Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Идентификация генов хромосомы 19 человека вблизи LTR эндогенного ретровируса HFRV-K

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Хиль, Павел Павлович, Москва

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

На правах рукописи

ХИЛЬ ПАВЕЛ ПАВЛОВИЧ

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ГЕНОВ ХРОМОСОМЫ 19 ЧЕЛОВЕКА ВБЛИЗИ ЬТЯ ЭНДОГЕННОГО РЕТРОВИРУСА НЕЯУ-К

03.00.03 - Молекулярная биология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: академик РАН Свердлов Е.Д.

Москва -1999

ВВЕДЕНИЕ.........................................................................................................................2

ЭНДОГЕННЫЕ РЕТРОВИРУСЫ ЧЕЛОВЕКА: НХ РОЛЬ В

ФУНКЦИОНИРОВАНИИ ГЕНОМА (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)................................3

Введение.........................................................................................................................3

Эндогенные ретровирусы и родственные им последовательности в геноме

человека.........................................................................................................................3

Роль эндогенных ретровирусов в функционировании генома человека....................12

Заключение...................................................................................................................17

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ....................................18

Введение.......................................................................................................................18

Стратегия, использованная для идентификации генов в локусах хромосомы 19

человека содержащих LTR эндогенногоретровируса семейства HERV-K..............19

кДНК селекция на космиды, содержащие LTR HERV-K...........................................22

Анализ обогащенных кДНК библиотек..............................г......................................25

Выделение индивидуальных фрагментов кДНК, специфичных к определенным

локусам хромосомы 19 человека и их последующее секвенирование........................30

Точное картирование на хромосоме 19 человека идентифицированных генов и

определение их взаиморасположения с LTR HERV-K................................................36

Определение тканеспецифичности экспрессии идентифицированных

потенциальных генов..................................................................................................38

Высокоразрешающее взаимное картирование кодирующих областей гена ZNF91 и

LTRHERV-K................................................................................................................40

Идентификация и характеристика вариантов транскриптов гена р31

регуляторной субъединицы 26S протеасомы............................................................44

Характеристика потенциального гена со специфической экспрессией в тканях

мозга человека.............................................................................................................48

Сравнительный структурный анализ индивидуальных LTR......................................52

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ..............................................................................63

Оборудование и расходные материалы.....................................................................63

Реактивы и ферменты...............................................................................................64

Штаммы, культуры, плазмиды..................................................................................65

Космидные библиотеки...............................................................................................67

PCR-амплификация.....................................................................................................67

кДНК селекция.............................................................................................................69

Клонирование продуктов кДНК селекции..................................................................73

In Vitro клонирование.................................................................................................. 74

Southern- и Northern-блот гибридизация.................................................................... 75

Выделение РНК............................................................................................................75

RT-PCR.........................................................................................................................75

RACE............................................................................................................................ 76

ВЫВОДЫ..........................................................................................................................78

БЛАГОДАРНОСТИ........................................................................................................79

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..............................................................................................80

ВВЕДЕНИЕ

Эндогенные ретровирусы человека (Human Endogenous Retroviruses, HERV) представляют собой стабильно наследуемые геномные последовательности, сходные по структуре с геномами ретровирусов. Полагают, что они являются потомками экзогенных ретровирусов, внедрившихся в геном предшественников человека. В геноме человека обнаружено более десяти семейств таких последовательностей, как сохранивших в разной степени измененные остатки генов ретро-вирусов, так и существующих в виде отдельных длинных концевых повторов (Long Terminal Repeals, LTR). Они могут также рассматриваться как мобильные генетические элементы, способные вызывать многочисленные мутации в геномах хозяев. По сделанным оценкам, по меньшей мере 1 % генома человека состоит из последовательностей HERV. Описано несколько типов HERV отличающихся друг от друга, в частности типом тРНК осуществляющей инициацию обратной транскрипции. В соответствии с этим признаком HERV классифицируют как HERV-E (инициатор — тРНК глутаминовой кислоты), HERV-H (гистидиновая тРНК), HERV-К (лизиновая тРНК) и т.д.

Биологическая роль и патогенный потенциал HERV пока неясны. Однако существует ряд данных об участии HERV в регуляции экспрессии генов, в опухо-леобразовании, предотвращении заражения похожими экзогенными ретровиру-сами, иммуносупрессии, а также в качестве патогенных агентов при некоторых аутоиммунных заболеваниях. Предполагается их связь с такими заболеваниями, как диабет и рассеянный склероз.

LTR включают в себя множество элементов, регулирующих транскрипцию — промоторов, энхансеров, элементов гормональной регуляции, сигналов поли-аденилирования — вследствие чего могут вызывать существенные изменения в картине экспрессии близлежащих генов человека. Обнаружение LTR-pery-лируемых генов является, таким образом, актуальным направлением в изучении механизмов регуляции экспрессии генов, в исследовании полиморфизма и эволюции, как отдельных генов человека, так и генома в целом. Задачей данной работы был структурный анализ последовательностей LTR HERV-К и идентификация кандидатных генов вблизи отдельных LTR на хромосоме 19 человека. В качестве объекта исследования был выбран HERV-K, поскольку именно это семейство эндогенных ретровирусов человека в наибольшей степени сохранило функциональный потенциал.

ЭНДОГЕННЫЕ РЕТРОВИРУСЫ ЧЕЛОВЕКА: ИХ РОЛЬ В ФУНКЦИОНИРОВАНИИ ГЕНОМА (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

Введение.

Процессам обратной транскрипции и ретротранспозиции приписывают одну из главенствующих ролей в эволюции (1). В геноме человека существует ряд типов последовательностей, использующих (или использовавших) обратную транскрипцию в своем жизненном цикле, одним из которых и являются эндогенные ретровирусы. Эндогенные ретровирусы являются потомками экзогенных ретро-вирусов, которые интегрировали в геном и после этого наследовались как его составная часть. Эндогенные ретровирусы и родственные им последовательности составляют значительную часть генома позвоночных и человека в частности (для обзора см. 2, 3, 4, 5, б, 7, 8, 9, 10, И). Недавно появились сообщения об обнаружении ретровирусов и у беспозвоночных (12, 13). По различным оценкам, подобные последовательности составляют не менее \% от общей ДНК человека (3, 4). Естественно, что столь большой объем вирусной информации, находящейся в геноме человека оказывает определенное влияние на функционирование генома. В данной работе мы попытаемся описать разнообразие эндогенных ретровирусных элементов в геноме человека и их возможное влияние на структуру и функционирование генома и человеческого организма.

Эндогенные ретровирусы и родственные им последовательности в геноме человека.

В геноме человека обнаружено значительное количество различных семейств эндогенных ретровирусов (3, 4, 5, 2, 6, 7, 8, 9, 10, 11). Среди них представлены как однокопийные (14, 15, 16), так и многокопийные эндогенные ретровирусы (17,18,19,20, 21, 22,23,24, 25, 26, 27). Следует отметить, что количество копий для представителей каждого из семейств вопрос достаточно тонкий. По крайней мере, в одном случае имеются сведения о том, что описанный ранее как одноко-пийный ретровирус был в дальнейшем охарактеризован как низкокопийный (28). Отличительной особенностью эндогенных ретровирусов является их большое разнообразие. В то время как в геноме человека содержится относительно немного различных семейств коротких диспергированных повторов (SINE) (Alu,

MIR) и длинных диспергированных повторов (LINE), количество различных семейств эндогенных ретровирусов составляет несколько десятков. Помимо полноразмерных провирусов, в геноме имеется большое количество связанных с ними последовательностей: одиночные длинные концевые повторы соответствующих ретровирусов (29, 27) (по видимости являющимися продуктами рекомбинации исходного провируса), ретротранспозоны, включающие в себя фрагменты ретровирусного генома (30, 31). Эти ретровирусы включились в зародышевую линию 10-60 миллионов лет назад путем инфицирования экзогенными ретровиру-сами, и с того времени они существуют как стабильно интегрированные, вертикально наследуемые провирусы (32, 33, 34, 35, 36). Практически всегда эндогенные ретровирусы являются дефектными, поскольку содержат многочисленные мутации в кодирующих областях. Систематика эндогенных ретровирусов человека весьма запутана и неупорядочена. Один из возможных подходов к их классификации состоит в использовании тРНК, используемой для инициации обратной транскрипции, в качестве классифицирующего признака. В соответствии с этим признаком HER V классифицируют как HERV-E (инициатор — тРНК глутамино-вой кислоты), HERV-H (гистидиновая тРНК), HERV-K (лизиновая тРНК) и т.д. Поскольку несколько кодонов могут кодировать одну и ту же аминокислоту, и используется несколько разных тРНК, то в ряде случаев в наименовании используют последовательность соответствующего антикодона (например, HERV-K(CUU)). Но и этому подходу свойственны недостатки — совершенно не связанные друг с другом ретровирусы могут использовать одну и ту же тРНК для инициации обратной транскрипции. В литературе часто используются уникальные, не систематические наименования семейств, соответствующие наименованию про-тотипного представителя семейства, что усложняет ситуацию.

Эндогенные ретровирусы, родственные типу С ретровирусов.

Семейство эндогенных ретровирусов человека HERV-E было изолировано с помощью ранее идентифицированных ретровирус-ассоциированных последовательностей из генома африканской зеленой обезъяны, использованных в качестве гибридизационного зонда (37). Семейство состоит из 50-100 полноразмерных провирусов, среди которых представленны элементы с длиной генома 8.8 т.п.о. и усеченные, длиной порядка 6 т.п.о. (38, 17). Следует отметить, что полноразмерная последовательность эндогенного ретровируса человека была впервые определена именно для HERV-E (17). В геноме человека также содержатся одиночные LTR HERV-E (39). Полноразмерный геном HERV-E содержит типичные ре-гуляторные элементы в длинных концевых повторах и последовательность связывания праймера, соответствующую tRNAGlu. Один из представителей семейст-

ва эндогенных ретровируеов HERV-E был найден в составе псевдогена у-актина, а еще два представителя родственного семейству HERV-E семейства NP-2 были картированы на Y хромосоме человека (40, 41). В литературе это семейство также называется HERV-A (41). Гомология между идентифицированной ранее про-тотипной последовательностью провируса HERV-E и изолированной позднее NP-2 составляет около 73% (40). Для ретровируеов этого семейства было показано, что распределение их у представителей различных рас практически идентично (42), что, по видимости, свидетельствует о том, что HERV-E интегрировал в геном человека на раннем эволюционном этапе (37), и что локусы, содержащие интегрированные провирусы, в основном не были затронуты в процессе дивергенции рас (39). В плаценте, клетках карциномы молочной железы, кишечника и рака легких обнаружен ряд LTR- и ели-содержащих транскриптов, среди которых присутствуют как близкие к полноразмерным, так и субгеномные транскрипты (43, 44, 45).

Эндогенный ретровирус HERV-R (ERV3) был изолирован из геномной библиотеки человека с использованием в качестве гибридизационного зонда фрагмента гена pol эндогенного ретровируса шимпанзе СН2 и LTR эндогенного рет-ровируса бабуина BaEV (46, 16). Полноразмерный геном HERV-R длиной 9.9 т.п.о. содержит в себе сайт связывания праймера, соответствующий аргининовой тРНК и длинные концевые повторы длиной 0.6 т.п.о. (46, 16). Первоначально ERV3 был описан как однокопийный эндогенный ретровирус, находящийся на 7 хромосоме человека и ее аналогах у приматов (16), но позднее появились данные о том, что в геноме человека содержится не менее 12 копий близкородственных последовательностей, причем три из них находятся на Y хромосоме (28). Строго говоря, эти последовательности не являются идентичными ERV3, максимальная гомология для секвенированых последовательностей составляет около 83% (28), поэтому не вполне корректно утверждать, что это представители ERV3-семейства, а не родственного ему семейства. Ретровирусные транскрипты обнаружены в плаценте (47, 48). Следует отметить, что две из трех мРНК, транскрибированных с провируса ERV3, содержат в своем составе клеточные последовательности, кодирующие Krüppel-подобный Zn-finger белок (48, 49). Эти транскрипты начинаются в 5' LTR, содержат в себе открытую рамку считывания гена env и двух случаях из трех проходят 3' LTR, после чего сплайсируются с клеточными последовательностями гена H-plk (human provirus-linked Krüppel) (48, 49). Транскрипты ERV3 имеют более высокий уровень экспрессии в дифференцирующихся клетках трофобластов плаценты, и сильно пониженный уровень экспрессии в клетках хориокарциномы (49, 50, 51).

ERV1 был первым эндогенным ретровирусом, для которого было получено прямое доказательство (путем определения первичной структуры) его наличия в геноме человека, и наличия эндогенных ретровирусов в геноме человека вообще (14). Клоны, содержащие последовательности ERV1, были выделены из геномной библиотеки человека путем использования в качестве гибридизационного зонда фрагмента гена ро/ эндогенного ретровируса шимпанзе СН2 (14). ERV1 представляет собой дефектный провирус длиной около 8 т.п.о., у которого отсутствует 5-LTR (52). Поскольку гомология между ERV1 и СН2 составляет 99%, и фланкирующие их последовательности идентичны, то они являются это одним и тот же провирус, интегрировавшим ранее в геном их общего предшественника. ERV1 картирован на хромосоме 18q22-23 (52,53).

Последовательности, гомологичные длинным концевым повторам нового семейства эндогенных ретровирусов человека, ERV9, были идентифицированы в ходе исследования повторяющихся последовательностей, экспрессирующихся в эмбриональной карциноме (54). В дальнейшем был изолирован и охарактеризован полноразмерный представитель данного семейства (27, 55). Полноразмерный провирус семейства ERV9 имеет длину порядка 8 т. п. о. и фланкирован длинными концевыми повторами длиной 1.8 т.п.о. у прототипного представителя семейства, которые являются наиболее длинными из ретровирусных LTR, описанных к настоящему времени (27, 55). В составе провируса ERV9 имеется потенциальный сайт связывания праймера соответствующий аргининовой тРНК (27), следовательно его можно было бы назвать HERV-R2. Структура LTR ERV9 весьма сложная: в его составе имеется два кластера тандемных повторов. Видимо, вследствие этого длины ERV9 LTR полиморфны (54, 55, 27). В геноме человека содержится порядка 30-40 полноразмерных копий ERV9 и около 4000 одиночных LTR (27, 55). В ряде клеточных линий обнаружены геномные транскрипты ретровирусов семейства ERV9 (27, 55). Было показано, что LTR ERV9 является активным промотором и энхансером как in vitro, так и in vivo, и обнаружен ряд LTR-содержащих гибридных транскриптов (56, 27, 57, 58)! Более того, одиночный LTR ERV9 является функциональным промотором гена ZNF80 в настоящее время, а интеграция его в этот локус произошла относительно недавно в эволюционном смысле — 10-15 млн. лет назад (57, 59).

На основании гомологии с саркома-ассоциированным вирусом обезъян (SS AV) был клонирован еще один эндогенный ретровирус человека, S71 (18). S71 представляет собой дефектный провирус длиной 5.5 т.п.о., у которого отсутствует 5' LTR, имеется большая делеция в гене ро/ и отсутствует ген env (60, 18, 61). S71 находится на хромосоме 18q21 и содержит в себе вставку в антисмысловом на-

правлении LTR HERV-K(CUU) (29, 60, 61). Дальнейший анализ показал, что в геноме человека содержится 15-30 копий S71-родственных последовательностей (60, 62). Некоторые из этих последовательностей содержат ген pol без делеции, имеющейся в геноме S71 (62).

Некоторое количество клонов, содержащих последовательности другого (или других) семейства эндогенных ретровирусов человека типа С, было изолированно при использовании в качестве гибридизационного зонда длинных концевых повторов эндогенного ретровируса бабуина (BaEV) (63), к сожалению, они не были более охарактеризованы более детально.

Эндогенные ретровирусы, родственные HTLV.

Семейство эндогенных ретровирусов HERV-H было открыто случайно при исследовании кластера ß-глобиновых генов на хромосоме 11 (64), впоследствии была определена первичная структура одного из клонов (19). Полноразмерный представитель семейства имеет геном длиной 8.4 т.п.о. и длинны