Ретровирус М813: молекулярные свойства и воздействие на клетки

Иванов, Дмитрий Сергеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Ретровирус М813: молекулярные свойства и воздействие на клетки
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Ретровирус М813: молекулярные свойства и воздействие на клетки"

На правах рукописи

Иванов Дмитрий Сергеевич

РЕТРОВИРУС М813: МОЛЕКУЛЯРНЫЕ СВОЙСТВА И ВОЗДЕЙСТВИЕ НА КЛЕТКИ

Специальность 03.00.03 - молекулярная биология 03.00.06 - вирусология

Автореферат диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва 2004

Работа выполнена в Лаборатории биологии клетки Института молекулярной биологии им В.А. Энгельгардга Российской академии наук

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук

B.C. Прасолов

доктор биологических наук, проф. Д.А.Крамеров

доктор медицинских наук, акад. РАЕН засл.деятель науки РФ проф. А.Д.Альтштейн

Ведущая организация: Институт биоорганической химии им.М.М.Шемякина и Ю А. Овчинникова РАН

Зашита состоится /Я ¿^2004 г. в // часов на заседании диссертационного совета Д 002.235.01 при Институте молекулярной биологии им. В.А Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул.Вавилова, д.32

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение ретровирусов в настоящее время представляет собой значительный интерес как для фундаментальной биологии, так и для ее прикладных областей, таких как генная терапия.

Для фундаментальной биологии данная область интересна тем, что ретровирусы широко распространены в природе, геномы человека и многих видов животных содержат большое количество эндогенных ретровирусов и ретровирусо-подобных элементов, функции которых окончательно не выяснены. Кроме того, ретровирусы являются единственными представителями РНК-содержащих онкогенных вирусов (все остальные онкогенные вирусы - ДНК-содержащие). В процессе изучения онкогенных ретровирусов (вируса саркомы Раусса) были открыты вирусные онкогены. Исследования, посвященные вирусным онкогенам, привели к открытию клеточных генов - регуляторов клеточного цикла и деления клеток. Изучение ретровирусов и особенностей их жизненного цикла привело к открытию в 1970 году обратной транскриптазы - фермента, способного осуществлять синтез ДНК на матрице РНК. Это открытие привело к уточнению так называемой «Центральной догмы» молекулярной биологии об однонаправленности генетической информации в направлении ДНК РНК белок, поскольку показало наличие потока информации от РНК к ДНК.

Для генной терапии интерес к ретровирусам обусловлен тем, что на основе ретровирусов созданы эффективные системы переноса и экспрессии генов. Особенностями ретровирусов, которые реализуются в этих системах, - способность генома ретровирусов (в виде ДНК-провируса) интегрировать в геном зараженной клетки, простота генетической организации (а, следовательно, и простота генно-инженерных манипуляций с геном), отсутствие цитолитического действия (зараженные клетки, как правило, не гибнут). Кроме того, при использовании ретровирусных систем переноса генов не наблюдается иммунного ответа на них, поскольку возможно полностью исключить вирус-специфические белки (развитие иммунного ответа на аденовирусные векторы - одно из самых серьезных препятствий на пути их использования, так как уже был случай развития анафилактической реакции со смертельным исходом).

Данная работа посвящена характеристике одного из представителей семейства ретровирусов, группы вирусов лейкозов мышей - ретровируса М813. Этот ретровирус был выделен в 1977 году при скрининге различных видов животных на наличие эндогенных ретровирусов, однако детально он исследован не был. Интерес к этому ретровирусу возник в 1997 году из-за оказавшегося позже неверным предположения об использовании им Pitl в качестве рецептора для заражения клеток.

Цели и задачи работы. Основной целью данного исследования является характеристика

--------- 1

. о. к» чыщ

ретровируса М813. Для достижения поставленной цели надо было надо было решить следующие задачи:

1. Определить спектр хозяев данного ретровируса

2. Определить группу интерференции данного ретровируса

3. Провести морфологическую характеристику данного ретровируса

4. Определить способность данного ретровируса вызывать слияние клеток с образование синцитиев

5. Определить условия, при которых происходит образование синцитиев при контакте данного ретровируса с клетками

Работа выполнена в лаборатории клеточной инженерии Института Молекулярной биологии им.ВА.Энгельгардта РАН в соответствии с планом научно-исследовательских работ

Научная новизна и практическая ценность работы. В работе проведена характеристика ретровируса М813. Показано, что данный ретровирус относится к группе экотропных ретровирусов мышей. Обнаружено, что ретровирус М813 не относится ни к одной из описанных до сих пор групп интерференции ретровирусов группы MLV и является представителем новой группы интерференции и использует уникальный клеточный рецептор для заражения клеток. Проведенное исследование морфологии ретровируса М813 свидетельствует о том, что он является ретровирусом С-типа.

Обнаружена и описана способность ретровируса М813 вызывать образование синцитиев при контакте с клетками ряда линий. Впервые определены условия индукции синцитиев - это наличие рецептора для ретровируса М813 на клеточной поверхности и экспрессия белков других ретровирусов семейства MLV в клетках.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на 5-й международной конференции им. В А.Энгельгардта (2000 г.), на ежегодных отчетных конференциях аспирантов института молекулярной биологии РАН. По результатам диссертации опубликовано 4 печатных работы.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Список литературы содержит наименования, из них иностранных источника. Работа содержит страниц, включая рисунков и таблиц.

Список сокращений.

MLV - murine leukemia viruses, вирусы лейкоза мышей. LTR - long terminal repeats, длинные концевые повторы.

ТМ - трансмембранный домен белка оболочки. SU - поверхностный гликопротеин белка оболочки. HFV - human foamy virus, фоами-вирус человека.

Mo-MuLV - Moloney murine leukemia virus, вирус лейкоза мышей Молони.

MCF V - mink cell focus-formed virus, вирус, вызывающий образование фокусов в культуре клеток норки. 4070А - амфотропный ретровирус. 1504А - амфотропный ретровирус. N23 - ксенотропный вирус.

mCATl - белок-переносчик основных аминокислот, рецептор для экотропных ретровирусов.

Pitl -Na/Pi-симпортер, рецептор для GALV и 10А1.

Pit2 - Na/Pi-симпортер, рецептор для амфотропных вирусов и 10А1

FI - fusion index, индекс слияния.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Определение спектра хозяев М813

Клетки SC-1, продуцирующие вирус М813, были получены заражением клеток линии SC-1 вирусом, продуцируемым клетками линии N1H ЗТЗ М813. Клетки линии NTH 3T3, зараженные вирусом М813, были любезно предоставлены в наше распоряжение д-ром Ульфом Раппом (Rapp U. 1980)

С целью характеристики вируса М813 надо было определить спектр его хозяев и убедиться в его идентичности описанному ранее ретровирусу СП из Mus cervicolor. Для определения спектра хозяев ретровируса М813 предстояло установить, клетки каких видов животных чувствительны к заражению вирусом М813. Для этого мы применили метод, основанный на псевдотипировании (так называемый «метод спасения маркера»). Метод основан на том, что репликационно-компетентные вирусы в клетке могут выполнять функцию помощника для дефектных по репликации вирусов, предоставляя им свои белки для репликации.

Клетки Scl, инфицированные М813, трансфецировали дефектным по репликации рекомбинантным ретровирусом R312 (ретровирусный вектор), несущим ген устойчивости к генетицину (G-418) пеог из бактериального транспозона Тп5. Клетки выращивали на селективной среде с G-418, для того, чтобы получить популяцию клеток, содержащую интегрированный ретровирусный вектор R312. Полученные в результате селекции клетки SC-1-M813-R312 продуцируют в культуральную среду два типа вирусных частиц с одинаковой белковой оболочкой вируса-помощника (т. е. М813), но с различными геномами: одни с геномом самого М813, а другие - R312. При попытке заражения вирусными частицами, продуцируемыми линией Scl-M813-R312, клетки, обладающие рецептором для М813, должны стать

устойчивыми к G-418. В случае клеток, не обладающих рецептором для вируса М813, переноса гена пеог не произойдет, и клетки при селекции на G-418 погибнут. Следовательно, по результатам селекции можно было сузить о способности вируса заражать данную линию клеток.

В данном случае мы определяли способность ретровируса MS 13 заражать линии клеток различных видов животных, определяя титр данного вируса на клетках различных линий. В качестве контроля определяли титр еще двух ретровирусов - Mo-MuLV (экотропный вирус) и 10А1 ретровируса. Были получены следующие результаты, представленные в таблице 1.

Табл. 1 Сравнительная эффективность заражения вирусом М813 клеток различных видов

Вид Клеточная линия Титр вируса (GTU/ml)':

M813 Mo-MuLV 10A1

Мышь SC-1 3.5 x 104 1.6 x 105 2.6 x 105

NM3T3 8.0 x 104 2.6 x 105 3.0 x 10'

Крыса Ratl- 37 8.6 xlO4 5.6 x Ю4

Ref 52 130 ND" 1.7 x 105

Человек HeLa 0 0 8.3 x 10'

HT 1080 0 0 4.3 x 104

TE 671. 0 0 1.4 x io5

а) среднее как минимум двух экспериментов

b)ND, не определяли

Как видно из этой таблицы, ретровирус М813 способен заражать клетки Mus musculus.H значительно хуже • клетки крысы (титр в этом случае меньше на 3 - 4 порядка). Следовательно, спектр хозяев ретровируса М813 ограничен клетками грызунов. Точно такие же свойства были описаны и для СП вируса, таким образом, можно • говорить о том, что М813 вирус идентичен вирусу СП. Для ретровирусов, использованных в качестве контролен, получены вполне ожидаемые результаты - Мо-MuLV заражает клетки и мыши, и крысы с одинаковой эффективностью, а 10А1 заражает клетки всех трехвидовживотных одинаково эффективно.

Результаты данного эксперименты представлены в табл. 2

Табл. 2 Сравнительная эффективность заражения вирусом М813 клеток различных видов

(продолжение)

Вид Мышь

Китайский хомячок

Кролик

Собака

Африканская зеленая мартышка

Клеточная линия SC-1 СНО RK13 СП

Титр вируса М813, GTU/мл

3.5 х Ю4

Как можно видеть из результатов этого эксперимента, ретровирус М813 не заражает клетки хомячка, кролика, собаки и африканской зеленой мартышки, что подтверждает вывод предыдущего эксперимента о том, что вирус М813 является экотропным вирусом мышей.

2.0пределение группы интерференции вируса М813

Как уже говорилось ранее, интерференция — явление, заключающееся в том, что клетки, зараженные определенным ретровирусом, становятся устойчивыми к суперинфекции ретровирусами, использующими для заражения клеток тот же рецептор, однако сохраняют чувствительность к заражению ретровирусами, использующими для заражения клеток другой тип рецептора. До недавнего времени для ретровирусов группы MLV было описано 5 групп интерференции - экотропные, амфотропные, политропные, ксенотропные вирусы и 10А1 ретровирус. Для определения группы интерференции вируса М813 надо было определить, влияет ли на эффективность заражения клеток вирусом М813 экспрессия ретровирусов различных групп интерференции в клетках-мишенях. Для ответа на поставленный вопрос было необходимо решить две экспериментальные задачи:

1) Получить панель клеток мыши SC-1, экспрессирующих ретровирусы всех групп интерференции MuLV

2) Определить титр ретровируса М813 на полученных линиях клеток.

Для решения первой экспериментальной задачи в клетки-мишени SC-1 была проведена трансфекция плазмид, содержащих геномы различных ретровирусов. После трансфекции клетки растили 10-14 дней для того, чтобы вирус распространился по всей клеточной популяции. Таким образом, была получена панель клеток SC-1, экспрессирующих ретровирусы всех групп интерференции (кроме

ксенотропных, так как ретровирусы этой группы не заражают клетки Mus musculus).

После получение панели клеток было проведено определение титравируса М813 методом спасения маркера, как это описано выше. I la ¡ученные результаты позволяют сулить об относительной эффективности заражения ретровирусом М813 клеток SC-1, экспрессирующих ретровирусы всех групп интерференции. В качестве положительного контроля эксперимента было проведено определение титра ретровируса 10А1 на той же панели клеток. В качестве отрицательного контроля использовали линию клеток SC-1 M813, которая не должна заражаться ретровирусом М813. Результаты представлены в табл. 3

Табл. 3 Сравнительная эффективность заражения вирусом М813 клеток мыши 5С-1 экспрессирующих ретровирусы различных групп интерференции

Клепси-мишени Титр вируса (GTU/ml)

М813 10A1

SC-1 3.4 » 10* 7.6 x 104

SC-1+M813 1.5 7.4 x Ю4

SC-1+MoMuLV 3.5 * 104 7.6 x 104

SC-1 + MoAmphoV 5.7 х 104 8.8 x Ю4

SC-1+MolOAlV 8.8 x 105 2

SC-1 + MoMCFV 4.3 x Ю4 » 2.0 x 105

а) среднее как минимум двух экспериментов

Из результатов, представленных в таблице, можно сделать вывод, что экспрессия в клетках линии 8С-1 ретровирусов различных групп интерференции не препятствует заражению их ретровирусом М813, т.к. значения титра М813 на всех линиях клеток практически одинаковы, за исключением отрицательного контроля. В случае положительного контроля (ретровирус 10А1) видно, что он успешно заражает все линии клеток, за исключением клеток, инфицированных этим же вирусом, и, следовательно, с заблокированным для него рецепторами. Следовательно, ретровирус М813 является представителем отдельной группы интерференции, так как он не интерферирует с остальными ретровирусами группы МЬУ.

Из этих данных можно сделать вывод о том, что ретровирус М813 является представителем ешр одной группы интерференции МиЬУ, и, скорее всего, он использует для заражения уникальный клеточный рецептор.

Дополнительно были проведены эксперименты по регдапрокному заражению, в которых клетки 5>С-1 и ЗС-1 М813 пытались заражать ретровирусами различных групп интерференции. Результаты представлены в табл. 4

Табл. 4 Сравнительная эффективность заражения ретровирусами различных групп интерференции

клеток мыши БС-1, зараженных ретровирусом М813

Вирус Титр на клетках-мишенях (СГО/т!)'

эс-г 8С-1 М813

М813 5.4 х Ю4 0

Мо-МЛУ 1.8хЮ5 5.1 х 10'

Мо-АтрЬоУ 1.2 хю5 1.2 х 105

10А1 7.8 х Ю4 8.2 х 104

Мо-МСИ 2.6 х ю3 3.0 х 10'

а) среднее как минимум двух экспериментов

Из данных, представленных в этой таблице, видно, что предварительное заражение ретровирусом М813 уменьшает эффективность суперинфекции экотропным Мо-Мп1У в 50 раз, но не влияет на эффективность заражения клеток ретровирусами других групп - интерференции. Следовательно, в реципрокных экспериментах наблюдается небольшая интерференция между экотропным Мо-Ми1У и М813, с остальными ретровирусами никакой интерференции не наблюдается.

З.Морфологическая характеристика ретроввруса М813

Морфологическая характеристика ретровируса М813 была проведена методом электронной микроскопии в Институте экспериментальной вирусологии и иммунологии г. Гамбурга нашими коллегами с использованием клеточной линии, полученной нами (8С-1 М813). Результаты представлены

на рис. 1 (рисунок скомпонован из трех микрофотографий, с тем, чтобы можно было четко видеть стадии созревания вириона).

Рис 1. Электронная микрофотография ретровируса С-типа М813, группы MLV на разных стадиях формирования вириона

1 - начальная стадия формирования вириона 2- отпочковывание вириона 3 • зрелый вирион

Из представленной микрофотографии видно, что сборка вириона происходит на цитоплазматической мембране клетки, с последующим созреванием вирионапосле отпочковывания от мембраны. Следовательно, по морфологии ретровирус М813 относится с С-типу ретровирусов.

4. Определение индексов слияния фибробластов мыши Scl, экспрессируюших ретровирусы разных групп интерференция MLV, при действии ретро вируса М813.

При исследовании свойств ретровируса М813 было обнаружено, что при попытке заражения данным ретровирусом клеток упаковывающей линии РАЗ 17 происходило быстрое образование многоядерных синцитиев. Первые признаки образования синцитиев появлялись через час контакта вируса с клетками. Через 4 часа образовывались гигантские многоядерные синцитии, с числом ядер в них более 10. Во всех дальнейших экспериментах образование синцитиев оценивали через 4 часа инкубации клеток с вирусом. Фотографии клеток РАЗ 17 и синцитиев, образованных ими представлены на рис. 2 (на следующей странице)

Надо отметить, что клетки линии РАЗ 17 созданы на основе клеточной линии NIH ЗТЗ и отличаются от них экспрессией белков (вирус 4070А). При попытке

заражения клеток линии NIH ЗТЗ, на основе которых создана линия клеток РАЗ 17, подобного феномена синцитвеобразования не наблюдали. Соответственно было интересно выяснтъ, объясняется ли такая способность клеток образовывать синцитии под действием М813 экспрессией в клетках-мишенях белков амфотропных ретровирусов или она может быть обусловлена экспрессией белков и других рстровирусов группы MLV.

Количественный анализ эффективности образования синцитиев проводили с помощью подсчета индекса слияния по формуле FI=(N-S)/T, где N - число ядер в синцитиях, S - число синцитиев, Т - общее число ядер. В каждом эксперименте было подсчитано не менее 500 ядер. Данный коэффициент отражает не только количество синцитиев, но и их размер: значение коэффициента растет с увеличением обоих параметров.

Результаты эксперимента (в виде индексов слияния) представлены в табл. 5

Табл. 5 Сравнительная эффективность образования синцитиев клетками, зараженными ретровирусами различных групп интерференции, под действием ретровируса М813

Вирус

Клетки-мишени

М813

Mo-MuLV Mo-MCFV Mo-AmphoV

РАЗ 17

80.1%

10.2%

6.1%

2.4%

SCI-Mo-MuLV

67.8%

1.9%

2.1%

2.5%

SCl-Mo-MCFV

68.5%

10.8%

4.1%

3.0%

8С1-Мо-АгарЬоУ

68.2%

5.7%

1.1%

1.6%

5С1-М813

1.9%

4.2%

2.3%

2.4%

5С1

3.0%

3.2%

1.3%

2.2%

Из представленных данных видно, что ретровирус М813 индуцирует образование синцитиев во всех клеточных линиях, экспрессирующих ретровирусы всех использованных групп интерференции (экотропные, амфотропные, полвтропные и 10А1 ретровирус).

Остальные исследованные нами в этом отношении ретровирусы обладали или существенно меньшей синцитиеобразующей активностью (Mo-MuLV), или практически не вызывали образование синцитиев (Mo-MCF, Mo-AmphoV').

4. Определение условий, необходимыхдля синлщиеобразовааия поддействием вируса М813

Как было показано нами, ретровирус М813 вызывает образование синцитиев при попытке заражения клеток мыши Scl, экспрессирующих ретровирусы семейства MLV. Ранее было установлено, что в процессе слияния клеток при действии различных вирусов важную роль играет белок оболочки вируса, последовательность аминокислот некоторых его доменов, характер его гликозилирования, липидный состав мембран клеток-хозяев, а также наличие некоторых клеточных факторов. Нами было показано, что под действием вируса М813 происходит слияние клеток в случае экспрессии в мышиных клетках белков другого ретровируса семейства MLV. До сих пор было неизвестно, является ли это свойством именно мышиных клеток и нужен ли для этого какой-нибудь клеточный фактор. В данном опыте предстояло выяснить, является ли рецептор для вируса М813 необходимым условием для синцитиеобразования и могут ли клетки других животных подвергаться слиянию при действии М813.

Из полученных в предыдущем эксперименте данных, к сожалению, нельм сделать однозначный вывод об условиях, необходимых для проявления ретровирусом М813 синиитиеобразуюшей активности. Одно из условий - это экспрессия в клетках-мишенях белков ретровирусов других групп интеферениии. С целью выяснить, насколько необходимо для синиитиеобразования наличие в клетках-мишенях рецептора для М813, был проведен эксперимент по заражению клеток человека, экспрессируюших белки MuLV. Клетки человека или не содержат рецептор для М813 или содержат вариант этого белка, который не может использоваться данным ретровирусом для заражения клеток. Следовательно, в этом эксперименте можно установить важность наличия рецептора для М813 на поверхности клеток-мишеней для проявления синцитиеобразующей способности.

Данный эксперимент состоял из двух частей;

1) Определить, способны ли клетки, не экспрессируюшие рецептор для ретровируса М813, но экспрессируюшие белки других ретровирусов, к синцитиеобразованию под действием ретровируса М813

2) Определить, способны ли к синцитиеобразованию клетки человека, экспрессируюшие рецептор для ретровируса М813.

В первой части эксперимента были использованы следуюшие линии клеток:

ТЕ671 - клетки рабдомиосаркомы человека

ТЕ FLY GALV - упаковываюшая линия клеток, созданная на основе ТЕ671, экспрессирует белок оболочки GALV - вируса лейкоза гиббонов

ТЕ FLY MOLV - упаковываюшая линия клеток, созданная на основе ТЕ671, экспрессирует белок оболочки экотропного MuLV

293 - клетки эмбриональной почки человека

293-Phoenix-Ampho - клетки упаковываюшей линии, созданной на основе 293 линии клеток,

Эффективность синиитиеобразования оценивали по индексу слияния БГ. Результаты представлены в табл. 6

Табл. 6 Сравнительная эффективность образования синцвтиев клетками человека, экспрессирующимн белки оболочки ретровирусов различных групп интерференции, под действием ретровируса М813

экспрессируют белок оболочки амфотропного MuLV.

Клетки-мишени

Индекс слияния

Нативные клетки

Клетки, находившиеся в контакте с вирусом М813

ТЕ671

1.6

4.2

TE-FLY-GALV

TE-FLY-MO

293

293-Phoemx-Ampho

7.8 8.4 <10 <10

6.5 6.8 <10 <10

Из полученных данных можно сделать вывод, что экспрессия белков оболочки различных ретровирусов в клетках человека, не содержащих рецептор для ретровируса М813, не сообщает им способность к синцитиеобразованию при действии вируса М813.

Во второй части эксперимента стояла задача определить индексы слияния клеток человека ТЕ671, устойчивых к заражению ретровирусом М813, и клеток человека ТЕ671 - R895, экспрессирующих рецептор для ретровируса М813, при действии ретровируса М813.

Ранее было показано, что клетки человека ТС671 не чувствительны к инфекция М813, в то время как TE671-R895, экспрессирующие рецептор для этого вируса, могут быть заражены им. Для исследования способности к образованию синцитиев в нашем распоряжении были клетки линий ТЕ671-R895 и TE671-R895, зараженные вирусом 10А1. Клетки ТЕ671 трансфецироваля ретровирусным вектором R338, несущим ген устойчивости к антибиотику генетицину neo', т. о. получили линию ТЕ671-R338. После этого была получена линия TE671-10A1-R338 путем заражения вирусом 10А1 клеток линии TE671-R338.

Для адекватного анализа данных была разработана система контролей. Положительным контролем служили клетки линии РАЗ 17, для которых ранее было показано образование гигантских синцитиев при действии вируса М813. Вторым позитивным контролем служили клетки Scl-lOAl, для того, чтобы продемонстрировать, что экспрессия 10А1 делает клетки Scl пермиссквными к слиянию. Отрицательными контролями служили клетки Scl, не образующие синцитиев при действии М813, и ТЕ671, нечувствительные к этому вирусу, также не сливающиеся при контакте с ним.

Фотографии клеток ТЕ671 и ТЕ671 R895, контактировавших с ретровирусом М813, представлены на рис. 3 (следующая страница)

Для образования синцитиев важно, чтобы клетки были посажены с оптимальной плотностью. Слишком редко растущие клетки образуют мало синцитиев, т. к. они мало контактируют. На препаратах с часто посаженными клетками трудно подсчитывать ядра. Учитывая, что клетки различных линий делятся с разной скоростью и имеют разный размер, в каждом случае необходимо высевать разное количество клеток. Для подбора оптимальной концентрации клетки рассевали в двух вариантах: 3*106 клеток и 5*10* клеток на чашку Петри диаметром 10 см. Результаты анализировали с помощью подсчета индексов слияния FI, которые представлены в таблице 7

Рис. 3 Фотографии клеток ТЕ671 (А) и ТЕ671R895, образовавший синцитии под действием ретровируса М813 (В).

