Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспрессия эндогенного ретровируса человека HERV-K в клетках рака молочной железы

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Экспрессия эндогенного ретровируса человека HERV-K в клетках рака молочной железы"

од

'1 1993 всероссийский научный центр

молекулярной диагностики п лвчпнш

На правах рукописи удк 575.114.4

Мягких Мария Вячеславовна

экспрессия эндогенного ретровируса человека пепу-к в клетках рака молочной езлезп

03.00.04 - Биохимия

Автореферат • диссертации на соискание ученой сггепенг кандидата биологических наук

Москва - 1996

Работа выполнена во Всероссийском Научном Центре Молекулярной Диагностики и Лечения, Москва, Россия} Национальном Институте Здоровья, США.

Научиыа руководители:

доктор химических наук С.Е. Северин доктор биологических наук М. РоберТт-Гурофф

Официальные оппоненты:

доктор химических наук А.Г.Габибов

кандидат биологических наук А.И.Глухов

Ведущая организация - Московская Медицинская Академия и) И.М.Сеченова

Защита диссертации состоится

часов на заседании Диссертационного совета Д 071.51.01 при Всероссийском научном центре молекулярн< диагностики и лечения по адресу 113149, Москв; Симферопольский бульвар, д. 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНЦМДЛ. Автореферат разослан

Ученый секретарь Диссертационного ейвета кандидат биологических наук

В.В.ОтрадноЕ

ОВШЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Начиная с 70-х годов, в науке накопилось больное количество фактов, подтверждающие гипотезу о вовлечении ретровируса в этнологию и/или патогенез рака молочной железы (РМЖ) человека. Поводом к возникновению этой гипотезы послужило генетическое сходство вируса рака молочной железы мышей (MMTV) и эндогенных ■ ретровирусных последовательностей,

обнаруженных в геноме клеток РМЖ человека (Fax H. et al, 1994). Многочисленные факты свидетельствовали в пользу прёдположения о существовании такого ретровируса, среди них обнаружение ретровирус-подобных частиц в женском грудном' молоке, образцах ткани рака молочной железы, а также в клетках карциномы молочной железы линий MCF-7 и T47D. Было показано, что эти частицы содержали РНК, имеющую характеристики РНК ретровирусов, и обратную транскриптазу (Moore D., 1971; Das M, 1972 f Axel R., 1972; McGrath C., 1974; Keydar I, 1984^ Faff О., 1992). Также в геноме человека были обнаружены последовательности ДНК, гомологичные последовательностям из генома вируса MMTV (Callahan et al, 1982; Franklin et al., 1988). ' .

Первый эндогенный ретровирус человека, который, теоретически, способен образовывать ретровирус-подобные частицг в клетках РМЖ, был клонирован, полностью секвенирован и охарактеризован группой М.Опо в 1986 гпу. Этот ретровирус был назван HERV-K10(+) и стал считаться прототипом генома семьи эндогенных ретровирусов человека HERV-K. HERV-K был обнаружен.в клетках линии карциномы МЖ человека T47D. Оказалось, что геном этого эндогенного ретровируса имеет значительную гомологию с геномом вируса MMTV и содержит вйе основные генетические элементы,

характерные дпя экзогег шх ретровирусов. Было показано, что при обработке клеток T47D стероидными гормонами, содержание мРНК ретровируса HERV-К в них увеличивается. Стероидные гормоны также стимулировали образование в этих клетках ретровирус-подобных.частиц (Опо И., 1907; Keydai I., 1984). В дальнейших исследованиях был охарактеризован HERV-к из клеток ггератокарцинома человека, который образояывал в этих клетках ретровируснке частицы, чтс свидетельствовало о спосооности ретровируса HERV-K кодировать полноценные ретровирусные белки (Lower R. et al., 1984, Lower I. et al, 1987, Boiler K. et el., 1993). Было показано (Lower et al, 1995), что мРНК HERV-K подвергается сложному сплайсингу й что продукт двойного сплайсинга представляет собой мРНК, которая кодирует регуляторный белок, названный cORF-белком, имеющий структурное сходство с • rev-белком экзогенных ретровирусов.

Суммируя вышеизложенное, ыокно сделать вывод с том, что эндогенный ретровирус человека HERV-К способен участвовать в злокачественной трансформации клеток МЖ человека. Поэтому изучение экспрессии HERV-К в клетках РМЖ человека может дать важную информацию для понимания возможной роли HERV-К в этнологии/патогенезе РМЖ человека.

Цель_х»абшдь. Цель данной работы состояла в изучении

экспрессии эндогенного ретровируса человека HERV-К в клетках рака молочной заелезы человека, нормальной ткани молочной железы и сравнение ее с экспрессией HERV-К в других -.тканях. Также ставилась задача изучения экспрессии обратной транскриптазы HERV-К, ассоциированной с ретровирусными частицами, в супернатантах клеток рака молочной железы человека.

Еауитая_____ловпзяа. В данной работе впервые изучена

экспрессия эндогенного ретровируса человека HERV-K в хороткоживущих первичных клеточных линиях, полученных и:-. РМЖ человека и из нормальной ткапя МЖ, прилегающей к раковой опухоли (НПТ), и проведено сравнение экспрессии HERV-K в различных тканях. ^Показана преимущественная экспрессия этого ретровируса в РМЖ человека по сравнению с экспрессией в НПТ и других тканях. Показано, что транскрибируемая мРНК HERV-K подвергается множественному Сплайсингу, что характерно для экзогенных ретровирусов. в супернатантах клеток линий РМЖ и НПТ обнаружена обратно-транскриптазная активность.

Апробация работо- Результаты исследований доложены на международной : конференции "Ежегодная конференция Набора', эрии биологии опухолевой клетки" (Бетесда, США, 1995). В завершенном виде диссертационная работа апробирована 29 ноября 1996 г. на заседании кафедры биохимии Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова и 14 декабря 1996 года на научном семинаре МНИИМЭ.

пубяжышии. По теме диссертации опубликовано 5 научных работ. • • •• . •.

С;груяду_ а я овдем работа». Диссертационная работа содержит следующие разделы! введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение результатов и список цитированной литературы. Работа излонена на 98 страницах печатного текста и иллюстрирована 11 рисунками и 1 таблицей. •

содбишвшиейшш

KaTEPHMriLJIJMErQttH^HCCnSflOEAEHH^

Клеточные линии. Уникальные линии раковых клеток полученные из первичных РМЖ человека (#1-#5) и и нормальной ткани молочной железы, прилегающей к опухол: (НПТ) V #1* , #б*), были описаны в работе Sgagias et al. 1995. нормальные кератиноциты. человека были получены и: Clonetics Corporation (Сан-Диего, США). Гладкомышечнт клетки из стенки аорты были любезно предоставлены д-poi Барбарой Энсоли (Нацональный Институт Здоровья, Бетесда США). Клетки тератокарцикомы человека были пюбезш предоставлены д-ром Рейнхардтом Куртом (Институт Пауля-Эрлиха, Ланген, Германия). Нормальные лимфоцит! периферической, крови (ЛПК) были изолированы с поиощы центрифугирования на градиенте фиколла крови нормальны; доноров.

Выделение мРЕК. Тотальную ыРНК выделяли из клеток с помощью экстракции гуанндинизотноцианатом с последующи! центрифугированием в градиенте плотности хлорида цезия, как описано Maniatis et al, 1982. ыРНК была изолирована из клеток или лз препарата тотальной РНК при . помощи набора Micro-Fast Track ittRNA Isolation Kit (Invitrogher Corporation, , Сан-Диего, США), . согласно инструкции производителя. Все полученные образца. мРНК были обработаны . ДНКазой (Boehringer Mannheim, Индианаполис, США). • '

Пр^!Ыер?АЛ_лрх2б.£1х. 5 пар олигонуклеотидных праймеров для проведения РНК ПЦР были подобраны в соответствии с опубликованной нуклеотидной последовательностью

йндогенного ретровируса HERV-KJ.0( + ) (75) таким образом, Чтобы продукты амплификации представляли собой участки Ьсех генов HERV-K. Праймеры были синтезированы Midland Certified Reagent Company (Midland, TX, СЫА). Структур-праймеров были следующими:

Gag:

НК-1(1632-1656), 5'.-CAGAGTCTAAACCACGAGGCACAAG-3' ПК-2(2013-2037), 5'-AGACTTGTATCTGGCCTCAACTGTG-3'

№-3(3124-3149), 5'-TACAAGCAGTCTCTCTGCTTCCAGG-3' НК-4(3740-3764), 5'-CATGGTGATTTCCGCACCCCATTGT-3'

. НК-5(4067-4091), 5'-CCTTCGTTCTCACCTTGGAATTCTC-3'

ПК-6(5819-5843), 5'-GCGTGACATCCATTTGCCATAATGC-3' Env: '

НХ-7(6355-6079), 5'-CATAGATGATCGCTGCCCTGCCAAA-3'

НК-8(.8048-в072), 5'-CTCATGAGTCTGTCTCCCATCCAAA-3' • L™! ..

ИК-9(8403-8427) , 5'-GTTAGTCTGCAGGTGTACCCAACAG-3' НК-10(9049-9064)е 5'-CTCAGTAGATGGAGCATACAATCGG-3'

Олигонуклеотидныэ ДНК-пробы для: LTR(8812-8836): 5'-CAATACCTGGCTTTCCTAGGCAGAG-3', ггротаазы(3410-3434): 5'-TCCTGTTGGATCAGTGCTTACACGC-3' были пслучены: аналогично праймерам.

Плазмидные пробы для генов дад. (1600-2037), env (65535843) и pol(OT)(4114-5843) были любезно предоставлены Dr. tower и Dr. R. Kurth (Paul-Ehrlich-Institutk Langen, Германия). .. ..

Пробы были радиоактивно мечены с помощью метода ник-транслйции компанией Lofatrandt Labs Limited,

Geithesburg, США и использовались со специфической активностью 106 имп/мин на 1 ыл гибридиэационной смеси.

енк_пце. РНК ПЦР проводили, используя GeneAmp КЫА РСН kit (Perkin Elmer Cetus, Норволк, США), согласно инструкции производителя.

Southoia- и НогЫюгп-гкбрдризапия. Для проведения Northern-гибридизации, образцы мРНК, полученные с помощью onnro(dT) селекции, электрофоретически разделялись в 1% агарозном геле, содержащем 6,5% формальдегида в приборе фирмы Bio-Rad, США по стандартной методике (Maniatig Т. et al., 1992). Для электрофореза продуктов ПЦР и проведения Southern-гибридизации использовали гель,, .не содержащий формальдегида. После электрофореза проводился' перенос ДНК-фрагментов на нейлоновые мембрана (Schleicher & Schuell, США) и гибридизация с радиоактивно меченой ДНК-пробой по стандартной методике.

транск^ лптаз ную активность супернатантах линий клеток РМЖ (РМЖ ОТ) определяли,, используя метод PERT (Product-Enhanced Reverse Transcriptase Assay) по методике Руга et al., 1994. ■ -

Серологический анализ РИ 00!. Для характеристики РМЖ ОТ проводили иммунопреципитацшо в комбинации с методом PERT. 3 мкл препарата РМЖ ОТ инкубировали в 10 мкл буфера, содержащего 56 мМ Tris-HCl рН, 8,3, 56 мм КС1 с антителами к ОТ различных ретровирусовs кроличьими антителами к ОТ вируса лейкемии Раушера (RLV) - анти-RLV ОТ, 20 . мкг, кроличьими антителами к вирусу саркомы обезьян (SSV) -анти-SSV ОТ, 20 мкг, мышиными моноклональными антителами

к ВИЧ ОТ - анти-ВИЧ ОТ, 5 мкл асцитной жидкости. Эти антитела были охарактеризованы и описаны ранее в раОотах Robert-Guroff Н. et al., 1980, Veronese F.D. et al., 1986. Контрольными ферментами были SSV ОТ, RLV ОТ и ВИЧ ОТ, полученные как описано Robert-Guroff М. et al, 1980. Для контроля, фермент , инкубировали с нормальными кроличьими IgG или контрольной асцитной жидкостью. Затем комплексы фермент-антитело осаждали добавлением титрованного количества вторичных козлиных-анти-кроличьих или кроличьих-анти-мышиных, антител в течении ночи при температуре 4'с. Далее, иммунные комплексы удаляли центрифугированием на микроцентрифуге Centronix, США при 10000 g в течение 10 мин. при температуре 4°С. В полученном супернатанте определяли обратно-

транскриптазную активность мет&дом PERT.

ЗИсспрессря гвиоя НВНУ-К в клеточных япнияа PMS,—ШИ_д кожгрощ&ти яяамутвг шмяях. 1

Экспрессию HERV-K в клерках различных, тканей человека проводили? методом РНК ПЦР с использованием 5-ти пар праймерой, подобранных таким образом, что продукты ггщлификации перекрывали, около половины всего генома HERV-K (рис. 1).

НК1 НК2 ИКЗ НК4 НКД 438 642

им ист • нка ни» нкю

П?АГ:МЕРЫ

1Ш ш

I I I_1_1 I I 1„]_1

1 2 3 4 6 « Г .« 9 М

НУКЛЕОТИЛНХЮ

Схематическое изображение генома провируса НЕОТ-К. НЕЯ7-К10{+) получен при вставке в геном НЕИУ-КЮ 290 нуклеотидов из клона НЕКУ-КВ.. На рисунке показано расположение пар праймеров. НК1-НК10. Под праймерами указаны расчетные размеры продуктов амплификации.

Краткая 'характеристика опухолей, из которых бигш получены коротхсжизущие первичные клеточные линии РМЖ и НПТ приведена на Таблице 1.

Еапяпдл_1. Краткая яарактсрнстпяа опухолового материала, исполазоващюго дня соэпсншя пзрвичния клаточпмх линий Ш п ШТ.'

ПАЦИЕНТ СТАДИЯ РМЖ ИСТОЧНИК КЛЕТОК

1* . II МЖ ■

1 II т

2 неизвестна т

3 IV - ш-

3 IV легочные метастазы

5 ' IV легочные метастазы

б* II мж

»-нормальная ткань, прилежащая к РИК (НПТ)

В клетках всех пятя пшшй РЫЖ (#1-#5) (рис.2,А),была обнаружена экспрессия LTR, генов gag, протеазы и env. В клетка? линий РМЖ 81 и Л2, полученных из первичных опухолей, была также обнаружена экспрессия гена r^l-Таким образом, в 2-х из 5-ти клеточных линиях РМЖ, которые были получены из первичных опухолей, обнаружена экспрессия всех генов ' ретровируса HERV-K, что может свидетельствовать об экспрессии.полноценного ретровируса HERV-K *в этих клеточных линиях. В клетках линий НПТ #1* и #6* была обнаружен^ экспрессия LTR, gag и протеазы.

Экспрессия гена env наблюдалась только в одной линии НПТ #1*, тогда как экспрессия гена pol вообще не была обнаружена в клетках линий НПТ. Таким образом, в парных клеточных линиях #1 и #1* была продемонстрирована избирательная экспрессия гена pol в РМЖ (#1), но не в нормальной ткани молочной железы (#1*). В другой пинии, полученной из НПТ (#6*) не удалось обнаружить экспрессию не toj.dko гена pol, но также и гена env, что также подтверждает гипотезу о преимущественной экспрессии HF.RV-К в клетках РМЖ по сравнению с клетками из НПТ. Однако, недоступность для исследования клеточной линии из РМЖ пациента #6, которая была бы парной к линии из НПТ (#6*) не позволяет с полной уверенностью говорить о такой преимущественной экспрессии. Клеточные линии, полученные из нормальных тканей человека (КЕРА, ГИ, ЛПК) использовались в качестве контрольных линий для изучения экспрессии 1IERV-K (рис. 2,Б). В нормальных кератиноцитах человека была обнаружена экспрессия гена протсазы и очень слабая экспрессия гена gag, тогда как в клетках гладких мышц ни один кз генов HERV-IC we зкспрессировался. В стимулированных фитогемагглютининоы (ФГЛ), также как п в кестимулировашшх ЛПК (рис. 2, В) иногда наблюдалась экспрессия LTR, генов gag или протеазы, но никогда не наблюдалась экспрессия генов c;r;v или pol. Таким образом, из анализа экспрессии HERV-K в контрольных клеточных линиях можно- сделать вывод о г~оп, что полноразмерный недефектный рехровирус- HERV-K не экспрессируется ни в одной изученной ткани, кроме ткани РМЖ. Эти результаты свидетельствуют о наличии избирательной экспрессии HERV-K в ткани РЖ, что поддерживает гипотезу об участии этого эндогенного ретровируса человека в развитии рака молочной железы.

А.

6' 5 - + - +

4 +

з +

О

2 + - 1 + - < 0. ш Г Н + - + от

О О | 1ТЯ

о о О С1 1 ПРОТЕАЗА

л тк ¡ил Е» ^ 2 | ет/ 1 ро!

6* 5 + - +

4 3 2 1 Г н 4- -+-+-+ - + - +

I.а й а а :

рхк г»п ?Т1

И Г-;:-.,-.- -УТ-С: Г'Ь V• ' 1

■и*»

II

от

СлгХ

р-актин

ЕзгОл_2и.Д Экспрессия генов НЕЯ\?-К в линиях РМЖ (#1-#5) и НПТ (#1*,$ 6 *}. ТЕРА ■ - клеточная линия тератокарциномц человека Тега 1,. которая была использована в качестве прлояитрпьного контроля для экспрессии ИЕКУ-К. Для контроля количества и нативности РНК показана зкспресгмя гена р-актина, Для исключения возможности ДНК-контаминации препаратов РНК все эксперимента проводили дважды, с добавлением и без добавления обратной транскриптазы ((+0Т) и (-ОТ), соответственно).

< < ' '

ч» О. о. •

£ ш ш Ь

+ — + — + от

1ТЯ

'О

протсазс "Р env

ро1 «ЭТ)

Йй дад

й-встни

Экспрессия генов II ЕЙ V-К в пориапьнах кератиноцитах человека (КЕГА) и гладкозишечных. клетках аорты (ГМ)

в.

Я J м Л £ .7 <

■M J. нее

- + - + - + -+-+-+-+ от

■ .... Q LTR

р. О '"» о

.'.^¿j ПРОТНАЭА

_______0 env

pol

gag

M. j w ■

К й К

Ч g Ч

* ч *

tili Ü :

*- ЛПК. СТИМУЛИРОВАННЫЕ ФГА

ГЛ а «

с; с с

ч ч ч

+ - + - + от

Г**"* п

>J ; л V; I р-Актил

VJ \J X.J

Зл^Л Экспрессия генов HERV-K в ' лимфоцитах риторической крови человека (ЛПК).

Наличие процессов сплайсинга mFHK HERV-K было изучено с помощью гибридизации по Northern' мРНК, полученной из клеток линии #2 (в которой методом РНК ПЦР была обнаружена экспрессия всех генов HERV-K) (рис.З), После электрофореза наблюдалось разделение продуктов транскрипции РНК по размеру на 3 группы полос. Первая группа, состоящая из одной, полосы, была представлена высокомолекулярной мРНК размером 10,2 тысяч пар оснований (т.п,о.). Возможно, эта ..мРНК является полнораэмзрной вирусной мРИК. Другая группа из 4 полос представляет мРНК

npi__1ежуточного размера, причем продукт транскрипции

размером 3,4 т.п.о. совпадает по размеру с 'опубликованным продуктом транскрипции гена env (Lower R., 1993) и, вероятно, является результатом . одиночного "сплайсинга мРНК-предшествепника. Происхождение других полос из этой группы мРНК неясно. Возмолно, они "являются транскриптам? дефектных провирусов, присутствующих в неклонированнь« клетках линии #2. .Третья . группа представлена низкомолекулярными мРНК. Их происхождение также неясно, т.к. они меньше описанного (Lower R. et al, 1995) продукта двойного сплайсинга, , кодирующего белок, гомологичный rev-белку экзогенных ретровирусов, Происхождение этих полос можно объяснить иле альтернативным сплайсингом; или транскрипцией дефектны} провирусов HERV-K. В любом случае, наличие полноразмерного продукта транскрипции HERV-K, а также продукта транскрипции, соответствующего по размер] продукту транскрипции гена env HERV-K, свидетельствует с том, что мРНК HERV-K подвергается сплайсингу. Это, в cboi очередь, свидетельствует об экспрессии в клетках PMJ HERV-K типа 2, который способен кодировать полноценны« ретровирусные белки и образовывать ретровиру^иые частиц! (Lower R. et al,, 1995).

"'"И--- 10,3 т.п.о.

3,2 з?.а.©„ 4,0 о.п.о.

3.4 с.и.о.

3.5 с.яг.о.

0,9

0,7 ф.П.О.

Вжг^а Ног^ет-гибридизация • иРЛК из клеток липни Р1И #2. Гибридизацию прсводили с пробой, гомологичной участку гена еп'/ НЕКУ-К. Указаны размсрм различных продуктов транскрипции мРИК.

Обратио-транскркптазную (О а-тнвность в сулернатантах клеточных линий PMS #1, #2, и клеточной линии НПТ #1* изучали методом PERT (рис. 4 В супернагантах клеточных линий рмж #1, #2, #4 бы обнаружена ОТ активность. Значительно иеньиая . О активность была обнаружена в супзрнас.анте линии НПТ îi ОТ', активность не была обнаружена в. контрольн супернатенте неннфпцировавдшх клеток таишв 119 (К-), тог как для клеток линии Н9, инфицированных вирусом ЕИЧ-1 (К+), ОТ-активность была высока. Обнаружение активности в супернатантах клеток PMS. подтвердило данн ранних работ по обнаружению ОТ активности в тка аденокарциномы молочной келезы (Axel R. et al., 1972) свидетельствует о существовании в клетках : р; ретровируса, способного акспресснровать ; полноценн ретровируенне белкн. Однако, на основании доступа информации, мы все ке Ii о iicaeu с полной уверенност утверждать, что именно HERV-K кодирует обнаруженную j активность, хота по наличию открытой рамки считывания д. гена pol, ; а таксе способности кодировать актив»; протеазу, HERV-K является вероятным кандидате: Безусловно, необходимы дальнейшие исслодовння д: уточнения природы обнаруженной в 'клотхах PMS . i активности. Однако, доке если .предположить,, ч1 обнаруженная ОТ не является ОТ HERV-K, это тем но мс.ч не исключает активную роль HERV-K в трансформации клет! МЖ, т.к. любая ОТ способна осуществлять ретротранепозпц: HERV-K в генома, повышая вероятность мутаций, приводят к имморталнзацни клетки;

-К +К

1 2 4

; •-. , , I.V.*!' Г' ...... ' '.. . ' - '

Результаты анализа супериатантов клеток линий PMS #1, #2 а #4 и линии НПТ $1* на наличие ОТ активности методом РЕНТ.

ЕидаашсазййЕМ-

_жавДля

доказательства того, чтг ..РП ОТ не является ферментом экэтешшх ретровирусов, которые могли контаминировать пинии ЕИЖ н НПТ в лабораторных условиях, а также для подтверждения того, что обнаруженная РШ ОТ на является клеточкой ДНК полнмеразой-у, имеющей свойства обратной траискриптазп и представляющей основной источник лошю-положителышх результатов, бал проведен иммунологический анализ РМЖ ОТ (рис. 5А,Б) с помощью нмиупопраципитации и последующего анализа несвязавшейся ОТ-актгганости методом РЕЯТ. Как видно из рисунка, анти-МЛГ ОТ антитела не

связывали РМЖ ОТ, тогда как контрольная RLV активность была ингибирована на 94,6%. - Аналогичн и-кубация с анти-SSV ОТ антителами не. оказывала влиян на РМЖ ОТ активность, тогда как SSV ОТ активос ингибировалась на 85,34. Антн-ВИЧ ОТ антитела,практичес не влияли на РМЖ ОТ активность, тогда как контрольная В ОТ ингибировалась на 55,7%. Для подтверждения того, ч незначительное ингибироваиие РМЖ ОТ активности анти-В ОТ антителами (на 7,2%), является неспецифическим, бы проведены дополнительные эксперименты для исключен; возможности контаминирования клеточных линий МЖ Вирус ВИЧ. При анализе супернатанта клеток PMS иммуноферментным методом на наличие р24 антигена, получ! отрицательный результат. Также отрицательный результат б) получен при тестировании ДНК из клеточной линии РМЖ 1 методом ПЦР с использованием пары праймеров, специфичш для гена env вируса ВИЧ-1 МЫ. '

Инкубирование образца. РМЖ ОТ с антителами к Д1 полимеразе-у (рис. 5,Б) . не влияло на . активное^ исследованного фермента несмотря на то, что количеси использованных антител было в У раз больше количества достаточного для связывания более 90% выделенной очищенной ДНК-полимераэы-у (Robert-Guroff М, and Gall R., 1977). , ■' ;

Как показали эти эксперимент»/ обнаруженная супернатантах клеток МЖ ОТ, оказалась иммунологически и родственной ферментам экзогенных ретровирусов, котора могли конхаминировать линии РМЖ и НПТ в лаборатории условиях. Также РМЖ ОТ оказалась не родственной кпеточно ДНК полимеразе-у.

Таким образом, экспрессия ретровируса HERV-K в клетка РМЖ н наличие ОТ активности в супернатантах этих клето подтверждает гипотезу о возможном учартии HERV-K

гокачественной трансформации клеток МЖ с . помощью !тавочного мутагенеза и активации протоонкогенов.

А.

г г

и и * ?

3 О

5 I

х X

Ь £

S <

Я ü

х > 5Й

esasя»**

teses» '

РМЖ ОТ ВИЧ от

РМЖ ОТ SSV от

РМЖ ОТ ,„, ОТ

S контроль лнтн-анч-Qt

рмжот esv от

' Гч контроль □ АНТН-ЯЯУ ОТ

РМЖ ОТ RL. ОТ

РМЖ от RLV ОТ

Пконтроль ОдНТК RLV ОТ

i- 5га иммунологическая характеристика РМЖ ОТ. ;ноавтографн анализировали на Phoaphorlmager (Molecular amica, США). Значения РМЯ ОТ активности а пикселях ле инкубации с контрольными иммуноглобулинами, были няты за 100%.

№

ч

£

К ■;■

О

-I -

-КОНТРОЛЬ (БЕЗ АНТИТЕЛ) НОРМАЛЬНЫЕ КОЗЛИНЫЕ АИТИ-7

ВЫВОДЫ

1.Изучена экспрессия . эндогенного ретровируса человека HERV-K и . показана избирательная, экспрессия этого ретровируса в клетках РНЯ человека. Обнаружена экспрессия всех генов HERV-K в некоторых линиях РМЖ человека, что свидетельствует об экспрессии цельного недефектного эндогенного ретровируса в ткани МЖ.

2. При изучении иРНК-транскриптов HERV-K показано, что мРНК HERV-K подвергается сплайсингу, который характерен для экзогенных ретровнрусов, что свидетельствует о способности HERV-X кодировать полноценные ратровирусные белки и, следовательно, образови ;ать ретровирусные частицы.

3.В супернатантах клеточных линий, полученных из РМЖ и ППТ обнаружена обратная транскриптаза, которая способна .осуществлять ретротранспознцио HERV-K. Такая ретротранспсзиция вируса, LTR которого содержат проыоторцые и энхансерныа элементы, может приводить к активации протоонкогейов и к трансформации нормальных клеток №5 в раковые клетки'. .

L.M. Robert-Gurof£, A. Louie, И. Myagkikh, F. Michaels, М-Р. Kieny, М.Е. White-Scarf, . В'. Potts, D. Grogg and M.S. Reitz,Jrs Alteration of V3 loop context within the envelope of human immunodefficiency virus type " I enhance neutralization. J. of Virology, Vol. 68, No 6, p. 3459-3466, 1j94.

2.A. Abimiku,G. Franchini; K. Aldrich, M. Myagkikh, P. Markham, E. Gard, R. Gallo, M. Robert-Guroff: Humoral and cellular immune responces in rhesus macaques

infected wi4h human immunodeficiency viru3 type 2, Aids Res. Hum. Retroviruses,11 (3)t383-393, 1995.

3 A. Abimiku, G. Franchini, J. Tartaglia, K. Aldrich, M, Myagkikh, P.D.' Markhaai, P. Chong, M. Klein, M.-P, Kieny, E. Paoletti, R.C. Gallo and M. Robert-Guroff. HIV-1 recombinant poxvirus vaccine induces protectior against HIV-2 challenge in rhesui niacague Nature Medicine 1(4):321-329, 1995.

4.M. Myagkiku, M.K. Sgagias, O.N. Danforth, Jr., and M. Robert-Guroff. Preferential .expression of HERV-K-i. elated sequences in breast cancer. 1995 Annual Meeting Sponsored by the Laboratory of Tumor Cell Biology, S103, August-Sept. 1995

5.M. Myagkikh, M.K. Sgagias, D.N. Danforth, Jr., antd M. Robert-Guroff. Expression, of human (endogenous retrovirus HERV-K mRNA and reverse transcriptase activity in primary human breaat cancer ceil strains. Cancer Res (in press). •