достаточной мере описана только для ВПЧ 16 типа, а во-вторых, по причине отсутствия стандартизованной методологии определения количества вирусной ДНК нельзя установить пороговое значение, выше которого она может считаться клинически значимой.

Ключевым событием в злокачественной трансформации эпителиальных клеток считается интеграция вирусной ДНК в ДНК клетки-хозяина. Процесс интеграции сопровождается разрушением открытых рамок считывания генов вируса Е1 и Е2, продукты которых участвуют в регуляции экспрессии онкогенных белков вируса Е6 и Е7 [8]. Считается, что следствием интеграции, вирусной ДНК в ДНК хозяина является значительное повышение экспрессии белков Е6 и Е7, которые выводят из строя два ключевых белка (р53 и рШэ), регулирующих клеточный цикл.

Несмотря на то, что явление интеграции вирусной ДНК в геном хозяина активно изучается, имеющиеся данные не позволяют однозначно оценить его клиническое значение. Как правило, на ранних стадиях опухолевого процесса вирусная ДНК выявляется в эписомной форме, тогда как на поздних — в интегрированной [9]. Недавно был предложен высокочувствительный метод определения физического статуса ВПЧ 16 типа с применением ПЦР в реальном времени, с помощью которого интегрированная форма вируса была обнаружена на самых ранних стадиях заболевания, когда еще не было цитологических доказательств неопластических изменений [10].

Многие авторы оценивают определение вирусной нагрузки и интегрированной формы вирусной ДНК ВПЧ как молекулярные маркеры трансформирующей активности ВПЧ, однако, возможность их использования в клинической практике еще предстоит оценить.

Для достижения поставленной цели планировалось решить следующие задачи:

3. Исследовать на- наличие ДНК ВПЧ типов высокого онкогенного риска, пробы, взятые от пациенток с патологией шейки матки, и оценить распространенность онкогенных типов вируса в данной популяции, а также изучить ассоциацию выявления нескольких типов ВПЧ со степенью неоплазии

6. Оценить персистенцию ВПЧ в эпителии цервикального канала как фактор неопластической прогрессии.

Научная новизна работы

- Выявлено, что высокая вирусная нагрузка ВПЧ 16 типа ассоциирована с повышенным риском развития неоплазии.

Научно-практическая значимость работы

- В качестве подхода, увеличивающего специфичность теста на ВПЧ в скрининге РШМ, предложено использовать персистенцию ВПЧ, определяемую как выявление одного и того же типа вируса при повторных исследованиях с интервалом 6 месяцев.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

2. Высокая вирусная нагрузка ВПЧ 16 типа может использоваться ' в качестве прогностического маркера, хотя низкая нагрузка не исключает прогрессию заболевания. Для остальных типов зависимости тяжести поражений от вирусной нагрузки не установлено.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 14 работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК России для публикации.

Апробация работы

Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (материалы и методы исследования и результаты), обсуждения результатов, выводов и практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 14 таблицами и 15 рисунками; библиографический указатель включает 169 публикаций.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Золотоверхая, Екатерина Андреевна

ВЫВОДЫ

2. Разработана методология определения физического статуса ВПЧ 16 и 18 типов.

3. Анализ распространенности типов ВПЧ по превалирующему типу в случаях множественной ВПЧ инфекции показал, что 16 тип существенно доминирует над остальными типами, а основными типами, обнаруживаемыми при раке шейки матки, являются 16 (62%), 18 (11%), 31 (10%), 33 (9%) и 45 (7%) типы.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. разработанная методология определения концентрации ДНК ВПЧ 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45 и 56 типов, нормированная на количество клеток в клинической пробе, может быть использована для дальнейшего изучения связи вирусной нагрузки с прогрессией цервикальных неопластических изменений.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ

ДИССЕРТАЦИИ

1. Определение вирусной нагрузки и статуса ДНК вируса папилломы человека 16 типа методом ПЦР в реальном времени// Журнал акушерства и женских болезней.- 2004.-T.LIII, № 4,-С.26-32. (соавт. Шипицына Е.В., Бабкина К.А., Савичева A.M., Микая Н.А., Орлова О.О., Юркова И.К.)

2. Папилломавирусная инфекция: факторы риска цервикальной неопластической прогрессии// Журнал акушерства и женских болезней.-2004.-T.LIII, №3C.34-45. (соавт. Шипицына Е.В., Бабкина К.А., Савичева A.M.)

3. Факторы риска развития рака шейки матки: интеграция ДНК вируса папилломы человека в ДНК клетки// Патология шейки матки. Генитальные инфекции.-2005, №1,-С.54-59. (соавт. Шипицына Е.В., Микая Н.А., Юркова И.К., Орлова О.О., Чхартишвили М.Г., Селимян Н.К., Ширшова Н.Ю., Бабкина К.А., Савичева A.M.)

4. Маркеры папилломавирусной инфекции в скрининге рака шейки матки// Журнал акушерства и женских болезней.- 2008.-T.LVII, №4, -С.31-39. (соавт. Шипицына Е.В., Юшманова Е.С., Савичева A.M.)

5. Применение метода ПЦР в реальном времени для определения вирусной нагрузки и статуса ДНК вируса папилломы человека 16 типа// Сборник трудов 5-ой Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней».-М., 2004.-Т.1,-С.341-343. (соавт. Шипицына Е.В., Микая Н.А., Савичева A.M.)

6. Papillomaviral infection and pathology of the cervix// Book of Abstracts of the 1st Euro-Asian Congress "The Events of the Year in Gynecology and Obstetrics'VSPb., 2004.-P.46-47. (соавт. Shipitsyna E.Y., Savicheva A.M., Yurkova I.K., Mikaya N.A.)

7. Выявление интегрированной формы вируса папилломы человека 16 типа методом полимеразной цепной реакции в реальном времени// Тезисы Российской научно-практической конференции «Санкт-Петербургские дерматологические чтения».-СПб, 2005,-С.91. (Шипицына Е.В., Савичева А.М.)

8. Интеграция ДНК вируса папилломы человека как фактор неопластической прогрессии// Материалы международной конференции «Репродуктивно значимые инфекции: Европейские стандарты диагностики, терапии и профилактики», посвященной 80-летию лаборатории микробиологии ГУ НИИАГ им. Д.О. Отта РАМН/ Журнал акушерства и женских болезней.- 2006.-T.LV, специальный выпуск,-С.35-36. (соавт. Савичева А.М., Шипицына Е.В.)

9. Значение папилломавирусной инфекции в возникновении заболеваний шейки матки// Материалы международной конференции «Репродуктивно значимые инфекции: Европейские стандарты диагностики, терапии и профилактики», посвященной 80-летию лаборатории микробиологии ГУ НИИАГ им. Д.О. Отта РАМН/ Журнал акушерства и женских болезней.- 2006.-T.LV, специальный выпуск,-С.88. (соавт. Юшманова Е.С., Веснина E.JL, Шипицына Е.В., Савичева А.М. )

10. Type-specific persistence of high-risk human papillomavirus DNA as a factor of cervical neoplastic progression// Abstracts of the 6th International Multidisciplinary Congress "Eurogen".-Paris, 2006.-P.137. (соавт Shipitsyna E., Yushmanova E., Savicheva A.)

11. Роль вирусологических факторов в развитии рака шейки матки у женщин репродуктивного возраста// Тезисы докладов 3-го международного научного конгресса «Новые технологии в акушерстве и гинекологии», посвященного 210-летию НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН, Журнал акушерства и женских болезней.-2007. T.LVII, специальный выпуск,-С.153-154. (соавт. Евстигнеева JI.A., Бахидзе Е.В., Семиглазов В.В., Шипицына Е.В.)

12. Маркеры папилломавирусной инфекции в скрининге рака шейки матки// Тезисы докладов 6-й Всероссийской научно-практической конференции «Молекулярная диагностика-2007»,-М. 2007.-Т.Ш. С. 91-93 (соавт. Шипицына Е.В., Юшманова Е.С., Савичева А.М.)

13. Распространенность онкогенных типов вируса папилломы человека у женщин с патологией шейки матки// Материалы международной научно-практической конференции «Профилактика рака шейки матки: взгляд в будущее». -М.-2008. С.50-51. (соавт. Шипицына Е.В., Юшманова Е.С., Евстигнеева JT.A., Савичева A.M.)

14. Диагностика папилломавирусной инфекции в скрининге рака шейки матки// Материалы международной конференции «Охрана репродуктивного здоровья в рамках реализации национального проекта «Здоровье», -СПб./ Журнал акушерства и женских болезней.-2007.- T.LVI, спецвыпуск, С.72-75. (соавт. Шипицына Е.В., Юшманова Е.С., Савичева A.M.)

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Золотоверхая, Екатерина Андреевна, Санкт-Петербург

1. zur Hausen, Н. Human papilloma viruses and cancer / H. zur Hausen, L. Gissman, W. Steiner, et al. // Bibl Haematol. -1975. Vol.43. -P.596-571.

2. Munoz, N. Epidemiologic classification of human papillomavirus types associated with cervical cancer / N. Munoz, F.X. Bosch, S. de Sanjose et al. // N Engl J Med. -2003. -P.348(6). -P.518-527.

3. Syrjanen, К J. Biological behavior of cervical intraepithelial neoplasia / K.J. Syrjanen // New developments in cervical cancer screening and prevention.-Oxford: Blackwell Science, -1997. -P.93-108.

4. Dalstein, V. Human papillomavirus testing for primary cervical cancer screening. / V. Dalstein, J. Bory, O. Graesslin, et al. // Emerging issues on HPV infections: from science to practice. Basel, Karger, 2006, pp 103-19.

5. Dalstein, V. Persistence and load of high-risk HPV are predictors for development of high-grade cervical lesions: a longitudinal French cohort study / V. Dalstein, D. Riethmuller, J.L. Pretet, et al. // Int J Cancer. -2003. -Vol.106.-P.396-403.

6. Jeon, S. Integration of human papillomavirus type 16 into the human genome correlates with a selective growth advantage of cells / S. Jeon, B,L. Allen-Hoffmann, P.F. Lambert // J Virol. -1995. -Vol.69. -P.2989-2997.