На верхней фотографии видно, что культура растет в виде одиночных клеток. На низшей фотографии видны поля клеток, слившихся воедино и образовавших гигантские синцитии с колтествсм ядер больше 10.

Таблица. 7 Сравнительная эффективность образования синцитиев клетками человека ТЕ671, экспрессирующими рецептор для ретровируса М813, под действием ретровируса М813

Клеточная линия ЗПО4 клеток FI,% 5*10'клеток И, %

Sel 3.5 ND

Scl - 10А1 75-80 ND

ТЕ671 2-4 2-5

TE671-R338 2-4 2-5

ТЕ671 - R338 - 10А1 3 3

TE671 - R895 38-49 84

TE671 - R89S - 10A1 44-52 87

РА 317 82 88-95

Примечания. ND - результаты не анализировали из-за очень плотного расположения клеток (объяснения в тексте). Значения, указанные через тире, относятся к различным участкам одного препарата.

По величине индексов слияния шило, что позитивным контролям соответствуют высокие значения FI (от 75%), а отрицательным - низкие (до 5%). Из исследовалныхлиний образовали гигантские синцитии при действии вируса М813 только клетки человека, экснрессируюшие рецептор для этото вируса, причем как TE671-R895-10A1, так и TE671-R895. Значит, способность клеток сливаться при действии ретровируса М813 не является особым свойством мышиных клеток. Рецептор является одним из необходимых условий для слияния клеток. Однако нельзя считать это условие достаточным. В случае Scl для образования синцитиев было нужно, чтобы клетка была заражена другим ретровирусом MLV, значение этото точно неизвестно. Существует предположение о том, что экспрессия ретровируса увеличивает силу межклеточных взаимодействий за счет связывания белка оболочки, экспонированното на поверхности одной клетки с рецептором, находящимся на соседней клетке. Для клеток человека ТЕ671 это условие, видимо, необязательно. В то же время неизвестно, экспрессируют ли ТЕ671 вирусы друтих семейств или они обладают свойствами, компенсирующими продукцию ретровирусов.

5.Клоннрование ретровнруса М813 и создание химерного вируса R704.

С целью установления степени родства с другими ретровирусами семейства MLV и для определения молекулярной основы использования уникального клеточного рецептора было осуществлено молекулярное клонирование части гена env ретровируса М813 нашими партнерами из Института экспериментальной вирусологии и иммунологии Г.Гамбурга. Данный участок гена env у ретровирусов кодирует SU домен белка оболочки и определяет тропизм вируса. После клонирования, для изучения свойств данного ретровируса на основе вируса лейкоза мышей Молони (Mo-MuLV) был создан химерный ретровирус, условно названный R704. У данного вируса ген оболочки представлен геном env вируса М813, тогда как остальные элементы генома Mo-MuLV были сохранены. Для доказательства того, что клонированный ген не является геном эндогенного ретровируса Mus musculus, были проведены Саузер-блоттинг и Нозерн-блоттинг.

6. Определение наличия в геноме мыши • Mus musculus эндогенных ретровирусов, родственныхретровирусу М813, методом Саузерн -блоттинга

Реальная биологическая роль и патогенный потенциал эндогенных ретровирусов пока до конца пе ясны. Однако к настоящему времени накоплены данные, которые свидетельствуют об участии эндогенных ретровирусов в регуляции экспрессии генов, в эмбриональном развитии, предотвращении заражения клеток родственными экзогенными ретровирусами, иммуносупрессии, опухолебразовании и развитии ряда аутоиммунных заболеваний.

Было важно выяснить, является ли М813 эндогенным ретровирусом мышей и есть ли в геноме мыши последовательности, гомологичные последовательности ретровируса М813. Для этого методом Саузерн-блотгинга был проведен анализ геномной ДНК мыши Mus musculus. Саузерн-блот гибридизация, или, сокращенно, Саузерн-блотпшг, позволяет выявить наличие в ДНК определенных нуклеотидныхпоследовательностей.

Для проведения анализа из клеточных линий мыши, неинфицированных ретровирусом М813 (SC-1) и инфицированных М813 (SC-1 M813), была выделена геномная ДНК. Суммарное количество геномной ДНК, выделенной с одной ]0-см чашки Петри, составило около300 мкг.

Далее геномная ДНК была подвергнута гидролизу рестрикционными эндонуклеазами EcoRV, Xba 1, Kpiil, Pstl, BamHl и EcoRl. Накаждую пробу брали по 10 мкг ДНК (на однудорожкугеля).

Продукты рестрикции разделяли с помощью электрофореза в 0.8% агарозном геле при низком напряжении (2В/см). Перенос фрагментов ДНК из геля на нейлоновую мембрану Hybond-N осуществляли капиллярным способом в течение ночи.

В качестве зонда для гибридизации был использован 5 концевой фрагмент гена env ретровируса М813 длиной в 840 нуклеотидов. Приготовление радиоактивно меченого зонда проводили с помощью

набора «Pnmc-a-gene labeling system» фирмы Ptomega. Гибридизацию провозили по методике фирмы BioRad

Результаты визуализировали с помощью прибора Cyclone Storage PhosphoScreen- Результаты Саузерн-блот гибридизации представлены на рис 4

f f / / jf /

4>4^4>4>

2)0 kl> 96IA 641*

4.4 №

НИ II kb

г:- t : \

L 11ж S4 ЯШ

1 ^ й. А -

ХЛ-Г-if rV*""

-А!- * "

1 Л *

1>? & ^

in? '

А. *

¿'■«г

fe-v.

•/-v г*

•ч 1

ч v ,

^Lj4'

г - / * «;*, % l С, it

V* ич *

TJ 1

■I Sf

f, л ч

„

-SV -,

^ : 4 » %

Sr* $

4« ri

EcoRV Xbtl Kpnl Pad Bmffi EeoRI

Рис. 4 Результаты анализа методом Саузерн-блоттинга геномной ДНК клеток мыши SC-l, незараженных и зараженных ретровирусом MS 13 Под рисунком даны названии рестриктаз, использованных для гибролиза геномной ДНК Крайняя левая дорожка - ДНК фага X, гидролизованная рестрикционной эвдонуклеазой Hind Ш. На следующие дорожки нанесена ДНК клеток незараженных (SC-1) и зараженных (SC-l M8I3) ретровирусом М813

Из результатов гибридизации можно сделать вывод, что в геноме незараженных клеток (8С-1) отсутствуют последовательности, гибридизуюшиеся с зондом к 5'-концевому фрагменту гена епу ретровируса М813. Это говорит о том, что ретровирус М813 не является эндогенным ретровирусом мышей и что в геноме мыши отсутствуют эндогенные ретровирусы, родственные ретровирусу М813.

В случае клеток, зараженных ретровирусом М813, в геномной ДНК выявляются последовательности, гибридизуюшиеся с использованным зондом В случае использования ресгрикиионных эндонулеаз ЕсоКУ, ХЬа I, Крп1, РчИ, и ВатН1 выввляется одна четко выраженная полоса и одна-две значительно менее выраженных полос. В случае использования рестрикаионной

эидонулеазы EcoRl выявляется несколько полос одинаковой интенсивности.

Интерпретировать эти результаты можно следующим образом - для рестрикционных эндонулеаз EcoRV, Xba I, Kpnl, Pstl и BamHl сайты рестрикции находятся внутри провируса в областях, фланкирующих ген env. Это подтверждается и размером полос, которые составляют 4.5 т.п.н в случае EcoRV, 6 т.п.н. в случае Xba 1, около 3 т.п.н. в случае Kpnl и Pstl, 6 т.п.н. в случае BamHl (размер провирусов для MuLV от 7 т.п.н до 12 т.п.н.). Вторичные, более слабо выраженные полоски, скорее всего, отражают факт наличия в геноме зараженных клеток провирусов с перестройками в геноме. Соотношение интенсивностей этих полос позволяет предположить, что провирусы с нормальной структурой находятся в геноме в нескольких копиях, а с перестроенной - в одной-двух копиях.

В случае использования рестрикционной эндонуклеазы EcoRl, скорее всего, один сайт находится внутри провируса, а один - вне провируса. Поэтому размер полос будет зависеть от места интеграции провируса в геном клетки (и, соответственно от того, насколько далеко в геноме от места интеграции будет располагаться сайт рестрикции для EcoRl), количество полос будет зависеть от числа копий интегрированных провирусов. В данном случае выявляется б полос, что позволяет говорить о наличии не менее 6-ти копий провируса М813 в геноме клеток.

7. Определение экспрессия ретровирусов М813 и R704 с помощью Нозерн-блотт-гибрндизацин

Для подтверждения результатов Саузерн-блоттинга нами был проведен анализ экспрессии ретровирусов М813 и R704 в зараженных клетках методом Нозерн-блотт-гибридизации.

Метод Нозерн-блотгинга, позволяет определить наличие в клетке молекул РНК определенного размера, и, таким образом, позволяет определять экспрессию генов на уровне РНК

Из незараженных (SC-1) и зараженных (SC-1 M813) вирусом М813 клеток линии SC-1 была выделена тотальная РНК. Выход РНК составил приблизительно 100- 150 мкг с 10см культуральной чашки.

РНК также была выделена и из клеток линии SC-1, зараженных ретровирусом R704.

После разделения РНК электрофорезом в денатурирующих условиях (по 10 мкг РНК на дорожку геля) она была перенесена на мембрану HybondN* методом электропереноса.

В качестве зонда для блотгинга был использован 5'-концевой фрагмент гена env ретровируса М813 длиной в 840 нуклеотидов. Радиоактивное мечение данного зонда было проведено с помощью набора «Prime-a-gene labeling system» фирмы Promega.

Результаты визуализировали с помощью прибора Cyclone Storage PhosphoScreen. Результаты гибридизации представлены на рис. 5

Количество РНК на каждой дорожке оценивали гибридизацией к РНК одного из генов «домашнего хозяйства» - ОЛОРН (результаты не представлены). Во всех трех пробах количество РНК этого гена было одинаково.

Как можно видеть из вышеприведенных результатов, в незараженных клетках линии 8С-1 отсутствуют последовательности РНК, гибридизуюшиеся с зондом к гену его1 ретровируса М813.

В зараженных клетках выявляются две последовательности, гибридизуюшиеся с зондом к гену ену ретровируса М813, соответствующие размерам полноразмерной и спланированной РНК ретровирусов группы МЬУ (около 9КЬ для полноразмерной и ЗКЬ для спланированной). Отличие между двумя вирусами состоит в более низкой интенсивности полос в случае химерного ретровируса Я704, что позволяет говорить о меньшем количестве РНК этого вируса в зараженной клетке (с учетом того, что количество РНК на дорожках было одинаково, и оценивалось по уровню экспрессии ОЛОРН).

8. Определение спектра хозяев ретровируса R704

Для определения спектра хозяев химерного ретровируса R704 бьшо поставлено определение титра данного вируса, продуцируемого клетками линии SC-1 R704 на клетках разных видов. Определение титра было поставлено с помощью описанного ранее метода спасения маркера.

В качестве контролен были использованы ретровирус М813 и ретровирус 10А1. Результаты эксперимента представлены в табл 8

Табл.8 Определение спектра хозяев химерного ретровируса 11704

Вид Клеточная линия Титр вируса (СШ/т!)

М813 Я704 10А1

Мышь БСМ 3.5 * 104 1.6 хЮ3 2.6 х 10*

мн зтз 8.0 * 104 2.6 х 103 3.0 х Ю5

Крыса 1Ы1 37 0 5 6 х Ю4

1^52 130 0 1.7 х Ю5

Человек Ней 0 0 8.3 х Ю5

1ГТ1080 0 0 4.3 х Ю4

ТЕ 671 0 0 1.4 х Ю!

Как можно видеть из представленных данных, спектр хозяев полученного химерного ретровируса R704 в точности совпадает с таковым для ретровируса М813. Отличие состоит в более низком титре химерного вируса, что можно было ожидать исходя из меньшего содержания РНК ретровируса R704 в зараженных клетках (что было определено методом Нозерн-гибридизации ранее)

9. Определение группы интерференции ретровируса R704

Для определения группы интерференции полученного химерного ретровируса было проведено определение его титра вируса методом спасения маркера, как это описано ранее. Полученные результаты позволяют судить об относительной эффективности заражения ретровирусом R704 клеток SC-1, экспрессирующих ретровирусы всех групп интерференции. В качестве положительного контроля эксперимента было проведено определение титра ретровируса М813 на той же панели клеток. В качестве отрицательного контроля использовали линию клеток SC-1 M813, которая не должна заражаться ретровирусом R704.

Результаты эксперимента представлены в табл. 9

Табл. 9 Сравнительная эффективность заражения вирусом 11704 клеток мыши экс премирующих ретровирусы различных групп интерференции

¡Слетки-мишени Титр вируса (ОТи/ш1)':

М813 Я704

БС-1 3 4 х 104 7.6 х Ю'

БС-1+М813 1.5 0

5С-1 + МоМиЬУ 3.5 х Ю4 7.6 х 103

БС-1 + МоАтрЬоУ 5.7 х Ю4 8.8 х Ю5

БС-1 + Мо10А1У 8.8 х ю3 3.5 х Ю3

БС-! + МоМСИУ 4.3 х 104 2.0 х 103

Как можно видеть из данных, приведенных в этой таблице, ретровирус R704 не интерферирует ни с одним из вирусов различных групп интерференции. Клетки, инфицированные вирусом М813, не заражаются ретровирусом R704, как и следовало ожидать. Таким образом, можно сказать, что ретровирус R704 обладает такими же интерференционными свойствами, как и ретровирус М813.

Выводы:

1. Ретровирус М813 является экотропным вирусом и способен к инфекции фибробластов мыши (клеточные линии Scl и NIH ЗТЗ) и фибробластов крысы (клеточные линии Ratl и Ref52). Эффективность заражения вирусом М813 клеток крысы на три порядка ниже, чем клеток мыши.

2. Ретровирус М813 является представителем новой группы интерференции вирусов семейства MLV.

3. Ретровирус М813 вызывает образование гигантских синцитиев при попытке заражения клеток мыши Scl, инфицированных другими ретровирусами группы MLV. Все исследованные нами в этом отношении ретровирусы обладали или существенно меньшей синцитиеобразующей активностью (Mo-MuLV), или практически не вызывали образование синцитиев (Mo-MCF, Mo-AmphoV).

4. Экспрессия рецептора для ретровируса М813 в клетках человека ТЕ671, исходно

нечувствительных к действию этого вируса, сообщает им способность к синцитиеобразованию. Определяющим фактором для синцитяеобразования при контакте с вирусом М813 является наличие у клеток рецептора для этого вируса.

Основные результаты диссертации опубликованы в работах:

1 V.Prassolov, S.Hein, D.Ivanov, M.Ziegler, G.Rutter, J.Lohler, C.Stocking «Mus cervicolor murine leukemia virus isolate M813 belongs to a unique receptor interference group» J. Virol. 2001,75,10,4490-4498

2 V.Prassolov, D.Ivanov, S.Hein, GJtutter, C.Munk, J.Lohler, C. Stocking «The Mus cervicolor MuLV isolate M813 is highly fusogenic and induces a T-cell lymphoma associated with a large multinucleated cells» Virology, 2001,290,39-49

3 S.Hein, V.Prassolov, Y.Zhang, D.Ivanov, J.Lohler, S.Ross, C.Stocking «Sodium-dependent myo-inositol transporterl is a cellular rcccptor for Mus cervicolor M813 murine leukemia virus» J.Virol. 2003,77(10), 5926-5932

4. В.С.Прасолов, Д.С.Иванов «Ретровирусные векторы в генной терапии» Вопросы мед.химии, 2000,46,3,207-225

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 or01.12.99 г. Подписано к печати 30.00004 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печл. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ 055. Тел. 939-3890,939-3891,928-1042. ТелУФакс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к.

»-4284

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Иванов, Дмитрий Сергеевич

Оглавление.

Список сокращений.

Введение.

Обзор литературы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Ретровирус М813: молекулярные свойства и воздействие на клетки"

Общие свойства ретровирусов.8

ВведениеАктуальность проблемыИзучение ретровирусов в настоящее время представляет собой значительный интерес как для фундаментальной биологии, так и для ее прикладных областей, таких как генная терапия.

Для фундаментальной биологии данная область интересна тем, что ретровирусы широко распространены в природе, геномы человека и многих видов животных содержат большое количество эндогенных ретровирусов и ретровирусо-подобных элементов, функции которых окончательно не выяснены. Кроме того, ретровирусы являются единственными представителями РНК-содержащих онкогенных вирусов (все остальные онкогенные вирусы - ДНК-содержащие). В процессе изучения онкогенных ретровирусов (вируса саркомы Раусса) были открыты вирусные онкогены. Исследования, посвященные вирусным онкогенам, привели к открытию клеточных генов - регуляторов клеточного цикла и деления клеток. Изучение ретровирусов и особенностей их жизненного цикла привело к открытию в 1970 году обратной транскриптазы - фермента, способного осуществлять синтез ДНК на матрице РНК. Это открытие перевернуло так называемую «Центральную догму» молекулярной биологии об однонаправленности генетической информации в направлении ДНК —» РНК —> белок, поскольку показало наличие потока информации от РНК к ДНК.

Для генной терапии интерес к ретровирусам обусловлен тем, что на основе ретровирусов созданы эффективные системы переноса и экспрессии генов. Особенностями ретровирусов, которые реализуются в этих системах -способность генома ретровирусов (в виде ДНК-провируса) интегрировать в геном зараженной клетки, простота генетической организации (а, следовательно, и простота генно-инженерных манипуляций с геном), отсутствие цитолитического действия (зараженные клетки, как правило, негибнут). Кроме того, при использовании ретровирусных систем переноса генов не наблюдается иммунного ответа на них, поскольку возможно полностью исключить вирус-специфические белки (развитие иммунного ответа на аденовирусные векторы - одно из самых серьезных препятствий на пути их использования, так как уже были случаи развития анафилактических реакций со смертельными исходами).

Данная работа посвящена характеристике одного из представителей семейства ретровирусов, группы вирусов лейкозов мышей - ретровируса М813. Этот ретровирус был открыт в 1977 году при скрининге различных видов животных на наличие эндогенных ретровирусов, однако детально он исследован не был. Интерес к этому ретровирусу возник в 1997 году из-за оказавшегося позже неверным предположения об использовании им Pitl в качестве рецептора для заражения клеток.

Цели и задачи исследованияОсновной целью данного исследования является характеристика ретровируса М813. Для достижения поставленной цели надо было надо было решить следующие задачи:1. Определить спектр хозяев данного ретровируса2. Определить группу интерференции данного ретровируса3. Провести морфологическую характеристику данного ретровируса4. Определить способность данного ретровируса вызывать слияние клеток с образование синцитиев5. Определить условия, при которых происходит образование синцитиев при контакте данного ретровируса с клеткамиРабота выполнена в лаборатории клеточной инженерии Института Молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта РАН в соответствии с планом научно-исследовательских работНаучная новизнаВ работе проведена характеристика ретровируса М813. Показано, что данный ретровирус относится к группе экотропных ретровирусов мышей. Обнаружено, что ретровирус М813 не относится ни к одной из описанных до сих пор групп интерференции ретровирусов группы MLV и является представителем новой группы интерференции и использует уникальный клеточный рецептор для заражения клеток. Проведенное исследование морфологии ретровируса М813 свидетельствует о том, что он является ретровирусом С-типа.

Обзор литературыВведениеРетровирусы — РНК-содержащие вирусы, многие из которых вовлечены в патогенез ряда заболеваний (включая такие социально-значимые, как СПИД и Т-клеточный лейкоз взрослых) и являются уникальным инструментом для применения в фундаментальной биологии и генной терапии. Ретровирусы широко используют для изучения процесса онкогенеза, эволюционных связей между вирусами и их хозяевами, а также в качестве основы для конструирования векторов для переноса генов в лабораторных и клинических целях [21]. Один из наиболее широко распространенных объектов исследования - ретровирусы группы MLV (вирусов лейкоза мышей). Главным преимуществом вирусов этой группы является отсутствие ярко выраженного цитопатического (как правило, зараженная клетка остается живой) действия, простота организации, а, следовательно, и удобство генноинженерных манипуляций с геномом [40].

Первая часть обзора литературы посвящена общим свойствам ретровирусов, их строению и жизненному циклу. Во второй части рассмотрены особенности взаимодействия ретровирусов MLV с чувствительными клетками: взаимодействие с рецептором, слияние мембран, проникновение в клетку, явление интерференции и классификация вирусов на основе используемых рецепторов. Третья часть посвящена истории открытия ретровируса М813.

Общие свойства ретровирусовРетровирусы обладают рядом необычных свойств. В то время как большинство других типов вирусов убивают зараженную клетку, ретровирусы, как правило, вызывают хроническую инфекцию8чувствительных клеток, и продолжительная экспрессия вирусных генов обычно не сопровождается цитотоксических эффектом. При ретровирусной инфекции клеточная пролиферация либо увеличивается, либо не меняется вообще.

Для достижения хронической инфекции ретровирусы используют уникальную стратегию репликации. Хотя вирусный геном в составе вириона представлен одноцепочечной РНК, в ходе его репликации он проходит стадию двухцепочечной ДНК, которая эффективно интегрирует в геном хозяйской клетки. Превращение генома ретровируса из вирионной РНК в ДНК осуществляет РНК-зависимая ДНК-полимераза. Название ретровирус и отражает присутствие у всех представителей этого семейства обратной транскриптазы и наличие стадии ДНК в цикле репликации их генома. Надо отметить, что обратная транскрипция не является уникальной только для ретровирусов и присутствует в жизненном цикле гепадновирусов (представитель - вирус гепатита В человека) и некоторых вирусов растений.

Еще одно уникальное свойство ретровирусов, связанное с особенностями их репликации — существование некоторых из них в виде эндогенных провирусов и ретровирусо-подобных элементов, которые интегрированы в ДНК клеток и передаются вертикально.

Ретровирусы классифицируют на основе многих свойств, таких как морфология, гомология эволюционно-консервативных участков их генома, строении их генома, биологических свойств, спектру хозяев и др. Наиболее общепринятая классификация ретровирусов как семейства - деление на 3 подсемейства - онковирусы, лентивирусы и спумавирусы.

Онковирусы, как явствует из названия - способны вызывать онкологические заболевания у своих хозяев (чаще всего - лейкозы и саркомы). Опухоль чаще всего развивается через длительный инкубационный период, и все это время организм хозяина хронически инфицирован вирусом.

Лентивирусы названы так из-за очень длительного инкубационного периода и хронический характер вызываемых ими заболеваний. К данному подсемейству относится вирус иммунодефицита человека (ВИЧ).

Спумавирусы исходно обнаружены как инфекционные загрязнения первичных клеточных культур [38]. Они получили свое название из-за вызываемой ими характерной «пенной» дегенерации культуры. Спумавирусы выявлены у различных представителей млекопитающих, включая кошек, коров, приматов и человека. Они могут вызывать хроническую инфекцию у своих хозяев (вирус длительно присутствует в организме), однако пока не удалось связать их с каким-либо известным заболеванием.

Внутри подсемейства онковирусов выделяют еще несколько групп, и таким образом, ретровирусы в общей сложности подразделяют на 7 групп [20], как это показано в табл.1Табл.1 Классификация ретровирусовГруппа Представитель Морфология вириона1 Геном2Вирусы саркомы и лейкозов птиц (ASLV) RSV (вирус саркомы Раусса) С-тип ПростойВирусы млекопитающих В-типа MMTV (вирус рака молочной железы мышей) В-тип ПростойВирусы лейкоза мышей Mo-MuLV (вирус лейкоза С-тип Простой1 Классификация ретровирусов по морфологии вириона описана далее2 подробнее деление ретровирусов на простые и сложные описано далеемышей Молони) Группа вирусов Т-клеточного лейкоза человека и лейкоза крупного рогатого скота HTLV (вирус Т-клеточного лейкоза человека) Центрально расположенный сферический капсид СложныйВирусы D-типа M-PMV (вирус обезьян Мезон-Пфайзера) D-тип ПростойЛентивирусы HIV (вирус иммунодефицита человека) Конусообразный капсид СложныйСпумавирусы HFV (фоами -вирус человека) Центрально расположенный сферический капсид СложныйСтроение ретровирусного вирионаВирион ретровирусов является округлой частицей диаметром 80-120 нм. Внутри этой частицы находится нуклеокапсид вируса, окруженный наружной липопротеидной оболочкой. Это оболочка представляет из себя модифицированную белками ретровируса цитоплазматическую мембрануклетки, в которой произошло образование вирусной частицы. Схема строения ретровирусного вириона представлена на рис i.

ТМ - Трлнемембрпшгьпг беток SU - Поверхностный глнкопротеннRT - Обратная транскршттазаPro - Протеаза INT - НнтегразаNC - Нлтстеокапснд ный белот MA - Маггриксный беток СА - Капсндный бепокРисунок 1. Схема строения ретровирусного вир! юн аВ составе капсида содержится несколько видов белков: матриксный белок МА. капсндный белок СА, нуклеокапсидный белок NC, протеаза PR,интеграза IN и обратная транскриптаза RT, обеспечивающая синтез ДНК на матрице геномной РНК, а также транспортная РНК, служащая затравкой для обратной транскрипции. Липопротеидная оболочка является частью мембраны клетки, продуцирующей вирус. Она содержит как вирусспецифические, так и клеточные белки, попавшие туда случайным образом при отпочковывании вируса. К вирусспецифическим белкам оболочки относят комплекс белков-продуктов гена env.

По морфологии ретровирусы делят на 4 типа. Ретровирусы типа А неинфекционны и обнаруживаются только внутри клеток. Есть два типа А-частиц — внутрицитоплазматические и внутрицистернальные. Внутрицистернальные представляют собой продукт экспрессии эндогенных ретровирусоподобных элементов. У них не происходит протеолиза и созревания вирусных белков, поэтому они не дают продуктивной инфекции. Такие незрелые вирусные частицы окружаются мембраной эндоплазматического ретикулума клетки и накапливаются в цистернах эндоплазматического ретикулума. Другой тип А-частиц внутрицитоплазматические А-частицы, по крайней мере часть из них — предшественники вирионов В и D типов.

Ретровирусы В-типа характеризуются тем, что сборка их нуклеокапсида происходит в цитоплазме, далее нуклеокапсид транспортируется к плазматической мембране, где формируется вирион, особенностью которого является эксцентричное положение капсида.

К С-типу относят ретровирусы с округлым капсидом в центре вириона, сборка которых происходит непосредственно у плазматической мембраны и окончательное созревание вириона происходит после отпочковывания от мембраны.

Ретровирусы D-типа, как и тип В, тоже созревают в цитоплазме, но в отличие от типа В обладают палочкообразным кором (Рис. 2)Рисунок 2.Классификация ретровирусов по морфологии.

Строение генома ретровирусовГеном ретровирусов представляет собой две идентичные молекулы РНК размером 7-12 тыс. нуклеотидов у разных вирусов (табл.2), объединенные различными нековалентными взаимодействиями и посредством капсидных белков. Очищенная геномная РНК не инфекционна, так как в вирионе содержатся компоненты, необходимые для прохождения первых стадий жизненного цикла (для стадий обратной транскрипции и интеграции в геном). Структура вирусной РНК похожа на клеточную мРНК и модифицирована сходным образом: 5'-конец кэпирован, несет метилированный GDP, соединенный З'-б'связыо с основной цепью; 3'-конец полиаденилирован, несет 50-200 остатков аденина.G^g-белкиС < 1/ ' 1 Gag-белкиGag-б елкиВирусы s А-типа - jВирусы В-типаВирусы С-типаВирусыD-типа ®Таблица 2. Размеры генома и отдельных элементов LTR у представителей различных групп ретровирусовВирус Размер геномной РНК, нуклеотидов из R U5 Тип тРНК, выполняющей роль затравкиRSV 9300 230 20 80 ТриМо-MuLV 8300 450 70 80 ПроHIV-1 9200 450 100 80 ЛизM-PMV 7900 220 30 100 ЛизHTLV-1 8600 350 230 220 ПроHFV 11200 910 190 160 ЛизЭлементы генома ретровирусов можно разделить на элементы с цис- и транс-функциями (рис. 3). Элементы с цис-функциями - нуклеотидные последовательности, которые регулируют прохождение жизненного цикла ретровируса. Ими являются: вирусные LTR, в состав которых входят промоторы, энхансеры и сигнал полиаденилирования, att-последовательности (сайты интеграции), ^-область (последовательность, необходимая для инициации сборки вириона и димеризации вирусной РНК при сборке), PBS (primer-binding site - участок связывания специфической тРНК, которая играет роль затравки для синтеза «минус» цепи ДНК провируса при обратной транскрипции), РР (полипуриновый тракт- участок РНК, выполняющий роль затравки для синтеза «плюс» цепи ДНК), SD и SA (донорный и акцепторный сайты сплайсинга, которые обеспечиваютэкспрессию гена env, находящегося в собственной рамке считывания, которая начинается за SA). Цис-элементы должны присутствовать в геноме любого ретровируса (и ретровирусного вектора) для осуществления его жизненного цикла. Надо отметить, что SA и SD являются необходимыми элементами для ретровирусного генома, однако в случае ретровирусных векторов они могут отсутствовать.

Продукты гена gag обеспечивают сборку и отпочковывание вириона. Ген gag (от Group Specific Antigen) кодирует основные структурные белки вирусного капсида. Белок-предшественник - продукт трансляции гена gag протеолитически расщепляется на зрелые белки МА (белок матрикса), СА (капсидный белок), NC (белок нуклеокапсида) и (не у всех ретровирусов) некоторые малые белки. Протеолитическое расщепление белка-предшественника происходит уже после отпочковывания вириона и осуществляется вирусной протеазой.

Продукты гена pol обеспечивают ферментативный аппарат процесса обратной транскрипции и интеграции. Ген кодирует интегразу и обратную транскриптазу. Обратная транскриптаза (RT) без участия дополнительных белков осуществляет обратную транскрипцию. Интеграза совместно с клеточными белками отвечает за интеграцию вирусной ДНК в геном инфицированной клетки.

Ген pro кодирует вирусную протеазу, осуществляющую процессинг белков-предшественников, продуктов генов gag, pol уже в составе вириона, а также отщепляет от цитоплазматического домена ТМ (продукт гена env) так называемого R-пептида. Pro может перекрываться с gag у некоторых вирусов и в таком случае ген транслируется со сдвигом рамки считывания.

Продукты гена env отвечают за связывание с рецепторными белками на мембране клетки-мишени при заражении и проникновение в клетку. Этот ген кодирует белки SU (surface) и ТМ (transmembrane), образующие в комплексе белок оболочки [105].

По наличию дополнительных генов в составе вирусного генома ретровирусы делят на простые и сложные. Простые ретровирусы содержат в составе генома только гены gag, pro, pol и env (как исключение - вирус саркомы Раусса в своем составе содержит онкоген src). Сложные ретровирусы содержат в своем составе ряд дополнительных генов,необходимых для их жизненного цикла. Например - ВИЧ содержит в своем геноме 6 дополнительных генов — vif, vpr, vpu, tat, rev и nef.

Кодирующая часть вирусной РНК фланкирована регуляторными последовательностями. На 3' конце находится элемент U3 (несколько сотен — более тысячи нуклеотидов у различных вирусов), на 5'- U5 (100-200 нуклеотидов у различных вирусов), элемент R (десятки - более 100 нуклеотидов у различных вирусов) повторяется на обоих концах РНК. На границе U3 и R находится сайт начала транскрипции, на границе U5 и R -сайт полиаденилирования. U3 содержит большинство элементов, контролирующих транскрипцию: энхансеры, связывающие клеточные или вирусные белки-регуляторы (для сложных вирусов), промоторы. В процессе обратной транскрипции образуются длинные прямые концевые повторы, содержащие все три элемента (U3, R, U5). Таким образом, ДНК-провирус отличается от геномной РНК наличием дополнительных последовательностей. Схематично чередование форм РНК-ДНК можно представить так, как это показано на рис 4. Видно, что с геномной РНК синтезируется ДНК-провирус, который содержит LTR-ы, и показано образование двух РНК-транскриптов — несплайсированного и сплайсированного (как это происходит у вируса лейкоза мышей Молони — у других вирусов может образовываться большее количество форм РНК, у ВИЧ, например, их образуется как минимум 5). Несплайсированная РНК используется, во-первых, в качестве геномной РНК при сборке вирионов, и, во-вторых - как матрица для трансляции белковых продуктов генов gag, pro и pol.

Проникновение ретровируса в клетку начинается с взаимодействия белка оболочки с клеточным рецептором. После взаимодействия вируса с клеточным рецептором происходит проникновение нуклеокапсида в цитоплазму (путем слияния мембран вируса и клетки). В цитоплазме происходит обратная транскрипция, продуктом которой является двухцепочечная ДНК-копия геномной РНК вируса (провирус). Провирус интегрирует в геном зараженной клетки, этот процесс обеспечивается вирусной интегразой, вероятно, с участием клеточных белков. Для прохождения этой стадии жизненного цикла в случае простых ретровирусов необходимо, чтобы ядерная мембрана отсутствовала, т.е. клетка должна делиться. В случае сложных ретровирусов такого ограничения нет, потому что их вспомогательные белки способны обеспечить транспорт интеграционного комплекса через ядерную мембрану.

После интеграции провирус ведет себя как обычный клеточный ген — транскрибируется клеточной РНК-полимеразой II с участием клеточных факторов транскрипции, хотя уровень его транскрипции зависит от вирусных регуляторных последовательностей, локализованных в LTR провируса.

После синтеза вирусных белков происходит сборка вириона и отпочковывание его от цитоплазматической мембраны клетки, после чего инфекционный цикл повторяется.

Рассмотрим теперь каждую из стадий жизненного цикла ретровирусов подробнее.

Взаимодействие ретровирусов с клеточным рецепторами и проникновение в цитоплазмуРетровирусная инфекция начинается с прикрепления вириона к поверхности клетки-мишени. Первичное взаимодействие вируса с заражаемой клеткой является рецептор-независимым событием, как это было показано с помощью ретровирусных частиц, лишенных SU и ТМ. Было обнаружено, что такие ретровирусные частицы успешно прикрепляются к клеткам, но при этом не происходит их интернализация. Считается, что такое взаимодействие может происходить благодаря тому, что при отпочковывании ретровируса от клеточной мембраны происходит захват ряда клеточных белков, в том числе и молекул межклеточной адгезии. Подобного рода взаимодействия могут существенно облегчать последующее специфическое взаимодействие SU с клеточным рецептором [73].

Белок оболочки MLV представляет собой тример, каждый мономер которого состоит из двух субъединиц-гликопротеидов: SU (surface) и ТМ (transmembrane) [24]. Субъединица SU (gp70) белка оболочки отвечает за взаимодействие с клеточным рецептором [21]. SU состоит из двух доменов, соединенных пролин-богатым участком. Участок связывания gp70 с рецептором находится на N-концевом домене [5, 37], в составе которого есть три петли с различными размерами и последовательностями, т. н. гипервариабельные петли VRA, VRB и VRC. Исследование вирусов с химерными белками оболочки показало, что выбор рецептора зависитцеликом от гипервариабельных участков [8, 61], [66]. Таким образом, именно эти районы являются детерминантами, ответственными за распознавание рецептора, а значит, и за спектр хозяев (рис. 6). Роль участка, богатого пролином, менее ясна. Было показано, что он необходим для эффективного взаимодействия N-концевого домена с рецептором у ряда вирусов [7].

Клетка-мишеньТМ доменFusicn-пепшд С-концевой пептидРетровирусРсцсгттор££ домен Связывание рецептораКшфсрмацпшная ^ровнрус перестройкаVRAVR СVEBРисунок 6. Белок оболочки niipvcn лейкоз п мышей Молонп. Связывпнне с рецептором и конформацпоннля перестройка.

ТМ (р!2Е) субъединица также гликозилирована и состоит из двух доменов: С-концевой трансмембранный домен отвечает за заякоривание всего комплекса в мембране, N-концевой домен представляет собой такназываемый fusion-пептид. При связывании рецептора белком оболочки происходит изменение конформации С-концевого домена SU, которое влечет за собой перестройку ТМ и экспонирование fusion-пептида [39]. Особенности проникновения вируса в цитоплазму менее изучены. Fusion-пептид каким-то образом взаимодействует с компонентами клеточной мембраны и вызывает слияние мембран вируса и клетки [101] [79] (рис. 6). Существуют предположения о необходимости дополнительного корецептора на поверхности клетки, который вовлекается после узнавания соответствующего первичного рецептора и необходим для слияния мембран [87] [98]. В настоящее время идентифицировано и описано несколько типов первичных рецепторов, представляющих собой трансмембранные белки-переносчики низкомолекулярных соединений [100].

Вирусы с липопротеидной оболочкой могут проникать в цитоплазму как через слияние с мембраной клетки прямо на ее поверхности, так и через образование эндосом, в которых происходит слияние мембран [55]. Проникновение через эндосомы характерно для вирусов, у которых белок оболочки претерпевает конформационные перестройки при изменении рН (в эндосомах происходит снижение рН). Для ретровирусов не установлено единого механизма попадания капсида в цитоплазму. Ультраструктурные исследования слияния мембраны вириона HIV-1 с клеткой показали наличие обоих способов интернализации: как рецептор-опосредованным эндоцитозом, так и прямым слиянием мембран у поверхности клетки [32]. Для вирусов лейкоза мышей косвенные исследования также свидетельствуют о реализации этих двух возможностей [4] [74] [57].

Обратная транскрипция и интеграция в геномПосле проникновения в цитоплазму еще в составе капсида происходит обратная транскрипция, в результате которой на матрице РНК синтезируется двуцепочечная ДНК (рис. 7). Для обратной транскрипции необходимы дваосновных цис-элемента: PBS, который служит для связывания праймера для синтеза «минус» цепи и РРТ, который сам является затравкой для образования «плюс» цепи. Обратная транскриптаза (ревертаза) проявляет следующие активности: (1) синтез ДНК на матрице РНК, (2) синтез ДНК на матрице ДНК, (3) расщепление РНК в дуплексе с ДНК (т. н. активность РНКазы Н). Наличие всех трех функций обеспечивает осуществление стадии обратной транскрипции.

РВ-.J U14ГЛ Л (A) i. Щ : R (А) 3- (А) 3я) 5к) 4. ( о»;| к ids a рТЧ £ j у5 P0S;dbж) Удаление РНК п тРНК РНКа зой Н 1 $ тяв й ШШ пятз) В юрой "прыжок"4и) Завершение синтеза обоих цепей ДНКLTTtПровпрусная ДИК LTRРисунок 7 Схема обратной транскрипцийОбразованная двуцепочечная молекула ДНК интегрирует в геном клетки. Для этого она должна попасть в ядро, если вирус обладает специальными транспортными белками с сигналом ядерной локализации, или дождаться деления клетки, во время которого ядерная мембрана разрушается. В интеграции участвует интеграционный комплекс, состоящий из вирусной интегразы и клеточных белков.^ Удаление нуклеотидов с 3' конца^ Внесение ступенчатого разрыва в ДНК клеткиЛигированиеРепарация брешейРисунок 8. Интеграция ретровирусов в геном клетки.

На внешних концах обоих LTR вирусной ДНК расположены att-сайты, частично инвертированные повторы, необходимые для интеграции. Интеграционный комплекс сближает и укорачивает att-сайты на несколько оснований, так что появляются выступающие липкие концы. В геномную ДНК вносится ступенчатый разрыв, укороченные концы вирусной ДНК лигируются с удлиненными концами клеточной ДНК, выступающие нуклеотиды удаляются, а образовавшиеся бреши репарируются клеточными ферментами (рис. 8). Интеграция, как правило, не сайт-специфическая, место выбирается случайно, с некоторым предпочтением активному, деконденсированному хроматину. С момента интеграции встроенная ДНК провируса ведет себя как часть клеточного генома, являясь самостоятельной транскрипционной единицей. Все генетические процессы с ДНК провируса (репликация, транскрипция) происходят с участием клеточных ферментов.

Транскрипция провируса, синтез вирусных белков и сборка вирионаТранскрипция осуществляется клеточной РНК-полимеразой II, синтезирующей все хозяйские матричные РНК и некоторые малые ядерные РНК. Доказательства этого факта были получены при изучении чувствительности транскрипция провируса к а-аманитину — ингибитору РНК-полимеразы И, и при изучении регуляторных последовательностей ретровирусного генома. Было обнаружено, что в регуляторных участках генома ретровирусов находятся сайты связывания клеточных транскрипционных факторов РНК-полимеразы И.

В результате транскрипции образуется вирусспецифическая РНК, подвергающаяся процессингу: кэпированию, полиаденилированию и сплайсингу. Промоторы и энхансеры, необходимые для транскрипции находятся в U3 элементе, и именно от них зависит уровень транскрипции провируса.

Рассмотрим элементы, контролирующие транскрипцию провнруса, на примере вируса лейкоза мышей Молони.

Схематично строение LTR данного вируса показано на рис. 9Mo-MLV LTRпрямые повторыэнхансер (+)промоторыFACTOR АH3S (-)tsaij^Рис 9. Строение э нх а не ерно-промотор нон областивируса лейкоза мышеи Молони U3. R. U5 - области LTRобозначены сайты связывания факторов транскрипции "-" ц " f" обозначены области, ответственные за подавление и усиление транскрипции, соответственноРегуляторные элементы, выполняющие функции промотора и энхансера, локализованы в IJ3 элементе.

Промотор содержит ТАТА-блок и набор цис-активных элементов, расположенных непосредственно вблизи этого блока. На большем расстоянии от ТАТА-блока находится энхансер. Он был идентифицирован по аналогии с 75-нуклеотидными повторами вируса SV-40, так как состоит из двух блоков приблизительно такой же длины. Между ними наблюдается некоторая гомология, как и между энхансером Mo-MuLV и «епсЬапсег соге»-элементом полиомавирусов. Показано, что энхансер Mo-MuLV может выполнять свою функцию даже в случае использования гетерологичных промоторовРегуляторные участки промотора и энхансера Mo-MuLV имеют сайты связывания для ряда клеточных транскрипционных факторов. Многие эти сайты находятся близко друг от друга, и даже могут перекрываться. Такое расположение этих сайтов, как полагают, необходимо для того, чтобы соответствующие факторы могли взаимодействовать друг с другом (или конкурировать), что является, видимо, необходимым для функционирования промоторов и энхансеров.

На сегодняшний день охарактеризованы следующие транскрипционные факторы, связывающиеся с промоторно-энхансерными областями LTR:1) члены семейства Ets. Для данных факторов есть по два сайта связывания в каждом повторе энхансера. В этом семействе насчитывается более 20 представителей, и до сих пор не очень понятно, какие именно представители этого семейства вовлечены в регуляцию транскрипции Mo-MuLV.

2) Так называемый Core-Binding Protein (СВР). Показано, что данный фактор взаимодействует с факторами семейства Ets и также является активатором транскрипции.

3) NF-1 фактор, который имеет по два сайта связывания в каждом повторе, и этот фактор является представителем семейства малых ДНК-связывающих белков.

4) MCREF-1 ( Mammalian C-type Retrovirus Enhancer Factor ) является лишь частично охарактеризованным клеточным белком, сайт связывания которого перекрывается с сайтами связывания для Ets и СВР.

5) GR - рецептор глюкокортикоидных гормонов, тоже имеет сайт связывания в энхансерной области Mo-MuLV. Показано, что транскрипция генно-инженерных конструкций, содержащие такой сайт, активируется глюкокортикоидами. Показано, что данный сайт связывания перекрывается с сайтом связывания (такназываемый «Е-box») с которым связываются представители самейства bHLH (basic Helix-Loop-Helix).

6) ELP - (embryonal LTR-binding protein) является представителем суперсемейства ядерных гормональных рецепторов и выполняет функцию ингибитора транскрипции.

7) UCRBP (upstream concerved region binding protein, также обозначается как YY-1 и NF-E1) связывается с расположенным на 5'-конце LTR сайленсером и опосредует репрессию транскрипции.

8) pbs область ретровирусного генома тоже является сайтом связывания регуляторных факторов (некий фактор А), которые являются репрессорами транскрипции.

К сожалению, до настоящего времени не удалось понять, какие из факторов регулируют транскрипцию провируса in vivo. Вероятно, это происходит потому, что в клетках-мишенях Mo-MuLV экспрессируется большое количество различных факторов, что и затрудняет точную идентификацию.

Надо отметить, что если в группе вирусов млекопитающих С-типа сайты связывания транскрипционных факторов достаточно консервативны, то среди ASLV (Avian Sarcoma-Leukosis Viruses) вирусов сайты связывания отличаются от одного вируса к другому.

Практически у всех ретровирусов семейства MLV единственным продуктом транскрипции является полноразмерная геномная РНК, с которой должны синтезироваться все белковые продукты. Для этого вирусы используют различные стратегии: перекрывание генов, сплайсинг РНК и процессинг белков. Сплайсинг происходит в ядре, затем РНК должны выйти из ядра, как субгеномные, так и полноразмерные. Соотношение количества полноразмерной и субгеномной РНК может быть различным. Регуляцияэтого соотношения у простых и сложных ретровирусов происходит по различным механизмам. В геноме простых вирусов, таких как MLV, находится один донорный и один акцепторный сайт сплайсинга. Как правило, основным регулирующим фактором является неполное использование сайтов сплайсинга; кроме того у многих вирусов есть цис-элементы, позволяющие транспортировать полноразмерные РНК из ядра в цитоплазму (СТЕ). У сложных ретровирусов в регуляцию сплайсинга и выхода из ядра вовлекаются белковые факторы. Например, у HIV и HTLV на начальной стадии из ядра транспортируются субгеномные РНК, кодирующие регуляторные белки, позволяющие выйти несплайсированным РНК.

Матрицей для синтеза вирусных белков является РНК, синтезированная РНК-полимеразой И. В случае Mo-MuLV после транскрипции и процессинга образуются два типа РНК — полноразмерная, которая является матрицей для синтеза белков-продуктов генов gag, pro и pol и сплайсированная РНК, которая является матрицей для синтеза белков-продуктов гена env. Надо отметить, что полноразмерная РНК служит и геномной, однако известно, что РНК не может упаковываться в вирион, будучи связанной с полирибосомами. Механизм, с помощью которого некоторая часть полноразмерной РНК избегает связывания полирибосомами и, следовательно, может быть упакована в вирион, пока неустановлен.

Процесс инициация трансляции с вирусной РНК сходен с таковым для клеточных РНК. Инициаторным кодоном, как обычно, является AUG. В случае ретровирусов, однако, матричная РНК имеет ряд особенностей — выраженная вторичная структура на 5'-конце РНК и открытые рамки считывания перед инициаторным кодоном гена gag. В настоящее время неустановленно, каким образом рибосома проходит эти рамки считывания.

Выраженная вторичная структура 5'-концевой области вирусной РНК необходима для осуществления ряда стадий жизненного цикла ретровируса -для обратной транскрипции, упаковки РНК в вирион и ее димеризации.

Однако наличие такой структуры мешает рибосоме осуществлять сканирование РНК. По всей видимости, используется какой-то альтернативный механизм для инициации трансляции. По крайней мере, было показано, что в РНК вируса F-MuLV есть IRES-подобная последовательность [10]. Продемонстрировано, что экспрессия gag может осуществляться кэп-независимо, и что такая IRES-подобная последовательность может направлять синтез генов в бицистронных РНК.

Так или иначе, с полноразмерной матричной РНК полирибосомами синтезируется полипротеин gag (и gag-pro-pol). У большинства ретровирусов он претерпевает ряд ковалентных модификаций, среди которых наиболее частой является N-миристилирование концевого глицина. Эта модификация считается наиболее важной для функций gag-белка, потому что она позволяет белку заякориваться в мембране. Она является необходимой для заякоривания, но недостаточной, так как было показано, что аминокислоты, окружающие миристилированный остаток Гли, также являются необходимыми для этого процесса [82]. К другим ковал ентным модификациям относится фосфорилирование и ацетилирование.

Во время репликации ретровирусов белковые продукты гена gag необходимы в больших количествах, потому что они выполняют структурную роль. Белковые продукты генов pro и pol необходимы в меньших количествах, так как они являются ферментами. У ретровирусов существует механизм, который обеспечивает согласованный синтез большого количества Gag белка и синтез меньшего количества Pro и Pol белков. Заключается этот механизм в следующем — гены gag, pro и pol транслируются с одной РНК. На 3"-конце гена gag есть терминирующий кодон, на котором в большинстве случаев происходит терминация трансляции. Однако периодически происходит проскок этого кодона и трансляция продолжается в область генов pro и pol и в этом случае синтезируется большой белок-предшественник Gag-Pro-Pol. Эффективностьпроскока не очень велика, так что на каждые 10-20 молекул gag приходится 1 молекула Gag-Pro-Pol [42].

Такой проскок терминирующего кодона происходит двумя способами. В случае вирусов С-типа млекопитающих осуществляется подавление функции этого терминирующего кодона и он транслируется как смысловой ко дон.

У большинства же ретровирусов используется механизм сдвига рамки считывания (frameshifting). Происходит сдвиг рамки считывания рибосомой (на -1 нуклеотид в 5'-направлении). При этом, естественно, терминирующий кодон считывается как смысловой и трансляция продолжается в область генов pro и pol [36].

Трансляция гена env осуществляется со сплайсированной РНК, в которой удалены последовательности генов gag, pro и pol. Механизм синтеза белка-предшественника осуществляется по тому же механизму, что и для клеточных поверхностных и секреторных белков. Инициация трансляции осуществляется на свободных рибосомах. После синтеза сигнального N-концевого пептида (его длина варьирует для разных ретровирусов) он специфически распознается SRP (signal recognition particle) и с их помощью транспортируется к мембране эндоплазматического ретикулума, после чего сигнальный пептид встраивается в мембрану. В дальнейшем, при протекании трансляции, синтезируемый белок транслоцируется через мембрану в полость эндоплазматического ретикулума.

Параллельно с транслокацией происходит два типа модификаций белка — это протеолитическое отщепление лидерного пептида, катализируемое клеточной сигнальной пептидазой и второй тип модификаций — это N-гликозилирование. Показано, что гликозилирование осуществляется точно по такому же механизму, что и для клеточных белков — промежуточным медиатором гликозилирования является долихол, на котором собирается полисахаридный «блок» следующего состава — Глюкозаз-Маннозаб-N-ацетилглюкозаминг и в дальнейшем такой блок переносится насинтезируемый белок (в данном случае - на белок- предшественник env) [1]. Гликозилирование осуществляется по аспарагину в составе следующей канонической последовательности - Асп-Х-(СерЛГре), где X - любая аминокислота, кроме пролина. Число сайтов гликозилирования весьма сильно различается у разных ретровирусов - у MLV их 6, у HIV - около 30. В дальнейшем присоединенные к белку env остатки Сахаров претерпевают модификацию клеточными ферментами - глюкозидазой 1, глюкозидазой 2 и маннозидазой эдоплазматического ретикулума.

На С-конце белка-предшественника env находится длинный обогащенный гидрофобными аминокислотами участок (длиной в 27 — 40 аминокислотных остатков), который заякоривает белок-предшественник в мембране. Было показано, что если ввести стоп-кодон непосредственно перед этим участком, белок env не остается ассоциированным с мембраной и обнаруживается в пространстве эндоплазматического ретикулума и секретируется из клеток [11]. После этого участка в составе env находится длинный цитоплазматический «хвост» длиной от 30 до более чем 100 аминокислотных остатков в зависимости от вируса.

Перед тем, как белок-предшественник env будет транспортирован на поверхность клетки из эндоплазматического ретикулума, он должен соответствующим образом собран в олигомерную функциональную структуру, как правило — в виде тримера. Процесс олигомеризации является довольно медленным и именно он считается лимитирующим в сборке вириона. В случае ВИЧ и ASLV показано, что полувремя этого процесса — около 2-х часов [24]. Для вируса гриппа, к примеру, это время - 20 минут. Судя по всему, этот процесс занимает столько времени из-за двух причин -во-первых, эндоплазматический ретикулум - место интенсивного метаболизма клеточных белков. Следствием этого является наличие в его полости большого количества различных белков, в том числе и не до конца синтезированных, поэтому могут образовываться различного рода агрегаты между разными белками благодаря гидрофобным взаимодействиям, чтоможет мешать белкам принимать правильную конформацию и, соответственно, мешать олигомеризации.

Вторая причина — среда в полости эндоплазматического ретикулума обладает высоким окислительно-восстановительным потенциалом, следствием чего является легкость окисления сульфгидрильных групп белков и последующего образования дисульфидных связей, причем связи могут образовываться между различными белками и мешать образованию правильной трехмерной структуры белка.

Для предотвращения образования нежелательных гидрофобных взаимодействий между белками и обеспечения образования правильной пространственной структуры, в эндоплазматическом ретикулуме находится большое количество шаперонов, таких как BiP (immunoglobulin-heavy-chain binding protein), кальнексин и кальретикулин, которые в том числе участвуют и в сборке белка env. Считается, что взаимодействия с шаперонами предотвращает и транспорт неполностью собранных олигомеров белка env изэндоплазматического ретикулума.

Полагают, что в олигомеризации наиболее важную роль играет ТМ субъеденица белка [25]. Показано, что в отсутствие ТМ SU субъеденица экскретируется из клеток в мономерной форме. В то же время, ТМ субъеденица даже в отсутствие SU сохраняет способность к олигомеризации и транспорту на клеточную поверхность в олигомерной форме. Показано, что цитоплазматическая часть ТМ и трансмембранный гидрофобный домен не играют особой роли в олигомеризации, тем не менее точный механизм олигомеризации неизвестен.

Во время синтеза и олигомеризации env возникает проблема взаимодействия env с молекулами рецепторных белков, потому что они тоже синтезируются и претерпевают ковалентные модификации в пространстве эндоплазматического ретикулума. Такое взаимодействие может нарушать транспорт env на поверхность клетки. Существует несколько путей решения этой проблемы. В случае ВИЧ эта проблема решается с помощьювспомогательного белка vpu, который связывает цитоплазматический домен CD4 (рецептор для ВИЧ) и индуцирует его деградацию.

Другие ретровирусы используют другие способы решения этой проблемы. В основном эта проблема решается тем, что уровень экспрессии env значительно превышает уровень экспрессии рецепторных белков. Таким образом, небольшая часть env связывается с рецепторными белками в пространстве эндоплазматического ретикулума и не транспортируется на поверхность, но это не оказывает значительного влияния на общий уровень env на поверхности клетки. Однако такое взаимодействие имеет и другое следствие — рецепторные белки оказываются связанными с env и становятся неспособны служить рецептором для других вирусов, что и является основой вирусной интерференции.

В дальнейшем происходят события, играющие очень важную роль в жизненном цикле ретровирусов. Хотя уже в эндоплазматическом ретикулуме олигомеризованный полипротеин env способен связываться с рецептором, он не обладает фьюзогенной активностью (в данном случае под термином фьюзогенная активность подразумевается способность вызывать слияние мембран клетки и вириона после взаимодействия с клеточным рецептором). Такая активность приобретается им после расщепления белка на SU и ТМ субъединицы [71]. Происходит это в аппарате Гольджи, куда белковый комплекс попадает из эндоплазматического ретикулума по пути к клеточной мембране, под действием клеточной протеазы фурина, или протеазы с очень близкой субстратной специфичностью [33].Эта эндопептидаза схожа с бактериальным ферментом субтилизином. Она связана с мембраной аппарата Гольджи и расщепляет полипептидную цепь после следующей последовательности - Арг-Х-Лиз или Арг-Арг, которая содержится (в том числе) во всех полипротеинах-предшественниках env. После расщепления на SU и ТМ происходит, видимо, конформационная перестройка олигомерного комплекса, вследствие чего высвобождается так называемый «пептид слияния» (fusion peptide), который находится на N-конце ТМ. Надо отметить,что термин «высвобождается» отражает только факт приобретения этим доменом белка своей функциональной активности, которая проявляется после взаимодействия белкового комплекса с белком-рецептором.

В аппарате Гольджи происходит не только расщепление белка-предшественника env, но и другие его модификации - это изменения состава олигосахаридов, присоединенных к env, а также О-гликозилирование остатков серина и сульфатирование олигосахаридов [12]. Насколько важны такие модификации для функционирования ТМ и SU, до сих пор неясно.

После синтеза вирусных белков происходит сборка вириона. Считается, что наиболее важную роль в этом процессе играет белок-предшественник gag. Для обеспечения этого процесса этот полипептид должен обладать, как минимум, способностями обеспечивать отпочковывание вириона от клеточной мембраны и обеспечивать упаковку остальных компонентов вириона (РНК, env, и gag-pro-pol и т.п.). Надо отметить, что в составе белка gag имеются довольно консервативные последовательности. Одна из них называется MHR (major homology region). Эта последовательность состоит из 20 аминокислотных остатков, более половины из которых являются консервативными [69] во всех группах ретровирусов, кроме спумавирусов, у которых данная последовательность отсутствует [81]. Такая последовательность обнаружена и у части ретроэлементов, таких как ТуЗ. Локализована она в СА белке, и ее функция пока неясна. На сегодняшний день с помощью мутационного анализа получены довольно спорные данные по поводу ее роли. Показано, что она играет роль в обеспечении стабильности нуклеокапсида (мутанты нестабильны в неионных детергентах). Некоторые мутации уменьшают количество отпочковывающихся вирионов, другие не уменьшают количество вирионов, но снижают их инфекционность [78] [78] [22].

Другая консервативная последовательность в составе белка-предшественника (отсутствует у спумавирусов) - это один или два блокацистеиновых остатков (Цис-Хг-Цис-Хд-Гис-Хд-Цис) в составе NC белка. Каждый такой блок связывает один атом цинка и обладает РНК-связывающей активностью [93].

В составе предшественника gag выделяют три функциональных домена - М, L и I. М-домен ответственен за ассоциацию gag с мембраной. L-домен вовлечен в отпочковывание вириона от мембраны. I-домен — ответственен за межмолекулярные белковые взаимодействия gag-gag и ассоциацию их с друг другом.

М-домен находится на N-конце белка-предшественника gag. У большинства ретровирусов (исключая ASLV) он миристилирован (миристилирован остаток глицина), о чем уже говорилось выше. Считается, что остаток миристата встраивается в цитоплазматическую мембрану клетки и заякоривает в ней белок gag. Стабилизация этого взаимодействия с мембраной достигается наличием поблизости от этого остатка блока основных аминокислот, которые формируют □-структуру вблизи мембраны и за счет электростатических взаимодействий между положительно заряженными остатками аргинина и лизина белка и несущими отрицательный заряд молекулами фосфолипидов цитоплазматической мембраны [106]. Интересно, что М-домен может быть замещен не только М-доменами других ретровирусов без нарушения эффективности созревания вирионов, но и замещен на гетерологичные мембранно-связывающие домены клеточных белков, как это показано для pp60c"src белка [52].I- домен ответственен за межмолекулярные взаимодействия gag-gag. Он находится в составе NC белка зрелого вириона. Показано, что мутации, затрагивающие этот регион, нарушают ассоциацию gag-gag и уменьшают плавучую плотность образующихся вирионов, что указывает на уменьшение количества белков в их составе.L-домен (от late stage) играет важную роль на поздних стадия образования вириона, а точнее - собственно на стадии отпочковывания вириона от мембраны клетки. Этот домен очень небольшой по размерам, и уразных ретровирусов находится в разных участках gag белка. На примере ВИЧ было показано, что мутанты по данному домену формируют вирионы, но они не могут отпочковываться от мембраны и остаются связанными с ней [30]. Интересно, что L-домен, также, как и М-домен, можно заменять на домены других ретровирусов. Пока неясно, каким именно образом этот домен участвует в отпочковывании вириона.

Помимо этих доменов, в формировании вирионов роль играют и другие участки белка gag. Показано, что последовательности белка СА в составе белка gag влияют на размер образующихся вирионов. После внесения мутаций в данную область было обнаружено образование аномально больших вирионов [31].

В сборке и отпочковывании вириона от клеточной мембраны важную роль играют также и клеточные белки. Для ASLV показано, что их L-домен взаимодействует с Yap (Yes-associated protein) [29]. Yes — это ассоциированная с мембраной клеточная протеинкиназа, которая принимает участие в передаче сигналов от рецепторов внутрь клетки. Для ВИЧ и MLV установлено, что значительные количества белка gag ассоциированы с цитоскелетом клетки, и что разрушение или перестройка цитоскелета нарушает процесс отпочковывания вириона [70]. Кроме того, показано, что в случае ВИЧ его gag белок способен непосредственно взаимодействовать с актином, и что в составе вириона ВИЧ присутствуют цитоскелетные белки, в том числе и актин [67]. Кроме того, роль клеточных белков в формировании вириона можно предполагать исходя из того факта, что формирование вирионов (для С-типа вирионов) и дальнейшее отпочковывание их идет только на цитоплазматической мембране клетки, хотя она составляет не такую уж большую долю всех мембран клетки. Для В и D типов ретровирусов возникают те же проблемы. Их вирионы формируются в цитоплазме, но затем транспортируются к цитоплазматической мембране клетки, от которой они и отпочковываются. От функций каких именно белков зависит такой транспорт, чем определяется отпочковывание вирионовименно от цитоплазматической мембраны — на настоящий день остается невыясненным. Кроме того, было показано, что в полярных клетках, к примеру - эпителиальных, у которых различается базолатеральная мембрана и апикальная мембрана, отпочковывание ретровирусов происходит только от базолатеральной мембраны [68].

Для формирования инфекционной вирусной частицы необходимо упаковать помимо белка gag еще и белок gag-pro-pol, а также вирусную геномную РНК и тРНК, которая служит затравкой в процессе обратной транскрипции. На стадии включения в состав вириона белка-предшественника gag-pro-pol возникают некоторые проблемы. Как было показано, несмотря на наличие в составе этого белка полноценного белка gag, сам по себе белок gag-pro-pol не способен к формированию вирионов. Полагают, что это, скорее всего, связано с особенностями трехмерной структуры белка gag-pro-pol, в которой домены, необходимые для формирования вириона, неспособны к полноценному функционированию, однако при этом сохраняется способность взаимодействовать с белком gag. По крайней мере, для ВИЧ было показано, что упаковка белка gag-pro-pol зависит от последовательности, локализованной в MHR регионе gag (в то время как взаимодействия gag-gag зависят от I-домена, который находится в составе NC). У некоторых мутантов по этому области не происходит включения в состав вириона белка gag-pro-pol [91].

Для успешной упаковки вирусной РНК в вирион необходимо наличие специальной области РНК, которая бы направляла бы этот процесс, так как вирусная РНК содержится в клетке в не слишком большом количестве (считается, что менее 1% тотальной РНК клетки). Кроме того, в состав вирионов практически не включается сплайсированная вирусная РНК, однако зачастую геном ретровирусов претерпевает различные рекомбинации с клеточными генетическими последовательностями, в результате чего часть вирусных генов теряется, и вместо них в геноме содержатся клеточные последовательности. Довольно часто такие химерные геномы способны?0 ССЯЙСКЛи' гп^-'п rtjLti;:;,r.эффективно упаковываться в вирион. Анализ этих данных позволил предположить, что сигналом для упаковки геномной РНК в вирион служит начало гена gag и прилежащий к нему 5Л-некодирующий регион. Эта сигнальная последовательность обозначается как Т-область. Считается, что упаковка геномной РНК в вирион зависит от gag-белка, так как было показано, что при экспрессии одного только гена gag образуются вирионы, которые содержат вирусную РЖ [85]. Включение в состав вириона тРНК, которая в дальнейшем служит затравкой для обратной транскрипции, зависит от RT в составе белка gag-pro-pol.

Включение в состав вириона гликопротеина env (вернее — тримерного комплекса) может происходить по двум механизмам — пассивная и активная упаковка. Пассивный механизм подразумевает, что гликопротеин env свободно диффундирует по клеточной мембране и захватывается при формировании вириона вместе с ней. Этот механизм подтверждается теми фактами, что в составе вириона всегда содержится целый ряд клеточных белков. К тому же, к упаковке в ретровирусный вирион способны не только env других ретровирусов, но и поверхностные гликопротеины других вирусов (к примеру — вируса везикулярного стоматита). Процесс образования химерных вирионов, содержащих геном одного вируса, и поверхностные гликопротеины другого вируса (вирусов) называется псевдотипированием и это явление используется для создания ретровирусных векторов с определенной специфичностью. Данный механизм предполагает, что для упаковки в вирион белок должен свободно диффундировать по мембране, и именно этим можно объяснить преимущественное включение в состав вириона вирусного белка env по сравнению к белками клетки, потому что клеточные мембранные белки, как правило, ассоциированы с другими клеточными белками, в том числе и с цитоскелетом, и их диффузия в мембране сильно ограничена.

Вместе в тем ряд данных подтверждает и другой механизм включения белка env в состав вириона - активный. Данный механизм предполагает, чтовключение env в вирион происходит за счет взаимодействий между env и gag. Для ВИЧ было показано, что мутации в МА (матриксный белок, один из продуктов протеолиза белка-предшественника gag) нарушают включение env в состав вириона, но не нарушается формирование вирионов и их отпочковывание, и что мутации в цитоплазматическом домене ТМ тоже нарушают этот процесс [28].

После сборки вириона происходит следующая важная стадия в жизненном цикле ретровирусов — это расщепление вирусной протеазой белков-предшественников gag, gag-pro-pol и env (в случае env происходит отщепление так называемого R-пептида от цитоплазматического домена ТМ в составе тримеров env). Для С-типа ретровирусов такой протеолиз наблюдается уже после отпочковывания вириона от цитоплазматической мембраны клетки. Вирусная протеаза (PRO или PR) является представителем семейства аспартиловых протеаз, к которым относятся пепсин, ренин и катепсин D. Для этого семейства характерно наличие в активном центре фермента последовательности Асп-(Три/Сер)-Гли и наличие связанной с этим активным центром молекулы воды. На сегодняшний день установлены трехмерные структуры ряда вирусных протеаз, в первую очередь ВИЧ и ASLV. Интерес к протеазе ВИЧ вызван поисками ингибиторов этого фермента для применения в клинической практике.

Показано, что протеаза формирует димер, который и является функционально активным ферментом. Однако наиболее интересно выяснить механизм, с помощью которого активация протеазной активности и связанный с этим процессинг белков-предшественников gag, gag-pro-pol и частично env происходит только после отпочковывания вириона от мембраны. Как было продемонстрировано, преждевременная активация протеазной активности приводит к нарушению формирования вирионов и их отпочковыванию от мембраны [16].

Одно из логичных объяснений — что даже в составе белка-предшественника gag-pro-pol протеаза обладает некоторой остаточнойактивностью и способна (конечно, не слишком эффективно) расщеплять находящиеся вблизи от нее молекулы gag-pro-pol. Однако, концентрация молекул белка-предшественника в цитоплазме не слишком велика, и такая активность может проявиться только когда белки gag и gag-pro-pol будут формировать вирион, и, соответственно, будет наблюдаться их высокая локальная концентрация. И в процессе формирования вириона возникает ситуация, когда протеаза в составе молекулы gag-pro-pol способна расщеплять соседние молекулы gag и gag-pro-pol и рано или поздно ее активность приведет к освобождению полноценной вирусной протеазы [107]. Так как активность протеазы в составе белка-предшественника не слишком велика, то до того, как это произойдет, видимо, вирион успевает полностью сформироваться и отпочковаться от клеточной мембраны.

Однако, такое объяснение подходит только для С-типа ретровирусов, вирионы которых формируются около цитоплазматической мембраны. Для В и D -типов такое объяснение не подходит, так как их капсиды формируются в цитоплазме клеток и только потом транспортируются к клеточной мембране. В этом случае, локальная концентрация всех белков очень велика, однако процессинг вирусных белков не происходит до того момента, пока вирион не будет отпочковываться от мембраны. Что служит сигналом начала процессинга вирусных белков в этом случае - совершенно непонятно.

Помимо вирусных белков, было продемонстрировано, что вирусная протеаза способна расщеплять и ряд клеточных белков, например предшественник NF-kB и белки цитоскелета [86]. Какую роль такая функция вирусной протеазы играет в жизненном цикле ретровирусов — еще предстоит выяснить.

Процессинг вирусных белков предшественников gag, gag-pro-pol и env происходит либо в процессе почкования, либо сразу после отпочковывания от цитоплазматической мембраны, так как почти сразу после отпочковывания от нее ретровирусные вирионы приобретают морфологию зрелых вирусных частиц. При процессинге этих белков образуются все белкиретровирусного вириона - из gag - MA, СА, NC и некоторые малые белки, из gag-pro-pol - те же белки а также PRO (протеаза), IN (интеграза) и RT (обратная транскриптаза). При процессинге env происходит отщепление от цитоплазматического домена ТМ-субъеденицы короткого пептида, так называемого R-пептида, что приводит к значительному усилению фьюзогенной активности всего комплекса SU-TM (под фьюзогенной активностью подразумевается способность этого комплекса вызывать слияние мембран, что необходимо для проникновения вируса в цитоплазму клетки взаимодействия с рецептором при заражении). Показано, что удаление мутагенезом этого пептида приводит к формированию env, фьюзогенные свойства которого приводят к эффективному формированию синцитиев соседними клетками-продуцентами вируса [14].

Взаимодействие вирусов с клеточными рецепторами и син цитиеобразованиеСлияние мембран при контакте клетки с ретровирусом может приводить к иным последствиям, нежели проникновение капсида в цитоплазму. В ряде случаев при попытке заражения ретровирусом происходит слияние соседних клеток, образуются многоядерные клетки, или синцитии. Описано два механизма слияния клеток: «извне» и «изнутри» [99].

Образование синцитиев «извне» протекает по механизму, сходному с проникновением вируса в клетку: вирион прикрепляется к поверхности клетки, субъединица SU взаимодействует с рецептором, это влечет за собой экспонирование fusion-пептида, ответственного за слияние. Этот процесс может одновременно происходить между одной вирусной частицей и несколькими окружающими ее клетками. В результате вирусная частица служит мостиком между этими клетками и происходит их слияние. Образовавшиеся синцитии, как правило, нежизнеспособны и гибнут в течение нескольких дней. Синцитиеобразование может иметь важноезначение в патогенезе заболеваний, вызванных различными вирусами. Например, некоторые варианты HIV обладают цитопатическим действием, индуцируя слияние клеток [95]. SIV (simian immunodeficiency virus) также может вызывать образование многоядерных клеток в мозге, индуцируя развитие энцефалита [88].

Причины, по которым в некоторых условиях происходит слияние клеток, точно не установлены. Однако показано, что эффективность синцитиеобразования зависит от выбранного ретровируса, свойств клеточной линии, уровня экспрессии рецептора [87], а так же липидного состава мембраны клетки и вируса [103] [83]. Многие исследования были направлены на идентификацию районов белка оболочки, ответственных за слияние. Было показано, что способность вируса вызывать образование синцитиев зависит от последовательности пролин-богатого района SU [51]. Изменение его конформации является триггером для экспонирования fusion-пептида ТМ-белка, как в случае слияния мембран вируса с клеткой, так и соседних клеток.

Способность вызывать образование синцитиев «извне» исследовали у мутантных вариантов вируса лейкоза мышей Молони. Анализ мутаций показал, что синцитиеобразующая активность появлялась у вирусов с измененным пролин-богатым участком субъединицы SU белка оболочки, причем мутации влияли на характер гликозилирования gp70 [3]. Т. о., вероятно, существует взаимосвязь пролинового участка gp70, гликозилирования белка оболочки и синцитиеобразования.

Как уже говорилось выше, синцитиеобразующая активность вируса резко возрастает после процессинга ТМ, в результате которого происходит его расщепление на р12Е и р2Е (R-пептид) [79]. Судя по всему, R-пептид в составе полноразмерного ТМ каким-то образом подавляет синцитиеобразующую активность, препятствуя слиянию мембран до того, как сформировался вирион.

Образование синцитиев «изнутри» может происходить при сокультивировании клеток, экспрессирующих ретровирус, и клеток, обладающих рецептором к нему. Образование синцитиев по механизму "изнутри" впервые наблюдали при смешанной культуре клеток крысы ХС и клеток, продуцирующих экотропный вирус лейкоза мышей Молони Мо-MuLV [49]. Амфотропные ретровирусы также способны индуцировать синцитиеобразование «изнутри», но с меньшей эффективностью [51]. Механизм слияния схож с описанным для слияния «извне» с тем отличием, что белок оболочки находится на поверхности клетки-продуцента ретровируса. Он взаимодействует с рецептором соседней чувствительной клетки, в результате вовлекаются механизмы слияния мембран и образуются многоядерные клетки [75]. Моноклональные антитела к gp70 ингибируют слияние, что указывает на необходимость связывания SU с клеточным рецептором при образовании синцитиев «изнутри» [72]. Синцитиеобразование «изнутри», как и «извне», может быть связано с характером гликозилирования белка оболочки вируса [45].

Образование синцитиев можно наблюдать визуально за достаточно короткий промежуток времени, поэтому на этом явлении построены системы определения продукции ретровирусов или наличия рецептора на поверхности клетки, а так же интерференции между вирусами [84] [89].

Группы интерференции ретровирусов семейства MLVРетровирусы С-типа семейства вирусов лейкоза мышей (MLV, или MuLV) делят на несколько групп в соответствии с используемыми рецепторами и спектром заражаемых клеток [80]. После инфицирования клетки каким-либо ретровирусом клетка становится устойчивой к повторному заражению другими вирусами, использующими тот же рецептор для заражения. Это явление называется интерференцией. Группы вирусов, использующих общие рецепторы (группы рецепторов), называют группамиинтерференции. Механизм интерференции точно не установлен. Предполагают, что SU белок, экспонированный на поверхности зараженной клетки, блокирует сайты узнавания на клеточном рецепторе [92] [60].

На сегодняшний момент показано, что в механизме интерференции задействовано, как минимум, два механизма — снижение уровня экспрессии рецептора и маскировка рецептора SU субъединицей.

Как правило, интерференция - реципрокное явление, т. е. если один вирус блокирует заражение другим вирусом, то верно и обратное: второй блокирует заражение первым. Однако в некоторых случаях наблюдали нереципрокную интерференцию. Например, вирус 10А1 интерферирует с амфотропными вирусами, в то время как сам он может заражать клетки, экспрессирующие амфотропный вирус. Причина стала ясна, когда показали, что 10А1 использует два рецептора Pitl и Pit2, а амфотропные вирусы -только Pit2. Т. о., если рецептор для амфотропных вирусов Pit2 блокирован, то 10А1 может проникать в клетку, используя Pitl [80]. В ряде случаев наблюдали нереципрокную интерференцию между поли- и ксенотропными вирусами [18, 26], несмотря на то, что вирусы данных групп используют общий рецептор. Причина этого явления точно неизвестна.

Блокирование заражения может быть обусловлено как отсутствием доступного рецептора на клеточной поверхности, так и рядом других причин. Например, линия клеток мышиной эмбриональной карциномы, обладающая клеточным рецептором для экотропного MLV, тем не менее устойчива к его инфекции, т. к. не экспрессирует факторы транскрипции, необходимые для активации промотора ретровируса (постинтеграционный блок). Кроме того, ряд клеток Mus musculus обладает генами семейства Fv, продукты которого могут управлять репликацией ретровирусов, не позволяя произойти той или иной стадии жизненного цикла. Продукт гена Fv-1 взаимодействует с одним из продуктов гена gag, блокируя инфекцию на преинтеграционном уровне [44]. Ген Fv-4 представляет собой ген env эндогенного экотропного ретровируса, находящийся под влиянием клеточного промотора [41].

Продукт гена Fv-6 является регулятором экспрессии гена env эндогенного политропного ретровируса [27]. Т. о. Fv-4 и Fv-б отвечают за экспрессию эндогенных генов env, в результате блокируются рецепторы на поверхности клеток (эндогенная интерференция) [15]. Возможно, что в ходе эволюции клетки стали использовать интерференцию как механизм защиты от суперинфекции или реинфицирования путем регулирования этого явления своими внутренними механизмами [99].

Остановимся подробнее на классификации MLV (вирусов лейкоза мышей) домовой мыши Mus musculus, которые изучены наиболее полно (таблица 1). Ранее их делили на три группы в зависимости от спектра хозяев: экотропные (способные заражать только клетки грызунов), ксенотропные (заражающие клетки других видов, но не заражающие клетки грызунов) и амфотропные (способные заражать как клетки грызунов, так и клетки других видов) вирусы. Позже было показано, что амфотропные ретровирусы — неоднородная группа и из них выделил три группы - собственно амфотропные, политропные и 10А1 вирус. Таким образом, до недавнего времени было известно пять групп интерференции MLV М musculus и описано три семейства клеточных рецепторов [100]. Все они выполняют функцию трансмембранных переносчиков:1) CAT - транспорт основных аминокислот.

2) Pit - транспорт неорганического фосфата.

3) Syg - предположительно транспорт фосфата.

Таблица 3. Группы интерференции вирусов семейства MLV.

Группа интерференции Используемый рецептор Спектр хозяев ПредставителиЭкотропные mCATl Мышь, крыса Mo-MuLVКсенотропные Sygi Клетки многих видов животных, за NZB исключением мышей Политропные sygi Клетки многих видов животных, включая мышей MCFVАмфотропные Pit2 4070А10А1 Pitl, Pit2 10А1Ретровирусы, заражающие лишь клетки грызунов, относят к группе экотропных MLV (oikos — греч. «дом»), или E-MLV. Клеточный рецептор для этих вирусов представляет собой белок mCATl, состоящий из 622 аминокислот и содержащий 14 гидрофобных трансмембранных доменов [2]. mCATl присутствует на поверхности клеток большинства тканей мышей. Исследование экспрессии mCATl в ооцитах лягушки путем инъекции mRNA в клетку показало, что функция этого белка — Na-независимый транспорт положительно заряженных L-аминокислот (аргинина, лизина, орнитина и гистидина), а так же Na-зависимый транспорт серина и гомоцистеина [48] [97]. Топология и функциональная активность mCATl позволяют отнести его к целому семейству белков у+, транспортирующих в клетку основные аминокислоты [102]. Наиболее важная роль в связывании рецептора Мо-MuLV принадлежит аминокислотным остаткам Arg-83 и Arg-95 белка оболочки, которые могут взаимодействовать с отрицательно заряженными остатками или делокализованными пи-электронами гидрофобных аминокислот в составе транспортера основных аминокислот mCATl [5]. При продуктивной инфекции экотропными MuLV клетки остаются жизнеспособными, несмотря на блокирование рецептора, которое может привести к потере его функциональности. Тем не менее, предполагают, что mCATl сохраняет свою функцию за счет того, что сайт связывания аминокислот удален от места узнавания белка оболочки вируса в молекуле рецептора [96].

Эндогенные вирусы мышей, способные инфицировать клетки других видов млекопитающих и лишь в редких случаях клетки диких мышей, называют ксенотропными (xenos - греч. «чужой» [53] [34]), или X-MLV. Ксенотропные вирусы лейкоза мышей интерферируют с политропными вирусами во многих линиях клеток, поэтому предполагали, что вирусы этих групп используют общий клеточный рецептор [6] [50]. В пользу этой гипотезы так же говорило и то, что последовательности аминокислот субъединиц SU белков оболочки, отвечающих за узнавание рецептора, у обеих групп вирусов очень похожи [8]. В то же время спектр их хозяев и патогенез совершенно различен.

Политропные MLV (P-MLV) заражают клетки многих видов млекопитающих [26] и вызывают изменения в культурах клеток норки, поэтому их называют так же вирусами, вызывающими образование фокусов трансформации в культуре клеток норки (mink cell focus forming MLV, MCF-MLV, [19]). Кроме того, в некоторых случаях наблюдали нереципрокную интерференцию ксенотропных и политропных вирусов [58].

Для подтверждения гипотезы об использовании общего рецептора ксено- и политропными вирусами рецептор X-MLV клонировали в экспрессирующий вектор[94]. При переносе рецептора в культуру клеток яичников китайского хомячка СНО, не заражаемую Р- и X-MLV, клетки становились чувствительными к инфекции как политропными, так и ксенотропными вирусами. Путем гибридизации было установлено, что гены рецепторов обеих групп вирусов локализованы на дистальном конце 1 хромосомы в одном локусе. Эти результаты свидетельствуют в пользу того, что ксенотропные и политропные вирусы используют общий клеточный рецептор.

Рецептор для ксено- и политропных вирусов состоит из 696 аминокислот, содержит несколько трансмембранных доменов и экспрессируется в подавляющем большинстве исследуемых тканей. Он проявляет гомологию с дрожжевыми белками Sygl и РН081. Функция Syglточно не известна, но его N-концевой немембранный домен может заменять альфа-субъединицу G-белка при передаче сигнала в клетку [90]. РН081, возможно, вовлечен в регуляцию транспорта фосфата в клетку [104]. Было установлено, что клеточный рецептор для ксено- и политропных вирусов выполняет транспортную функцию.

Предполагают, что политропные ретровирусы могли произойти в результате рекомбинации экотропных вирусов с генами env эндогенных ксенотропных вирусов [17]. В ответ на высокую патогенность вирусов у млекопитающих мог возникнуть полиморфизм рецептора. В результате коэволюции вирусов и организмов-хозяев могли возникнуть разные варианты преодоления вирусом защиты клеток от заражения. Впоследствии дивергенция двух групп ретровирусов привела к различиям в спектре хозяев и неполной интерференции.

Помимо политропных, существуют и другие группы ретровирусов с широким спектром хозяев, заражающих как мышиные, так и клетки других животных.

Амфотропные вирусы (amphos - греч. «оба»), или A-MLV, впервые обнаружили среди экзогенных вирусов домовой мыши Mus musculus [35]. Рецептор для амфотропных ретровирусов клонировали и осуществили перенос в ооциты Xenopus laevis и фибробласты мышей. В среду для культивирования добавили [ Р]-фосфат, затем регистрировали поступление катионов в клетку с помощью микроэлектродов и определяли количество меченого фосфата, поступившего в нее. Было показано, что его рецептор — трансмембранный белок Pit2, осуществляющий симпорт натрия и фосфата в клетку [47]. В то же время еще один ретровирус С-типа GALV (вирус лейкемии гиббонов), близкий MLV по многим свойствам, использует в качестве рецептора белок Pitl, очень похожий на Pit2. Оба белка выполняют сходную функцию, широко распространены в разных тканях и имеют похожее строение. При продуктивной инфекции GALV рецептор блокирован и в значительной степени нефункционален, однако клетки сохраняютжизнеспособность, т. к. работает по крайней мере еще один переносчик фосфата.

К ретровирусам, использующим Na/Pi-симпортеры в качестве рецептора, относится так же вирус 10А1, который образует отдельную группу интерференции с более широким спектром хозяев, чем амфотропные ретровирусы. Он способен заражать клетки китайского хомячка СНО, устойчивые к инфекции амфотропными и политропными вирусами [65]. Было показано, что 10А1 нереципрокно интерферирует с амфотропными MLV. Это говорило о том, что помимо Pit2, он может использовать еще один рецептор [80]. Исследование специфичности связывания белка оболочки амфотропного вируса с рецепторами показало, что достаточно 6 аминокислотных замен для расширения его спектра хозяев до спектра хозяев 10А1 [66]. Было сделано предположение о том, что вторым рецептором 10А1 может служить белок, близкий к Pit2, и им может быть Pit 1. Для проверки этого предположения оба рецептора клонировали в экспрессирующие векторы и вносили их в клетки, устойчивые к инфекции вирусом 10А1. Клетки, экспрессирующие любую из исследованных конструкций, стали чувствительными к заражению 10А1 [59]. Следовательно, данный ретровирус способен использовать как Pit 1, так и Pit2 в качестве рецепторов для проникновения в клетку.

Гомология аминокислотных последовательностей двух белков составляет 60%. Pitl содержит 10 альфа-спиралей, пронизывающих мембрану (См. Рис.10), образующих гексагональный канал с гидрофильной внутренней поверхностью, через который может проникать фосфат-анион [64]. Кроме того, во внеклеточном домене обнаружили предполагаемый Na-связывающий мотив Gly-X-X-X-X-Leu-X-X-X-Gly-Arg [23], присутствующий во многих Na-зависимых преносчиках (переносчики пролина и глутамата Е coli, переносчик глюкозы кролика и человека). Pitl и Pit2 оказались эволюционно очень консервативными. Их гомологи обнаружены у Е coli [76], Neurospora crassa [43] и у людей [46]SU-связывающгш доменсоонклеточная мембранаРис.10 Строение Pitl рецептора Выделен домен,связывающий SU субъеденицу вируса. Числа - номера аминокислотных остатковАмфотропные MLV, 10А1 и GALV составляют группу вирусов, использующих в качестве рецепторов Na/фосфатные переносчики. Столь похожие последовательности SU и спектры хозяев амфотропного ретровируса и 10А1 говорят о близком эволюционном родстве двух групп интерференции. Было показано, что 10А1 мог произойти в результате рекомбинации генома амфотропного вируса 1504А с геномом env эндогенных ксенотропных провирусов, найденных в мышах линии SwissРетровирусы С-типа были изолированы так же из диких видов грызунов Юго-Восточной Азии М caroli [54], М. dunni [13]и М. cervicolor [9]. О их свойствах и классификации на данный момент известно немного. Из М cervicolor выделили эндогенные ретровирусы двух классов: CI и CII. Тип CI обладает классическим ксенотропным спектром хозяев, а по иммунологическим и гибридизационным критериям близок к ретровирусам,[77].выделенным из M.caroli. Обе группы близки по последовательности GALV, а вирус из М. caroli интерферирует с ним. Эндогенный ретровирус из М. dunni (MDEV) образует отдельную группу интерференции с широким спектром хозяев, т. н. группу «мультитропных вирусов». Нуклеотидная последовательность MDEV близка к GALV, однако эти вирусы используют разные рецепторы и относятся к разным группам интерференции. Описанные три подгруппы относят к группе вирусов, родственных GALV. Т. к. ретровирусы М. caroli используют тот же рецептор, что и GALV, а хозяева этих вирусов населяют одну территорию, то было высказано предположение о том, что эндогенный вирус грызуна мог перенестись в гиббона.

Ретровирус CII типа (вирус М813) из М. cervicolor ближе к ретровирусам М. musculus. Спектр хозяев вируса СИ типа ограничен клетками мыши и крысы (экотропный). Было показано, что ген рецептора к М813 расположен на 2 хромосоме [56].

История открытия ретровируса М813В 1997 году было показано, что заражение новорожденных мышей рекомбинантными ретровирусами с белками оболочки амфотропного вируса и 10А1 вируса вызывает развитие губчатой энцефаломиелопатии [62] [63]. Оба типа ретровирусов используют рецептор Pit2 для инфицирования клеток. Помимо Pit2, рецептором для вируса 10А1 служит родственный белок Pitl. Было показано, что характер патологии в случаях амфотропного ретровируса и 10А1 ретровируса различается по тяжести течения и по топологии поражения ЦНС. По-видимому, можно предполагать, что данное различие может объясняться использованием различных рецепторов при заражении. Представлялось интересным проверить действие на новорожденных мышей вируса, использующего только Pitl для проникновения в клетку. Из охарактеризованных вирусов к тому времени только GALV (gibbon аре leukemia virus) использовал Pitl, однако он не заражал клетки мышей [47].

Исследование данных литературы показало, что в изоляте эндогенных ретровирусов из генома Mus cervicolor был найден некий вирус CII, использующий рецептор, ген которого методом клеточных гибридов был картирован на 2 хромосоме, на которой значительно позже был картирован и Pitl [9] [56]. Это привело к предположениям об использовании М813 этого рецептора.

Материалы и методы.

МатериалыВ работе использовали следующие реактивы:Сухой концентрат сред DMEM, MEM и RPMI, 10-кратный концентрат трипсин/ЭДТА фирмы "Gibco BRL."Сыворотка эмбрионов крупного рогатого скота (FCS) фирмы "Sigma".DMSO фирмы "Sigma".

Генетицин (G-418) фирмы "Gibco BRL".HEPES, NaCl, KC1, CaCl2, Na2C03 и др. соли фирмы "Merck".MOPS фирмы "Serva".

Бактотриптон, дрожжевой экстракт, бактоагар фирмы "Difco"Агароза фирмы "BioRad".

Легкоплавкая агароза фирмы "Sigma".

Фенол, хлороформ фирмы "Диа-М".

Формальдегид фирмы "ICN".

Буферы для выделения плазмиды PI, Р2, РЗ, колонки для ионообменной хроматографии, буферы для ионообменной хроматографии QBT, QC, QF фирмы "Qiagen".

Диэтилпирокарбонат фирмы "Sigma".

Краситель Гимза фирмы "Merck".

Эндонуклеазы рестрикции Xbal (Sybenzyme), BamHI (MBI Fermentas) и соответствующие буферы.

Набор для радиоактивного мечения зонда Random Primer Labelling System (Promega).

РНКаза A (DNase free) фирмы «Sigma».

ДНК спермы лосося фирмы "Sigma".

В работе использовали следующее оборудование:СОг - инкубаторы для клеточных культур фирмы «Heraeus».

Центрифуги «Eppendorf 5415С», «Jouan CR 422». Гибридизационная печь Stuart Scientific SI20H.

Прибор для электропереноса SEMI-PHOR ТЕ70 (Hoefer Scientific Instruments).

Для быстрой визуализации результатов Саузерн-блот и Нозерн-блот гибридизации использовали прибор Cyclone Storage Phosphor Screen (A Packard Bioscience Company). Спектрофотометр Genesys 2.

Излучатель коротковолнового УФ Herolab UVT-20S GmbH Laborgerate.

Методы работы с клеточными культурами эукариотВ работе использовали следующие клеточные линии:SC-1 - иммортализованные эмбриональные мышиные фибробласты. NIH ЗТЗРА 317 — линия амфотропных упаковывающих клеток, полученная из иммортализованных мышиных эмбриональных фибробластов NIH ЗТЗ, дефектных по тимидинкиназе, путем котрансфекции гена тимидинкиназы и плазмидной конструкции рРАМ13, содержащей геном MLV с несколькими мутациями.RATI, Ref 52 - иммортализованные фибробласты крысы.COS-1 — нефроциты африканской зеленой мартышкиCf-1 - иммортализованные фибробласты собакиRK13 - нефроциты кроликаНТ1080 — клетки фибросаркомы человекаHeLa - клетки цервикальной карциномы человекаТЕ671 - клетки рабдомиосаркомы человека.

ТЕ671 R895 - линия клеток человека, полученная из линии ТЕ671 путем внесения экспрессирующего вектора R895 с клонированным рецептором для ретровируса М813. Данная линия клеток любезно предоставлена доктором К.

Стокинг-Харберг из Института Экспериментальной Вирусологии и Иммунологии им. Генриха Петте, Гамбург, ФРГ.

Клеточные линии Scl, РАЗ 17, Rati, Ref 52, ТЕ 671 выращивали на среде DMEM с добавлением 10% (по объему) FCS. СНО выращивали на среде RPMI также с добавлением 10% (по объему) FCS. Клетки линий Scl, продуцирующие ретровирус М813, выращивали на среде MEM с 10% FCS.

Пересев клетокИспользуемые реактивы:1. Среда для культивирования клеток с 10% (v/v) FCS.

3. После открепления клеток от поверхности культуральной посуды добавляли среду с FCS и суспендировали пипетированием.

4. Клетки рассеивали на необходимое количество чашек Петри или культуральных флаконов в нужном разведении.

Криоконсервация клетокИспользуемые реактивы:1. Среда для культивирования клеток с 10% (v/v) FCS.

3. Смесь трипсин/EDTA.

4. Смесь FCS + 10% DMSO (v/v)Порядок действий:1. Клеточный монослой промывали PBS.

4. Осадок суспендировали в смеси FCS и 10% DMSO и разливали по 1 мл в ампулы для криоконсервации.

Са2+-фосфатная трансфекция Используемые растворы:1. 2х HBS:Hepes 50 мМКС110 мМГлюкозаNaClNa2HP04280 мМ1.5 мМ12 мМ2. СаСЬ (для работы с клетками) 2 М.

3. Стерильная Н20После приготовления растворы HBS и СаС12 стерилизовали фильтрованием через фильтр с диаметровм пор 0.22 мкм, Н20 -автоклавированием.

Для эффективности трансфекции критичен размер частиц образуемого преципитата, который в основном зависит от рН 2х HBS (трансфекция наиболее эффективна при рН 7.05), но т.к. рН растворов всегда измеряется с небольшой погрешностью, обусловленной приборными ошибками, то HBS необходимо готовить с несколькими значениями рН (например, 6.90, 6.95, 7.00, 7.05, 7.10 и 7.15) и для каждого значения рН смотреть эффективность трансфекции (по трансфекции какого-нибудь маркерного гена, например, GFP — green fluorescent protein — белковый продукт этого гена сильно флуоресцирует в УФ-излучении зеленым светом). Трансфекция лучше всего отрабатывается на клеточной линии 293, которая отличается необычно высокой способностью трансфицироваться (>50% клеток), в то время как трансфекция в другие клеточные линии идет со средней эффективностью -100 колоний/1 Омкг плазмидной ДНК/500 тыс. клеток.

Порядок действий:1. Клетки рассевали по 300-500 тыс. на чашку Петри диаметром 6 см (в зависимости от скорости роста клеточной линии - 300 тыс. — для SC-1, 500 тыс. - для более медленно растущих клеточных линий) с 5 мл среды.

2. На следующий день проводили собственно трансфекцию: в 15 мл полипропиленовой пробирке смешивали 62 мкл 2М СаСЬ и 438 мкл воды с растворенной плазмидной ДНК в количестве 10 мкг. Затем добавляли 0,5 мл 2х HBS при пробулькивании с помощью тонкой стеклянной пипетки, перемешивали несколько раз пипетированием и переносили по каплям равномерно по всей площади в чашку Петри с клетками.

3. Через 8-12 часов после трансфекции клеткам меняли среду на свежую, т.к. они могут гибнуть из-за избытка Са в среде.

4. Через день клетки пересевали на селективную среду с G-418, которую меняли один раз в три-четыре дня. Контролем служили исходные клетки, не подвергнутые процедуре трансфекции. Селекцию проводили в течение 10-14 дней (до полной гибели контроля + несколько дней для полной уверенности в выживании только устойчивых клеток).

В течение первых нескольких дней в культуре трансфицированных клеток наблюдается эффект транзиторной экспрессии — экспрессия белков с плазмиды, находящейся в клетке в виде эписомы. Через несколько делений клетки неинтегрированная в геном чужеродная ДНК элиминируется, и устойчивыми к антибиотику остаются только те клетки, в геном которых произошла интеграция векторной ДНК с функционирующим маркерным геном.

В настоящей работе для селекции клеток, экспрессирующих бактериальный ген устойчивости к неомицину neoR, использовали антибиотик G-418, - производное неомицина, которое является ингибитором трансляции, действуя на большие субъединицы рибосом. G-418 добавляли к обычной среде для выращивания клеток в концентрации от 400 (для SC-1 и РА 317) до 1200 мкг/мл (для лимфоцитарных линий клеток). Большоеколичество G-418 вызывает понижение рН среды, поэтому в среду также добавляли стерильный раствор гидрокарбоната натрия с концентрацией 8.5%.

Подбор концентрации антибиотика для селекции Используемые реактивы:1. Среда для культивирования клеток с 10% (v/v) FCS.

3. Смесь трипсин/EDTA.

4. Селективные среды, содержащие антибиотик (генетицин, G-418) с концентрациями 400, 600, 800, 1000, 1200 мкг/мл.

Селекцию проводили путем выращивания клеток на среде, содержащей антибиотик с минимальной концентрацией, достаточной для гибели чувствительных клеток.

Порядок действий:1. Исследуемые клетки рассевали в 24-луночные планшеты по 10 тыс. клеток в лунку.

2. На следующий день начинали селекцию на среде, содержащей различное количество антибиотика (200, 400, 600, 800, 1000 и 1200 мкг/мл G-418).

3. Среду меняли каждые 2-3 дня в течение 2 недель.

Для последующей работы использовали минимальную концентрацию антибиотика, при которой гибли все клетки, не обладавшие устойчивостью к нему.

Определение титра ретровирусного вектораИспользуемые реактивы:1. Среда для культивирования клеток с 10% (v/v) FCS.

3. Смесь трипсин/EDTA.

4. Полибрен 8 мг/мл.

5. Селективная среда, содержащая антибиотик с концентрацией, необходимой для селекции.

Порядок действий:1. При достижении клетками-продуцентами ретровирусного вектора монослоя им меняли среду на свежую.

2. Клетки-мишени рассевали по 10 тыс. в лунку 24-луночного планшета.

3. На следующий день собирали среду с клеток-продуцентов, к ней добавляли полибрен до 8 мкг/мл и фильтровали через фильтр с диаметром пор 0.22 мкм для того, чтобы избавиться от попавших в нее клеток-продуцентов.

4. Готовили семь последовательных серийных разведений среды 1:5 и меняли среду в планшетах с клетками-мишенями на 1 мл подготовленных разведений среды с рекомбинантным вирусом. Каждому разведению соответствовало три лунки. Т.о., получили планшет с лунками, в которых исходная среда с рекомбинантным вирусом разбавлена серийным разведением до 5.

5. Селекцию начинали на следующий день после инфекции, чтобы избежать значительного увеличения числа устойчивых клеток за счет их деления и проводили до образования видимых невооруженным глазом колоний устойчивых клеток (примерно две недели). К этомувремени клетки в контроле (т.е. неинфицированные вектором) полностью погибали.

6. Титр вирусных частиц подсчитывали по формуле: Титр = количество колоний х разведение. За количество колоний принимали среднее число колоний из трех лунок с одинаковым разведением вируса.

Анализ синцитиеобразованияИспользуемые реактивы:1. Среда для культивирования клеток с 10% (v/v) FCS.

3. Смесь трипсин/EDTA.

4. Полибрен 8 мг/мл.

5. Метанол.

6. Смесь метанол:РВ8 (1:1).

7. Краситель Гимза.

Порядок действий1. При достижении клетками-продуцентами монослоя им меняли среду на свежую.

2. Стекла для посева клеток выдерживали в метаноле в течение 2 часов для стерилизации и обезжиривания.

3. Стекла помещали на дно чашек Петри диаметром 10 см и высушивали в ламинаре с включенным ультрафиолетом.

4. В подготовленные чашки со стеклами высевали клетки так, чтобы на следующий день они занимали около 70% от общей площади (клетки линии Sc-1 рассевали по 2 млн/чашка, РАЗ 17 3 млн/чашка)5. На следующий день собирали среду с продуцентов, добавляли полибрен до концентрации 8 мг/мл и фильтровали через фильтр с диаметром пор 0.22 мкм.

8. Стекла помещали на 30 секунд в смесь метанолгРВЭ (1:1).

9. Переносили стекла в чистый метанол на 10 минут.

Ю.Затем производили смену метанола и выдерживали их в течение 30 минут.

11.Стекла высушивали и окрашивали по Гимза. Для этого их опускали на 2 минуты в профильтрованную краску, после чего хорошо промывали дистиллированной водой.

12.Полученные препараты использовали для подсчета ядер.

Выделение геномной ДНКИспользуемые реактивы:1. Лизирующий буфер: протеиназа К 0.15 мг/мл SDS 0.75 % Трис НС1 рН 8.0 10 тМ EDTA 10 тМ NaCl 50 тМБуфер готовили непосредственно перед использованием.

2. Фенол, перегнанный и насыщенный ТрисНС1 рН 8.0.

3. Смесь хлороформ:изоамиловый спирт (24:1).

4. Смесь фенол:хлороформ (1:1)5. Ацетат натрия 2.4 М рН 5.2.

6. РНКаза А 10 мг/мл (DNase free).

7. Изопропанол.

8. 70% этанол.

9. Буфер ТЕ:TrisHCl 10 шМ рН 8.0EDTA 1 шМОсновной задачей при выделении геномной ДНК является получение высокомолекулярной и чистой, без примеси белков, ДНК. Для этого необходимо тщательно перемешивать суспензии при экстракции, но очень аккуратно и медленно. Пользоваться «Vortex» нельзя, иначе геномная ДНК порвется.

3. Аккуратно отбирали верхнюю водную фазу с помощью автоматической пипетки с обрезанным наконечником, добавляли к ней равный объем смеси фенол:хлороформ (1:1). Аналогично п.2 перемешивали и центрифугировали.

4. К полученной водной фазе добавляли равный объем хлороформа, перемешивали и центрифугировали в том же режиме.

6. Затем из раствора осаждали геномную ДНК. Для этого добавляли 0.1 объема ацетата натрия и 1 объем изопропанола. Высокомолекулярная ДНК выпадает в осадок в виде сгустка, который можно отобрать автоматической пипеткой с обрезанным наконечником.

7. Осадок промывали 70% этанолом. Для этого к нему добавляли охлажденный 70% этанол и центрифугировали на центрифуге «Eppendorf 5415С» 13000 об/мин 5-10 мин. Процедуру промывания повторяли еще раз.

8. ДНК растворяли в стерильном ТЕ в течение ночи при комнатной температуре.

9. Концентрацию определяли по формуле C=D26o * 50 мкг/мл, где D26o оптическая плотность при 260 нм.

10.Анализ чистоты ДНК проводили с помощью измерения оптической плотности при 260 и 280 нм. Достаточно чистым от белка считается образец с отношением D26o /Е>2во около 1.8.

И. Качество выделения ДНК оценивали с помощью электрофореза в 0.8% агарозе.

Выделение тотальной РНК из клеточных культурИспользуемые реактивы:1. Лизирующий буфер:Гуанидинизотиоцианат Меркаптоэтанол №зцитрат Саркозил100 мМ25 мМ0.5%4М2. 2М Na Ацетат, рН=4.03. Фенол, перегнанный и насыщенный водой.

Порядок действий:1. Монослой клеток промывали PBS и лизировали в течение 2030 минут добавлением лизирующего буфера (на 10 см чашкуПетри необходимо 2 мл лизирующего буфера, на 25 см2 флакон 1 мл).

2. Лизат несколько раз пропускали через шприц с тонкой иглой для гомогенизации.

3. Добавляли 1/10 объема ацетата натрия, перемешивали, добавляли равный объем фенола и снова тщательно перемешивали на «Vortex» (раствор должен стать прозрачным).

4. Добавляли 1/3 объема хлороформа и тщательно перемешивали на «Vortex» (раствор должен стать молочно-белым, если это не так, добавляли еще хлороформ).

5. Полученную суспензию центрифугировали на центрифуге для пробирок «Eppendorf 5415С» 13000 об/мин 5 мин.

6. Отбирали водную фазу (верхняя), к ней добавляли равный объем смеси фенол-хлороформ, перемешивали на «Vortex» и центрифугировали в том же режиме.

7. Отбирали водную фазу. Фенол-хлороформную экстракцию повторяли 3 раза.

9. Осадок промывали 70% этанолом и центрифугировали на центрифуге «Eppendorf 5415С» 13000 об/мин 5-10 мин.

10.РНК растворяли в деионизированной и свободной от РНКазы воде.

1 /.Концентрацию РНК вычисляли по формуле c=D2eo*40 мкг/мл, где D260 - оптическая плотность раствора при 260 нм.

Трансформация и селекция клеток Е. Coli, выделение плазмиды.

Приготовление компетентных клеток Е. coli.

Используемые реактивы:1. Среда SOB:бактотриптон дрожжевой экстракт NaCl КС1 MgCl22. Буфер ТВ:HEPES СаС12 КС1 МпС123. DMSO.

4. Осадок суспендировали в 1/3 (от объема исходной суспензии) объема буфера ТВ и инкубировали 10 минут на льду.

5. Осадок отделяли центрифугированием в том же режиме, что и в п. 3.

20 г/л 5 г/л 10 тМ 2.5 тМ 20 тМ10 тМ 15 тМ 250 тМ 45 тМ6. К осадку добавляли 1/12 (от объема исходной суспензии) объема буфера ТВ.

7. При перемешивании добавляли DMSO до 3.5% и инкубировали во льду 10 минут.

8. При перемешивании добавляли еще одну порцию DMSO до 7% и инкубировали во льду 10 минут.

9. Клетки быстро расфасовывали по пробиркам «Eppendorf» объемом 1.5 мл и замораживали в жидком азоте.

ТрансформацияИспользуемые реактивы: 1. Бактериальная среда LBбактотриптон 10 г/лдрожжевой экстракт 5 г/лNaCl Юг/л2. 1.5% агар наЬВ.рН 7.0Порядок действий:1. Аликвоту компетентных клеток (200 мкл) размораживали и добавляли к ним 0.01-0.02 мкг/10 мкл разведенной плазмиды.

4. Клетки высевали на чашки Петри с агаром на LB с антибиотиком ампициллином (с концентрацией 150 мкг/мл) и без него (для контроля роста клеток).

Выделение и очистка плазмиды.

Используемые реактивы:1. Буфер для суспендирования Р1:Tris НС1 EDTA RNase А50 mM рН 8.0 10 тМ 100 мкг/мл2. Лизирующий буфер Р2:NaOH SDS200 тМ 1%3. Нейтрализующий буфер РЗ: Ацетат К3.0 М рН 5.54. Уравновешивающий буфер QBT:NaCl MOPS750 mM 50 mM рН 7.015%0.15%этанолTriton Х-1005. QC для промывки колонкиNaCl MOPS1.0М 50 mM рН 7.015%этанол6. Элюирующий буфер QFNaCl Tris НС11.25 М 50 mM рН 8.515%этанол7. Буфер ТЕ:TrisHCl 10 шМ рН 8.0EDTA 1 шМ8. Изопропанол.

9. 70% этанол.

3. Клеточный осадок суспендировали в 10 мл буфера Р1.

4. Добавляли двойной объем лизирующего буфера Р2, перемешивали аккуратным переворачиванием и помещали в лед не более чем на 5 минут.

5. Добавляли 1.5 объема нейтрализующего буфера РЗ, перемешивали и держали на льду 5 минут.

7. На колонку для ионообменной хроматографии Qiagen наносили 10 мл буфера QBT для уравновешивания.

8. Наносили на колонку профильтрованный через двойной слой марли супернатант.

9. Колонку промывали 15 мл буфера QC дважды.

Ю.Элюировали связавшуюся ДНК 10 мл буфера QF.

12.Плазмиду осаждали центрифугированием в течение 10 минут со скоростью 13000 об/мин на центрифуге «Eppendorf 5415С».

13.Осадок промывали 70% этанолом. Для этого к нему добавляли 400 мкл охлажденного 70% этанола, перемешивали на «Vortex» и осаждали центрифугированием в течение 10 минут со скоростью 13000 об/мин на центрифуге «Eppendorf 5415С».

Н.Растворяли осадок в буфере ТЕ.

15.Концентрацию определяли по формуле C=D26o * 50 мкг/мл, где D260 оптическая плотность раствора при 260 нм.

Анализ геномной ДНК методом Саузерна.

Используемые растворы и реактивы:1. Рестрикционная эндонуклеаза Xbal (Sybenzyme) и соответствующий буфер.

4. Разделение рестриктных фрагментов геномной 'ДНК проводили с помощью электрофореза в 0.8% агарозе. В качестве электрофорезногобуфера использовали ТАЕ. Пробы наносили в буфере для нанесения в соотношении 10:1. В качестве маркера наносили геномную ДНК X, гидролизованную рестрикционной эндонуклеазой Hind III. Электрофорез проводили при напряжении 2 В/1 см камеры и силе тока 60 шА в течение 8 часов.

5. По окончании электрофореза гель инкубировали 30 минут в растворе для переноса.

6. ДНК из геля переносили на мембрану с помощью капиллярного переноса в щелочных условиях. Для этого в боковые отсеки электрофорезной камеры наливали буфер для переноса и клали листок фильтровальной бумаги концами в разные отсеки так, чтобы по нему буфер мог подниматься под действием капиллярных сил. На фильтровальную бумагу помещали гель, а на него - нейлоновую мембрану Hybond N+ (Amersham). Предварительно мембрану смачивали в дистиллированной воде, потом в буфере для переноса. По краям клали тонкие полоски пленки для того, чтобы буфер поднимался снизу вверх только через гель и мембрану без боковых потоков. Затем сверху помещали стопку листков фильтровальной бумаги размером с гель. Сверху ставили груз весом около 500 г. Перенос проводили в течение ночи при комнатной температуре.у7. По окончании переноса мембрану споласкивали 2 SSC и просушивали между слоями фильтровальной бумаги.

8. Гель прокрашивали бромистым этидием в течение ночи, чтобы убедиться в полноте переноса ДНК из геля на мембрану.

Анализ РНК методом Нозерн - блоттинга.

Используемые растворы: 1. Буфер 10х для электрофореза (10х MOPS): MOPS 200 гаМацетат Na 80 mMEDTA 10 mMрН 7,0Раствор фильтровали через 0,45 мкм фильтр, добавляли диэтилпирокарбонат до 0,1%, тщательно встряхивали и использовали на следующий день.

3. Буфер 50х для электропереноса (50хТАЕ):Tris-ацетат 2МEDTA 0,05МрН 7,5-7,8Раствор фильтровали через 0,45 мкм фильтр.

4. SSCX20NaCl ЗМцитрат натрия 0.1МПорядок действий:1. Электрофорезную камеру и гребенку предварительно обрабатывали 0.1% раствором ДЭПК в течение ночи.

3. Для электрофореза использовали буфер, содержащий lxMOPS и 0.74% формальдегида. Буфер готовили на воде, обработанной ДЭПК.

5. Электрофорез проводили при напряжении примерно 5 В на 1 см камеры в течение 2 часов.

6. По окончании электрофореза гель отмывали от буфера с формальдегидом и насыщали ТАЕ, в котором проводили перенос РНК из геля на мембрану. Для этого гель вымачивали один раз в течение 30 минут в дистиллированной воде и трижды - по 30 минут в lxTAE при покачивании.

8. После переноса мембрану ополаскивали в 4xSSC.

10. Мембрану облучали коротковолновым УФ в течение 45 секунд для фиксации РЖ.

Гибридизация.

Получение матрицы для зонда.

Используемые реактивы:1. Рестрикционная эндонуклеаза BamHI (MBI Fermentas), буфер для рестриктазы.

3. Фенол, перегнанный и насыщенный ТрисНСЛ рН 8.0.

4. Смесь хлороформ:изоамиловый спирт (24:1).

5. Смесь фенол:хлороформ (1:1)6. Ацетат натрия 2.4 М рН 5.2.

7. Изопропанол.

8. 70% этанол.

Матрицей для получения зонда служил уникальный фрагмент гена белка оболочки ретровируса М813. Для ее получения использовали плазмиду R840 с клонированным фрагментом гена белка оболочки длиной 840 нуклеотидов и геном устойчивости к ампициллину.

Порядок действий:1. По методике, описанной выше, проводили трансформацию клеток Е. coli данной плазмидой, отбирали нужные клоны и выделяли из них плазмиду.

3. Рестриктные фрагменты разделяли электрофорезом в 1% агарозе в присутствии бромистого этидия. Интересующий фрагмент обнаруживали по свечению в длинноволновом ультрафиолете, вырезали участок геля перед ним и заливали 1.2% легкоплавкую агарозу. Электрофорез продолжали в течение 30 минут при низком напряжении (40V).

5. Добавляли равный объем фенола, уравновешенного TrisHCl рН 8.0, перемешивали на «Vortex» до молочно-белого цвета и центрифугировали на центрифуге «Eppendorf 5415С» в течение 10 минут со скоростью 13000 об/мин.

6. Аккуратно отбирали водную фазу, добавляли равный объем смеси фенол гхлороформ (1:1), перемешивали на «Vortex» и центрифугировали в том же режиме.

7. К водной фазе добавляли равный объем хлороформа и проводили экстракцию аналогичным образом.

9. Осадок промывали 70% этанолом. Для этого к нему добавляли 400 мкл охлажденного 70% этанола, перемешивали на «Vortex» и осаждали центрифугированием в течение 10 минут со скоростью 13000 об/мин на центрифуге «Eppendorf 5415С».

Ю.Растворяли осадок в буфере ТЕ.

11.Для определения чистоты и количества выделенного фрагмента плазмиды проводили электрофорез в 1% агарозе с бромистым этидием. 12.Концентрацию ДНК оценивали по интенсивности свечения полосы в геле в коротковолновом УФ.

Радиоактивное мечение зонда.

13.ДНК осаждали центрифугированием на центрифуге «Eppendorf 5415С» в течение 10 минут со скоростью 13000 об/мин.

14.0садок промывали 70% этанолом. Для этого к нему добавляли 400 мкл охлажденного 70% этанола, перемешивали на «Vortex» и осаждали центрифугированием в течение 10 минут со скоростью 13000 об/мин на центрифуге «Eppendorf 5415С». Процедуру промывки проводили дважды.

3. Осадок растворяли в 50 мкл деионизированной воды.

Гибридизация (по Bio-Rad).

Используемые реактивы:1. Раствор для гибридизации Саузерн-блота:Формамид 25%Na2HP04pH7,2 0,12 МNaCl 0,25 МSDS 7%ДНК спермы лосося 0,1 мг/мл Перед добавлением ДНК спермы лосося предварительно обрабатывали ультразвуком, затем денатурировали на кипящей водяной бане 10 минут и помещали в лед.

2. Раствор для гибридизации Нозерн-блота:Формамид 50%Na2HP04 рН 7,2 0,12 МNaCl 0,25 МSDS 7%ДНК спермы лосося 0,1 мг/мл ДНК спермы лосося обрабатывали как в п. 1.

4. После отмывки мембраны заворачивали в 2 слоя Saran Wrap и экспонировали с экраном Cyclone Storage Phosphor Screen (примерно 1 час экспозиции для счета 400 ерш).

Результат визуализировали с помощью прибора Cyclone Storage Phosphor Screen.

Результаты и обсуждениеХарактеристика ретровируса М813В 1997 году было показано, что заражение новорожденных мышей рекомбинантными ретровирусами с белками оболочки амфотропного вируса и 10А1 вируса вызывает развитие губчатой энцефаломиелопатии [62] [63]. Оба типа ретровирусов используют рецептор Pit2 для инфицирования клеток. Помимо Pit2, рецептором для вируса 10А1 служит родственный белок Pit 1. Было показано, что характер патологии в случаях амфотропного ретровируса и 10А1 ретровируса различается по тяжести течения и по топологии поражения ЦНС. По-видимому, можно предполагать, что данное различие может объясняться использованием различных рецепторов при заражении. Представлялось интересным проверить действие на новорожденных мышей вируса, использующего только Pitl для проникновения в клетку. Исследование данных литературы показало, что в изоляте эндогенных ретровирусов из генома Mus cervicolor был найден некий вирус CII, использующий рецептор, ген которого методом клеточных гибридов был картирован на 2 хромосоме, на которой значительно позже был картирован и Pitl [9] [56], что привело к предположениям об использовании М813 этого рецептора. Дальнейшая работа была посвящена характеристике этого ретровируса, который был назван М813.

Определение спектра хозяев М813Клетки SC-1, продуцирующие вирус М813, были получены заражением клеток линии SC-1 вирусом, продуцируемым клетками линии NIH ЗТЗ М813. Клетки линии NIH ЗТЗ, зараженные вирусом М813, были любезно предоставлены в наше распоряжение д-ром Ульфом Раппом [108]С целью характеристики вируса М813 надо было определить спектр его хозяев и убедиться в его идентичности описанному ранее ретровирусу CII из Mus cervicolor. Для определения спектра хозяев ретровируса М813 предстояло установить, клетки каких видов животных чувствительны к заражению вирусом М813. Для этого мы применили метод, основанный на псевдотипировании (так называемый «метод спасения маркера»). Метод основан на том, что репликационно-компетентные вирусы в клетке могут выполнять функцию помощника для дефектных по репликации вирусов, предоставляя им свои белки для репликации.

Клетки Scl, инфицированные М813, трансфецировали дефектным по репликации рекомбинантным ретровирусом R312 (ретровирусный вектор), несущим ген устойчивости к генетицину (G-418) пеог из бактериального транспозона Тп5. Клетки выращивали на селективной среде с G-418, для того, чтобы получить популяцию клеток, содержащую интегрированный ретровирусный вектор R312. Полученные в результате селекции клетки SC-1-M813-R312 продуцируют в культуральную среду два типа вирусных частиц с одинаковой оболочкой вируса-помощника (т. е. М813), но с различными геномами: одни с геномом самого М813, а другие - R312. При попытке заражения вирусными частицами, продуцируемыми линией Scl-M813-R312, клетки, обладающие рецептором для М813, должны стать устойчивыми к G-418. В случае клеток, не обладающих рецептором для вируса М813, переноса гена пеог не произойдет, и клетки при селекции на G-418 погибнут. Следовательно, по результатам селекции можно было судить о способности вируса заражать данную линию клеток.

Перед решением основной экспериментальной задачи было необходимо провести определение концентраций антибиотика генетицина (G-418), необходимых для селекции исследуемых линий клеток. Для этого клетки различных линий пытались вырастить на среде, содержащей 400, 600, 800, 1000 и 1200 мкг/мл генетицина. Селекцию проводили в течение 10-14 дней.

Для последующей работы использовали минимальную концентрацию антибиотика, при которой гибли все клетки, не обладавшие устойчивостью к нему. Результаты представлены в табл. 4Табл. 4 Концентрации генетицина, необходимые для селекции клетокразличных линийЛиния клеток Концентрация G-418, мкг/млScl 400NIH ЗТЗ 400Rati 800Ref 52 800RK13 600Cfl 600Cosl 600CHO 400TE671 800HT1080 1000HeLa 1000С помощью метода псевдотипирования было проведено определение титра вируса М813 на нескольких типах клеток. Титр вируса отражает количество инфекционных вирусных частиц в 1 мл культуральной среды. Значение определяемого титра зависит от свойств самого вируса, свойств клеток-мишеней, а также от количества вирусных частиц в среде. Значение титра вируса является не абсолютной величиной, а относительной, и позволяет сравнивать инфекционность различных вирусов на одной клеточной линии, или сравнивать эффективность заражения каким-либо одним ретровирусом клеток различных типов. Титр измеряется в КОЕ -колоние-образующих еденицах (в данной работе - GTU - geneticin transfer units.H HTU - hygromycin transfer units в мл. среды). Строго говоря, с помощью метода псевдотипирования определяется титр не самого вируса, а химерных вирусных частиц, содержащих в качестве генома ретровирусныйвектор в его РНК-вой форме. Однако, полученные значения будут характеризовать и содержание собственно вирусных частиц, так как оно изменяется пропорционально с изменениями количества химерных ретровирусных частиц.

В данном случае мы определяли способность ретровируса М813 заражать линии клеток различных видов животных, определяя титр данного вируса на клетках данных линий. В качестве контроля определяли титр еще двух ретровирусов - Mo-MuLV (экотропный вирус) и 10А1 ретровируса. Были получены следующие результаты, представленные в таблице 5.

С целью более точно определить спектр хозяев, было поставлено определение титра вируса М813 на клетках животных еще нескольких видов (китайский хомячок, кролик, собака и африканская зеленая мартышка) Результаты данного эксперименты представлены в табл. 6Табл. 6 Сравнительная эффективность заражения вирусом М813 клеток различных видов (продолжение)Вид Клеточная линия Титр вируса М813,GTU/млМышь SC-1 3.5 х 104Китайский хомячок СНО ОКролик RK13 ОСобака Cfl ОАфриканская зеленая Cosl О мартышкаКак можно видеть из результатов этого эксперимента, ретровирус М813 не заражает клетки хомячка, кролика, собаки и африканской зеленой мартышки, что подтверждает вывод предыдущего эксперимента о том, что вирус М813 является экотропным вирусом мышей.

Определение группы интерференции вируса М813Как уже говорилось ранее, интерференция — явление, заключающееся в том, что клетки, зараженные определенным ретровирусом, становятся устойчивыми к суперинфекции ретровирусами, использующими для заражения клеток тот же рецептор, однако сохраняют чувствительность к заражению ретровирусами, использующими для заражения клеток другой тип рецептора. До недавнего времени для ретровирусов группы MLV было описано 5 групп интерференции - экотропные, амфотропные, политропные, ксенотропные вирусы и 10А1 ретровирус. Для определения группы интерференции вируса М813 надо было определить, влияет ли на90эффективность заражения клеток вирусом М813 экспрессия ретровирусов различных групп интерференции в клетках-мишенях. Для ответа на поставленный вопрос было необходимо решить две экспериментальные задачи:1) Получить панель клеток мыши SC-1, экспрессирующих ретровирусы всех групп интерференции MuLV2) Определить титр ретровируса М813 на полученных линиях клеток.

Для решения первой экспериментальной задачи в клетки-мишени SC-1 была проведена трансфекция плазмид, содержащих геномы различных ретровирусов. После трансфекции клетки растили 10 - 14 дней для того, чтобы вирус распространился по всей клеточной популяции. Таким образом, была получена панель клеток SC-1, экспрессирующих ретровирусы всех групп интерференции (кроме ксенотропных, так как ретровирусы этой группы не заражают клетки Mus musculus).

Из этих данных можно сделать вывод о том, что ретровирус М813 является представителем еще одной группы интерференции MuLV, и, скореевсего, он использует для заражения уникальный клеточный рецептор.

Полученные в данном эксперименте данные позволяют предполагать, что М813 может использовать для заражения клеток (помимо своего рецептора) и рецептор для экотропных ретровирусов Catl.

Для проверки этого предположения были проведены эксперименты по заражению ретровирусом М813 клеток человека ТЕ671, экспрессирующих mCatl, то есть Catl мыши (такие клетки получили обозначение ТЕ671пео-mCatl). В качестве положительного контроля в данном эксперименте был использован экотропный ретровирус Mo-MuLV, который использует mCatl в качестве рецептора. В качестве отрицательного контроля для заражения была использована клеточная линия ТЕ 671, которая не должна заражаться ни М813, ни Mo-MuLV. В качестве положительного контроля для заражения была использована клеточная линия SC-1, которая должна заражаться и М813, и Mo-MuLV. Определение титров проводили с помощью вышеописанного метода спасения маркера (в данных экспериментах использовали ретровирусный вектор, несущий ген устойчивости к гигромицину — hygromycin, так как устойчивость к генетицину была селективным признаком при получении линии клеток TE671neo-mCat и полученные клетки устойчивы к нему). Для селекции использовались следующие концентрации гигромицина - 200 мкг/мл для клеток линии SC-1 и 400 мкг/мл для клеток линии ТЕ671 и их производных. Результаты представлены в табл. 9Табл. 9 Сравнительная эффективность заражения вирусом М813 клеток человека ТЕ671, экспрессирующих рецептор для экотропныхретровирусов mCatlКлетки-мишени Титр (HTU/ml)a Mo-MuLV М813SC-1 1 х Ю4 2 х Ю4ТЕ671пео 0 0TE671neo-mCat 2.2 х Ю3 0*) Показаны результаты нескольких независимых экспериментов. HTU hygromycin transfer units.

Из представленных в таблице данных видно, что экспрессия в клетках человека ТЕ671 рецептора mCatl сообщает им чувствительность к заражению экотропным ретровирусом Mo-MuLV и не влияет на устойчивость к заражению ретровирусом М813. Клетки, использованные в качестве положительного контроля (SC-1), заражаются обоими типами ретровирусов. Клетки, использованные в качестве отрицательного контроля (ТЕ671), не заражаются обоими типами ретровирусов. Из этого можно сделать вывод, что ретровирус М813 не использует рецептор Catl для заражения или эффективность использования этого рецептора пренебрежительно мала.

Морфологическая характеристика ретровируса М813Морфологическая характеристика ретровируса М813 была проведена методом электронной микроскопии в Институте экспериментальной вирусологии и иммунологии г. Гамбурга нашими коллегами с использованием клеточной линии, полученной нами (SC-1 М813). Результаты представлены на рис. 11 (рисунок скомпонован из трех микрофотографий, с тем, чтобы можно было четко видеть стадии созревания вириона).

Рис11. Электронная микрофотография ретровируса С-типа М813, группы MLVна разных стадиях формирования вириона1 - начальная стадия формирования вириона2 - огпочковывание вириона3 - зрелый вирионИз представленной микрофотографии видно, что сборка вириона происходит на цитоплазматической мембране клетки, с последующим созреванием вириона после отпочковывания от мембраны. Следовательно, по морфологии ретровирус М813 относится с С-типу ретровирусов.

Определение индексов слияния фибробластов мыши Scl, экспрессирующих ретровирусы разных групп интерференции MLV, при действии ретровируса М813.

Фотографии клеток РАЗ 17 и синцитиев, образованных ими представлены на рис. 12 (на следующей странице)Надо отметить, что клетки линии РАЗ 17 созданы на основе клеточной линии NIH ЗТЗ и отличаются от них экспрессией белков gag и pol Mo-MuLV, a env - Mo-AmphoV (вирус 4070А). При попытке заражения клеток линии NIH ЗТЗ, на основе которых создана линия клеток РАЗ 17, подобного феномена синцитиеобразования не наблюдали. Соответственно было интересно выяснить, объясняется ли такая способность клеток образовывать синцитии под действием М813 экспрессией в клетках-мишенях белков амфотропных ретровирусов или она может быть обусловлена экспрессией белков и других ретровирусов группы MLV.

Для выяснения того, влияют ли на способность клеток образовывать синцитии при заражении М813 и другими ретровирусами экспрессия белков различных ретровирусов группы MLV, мы использовали полученную нами ранее панель клеток линии Scl, зараженных различными ретровирусами группы MLV (экотропный Mo-MuLV, амфотропный Mo-AmphoV, политропный Mo-MCFV и 10А1 ретровирусы),. В качестве положительного контроля синцитиеобразования служили клетки упаковывающей линии РАЗ 17, экспрессирующие продукты генов gag и pol Mo-MuLV, a env - Mo-AmphoV (вирус 4070А), для которых ранее нами было обнаружено образование гигантских синцитиев при заражении М813. В качестве отрицательного контроля служили незараженные клетки Scl и Scl, инфицированные М813. В последних клеточные рецепторы для этого вируса заблокированы и контакта вируса с рецептором а, следовательно, и слияния происходить не должно. Существенно то, что клетки исследуемых линий были заражены вирусами из разных групп интерференции, следовательно, в них были заблокированы разные клеточные рецепторы.Рис. 12 Фотографии клеток линии РА317 (В) и РАЗ П. находивш ихся -I часа под действием ретровируса М813 (А). На нижней фотографии видны еденнчные клетки, на верхней видно, что клетки сливаются в многоядерныеСИНЦИХИИКоличественный анализ эффективности образования синцитиев проводили с помощью подсчета коэффициента слияния по формуле FI=(N-S)/T, где N -число ядер в синцитиях, S - число синцитиев, Т - общее число ядер. В каждом эксперименте было подсчитано не менее 500 ядер. Данный коэффициент отражает не только количество синцитиев, но и их размер: значение коэффициента растет с увеличением обоих параметров.

Результаты эксперимента (в виде индексов слияния) представлены в табл.

10Табл. 10 Сравнительная эффективность образования синцитиев клетками, зараженными ретровирусами различных групп интерференции, поддействием ретровируса М813ВирусКлетки-мишени М813 Mo-MuLV Mo-MCFV Mo-AmphoVРАЗ 17 80.1% 10.2% 6.1% 2.4%SCI-Mo-MuLV 67.8% 1.9% 2.1% 2.5%SCI-Mo-MCF V 68.5% 10.8% 4.1% 3.0%SCI-Mo-AmphoV 68.2% 5.7% 1.1% 1.6%SC1-M813 1.9% 4.2% 2.3% 2.4%SCI 3.0% 3.2% 1.3% 2.2%Из представленных данных видно, что ретровирус М813 индуцирует образование синцитиев во всех клеточных линиях, экспрессирующих ретровирусы всех использованных групп интерференции (экотропные, амфотропные, политропные и 10А1 ретровирус).

Остальные исследованные нами в этом отношении ретровирусыобладали или существенно меньшей синцитиеобразующей активностью (Мо-MuLV), или практически не вызывали образование синцитиев (Mo-MCF, Мо-AmphoV).

Определение условий, необходимых для синцитиеобразования под действием вируса М813Как было показано нами, ретровирус М813 вызывает образование синцитиев при попытке заражения клеток мыши Scl, экспрессирующих ретровирусы семейства MLV. Ранее было установлено, что в процессе слияния клеток при действии различных вирусов важную роль играет белок оболочки вируса, последовательность аминокислот некоторых его доменов, характер его гликозилирования, липидный состав мембран клеток-хозяев, а также наличие некоторых клеточных факторов. Нами было показано, что под действием вируса М813 происходит слияние клеток в случае экспрессии в мышиных клетках белков другого ретровируса семейства MLV. До сих пор было неизвестно, является ли это свойством именно мышиных клеток и нужен ли для этого какой-нибудь клеточный фактор. В данном опыте предстояло выяснить, является ли рецептор для вируса М813 необходимым условием для синцитиеобразования и могут ли клетки других животных подвергаться слиянию при действии М813.

Из полученных в предыдущем эксперименте данных, к сожалению, нельзя сделать однозначный вывод об условиях, необходимых для проявления ретровирусом М813 синцитиеобразующей активности. Одно из условий - это экспрессия в клетках-мишенях белков ретровирусов других групп интеференции. С целью выяснить, насколько необходимо для синцитиеобразования наличие в клетках-мишенях рецептора для М813, был проведен эксперимент по заражению клеток человека, экспрессирующих белки MuLV. Клетки человека или не содержат рецептор для М813 илисодержат вариант этого белка, который не может использоваться данным ретровирусом для заражения клеток. Следовательно, в этом эксперименте можно установить важность наличия рецептора для М813 на поверхности клеток-мишеней для проявления синцитиеобразующей способности.

Данный эксперимент состоял из двух частей:1) Определить, способны ли клетки, не экспрессирующие рецептор для ретровируса М813, но экспрессирующие белки других ретровирусов, к синцитиеобразованию под действием ретровируса М8132) Определить, способны ли к синцитиеобразованию клетки человека, экспрессирующие рецептор для ретровируса М813.

В первой части эксперимента были использованы следующие линии клеток:ТЕ671 - клетки рабдомиосаркомы человекаТЕ FLY GALV - упаковывающая линия клеток, созданная на основе ТЕ671, экспрессирует белок оболочки GALV — вируса лейкоза гиббоновТЕ FLY MOLV - упаковывающая линия клеток, созданная на основе ТЕ671, экспрессирует белок оболочки экотропного MuLV293 - клетки эмбриональной почки человека293-Phoenix-Ampho - клетки упаковывающей линии, созданной на основе 293 линии клеток, экспрессируют белок оболочки амфотропного MuLV.

Эффективность синцитиеобразования оценивали по индексу слияния FI. Результаты представлены в табл. 11Табл. 11 Сравнительная эффективность образования синцитиев клетками человека, экспрессирующие белки оболочки ретровирусов различных групп интерференции, под действием ретровируса М813Клетки-мишени Индекс слиянияНативные клетки Клетки, находившиеся в контакте с вирусом М813ТЕ671 1.6 4.2TE-FLY-GALV 7.8 6.5TE-FLY-MO 8.4 6.8293 <10 <10293-Phoenix-Ampho <10 <10Из полученных данных можно сделать вывод, что экспрессия белков различных ретровирусов в клетках человека, не содержащих рецептор для ретровируса М813, не сообщает им способность к синцитиеобразованию при действии вируса М813.

Ранее было показано, что клетки человека ТЕ671 не чувствительны к инфекции М813, в то время как TE671-R895, экспрессирующие рецептор для этого вируса, могут быть заражены им. Для исследования способности к образованию синцитиев в нашем распоряжении были клетки линий ТЕ671-R895 и TE671-R895, зараженные вирусом 10А1. Клетки ТЕ671 трансфецировали ретровирусным вектором R338, несущим ген устойчивости к антибиотику генетицину пеог, т. о. получили линию TE671-R338. После этого была получена линия TE671-10A1-R338 путем заражения вирусом10А1 клеток линии TE671-R338.

Для адекватного анализа данных была разработана система контролей. Положительным контролем служили клетки линии РАЗ 17, для которых ранее было показано образование гигантских синцитиев при действии вируса М813. Вторым позитивным контролем служили клетки Scl-10A1, для того, чтобы продемонстрировать, что экспрессия 10А1 делает клетки Scl пермиссивными к слиянию. Отрицательными контролями служили клетки Scl, не образующие синцитиев при действии М813, и ТЕ671, нечувствительные к этому вирусу, также не сливающиеся при контакте с ним.

Фотографии клеток ТЕ671 и ТЕ671 R895, контактировавших с ретровирусом М813, представлены на рис. 13 (следующая страница)Для образования синцитиев важно, чтобы клетки были посажены с оптимальной плотностью. Слишком редко растущие клетки образуют мало синцитиев, т. к. они мало контактируют. На препаратах с часто посаженными клетками трудно подсчитывать ядра. Учитывая, что клетки различных линий делятся с разной скоростью и имеют разный размер, в каждом случае необходимо высевать разное количество клеток. Для подбора оптимальной концентрации клетки рассевали в двух вариантах: 3*106 клеток и 5*106 клеток на чашку Петри диаметром 10 см. Результаты анализировали с помощью подсчета индексов слияния FI, которые представлены в таблице 12Рис 13Фотографии клеток ТЕ671 (А) и ТН671 R895. образовавших синцитии под действием ретровируса М813 (В)На верхней фотографии видно, что культура растет в виде одиночных клеток. На нижней фотографии видны пом клеток, слившихся воедино и образовавших гигантские синцитии с количеством ядер больше 10Таблица. 12 Сравнительная эффективность образования синцитиев клетками человека ТЕ671, экспрессирующими рецептор для ретровируса М813, поддействием ретровируса М813Клеточная линия 3*106 клеток FI, % 5*106 клеток FI, %Scl 3.5 NDScl - 10А1 75-80 NDТЕ671 2-4 2-5ТЕ671 -R338 2-4 2-5ТЕ671 -R338- 10А1 3 3TE671 - R895 38-49 84TE671 -R895- 10A1 44-52 87PA 317 82 88-95Примечания. ND - результаты не анализировали из-за очень плотного расположения клеток (объяснения в тексте). Значения, указанные через тире, относятся к различным участкам одного препарата.

По величине индексов слияния видно, что позитивным контролям соответствуют высокие значения FI (от 75%), а отрицательным - низкие (до 5%). Из исследованных линий образовали гигантские синцитии при действии вируса М813 только клетки человека, экспрессирующие рецептор для этого вируса, причем как TE671-R895-10A1, так и TE671-R895. Значит, способность клеток сливаться при действии ретровируса М813 не является особым свойством мышиных клеток. Рецептор является одним из необходимых условий для слияния клеток. Однако нельзя считать это условие достаточным. В случае Scl для образования синцитиев было нужно, чтобы клетка была заражена другим ретровирусом MLV, значение этоготочно неизвестно. Существует предположение о том, что экспрессия ретровируса увеличивает силу межклеточных взаимодействий за счет связывания белка оболочки, экспонированного на поверхности одной клетки с рецептором, находящимся на соседней клетке. Для клеток человека ТЕ671 это условие, видимо, необязательно. В то же время неизвестно, экспрессируют ли ТЕ671 вирусы других семейств или они обладают свойствами, компенсирующими продукцию ретровирусов.

Клонирование ретровируса М813 и создание химерного вируса R704.

С целью установления степени родства с другими ретровирусами семейства MLV и для определения молекулярной основы использования уникального клеточного рецептора было осуществлено молекулярное клонирование части гена env ретровируса М813 нашими партнерами из Института экспериментальной вирусологии и иммунологии г.Гамбурга. Данный участок гена env у ретровирусов кодирует SU домен белка оболочки и определяет тропизм вируса. После клонирования, для изучения свойств данного ретровируса был создан химерный ретровирус, условно названный R704, у которого геном представлял из себя геном экотропого вируса Мо-MuLV с замененным на аналогичный из генома ретровируса М813 участком гена env.

Для доказательства того, что клонированный ген не является геном эндогенного ретровируса Mus musculus, были проведены Саузер-блоттинг и Нозерн-блоттинг.

Определение наличия в геноме мыши Mus musculus эндогенных ретровирусов, родственныхретровирусу М813, методом Саузерн — блоттингаРеальная биологическая роль и патогенный потенциал эндогенных ретровирусов пока до конца не ясны. Однако к настоящему времени накоплены данные, которые свидетельствуют об участии эндогенных ретровирусов в регуляции экспрессии генов, в эмбриональном развитии, предотвращении заражения клеток родственными экзогенными ретровирусами, иммуносупрессии, опухолебразовании и развитии ряда аутоиммунных заболеваний.

Предполагается, что благодаря наличию многочисленных регуляторных последовательностей, эндогенные ретровирусы могут влиять на транскрипционную активность клеточных генов. В настоящее время интенсивно изучается гипотеза, а в ряде случаев подтвержден факт, что LTR служат промоторами и энхансерами соседних клеточных генов. В LTR находятся сайты связывания факторов, регулирующих транскрипцию, в том числе и гормон-зависимых. Например, у человека уже известно 5 генов, транскрипция которых регулируется LTR эндогенных ретровирусов. Это гены амилазы слюнных желез, цитохрома cl, фосфолипазы A2-L, регуляторных белков ZNF80 и Kruppel-like human proviral linked protein.

Поэтому было важно выяснить, является ли М813 эндогенным ретровирусом мышей и есть ли в геноме мыши последовательности, гомологичные последовательности ретровируса М813. Для этого методом Саузерн-блоттинга был проведен анализ геномной ДНК мыши Mus musculus. Саузерн-блот гибридизация, или, сокращенно, Саузерн-блоттинг, позволяет выявить наличие в ДНК определенных нуклеотидных последовательностей.

Для проведения анализа из клеточных линий мыши, неинфицированных ретровирусом М813 (SC-1) и инфицированных М813 (SC-1 М813), былавыделена геномная ДНК. Суммарное количество геномной ДНК, выделенной с одной 10-см чашки Петри, составило около 300 мкг.

Далее геномная ДНК была подвергнута гидролизу рестрикционными эндонуклеазами EcoRV, Xba 1, Kpnl, Pstl, BamHl и EcoRl. На каждую пробу брали по 10 мкг ДНК (на одну дорожку геля).

В качестве зонда для гибридизации был использован 5'-концевой фрагмент гена env ретровируса М813 длиной в 840 нуклеотидов. Приготовление радиоактивно меченого зонда проводили с помощью набора «Prime-a-gene labeling system» фирмы Promega. Гибридизацию проводили по методике фирмы BioRad.

Результаты визуализировали с помощью прибора Cyclone Storage PhosphoScreen. Результаты Саузерн-блот гибридизации представлены на рис. 1423.0 kb2.1 kb4.4 kb2.3 kb9.6 kb6.6 kbEcoRV Xbal Kpnl PstI BamHI EcoRrРис. 14 Результаты анализа методом Саузерн-блоттинга геномной ДНК клеток мыши SC-1, незараженных и зараженных ретровирусом М813. Под рисунком даны названия рестриктаз, использованных для гибролиза геномной ДНК. Крайняя левая дорожка - ДНК фага X, гидролизованная рестрикционной эндонуклеазой Hind Ш. На следующие дорожки нанесена ДНК клеток незараженных (SC-I) и зараженных (SC-1 М813) ретровирусом М813Из результатов гибридизации можно сделать вывод, что в геноме незараженных клеток (SC-1) отсутствуют последовательности, гибридизующиеся с зондом к 5'-концевому фрагменту гена env ретровируса М813, Это говорит о том, что ретровирус М813 не является эндогенным ретровирусом мышей и что в геноме мыши отсутствуют эндогенные ретровирусы, родственные ретровирусу М813.

В случае клеток, зараженных ретровирусом М813, в геномной ДНК выявляются последовательности, гибридизующиеся с использованнымзондом. В случае использования рестрикционных эндонулеаз EcoRV, Xba 1, Kpnl, Pstl, и BamHl выявляется одна четко выраженная полоса и одна-две значительно менее выраженных полос. В случае использования рестрикционной эндонулеазы EcoRl выявляется несколько полос одинаковой интенсивности.

Интерпретировать эти результаты можно следующим образом — для рестрикционных эндонулеаз EcoRV, Xba 1, Kpnl, Pstl и BamHl сайты рестрикции находятся внутри провируса в областях, фланкирующих ген env. Это подтверждается и размером полос, которые составляют 4.5 т.п.н в случае EcoRV, 6 т.п.н. в случае Xba 1, около 3 т.п.н. в случае Kpnl и Pstl, 6 т.п.н. в случае BamHl (размер провирусов для MuLV от 7 т.п.н до 12 т.п.н.). Вторичные, более слабо выраженные полоски, скорее всего, отражают факт наличия в геноме зараженных клеток провирусов с перестройками в геноме. Соотношение интенсивностей этих полос позволяет предположить, что провирусы с нормальной структурой находятся в геноме в нескольких копиях, а с перестроенной — в одной-двух копиях.

В случае использования рестрикционной эндонуклеазы EcoRl, скорее всего, один сайт находится внутри провируса, а один — вне провируса. Поэтому размер полос будет зависеть от места интеграции провируса в геном клетки (и, соответственно от того, насколько далеко в геноме от места интеграции будет располагаться сайт рестрикции для EcoRl), количество полос будет зависеть от числа копий интегрированных провирусов. В данном случае выявляется 6 полос, что позволяет говорить о наличии не менее 6-ти копий провируса М813 в геноме клеток.

Определение экспрессии ретровирусов М813 и R704 с помощью Нозерн-блотт-гибридизацииДля подтверждения результатов Саузерн-блоттинга нами был проведен анализ экспрессии ретровирусов М813 и R704 в зараженных клетках методомНозерн-блотт-гибридизации.

Метод Нозерн-блоттинга, позволяет определить наличие в клетке молекул РНК определенного размера, и, таким образом, позволяет определять экспрессию генов на уровне РНК.

Из незараженных (SC-1) и зараженных (SC-1 М813) вирусом М813 клеток линии SC-1 была выделена тотальная РНК. Выход РНК составил приблизительно 100- 150 мкг с 10см культуральной чашки.

РНК также была выделена и из клеток линии SC-1, зараженных ретровирусом R704.

В качестве зонда для блоттинга был использован 5'-концевой фрагмент гена env ретровируса М813 длиной в 840 нуклеотидов. Радиоактивное мечение данного зонда было проведено с помощью набора «Prime-a-gene labeling system» фирмы Promega.

Как можно видеть из вышеприведенных результатов, в незараженных клетках линии SC-I отсутствуют последовательности РНК, гибридизующиеся с зондом к гену env ретровируса М813.

В зараженных клетках выявляются две последовательности, гибридизующиеся с зондом к гену env ретровируса М813, соответствующие размерам полноразмерной и сплайсированной РНК ретровирусов группы MLV (около 9КЬ для полноразмерной и ЗКЬ для сплайсированной). Отличие между двумя вирусами состоит в более низкой интенсивности полос в случае химерного ретровируса R704, что позволяет говорить о меньшем количестве РНК этого вируса в зараженной клетке (с учетом того, что количество РНК на дорожках было одинаково, и оценивалось по уровню экспрессии GADPH).

Для определения свойств химерного ретровируса нами были проведены следующие эксперименты:Определение спектра хозяев ретровируса R704Определение группы интерференции ретровируса R704Определение спектра хозяев ретровируса R704Для определения спектра хозяев химерного ретровируса R704 было поставлено определение титра данного вируса, продуцируемого клетками линии SC-1 R704 на клетках разных видов. Определение титра было поставлено с помощью описанного ранее метода спасения маркера.

В качестве контролей были использованы ретровирус М813 и ретровирус 10А1.

В результате проведенных экспериментов были определены важные свойства ретровируса М813.

Нами определен спектр хозяев данного ретровируса — показано, что ретровирус М813 является экотропным ретровирусом, т.е. способен заражать только клетки мыши и крысы, причем эффективность заражения клеток крысы ниже на несколько порядков - титр на клетках мыши 3.5 х 104115КОЕ/мл, в случае клеток крысы - 37 - 130 КОЕ/мл. Данная особенность отличает ретровирус М813 от других экотропных ретровирусов, которые заражают клетки мыши и крысы практически с одинаковой эффективностью.

При определении группы интерференции ретровируса М813 показано, что ретровирус М813 не интерферирует с ретровирусами всех групп интерференции MLV (экотропные, амфотропные, политропные и 10А1), однако в реципроктных экспериментах обнаружена слабая интерференция с экотропными ретровирусами (титр экотропного вируса на клетках линии SC-1 М813 ниже в 50 раз, чем на незараженных клетках), что может говорить об использовании ретровирусом М813 рецептора экотропных ретровирусов Catl при заражении клеток. При анализе этого явления, было установлено, что ретровирус М813 не использует данный рецептор для заражения, так как ретровирус М813 не заражает клетки человека, экспрессирующие рецептор Catl.

Отсутствие интерференции с представителями различных групп интерференции MuLV говорит о том, что ретровирус М813 является представителем новой группы интерференции.

Показано, что ретровирус М813 не является эндогенным ретровирусом мышей - в геноме незараженных клеток не выявляются последовательности, гомологичные последовательности гена env вируса М813. Такие последовательности не выявляются и на уровне РНК.

Обнаружена и исследована способность ретровируса М813 вызывать образование многоклеточных синцитиев. Данное явление наблюдается в случае попытки заражения ретровирусом М813 клеток мыши, экспрессирующих ретровирусы всех групп интерференции. Кроме того, синцитиеобразование наблюдается в случае экспрессии в клетках человека рецептора для ретровируса М813.

Нами исследован также полученный нашими коллегами химерный ретровирус R704, который содержит часть гена env ретровируса М813, остальной геном представлен геномом экотропного MLV. Показано, что

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Иванов, Дмитрий Сергеевич

Выводы

1. Ретровирус М813 является экотропным вирусом и способен к инфекции фибробластов мыши (клеточные линии Scl и NIH ЗТЗ) и фибробластов крысы (клеточные линии Rati и Ref52). Эффективность заражения вирусом М813 клеток крысы на три порядка ниже, чем клеток мыши.

2. Ретровирус М813 является представителем новой группы интерференции вирусов семейства MLV.

4. Экспрессия рецептора для ретровируса М813 в клетках ТЕ671, исходно нечувствительных к действию этого вируса, сообщает им способность к синцитиеобразованию. Определяющим фактором для синцитиеобразования при контакте с вирусом М813 является наличие у клеток рецептора для этого вируса.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Иванов, Дмитрий Сергеевич, Москва

1. Abeijon, С. and С.В. Hirschberg, Topography of initiation of N-glycosylation reactions. J Biol Chem, 1990. 265(24): p. 14691-5.

2. Albritton, L.M., L. Tseng, D. Scadden, and J.M. Cunningham, A putative murine ecotropic retrovirus receptor gene encodes a multiple membrane-spanning protein and confers susceptibility to virus infection. Cell, 1989. 57(4): p. 659-66.

3. Andersen, K.B., A domain of murine retrovirus surface protein gp70 mediates cell fusion, as shown in a novel SC-1 cell fusion system. J Virol, 1994. 68(5): p. 3175-82.

4. Andersen, K.B. and B.A. Nexo, Entry of murine retrovirus into mouse fibroblasts. Virology, 1983.125(1): p. 85-98.

5. Bae, Y., S.M. Kingsman, and A.J. Kingsman, Functional dissection of the Moloney murine leukemia virus envelope protein gp70. J Virol, 1997. 71(3): p. 2092-9.

6. Bassin, R.H., S. Ruscetti, I. Ali, D.K. Haapala, and A. Rein, Normal DBA/2 mouse cells synthesize a glycoprotein which interferes with MCF virus infection. Virology, 1982. 123(1): p. 139-51.

7. Battini, J.L., 0. Danos, and J.M. Heard, Receptor-binding domain of murine leukemia virus envelope glycoproteins. J Virol, 1995. 69(2): p. 713-9.

8. Battini, J.L., J.M. Heard, and O. Danos, Receptor choice determinants in the envelope glycoproteins of amphotropic, xenotropic, and polytropic murine leukemia viruses. J Virol, 1992.66(3): p. 1468-75.

9. Benveniste, RE., R. Callahan, C.J. Sherr, V. Chapman, and G.J. Todaro, Two distinct endogenous type С viruses isolated from the asian rodent Mus cervicolor: conservation of virogene sequences in related rodent species. J Virol, 1977. 21(3): p. 849-62.

10. Berlioz, C. and J.L. Darlix, An internal ribosomal entry mechanism promotes translation of murine leukemia virus gag polyprotein precursors. J Virol, 1995. 69(4): p. 2214-22.

11. Berman, P.W., W.M. Nunes, and O.K. Haffar, Expression of membrane-associated and secreted variants of gpl60 of human immunodeficiency virus type 1 in vitro and in continuous cell lines. J Virol, 1988. 62(9): p. 3135-42.

12. Bernstein, H.B. and R.W. Compans, Sulfation of the human immunodeficiency virus envelope glycoprotein. J Virol, 1992. 66(12): p. 6953-9.

13. Bonham, L., G. Wolgamot, and A.D. Miller, Molecular cloning of Mus dunni endogenous virus: an unusual retrovirus in a new murine viral interference group with a wide host range. J Virol, 1997. 71(6): p. 4663-70.

14. Brody, B.A., S.S. Rhee, and E. Hunter, Postassembly cleavage of a retroviral glycoprotein cytoplasmic domain removes a necessary incorporation signal and activates fusion activity. J Virol, 1994. 68(7): p. 4620-7.

15. Buller, R.S., A. Ahmed, and J.L. Portis, Identification of two forms of an endogenous murine retroviral env gene linked to the Rmcf locus. J Virol, 1987. 61(1): p. 29-34.

16. Burstein, H., D. Bizub, and A.M. Skalka, Assembly and processing of avian retroviral gag polyproteins containing linked protease dimers. J Virol, 1991. 65(11): p. 6165-72.

17. Chattopadhyay, S.K., M.R. Lander, S. Gupta, E. Rands, and D.R. Lowy, Origin of mink cytopathic focus-forming (MCF) viruses:comparison with ecotropic and xenotropic murine leukemia virus genomes. Virology, 1981. 113(2): p. 465-83.

18. Chesebro, B. and K. Wehrly, Different murine cell lines manifest unique patterns of interference to superinfection by murine leukemia viruses. Virology, 1985. 141(1): p. 119-29.

19. Cloyd, M.W., M.M. Thompson, and J.W. Hartley, Host range of mink cell focus-inducing viruses. Virology, 1985. 140(2): p. 239-48.

20. Coffin, J.M., S.H. Hughes, and H.E. Varmus, Retroviruses. 1997: Cold Spring Harbor Press.

21. Cosset, F.L. and S.J. Russell, Targeting retrovirus entry. Gene Ther, 1996. 3(11): p. 946-56.

22. Craven, R.C., A.E. Leure-duPree, R.A. Weldon, Jr., and J.W. Wills, Genetic analysis of the major homology region of the Rous sarcoma virus Gag protein. J Virol, 1995. 69(7): p. 4213-27.

23. Deguchi, Y., I. Yamato, and Y. Anraku, Nucleotide sequence of gltS, the Na+/glutamate symport carrier gene of Escherichia coli B. J Biol Chem, 1990. 265(35): p. 21704-8.

24. Einfeld, D. and E. Hunter, Oligomeric structure of a prototype retrovirus glycoprotein. Proc Natl Acad Sci USA, 1988. 85(22): p. 8688-92.

25. Einfeld, D.A. and E. Hunter, Expression of the TM protein of Rous sarcoma virus in the absence of SU shows that this domain is capable of oligomerization and intracellular transport. J Virol, 1994. 68(4): p. 2513-20.

26. Fischinger, P.J., S. Nomura, and D.P. Bolognesi, A novel murine oncornavirus with dual eco- and xenotropic properties. Proc Natl Acad Sci U S A, 1975.72(12): p. 5150-5.

27. Frankel, W.N., J.P. Stoye, B.A. Taylor, and J.M. Coffin, Genetic identification of endogenous polytropic proviruses by using recombinant inbred mice. J Virol, 1989. 63(9): p. 3810-21.

28. Freed, E.O. and M.A. Martin, Domains of the human immunodeficiency virus type 1 matrix and gp41 cytoplasmic tail required for envelope incorporation into virions. J Virol, 1996. 70(1): p. 341-51.

29. Gamier, L., J.W. Wills, M.F. Verderame, and M. Sudol, WW domains and retrovirus budding. Nature, 1996. 381(6585): p. 744-5.

30. Gottlinger, H.G., T. Dorfman, J.G. Sodroski, and W.A. Haseltine, Effect of mutations affecting the p6 gag protein on human immunodeficiency virus particle release. Proc Natl Acad Sci U S A, 1991. 88(8): p. 3195-9.

31. Gottlinger, H.G., J.G. Sodroski, and W.A. Haseltine, Role of capsid precursor processing and myristoylation in morphogenesis and infectivity ofhuman immunodeficiency virus type 1. Proc Natl Acad Sci USA, 1989. 86(15): p. 5781-5.

32. Grewe, C., A. Beck, and H.R. Gelderblom, HIV: early virus-cell interactions. J Acquir Immune Defic Syndr, 1990. 3(10): p. 965-74.

33. Hallenberger, S., V. Bosch, H. Angliker, E. Shaw, H.D. Klenk, and W. Garten, Inhibition of furin-mediated cleavage activation of HIV-l glycoprotein gpl60. Nature, 1992. 360(6402): p. 358-61.

34. Hartley, J.W. and W.P. Rowe, Clonal cells lines from a feral mouse embryo which lack host-range restrictions for murine leukemia viruses. Virology, 1975. 65(1): p. 128-34.

35. Hartley, J.W. and W.P. Rowe, Naturally occurring murine leukemia viruses in wild mice: characterization of a new "amphotropic" class. J Virol, 1976. 19(1): p. 19-25.

36. Hatfield, D.L., J.G. Levin, A. Rein, and S. Oroszlan, Translational suppression in retroviral gene expression. Adv Virus Res, 1992. 41: p. 193239.

37. Heard, J.M. and O. Danos, An amino-terminal fragment of the Friend murine leukemia virus envelope glycoprotein binds the ecotropic receptor. J Virol, 1991.65(8): p. 4026-32.

38. Hooks, J.J. and C.J. Gibbs, Jr., The foamy viruses. Bacteriol Rev, 1975. 39(3): p. 169-85.

39. Hunter, E. and R. Swanstrom, Retrovirus envelope glycoproteins. Curr Top Microbiol Immunol, 1990. 157: p. 187-253.

40. Прасолов, B.C., Иванов, Д. С., Ретровирусные векторы в генной терапии. Вопросы медицинской химии, 2000. 46(3): р. 207-225.

41. Ikeda, Н., F. Laigret, М.А. Martin, and R. Repaske, Characterization of a molecularly cloned retroviral sequence associated with Fv-4 resistance. J Virol, 1985. 55(3): p. 768-77.

42. Jamjoom, G.A., R.B. Naso, and R.B. Arlinghaus, Further characterization of intracellular precursor polyproteins of Rauscher leukemia virus. Virology, 1977. 78(1): p. 11-34.

43. Johann, S.V., J.J. Gibbons, and B. O'Hara, GLVR1, a receptor for gibbon ape leukemia virus, is homologous to a phosphate permease of Neurospora crassa and is expressed at high levels in the brain and thymus. J Virol, 1992. 66(3): p. 1635-40.

44. Jolicoeur, P. and D. Baltimore, Effect of Fv-1 gene product on pro viral DNA formation and integration in cells infected with murine leukemia viruses. Proc Natl Acad Sci USA, 1976. 73(7): p. 2236-40.

45. Jones, J.S. and R. Risser, Cell fusion induced by the murine leukemia virus envelope glycoprotein. J Virol, 1993. 67(1): p. 67-74.

46. Kim, J.W., E.I. Closs, L.M. Albritton, and J.M. Cunningham, Transport of cationic amino acids by the mouse ecotropic retrovirus receptor. Nature, 1991.352(6337): p. 725-8.

47. Klement, V., W.P. Rowe, J.W. Hartley, and W.E. Pugh, Mixed culture cytopathogenicity: a new test for growth of murine leukemia viruses in tissue culture. Proc Natl Acad Sci USA, 1969. 63(3): p. 753-8.

48. Kozak, C.A., Susceptibility of wild mouse cells to exogenous infection with xenotropic leukemia viruses: control by a single dominant locus on chromosome 1. J Virol, 1985. 55(3): p. 690-5.

49. Lavillette, D., M. Maurice, C. Roche, S.J. Russell, M. Sitbon, and F.L. Cosset, A proline-rich motif downstream of the receptor binding domain modulates conformation and fiisogenicity of murine retroviral envelopes. J Virol, 1998. 72(12): p. 9955-65.

50. Lee, P.P. and M.L. Linial, Efficient particle formation can occur if the matrix domain of human immunodeficiency virus type 1 Gag is substituted by a myristylation signal. J Virol, 1994. 68(10): p. 6644-54.

51. Levy, J.A., Xenotropic viruses: murine leukemia viruses associated with NIH Swiss, NZB, and other mouse strains. Science, 1973. 182(117): p. 1151-3.

52. Lieber, M.M., C.J. Sherr, G.J. Todaro, R.E. Benveniste, R. Callahan, and H.G. Coon, Isolation from the asian mouse Mus caroli of an endogenous type С virus related to infectious primate type С viruses. Proc Natl Acad Sci USA, 1975. 72(6): p. 2315-9.

53. Marsh, M. and A. Helenius, Virus entry into animal cells. Adv Virus Res, 1989. 36: p. 107-51.

54. Marshall, Т.Н. and U.R. Rapp, Genes controlling receptors for ecotropic and xenotropic type С virus in Mus cervicolor and Mus musculus. J Virol, 1979. 29(2): p. 501-6.

55. McClure, M.O., M.A. Sommerfelt, M. Marsh, and R.A. Weiss, The pH independence of mammalian retrovirus infection. J Gen Virol, 1990. 71(Pt 4): p. 767-73.

56. Miller, A.D. and G. Wolgamot, Murine retroviruses use at least six different receptors for entry into Mus dunni cells. J Virol, 1997. 71(6): p. 4531-5.

57. Miller, D.G. and A.D. Miller, A family of retroviruses that utilize related phosphate transporters for cell entry. J Virol, 1994. 68(12): p. 8270-6.

58. Moldow, C.F., R.S. Kauffman, S.G. Devare, and J.R. Stephenson, Type-C and type-D primate retrovirus envelope glycoproteins bind common cellular receptor sites. Virology, 1979. 98(2): p. 373-84.

59. Morgan, R.A., О. Nussbaum, D.D. Muenchau, L. Shu, L. Couture, and W.F. Anderson, Analysis of the functional and host range-determining regions of the murine ectropic and amphotropic retrovirus envelope proteins. J Virol, 1993. 67(8): p. 4712-21.

60. Munk, C., J. Lohler, V. Prassolov, U. Just, M. Stockschlader, and C. Stocking, Amphotropic murine leukemia viruses induce spongiform encephalomyelopathy. Proc Natl Acad Sci USA, 1997. 94(11): p. 5837-42.

61. Munk, C., S. Thomsen, C. Stocking, and J. Lohler, Murine leukemia virus recombinants that use phosphate transporters for cell entry induce similar spongiform encephalomyelopathies in newborn mice. Virology, 1998. 252(2): p. 318-23.

62. Olah, Z., C. Lehel, W.B. Anderson, M.V. Eiden, and C.A. Wilson, The cellular receptor for gibbon ape leukemia virus is a novel high affinity sodium-dependent phosphate transporter. J Biol Chem, 1994. 269(41): p. 25426-31.

63. Ott, D., R. Friedrich, and A. Rein, Sequence analysis of amphotropic and 10A1 murine leukemia viruses: close relationship to mink cell focus-inducing viruses. J Virol, 1990. 64(2): p. 757-66.

64. Ott, D. and A. Rein, Basis for receptor specificity of nonecotropic murine leukemia virus surface glycoprotein gp70SU. J Virol, 1992. 66(8): p. 46328.

65. Ott, D.E., L.V. Coren, B.P. Kane, L.K. Busch, D.G. Johnson, R.C. Sowder, 2nd, E.N. Chertova, L.O. Arthur, and L.E. Henderson, Cytoskeletal proteins inside human immunodeficiency virus type 1 virions. J Virol, 1996. 70(11): p. 7734-43.

66. Owens, R.J. and R.W. Compans, Expression of the human immunodeficiency virus envelope glycoprotein is restricted to basolateral surfaces of polarized epithelial cells. J Virol, 1989. 63(2): p. 978-82.

67. Patarca, R. and W.A. Haseltine, A major retroviral core protein related to EPA and TIMP. Nature, 1985. 318(6044): p. 390.

68. Pearce-Pratt, R., D. Malamud, and D.M. Phillips, Role of the cytoskeleton in cell-to-cell transmission of human immunodeficiency virus. J Virol, 1994. 68(5): p. 2898-905.

69. Perez, L.G. and E. Hunter, Mutations within the proteolytic cleavage site of the Rous sarcoma virus glycoprotein that block processing to gp85 and gp37. J Virol, 1987. 61(5): p. 1609-14.

70. Pinter, A., Т.Е. Chen, A. Lowy, N.G. Cortez, and S. Silagi, Ecotropic murine leukemia virus-induced fusion of murine cells. J Virol, 1986. 57(3): p. 1048-54.

71. Pizzato, M., S.A. Marlow, E.D. Blair, and Y. Takeuchi, Initial binding of murine leukemia virus particles to cells does not require specific Env-receptor interaction. J Virol, 1999. 73(10): p. 8599-611.

72. Portis, J.L., F.J. McAtee, and L.H. Evans, Infectious entry of murine retroviruses into mouse cells: evidence of a postadsorption step inhibited by acidic pH. J Virol, 1985. 55(3): p. 806-12.

73. Rand, K., J. Davis, R.V. Gilden, S. Oroszlan, and C. Long, Fusion inhibition: bioassay of type С viral protein. Virology, 1975. 64(1): p. 63-74.

74. Rao, N.N. and A. Torriani, Molecular aspects of phosphate transport in Escherichia coli. Mol Microbiol, 1990. 4(7): p. 1083-90.

75. Rasheed, S., B.K. Pal, and M.B. Gardner, Characterization of a highly oncogenic murine leukemia virus from wild mice. Int J Cancer, 1982. 29(3): p. 345-50.

76. Reicin, A.S., S. Paik, R.D. Berkowitz, J. Luban, I. Lowy, and S.P. Goff, Linker insertion mutations in the human immunodeficiency virus type 1 gag gene: effects on virion particle assembly, release, and infectivity. J Virol, 1995. 69(2): p. 642-50.

77. Rein, A. and A. Schultz, Different recombinant murine leukemia viruses use different cell surface receptors. Virology, 1984. 136(1): p. 144-52.

78. Renne, R., E. Friedl, M. Schweizer, U. Fleps, R. Turek, and D. Neumann-Haefelin, Genomic organization and expression of simian foamy virus type 3 (SFV- 3). Virology, 1992. 186(2): p. 597-608.

79. Resh, M.D., Myristylation and palmitylation of Src family members: the fats of the matter. Cell, 1994. 76(3): p. 411-3.

80. Roos, D.S., C.S. Duchala, C.B. Stephensen, K.V. Holmes, and P.W. Choppin, Control of virus-induced cell fusion by host cell lipid composition. Virology, 1990. 175(2): p. 345-57.

81. Rowe, W.P., W.E. Pugh, and J.W. Hartley, Plaque assay techniques for murine leukemia viruses. Virology, 1970. 42(4): p. 1136-9.

82. Sakalian, M., J.W. Wills, and V.M. Vogt, Efficiency and selectivity of RNA packaging by Rous sarcoma virus Gag deletion mutants. J Virol, 1994. 68(9): p. 5969-81.

83. Siess, D.C., S.L. Kozak, and D. Kabat, Exceptional fusogenicity of Chinese hamster ovary cells with murine retroviruses suggests roles for cellular factor(s) and receptor clusters in the membrane fusion process. J Virol, 1996. 70(6): p. 3432-9.

84. Simon, M.A., SJ. Brodie, V.G. Sasseville, L.V. Chalifoux, R.C. Desrosiers, and D.J. Ringler, Immunopathogenesis of SIVmac. Virus Res, 1994. 32(2): p. 227-51.

85. Sommerfelt, M.A. and R.A. Weiss, Receptor interference groups of 20 retroviruses plating on human cells. Virology, 1990. 176(1): p. 58-69.

86. Spain, B.H., D. Koo, M. Ramakrishnan, B. Dzudzor, and J. Colicelli, Truncated forms of a novel yeast protein suppress the lethality of a G protein alpha subunit deficiency by interacting with the beta subunit. J Biol Chem, 1995. 270(43): p. 25435-44.

87. Steck, F.T. and H. Rubin, The mechanism of interference between an avian leukosis virus and Rous sarcoma virus. I. Establishment of interference. Virology, 1966. 29(4): p. 628-41.

88. Tailor, C.S., A. Nouri, C.G. Lee, C. Kozak, and D. Kabat, Cloning and characterization of a cell surface receptor for xenotropic and polytropic murine leukemia viruses. Proc Natl Acad Sci USA, 1999. 96(3): p. 927-32.

89. Wang, H., E. Dechant, M. Kavanaugh, R.A. North, and D. Kabat, Effects of ecotropic murine retroviruses on the dual-function cell surface receptor/basic amino acid transporter. J Biol Chem, 1992. 267(33): p. 23617-24.

90. Wang, H., M.P. Kavanaugh, R.A. North, and D. Kabat, Cell-surface receptor for ecotropic murine retroviruses is a basic amino-acid transporter. Nature, 1991. 352(6337): p. 729-31.

91. Wang, H., R. Paul, R.E. Burgeson, D.R. Keene, and D. Kabat, Plasma membrane receptors for ecotropic murine retroviruses require a limiting accessory factor. J Virol, 1991. 65(12): p. 6468-77.

92. Weiss, R., ed. Cellular receptors and viral glycoproteins involved in retroviral entry. Retroviridae, ed. J. Levy. Vol. 2. 1993, Plenum Press: New York. 1-108.

93. Weiss, R.A. and C.S. Tailor, Retrovirus receptors. Cell, 1995. 82(4): p. 5313.

94. White, J.M., Membrane fusion. Science, 1992. 258(5084): p. 917-24.

95. White, M.F., G.C. Gazzola, and H.N. Christensen, Cationic amino acid transport into cultured animal cells. I. Influx into cultured human fibroblasts. J Biol Chem, 1982. 257(8): p. 4443-9.

96. Wong, P.K., P.H. Yuen, and S.J. Kaufman, Mechanism of murine leukemia virus-induced fusion in rat myoblasts defective in differentiation. J Virol, 1977. 23(3): p. 768-75.

97. Yoshida, K., N. Ogawa, and Y. Oshima, Function of the PHO regulatory genes for repressible acid phosphatase synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Mol Gen Genet, 1989. 217(1): p. 40-6.

98. Zhao, Y., L. Zhu, C.A. Benedict, D. Chen, W.F. Anderson, and P.M. Cannon, Functional domains in the retroviral transmembrane protein. J Virol, 1998. 72(7): p. 5392-8.

99. Zybarth, G., H.G. Krausslich, K. Partin, and C. Carter, Proteolytic activity of novel human immunodeficiency virus type 1 proteinase proteins from aprecursor with a blocking mutation at the N terminus of the PR domain. J Virol, 1994.68(1): p. 240-50.

Информация о работе

Иванов, Дмитрий Сергеевич
кандидата биологических наук
Москва, 2004
ВАК 03.00.03

Диссертация

Ретровирус М813: молекулярные свойства и воздействие на клетки - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Ретровирус М813: молекулярные свойства и воздействие на клетки ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Ретровирус М813: молекулярные свойства и воздействие на клетки"

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Иванов, Дмитрий Сергеевич

Введение Диссертация по биологии, на тему "Ретровирус М813: молекулярные свойства и воздействие на клетки"

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Иванов, Дмитрий Сергеевич

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Иванов, Дмитрий Сергеевич, Москва

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Ретровирус М813: молекулярные свойства и воздействие на клетки
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология