Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клеточные гены, родственные генам вируса саркомы молони

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Клеточные гены, родственные генам вируса саркомы молони"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ КОЛЕКУЛЯРНОЯ БИОЛОГИИ имен* В.А.ЭНГЕЛЫАРДТА

///

АеасЛч г О £

^ ^ ° На правах рукописи

. УДК 577.214:578.828

10 ЮЧ

9о - Ьр.О0(с»^.

1 ЧУМАКОВ

ИЛЬЯ МИХАИЛОВИЧ

КЛЕТОЧНЫЕ ГЕНЫ, РОДСТВЕННЫЕ ГЕНАМ ВИРУСА САРКОМЫ КОЛОНИ

Специальность - 03.00.03 молекулярная биология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора биологических наук в ферме научного хоклада

МОСКВА, 1989

Работа выполнена в Институте молекулярной биологии имени В.А.Знгельгардта АН СССР

Официальные оппоненты:

член-корреспондент АН СССР, доктор биологических наук

профессор Е.Д.СВЕРДЛОВ доктор биологических наук,

профессор О.Л.ПОЛЯНОВСКИЯ

доктор медицинских наук А.Д.АЛЬТЖТЕНН

Ведуиая организация - Научно-исследовательский институт канцерогенеза ВОНЦ АМН СССР.

Защита состоится " "_1990 г. в часов

на заседании Специализированного совета Д 002.79.01 по заните докторских диссертаций при Институте молекулярной биологии

АН СССР по адресу: 117901, Москва, ул.Вавилова, 32

'V -

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института

иолекулярноч биологии АН СССР.

Автореферат разослан н Г_19Й9 г.

Ученый секретарь Специализированного совета канд. хим. наук А.М.Крицын

ОБДАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.Молекулярная онкобиология - бурно развипаюиаяся область современной науки.Центральным в ней )вляется понятие о протоонкогене как мишени канцерогенного мутагенеза, приводящего к инициации и прогрессии неопластического состояния клеток.Это понятие было впервые сформулировано при исследовании биологических свойств высокоонкогешшх ретровирусов. <х онкогены имеют клеточное происхождение и воили в состав ярусного генома благодаря способности рекомбинировать с эетровирусами. Такой захват клеточных регуляторних генов эетровирусами представляет собой крайний случай канцерогенной активации этих генов, при которой они приобретают способность трансформировать зараженные вирусом клетки.

Исследование ретровирусов и содержащихся в составе генома знкогенов представляет, таким образом, ключевую проблему современной молекулярной онкологии.Это направление исследований неразрывно связано с изучением роли эндогенных ретровирусов а »неогенов в процессах дифференцировки и пролиферации нормальных слеток.3 связи с этим актуальным является детальное исследование 1роцесса перехода ретровируса из экзогенного, то есть передающего )т особи к особи состояния трансмиссии, к эндогенному, мдразумевающему интеграцию в половые клетки м перенос от родителей потомству.

Непосредственно связан с этим вопрос о роли эндогенных ретровирусов в амплификации протоонкогенов в ходе формирования :емейств этих важных регуляторных зукар.ютических генов. Идентификация новых представителей семейств протоонкогенов )вляется важной предпосылкой для создания единой схемы регуляции 1ролиферации, роста м дифференцировки клеток в многоклеточном зрганкэме.

Привлекательной моделью для исследования всех этих вопросов служит комплекс вируса лейкоза-сархомы мыяей Нолони.Недефектный мрус лейкоза Иолони передается экзогенно-Тем не менее, жепериментальная инфекция вирусом оплодотворенной яйцеклетки ]риводит к рождению трансгенных животных, передающих вирус ютомству, что позволяет детально исследовать процесс образования ждогенных ретровирусов.

Вирус лейкоза Молонн в результате рекомбинационного события захватил клеточный протоонкоген c-mos и дал начало высокоонкогенному вирусу сарком» Колони.По структуре онкоген mos уникален и имеет лишь отдаленное родство с другими протоонкогенами.

Актуальной задачей является выявление других родственных протонкогену mos участков генома, исследование их связи с ретровирусныки последовательностями и изучение структуры эндогенного провируса л&йкоза Молонк.

Цели и задачи исследования. Целью раОоты было обнаружение и исследование структуры последовательностей эукарнот, родственных генам вируса саркомы кыией Молони.По задачам данная работа распадается на три раздела.

Во первых, это клонирование и сравнение структуры эндогенного вируса лейкоза Иолони с экзогенным. Оно было предпринято с целью выяснения причин, по которым два независимо полученных эндогенных провируса различаются по своим биологическим свойствам.В ходе этого этапа были клонированы гены вируса лейкоза Молонн, входящие также в состав саркомного вируса и йогувне рыть использованными в качестве гибридизационных зондов. К данной задаче примыкало такхе клонирование и другой части провируса саркомы Молони - вирусного онкогена v-mos.

Целью второго этапа 'было применение метода молекулярной гибридизации в сочетании с меледулярным клонированием для обнарухения, клонирования и детекции экспрессии клеточных последовательностей, имеювдх сходство с различными фрагментами вирусного генсьа.В качестве гибридизационных зондов на этом этапе работы были использованы рекомбинантные ДНК, полученные на первой стадии. Кроме того, был применен синтетический олигонуклеотидный зонд, специфичный к консервативному району белка-продукта онкогена ms.

Третий этап работы был посвямен исследованию первичной структуры клонированных последовательностей и анализу их родственных связей с генами вируса саркомы Иолони.

Предполагалось, что в результате решения этих задач удастся составить представление о генах эукариот, структурно родственных онкогену mos и роли эндогенных ретровирусов в активации их .экспрессии и амплификации.

Научная новизна.В ходе выполнения работы впервые были :лонировани эндогенные провирусы лейкоза Молони Mov-9 и Mov-7, юкаэана их интеграция в ДНК генома кыш.Вирусный ген ms слонирован из вирусспецифическоя ДНК, синтезированной In vitro, юказаиа его идентичность онкогену из зараженных вирусом клеток, доведено систематическое исследование распространения фотоонкогена c-mos в геноме позвоночных. Впервые показано, что у сопытных животных могут присутствовать две копии этого гена на 'аплоидный геном.

С помощью олигонуклеотидного зонда, специфичного для сонсервативного района mos-белка, продемонстрировано присутствие I геноме грибов и растений последовательностей, способных солировать этот домен mos-белка.

Впервые обнаружены и клонированы последовательности генома (еловека и животных,родственные протоонкогену c-mos.Показано, что [»«-родственные последовательности тесно сцеплены в геноме юловеха с ретровирусоподобными элементами и Alu повторами. 1айдено, что при индукции гепатом у мышей ортоамкноазотолуолом зетровирусные последовательности могут зкспрессироваться вместе с ipoTooiiKoreHOM c-mos.

Летально исследован локус ер5 человека, содержаний псевдоген dos. Показано, что его структура прервана Alu повторами. На >снованик изучения строения этого локуса и рспространения его у фугих млекопитающих было сделано предположение о его возникновении и функциональной инактивации около 70 миллионе а лет гоку назад.Обнаруженные в составе локуса ретровирусооодобнне (лементы позволили предположить участие ретрсвирусов в процессе 1упликации гена c-mos.Показано, что ретровирусоподобные госледовательносги,найденные в составе gp5, представлены з геноме <еловека большим числом копий. Идентифнцировны

шеокомолекулярные транскрипты, содержащие эти повторы.

Исследована структура фрагмента нового гена человека- son, юказано присутствие в составе его белкового продукта доменов, родственных определенным участкам mos-белка, а также (онсервативным районам белков семейства шус м ДНК-связываюмему 5елку галлмну.

Практическая ценность.В ходе выполнения работы был клонирован инфекционный провирус лейкоза Колони, использованный для создания первого ретровирусного вектора «-neo и клеток <*-1 для его упаковки в ретровирусные белки.Этот же провирус используется для создания бактериальных продуцентов ревертазы.Клонированный нами вирусный онкоген mos применяется в ряде лабораторий в качестве гибридизационного зонда для детекции онкогена и его транскриптов.

Обнаружена новая экспериментальная модель для исследования связи онкогенов и ретровирусов - гепатомы мыяея, индуцированные ортоаминоазотолуолом.

Клонированный новый онкоген-родственный ген son человека используется в ходе работ по идентификации генов, измененных в раковых клетках, ведущихся в ИМБ АН СССР и ВОНЦ АМН СССР.

Апробация работы.Диссертационная работа была апробирована на заседании научного городского семинара "Хромосома" в декабре 1988 года-Работа также доложена и обсуждена на заседании Всесоюзного Бихимического Общества в ноябре 1988 года.

Основные результаты исследований докладывались на 3-м, 4-м м 6-м симпозиумах ФРГ-СССР в 1979, 1951 и 1984 годах;на 1Х-м международном симпозиуме по сравнительному изучению лейкоза м родственных заболеваний, Пицунда, 1979 год'; на Всесоюзной конференции по рекомбынантным i ДНК,Пуиино, 1982; на 14-м симпозиуме Европейской группы поизучению онкогенных вирусов, Варна, 1982; на V-м Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов, Иосква, 1983; на 16-той Конференции ФЕБО (Москва, 1984 г.); на 8-м симпозиуме СССР-Франция "Функции белкоь и нуклеиновых кислот" (Москва, 1986г.); на 4-м и 5-м симпозиумах СССР-Италия в Киеве, 1984, и Павии, 1986; на международном совещании по онкогенам (Фредерик,CIA,1984 ) ;на 1-м Всесоюзном совещаний "Онкогены и ростовые факторы" (Кяярику, 1986 г.);на Всесоюзном съезде генетиков и селекционеров, Москва, 1987 г.);на Всесоюзной конференции "Молекулярная биология генов высшх организмов" (Москва. 1987г.);на 2-ом Международном симпозиуме по молекулярной и клеточной онкобиологии (Таллин,1988г.); а также неоднократно докладывались на московском семинаре вирусологов (МГУ) и на конкурсах работ ИМБ -АН СССР.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1- Стратегия работу и методические подходы к ее выполнению.

Начальный этап данной работы заключался в клонировании генов вирусного комплекса саркомы-лейкоза Колони.При этом нас интересовал эндогенный вариант вируса лейкоза Молони, который можно считать составной часть» генома мышей линий Mov. Клонированные геномные последовательности, содержание провирус.были затем использованы для структурного сравнения провирусов Мov9 и Mov7 друг с другом и с экзогенной формой вируса лейкоза Молони.Кроме того, было проведено клонирование онкогена вируса саркомы мышея Молони - гена v-mos.

Клонированный онкоген был использован в качестве гибридизационного зонда для демонстрации консервативности структуры протоонкогена c-nos в ходе эволюции.Этот вывод был подкреплен гибридизвционными экспериментами в которых в качестве зонда использовалась смесь олигонуклеотидов, способная кодировать консервативный пептид из структуры с-mos белка.

Клонированные гены вирусов саркомы-лейкоза Молони были применены для поиска экспрессии эндогенных последовательностей у мышей.Найдена значительная экспрессия протоонкогена mos в экспериментальных гепатомах.

Метод молекулярного клонирования был использован для выделения генов млекопитающих, обладающих лишь небольшим структурным родством с онкогеном"вируса саркомы Молони.Для этого на первом'9 этапе скрининга использовались так называемые "нестрогие" условия проведения молекулярной гибридизации, что позволило , поднять чувствительность метода.Такие условия благоприятствовали образованию молекулярных гибридов между неидентичными, но родственными последовательностями. Чувствительность гибридиэационной детекции значительно повышалась за счет применения не метода блоттинга, а прямого скринирования Фаговых библиотек, что позволило детектировать в составе генома отдаленно родственные последовательности.

На заключительной стадии работы мы определили' последовательность нуклеотидов интересующих нас клонов и провели анализ их родства с генами вируса саркомы Молони.

2.Клонирование генома эндогенных провирусов лейкоза Колони.

Геном мышей содержит множество копия эндогенных вирусов типа С. Существуют клеточные механизмы контроля экспрессии вирусных геномов и, как было показано в ряде случаев, активация инфекционного вируса может привести к индукции неопластического перерождения клеток.

Большое число копдя разнообразных ретровирусов затрудняет детальное исследование структуры и -путей активации эндогенных ретровирусов¿Оригинальная модель для исследования этих вопросов была создана в лаборатории 11Л&еп1&сП (Университет Гамбурга,ФРГ).Путем инфекции ранних эмбрионов мыаш экзогенным вирусом лейкоза Колони им получены несколько сублиний трансгенных мышей, содержащих провирусы лейкоза Колони, интегрированные в разных хромосомах. Характер экспрессии этих провирусов кардинально различен.В то время, как у мышея линии Моу-7 вирус не обнаруживается в течении всея их жизни, у мышей линии Моу-9 инфекционный вирус выделяется регулярно ухе в ходе эмбриогенезалчто привод ,т к виремии и развитие лейкозов у взрослых животных.В еще одной линии мышея- Шу-13 гомозиготное состояние летально, что позволяет предположить интеграцию в жизненно важный район хо&яйскоц ДИК. Для выяснения структурных основ этих вариация мы произведу клонирование эндогенных провирусов лейкоза Молони из генома мышея линия Моу.

2-1. Сравнение структуры клонироранных провирусов

Ноу-7 и Моу-9.

Интегрированные геномы провирусов Моу-7 и Моу-9 находятся в составе ЕсоН1 фрагментов величиноя 12,1 и 13,2 тысяч пар оснований.Мы обогатили препарат ДНК при помощи фракционирования по размерам и клонировали полученные ЕсоМ фрагменты в фаговый вектор Харон4А. Известные трудности встретились ори скрининге полученных таким образом обогащенных библиотек ввиду присутствия в мышиной ДНК множества последовательностей эндогенных ретровирусов типа С. Из-за этого нам пришлось проанализировать значительное количество индивидуальных клонов.При этом удалось выделить несколько рекоибинантов, сходных по структуре с экзогенным провирусом.Мы определили рестриктазные карты

роякрусов, показанные на Рис.1.

>ис. 1. Физические сарты клонированных •соК1 фрагментоэ юкусов Mov-7 я №оч-9 ¡пояснения в тексте).

моу7

и.. 11..

т-1—I-г-"

*Ьо1 ив Мг*1И ш

ру«а И I с«! | ; ! I

ТТ

«х>1 , Лкй]

|

№х)|

т—п—Г

птг

пг

III

-Т—Г

моу2

-!—I-

хьог Бал н^ш

(

СИ!

РЫ1 СУ1/1!

&зтК1

ХЬо1 Л чо!

Хне! НМ1

т-гт"

—Чп-

-п—I-

тгтп 1 г з

5 е

^—ь

1 ! ! , » а п о о

' ' ' Ч'

Расстояния на приведенной карте даны э тысячах пар оснований (КЬ).Прн сравнении полученных карт с картой экзогенного зровируса нами были идентифицированы полностью совпадавшие районы» показанные двойными линиями.На концах этих районов находятся длинные концевые повторы, обозначенные вертикальными чертами. По своей длине клонированные встазхи совпадали с геномными ЕсоН1 Фрагментами,* содержавши провируе.

2.2.Эндогенное происхождение клонированных ретро^ирусов.

Следующий этап работы состоял в подтверждении принадлежности этих клонов эндогенным локусам Шv-7 к Для этого мы

субклонировали фланкируюиме уникальные последовательности (показанные черными прямоугольниками ка Рис.1> и использовали их в качестве зондов для анализа геномной ДНК сублиния трансгеиных мышей. На Рис.2 показан пример такого анализа, проведенного в случае локуса Mov-9.Hr дороясу "а" нанесена ДНК исходной линии

сравнение концентрации транскриптов в разных препратах.

Для такого сравнительного аназкза транскрипции иы

воспользовались методом гибридизации in situ. В этом случае

молекулярная гибридизация используется для определения

концентрации транскриптов непосредственно в срезах тканей и может

и ее величина может служить для количественной оценки

интенсивности транскрипции.

На Рис.16 показан результат такого эксперимента для 9-ти

недельного эмбриона чОловека (гистологичесий срез любезно

предоставлен R.Ohlsson. Каролинский Институт, Стокгольм).

35

Гибридизация проводилась с меченным S зондом гена son. После экспозиции на рентгеновской пленке эачерненность индивидуальных тканей отражает интенсивное ь транскрипции гена.

Рис. 1в

Гибридизация In situ 9-ти недельного

35

эмбриона человека с меченным S зондо« гена son.

т

Такого рода эксперименты показали, что в большинстве тканей развивавшегося эмбриона человека происходит активная транскрипция гена son. Вместе с тем, в некоторых тканях, таких как печень 9-ти недельного эмбриона и в определенных участках эмбрионального мозга нблюдается повышенная транскрипционная активность этого гена. Эта активность связана со'определенными стадиями развития, так как в печени 6-ти и 12-тм недельных эмбрионов уровень транскрипции примерно тот же, что и в прилегающих мезенхимальных тканях.

Ввиду того, что в ряде случаев транскрипционная активность генов не коррелиует с концентрацией кодируемого ими белка, важным било иметь надежный метод определения белка-продукта гена son. Детекция этого белка в клетках позволила бы говорить не о

гипотетическом пептиде, а о конкретном белке с определенными свойствами.

Для идентификации этого белка мы воспользовались методами иммунохимии. С помощью компьютерной программны были найдены в структуре гипотетического белка-продукта гена son участки, для которых возможно расположение на поверхности белковой глобулм. Предполагается, что для таких пептидов велика вероятность обладать иммуногешшии свойствами и связывать специфические иммуноглобулины в нативном состоянии. Один такой пептид, закодированный аминокислотными остатками 943-963 продукта гена son (Рис.14) был любезно синтезирован для нас в отделе белкового синтеза Центра биотехнологии Каролинского Института, Стокгольм, йвешя. После конъюгирования с геиоцианином он был использован для иммунизации кроликов. В результате были получены антитела, специфические для данного пептида. С их помощью мы попытались детектировать искомый продукт гена son в лизатах клеток культуры ткани человека при помощи реакции иммунопреципиташи.

На Рис.19 показан результат такого эксперимента с использованием меченных S метионином лизатов клеток периваемой линии почки человека, трансформированной аденовирусом типа с.

Рнс.19

Авторадиографическая детекция белков..

осажденных различными кроличьими

35

сыворотками из меченных 3 лизатов клеток линии почки человека . и Фракционированых с помощь»

электрофореза в денатурируюием полиакрилачидном геле:

1-преципитация антисывороткой против пептида 943-963,

2-преципитаиия иммунной сывороткой, блокированной пептидом 943-963,

3-преципитация преиммунной сывороткой-

Видно, что в данных клетках имеется белок, с кажущейся молекулярной массой 92000, специфически реагирующий с антипептидными иммуноглобулинами. В качестве контролей мы

200-

lis-l

4tr

трансформировать клетки в культуре.Более того, оказалось, что трансформационной активностью обладает фрагмент этой ДНК величиной 2100 пар оснований, генерируемый рестриктазами Hindin ы Sali-

№ решили попытаться получить этот фрагмент и клонировать его р плаэмиду pBR322 по сайтам Hlndlll и Sali- В качестве исходного материала использовали вирионы саркомы Колони, атаки ТВ124- В продуктах расщепления синтезированной In vitro ретровирусной ДНК совместным действием рестриктаз Hindill к Sali отчетливо бил виден фрагмент величиной в 2100 пар оскозаяия.Клонировав его в pBR322, мы получилк рекокбинантную т.лазкиду ¡?126. На Ркс.З показана физическая карта этой плазииды.

Püc.S Физическое картирование рекоибинантной плазииды р126. А-рестрмктазная карта; В и С- гибридизационний анализ.(смотри пояснения в тексте).

А.

В.

—

т

•V

-1? f ,.1.1.1

-44 -2Л 13 13 086 кЬ

Двойной линией показана рекомбинантная часть плазииды; стрелками указаны сайты растепления для некоторых рестриктаз-

Для локализации последовательностей онкогена mos в составе этой плазииды ми прогибридизовали продукты расщепления р126 с меченной Р32 кДНК вируса лейкоза Молони (Рис.ЗВ» и зондом кДНК вируса саркомы Колони (Рис.ЗС). Плазиидная ДНК была расщеплена рестриктазами HlndHI+Sall (дорожка 1); рестриктазаии BellI+HlndlII (дорожка 2) и рестриктазами Xbal+НIndiII (дорожка 3). Ясно видно, что иинииальный фрагмент, гибридизуюшинся только с к ДНК саркоиного вируса, равен 1100 пар оснований (kb) и заключен между рестриктааными сайтами Xbal и Hlndlll.

Последовательности вируса лейкоза Колони тесно сцеплены с онкогеном, что подтверждает рекомбинантную природу саркомного вируса.

Для использования в качестве гибридизационной пробы мы субклокировали онкоген то s в плазмидные и фаговые векторы, а также получили субклоны, содержание половинки целого гена.Эти конструкции были применены в дальнейшей работе для детекиии последовательностей генома, родственных онкогену nos.

Примерно в то же время провнрус саркомы Молонм был независимо клонирован из ДНК трансформированиях клеток I Van Beveren et al.1981). Его рестриктазная карта полностью совпадает с опубликованной нами.Кроме того, мы определили первичную последовательность клонированного фрагмента и сравнили с последовательностью онкогена, выделенного из трансформированных клеток. Эти две структуры оказались идентичными, что подтверждает правильность использованного heîki подхода.

4.Распространение и эволюционная консервативность протоонкогена c-mos.

Многочисленные данные указывают на клеточное происхождение онкогена nos. Високоонкогешшй вирус саркомы колони был получен при пассировании вируса лейкоза Колони на кыаах.Кроме того, исходные атаммы вируса саркомы Молони кодируют онкобе^к ¡nos, идентичный продукту клеточного мывиного протоонкоогена.Мы ренили выяснить, насколько древним является, происхождение этого протоонкогена, а тем самым и функции, выполнзекоя им в клетке.

4.1 Гибридиэационныя анализ при помощи v-mos зонда.

Наиболее простым путем для исследования клеточных последовательностей, близкородственных онкогену mos, может быть геномный блоттинг-анализ. В качестве гибридизационноя пробы мы использовали клонированный нами онкоген nos.В ДНК всех исследованных нами представителей млекопитающих (более 16 видов) нами обнаружены гибридизуювиеся фрагменты.По интенсивности они соответствовали небольвоя копияности в расчете на геномныя эквивалент.Можно предположить, что скорее всего это 1-2 копии.

Таблица 1

Размеры рестриктазных фрагментов ДНК различных видов,гнОридиэуюмкеся с зондом вирусного онкогена mos.

Класс

Отряд

Представитель

о

Млекопитающие Грызуны

Насекомоядные

Зайцеобразные

Приматы

Ластоногие

Хишмые

Насекомоядные/

приматы

Парнокопытные

Непарнокопытные

Птицы

Куриные

Пастушковые

Домовая мышь Серая крыса Агути

Сирийский хомяк

Крот

Кролик

Человек

Хорх

Тмгр

Тупайя

Бородавочник

Размер гибридиэуюнмхся

фрагментов (тысяч пар нуклеотидоп)

EcoRI | Hind III

14.0 10,5 б,в 17,0 8,6 3,3 2,8 3,8 5,1 18,0

2,7; 2,0

Лошадь Пржевальского 21,5; 30,0

Фазан Султанка

14,5 7,7

14,5; 30,0;

6,2 б,б

В таблице 1 показаны значения молекулярного размера гибридизующихс* с иоэ -зондом фрагментов ДНК представителей различных отрядов млекопитающих,и птиц.В большинстве случаев те же фрагменты гибридизуются и с зондами 5/ и 3/ половин вирусного онкогена, причем интенсивность гибридизации примерно одинакова для обеих субгенных проб. Эти данные согласуются с тем , что мы сейчас знаем о структуре уже секвенированных протоонкогенов с-шо5 и дают основание предположить, что и у других видов эволюция этого гена протекала сходным образом..

Исключением является геном копытных млекопитающих- как

парно-, так и непарнокопытных.В ДНК. этих животных присутствуют два EcoRI фрагмента, реагирующих с зондом онкогена mos.Это может быть следствием либо наличия двух генов mos, либо полиморфизмом в популяции по этому гену, либо внутренним расположением EcoRI сайта в протоонкогене mos у копытных.

Для того, чтобы выбрать между этими альтернативными объяснениями, мы провели расцепление ДНК парнокопытных второй рестриктазоя -Hindill- и капли, что при этом обнаруживаются также два фрагмента, реагирующие с зондом mos.Кроме того, нами показано, что субгенные зонды, специфичные для половинок гена v-mos, гибридизуются с теми же фрагментами, что и целый онкоген.

Кроме указанных в таблице представителей копытных мы наблюдали гибридизацию mos-эонда с несколькими EcoRI фрагментами и у трех других видов животннх из этой группы.Более того, мы обнаружили идентичный паттерн из двух mos-гомологичных EcoRI Фрагментов в ДНК пяти неродственных быков. В совокупности, эти данные делают очень вероятным предположение о существовании в геноме копытных двух вариантных генов c-aos.

По всей видимости, дупликация и независимая дивергенция протоонкогена c-mos произошла незадолго до расхождения обеих предков парно- н непарнокопытных-По некоторым палеонтологческим данным это произошло 45-50 миллионов лет тому назад.

В настоящее время мы не имеем достаточно данных о функциональной роли вариантов протоонкогена mos.Возможно, что один из этих дуплицированных генов стал со времени псевдогечом и утратил свое функциональное значение.С другой стороны, существует возможность -.того, что в ходе эволюции у копытных млекопитающих появилась потребность в вариантном гене c-mos, выполняющем новую Функцию. Дальнейшие работы по клонированию и исследованию транскрипции генов mos помогут ответить на этот вопрос.

Таким образом, нами показано существование в геноме широкого класса позвоночных последовательностей родственных вирусному онкогену mos.О близком родстве этих последовательностей онкогену говорит тот факт,что они могут быть обнаружены при помощи блоттинга геномной ДНК.

4.2 Анализ при помоши специфического олигонуклеотида.

С помощью зонда вирусного онкогена mos нам не удалось обнаружить гибридизующиеся фрагменты в ДНК беспозвоночных, грибов н растении-Больаое время, прояедвее со времени дивергенции этих организмов и позвоночных могло привести к накоплению значительного числа мутационных изменений в структуре протоонкогена c-mos.

Вырожденность генетического кода обуславливает существование различных путей кодирования даже одного и того же белка- Поэтому мы предположили,что смесь синтетических олигонуклеотмдов, способных кодировать консервативный пептид из структуры mos-белка, может служить адекватным зондом при детекции нуклеиновых последовательностей, способных кодировать эту часть белка-продукта протоонкогена c-aos.

Для того, . чтобы локализовать консервативные области структуры белка-продукта протоонкогена c-aos, мы провели сравнение трех клеточных протоонкогенов mos: из генома человека, крысы и мыши.На рис.4 показаны результаты такого сравнения (дан наиболее консервативный домен этого белка).

Рис.4

Структура консервативного' пептида белка-продукта гена mos и специфческого для него олигонуклеотида.

Консенсус для.

сериновых кинг<з LH RDLKPEN D DFCF

mos мыт FLH3QSILHLDLKPAHILISEQDVCKISDFCCSQK

sos курицы FLH3QCIVHLDLKPAHILITEHDICKVSDFCIТНК mos человека ALH3Q3IVHLDLKPANILV3EQDVCKK3DFGC3KK

Консенсус для * X Е HRöt А Ы LV тирозиновых киназ

\

К DFG R

Структура выбранного пептида

Структура зонда

HLDLKPAH CT^AJCT^AJTTJCC^CC^T 5/

Структура белка-продукта гена nos имеет некоторое сходство как с сериковыйи, так и с тирозиновыми протеинкииазами (Van Beveren et al,1961) . На Рис.4 показаны для сравнения консенсусы последовательностей этих двух семейств киназ.При выборе пептида мы ориентировались на район, консервативный для ухе известных mos-белков и соответствующий консервативным участкам других киназ.

С учетом встречаемости кодонов в генах низших зукариот мы использовали смесь синтетических 23-х членных олигонуклготидов (синтезированную Друца В-В., МГУ) и показанную на Рис.4.

После соответствующего мечения эта смесь была применена для гибидизационного анализа гомологичных последовательностей в ДНК пекарских дрожжей, мукорового гриба, а также однодольных (лук репчатый) и двудольных (тыква) растении.При проведении гибридизации в строгих для этой скоси олигонуклеотидов условиях нам удалось детектировать родственные последовательности во всех этих случаях (смотри таблицу 2). В ДНК пекарских дрожжей кроме мажорных полос наблюдались также минорные компоненты, не указанные в таблице и исчезающие после отмывки при высокой температуре.

Размеры ЕсоМ фрагментов ДНК грибов и растений, гибридизуюяихся с олигонуклеотидои, специфичным для консервативного пептида из структуры поз-белка.

Таблица 2

Организм

Размер фрагментов

(тысяч-пар основания).

Пекарские дрожжи Sacharomyces cerevlsae Мукоровый гриб Cunnlngamella Japonica Лук

ЛШии сера Тыква

Cucurbita реро

6,9; 6.4; 3,6; 3,4; 2,6; 2.4

2.1

2,5; 2,6

2.4

К настоящему моменту известно несколько генов, сохранивших гомологию за время, прошедшее с момента дивергенции предков грибов и приматов.Среди них имеются и чротоонкогени - например, гены ras и Jил. Согласно последним функциональным исследованиям i F.Propst et. al-,1986), протоонкоген e-nos играет определенную роль в ходе подготовки половых клеток млекопитающих к мейозу. Можно предположить, что этот древний биологический процесс опосредуется у большинства организмов экспрессией гомологичных генов. Наш» эксперимент^ указывают на возможную древность генов, родственных с-aas. Следует однако помнить и о том, что для зонда ми использовали лишь небольшой фрагмент этого гена. Только после клонирования и определения структуры можно будет говорить о гомологическом ( то есть подразумевающим наличие общего предка ) родстве найденных последовательностей протоонкогену c-ffios.

Суммируя эту часть работы, можно заключить, что в результате использования двух независимых подходов- гибридизации с зондом онкогена V-B05 и прииенения специфичного для консервативного домена mos-белка олигонуклеотида - нами получены данные о присутствии „ родственных онкогену вируса саркомы Молони последовательностей в ДНК широкого класса организмов.

5. Транскрипция протоЬнкогена c-roos в тканях животных.

4>

Следующий этап нашей работы заключался в идентификации тканей, в которых происходит экспрессия протоонкогена c-mos. Проведение такого рода экспериментов необходимо для выяснения Функциональной роли клеточных структур, родственных генам вируса саркомы Молони. При этом мы использовали достаточно чувствительный метод РНК-блоттинга. В качестве гибридизационного зонда был применен клонированный онкоген v-mos. В ходе экспериментов мы провели скрининг широкого спектра тканей из различных линий лабораторных мышей, крыс, а также человека ( смотри таблицу 3). Нами была найдена транскрипция только в одном случае - печени нелинейной белой мыии(Рис.5 ).В других образцах печени мышей из той же партии мы не обнаруживали даже следовых количеств транскрипта гена mos.

Таблица 3.

Образцы тканей исследованных на присутствие трансхрипто»

гена с-тоя.

В числителе дано число образцов, в которых методой РНК-блоттинга обнаружены траискрипты гена с-вюл; в знаменателе общее количество исследованных образцов.

Источник ДИК : Экспрессия

c-mos

Мышь. Крыса. :

Печень Ва1Ь/с 0/3 Печень : 0/2

Печень С57В1 0/3 Perенер.печень 0/2

Печень СЗНА 0/3 Человек

Случайные, белые.:

2-3 месяца 0/3 Печень 0/1

5-7 месяцев 0/3 Мозг 0/1

12-14 месяцев 0/3 Эмбрионы 0/2

Регенер.печень 0/2 Плацента 0/1

Эмбрионы С57В1 0/2 Рак жнлудка 0/13

ОААТ-индуциров. Меланома 0/1

СЗНА гепатоиа 4/4 Хориоэндо-

Спонтан.гепатома телиома 0/1

СЗНА 0/2

Источник ДНК : Экспрессия : c-mos

Полученные данные согласуются с результатами, опубликованными другими группами исследователей (Muller et &1.1982, Vande Wbude. 1983). Согласно работе, проведенной в лаборатории G.Vande Woude, более или менее значительная экспрессия наблюдается только в половых клетках мывея и тольхо на определенной"стадии образования зрелых гамет.

Нам представлялось вероятным, что экспрессия в печени одной из исследованных нами кыией связана с какики-то особенностями в физиологическом состоянии этого животного. Однако, наки попытки обнаружить транскрипт в регенерируюоей после гепатзктомии печени мышей не увенчались успехом.

Мы предположили, что это необычное состояние связано с неопластической трансформацией клеток. Для моделирования такой ситуации мы индуцировали гепатомы у мыоей линии СЗНА введением ■мроко известного канцерогена- ортоамикоазотолуола.Развитие гепатом при этом проходит через предраковую стадию.

характеризующуюся появлением нескольких доброкачественнх узелков в пораженной печени, некоторые из которых прогрессируют затеи в гепатоиы.

А Б В Г

Г Л

^ —Í6S

Рис.5 Гибридизация образцов ^

РНК печени милей с зондом Д —т

онкогена mos. (пояснения в _,es

— 5ÍS

тексте) . —165

— 16S

— 16S

0

На рис.5 показана гибридизация образцов РНК, выделенных из контрольной, необработаноя печени мышея СЭНА ( дорожка AI, из узелков печени животных перед развитием гепатомы (дорожка Б) и из морфологически хорошо выраженной гепатомы (дорожка В). Для сравнения на дорожху Г был нанесен препарат РНК из печени ¡¡»¿-позитивной беспородной мыши.

Транскрипт, обнаруживающийся в предгепатомных узелках, имеет длину, сопоставимую с размером вирусного онкогена, и похож по своей величине на транскрипт из печени ¡¡юз-позитивной мыши. Напротив, в хорошо развитой гепатоме имеются высокомолекулярные транскрипти, содержание кодирующий район гена mos.

Наличие этого транскрипта не является, в обшем случае, маркером злокачественной трансформации клеток печени.В исследованных нами образцах спонтанных гепатом мышей не было обнаружено транскрипции гена mos. Транскрипты гена c-mos не присутствовали и в исследованных нами перевиваемых линиях гепатом, в том числе полученных из индуцированных ортоаминоаэотолуолом первичных опухолей.

Транскрипт, обнаруживавшийся в предгепатомннх узелках, имеет длину, сопоставимую с размером вирусного онкогена, и похож по своей величине на транскрипт из bos-поэмтивной мыши. Напротив,в хороио развитой гепатомс имеется высокомолекулярная РНК, содержащая кодирующий район гена mos.

Полученные результаты согласуются с предположением, что первичная активация проюонкогена mos в данной системе приводит к появлению низкомолекулярного транскрипта этого гена.Дальнейшие изменения в локусе в ходе прогрессии к гепатоме делают возможной совместную транскрипцию протоонкогека mos и некоторых других клеточных последовательностей.

Проведя гибридизацию РНК из гепатоиного материала с зондом клонированного провируса лейкоза Молони, мы обнаружили, что в предгепатомннх узелках и печени здоровых мышей линии СЗНА экспрессии эндогенных ретрошфусных последовательностей не наблюдается . В индуцированных ортоаминоазотолуолок гепатомах присходит интенсивная транскрипция этих элементов генома мыши, причем размер транскрипта совпадает с длиной РНК, содержащей последовательности протоонкогена mos а этих клетках.

Таким образом, в ходе прогрессии опухоли в данной с стеме происходит не только изменение величины транскрипта протоонкогена mos, ко и активация эндогенных ретровирусов. По аналогии с тесной сцепленностью ретровирусных последовательностей и онкогена в структуре вируса саркомы Молони, можно предположить, что в ходе канцерогенеза здесь происходит такая перестройка геномной ДНК, при которой становится возможной хоэкспрессия клеточного онкогена и ретровирусных последовательностей, с образованием единого транскрипта.

Воспроизводимость активации экспрессии протоонкогена mos и ретровирусных последовательностей в этой системе экспериментального канцерогенеза делают ее весьма привлекательной для выяснения роли эндогенных ретровирусов в активации протоонкогенов и значения этого процесса при возникновении и прогрессии опухолей. Одним из путей такого исследования могло бы стать клонирование онкоген-содержаших транскриптов, с последующим исследованием их структуры. До сих пор активация онкогена mos эндогенными ретровирусами показана лишь в одном случае экспериментальной плазмоцитомы (C.ftechavl et al, 1962 ).

б. Клонирование клеточных последовательностей, родственных онкогену Bios.

С помощью метода геномного блоттинга нами детектировались линь те родственные онкогену mos последовательности геномной ДНК млекопитающих, которые имели сравнительно больную степень гомологии с вирусным онкогеном.Мы предположили, что наряду с последовательностями протоонкогена иоs в ДНК клеток имеются также и другие гены, степеньСродства которых недостаточна для того, чтобы обнаружить их при поиоки гибридизации зонда v-mos с геномной ДНК.

Для детекции и изучения этих генов мы решили использовать ту высокую чувствительность детекции и простоту, которая характерна для метода молекулярного клонирования.В то время, как при гибридизационном анализе геномной ДНК мы имеем дело, в лучшем случае, с пикограммами индивидуального гена, при хлоннрованмн, в реплике фагового' рекомбинанта присутствует на несколько порядков больше ДНК. Кроме того, выбранный нами подход включал х проведение молекулярной гибридизации при так называемых "нестрогих" .условиях, отличающихся от стандартных на 10°С. При этом мы надеялись обнаружить в клонированном материале последовательности, отдаленно родственные примененному в качестве зонда вирусному онкогену sos.

Первый этап работы мы провел^ на геномных библиотеках мыши, крысы и человека. Обнаруженные клоны, гкбридизуюшмеся с зондом онкогена при гибридизации в "нестрогих" условиях, были затем тестированы ьа наличие гибридизации с этим же зондом при стандартных условиях. Отобранные по такой схеме рекомбинантные клоны были затеи картированы, атрибутированы в геномной ДНК и частично секвенированы с целью идентификации участков, ответственных за гибридизацию с зондом вирусного онкогена. Кроме того, нами произведено картирование расположения в этих клонах повторов типа Alu к последовательностей, родственных репликативным генам вируса лейкоза Молони.Была также предпринята работа по обнаружению транскриптов последовательностей, входящих в состав выделенных клонов.

На втором этапе нами бил выделен из кДНК-библиотеки генов,экспрессируюоихся в печени человека, клон, обладающий отдаленным структурным родством с последовательностями онкогена mos. Этот факт был продемонстрирован также при помощи секвенирования mos-родственного участка. Вблизи от этого участка била обнаружена также область гомологии с пептидом чз консервативного района белков-продуктов генов семейства аус и ДНК-компактизующим белком галлином.

6.1 Участки генома.отдаленно родственные онкогену mos.

Использовав описанную выше процедуру поиска родственных онкогену mos последовательностей применительно к сконструированной нами библиотеке генов человека в фаге Харон4А, иы выделили 19 рекомбинантов, 4 из которых гибридизовались также и в стандартных условиях с зондом онкогена v-mos. На Рис.б показаны рестриктазные карты этих рекомбинантов-E-EcoRI;X-XbaI;H-HlndIII;

Рис. 6 Рестриктазное картирование геномных клонов выделенных по гибридизации с зондом v-mos (пояснения в тексте)

В-ВашН1. Заштрихованы фрагменты, отжигающиеся с зондом вирусного онкогена в стандартных условиях гибридизации (бхБгС; 65°С). Представленные на этом рисунке рекомбинантные клоны ерЗ. до7, УС24 и УС212 выделены при скрининге геномной библиотеки человека.

Обращает на себя внимание то, что ни один из представленных, на рис.б рекомбинантных клонов не похож по своей рестриктазной

карте на протонкоген c-mos. Более того, в некоторых рекомбинантах области гомологии с геном mos имеют прерывистую структуру и по протяженности больше , чем размер протонкогека c-aos.

Сходным образом мы выделили участки генома домовой мыши и серой крысы, гибридизуюшиеся с онкогеном v-mos. Эти клоии также имеют отличия по рестриктазным картам как друг от друга так и от с-mos генов мыши и крысы.

6.1.1 Структура локуса gp5 человека.

В качестве объекта для более детального исследования структуры mos-родственных участков мы выбрали рекомбинантний фаг \gp5. На рис.7 дана его öoj.oe детальная рестриктазная карта. Видно, что в составе этого рекомбннанта имеются три дискретных участка, гибридизуюшихся с зондом онкогена mos (показаны зачерненными прямоугольниками). Как и многие участки генома человека, исследуемый район содержит также повторы типа AI и (показаны штриховкой).

Fr, т fc»*I f««

*** Ii ля 1 ГЬяТ M/.JlT IT ft . Г

Рис.7

Рестриктазная карта рекомбинанта ер5-(пояснения в тексте).

CL-1

Неожиданным для нас было обнаружение в составе данного рекомбинанта последовательностей, гибридизуюшихся с зондом вируса лейкоза Молони (показаны незаполненными прямоугольниками).Из анализа взаимного расположения этих трех типов последовательностей - А1и повторов, участков гибридизации с онкогеном вируса саркомы Колони и ретровирусоподобными элементами- следует, что содержащие их фрагменты не обязательно совпадают друг с другом.

Опыты по обратной гибридизации иммобилизованных на фильтре Фрагментов клонированного провируса лейкоза Молони с меченным зондом рекомбинанта и>5 показали, что в структуре этого клона

имеются последовательности, родственные не только генам gag, pol и env ретровирусов, но и участку большого концевого повтора.

Для атрибутирования рекомбинанта гр5 геному человека ми субклонировали уникальные, не содержание АЗп-повторов фрагменты этого клона, и использовали их в качестве зондов при анализе геномной ДНК человека.На Рис.в показаны результаты такого анализа. Субклонированный уникальный участок из EcoRI

/ г 3

Рис .8

Гибридизационная детекция локуса gp5 человека, (пояснения в тексте).

Втпн ДО CD

Фрагментов gp5 метили и гибридизовали с геномной ДНК человека (дорожка 1); мыши (дорожка 2),обработанных рестриктазой EcoRI, и Юре ДНК фага \gp5, гидролизованной тем же ферментом (дорожка 3 (.Гибридизация с зондом из EcoRI фрагмента фага \gp5 размером 6 тысяч пар нуклеотидов.

Из этих данных следует, что в геноме человека присутствует участок, представленный в рекомбинанте gp5 и не претерпевший сильных изменений в ходе клонирования.

Для выяснения степени родства клонированного локуса с онкогеном v-mos мы определили последовательность нуклеотидов участка этого локуса, обозначенного на Рис.8 буквами HV. Как следует из карты, данный район содержит также Alu повторы. После определения первичной структуры района NV, мы обнаружили в его составе три повтора такого типа, мало отличающиеся от консенсуса. Между ними были расположены участки, родственные фрагменту меаду 846 и 1058 нуклеотидами человеческого протоонкогена c~mos.

Взаимное схематическое расположение этих участков показано на Рис.9. Зачернены места совпадения между последовательностями района HV локуса gp5 и участками протоонкогенов c-mos человека и

мыши. Гомология между протоонкогенами в данной области примерно 75%, сходство между каждым из них и gp5 ~ 53-60Х.i-c-nos человека,2-gp5,3-c-mos мыши.

Рис.9

Взаимное расположение районов сходства между локусом gp5 и протоонкогенами e-mos и повторами типа Alu в участке NV локуса gp5 человека.¡пояснения в тексте).

c-ffios человека

Нам не удалось обнаружить участков, похожих на консенсус для сигналов сплайсинга РНК в пределах секвенированного района. Кроме того, зо всех трех рамках этоя последовательности имеются терминирующее кодоны.Сопоставив полученные данные с фактом наличия сходства с протяженным районом протоонкогена с-тог мы сделали предположение, что в участке НУ локуса ер5 человека расположен псевдогек.

Существует методика определения времени дивергенции активных генов и псевдогенов, которая исходит из разиоя скорости накопления синонимических й изменяющих замен в составе кодирующего участка генов. Применив ее к рассматриваемому случаю, мы подсчитали, что независимое развитие и инактивация района НУ и протоонкогена с-шоб произошли около 65 миллионов лет тому назад.Это соответствует примерно моменту расхождения предков приматов и грызунов.

проведенные нами эксперименты по гибридизационому анализу £НК различных групп. млекопитающих показали, что с помощью высокомеченного зонда из области ЫУ локуса ер5 гомологичные Фрагменты могут быть обнаружены только у приматов и грызунов.

что вполне соответствует сделанному внше выводу о недавнем происхождении локуса ер5 человека.

Кроме того, многочисленные отрицательные эксперименты по детекции транскриптов, содержащих участок ¡IV, в РНК из различных ткслей человека позволили сделать вывод о функциональной неактивности этого района.

Единственный факт, противоречащий такому утверждению, заключается в обнаруженной нами консервации размера ЕсоМ-фрагментов локуса £р5 в геномной ДНК обезьян Старого Спета и человека. Этот удивительный результат был подтвержден с использованием трех удаленных друг от друга зондов и вряд ли может объясняться простым совпадением. Можно предположить, что данный участок несет какую-то функциональную нагрузку у приматов, не обязательно связанную с наличием в его составе псевдогена тоя.

Кроме участка НУ мы определили первичную структуру области, обозначенной нами как СИ смотри Рис.7), локуса яр5. По данным гкЗридизационного картирования, эта область гокологична участкам генома недефектного ретровируса лейкоза Молони.Анализ этой структуры показал наличие в ее составе участка, похожего на район 05 длинного концевого повтора ретровирусов(Рис. 10).

Хотя общая степень гомологии между этими двумя последовательностями не очень большая, она имеет примерно ту же величину, что и степень сходства между 115 районами отдельных ретровирусов. Для больших концевых повторов ретровирусов характерно также наличие фланкирующих динуклеотидов СА на их концах,непосредственно перед местом связывания клеточной т-РНК, служащей для затравки синтеза к-ДНК. В нашем случае слева к области - гомологии примыкает участок, с которым может гибридизоваться метиониновая т-РНК из клеток человека.

Рис.10

Сходство между фрагментом последовательности области С1. локуса гр5 и 45 концевым районом ретровирусов ( • - совпадающие нуклеотиды-, - - делеими введенные в ходе сравнения)-Нижняя строчка- последовательность из фрагмента С1. локуса ер5; 1- 1/5 вируса леш.оза Молони; 2- 115 эндогенного вируса павиан; 3- 115 вируса некроза селезенки; 4- 115 вируса саркомы Рауса; 5- Ш>

вируса рака молочных желез мышея. 1

TCGCTGTTCCTTGCGACGCTCTCCTCTGAG—TGATTGACTACCCGTCACCGGCGCTCTTTCA

mm т ж т ********* ж штт ж* тж тжтжж жж ж ж жт жж

TC-CAGCTACTTGGGAGGCTGACGCAGGAGGATGGCTGGA-ACCCGGGAC-GTCAAGGTTGCA 2

TTCTGTG—rTGGGTCC-TTCCTCGCGCCGA-CTCTCAAACCCTACGAACGTGATTCTAACA

* «I Ш * ** ««Ж** 4t» * * **

TCCAGCTACTTGGGACGCTGAGGCAGGAGCATGGCTGGAACCC—GGGACGTCAAGGTTGCA

3

GCTCCCCTACT-GGCTGCCCGCAGGGATCCGCA---CT-GAATCCGTAGTACT-TCGGTACAACA

m ж жжжжж жжж жж ж жжж ж жжж жж тжж ттж ж т жжж жж

TCCAG-CTACTTGGCAGGCTC-ACCCAGGrtGGATGCCTGCAACCCC-GGAGGTGAACGTT—GCA

4

TG-ATGGCC—GGACCGTTGATTCCCTGACGACTACCAGCA-CCTGCATGAAGCAGAAGCCTTCA

ж Ж Ж ЖЖ Ж 41** * ** ** * * * ** * * * ***** * **

TCCACCTACTTGGCAGCCTCAC-CCACGACCATCGCTCCAACCCCCGAGGT----CAAGCTTCCA

5

Т-САСТТТС—CAGAGGGTCCCCCCGCAG-ACCCCCGCCACCTCAGGTCGGCCGACTGCCGCA

* ** * * *¥** * Ж * ** * * * ** * * ** ** ** * ***

TCCAGCTACTTGCGACGCTCAGGCACGACGATCCCTG-CAACCC-CCGAGGT-GAAGCTTCCA

Гибридизационные опыты с геномной ДНК человека, а также скрининг библиотек генов человека привели нас к выводу, что данная ретровирусоподобная последовательность представлена также и в других участках хромосом,а обяее количество копия равно примерно 50000 на гаплоидный эквивалент. Аналогия с эндогенными ретровирусами усиливается также тем,что в клетках человека была обнаружена высокомолекулярная (5-10 тысяч нуклеотидов> гетерогенная полиаденилированная РНК, содержакая данный элемент вблизи своего эЛсониа-

Таким образом, при помощи молекулярного клонирования нами било продемонстрировано наличие в геноме человека

последовательностей, отдаленно родственных протоонкогену c-nos, сделано предположение о и* функциональной неактивности и обнаружены ретровирусоподобные элементы в непосредственной близости от них.

6.1-2 Хромосомная несцепленность mos родственных генов.

В связи с обнаружением нами в геноме человека и других животных нескольких генов, родственных онкогену mos, возникает

вопрос о происхождении этих генов. На молекулярном уровне хорошо исследованы случаи дупликации генов за счет удвоения целого участка хромосомы, содержащей данный ген. Гораздо реже генные семейства возникают за счет переброски новой копии в другой участок хромосомы или в другую хромосому. Одним из механизмов, по которому происходит такая транслокация, может Сыть внедрение ДНК ко!н:и транскрипта гена в новый участок генома - процесс, предполагающий наличие в клетке большого количества ревертазы-Теоретически, можно себе представить вариант, когда такой процесс облегчается за счет участия ретровирусных последовательностей в формировании первичного аномального транскрипта, его последующей обратной транскрипции и реинтеграции в другой участок генома.

Мы предположили, что именно за счет такого механизма произошла дупликация гена с-поя, приведшая к возникновению локуса £р5. Большое время, прошедшее с момента дупликации, не позволяет достоверно доказать эту гипотезу. Однако, можно проверить некоторые следствия, вытекающие из нее.

Одним из признаков, позволяющих в какой-то степени дискриминировать тот или иной механизм дупликации, может служить хромосомная локализация двух генов. Дупликация целого участка хромосомы обычно не приводит к его транслокации; две копии гена имеют тандемноэ расположение в одном и том же участке генома. Ретропозиция, с большой вероятностью, приводит к изменению хромосомной локализации новой копии гена.

Отдавая себе отчет в условном характере данного положения, мы решили проверить степень сцепленностм генов с-тоз и вр5, так как локализация на одном участке хромосомы определенно говорила бы о тандемной дупликации.

Для проверки этого положения мы воспользовались методикой анализа геномной ДНК соматических гибридов между клетками человека и хомяка. Как известно, в таких гибридах происходит выщепление человеческих хромосом, что приводит к образованию клонов, содержащих полный набор хромосом хомяка и разное число хромосом человека. В качестве родительских мы использовали диплоидные фибробласты человека и клетки хомяка, дефектные по гену гуанингипоксантинфосфорибозилтрансферазы и устойчивые к убаину. Наличие этих маркеров позволило бистро и надежно получать гибриды.

D дальнейшей, препараты ДНК , выделенной из индивидуальных клонов, анализировали на присутствие генов c-aos и gp5 человека при понови Олоттинг-гибридизации с специфическими для данных генов зондами. При такого рода анализе было обнаружено несколько соматических гибридов, содержащих только один из этих генов, что указывает на их хромосомную несцепленность и делает гипотезу о дупликации за счет ретропозиши более вероятной;

6.1.3 Структура транскрипционно-активного гена son человека. ;>

Наряду с поиском гомологичных онкогену fflos последовательностей в геномных библиотеках человека и животных нами был предпринят аналогичный эксперимент, но с использованием библиотеки кДНК копий транскриптов. экспрессирующихся в тканях печени человека- Исходная библиотека в фаге gtll была любезно предоставлена нам E.F.Fritsch (Мичиганский Университет). В ходе скрининга был обнаружен рекомбинант, вставка которого отжигалась с онкогеном v-mos в "строгих" условиях гибридизации (Рис.11). На этом рисунке дана гибридизация ДНК трех рекомбинантов после гидролиза ферментом EcoRI и последующего электрофореза в агарозном геле.

Рис.11

Гибридизация трех кДНК-клонов из печени человека с зондом онкогена v-mos. (пояснения в тексте)

Первоначально эти бактериофаги были выделены при помощи гибридизации в других, "нестрогих" условиях. Из Рис.11 видно, что ДНК только одного из них (обозначенного нами как ХзопЗ), нанесенная в данном эксперименте на дорожку 3, способна гибридизоваться с зондом у-тоз в стандартных условиях отжига.

Мы исследовали структуру этого рекомбинанта более подробно-После реклонирования оказалось, что мы имеем дело с

EcoRI фрагментом величиной 1400 пар оснований. Этот фрагмент составляет линь часть длинного (около 9 тысяч нуклеотидов) транскрипта, обнаруживаемого в РНК тканей человека при помощи вопЗ-зонда.

Для того, чтобы иметь представление о функциональной е^эпюсти клонированного нами транскрипта, ми использовали меченный зонд son3 для детекции гомологичных

последовательностей в геномной ДНК ряда позвоночных животных-Оказалось, что этот зонд гибридизуется с неболыаим числом полос в EcoRI-гидролизатах ДНК млекопитающих и птиц. На Рис.12 представлены результаты этого эксперимента в случае млекопитающих разных отрядов.

Рис.12

Детекция EcoRI фрагментов, родственных гену son человека в геномной ДНК нлекопитаюших 1- морж, 2- кролик, 3- крот, 4- слон. Гибридизация с зондом son3 в строгих условиях.

12 3 4

ч"

Довольно сильный сигнал ми наблюдали также при использовании ДНК таких животных, как крокодил и лягушка. Эти данные говорят о эволюционной древности локуса son, и о консервации его структуры в ходе дивергенции групп позвоночных животных. Кроме того, проводя молекулярную гибридизацию с зондом son3 в "нестрогих" условиях, оказалось возможным обнаружить родственные последовательнсти в геноме дрозофилы.

Используя зонд son3 для гибрндизационного поиска в библиотеках кДНК транскриптов плаценты человека, мы получили набор перекрывающихся клонов общей протяженностью 3,2 тысячи нуклеотидов. Некоторые из этих клонов имели полиА тракт на одном из концов, в то время как другие имели происхождение за счет

внутренней инициации реакции обратной транскрипции.

На протяжении 300 нуклеотидов, примыкающих к полиА-тракту имеется множество стоп-кодонов во всех трех рамках считывания. В этой области расположен элемент, ответственный за полиаденилирование первичного транскрипта, а также несколько копия AU-богатых последовательностей, определяющих стабильность информационных РНК высших эукариот. Остальная часть определенной нами последовательности содержит единственную протяженную рамку кодирования белка.

Ми провели анализ представленности данной

последовательности в последних версиях банков данных EMBL, NBRF, SWISS PROTEIN и СепеВапк.Нам не удалось обнаружить сильно родственных последовательностей ни в одном собрании нуклеотидиых и белковых структур определенных на данный момент.

Гипотетический белковый продукт нового гена, который мы предложили назвать son, имеет отчетливую доменную структуру. Сравнение этих доменов, выделенных исходя из профиля гидрофилыюсти и зарядов, с индивидуальными белками из банков данных также не привело к выявлению высокогомологичных белков. Единственным исключением может служить небольшой основной ДИК-компактизуюпий белок галлин из спермы петуха, имеющий гомологию с центральным доменом гипотетического белка-продукта гена son (смотри Рис.13).

Рис-13

Сравнение пептида из структуры белка-продукта гена son с последовательностью галлина петуха.

пептид son

674 676

RSRSVGRRRSFSISPSRRSRTPSRRSRTPSRRSRTPSRRSRTPS.RRSR..TP3RRSRTPSRRRRSR

* я* «ж яя »** яя *•*« яя т я я*яя я* я яяяя» ш

RYRSRGHSBSRRT.RRRRSPRSCRRRSPRRRRSR...RRRRYCSARRSRRSCGVRRRRYGSRRRRRR 2 64

галлин петуха

По аналогии с функцией галлина можно предположить, что эта

часть son-белка имеет отношение к связыванию ДНК. непосредственно примыкает к неп домен , сходный с белковыми последовательностями, определяющими ядерную локализацию многих клеточных и вирусных белков. Этот район имеет также простой состав и повышенную концентрацию остатков лизина и гидроксил-содержаших аминокислот. Рис.14

Последовательность участка гипотетического белка-продукта гена son человека, содержащего область белковых повторов (пояснения в тексте).

400 410 420 430 440 450 46Q

HLDLPSHHHLVSKBTEEPLPYKESDQTIAALL5PKESSCGEKEVPPPPKETLPDSGFSAHI

470 480 490 500 510 520 530

EDIHEADLVRPLLPKDMERLTSLRAGIEGPLLASDVCRDRSAASPVVSSMPERASESS5EE

540 550 560 ' 570 580 590 600

KDDYEIFVKVKDTHEK5KKNKHRDKGEKEKKRDPHLRSRSKRSKS5EHKSRKRT5ESRSRA

610 620 630 640 650 660 670

RKRSSKSKSHRSQTRSRSRSRRRRRSSR3RSKSRCRRSVSKEKPKRSPKHRSKSRERKRKR

680 690 700 710 720 730 740

SSSRDNRKTVRARSRTPSRRSRSHTPSRRRRSRSVCRRRSFSISPSRRSRTPSRRSRTPSR

750 760 770 780 790 800 810

RSRTPSRRSRTPSRRSRTP3RRSRTPSRRRRSRSVVRRRSFSISPVRLRRSRTPLRRRFSR

820 830 840 850 890 900 910

SPIRRKRSRSSERCRSPKRLTDLDKAQLLEIAKAMAAAMCAKAGVPLPPHLKPAPPPTIVE

920 930 940 950 960 970 980

KVAKKSGCATIEELTEKCKQIAQSKEDDDVIVHKPHVSDEEEEEPPFYHHPFKLSEFKPIF

Гомологичный галлину участок входит в состав области белковых псвторов. Эта область хорошо видна при матричном анализе белка-продукта гена son (Рис.15). Здесь, при матричном сравнении

Фрагмента пептида, закодированного в исследуемом траискрипте с самим собой видны разные формы повторов и взаимная ориентация их относительно друг друга. Можно сделать вывод, что в данном районе присутствуют по крайней мере пять дискретных субдоменов, содержащих белковые повторы.

Рис-15 Повтори в центральной гол-белка.

структуре части

. -, V

г

ч

1 1 1

У"

[

Наиболее характерным является прямой белковый повтор, который мы обозначили как повтор типа А:. треонин-пролин-серин-аргинин-аргинин-серин-аргинин, тандемно

повторенный 6 раз (Рис.И). Этот же пептид встречается еве один раз ближе к Н-концу области белковых повторов.

Сходный мотив повторов сохраняется слева и справа от совершенных повторов. Возможный консенсус для этих неполных повторов похож на последовательность совершенного повтора. По аминокислотному составу ' область повторов богата гидроксил-содержащими аминокислотами - треонином и серином, заметающими в ряде случаев друг друга в индивидуальных повторах; пролином и аргинином, часть остатков которого замешена в индивидуальных повторах лизином. Пролин встречается в несовершенных повторах реже , чем в совершенных и имеет тенденцию к замещению аргинином. Область несовершенных повторов отмечена на Рис.15 прерывистой линией-

Статистический анализ этой области указывает на

существование значительной периодичности на уровне третичной

структуры. Этот основной, гидрофильный домен образован аминокислотами, склонными к участию в а-спирализации. Остатки пролина обуславливают поворот сегментов а-спиралея относительно друг друга.

Eue ближе к N-концу белка расположена область, богатая основными аминокислотами- лизином и аргинином, а также серином и трр^нином. В этой области, однако, уже довольно трудно вычленить отдельный элемент повтора. Здесь расположены пептиды, напоминающие по последовательности элементы, определяющие ядерную локализацию многих белков - например, Т-антигена вируса 5V-40.

Непосредственно за районом прямых повторов в структуре гипотетического белка находится область, похожая на фрагмент центрального участка белка-продукта онкогена mos (Рис-16). Нумерация аминокислотных остатков на этом рисунке соответствует нумерации, показанной на Рис.H для области, окружающей район белковых повторов son-белка. Совпадающие аминокислотные остатки показаны знаком ».

Рис.16

Гомология между фрагментами œos-белка и гипотетического белка-продукта гена son.(пояснения в тексте).

son пептид

808 843

ACVPLPPHLKPAPPPTIEEKVAKKSCCATIEEL.TEKCKQ

« я ттшя « * ж ж ж ж ж ж

3IVHLD..LKPANILISEQDVCKISDFGCSEKLEDLLCFQ 187 213

c-aos пептид

По всей видимости, эта область и определяет наблюдаемую нами гибридизацию между онкогеном mos и фрагментом гена son человека. Возможно, что стабилизации молекулярных гибридов способствовал повышенный СС состав этого района.

Кроме этого есть еще один участок онкобелка mos, похожий по структуре на определенную нами последовательность. В последовательности онкобелка, вблизи его N-конца, имеется домен, ответственный за АТР-зависимое связывание ДНК (G.Vande Woude et

al,t9&6t я имеющий сходство с элементом белкового повтора son-белка-

С другой стороны от области белковых повторов белка son расположен участок, обладающий гомологией с белком-продуктом ядерного онкогена туе- Этот фрагмент представлен на Рис.16 (нумерация sori-белка как на Рис-13; совпадающие аминокислотные остатки отмечены знаком »). Как и в случае родства с белком mos и Таллином, кы принимали во внимание только напрямую совпадающие аминокислотные остатки и не учитывали функциональные замены. Обиая степень гомологии достигает здесь 30*.

Рис.16.

Гомология между белком-продуктом гена son и онкобелком гаус. ((пояснения в тексте).

son пептид 430

LLSPKES.SGCEKEVPPPPKETLP.DSCFS.AMIEDINEADLV____RPLLPKDMERLTSLRACI

ЗИ«: * £3 * * V ЯЕ* * * « Ж и V « «а

LLSSTESAPQGSPEPLVFHEETSPTTSSDSEEEQEDEEEIDVVSVEKRQAPGKRSE.SCSPSACG 224

с-туе пептид

523

TGPLLASDVGRDRSAASPVVSSMPERASESSSEEKD

а & ЯП * «ж

HSKPPHSPLVLKR____CHVSTHQHNYAAPPSTRKD

319

Ядерные белки, продукты генов семейства туе, консервативны по своей структуре и выполняют в клетке ряд регуляторных функция, связанных с пролиферацией и дифференшровкой. Предполагается, что онк являются составной частью белковых комплексов, контролирующих транскрипцию при помощи взаимодействия с регуляторными элементами генов. Отдельные гены этого семейства, насчитывающего, по краяней мере, пять индивидуальных членов, имеют гомологию друг с другом в области наблюдаемого родства с геном son.

Можно предположить, что консервативные участки данных белков

выполняют сходную функцию а ответственны за связывание с определеныии белками или элементами ДНК. Тогда гомология между myc-белками и белком son может означать либо конкурирование за обиие места связывания, либо выполнение этим белком сходкой с тус-белкаки функции. Наличие в составе белка-продукта гена son гакже и других доменов, не представленных в myc-белках, делает первое предположение более вероятным.

Наблюдаемая степень гомологии между с-туе белком и продуктом гена son примерно одного порядка, что к в случае родсгва кекду с-пус и генами MyoD и ииогенина. Эти важные регуляторные гены участвуют в процессе терминальной дифференциации мкобластоз. В литературе активно обсуждается гипотеза, что родстэенкне последовательности участвуют в конкурентном связывании ДНК-узиаюиих факторов и тем самым опосредуют баланс нехду дифференцировкой и пролиферацией клеток. Интересным в этой связи представляется факт, что онкобелок mos обладает ДНК-связывашея активностью и что его домен участвующий в этом связывании имеет сходство с определенным фрагментом структуры son белка.

Несмотря на существование областей частичного сходства между son-белком и онкогенами mye, mos, а такжв Таллином, общая структура исследуемого белка совершенно уникальна и не имеет никаких аналогий с определенными до сих пор пептидами. Исходя из некоторого сходства одного из доменов этого белка сДНК-связывающими и ядерными белками, можно предположить, что он имеет ядерную локализацию и выполняет регуляторные функции в ходе пролиферации или дифференцировки клеток человека. Консерватизм его структуры говорит , по-видимому, о важности этих функций для позвоночных животных.

Одним из подходов в исследовании функции новых генов может быть идентификация тканей и клеток, для которых характерна транскрипционная активность данного гена и идентификация соответствующего белка-продукта.

При помоши гибридизационного Northern-анализа препаратов РНК, выделенных из образцов плаценты и эмбрионов человека мы показали присутствие в них значительной концентрации транскриптов гена son. Активная транскрипция наблюдалась на всех стадиях развития эмбриона человека. В этом случае, ввиду большого размера 19 тысяч нуклеотидов) РНК трудно проводить количественное

иная 129; на дорожку "Ъ" ДНК гетерозиготной по Моу-9 мыви, а на дорожку "с" ДНК гомозиготы.Все ДНК Оыли обработаны Есой1; гибридизацию проводили с зондом клеточной примыкающей последовательности.Как и следовало ожидать из физической карты, в геноме исходной линии мышей присутствует фрагмент длиной 4,4 тысяч пар основании (кЬ1, который дал после интеграции 8,8кЪ провируса Мололи фрагмент длиной 13,2кЬ.

а Ь о

кЬ

Рис.".Идентификация клоточного происхождения клонированного ЕсоШ фрагмента рекомбинанта рИоу-9 (пояснения в тексте).

Аналогичным образом была подтверждена структура клонированного провируса Mov-7. Эти данные указывают на то, что эндогенные провирусы лейкоза Молони интегрированы с клеточной ДНК и могут рассматриваться как составная часть генома трансгенных

кынеи.

Мы определили инфекционность клонированных провирусов для клеток культуры ткани при помощи ХС-теста. Оказалось, что удельная инфекционность провируса Mov~9 более чем на три порядка выше инфекционности клонированного провируса Mov-7.Здесь наблюдается прямая корреляция между характером активации эндогенного провируса и его инфекционностью после клонирования. Более детально этот вопрос исследовался в серии экспериментов по созданию рекомбинантов между провирусом Mov-7 и недефектными провирусами.При помоши данного подхода нам удалось показать,что малая инфекционность Mov-7 связана с дефектом в гене gag, кодирующим внутренний капсидный белок вируса лейкоза

Молони.Фланкирующие клеточные последовательно™ не играют здесь особой роли и не несут, по всей видимости, важной для орган ;;жа информации.

В ходе работы нами (совместно с д-ром К.Харберсом, У«ч_оситет Гамбурга) бил также клонирован ьровмрус Mov-13. Долгое время не удавалось получить гомозиготных по этону локусу мыкай. После клонирования и анализа фланкируюиих последовательностей нами было обнаружено, что интеграция произошла в область важного гена, функционирующего в ходе эмбриогенеза. Впоследствии было найдено, что это один из генов, кодирующих коллаген.

Таким образом, различия в биологических особенностях сублиний мышей, несущих вариантные формы эндогенных яровирусов могут быть опосредованы как структурными особенностями самих аровирусов, так и точкой интеграции в клеточную ДНК.

Клонированнче провнрусы лейкоза Молони и в особенности инфекционный Mov-9 нашли широкое применение в конструировании ретровирусных вечторов, получении бактериальных продуцентов ретровирусных белков и в качестве гибридизационных зондов для обнаружения последовательностей ретровирусов типа С. Провирус лейкоза Молот« обладает удобным расположением рестриктазнмх сайтов, позволяющим в чистом виде иметь зонды, специфичные для отдельных генов ретровирусов.В нашей работе мы использовали элюированные фрагменты клонированных провирусов для детекции родственных последовательностей в исследуемых нами рекомбинантах.

3. Клонирование онкогена вируса саркомы Молони.

Високоонкогенный ретровирус саркомы Молони содержит в своем составе особый ген - mos, отсутствующий у родительского вируса лейкоза Молони и определяющий трансформационную активность саркоиного вируса. Нам было необходимо иметь этот ген в чистом виде.Так как ретровируси содержат РНК в качестве генетического материала, а ДНК- содержащий провирус образуется в крайне низких концентрациях, то наиболее простым выходом из этого положения являлось молекулярное клонирование вирусной ДНК.

К моменту начала работы было показано (Andersson, 19в0>, что при обратной транскрипции вирусной РНК, содержащейся в вирионах вируса саркомы Молони можно получить ДНК, способную

использовали иммунную сыворотку после блокирования ее исходным вевтмдои, а также преиммунную сыворотку от того же животного.

Сходный белок мы наблюдали в клетках первичных фибробластов человека, а также в перевиваемых крысиных клетках RAT2. Для всех этих клеток характерна активная транскрипция гена son.

Многие белки с высоким содержанием пролина или основных аминокислот ведут себя аномально при электрофорезе в денатурирующих условиях. Поэтому значение молекулярной массы белка-продукта гена son как 92000 можно считать линь приблизительной оценкой. 1 Кроме того, в составе последовательности этого белка имеются два потенциальных сайта для N-гликозилирования и много мест для фосфорилирования сАМР-завмсимой протеинкиназой. Эти модификации могут также искажать значение оценки молекулярной массы исходя из подвижности при ¿летрофорезе.

Таким образом, мы показали, что в клетках человека и животных присутствует белок-продукт гена son. Это открывает возможность для исследования роли этого гена в метаболизме клеток, его взаимодействия с другими белками и выяснения функционального значения описанной выше гомологии с генами mos и туе.

7. Направления изменчивости клеточных генов.родственных генам вируса саркомы Молони-

С помощью сочетания, молекулярной гибридизации, клонирования и секвенирования генов, исследования их функциональной экспрессии, нам удалось показать наличие в геноме и исследовать структуру генов, обладающих разной степенью сходства с генами высокоонкогеного ретровируса саркомы мышей Молони.

Это были прежде всего гены эндогенного провируса лейкоза Молони и клеточный аналог вирусного онкогена - ген c-bos. 3 этом случае, как было показано большим числом исследований на аналогичных моделях, речь идет, по всей видимости, о родстве, об ясняемом недавним общим происхождением и последующей дивергенцией последовательностей.

Перейдя затем к исследованию mos-родственных

последовательностей у более отдаленных в эволюционном отношении

животных, ми в ряде случаев уте не били уверены в том, что наблюдаемое родство с генами вируса саркомы Колони отражает процесс дивергенции или конвергенции изучаемых последовательностей-

Эта дискриминация еще более затруднена при анализе отдаленно родственных структур - таких, как псевдоген gp5 или ген son человека. Выделенное с применением сочетания необычайно чувствительных методов молекулярной гибридизации и клонирования, эти гены обладают , за счет древности своего происхождения, линь малой степенью сходства с вирусным онкогеном. Нам представляется, что вопрос о происхождении такой гомологии не имеет, по крайней мере в настоящее время, особого смысла. Нам представлялось важным, что применяя сочетание этих методов стало возможным идентифицировать в геноме и изучить структуру последовательностей, имеюних ряд функциональных аналогий с генами высокоонкогенних ретровирусов. Можно предположить, что в будунем, после исследования структуры некоторой части генома животных, станет возможным ввести более строгие критерии и обратиться к вопросу о важности сходства и различий, возникающих за счет конвергеними или дивергенции.Отсюда следует, что сравнение структур отдаленно родственных последовательностей друг с другом имеет в настоящее время преииуяественно эвристический характер, указывая на правомочность того или иного направления в исследовании функций этих последовательностей-

9 *

•

Мы исследовали различные по структуре, функциям, а возможно и происхождению гены, родственные генам вируса саркомы Молонк. Входящие в их состав элементы - ретровирусные последовательности и онкогены - считаются в настоящее время основными участниками канцерогенного спонтанного мутагенеза. Для каждой из этих групп был клонирован вирусный прототип, использованный для идентификации структуры и обнаружения экспрессии клеточных генов, связанных с вирусными сходством структуры. Несмотря на имеюниеся различия, нами было обнаружено ; довольно много обнмх черт в функционировании этих генов. Хотя полученные данные и не могут

претендовать на исчерпывающее описание структуры и функции клеточных генов, родственных вирусу саркомы Молонм, они указывают на неслучайный характер захвата ретровирусои клеточного онкогена.

Исследование грнов, отдаленно родственных онкогенам, помогает идентифицировать гены эукариот, ответственные за ключевые моменты в регуляции пролиферации и дифференцировки клеток и вовлеченные в процесс индукции неопластичекого состояния.

выводы

1. Геном эукариот содержит последовательности разной степени сходства с онкогеном mos и генами недефектного ретровируса Молони.

2. При помоки молекулярного клонирования показана сн»^ленность онкогена mos с ретровирусными последовательностями в составе генома вируса саркомы Молони.

3. Из генома мышей линий M0V7 и MOV9 клонированы эндогенные провирусы лейкоза Молони ; локализован дефект в провирусе MOV7-

4. С помощью молекулярной гибридизации обнаружена экспрессия клеточного гена c-mos в гепатомах мышей, индуцированных ортоаминоазотолуолом и присутствие в них транскриптов эндогенных ретровирусов.

5. Обнаружены последовательности, родственные вирусу саркомы Молони у эукариот,

A). Гибридизация олигонуклеотидного зонда, специфического к участку кодирования консервативного района mos-белков указывает на наличие родственных последовательностей в геномах растений и грибов.

Б). Ген c-mos обнаружен у широкого класса позвоночных животных. Данные молекулярной гибридизации указывают на присутствие двух генов c-mos у копытных,

B). При помощи молекулярного клонирования обнаружены и выделены участки генома млекопитающих, имеющие гомологию с онкогеном mos и ретровмрусами.

6. Определена структура mos-родственных генов человека:

А). Локус gp5 содержит псевдоген c-ms, сцепленный с ретровирусными последовательностями, экспрессируюшимися в некоторых тканях человека.

Б). Траискриацхонно-активный ген son эволюционно консервативен и содержит участки гомологии с генами mos и шус.

список

работ, опубликованных по теме диссертации

1. Chumakov I.M., iPrassolov V.S., Kisselev L.L.. Mammalian sequences, homologous to the src gene of Moloney murine sarcoma virus. Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 1979. 360, 1023.

2. Чумаков И-М.. Ретровирусныё онкогены. В кн. Итоги науки к техники. Молекулярная биология/ ред. Л.Л.Киселева. Москва, ВИНИТИ АН СССР, 1979, т.19, с.117-182.

3. Чумаков И-М., Прасолов B.C., Киселев Л.Л.. Последовательности ДНК человека, родственные гену src вируса саркомы Молони и их картирование. Докл. АН СССР, 1980, т.252, 232-234.

4. Забаровския Е.Р, Чумаков И.М., Прасолов B.C., Киселев Л.Л.. Конструирование библиотеки генов человека и клонирование нуклеотидных последовательностей, гомологичных геномам вирусов лейкоза и саркомы Молони. Докл. АН СССР, 1960, т.255, с.1275-1277.

5. Чумаков И.М., Забаровский Е.Р, Метт В.Л..Прасолов B.C., Киселев Л.Л.. Клонирование участка генома вируса саркомы мышей Молони, содержащего онкоген этого вируса. Докл. АН СССР, 1981 Т.259, с.219-222-

6. Забаровский Е.Р., Прасолов B.C., Чумаков И.М., Киселев Л.Л.. Молекулярное клонирование фрагментов ДНК, гомологичных онкогену вируса саркомы мышей, из коллекции генов трансформированных клеток. Докл. АН СССР, 1981, т.261, с.1456-1459.

7. Метт В.Л-, Чумаков И.М., Киселев Л.Л.. Транскрипция клеточного аналога гена src вируса саркомы в печенм мышея. Докл. АН СССР, 1981, т.261, с.1471-1472.

8. Chumakov I., Stuhlmann Н.. Harbers К., Jaenlsch R..Cloning of two genetlcaly transmlted Moloney Leukemia proviruses:Correlation between biological activity of the cloned DMA and the viral genoae activation In the anleal.Journal of Virology, 1982 ,42, 1088-1089.

9. Chumakov, I.К., Zabarovsky, E.R., Mett. V.L. Klsselev.L.L.. Human nucleotide sequences, related to the transforming gene of Moloney Sarcoma Virus. Cene.1982. 17, 19-26.

10. Jaenlsch R., Harbers K., Schnleke A., Lohler J., Chumakov X.. Jahner D., Grotkopp D., Hoffman E..Germllne Integration of Moloney murine lei kemla virus at the mov 13 locus leads to recessive lethal mutation and early embryonic death. Cell, 1983, 32. 209-216.

11. Саянова O.B.. Прасолов B.C., Забаровский E.P., Чумаков И.М.. Молекулярное клонирование и структурная организация фрагментов ДНК крысы, гомологичных онкогену mos вируса саркомы мышей. Докл. АН СССР, 1983, т.286, с.1480-1482.

12. Zabarovsky, Е.Й., Chumakov, I.M., Klsselev L.L. Tight linkage oi retrovlral-llke sequences to a variant c-mos gene in the human genome. Gene, 1963. 23. 379-383.

13. Shnleke A.. Stuhlman H., Harbers K.. Chumakov I., Jaenlsch R.. Endogenous Moloney leukemia virus In nonvlremlc Mov substrains of mice carries defects In the provlral genome. Journal of Virology. 1983. 45, 505-513.

14. Забаровский E.P., Прасолов B.C., Чумаков И.М., Киселев Л.Л.. Кодируюндя часть гена человека, родственного онкогену c-mos прервана AIu-повторами. Докл- АН СССР, 1984, т.277, с.504-508.

15. Бердичевский Ф.Б.,Чумаков И.М.- Хроиосомнаая несцепленность двух генов семейства mos у человека.Докл. АН СССР, 1984, т.279, с.748-750.

16. Zabarovsky. E.R., Chumakov, I.M., Tretyakov, L.O. Klsselev, L.L..The coding region of the human c-mos pseudogene contains Alu repeat Insertions. Gene, 1984, 30, 107-111.

17. Забаровский E.P., Чумаков И.М., Прасолов B.C., Киселев Л.Л.. Участки генома человека, содержащие аналоги онкогенов и ретровирусов. I. Семейство генов c-mos и необычная структура локуса ORAgpS. Молекуляр. биология, 1984, т.18, с.60-82.

18. Klsselev. L.L.. Chumakov. I.M., Zabarovsky. E.R.. Prassolov, V.3., Mett. V.L.. Berdlchevsky. F.B., Tret'yakov. L.O.. Human genome: protooncogenes and proretroviruses. Folia blologlca IPrahal, 1985, 31, 121.

19. Чукаков K.M., Забаровский Е.Р., Прасолов B.C., Метт В.Л., Киселев JI.Л. .Участки генома человека, содержание аналоги онкогенов и ретровирусов человека. II. Новый класс ретровирусоподобимх элементов. Молекуляр. биология, 1983, т.19, с.425-433.

20. Забаровский Е.Р, Прасолов B.C., Чумаков И.М., Третьяков Л.О.,Киселев Л.Л.. Участки генома, содержание аналоги онкогенов и генов ретровирусов. 3- Первичная структура mos-родственного участка CL-1 из локуса OBAgp-5. Биоорган, химия, 1985, т. 11, 380-390.

21. Чумаков И.М.. Онкогены ретровирусов и клеточные протоонкогены. Журнал ВХО им. Л-И.Менделеева, 1986, 31, с .265-272.

22. I.M.Chujnakov, E.R.Zabarovsky, Yu.P.Shvets, L.O.Tretyakov, ".B.Berdlchevsky, L.L.Klsselev. Rat genome contains an active locus structurely related to mos protooncogene. In: Macromolecules In the functioning cell, ed. Bayev A.A., 1986, Puschlno.

23. Бердичевский.Ф.Б.. Швец Ю.П..Сустерович И.И., Гаранина H.M.. Чумаков И.М., Киселев Л.Л..Эволюционные варианты гена mos. Молекуляр. биология, 1986, т.20, С.536-343.

24. Чумаков И.М.. Забаровский Е.Р., Ввец Ю.П., Третьяков Л.О., Бердичевский Ф.Б., Киселев Л.Л.^Геном крысы содержит активный локус, структурно связанный с протонкогенои mos. Докл. АН СССР. 1986, т.290, С.1252-1254.

25. Блисковский В.В., Бердичевский Ф.Б., Чумаков И.М.. Участки генома человека, содержание аналоги онкогенов и генов ретровирусов. 4. Первичная структура mos-родственного участка АО локуса 0RAgp5. Биоорган.химия, 1989, т.13, 484-431.

26. Berdlchevsky, F.B., Chumakov, I.M.. Klsselev, L.L.. Transcription of son and K51 loci in human and rat tissues. In:Macromolecules In the functioning eelI.Ed. by A.Castellanl, C.Baldunl and P.Volpe. Rone.1988.

27. Бердичевский Ф.Б., Чумаков И.М..Транскрипционно-активный локус генома человека из семейства генов mos. Генетика.1988. т.24, с.366-369. "

б. Бердичевский Ф.Б, Чумаков И.М., Киселев Л.Л.. Расшифровка первичной последовательности участка son3 генома человека: Идентификация нового белка, имеющего необычную структуру и гомологию с ДНК-связываювими белками. Молекуляр.биология, 1988. т.22, с.794-801. 9. Демиров Д.Г., Друца В.Д.,Чумаков И.М.. Геном грибов и высших растений содержит последовательности, гомологичные участку гена mos млекопитающих. ?окя. АН СССР,1988, т.301, с.226-229.

Т-13601 рт26. 10. 89г. Формат изд. 60x84 1/16 -Объем 2,75ц.л. Зак. 67/У Тир.ЮО

ПП" Печатник" Мосгорпечать. Н. Краснохолмская д.5