7. Waggoner, S.E. Cervical cancer / S.E. Waggoner // Lancet. —2003. Vol.361.-P.2217-2225.

8. Козаченко, В.П. Рак шейки матки / В.П. Козаченко // Современная онкология 2001. - Т.2. -№ 2. - С. 2-4.

9. Коломиец, JI.A. Генитальная папиломавирусная инфекция и рак шейки матки. / JI.A. Коломиец, JI.H. Уразова Томск : Изд-во HTJI, 2002. - 100 с.

10. Новик, В.И. Эпидемиология рака шейки матки, факторы риска, скрининг / В.И. Новик // Практическая онкология. 2002. - Т.З. - С. 156165.

11. Новикова, Е.Г. Органосохраняющее и функционально-щадящее лечение при раке шейке матки / Е.Г. Новикова, В.А. Антипов, Е.А. Ронина, О.И. Трушина // Вопросы онкологии. -2006. —Т. 52. №1. - С. 78-82

12. Чиссов, В.И. Злокачественные новообразования в России в 1998 г. (заболеваемость и смертность) / В.И. Чиссов; под ред. В.И. Чиссова, В.В. Старинского, JI.B. Ременник М. : МНИОИ им. П.А. Герцена, 2000. - 284 с.

13. Jablonska, S. Epidermodysplasia verruciformis as a model in studies on the role of papovaviruses in oncogenesis / S. Jablonska, J. Dabrowski, K. Jakubowicz // Cancer Res. -1972. -Vol. 32. -P.583-589

14. Bosch, F.X. The causal relation between human papillomavirus and cervical cancer / F.X. Bosch, A. Lorincz, N. Muñoz, et al. // J Clin Pathol. -2002. -Vol.55. -P.244-265.

15. Alazawi, W. Changes in cervical keratinocyte gene expression associated with integration of human papillomavirus 16 / W. Alazawi, M. Pett, B. Arch, et al. // Cancer Res. -2002. -Vol.62. -P.6959-6965.

16. Koutsky, L.A. A controlled trial of a human papillomavirus type 16 vaccine / L.A. Koutsky, K.A. Ault, C.M. Wheeler, et al. //N Engl J Med. -2002. Vol.347.-P. 1645-1651.

17. Franco, E. Vaccination against human papillomavirus infection: a new paradigm in cervical cancer control / E. Franco, D.M. Harper // Vaccine. -2005. -Vol.23. -P.23 88-2394.

18. Taira, A.V. Neukermans C.P., Sanders G.D. Evaluation human papillomavirus vaccination programs / A.V. Taira // Emerg Infect Dis. -2004. Vol.10.-P. 1915-1923.

19. Уварова, Е.В. Репродуктивное здоровье девочек России в начале XXI века / Е.В. Уварова // Акушерство и гинекология. —2006. —№ 1.-С. 27-30.

20. Манухин, И.Б. Заболевания наружных половых органов у женщин / И.Б. Манухин, Н.И. Кондриков, Т.П. Крапошина- М. : МИА, 2002. -303с.

21. World Health Organization (WHO). Comprehensive Cervical Cancer Control. A guide to essential practice. Geneva: WHO 2006. URL: http://www.who.int/reproductive-health/publications/cervicalcancergep/text.pdf.

22. Quinn, M. Effect of screening on incidence of and mortality from cancer of cervix in England: evaluation based on routinely collected statistics / M. Quinn, P. Babb, J. Jones, E. Allen // BMJ. -1999. -Vol.318. -P. 3.

23. Sasieni, P. Effect of screening on cervical cancer mortality in England and Wales: analysis of trends with an age period cohort model / P. Sasieni, J. Adams // BMJ. -1999. -Vol.318. -P.1244-1245.

24. US Preventive Services Task Force. Screening for cervical cancer. Recommendations and rationale. AHRG Pub. No. 03-515A, January 2003. URL: http://www.ahrg.gov/clinic/3rduspstf/cervcan/cervcanrr.htm. Accessed 19 June 2006.

25. The CancerWeb Project. URL:http ://cancerweb.ncl .ac.uk/cancernet/304728.html.

26. Sankaranarayanan, R. A critical assessment of screening methods for cervical neoplasia / R. Sankaranarayanan, L. Gaffikin, M. Jacob, et al. // Int J Gynecol Obstet. -2005. -Vol.89. -P.4-12.

27. Solomon, D. The 2001 Bethesda System. Terminology for reporting results of cervical cytology / D. Solomon, D. Davey, R. Kurman, et al. // JAMA. -2002. -Vol.287. -№ 16. -P.2114-2118.

28. Kocjan, G. BSCC, Bethesda or other? Terminology in cervical cytology European panel discussion / G. Kocjan, B.C. Priollet, M. Desair, et al. // Cytopathology. -2005. -Vol.16. -P.l 13-119.

29. Nuovo, J. New tests for cervical cancer screening / J. Nuovo, J. Melnikow, L.P. Howell // Am Fam Physician. -2001. -Vol.64. -P.780-786.

30. Karnon, J. Liquid-based cytology in cervical screening: an updated rapid and systematic review and economic analysis / J. Karnon, J. Peters, J. Piatt // Health Technol Assess. -2004. -Vol.8. -№20.

31. Saslow, D. American Cancer Society Guideline for the Early Detection of Cervical Neoplasia and Cancer / D. Saslow, C.D. Runowicz, B. Solomon, et al. // CA Cancer J Clin. -2002. -Vol.52. -P.342-362.

32. Cancer Research UK. Cervical screening in the UK. URL: ht1p://info.cancen,esearchuk.org/cancerstats/types/cervix/screening.

33. Wright, T.C. Interim guidance for the use of human papillomavirus DNA testing as an adjunct to cervical cytology for screening / T.C. Wright, M. Schiffinan, D. Solomon, et al. // Obstet Gynecol. -2004.-Vol. 103(2). -P.304-309.

34. Molijn, A. Molecular diagnosis of human papillomavirus (HPV) infections / A. Molijn, B. Kleter, W. Quint, L.J. van Doom // J Clin Virol. -2005. -Vol.32. -Suppl.l:S43-51.

35. Ault, K.A. Recommendations for the Diagnosis and Treatment of HPV Infections of Female Tract / K.A. Ault, K. Friese, L. Gissmann, et al. // European J for Infectious Diseases in Obstetrics and Gynecology. — 2002.

36. European Cervical Cancer Screening Network. European guidelines for quality assurance in cervical screening. 2nd draft of 15 December 2003. URL: http://www.cancer-network.de/

37. IARC WHO Press Release 151 IARC confirms efficacy of cervix cancer screening for women 25-65 in reducing mortality, 03 May 2004

38. Monsonego, J. Cervical Cancer Control Priorities and new directions / J. Monsonego, F.X. Bosch, P. Coursaget, et al. // Int J Cancer. -2004. -Vol.108. -P.329-333.

39. Monsonego, J. EUROGIN 2006 expert consensus report Innovations in cervical cancer prevention: Science, practice and actions / J. Monsonego // Gynecol Oncol. -2006 Aug 9;

40. Wright, T.C. 2001 consensus guidelines for the management of women with cervical cytological abnormalities / T.C. Wright, J.T. Cox, L.S. Massad, et al. //JAMA. -2002. -Vol.287. -P.2120-2129.

41. ACOG: ACOG Practice Bulletin: clinical management guidelines for obstetrician-gynecologists. Cervical cytology screening (replaces committee opinion 152, March 1995) / Obstet Gynecol. 2003. - Vol. 102. - № 45. -P. 417-427.

42. Cuzick, J. Management of women who test positive for high-risk types of human papillomavirus: the HART study / J. Cuzick, A. Szarewski, H. Cubie, et al. // Lancet. -2003. -Vol.362. -P.1871-1876.

43. Cuzick, J. New dimensions in cervical cancer screening / J. Cuzick, M.H. Mayarand, G. Ronco, et al. // Vaccine. -2006. -Vol.24. -Supl.3. -P.90-97

44. Petry, U.A. German project uses HPV-testing as primary screening test in the prevention of cervical cancer / U.A. Petry // HPV Today. —2006. — Vol.9. —P.7.

45. Clavel, C. Negative human papillomavirus testing in normal smears selects a population at low risk for developing high-grade cervical lesions / C. Clavel, J. Cucherousset, M. Lorenzato et al. // Br J Cancer. -2004. -Vol.90. -№ 9. -P. 1803-1808.

46. Munoz, N. Against which human papillomavirus types shall we vaccinate and screen? The international perspective / N. Munoz, F.X. Bosch, X. Castellsague, et al. // Int J Cancer. -2004. -Vol. 111. -P.278-285.

47. Goldie, S J. Cost-effectiveness of Cervical-cancer Screening in Five Developing Countries / S J. Goldie, L. Gafficin, J.D. Goldhaber-Fiebert, et al. // N Engl J Med. -2005. -Vol.353(20). -P.2158-2168.

48. Bernard, H.U. Evolution of papillomaviruses / H.U. Bernard, S.-Y. Chan, H. Delius // Cur Top Microbiol Immunol. -1994. -Vol.186. -P.33-53.

49. Syijanen, K. Epidemiology of human papillomavirus infection and genital neoplasia / K. Syrjanen, S. Syijanen // Scand J Infect Dis Suppl. -1990. -Vol.69. -P.7-17.68. zur Hausen, H. Viruses and Cancer / H. zur Hausen // Cambridge. — 1985. P.83-90.

50. Doorbar, J. Molecular biology of human papillomavirus infection and cervical cancer / J. Doorbar // Clin Sei (Lond). —2006. -Vol. 110(5). -P.525-541.

51. Борисов JI.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммуногия / Л.Б. Борисов, A.M. Смирнова —М. : Изд-во Медицина, 1994. — 528 с.

52. Козлова В.И. Вирусные, хламидийные и микоплазменные заболевания гениталий / В.И. Козлова, А.Ф. Пухнер -М. : Изд-во Филин, 1997.-536 с.72. zur Hausen, Н., Gissman, L. Viral Oncology / H. zur Hausen, L. Gissman; Ed. G. Klein.-New York, 1980. -P.433.

53. Калинин, В.Л. Введение в молекулярную вирусологию / В.Л. Калинин // СПб.: СПбГТУ, 2002. 302 с.

54. Nishimura, A. Mechanism of human papillomavirus E2-mediated repression of viral oncogene expression and cervical cancer cell growthinhibition / A. Nishimura, T. Ono, A. Ishimoto, et al. // J Virol -2000. -Vol.74. -P.3752-3760.

55. Киселев, Ф.Л. Клонирование трансформированных генов вирусов папилломы человека типа 18 / Ф.Л. Киселев // Вопросы вирусологии. -1997.-№6. С. 248-251.

56. Nagao, S. Rapid and sensitive detection of physical status of human papillomavirus type 16 DNA by quantitative real-time PCR / S. Nagao, M. Yoshinouchi, Y. Miyagi, et al. // J Clin Microbiol. -2002. -Vol.40. -P.863-867.

57. Jeon, S. Integration of human papillomavirus type 16 DNA into the human genome leads to increased stability of E6 and E7 mRNAs: implications for cervical carcinogenesis / S. Jeon, P.F. Lambert // Proc Natl Acad Sci USA. — 1995. -Vol.92. -P.1654-1658.

58. Хансон, К.П. Современные представления о канцерогенезе рака шейки матки / К.П. Хансон, Е.Н. Имянитов // Практическая онкология. -2002. -Т.З. -С.145-155.

59. Francis, D.A. Repression of the integrated papillomavirus E6/E7 promoter is required for growth suppression of cervical cancer cells / D.A. Francis, S.I. Schmid, P.M. Howley // J Virol. -2000. -Vol.74. -P.2679-2686.

60. Munger, K. Biological activities and molecular targets of the human papillomavirus E7 oncoprotein / K. Munger, J.R. Basile, S. Duensing, et al. // Oncogene. -2001. -Vol.20. -P.7888-7898.

61. Luo, R.X. Rb interacts with histone deacetylase to repress transcription / R.X. Luo, A.A. Postigo, D.C. Dean // Cell. -1998. —Vol.92. -P.463-473.

62. Weintraub, S.J. Retinoblastoma protein switches the E2F site from positive to negative element / S.J. Weintraub, C.A. Prater, D.C. Dean // Nature. -1992. -Vol.358. —P.259-261.

63. Weintraub, S.J. Mechanism of active transcriptional repression by the retinoblastoma protein / S.J. Weintraub, K.N. Chow, R.X. Luo, et al. // Nature. -1995. -Vol.375. -P.812-815.

64. Smotkin, D. Transcription of human papillomavirus type 16 early genes in a cervical cancer and a cancer-derived cell line and identification of the E7 protein / D. Smotkin, F.O. Wettstein // Proc Natl Acad Sci USA. -1986. -Vol.83. -P.4680-4684.

65. Barbosa, M.S. Papillomavirus polypeptides E6 and E7 are zinc-binding proteins / M.S. Barbosa, D.R. Lowy, J.T. Schiller // J Virol. -1989. -Vol.63.-P. 1404-1407.

66. Lee, J.O. Structure of the retinoblastoma tumour-suppressor pocket domain bound to a peptide from HPV E7 / J.O. Lee, A.A. Russo, N.P. Pavletich // Nature. -1998. -Vol.391. -P.859-865.

67. Dyson, N. The regulation of E2F by pRB-family proteins / N. Dyson // Genes Dev. -1998. -Vol.12. -P.2245-2262.

68. Flores, E.R. The human papillomavirus type 16 E7 oncogene is required for the productive stage of the viral life cycle / E.R. Flores, B.L. Allen-Hoffmann, D. Lee, P.F. Lambert // J Virol. -2000. -Vol.74. -P.6622-6631.

69. Funk, J.O. Inhibition of CDK activity and PCNA-dependent DNA replication by p21 is blocked by interaction with the HPV-16 E7 oncoprotein / J.O. Funk, S. Waga, J.B. Harry, et al. // Genes Dev. -1997. -Vol.11. -P.2090-2100.

70. Nurnberg, W. Nuclear proto-oncogene products transactivate the human papillomavirus type 16 promoter / W. Nurnberg, M. Artuc, G. Vorbrueggen, et. al. // Br J Cancer. -1995. -Vol.71. -P.l 018-1024.

71. Scheffner, M. The HPV-16 E6 and E6-AP complex functions as a ubiquitin-protein ligase in the ubiquitination of p53 / M. Scheffner, J.M. Huibregtse, R.D. Vierstra, P.M. Howley // Cell. -1993. -Vol.75. -P.495-505.

72. Bechtold, V. Human papillomavirus type 16 E2 protein has no effect on transcription from episomal viral DNA / V. Bechtold, P. Beard, K. Raj // J Virol. -2003. -Vol.77. -P.2021-2028.

73. Stunkel, W. Nuclear matrix attachment regions of human papillomavirus type 16 repress or activate the E6 promoter, depending on the physical state of the viral DNA / W. Stunkel, Z. Huang, S.H. Tan, et al. // J Virol. -2000. -Vol.74. -P.2489-2501.

74. Romanczuk, H. Disruption of either the El or the E2 regulatory gene of human papillomavirus type 16 increases viral immortalization capacity / H. Romanczuk, P.M. Howley // Proc Natl Acad Sci USA. -1992. -Vol.89. -P.3159-3163.

75. Hou, S.Y. Transcriptional activity among high and low risk human papillomavirus E2 protein correlates with E2 DNA binding / S.Y. Hou, S.Y. Wu, C.M. Chiang // J Biol Chem. -2002. -Vol.277. -P.45619-45629.

76. Thorland, E.C. Common fragile sites are preferential targets for HPV16 integrations in cervical tumors / E.C. Thorland, S.L. Myers, B.S. Gostout, D.I. Smith // Oncogene. -2003. -Vol.22. -P. 1225-3127.

77. Mullokandov, M.R. Genomic alterations in cervical carcinoma: losses of chromosome heterozygosity and human papilloma virus tumor status / M.R. Mullokandov, N.G. Kholodilov, N.B. Atkin, et al. // Cancer Res. -1996. -Vol.56.-P. 197-202.

78. Goldie, SJ. Analysis of intratumoral heterogeneity of chromosome 3p deletions and genetic evidence of polyclonal origin of cervical squamous carcinoma / SJ. Goldie, F. Wu, A. Asplund, et al. // Mod Pathol. -2001. -Vol.14.-P.54-61.

79. Mazurenko, N. High resolution mapping of chromosome 6 deletions in cervical cancer / N. Mazurenko, M. Attaleb, T. Gritsko, et al. // Oncol Reports. -1999. -Vol.6. -P.859-863.

80. Koopman, L.A. Multiple genetic alterations cause frequent and heterogeneous human histocompatibility leukocyte antigen class I loss in cervical cancer / L.A. Koopman, W.E. Corver, A.R. van der Slik, et al. // J. Exp. Med. -2000. -Vol.191. -P.961-975.

81. Xi, L.F. Analysis of human papillomavirus type 16 variants indicates establishment of persistent infection / L.F. Xi, W. Demers, L.A. Koutsky et al. // J Infect Dis. -1995. -Vol.172. -P.747-755.

82. Ong, C.K. Evolution of human papillomavirus type 18: an ancient phylogenetic root in Africa and intratype diversity reflect co-evolution with human ethnic groups / C.K. Ong, S.-Y. Chan, M.S. Campo, et al. // J Virol -1993. -Vol.67. -P.6424-6431.

83. Heinzel, P.A. Variation of human papillomavirus type 6 (HPV-6) and HPV-11 genome samples throughout the world / P.A. Heinzel, S.-Y. Chan, L. Ho, et al. // J Clin Microbiol. -1995. -Vol.33. -P. 1746-1754.

84. Ho, L. The genetic drift of human papillomavirus type 16 is a means of reconstructing prehistoric viral spread and the movement of ancient human populations / L. Ho, S.-Y. Chan, R.D. Burk, et al. // J Virol. —1993. — Vol.67. -P.6413-6423.

85. Xi, L.F. Genomic variation of human papillomavirus type 16 and risk for high-grade cervical intraepithelial neoplasia / L.F. Xi, L.A. Koutsky, D.A. Galloway, et al. // J Nation Cancer Inst. -1997. -Vol.89. -P.796-802.

86. Villa, L.L. Molecular variants of human papillomavirus types 16 and 18 preferentially associated with cervical neoplasia / L.L. Villa, L. Sichero, P. Rahal, et al. // J Gen Virol. -2000. -Vol.81. -P.2959-2968.

87. Londesborough, P. Human papillomavirus genotype as a predictor of persistence and development of high-grade lesions in women with minor cervical abnormalities / P. Londesborough, L. Ho, G. Terry, et al. // Int J Cancer. -1996. -Vol.69.-P.364-368.

88. Song, Y.S. Major sequence variants in E7 gene of human papillomavirus type 16 from cervical cancerous and non-cancerous lesions of Korean women / Y.S. Song, S.H. Kee, J.W. Kim, et al. // Gynaecol Oncol. -1997. -Vol.66. -P.275-281.

89. Franco, E. Molecular variant analysis as an epidemiological tool to study persistence of cervical human papillomavirus infection / E. Franco, L.L. Villa, P. Rahal, A. Ruiz // J Nation. Cancer Inst. -1994. -Vol.86. -P.1558-1559.

90. Junes, K.S. Intratypic variability of HPV-16 and -18 in tumour biopsies from a high risk area for cervical cancer / K.S. Junes, L. Sichero, W. Mello, et al. // 18th International Papillomavirus Conference. -2000, 23-28 July. -Barcelona, Spain.

91. Zehbe, I. The biological significance of human papillomavirus type 16 variants for the development of cervical neoplasia /1. Zehbe, M. Tommasino // Papillomavirus Report. -1999. -Vol.10. -P.105-116.

92. Swan, D.C. Human papillomavirus (HPV) DNA copy number is dependent on grade of cervical disease and HPV type / D.C. Swan, R.A. Tucker, G.,Tortolero-Luna, et al. // J Clin Microbiol. -1999. -Vol.37. -P.1030-1034.

93. Perovic, M.V. High-risk human papillomavirus (HPV) types in patients with squamous intraepithelial lesions (SIL) / M.V. Perovic, M.J.

94. Berisavac, N. Kuljic-Kapulica, T. Jovanovic // Eur J Gynaecol Oncol. —2003. — Vol.24. -P.178-180.

95. Fife, K.H. Detection of multiple human papillomavirus types in the lower genital tract correlates with cervical dysplasia / Fife K.H., Cramer H.M., Schroeder J.M., Brown D.R. // J Med Virol. -2001. -Vol.64. -P.550-559.

96. Szoke, K. Moderate variation of the oncogenic potential among high-risk human papillomavirus types in gynecologic patients with cervical abnormalities / K. Szoke, T. Sapy, Z. Krasznai, et al. // J Med Virol-2003. -Vol.71. -P.585-592.

97. Bekkers, R.L. Effects of HPV detection in population-based screening programmes for cervical cancer; a Dutch moment / R.L. Bekkers, C J. Meijer, L.F. Massuger, et al. // Gynecol Oncol. -2006. -Vol. 100. -№ 3 -P.451-452.

98. Peto, J. The cervical cancer epidemic that screening has prevented in the UK / J. Peto, C. Gilham, O. Fletcher, F.E. Matthews // Lancet. -2004. -Vol. 364. —P.249-256.

99. Ho, G.Y. Natural history of cervicovaginal papillomavirus infection in young women / G.Y. Ho, R. Bierman, L. Beardsley, et al. // N Engl J Med. -1998. -Vol.338. -P.423-428.

100. Moscicki. A.B. The natural history of human papillomavirus infection as measured by repeated DNA testing in adolescent and young women / A.B. Moscicki, S. Shiboski, J. Broering, et al. // J Pediatr. -1998. -Vol.132. -P.277-284.

101. Samoylova. E.V. HPV infection in cervical-cancer cases in Russia / E.V. Samoylova, G.O. Shaikhaiev, S.V. Petrov, et al. // Int J Cancer. -1995. -Vol.61.-P.337-341.

102. Vernon, S.D. Association of human papillomavirus type 16 integration in the E2 gene with poor disease-free survival from cervical cancer / S.D. Vernon, E.R. Unger, D.L. Miller, et al. // Int J Cancer. -1997. -Vol.74. -P.50-56.

103. Киселев, Ф.Л. Статус ДНК вируса папиллом человека в опухолях шейки матки / Ф.Л. Киселев, Н.П. Киселева, В.К. Кобзева и др. // Мол. Биол. Клетки. -2001. -Т.35. С. 470-476.

104. Gallo, G. Study of viral integration of HPV-16 in young patients with LSIL / G. Gallo, M. Bibbo, L. Bagella, et al. // J Clin Pathol. -2003. -Vol.56. -P.532-536.

105. Kraus, I. Human papillomavirus oncogenic expression in the displastic portio; an investigation of biopsies from 190 cervical cones /1. Kraus, Т. Molden, L.E. Erno, et al. // Brit J Cancer. -2004. -Vol.90. -P. 1407-1413.

106. Cuschieri, K.S. Human papillomavirus type specific DNA and RNA persistence implications for cervical disease progression and monitoring / K.S. Cuschieri, M.J. Whitley, A.C. Heather // J. Med. Virol. -2004. -Vol.73. -P.65-70.

107. Evans, M.F. Human papillomavirus integration: detection by in situ hybridization and potential clinical application / M.F. Evans, K. Cooper // J Pathol. -2004. -Vol.202. -P. 1-4.

108. Boom, R. Rapid and simple method for the purification of nucleic acids / R. Boom, C.J.A. Sol, M.M. Salimans, C.L. Hansen, et al. // J Clin Microbiol. -1990. -Vol.28. -P.495-503.

109. Inoue, H. High efficiency transformation of with Escherichia coli Plasmids / H. Inoue, H. Nojima, H. Okayama // Gene. -1990. -Vol.96. -P.23-28.

110. Lee, S.Y. A simple procedure for maximum yield of high-quality Plasmid DNA / S.Y. Lee, A. Rasheed // Biotechniques. -1990. -Vol.9. -P.676-679.

111. Лагутин, М.Б. Наглядная математическая статистика: Учебное пособие / М.Б. Лагутин. — М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2007.^72 с.

112. Herrington, C.S. Human papillomavirus and cervical neoplasia. Classification, virology, pathology, and epidemiology / C.S. Herrington // J Clin Pathol. -1994. -Vol.47. -P.1066-1072.

113. Cuschieri, K.S. Multiple high risk HPV infections are common in cervical neoplasia and young women in a cervical screening population / K.S. Cuschieri, H.A. Cubie, M.W. Whitley, et al. // J Clin Pathol. -2004. -Vol.57. -P.68-72.

114. Thomas, K.K. Concurrent and sequential acquisition of different genital human papillomavirus types / K.K. Thomas, J.P. Hughes, J.M. Kuypers et al. // J Infect Dis. -2000. -Vol.l82. -P. 1097-1102.

115. Rolon, P.A. Human papillomavirus infection and invasive cervical cancer in Paraguay / P.A. Rolon, J.S. Smith, N. Munoz, et al. // Int J Cancer. -2000. —Vol.85. -P.486-491.

116. Rousseau, M.C. Predictors of cervical coinfection with multiple human papillomavirus types / M.C. Rousseau, M. Abrahamowicz, L.L. Villa, et al. // Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. -2003. -Vol.12. -P.1029-1037.

117. Lee, S.A. Multiple HPV infection in cervical cancer screened by HPV DNA Chip / S.A. Lee, D. Kang, S.S. Seo, et al. // Cancer Lett. -2003. -Vol.198. -P.187-192.

118. Cuzick, J. Role of HPV testing in clinical practice / J. Cuzick // Virus Res. -2002. -Vol.89. -P.263-269.

119. Lorincz, A.T. Screening for cervical cancer: new alternatives and research / A.T. Lorincz // Salud Publica Мех. 2003. - Vol.45. - Suppl.3. -P.376-387.

120. Ostor, A.G. Natural history of cervical intraepithelial neoplasia — a critical review / A.G. Ostor // Int J Gynecol Pathol. -1993. -Vol.12. -P.186-192.

121. Cuzick, J. Type-specific human papillomavirus DNA in abnormal smears as a predictor of high-grade cervical intraepithelial neoplasia / J. Cuzick, G. Terry, L. Ho, et al. // Br J Cancer. -1994. -Vol.69. -P.167-171.

122. Mansell, M.E. Semi-quantitative human papillomavirus DNA detection in the management of women with minor cytological abnormality / M.E. Mansell, L. Ho, G. Terry, et al. // Br J Obstet Gynaecol.-1994. -Vol. 101.-P.807-809.

123. Snijders, J.F.S. The Value of Viral Load in HPV Detection in Screening / J.F.S. Snijders, C.J.L.M. Meijer // HPV Today. -2006. -Vol.8. -P.8-9.

124. Moberg, M. High viral loads of human papillomavirus predict risk of invasive cervical carcinoma / M. Moberg, I. Gustavsson, E. Wilander, U. Gyllensten // Br J Cancer. -2005. -Vol.92. -891-894.

125. Moberg, M. Type-specific associations of human papillomavirus load with risk of developing cervical carcinoma in situ / M. Moberg, I. Gustavsson, U. Gyllensten // Int J Cancer. -2004. -Vol.112(5). -P.854-859.

126. Duensing, S. Mechanisms of genomic instability in human cancer: insights from studies with human papillomavirus oncoproteins / S. Duensing, K. Munger // Int J Cancer. -2004. -Vol. 109. -P. 157-162.

127. Pepe, M.S. Phases of biomarker development for early detection of cancer / M.S. Pepe, R. Etzioni, Z. Feng, et al. // J Natl Cancer Inst. -2001. -Vol.93.-P.1054-1061.

128. Baldwin, P. Translation approaches to improving cervical screening / P. Baldwin, R. Laskey, N. Coleman // Nat Rev Cancer. 2003. -№ 3. -P.217-226.

129. Murphy, N. pl6INK4A, CDC6, and MCM5: predictive biomarkers in cervical preinvasive neoplasia and cervical cancer / N. Murphy, M. Ring, C.C. Heffron, et al. // J Clin Pathol. -2005. -Vol.58. -P.525-534.

130. Steenbergen, R. HPV-mediated transformation of the anogenital tract / R. Steenbergen, J. de Wilde, S. Wilting, et al. // J Clin Virol. -2005. -Vol.32. -Suppl.S25-33.

131. Lehn, H.L. Physical state and biological activity of human papillomavirus genomes in precancerous lesions of the female genital tract / H.L. Lehn, L.L. Villa, F. Marziona, et al. // J Gen Virol. -1998. -Vol.69. -P. 187-196.

132. Cullen, A.P. Analysis of the physical state of different human papillomavirus DNAs in intraepithelial and invasive cervical neoplasms / A.P. Cullen, R. Reid, M. Campion, A.T. Lorincs // J Virol. -1991. -Vol.65. -P.606-612.

133. Pirami, L. Analysis of HPV16, 18, 31, and 35 DNA in pre-invasive and invasive lesions of the uterine cervix // L. Pirami, V. Giache, A. Becciolini // J Clin Pathol. -1997. -Vol.50. -P.600-604.i • / '

134. Badaracco, G. HPV16 and HPV18 in genital tumors: significantly different levels of viral integration and correlation to tumor invasiveness / G. Badaracco, A. Venuti, A. Sedati, M.L. Marcante // J Med Virol. -2002. -Vol.67. -P.574-582.

Информация о работе

Золотоверхая, Екатерина Андреевна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2009
ВАК 03.00.06

Диссертация

Молекулярные маркеры онкогенной активности вируса папилломы человека - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Молекулярные маркеры онкогенной активности вируса папилломы человека ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярные маркеры онкогенной активности вируса папилломы человека"

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Золотоверхая, Екатерина Андреевна

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярные маркеры онкогенной активности вируса папилломы человека"

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Золотоверхая, Екатерина Андреевна

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Золотоверхая, Екатерина Андреевна, Санкт-Петербург

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярные маркеры онкогенной активности вируса папилломы человека
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология