Сравнительный анализ активности ретроэлементов в нормальных и опухолевых тканях человека

Леппик, Людмила Паульевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Сравнительный анализ активности ретроэлементов в нормальных и опухолевых тканях человека
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Сравнительный анализ активности ретроэлементов в нормальных и опухолевых тканях человека"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова

На правах рукописи

ЛЕППИК ЛЮДМИЛА ПАУЛЬЕВНА

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ АКТИВНОСТИ РЕТРОЭЛЕМЕНТОВ В НОРМАЛЬНЫХ И ОПУХОЛЕВЫХ ТКАНЯХ ЧЕЛОВЕКА

03.00.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва • 2004

Работа выполнена в лаборатории структуры и функции генов человека Института биоорганической химии им академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

кандидат биологических наук Т.В.Виноградова

доктор биологических наук Рубцов П.М. кандидат биологических наук Лукьянов К.А.

Ведущая организация: Центр «Биоинженерия» РАН

Защита состоится " " 2004 г. в часов на заседании

Специализированного совета Д.002.019.01 при Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю А. Овчинникова РАН по адресу 117871, ГСП-7, г Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая 16/10.

С текстом диссертации можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан " " марта 2004 г.

Учёный секретарь Специализированного совета доктор химических наук

А. Несмеянов

цчо\

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Около 40% генома человека составляют повторяющиеся элементы, представленные в основном ретроэлементами (далее РЭ), такими как короткие диспергированные повторы (Short Interspersed Nuclear Elements, SINEs), длинные диспергированные повторы (Long Interspersed Nuclear Elements, LINEs) и производными эндогенных ретровирусов (Human Endogenous Retroviruses, HERV), содержащими длинные концевые повторы (Long Terminal Repeats, LTRs), в то время как последовательности, кодирующие белки, составляют менее 5% генома.

Часть повторяющихся элементов генома транскрипционно активна, многие из пих могут образовывать собственные транскрипты. Экспрессию генов HERV и LINE неоднократно детектировали в различных нормальных и опухолевых тканях, клеточных линиях. Кроме того последовательности ретроэлементов могут входить в состав клеточных транскриптов. Так РНК, содержащие Alu элементы, составляют около 5% от известных мРНК Особенно богаты последовательностями РЭ 5'- и З'-UTR транскриптов эволюционно молодых генов, таких как гены иммунного ответа или ответа на воздействия внешних факторов. Ретроэлементы могут образовывать некодирующие РНК, потенциально способные принимать участие в регуляции генной активности, например при посттранскрипционном сплайсинге генов или участвуя в подавлении экспрессии других повторяющихся элементов.

Перемещаясь по геному, РЭ могут влиять на структуру генетического материала хозяина и иметь фундаментальное значение для формирования генетической изменчивости. Считают, что транспозиционная активность подвижных элементов генома является одной из причин возникновения спонтанных мутаций При инсерциях РЭ могут изменять как последовательность генов, так и влиять на уровень и тканеспецифичность их экспрессии Описаны случаи, когда встраивание ретроэлемента приводило к возникновению рака. Например, ретропозиция LINE1 в ген АРС вызывала рак толстой кишки, а вставка Alu-элемента в ген BRCA-2 - рак молочной железы.

»ОС. h.-i ,ЛЬНАЯ

К К А

Í • .'б.рг

Существует множество примеров нарушения регуляции ■-енов в результате встраивания РЭ рядом или непосредственно в регуляторный участок гена Например, встраивание Alu-элемента в интрон гена NF1, вызывало развитие нейрофиброматоза, а встраивание элемента LINE1 в ген фактора свертывания крови VIII приводило к возникновению гемофилии А. Для некоторых ретроэлементов показано, что они могут являться промоторами и терминаторами транскрипции близлежащих клеточных генов, участвовать в альтернативном сплайсинге, а также в ремоделировании хроматина и других процессах Однако приведенные выше данные описывают лишь единичные случаи активности РЭ, и остается неясным, является ли такая активность свойством всего класса РЭ или только конкретных элементов.

Методами блот-гибридизации и PCR было показано, что активность РЭ может изменяться в зависимости от внешних условий и состояния клетки, например количество транскриптов Alu в клетках увеличивается при стрессовых условиях. Другим хорошо известным примером является изменение картины экспрессии эндогенных ретровирусов и LINE1 в процессе опухолевой трансформации.

Все это свидетельствует о том, что, по крайней мере, некоторые ретроэлементы в процессе эволюции сохранили свой биологический потенциал, но, к сожалению, вопрос о функциональной роли РЭ в геноме человека до сих пор остается неясным Остается неясным, какие факторы участвуют в регуляции активности ретроэлементов, сколько этих элементов и какие именно подвергаются этой регуляции, как и за счет чего при изменениях внешних условий и клеточного состояния изменяется транскрипционная активность индивидуальных РЭ.

Существует большое число работ, исследующих роль повторяющихся элементов в функционировании клетки, но все они сфокусированы на активности отдельных их представителей. На сегодняшний день нет полногеномных исследований транскрипционно активных ретроэлементов и изменения их активности в нормальных и опухолевых тканях, так как не существует метода для изучения всего пула РНК, содержащих определенный класс повторяющихся элементов, и позволяющего сравнивать спектры РНК в различных типах клеток и тканей.

В данной работе мы разработали методы, которые могут быть полезны для выяснения вклада активности РЭ в функционирование генома хозяина, и использовали их для полногеномного анализа функциональной активности HERV и LINE элементов и ее изменений при переходе от нормальных тканей к опухолевым.

Цели и задачи работы.

Целью данной работы является полногеномный анализ активности HERV и LINE элементов в геноме человека и анализ ее изменений при переходе от нормальных тканей к опухолевым.

Работа состояла из двух частей - первая посвящена изучению транскрипционной активности LTR семейства HERV-K в нормальных и опухолевых тканях, а вторая - сравнению геномов опухолевых и нормальных тканей, чтобы на примере эндогенных ретровирусов и LINE1 элементов оценить вклад ретроэлементов в перестройки генома, происходящие при опухолевой прогрессии.

Для решения этих задач необходимым этапом было создание метода, позволяющего проводить полногеномное сравнение транскриптов, содержащих определенный класс повторяющихся ретроэлементов. Метод планировали применить для сравнения спектров транскрипции РНК, содержащих LTR HERV-К, в герминогенной опухоли семиноме и соответствующей ей нормальной паренхиме яичка

Были поставлены следующие экспериментальные задачи

-На панели нормальных и опухолевых тканей и клеточных линий провести сравнение транскрипционной активности одиночных LTR семейства HERV-K, различающихся по времени интеграции в геном человека и хромосомной локализации

-Разработать метод, позволяющий проводить сравнение транскрипционной активности ретроэлементов на полногеномном уровне в различных типах клеток и тканей.

-Провести сравнение спектров РНК, содержащих LTR HERV-K, в герминогенной опухоли семиноме и соответствующей ей нормальной

паренхиме яичка. Провести анализ выявленных дифференциальных транскриптов и их генного окружения

-Модифицировать разработанный в нашей лаборатории метод TGDA для поиска редко происходящих геномных перестроек.

-Используя метод TGDA, на примере герминогенной опухоли человека семиномы оценить вклад LTR HERV-K и элементов LINE1 в нестабильность генома при опухолевой прогрессии

Научная новизна и практическая ценность работы.

Мы исследовали транскрипционную активность одиночных LTR семейства HERV-K, характеризующихся различным временем интеграции в геном приматов и различной локализацией в геноме, в различных нормальных и опухолевых тканях и клеточных линиях Полученные нами данные свидетельствуют о том, что значительная фракция LTR сохранила свой регуляторный потенциал в процессе эволюции Показано, что каждый из исследованных LTR проявлял отличающуюся от других транскрипционную активность, в зависимости от типа ткани, клеток и воздействия внешних факторов. В одной и той же ткани разные LTR проявляли разную транскрипционную активность.

Нами был разработан метод SDDIR (Selective Differential Display of RNAs containing Interspersed Repeats), позволяющий проводить нолно1еномное сравнение спектров РНК, содержащих определенный класс повторяющихся последовательностей. Было показано, что разработанный метод SDDIR обладает высокой специфичностью (дает низкое число ложно-позитивных сигналов) и чувствительностью (дает низкое число ложно-негативных сигналов) и позволяет детектировать низко представленные в клетке дифференциальные транскрипты.

SDDIR был применен для сравнения спектров LTR-содержащих транскриптов в опухоли семиноме и соответствующей ей нормальной паренхиме яичка. Показано, что при сравнении образцов опухолевой и нормальной тканей происходит заметное изменение набора LTR-содержащих транскриптов, при этом происходит как подавление, так и усиление транскрипции отдельных LTR-содержащих РНК. Оказалось, что часть

дифференциальных LTR-содержащих транскриптов являются антисмысловыми по отношению к транскриптам известных клеточных генов

Для проведения полногеномного поиска перестроек происходящих с участием LTR семейства HERV-K и элементов LINE1, специфичных для генома опухолей, был использован метод TGDA (Targeted Genomic Difference Analysis), разработанный ранее в нашей лаборатории, и модифицированный нами для поиска редко происходящих событий (примерно 1 перестройка на 10 клеток). С этой целью мы сравнили распределение этих ретроэлементов в ДНК семиномьт и нормальной паренхимы яичка, полученных от одного и того же пациента

Было показано, что при переходе от нормальной паренхимы яичка к герминогенной опухоли семиноме какого-либо значительного увеличения транспозиционной активности элементов LINE1 и LTR-HERV-K не происходит. По-видимому, если в исследуемой опухолевой ткани и происходят перестройки этих ретроэлементов, то с низкой частотой (<1 на 10 клеток).

Структура диссертации.

Диссертационная работа изложена на 150 страницах машинописного текста и состоит из обзора литературы, результатов и их обсуждения, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 150 ссылок.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Анализ транскрипционной активности индивидуальных LTR семейства HERV-K. Ранее было показапо, что LTR семейства HERV-K могут быть разделены на подсемейства, интегрировавшие в процессе эволюции в геном человека от 50 до 2 млн лет назад. Вопрос о транскрипционной активности LTR, относящихся к различным подсемействам, остается малоизученным. Для анализа транскрипционной активности одиночных LTR, характеризующихся различным временем интеграции в геном приматов, мы выбрали четыре LTR семейства HERV-K, расположенных на различных хромосомах человека (см. табл 1). Выбор был основан на двух критериях: 1) LTR должен быть полноразмерным и содержать все регуляторные элементы; 2)

ЬТЯ не должен находиться в окружении повторяющихся элементов, что давало возможность подобрать уникальные геномные праймеры Два выбранных Г,Т1? были эволюционно молодыми и присутствовали только в геноме человека, в то время как два других присутствовали также в геномах приматов.

Чтобы оценить транскрипционную активность ЬТЯ, была разработана схема эксперимента, представленная на рис. 1. Были рассмотрены три основные модели участия 1Л"11 в транскрипции' 1) ЬТО является промотором и инициирует транскрипцию; 2) ЬТЯ терминирует транскрипцию, инициированную с внешнего промотора; 3) ЬТЯ входит в состав транскрипта, инициированного и терминированного с других регуляторных элементов Отнесение данного ЬТИ к той или иной модели осуществляли с помощью ЯТ-РСЯ с использованием двух пар праймеров

Первая пара включала в себя праймер, комплементарный уникальной части генома, фланкирующей Ш область 1Л"11, и праймер, комплементарный Ш области ЬТЫ (праймеры Р1 и Р2 на рис. 1)

Вторая пара состояла из праймера, комплементарного уникальному ■ еномному фрагменту, фланкирующему 115 область ЬТЯ, и праймера, комплементарного И5 области ЬТЯ (праймеры РЗ и Р4 на рис 1) Если 1ЛТ1, аналогично ЦП* ретровирусов, инициирует транскрипцию на границе 113 и Я областей, то при ЯТ-РСИ. с праймерами РЗ и Р4 будет образовываться продукт амплификации, а с праймерами Р1 и Р2 - нет (Строго говоря, это относится к случаю, когда инициация транскрипции происходит в области ЦП* между указанными двумя парами праймеров) Амплификация с праймерами Р1 и Р2, но не с праймерами РЗ и Р4, будет происходить только тогда, когда ЬТЯ служит терминатором транскрипции. Обе пары праймеров будут давать продукты амплификации в том случае, если ЬТИ входит в состав более длинного транскрипта Во избежание потерь неполиаденилированных ЬТЯ-содержащих регуляторных транскриптов и транскриптов, в которых Т.ТЯ входит в состав интронов, для затравления синтеза 1-ой цепи кДНК использовали смесь из о^о(сГГ) праймера и статистических гексамеров.

Геномная ДНК

Р2

HERV-K LTR

I ÜS

Геномная ДНК

РНК

I цепь кДНК

Инициация транскрипции

Терминация транскрипции

РЗ

Р4

Ш PCR продукт U5 PCR продукт

Инициация транскрипции +

+ Терминациятранскрипции

+ Транскрипция сквозь LTR +

Рис. 1. Схема анализа транскрипционной активности индивидуальных ЬТЯ методом ЛТ-РСЯ. Пары праймеров Р1/Р2 и РЗ/Р4 использовали для амплификации 113 и Ш областей ЬТЯ НЕЯУ-К, соответственно. Предполагаемая активность ЬТЯ и соответствующие продукты Я'Г-РСЯ приведены в нижней части рисунка

На рис. 2 приведены примеры результатов анализа транскрипционной активности ЬТЯ Как видно из рис. 2А, транскрипт, содержащий 115 область ЬТЯ из геномного локуса АВ006684, присутствует в семиноме, но отсутствует в эмбриональной карциноме. В то же время транскриш, содержащий Ш область этою 1/П1, присутствует в эмбриональной карциноме, но отсутствует в семиноме. Транскрипт, содержащий Ш область ЬТИ. из геномного локуса ВС52374, был обнаружен и в семиноме, и в эмбриональной карциноме, а 115-содержащий транскрипт этого ЬТЯ не детектировали ни в одной из исследуемых нормальных и опухолевых тканей

А В

АВ006684 1)3 (Р1- Р2) и5(РЗ-Р4) Семинома АС002508 Клеточная линия Лигка( после теплового шока 113 (Р1- Р2) и5 (РЗ- Р4)

Эмбриональная карцинома 33 35 тГ 33 35 ~

ВС52374 Семинома Амплификация ЬТЯ (Р1- Р4)

'Эмбриональная карцинома 34 37 34 37 кДНК геномная ДНК

33 35 37 33 35 37

Рис.2. Пример дифференциального ЯТ-РСЯ На панели (А) представлена дифференциальная активность индивидуальных ЬТИ в различных опухолях Надписи Ш и 115 соответствуют амплификации с праймерами, комплементарными из и и5 областям ЬТЛ, соответственно АВ006684, ВС52374, АС002508 - номера исследованных ЬТЯ-содержащих геномных локусов по йепВапк Цифры 33-35-37 обозначают количество циклов амплификации На панели (В) представлены результаты амплификации Ш и 1)5 областей ЬТЯ АС002508 в линии клеток Дигка! после теплового шока Отсутствие транскрипта, содержащего полноразмерный ЬТИ АС002508, доказано амплификацией с праймерами Р1-Р4

При исследовании транскрипционной активности ЬТЯ из геномного локуса АС002508 в клеточной линии ,1игка1, было показано, чю происходит амплификация только Ш области этого ЬТЯ (данные не показаны) После обработки клеток 1игка1 тепловым шоком (рис 2В) присутствовали продукты амплификации как Ш, так и Ш областей ЬТЙ. Так как при этом нет амплификации с праймерами Р1 и Р4, то мы можем сказать, что 1ЛТ?. не является частью более длинного транскрипта, а входиг в состав двух разных транскриптов. Таким образом, после обработки клеточной линии тепловым шоком появляется новый транскрипт, содержащий Ш область ЬТЯ

Результаты анализа транскрипционной активности индивидуальных ЬТЯ представлены в таблице 1.

Таблица 1. Транскрипция индивидуальных в различных тканях и клеточных линиях

N. Геномный локус" L47334 АС002508 ВС52374 АВ006684

19ql3.2 7q31.3 19ql3.1 21q22.3

Ткани и клеточныеЧ (<5.6 млн. лет) (<5.6 млн. лет) (13-18 млн. лет) (<18 млн. лет)

линии N. из U5 из U5 из TJ5 из U5

Ткани

Плацента - - - - - - - +

Нормальная паренхима яичка - - - - + - - -

Эмбриональная карцинома - + - - + - + -

Семинома - - + - + - - +

Тератома - - - - + - - +

Смешанная опухоль (тератома, опухоль желточного мешка) - + - - - - - +

Клеточные линии

Клеточная линия лимфомы, •1игка1 + - + - + + + -

Лигка1, обработанные РНА/РМА* - - + - + + + -

.1игка1, тепловой шок - + + + + + -

Эмбриональная карцинома Тега 1 + - - - - + + -

Рабдомиосаркома ЯМБ-13 - - - + + + - -

"Номер геномного локуса, содержащего LTR, в GcnBank, локализация на хромосоме по данным Human Genome Browser (октябрь 2003 г), возраст LTR (возраст мастер гена, млн. лет) «+» - есть транскрипция (к 37 циклу амплификации синтезировано как минимум 100 нг продукта в большинстве случаев детектировали 100 нг продукта уже после 35 циклов амплификации или ранее, детектируемое количество LTR-содержащих транскриптов можно оценить как 1-30 копий на клетку) «-» - нет транскрипции

(количество продукта амплификации ниже уровня детекции или составляло менее 5%

от количества самого слабого из «+» продуктов)

•РНА- фитогемаглютинин, РМА - форбол-12-миристат 13-ацетат

Было показано, что все исследованные LTR, как эволюционно молодые, присутствующие только в геноме человека, так и более старые, присутствующие в геноме примаюв, транскрипционно активны. Разные LTR в одной и той же ткани обладали различной транскрипционной активностью В тоже время, один и тот же LTR в разных тканях и клеточных линиях обладал различной транскрипционной активностью. Транскрипционный статус LTR менялся под воздействием митогенов и стрессовых факторов, а также в опухолевых клетках по сравнению с нормальными

Полученные данные позволяют предположить, что индивидуальные LTR являются объектом специфической транскрипционной рефляции и существенная фракция LTR семейства HERV-K сохранила свой регуляторный потенциал после миллионов лет эволюции

Анализ транскрипционной активности LTR HERV-K в нормальных и опухолевых тканях человека. Для иден1ификации транскриптов, содержащих последовательности ретроэлементов, и сравнения спектров их экспрессии в нормальных и опухолевых тканях была разработана техника селективного дифференциального дисплея РНК, содержащих повторяющиеся последовательное^ генома (SDDIR) Метод включает две основные стадии- 1) селективную RT-PCR амплификацию той части тотальной клеточной РНК, которая содержит повторяющиеся элементы, 2) получение ампликонов из разных тканей для сравнения их в параллельных дорожках при помощи гель-электрофореза. Схема метода приведена на рис. 3 Метод включает следующие стадии.

1) Выделение суммарной РНК из тканей. Синтез 1-ой цепи кДНК обратной транскриптазой SuperScript II с праймера, комплементарного последовательности LTR, в присутствии праймера, несущего на 3'-конце последовательность rGrGrG (SmrtRD на рис 3). Построение второй цепи кДНК полимеразой Advantage и амплификация кДНК с праймером,

комплементарным LTR и праймером SMR22, комплементарным 5'-концу первой цепи кДНК (рис.3 1).

SmrtRD—rGrCrC...........4 13 |K|US|> РНК

— С с С-Ры ДНК

РА-1 (■■|РА-Нет амплификации

Выделение, сиквенс, Идентификация, RT-PCR

Рис.3 Схема метода селективного дифференциального дисплея РНК, содержащих повторяющиеся элементы генома (SDDIR), в применении к анализу РНК, содержащих LTR HERV-K. Стадии метода (1) селективная PCR амплификация LTR-содержащих РНК, (2) рестрикция ампликонов эндонуклеазой

рестрикции; (3) лигирование супрессионных адапторов, (4) PCR амплификация с адапторным и LTR-специфичным праймерами, (5) nested PCR и разделение продуктов амплификации в полиакриламидном геле, (6) выделение и анализ фрагментов. Горизонтальными стрелками обозначены положение и ориентация праймеров Прямоугольниками, содержащими белые и черные фрагменты, обозначены инвертированные концевые повторы, образовавшиеся после лигирования супрессионных адапторов и достройки концов Стрелками на схематическом изображении ПААГ обозначены дифференциальные фрагменты

2) Обработка кДНК эндонуклеазой рестрикции A/uI Репарация концов фрагментом Кленова ДНК полимеразы I Е coli (рис.3.2).

3) Лигирование супрессионных адаптеров Амплификация с праймером, комплементарным внешней части адаптора и праймером, комплементарным последовательности LTR При этом за счет PCR супрессии подавляется амплификация тех фрагментов, которые не содержат последовательность LTR, и амплифицируются только LTR-содержащие фрагменты Второй раунд амплификации с заглубленными праймерами (nested PCR)' праймером, комплементарным внутренней части адаптора, и радиоактивно меченным внутренним праймером к LTR (рис 3 3)

4) Денатурирующий электрофорез в 5% полиакриламидном геле с 7 М мочевиной. Идентификация дифференциальных полос и элюция фрагментов кДНК из геля. Определение нуклеотидной последовательности фрагментов кДНК (рис 3.4).

Данный метод был применен для сравнения набора LTR-содержащих транскриптов в семиноме и соответствующей ей нормальной паренхиме яичка. Герминогенные опухоли (testicular germ cell tumors, TGCT) - наиболее распространенный вид рака среди мужчин европеоидной расы от 15 до 45 лет В этом виде опухолей до нашей работы была показана суммарная транскрипционная активность HERV-K без анализа активности индивидуальных элементов. Из всех TGCT наиболее часто встречаются семиномы, наиболее агрессивные и быстро развивающиеся опухоли этого типа. Они представляют значительный интерес с медицинской точки зрения, поэтому в данной работе в качестве объекта исследований была выбрана эта герминогенная опухоль.

Было изолировано 60 дифференциальных фрагментов кДНК. Для них была установлена нуклеотидная последовательность 56 последовательностей

удалось локализовать в геноме, используя опубликованные базы данных. 28 из 56 локализованных последовательностей соответствовали уникальным последовательностям генома.

Для проверки чувствительности и специфичности метода БОБШ из 28 уникальных транскриптов было произвольно отобрано 12, для которых была проведена проверка их дифференциальности в исследуемых тканях методом ЯТ-РСЯ Для РСЯ-амплификации фрагментов кДНК были подобраны пары праймеров так, чтобы один из них был комплементарен уникальной области генома, прилежащей к ЦГЯ, а другой — 113 области ЬТЯ. Для 9 транскриптов ЯТ-РСЯ полностью подтвердил данные БОШЯ. В одном случае в нормальной и опухолевых тканях присутствовало одинаковое количество анализируемого транскрипта, а в двух других случаях данные ЭОЕНЯ были подтверждены лишь для одной из опухолей. Таким образом, мы можем оценить количество ложных позитивов при использовании метода 8001Я как 10%. Пример результатов дифференциального дисплея 1/ГЯ НЕЯУ-К для герминогенной опухоли семиномы и нормальной паренхимы яичка и ЯТ-РСЯ анализа одного из дифференциальных транскриптов представлены на рис 4А и В.

Известно, что в геноме человека по оценкам разных авторов содержится 1.5-2 тысячи одиночных ЬТЯ семейства НЕЯУ-К. Из полученных нами данных следует, что количество ЬТЯ-содержащнх транскриптов в нормальной и опухолевой тканях сравнимо и составляет несколько сотен. Это значит, что, по крайней мере, 10 % ЬТЯ НЕЯУ-К. являются транскрипционно активными. Из литературы известно, что в опухолевых тканях уровень экспрессии ЬТЯ повышается, однако эти данные были получены только для пула РНК, а не для индивидуальных транскриптов. Из этих данных не было ясно, чем обусловлены такие изменения. Меняется ли спектр транскрипции, например, возрастает разнообразие ЬТЯ-содержащих транскриптов, или же это связано с увеличением уровня экспрессии отдельных транскриптов. Анализируя наши данные, мы можем сказать, что при сравнении образцов опухолевой и нормальной тканей происходит заметное изменение набора ЬТЯ-содержащих транскриптов

(А)

N1 в! в2

(В) АС026424

N1 81 82

+КГ -ИТ +КГ -КГ +КГ -кг

33 36 39 39 33 36 39 39 33 36 39 39

Рис. 4 Результаты анализа ПИ-содержащих транскриптов в двух семиномах и нормальной паренхиме яичка методом Б001Я На рис (А) приведен пример БОГ)!Я На рис (В) приведены результаты ЯТ-РСЯ анализа Ь'ГЯ-содер/кащего транскрипта из локуса АС02624 ЯI 52 два рапячныч образца ссмнномы N1 нормальная паренхима яичка гктченная от пациента с семиыочой Строчками \ катаны дифференциальные фрагменты Стретюй с \к<шниеч номера лошеа в Ос(1В;и\к обонлчен дифференциальных фрагмент, для которого приведены рещътаты КТ-РСК пнлтню Цифрами )К.ТЙНЫ циклы амплификации Приведены ре п чьтлты ЯТ-РСЯ анаэнм для опытных об р а {ци в ( + Я Т ) и контрольных ( - Я Т )

Мы обнаружили, что при переходе к опухоли происходит как подавление, так и усиление транскрипции отдельных ЕТЯ-содержащих РНК. Набор транскриптов различается и в двух образцах семином, что неудивительно,

поскольку каждая опухоль данного типа, наряду с общими характеристиками изменений экспрессии генов, содержит также и индивидуальные для данной опухоли особенности.

Нами были обнаружены транскрипты, в которых LTR были расположены в интронах известных генов, но ориешация LTR (направление U3-<R —>U5) не совпадало с направлением транскрипции этих генов. То есть в этих случаях мы наблюдали не транскрипты этих генов (праймер, использованный при построении первых цепей кДНК в SDDIR, не мог отжечься на такую РНК, так как он не комплементарен ей), а какие-то неизвестные транскрипты Об их функции мы можем только строить предположения. Возможно, они входят в > состав ан!исмысловых РНК, которые могут участвовать в регуляции

транскрипции этих генов, либо они могут входить в состав транскриптов других, неизвестных на сегодняшний день, генов, расположенных в этих локусах.

Внутри семейства HERV-K существует деление на две группы (эволюционно старые и молодые, соответственно), внутри которых существует разделение на подгруппы, основанное на различиях в нуклеотидных последовательностях LTR и времени интеграции в геном хозяина Последовательности дифференциально транскрибирующихся LTR были проанализированы и отнесены к различным группам семейства HERV-K Можно выделить 2 наиболее транскрипционно активные группы LTR семейства HERV-К- II-T (одна из самых молодых групп - время интеграции 16 млн. лет назад) и I-A (эволюционно старая группа, время внедрения которой оценивается как 43 млн. лет назад). Считается, что эволюционно молодые LTR HERV-K в среднем более транскрипционно активны, однако полученные нами результаты противоречат этому

Все изложенное выше свидетельствует о том, чю при сравнении образцов опухолевой и нормальной тканей происходит заметное изменение набора LTR-содержащих транскриптов. Существенное изменение спектра транскрипции при переходе от нормальной к опухолевой ткани может отражать особенности функциональной роли LTR-содержащих транскриптов. Однако надо принять во внимание, что в случае LTR-содержащих транскриптов, мы имеем дело с классом транскриптов, роль которых в геноме до сих пор не известна

Обнаруженные нами дифференциально экспрессирующиеся LTR-содержащие транскрипты можно разделить на несколько групп- Транскрипты, в которых LTR входит в состав провирусов Такие транскрипты имеют довольно высокий уровень транскрипции, их обнаружение было ожидаемо, поскольку известно, что провирусы HERV-K транскрибируются и экспрессируют вирусные белки в герминогенных опухолях. Мы идентифицировали несколько гибридных провирусов, в состав которых помимо HERV-K входили фрагменты HERV-H и SVA ретропозонов. Для провирусов HERV-H была показана транскрипция в герминогенных опухолях, однако о транскрипции гибридных провирусов на сегодняшний день известно мало.

- Транскрипты, в которых LTR окружены повторами. Традиционно считается, что LTR, окруженные повторяющимися последовательностями, находятся в так называемых «свалках» генома и транскрипционно не активны Наши данные говорят о том, что и они транскрибируются.

- LTR, для которых на расстоянии 10 т п.о. от LTR не обнаружено каких-либо генов или экспрессирующихся последовательностей (Expressed Sequenced Tag, EST) («orphan»).

- LTR, поблизости от которых находятся гены или EST; LTR, находящиеся в интронах различных генов.

Дифференциально экспрессирующиеся LTR-содержащие транскрипты, относящиеся к последним двум группам, представлены в таблице 2.

Таблица 2. Дифференциальные ЬТЯ-содержащие транскрипты, обнаруженные методом КОБШ при анализе семиномы и нормальной паренхимы яичка.

Номер геномного локуса в GenBank Хромосомная локализацияа Известные гены, EST" Локализация LTR относительно известных генов, EST с Подсемейство LTR"

AL591742 lql3.2 «orphan»* I-D(25)

АС 126471 12q21.31 «orphan» II-T (16.5)

АС053544 4ql3.2 «orphan» 11-0(33.1)

АС020928 19ql 3 12 AL600738 и другие ESTs интрон + I-K(43)

АС008784 5ql 1.2 AB059368 интрон + I-S(40)

АС068134 2q37 1 ALPPL2 BM012844, BF991338 downstream интрон + 11-0(33 1)

АС011939 15q22 31 B-indl AL832602, BC041704, AK.091368 интрон + интрон - II-T(16 5)

AL157395 lOpl5 1 BG897563 CB990524 ин1рон -интрон + I-P(35 4)

AC022150 19ql3.41 множество мРНК интрон +,- I-A(43 5)

AC090515 15q21 3 KIAA1164 и другие ESTs интрон - 1-X(29 6)

AC006432 12pl3.31 KLRB1 интрон - II-L(7)

AC109327 17q25.3 Hs raptor mRNA интрон - II-T(16 5)

AL591806 lq23 3 JAM1 интрон - I-X(29 6)

AC020924 5ql 1.2 PDE4D интрон - 1I-T(16.5)

AL392086 10pl4 AK094154 интрон - II-V(31.5)

AL391820 1р32 1 DKFZp761D221 и другие ESTs интрон - I-S(40)

AL121753 20ql 1 22 MMP24 интрон - Il-L(7)

AC024361 17q25.3 FN3K интрон - II-T(16.5)

AC016708 2q35 BARD1 интрон - II-T(16 5)

AP001160 llql2 3 SLC3A2 интрон - I-A(43 5)

AL713888 10q21 3 SLC25A16 интрон - II-V(31 5)

AL590543 6q25.1 AL110241 FLJ20627, BC012081 интрон -upstream+ II-T(16 5)

AC108063 4pl5 32 PROM1 MSTP061 mRNA upstream -интрон - II-V(31 5)

AL121928 10q24 32 FLJ14280 upstream + 11-0(33 1)

ACO 16697 2q34 IDH1 upstream + 1-P(35 4)

PIP5K upstream -

АС026424 5ql 3 3 POLK upstream + II-L(7)

АС109326 17q21 31 AK023939, AK056941 upstream - II-V(31.5)

AL139022 14q23.3 FNTB upstream - II-L(7)

"Хромосомная локализация LTR, полученная с помощью сервера Human Genome Browser (октябрь 2003 г ), ' Указаны близлежащие гены, кДНК, EST, обнаруженные с помощью Human Genome Browser (октябрь 2003 г ), жирным шрифтом обозначены известные гены, * «orphan» - означает, что на расстоянии 10 т п о от LTR не обнаружено каких-либо генов или EST; "Локализация и ориентация LTR относительно известных генов, кДНК, EST, 'указано подсемейство LTR (возраст мастер гена, млн лет)

Поиск специфичных для опухолей интеграции LTR HERV-K и LINE1.

Полученные данные о высокой транскрипционной активности LTR HERV-K позволили нам предположить, что эти повторяющиеся элементы могли сохранить и свою транспозиционную активность, неотъемлемым условием которой является транскрипция На сегодняшний день данные об участии ретроэлементов в геномной нестабильности, возникающей при опухолевой прогрессии, очень скудны. Это объясняется в первую очередь отсутствием методов, позволяющих проводить сравнение распределения ретроэлементов в геномной ДНК из нормальных и опухолевых тканей. Для поиска LTR семейства HERV-K и LlNE-элементов, присутствующих в геноме опухоли и отсутствующих в геноме нормальной ткани, мы применили метод вычитающей гибридизации Targeted Genomic Difference Analysis (TGDA), модифицировав его для поиска редких (1 на 10 клеток) перестроек геномной ДНК.

Важнейшими параметрами, определяющими эффективность работы методов, основанных на процессах диссоциации-реассоциации, являются кинетические Поэтому нами были проведены теоретические расчеты для определения оптимальных параметров гибридизации, а именно- соотношение трейсер/драйвер, концентрация трейсера и драйвера, время гибридизации Расчеты показали, что наиболее подходящими (исходя из теоретических положений и реальных возможностей эксперимента) для решения нашей задачи будет соотношение трейсер/драйвер 1 30 при концентрации трейсера 1.3 цМ Исходя из этих соотношений, мы рассчитали оптимальное время гибридизации, которое меняется в зависимости от частоты встречаемости различий в

анализируемых геномах (например, 1 копия на геном, 0,1 копии на геном и 0,01 копии на геном)

Для количественной оценки чувствительности разработанного нами метода и проверки теоретических расчетов в эксперимент была введена "искусственная", отсутствующая в геноме человека, последовательность, так называемый вложенный контроль Вложенный контроль состоял из короткого фрагмента последовательности РЭ и фрагмента последовательности вектора pGEM-T, фланкированных супрессионными адаптерами, такими же, как и у трейсера Вложенный контроль присутствовал только во фракции трейсера, и в результате вычитания его удельная концентрация должна была возрастать Оценивая увеличение удельной концентрации вложенного контроля, мы могли судить об эффективности вычитающей гибридизации

Были проведены три вычитающие гибридизации, в которых концентрации вложенного контроля соответствовали 1, 0,1 и 0,01 копиям на геном В каждом из этих экспериментов отбирали аликвоты гибридизационной смеси через 2,5, 10 и 27 часов гибридизации и оценивали удельную концентрацию вложенного контроля. Существенное увеличение концентрации мишеней происходило после 27 часов гибридизации

Известно, что опухолевые ткани сильно гетерогенны и, следовательно, различия могут присутствовать в геномах одних клеток и отсутствовать в других Эксперименты показали, что метод позволяет обнаружить различия, встречающиеся в геноме только одной из 10 клеток

Для оценки частот ретропозиций LTR HF.RV-K и I INFI элементов были использованы герминогенная опухоль семинома и нормальная паренхима яичка от одного и того же пациента Выбор семейства HERV-K объясняется тем, что это семейство является наиболее молодым и активным среди эндогенных ретровирусов, и его представители сохранили свою транскрипционную активность в процессе эволюции. Из всех LINE-элементов мы выбрали наиболее эволюционно молодые и гранспозиционно активные LINE1 (1.1)

После проведения вычитающей гибридизации были получены наборы фрагментов ДНК, обогащенные специфичными для опухолевой и нормальной тканей фланками LTR HERV-K и LI. Эти фрагменты ДНК были клонированы, после чего были получены четыре ранжированные библиотеки, каждая их которых содержала около 500 клонов Были проведены дифференциальные

гибридизации полученных библиотек, определение нуклеотидной последовательности предположительно дифференциальных фрагментов и картирование их в геноме. Для проверки возможной дифференциальной природы этих геномных фрагментов проводили PCR амплификацию с уникальными праймерами на ДНК из опухолевой и нормальной тканей

LTR HERV-K и LINE1, присутствующих в опухолевой ткани и отсутствующих в нормальной, нами обнаружено не было По-видимому, если подобные перестройки с участием ретроэлементов и происходят, то крайне редко (менее 1 на 10 клеток).

Показано, что транскрипционная активность индивидуальных ЬТИ семейства НЕЯУ-К меняется в зависимости от типа ткани, при воздействии митогенов и стрессовых факторов, а также при опухолевой трансформации Каждый ЬТЯ имеет свой характерный профиль экспрессии Разработан метод сравнения спектров транскриптов, содержащих повторяющиеся элементы генома, в разных тканях (селективный дифференциальный дисплей РНК, БООЖ) Показано, что вБИт обладает высокой чувствительностью и специфичностью

С использованием ЗВРЖ установлено, чю примерно 10% ЬТК НЕЯУ-К входят в состав транскриптов, причем при переходе от нормальной ткани к опухолевой происходит как подавление, так и усиление транскрипции отдельных ЬТЯ-содержащих РНК

Показано, что при переходе от нормальной ткани к герминогенной опухоли не происходит значительного увеличения частоты ретропозиций ЬТЯ НЕЮ/-К и ЬШЕ1 элементов.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ ИЗЛОЖЕНЫ В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ:

Публикации в научных журналах:

Т. Vinogradova, L. Leppik, Е. Kalinina, Р Zhulidov, К.-Н. Grzeschik and Е. Sverdlov «Selective Differential Display of RNAs containing interspersed repeats: analysis of HERV-K LTRs transcription changes m germ cell tumors» Mol Genet Genomics (2002) 266: 796-805

T Vinogradova, L. Leppik, L Nikolaev, S. Akopov, A Kleiman, N Senyuta, E Sverdlov "Solitary Human Endogenous Retroviruses-K LTRs Retain Transcription Activity in vivo, the Mode of Which is Different in Different Cell Types" Virology (2001) 290. 83-90

Тезисы российских и международных научных конференций:

Vinogradova Т., Leppik L, Kalinma Е., Grzeschik К-Н and Sverdlov Е. "Selective differential display of the RNAs containing interspersed repeats- changes of transcription in germ cell tumor". 2-d International Workshop "Retrotransposones and genome evolution", April 20-22,2003, Сочи, Россия (тезисы докладов стр. 22)

Т. Vinogradova, L. Leppik, L. Nikolaev, K.-H. Grzeschik, E. Sverdlov. "Probing a role of human endogenous retroviruses in transcription regulation in testicular germ cell tumors". «5lh Copenhagen Workshop on Carcinoma in situ and Cancer of the Testis», August 29-31, 2002, Copenhagen, Denmark, Poster # 27

T V Vinogradova, L.P.Leppik, E A.Kalinina, P A Zhulidov, K.-H.Grzeschik, E.D.Sverdlov. "Selective differential display of the RNAs containing interspersed repeats- changes of transcription m germ cell tumor" Human Genome Meeting 2001, April 19-22, 2001, Edinburgh, UK, Poster # 105

Виноградова T.B., Ленпик Л.П , Калинина Е А , Жулидов П.А, Гржешик К -X , Свердлов Е Д. (^Дифференциальный дисплей РНК, содержащих повторяющиеся элементы генома- изменение транскрипции в герминогенных опухолях». 9-я Международная конференция «СПИД, РАК И РОДСТВЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ», 2001, С-Пб, Россия (Русский журнал ВИЧ/СПИД т.5 №1 2001 г, стр. 20)

Т Vinogradova, L.Leppik, S.Akopov, L.Nikolaev, A.Kleiman, N.Senuata, T Gorodentseva, E Sverdlov. "Probing a role of human endogenous retroviruses m genome transcription in cancer and normal human cells". Human Genome Meeting, April 9-12, 2000, Vancouver, Canada (тезисы докладов стр. 24)

Виноградова Т.В., Леппик Л.П , Акопов С Б , Николаев Л II, Клейман А М, Сенюта Н.Б., Свердлов Е.Д. «Исследование транскрипции эндогенных ретровирусов человека в нормальных и опухолевых клетках». 8-я Международная конференция «СПИД, РАК И РОДСТВЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ», 2000, С-Пб, России (Русский журнал ВИЧ/СПИД т.4 №1 2000 г стр. 79)

T Vinogradova, L.Leppik, S Akopov, L Nikolaev, A Kleiman, N Senuata, T.Gorodentseva, E Sverdlov "Probing a role of human endogenous retroviruses in genome transcription in cancer and normal human cells". «Endogenous Retroviruses and evolution of genome. International workshop», 2000, Москва, Россия (тезисы докладов стр 14)

Виноградова Т В , Лсппик Л.П., Акопов С Б , Николаев JT H , Клейман A M , Сенкла H Б., Свердлов Е.Д. «Исследование транскрипции эндогенных ретровирусов человека в нормальных и опухолевых клетках». V чтения, посвященные памяти акад. Ю.А. Овчинникова, 2000, Москва-Пущино, Россия (тезисы докладов стр 22)

Отпечатано в копицентре «Учебная полиграфия» Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус www stprint.ru e-mail, zakaz@stprint.ru тел 939-3338 Заказ № 481, тираж 100 экз Подписано в печать 10 03.2004 г

РНБ Русский фонд

2006-4 4401

1 5 M„J 2004

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Леппик, Людмила Паульевна

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Классы ретротранспозонов.

1. LINE элементы.

1.1 Структура и классификация L1 элементов.

1.2 Распределение L1 по геному человека.

1.3 Функциональная активность L1.

Транскрипционная активность.

Транспозиционная активность.

2. Эндогенные ретровирусы человека.

2.1 Строение HERV.

2.2 Классификация.

2.3 Представленность и локализация HERV и LTR в геноме.

2.4 Распределение HERV и LTR по хромосомам.

2.5 Активность HERV и одиночных LTR.

2.6 Факторы, влияющие на экспрессию HERV.

2.7 Возможное участие ERV в различных нормальных и патофизиологических процессах.

ERV: возможное участие в развитии плаценты и эмбриогенезе.

Роль HERV в возникновении опухолей.

Участие ERV в иммунном ответе организма.

Потенциальная роль HERV в возникновении диабета I.

Ретротранспозиция и инсерционный мутагенез.

ГЛАВА 2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

2.1 Анализ транскрипционной активности индивидуальных LTR семейства HERV-K.

2.2 Анализ транскрипционной активности индивидуальных LTR HERV-K в нормальных и опухолевых тканях человека.

Чувствительность и репрезентативность метода SDDIR.

Варианты SDDIR.

Транскрипционная активность LTR HERV-K.

2. 3 Поиск специфичных для опухолей интеграции LTR HERV-K и LINE1.

Оценка чувствительности метода TGDA.

TGDA опухоль-специфичных интеграций LTR HERV-K и LINE1.

Идентификация дифференциальных фрагментов.

ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

3.1 Материалы.

3.1.1 Ферменты и реактивы.

3.1.2 Оборудование.

3.1.3 Расходные материалы.

3.1.4 Буферные и другие растворы.

3.1.5 Микробиологические среды.

3.1.6 Ткани.

3.1.7 Праймеры, последовательность нуклеотидов.

3.2 Методы исследования.

3.2.1 Выделение РНК и геномной ДНК.

3.2.2 Обработка ДНКазой.

3.2.3 Синтез первой цепи кДНК.

3.2.4 PCR.

3.2.5 Определение первичной структуры клонированных фрагментов ДНК и PCR фрагментов.

3.2.6 Подбор праймеров для амплификации.

3.2.7 Поиск гомологий, картирование в геноме человека.

3.2.8 Дифференциальный дисплей SDDIR (Selective Differential Display of RNAs containing Interspersed Repeats).

3.2.9 Модифицированный TGDA (Targeted Genomic Difference Analysis).

Приготовление вложенного контроля.

ВЫВОДЫ:.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Сравнительный анализ активности ретроэлементов в нормальных и опухолевых тканях человека"

Часть повторяющихся элементов генома экспрессионно активна. Большое число повторяющихся элементов могут образовывать собственные транскрипты, которые участвуют в функционировании клетки. Ретроэлементы могут образовывать некодирующие РНК, потенциально способные принимать участие в регуляции генной активности, например при посттранскрипционном сплайсинге генов или участвуя в подавлении экспрессии транспозонов и других повторяющихся элементов [3-5]. РНК, содержащие Alu элементы, составляют 5% от известных мРНК [6]. В 5' и 3' UTR многих генных транскриптов присутствуют последовательности ретроэлементов. Особенно богаты последовательностями РЭ транскрипты эволюционно молодых классов генов, таких как гены иммунного ответа или ответа на воздействия внешних факторов [7].

Перемещаясь, РЭ существенно влияют на структуру генетического материала хозяина и имеют фундаментальное значение в формировании генетической изменчивости. Считают, что причиной возникновения спонтанных мутаций может являться транспозиционная активность подвижных элементов генома [8]. Являясь причиной инсерционного мутагенеза, РЭ могут, как изменять последовательность гена, так и изменять его транскрипционную активность, влиять на тканеспецифичность и уровень экспрессии гена. Для некоторых ретроэлементов показано, что они могут быть промоторами и терминаторами транскрипции близлежащих клеточных генов, участвовать в альтернативном сплайсинге, предполагают участие РЭ в ремоделировании хроматина и других процессах [5, 9, 10].

Методами блот гибридизации и PCR было показано, что активность РЭ может изменяться в зависимости от внешних условий и состояния клетки [10]. Показано увеличение количества Alu транскриптов в клетках при стрессовых условиях [11]. Другим хорошо известным примером является изменение картины экспрессии эндогенных ретровирусов и LINE1 элементов в процессе опухолевой трансформации [12, 13]. Все эти данные свидетельствуют о том, что, по крайней мере, некоторые ретроэлементы в процессе эволюции сохранили свой биологический потенциал, но не дают возможности ответить на вопрос, каковы функции РЭ в геноме человека. Остается неясным, какие факторы участвуют в регуляции активности ретроэлементов, сколько и какие элементы подвергаются этой регуляции, как и за счет чего при изменениях внешних условий и клеточного состояния изменяется транскрипционная активность индивидуальных РЭ.

Существует большое число работ, исследующих роль повторяющихся элементов в функционировании клетки, но все они сфокусированы на активности отдельных представителей ретроэлементов [5, 9, 10]. На сегодняшний день не проводили полногеномных исследований транскрипционно активных ретроэлементов и исследований изменения их активности в различных нормальных и опухолевых тканях, так как не существует метода для исследования всего пула РНК, содержащих определенный класс повторяющихся элементов, и позволяющего сравнивать спектры РНК в различных типах клеток и тканей.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Леппик, Людмила Паульевна

ВЫВОДЫ:

1. Показано, что транскрипционная активность индивидуальных LTR семейства HERV-K меняется в зависимости от типа ткани, при воздействии митогенов и стрессовых факторов, а также при опухолевой трансформации. Каждый LTR имеет свой характерный профиль экспрессии.

2. Разработан метод сравнения спектров транскриптов, содержащих повторяющиеся элементы генома, в разных тканях (Селективный Дифференциальный Дисплей РНК, SDDIR). Показано, что SDDIR обладает высокой чувствительностью и специфичностью.

3. С использованием SDDIR установлено, что примерно 10% LTR HERV-K входят в состав транскриптов, причем при переходе от нормальной ткани к опухолевой происходит как подавление, так и усиление транскрипции отдельных LTR-содержащих РНК.

4. Показано, что при переходе от нормальной ткани к герминогенной опухоли не происходит значительного увеличения частоты ретропозиций LTR HERV-K и LINE-1 элементов.

Заключение

С момента открытия мобильных элементов прошло много времени, однако функции этой "избыточной" ДНК до сих пор не вполне ясны, хотя ее структура изучена достаточно подробно. Несмотря на широкую распространенность повторяющихся последовательностей в геноме эукариот и их очевидную активность во время жизненного цикла организмов, биологическое значение ретроэлементов и других некодирующих элементов генома остается непонятным. Вызывает сомнение правильность активно обсуждаемой в литературе гипотезы об «эгоистичности» избыточной геномной ДНК, в соответствие с которой вся избыточная ДНК является геномным паразитом и распространяется в геноме в результате транспозиций точных копий немногочисленных исходных последовательностей.

Перемещаясь по геному, РЭ могут влиять на структуру генетического материала хозяина и иметь фундаментальное значение для формирования генетической изменчивости.

Существует множество примеров нарушения регуляции генов в результате встраивания РЭ рядом или непосредственно в регуляторный участок гена. Однако приведенные в обзоре литературы данные описывают лишь единичные случаи активности РЭ, и остается неясным, является ли такая активность свойством всего класса РЭ или только конкретных элементов.

Приведенные в обзоре данные свидетельствуют о том, что, по крайней мере, некоторые ретроэлементы в процессе эволюции сохранили свой биологический потенциал, но, к сожалению, вопрос о функциональной роли РЭ в геноме человека до сих пор остается неясным. Остается неясным, какие факторы участвуют в регуляции активности ретроэлементов, сколько этих элементов и какие именно подвергаются этой регуляции, как и за счет чего при изменениях внешних условий и клеточного состояния изменяется транскрипционная активность индивидуальных РЭ.

В данной работе мы разработали методы, которые могут быть полезны для выяснения вклада активности РЭ в функционирование генома хозяина, и применили их для полногеномного анализа функциональной активности HERV и LINE элементов и ее изменений при переходе от нормальных тканей к опухолевым.

ГЛАВА 2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

2.1 Анализ транскрипционной активности индивидуальных LTR семейства HERV-K.

Выбор LTR для исследований

Ранее было показано, что LTR семейства HERV-K могут быть отнесены к различным подсемействам, интегрировавшим в геном человека от 50 до 2 млн. лет назад в процессе эволюции [50]. Вопрос о транскрипционной активности LTR, относящихся к различным подсемействам, остается малоизученным. Для анализа транскрипционной активности индивидуальных LTR, характеризующихся различным временем интеграции в геном приматов, мы выбрали четыре LTR семейства HERV-K, расположенных на различных хромосомах человека и аннотированных в базе данных GenBank (табл.2.1). Выбор был основан на двух критериях: 1) LTR должен быть полноразмерным и содержать все регуляторные элементы; 2) LTR не должен находится в окружении повторяющихся элементов, что дает возможность подобрать уникальные праймеры для амплификации. Два выбранных LTR присутствовали только у человека и являлись эволюционно молодыми, в то время как два других являлись более старыми и присутствовали в геномах приматов.

Нашей задачей было определить, обладают ли отобранные нами LTR транскрипционной активностью, является ли эта активность тканеспецифичной и изменяется ли она под воздействием внешних факторов. Ранее было показано, что индивидуальные LTRs могут выступать в роли промотора, энхансера и терминатора транскрипции, или полностью входить в состав транскрипта [60, 85, 86]. Остается неизвестным, может ли один и тот же LTR обладать различной транскрипционной активностью в одной и той же ткани или в разных тканях при разных внешних условиях. Чтобы оценить транскрипционную активность индивидуальных LTR, была разработана схема эксперимента, представленная на рис. 2.1.

HERV-K LTR

Геномная ДНК Геномная ДНК -; из | r | us |J

РНК I

I цепь кДНК

Инициация транскрипции

I R I U5 |

Тсрминация транскрипции из I R

Транскрипция сквозь LTR из | R | LJ5 h

PI Р2 РЗ Р4

U3 PCR проду1сг U5 PCR продуют

Инициация транскрипции +

Термипация транскрипции

Транскрипция сквозь LTR +

Рис. 2.1 Схема анализа транскрипционной активности индивидуальных LTR методом RT-PCR. Пары праймеров Р1/Р2 и РЗ/Р4 использовали для амплификации U3 и U5 областей LTR HERV-K, соответственно. Предполагаемая активность LTR и соответствующие продукты RT-PCR приведены в нижней части рисунка

Были рассмотрены три основные модели участия LTR в транскрипции: 1) LTR является промотором и инициирует транскрипцию; 2) LTR терминирует транскрипцию, инициированную с внешнего промотора; 3) LTR входит в состав транскрипта, инициированного и терминированного с других регуляторных элементов. Отнесение данного LTR к той или иной модели осуществляли с помощью RT-PCR с использованием двух пар праймеров. Первая пара праймеров включала в себя праймер, комплементарный уникальной части генома, фланкирующей U3 область LTR и праймер, комплементарный U3 области LTR (праймеры Р1 и Р2 на рис. 2.1).

Вторая пара праймеров состояла из праймера, комплементарного уникальному геномному фрагменту, фланкирующему U5 область LTR и праймера, соответствующего самой U5 области LTR (праймеры РЗ и Р4 на рис. 2.1). Если LTR, аналогично LTR ретровирусов, инициирует транскрипцию на границе U3 и R областей, то при RT-PCR с прайм ерами РЗ и Р4 будет образовываться продукт амплификации, а с праймерами Р1 и Р2 - нет. (Строго говоря, это относится к случаю, когда инициация транскрипции происходит в области LTR между указанными двумя парами праймеров). Амплификация с праймерами Р1 и Р2, но не с праймерами РЗ и Р4, будет происходить только тогда, когда LTR служит терминатором транскрипции. Обе пары праймеров будут давать продукты амплификации в том случае, если LTR входит в состав более длинного транскрипта. Для разделения различных индивидуальных LTR были использованы наборы уникальных праймеров Р1 и Р4 (табл. 2, глава «Материалы и методы»).

При сравнении уровня транскрипции U3 и U5 областей LTR, мы считали, что фрагмент транскрибируется («+» в табл. 2.1), если к 37 циклу амплификации было синтезировано как минимум 100 нг продукта. В большинстве случаев мы детектировали 100 нг продукта уже после 35 циклов амплификации или ранее. Мы считали, что фрагмент не транскрибируется, если количество продукта амплификации было ниже уровня детекции или составляло менее 5% от количества самого слабого из детектируемых продуктов («-» в табл. результатов).

Синтез первой цепи кДНК проводили на матрице суммарной РНК, выделенной из различных тканей человека и клеточных линий. Для избежания потерь не-полиаденилированных LTR-содержащих регуляторных транскриптов и транскриптов, в которых LTR входит в состав интронов, кДНК была синтезирована с помощью смеси праймеров: oligo(dT) праймера и статистических гексамеров. Однако результаты RT-PCR анализа были качественно одинаковыми, когда для синтеза были использованы только статистические гексамеры (данные не приводятся). В качестве контроля на возможное присутствие геномной ДНК использовали контрольные образцы, приготовленные абсолютно идентично опытным, за исключением отсутствия в реакционной смеси обратной транскриптазы.

Результаты анализа транскрипционной активности двух LTR из локуса АВ000064 и ВС52374 представлены на рис. 2.2, А.

Для подтверждения того, что анализируемые геномные локусы присутствовали в геномной ДНК всех используемых тканей и линий клеток, мы проводили PCR амплификацию геномной ДНК с парой праймеров Р1 и Р4 (данные не приводятся). PCR продукт отсутствовал при амплификации с этой парой праймеров геномной ДНК или кДНК грызунов, не содержащих каких-либо последовательностей HERV.

Чтобы оценить транскрипционную активность исследуемых LTR и количество LTR-содержащих транскриптов, можно соотнести полученные результаты с количеством транскриптов актина. Количество LTR-содержащих транскриптов составляло около 0.1-1% от количества транскриптов актина в одних и тех же тканях и клеточных линиях. Несмотря на сравнительно низкую представленность, эти транскрипты были достоверно детектированы к 33-37 циклу амплификации.

Транскрипция различных LTR в различных тканях.

Как видно из рис. 2.2 А, транскрипт, содержащий U5 область LTR из геномного локуса АВ006684 присутствовал в семиноме, в то время как транскрипт, содержащий U3 область присутствовал в эмбриональной карциноме.

А В

АВ006684

U3 (Р1- Р2) U5 (РЗ - Р4)

Семинома

Эмбриональная карцинома щ

ВС52374

Семинома

Эмбриональная карцинома

33 35 37

35 37

АС002508 Клеточная линия Jurkat после теплового шока

U3 (Р1- Р2) U5 (РЗ- Р4)

33 35 37 33 35 37 Амплификация LTR (Р1- Р4)

34 37 34 37 кДНК геномная ДНК

Рис. 2.2 Пример дифференциального RT-PCR. На панели (А) представлена дифференциальная активность индивидуальных LTR в различных опухолях. Надписи U3 и U5 соответствуют амплификации с праймерами, комплементарными U3 и U5 областям LTR, соответственно. АВ006684, ВС52374, АС002508 - номера исследованных LTR-содержащих геномных локусов по GenBank. Цифры 33-35-37 обозначают количество циклов амплификации. На панели (В) представлены результаты амплификации U3 и U5 областей LTR АС002508 в линии клеток Jurkat после теплового шока. Отсутствие транскрипта, содержащего полноразмерный LTR АС002508, доказано амплификацией с праймерами PI-P4.

Наоборот, транскрипт, содержащий U3 область LTR из локуса ВС52374 детектировали в семиноме и эмбриональной карциноме, в то время как U5 содержащий транскрипт этого LTR не детектировали ни в одной из исследуемых нормальных и опухолевых тканей. Результаты анализа транскрипционной активности LTR на панели кДНК из шести тканей и трех клеточных линий суммированы в таблице 2.1. Из полученных результатов можно сделать вывод, что в целом, транскрипционная активность LTR зависит от типа исследуемой ткани или клеточной линии. Например, LTR-содержащий транскрипт из геномного локуса АС002508 не детектировали в плаценте и эмбриональной карциноме, в то время как U3 и U5 области этого LTR транскрибировались в семиноме и клеточной линии рабдомиосаркомы. Помимо этого следует отметить, что спектр транскриптов индивидуальных LTR отличался в нормальной и опухолевой тканях, и в различных опухолевых тканях (табл. 2.1).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Леппик, Людмила Паульевна, Москва

1. J. McPherson, et al., A physical map of the human genome. Nature, 2001.409(6822): p. 934-41.

2. E. Lander, et al., Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature, 2001. 409(6822): p. 860-921.

3. J. Brosius, et al., RNAs from all categories generate retrosequences that may be exapted as novel genes or regulatory elements. Gene, 1999. 238(1): p. 115-34.

4. H. Kazazian, et al., LI retrotransposons shape the mammalian genome. Science, 2000. 289(5482): p. 1152-1153.

5. R. Lower, J. Lower, and R. Kurth, The viruses in all of us: characteristics and biological significance of human endogenous retrovirus sequences. Proc Natl Acad Sci U S A, 1996. 93(11): p. 5177-5184.

6. I. Yulug, A. Yulug, and E. Fisher, The frequency and position of Alu repeats in cDNAs, as determined by database searching. Genomics, 1995.27(3): p. 544-548.

7. P. Medstrand, Retroelement distributions in the human genome: variations associated with age and proximity to genes. Genome Res, 2002. Oct; 12(10): p. 1483-95.

8. H. Kazazian, An estimated frequency of endogenous insertional mutations in humans. Nat Genet, 1999.22(2): p. 130.

9. P. Nouvel, The mammalian genome shaping activity of reverse transcriptase. Genetica, 1994. 93(1-3): p. 191-201.

10. C. Leib-Mosch and W. Seifarth, Evolution and biological significance of human retroelements. Virus Genes, 1995. 11(2-3): p. 133-45.

11. W. Chu, et al., Potential Alu function: regulation of the activity of double-stranded RNA-activated kinase PKR. Mol Cell Biol, 1998. 18(1): p. 58-68.

12. A. Florl, et al., DNA methylation and expression of LINE-1 and HERV-K provirus sequences in urothelial and renal cell carcinomas. Br J Cancer, 1999. 80(9): p. 13121321.

13. G. Alves, A. Tatro, and T. Fanning, Differential methylation of human LINE-1 retrotransposons in malignant cells. Gene, 1996. 176(1-2): p. 39-44.

14. M. Kidwell and D. Lisch, Transposable elements as sources of variation in animals and plants. Proc Natl Acad Sci USA, 1997. 94(15): p. 7704-7711.

15. P. Хесин, Непостоянство генома. 1984, Москва: Наука. 472-472.

16. J. Yoder, С. Walsh, and Т. Bestor, Cytosine methylation and the ecology of intragenomic parasites. Trends Genet, 1997. 13(8): p. 335-40.

17. A. Smit, The origin of interspersed repeats in the human genome. Curr Opin Genet Dev, 1996. 6(6): p. 743-8.

18. E. Whitelaw and D. Martin, Retrotransposons as epigenetic mediators of phenotypic variation in mammals. Nat Genet, 2001. 27(4): p. 361-5.

19. С. Esnault, J. Maestre, and T. Heidmann, Human LINE retrotransposons generate processed pseudogenes. Nat Genet, 2000. 24(4): p. 363-7.

20. R. DeBerardinis, et al., Rapid amplification of a retrotransposon subfamily is evolving the mouse genome. Nat Genet, 1998. 20(3): p. 288-90.

21. H. Kazazian, and J. Moran, The impact of LI retrotransposons on the human genome. Nat Genet, 1998.19(1): p. 19-24.

22. A. Scott, et al., Origin of the human LI elements: proposed progenitor genes deduced from a consensus DNA sequence. Genomics, 1987. 1(2): p. 113-25.

23. H. Hohjoh and M. Singer, Cytoplasmic ribonucleoprotein complexes containing human LINE-1 protein and RNA. Embo J, 1996.15(3): p. 630-9.

24. D. Leibold, et al., Translation of LINE-1 DNA elements in vitro and in human cells. Proc Natl Acad Sci USA, 1990. 87(18): p. 6990-4.

25. J. McMillan and M. Singer, Translation of the human LINE-1 element, LIHs. Proc Natl Acad Sci USA, 1993. 90(24): p. 11533-7.

26. A. Smit, et al., Ancestral, mammalian-wide subfamilies of LINE-1 repetitive sequences. J Mol Biol, 1995. 246(3): p. 401-417.

27. M. Singer, et al., LINE-1: a human transposable element. Gene, 1993. 135(1-2): p. 183-8.

28. A. Clements and M. Singer, The human LINE-1 reverse transcriptase:effect of deletions outside the common reverse transcriptase domain. Nucleic Acids Res, 1998. 26(15): p. 3528-35.

29. S. Lee, J. Wong, and K. Collins, Human telomerase reverse transcriptase motifs required for elongation of a telomeric substrate. J Biol Chem, 2003.

30. Y. Miki, Retrotransposal integration of mobile genetic elements in human diseases. J Hum Genet., 1998. 43(2): p. 77-84.

31. J. Skowronski and M. Singer, Expression of a cytoplasmic LINE-1 transcript is regulated in a human teratocarcinoma cell line. Proc Natl Acad Sci USA, 1985. 82(18): p. 6050-4.

32. J. Goodier, E. Ostertag, and H. Kazazian, Transduction of З'-flanking sequences is common in LI retrotransposition. Hum Mol Genet, 2000. 9(4): p. 653-7.

33. V. Perepelitsa-Belancio and P. Deininger, RNA truncation by premature polyadenylation attenuates human mobile element activity. Nat Genet, 2003. 35(4): p. 363-6.

34. B. Brouha, et al., Hot Lis account for the bulk of retrotransposition in the human population. Proc Natl Acad Sci USA, 2003. 100(9): p. 5280-5.

35. E. Ostertag and H. Kazazian, Biology of mammalian LI retrotransposons. Annu Rev Genet, 2001. 35: p. 501-38.

36. Y. Miki, etal., Disruption oftheAPC gene by a retrotransposal insertion of LI sequence in a colon cancer. Cancer Res, 1992. 52(3): p. 643-5.

37. Z. Yang, et al., Apolipoprotein(a) gene enhancer resides within a LINE element. J Biol Chem, 1998.273(2): p. 891-7.

38. S. Kurachi, et al., Genetic mechanisms of age regulation of human blood coagulation factor IX. Science, 1999. 285(5428): p. 739-43.

39. B. Shewchuk, N. Cooke, and S. Liebhaber, The human growth hormone locus control region mediates long-distance transcriptional activation independent of nuclear matrix attachment regions. Nucleic Acids Res, 2001. 29(16): p. 3356-61.

40. E.D. Sverdlov, Perpetually mobile footprints of ancient infections in human genome. FEBS Lett, 1998. 428(1-2): p. 1-6.

41. M. Haltmeier, et al., Identification of S71-related human endogenous retroviral sequences with full-length pol genes. Virology, 1995. 209(2): p. 550-560.

42. M. Cohen and E. Larsson, Human endogenous retroviruses. Bioessays, 1988. 9(6): p. 191-6.

43. M. Barbulescu, et al., Many human endogenous retrovirus К (HERV-K) proviruses are unique to humans. Curr Biol, 1999. 9: p. 861-868.

44. M. Knossl, R. Lower, and J. Lower, Expression of the human endogenous retrovirus HTDV/HERV-K is enhanced by cellular transcription factor YY1. J Virol, 1999. 73(2): p. 1254-1261.

45. H. Urnovitz and W. Murphy, Human endogenous retroviruses: nature, occurrence, and clinical implications in human disease. Clin Microbiol Rev, 1996. 9(1): p. 72-99.

46. J. Martin, et al., Human endogenous retrovirus type I-related viruses have an apparently widespread distribution within vertebrates. J Virol, 1997. 71(1): p. 437-43.

47. M. Tristem, Identification and characterization of novel human endogenous retrovirus families by phylogenetic screening of the human genome mapping project database. J Virol, 2000. 74(8): p. 3715-30.

48. E. Herniou, et al., Retroviral diversity and distribution in vertebrates. J Virol, 1998. 72(7): p. 5955-66.

49. A. Smit, Identification of a new, abundant superfamily of mammalian LTR-transposons. Nucleic Acids Res, 1993. 21(8): p. 1863-72.

50. M. Andersson, et al., Diversity of human endogenous retrovirus class II-like sequences. J Gen Virol, 1999. 80(Part 1): p. 255-260.

51. J. Hughes and J. Coffin, Human endogenous retrovirus К solo-LTR formation and insertional polymorphisms: implications for human and viral evolution. Proc Natl Acad Sci USA, 2004. 101(6): p. 1668-72.

52. S. Anderssen, et al., Comparative analyses of LTRs of the ERV-H family of primate-specific retrovirus-like elements isolated from marmoset, African green monkey, and man. Virology, 1997. 234(1): p. 14-30.

53. N. de Parseval, H. Alkabbani, and T. Heidmann, The long terminal repeats of the HERV-H human endogenous retrovirus contain binding sites for transcriptional regulation by the Myb protein. J Gen Virol, 1999. 80 (Pt 4): p. 841-5.

54. J. Mayer, E. Meese, and N. Mueller-Lantzsch, Human endogenous retrovirus К homologous sequences and their coding capacity in Old World primates. J Virol, 1998. 72(3): p. 1870-1875.

55. I. Lavrentieva, et al., Subfamilies and nearest-neighbour dendrogram for the LTRs of human endogenous retroviruses HERV-K mapped on human chromosome 19: physical neighbourhood does not correlate with identity level. Hum Genet, 1998. 102(1): p. 107-116.

56. Y. Lebedev, et al., Physical mapping of sequences homologous to an endogenous retrovirus LTR on human chromosome 19. Mol Gen Genet, 1995. 247(6): p. 742-748.

57. И. Артамонова, et al., Неслучайное распределение регуляторных элементов LTR эндогенных ретровирусов HERV-K на 22 хромосоме человека. Доклады академии наук, 2000. 372(1-6): р. 87-9.

58. S. Steinhuber, et al., Distribution of human endogenous retrovirus HERV-K genomes in humans and different primates. Hum Genet, 1995. 96(2): p. 188-192.

59. C. Leib-Mosch, et al., Genomic distribution and transcription of solitary HERV-K LTRs. Genomics, 1993. 18: p. 261-269.

60. V. Kapitonov and J. Jurka, The long terminal repeat of an endogenous retrovirus induces alternative splicing and encodes an additional carboxy-terminal sequence in the human leptin receptor. J Mol Evol, 1999. 48(2): p. 248-251.

61. P. Kowalski, et al., Genomic structure and evolution of a novel gene (PLA2L) with duplicated phospholipase A2-like domains. Genomics, 1997. 39(1): p. 38-46.

62. P. Kowalski and D. Mager, A human endogenous retrovirus suppresses translation of an associated fusion transcript, PLA2L. J Virol, 1998. 72(7): p. 6164-6168.

63. K. Kato, Description of the entire mRNA population by a 3' end cDNA fragment generated by class IIS restriction enzymes. Nucleic Acids Res, 1995. 23(18): p. 368590.

64. T. Vinogradova, et al., Positioning of 72 potentially full size LTRs of human endogenous retroviruses HERV-K on the human chromosome 19 map. Occurrences of the LTRs in human gene sites. Gene, 1997. 199(1-2): p. 255-264.

65. S. Kurdyukov, et al., Full-sized HERV-K (HML-2) human endogenous retroviral LTR sequences on human chromosome 21: map locations and evolutionary history. Gene, 2001. 273(1): p. 51-61.

66. S. Baban, J. Freeman, and D. Mager, Transcripts from a novel human КЛАВ zinc finger gene contain spliced Alu and endogenous retroviral segments. Genomics, 1996. 33(3): p. 463-472.

67. A. Domansky, et al., Solitary HERV-K LTRs possess bi-directional promoter activity and contain a negative regulatory element in the U5 region. FEBS Lett, 2000. 472(2-3): p. 191-195.

68. M. Landry, Functional analysis of the endogenous retroviral promoter of the human endothelin В receptor gene. J Virol., 2003. Jul;77(13): p. 7459-66.

69. R. Waterston, et al., Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome. Nature, 2002. 420(6915): p. 520-62.

70. Б. Larsson and G. Andersson, Beneficial role of human endogenous retroviruses: Facts and hypotheses. Scand J Immunol, 1998. 48(4): p. 329-338.

71. C. Patience, D. Wilkinson, and R. Weiss, Our retroviral heritage. Trends Genet, 1997. 13(3): p. 116-120.

72. J. Harris, Placental endogenous retrovirus (ERV): structural, functional, and evolutionary significance. Bioessays, 1998. 20(4): p. 307-316.

73. J. Lyden, J.M.Mwenda, N. Rote, Ultrastructural characterization of endogenous retroviral particles isolated from normal human placentas. Biol Reprod., 1994. Jul;51(1): p. 152-7.

74. C. Leib-Mosch, et al., Expression and biological sugnificance of human endogenous retroviral sequences. Leukemia, 1992. 6 Suppl 3: p. 72S-75S.

75. W. Seifarth, et al., Retrovirus-like particles released from the human breast cancer cell line T47-D display type B- and C-related endogenous retroviral sequences. J Virol, 1995. 69(10): p. 6408-6416.

76. G. Simpson, et al., Endogenous D-type (HERV-K) related sequences are packaged into retroviral particles in the placenta and possess open reading frames for reverse transcriptase. Virology, 1996. 222(2): p. 451-456.

77. M. Lindeskog, et al., Coamplification and dispersion of adjacent human endogenous retroviral HERV-H and HERV-E elements; Presence of spliced hybrid transcripts in normal leukocytes. Virology, 1998. 244(1): p. 219-229.

78. M. Ono, M. Kawakami, and H. Ushikubo, Stimulation of expression of the human endogenous retrovirus genome by female steroid hormones in human breast cancer cell line T47D. J Virol, 1987. 61(6): p. 2059-2062.

79. A. Wilier, et al., Two groups of endogenous MMTV related retroviral env transcripts expressed in human tissues. Virus Genes, 1997. 15(2): p. 123-133.

80. N. Gotzinger, et al., Regulation of human endogenous retrovirus-K Gag expression in teratocarcinoma cell lines and human tumours. J Gen Virol, 1996. 77(12): p. 29832990.

81. I. Brodsky, B. Foley, and D. Gillespie, Expression of human endogenous retrovirus (HERV-K) in chronic myeloid leukemia. Leuk Lymphoma, 1993. 11 (Suppl 1): p. 11923.

82. K. Boiler, et al., Evidence that HERV-K is the endogenous retrovirus sequence that codes for the human teratocarcinoma-derived retrovirus HTDV. Virology, 1993. 196(1): p. 349-353.

83. Q. Long, et al., A long terminal repeat of the human endogenous retrovirus ERV-9 is located in the 5' boundary area of the human beta- globin locus control region. Genomics, 1998. 54(3): p. 542-555.

84. W. Goodchild NL, Mager DL., A human endogenous long terminal repeat provides a polyadenylation signal to a novel, alternatively spliced transcript in normal placenta. Gene, 1992. 16(121(2)): p. 287-94.

85. E. Sverdlov, Retroviral regulators of gene expression in the human genome as possible factors for its evolution. Bioorg Khim, 1999.25(11): p. 821-827.

86. I. Afonina, et al., Efficient priming of PCR with short oligonucleotides conjugated to a minor groove binder. Nucleic Acids Res, 1997. 25(13): p. 2657-60.

87. П. Хиль, et al., Структурная характеристика четырех длинных концевых повторов (LTR) эндогенных ретровирусов человека и характеристикаих сайтов интеграции. Биоорганическая химия, 1997. 23(5): р. 434-440.

88. L. van de Lagemaat, et al., Transposable elements in mammals promote regulatory variation and diversification of genes with specialized functions. Trends Genet, 2003. 19(10): p. 530-6.

89. L. Chene, et al., High-level replication of human immunodeficiency virus in thymocytes requires NF-kappaB activation through interaction with thymic epithelial cells. J Virol, 1999. 73(3): p. 2064-73.

90. U. Schon, et al., Cell type-specific expression and promoter activity of human endogenous retroviral long terminal repeats. Virology, 2001.279(1): p. 280-291.

91. A. Caricasole, et al., Bone morphogenetic proteins and retinoic acid induce human endogenous retrovirus HERV-K expression inNT2Dl human embryonal carcinoma cells. Dev Growth Differ, 2000.42(4): p. 407-411.

92. L. Lania, et al., Structural and functional organization of the human endogenous retroviral ERV9 sequences. Virology, 1992. 191(1): p. 464-468.

93. S. Akopov, et al., Long terminal repeats of human endogenous retrovirus К family (HERV-K) specifically bind host cell nuclear proteins. FEBS Lett, 1998. 421(3): p. 229-233.

94. J. Liu, et al., The matrix attachment region-binding protein SATB1 participates in negative regulation of tissue-specific gene expression. Mol Cell Biol, 1997. 17(9): p. 5275-87.

95. P. Schneider, et al., The endogenous retroviral insertion in the human complement C4 gene modulates the expression of homologous genes by antisense inhibition. Immunogenetics, 2001. 53(1): p. 1-9.

96. C. Lin, D. Goldthwait, and D. Samols, Induction of transcription from the long terminal repeat of Moloney murine sarcoma provirus by UV-irradiation, x-irradiation, and phorbol ester. Proc Natl Acad Sci USA, 1990. 87(1): p. 36-40.

97. H. Herbst, M. Sauter, and N. Mueller-Lantzsch, Expression of human endogenous retrovirus К elements in germ cell and trophoblastic tumors. Am J Pathol, 1996. 149(5): p. 1727-1735.

98. R. Tonjes, et al., HERV-K: the biologically most active human endogenous retrovirus family. J Acquir Immune Defic Syndr Hum Retrovirol, 1996. 13: p. S261-267.

99. J. Blond, et al., Molecular characterization and placental expression of HERV-W, a new human endogenous retrovirus family. J Virol, 1999. 73(2): p. 1175-1185.

100. M. Boyd, et al., The human endogenous retrovirus ERV-3 is upregulated in differentiating placental trophoblast cells. Virology, 1993. 196: p. 905-909.

101. A. Cordonnier, J. Casella, and T. Heidmann, Isolation of novel human endogenous retrovirus-like elements with foamy virus-related pol sequence. J Virol, 1995. 69(9): p. 5890-5897.

102. N. Kato, et al., Tissue-specific expression of human provirus ERV3 mRNA in human placenta: two of the three ERV3 mRNAs contain human cellular sequences. J Virol, 1987. 61(7): p. 2182-21891.

103. N. Kato, et al., Human proviral mRNAs down regulated in choriocarcinoma encode a zinc finger protein related to Kruppel. Mol Cell Biol, 1990. 10: p. 4401-4405.

104. K. Katsumata, et al., Tissue-specific high-level expression of human endogenous retrovirus-R in the human adrenal cortex. Pathobiology, 1998. 66(5): p. 209-215.

105. D. Langat, et al., Characterization of antigens expressed in normal baboon trophoblast and cross-reactive with HIV/SIV antibodies. J Reprod Immunol, 1999.42(1): p. 41-58.

106. E. Larsson, et al., Expression of the endogenous retrovirus ERV3 (HERV-R) during induced monocytic differentiation in the U-937 cell line. Int J Cancer, 1996. 67(3): p. 451-456.

107. E. Larsson, et al., Tissue and differentiation specific expression on the endogenous retrovirus ERV3 (HERV-R) in normal human tissues and during induced monocytic differentiation in the U-937 cell line. Leukemia, 1997. 3: p. 142-144.

108. G. Franklin, et al., Expression of human sequences related to those of mouse mammary tumor virus. J Virol, 1988. 62(4): p. 1203-10.

109. C. Kjellman, et al., HERV-F (XA34) is a full-length human endogenous retrovirus expressed in placental and fetal tissues. Gene, 1999. 239(1): p. 99-107.

110. T. Johansen, T. Holm, and E. Bjorklid, Members of the RTVL-H family of human endogenous retrovirus-like elements are expressed in placenta. Gene, 1989. 79(2): p. 259-67.

111. M. Sibata, et al., Human endogenous retroviruses: expression in various organs in vivo and its regulation in vitro. Leukemia, 1997. 3: p. 145-146.

112. G. Andersson, et al., Retroelements in the human MHC class II region. Trends Genet, 1998. 14(3): p. 109-114.

113. T. Bera, et al., Defective retrovirus insertion activates c-Ha-ras protooncogene in an MNU-induced rat mammary carcinoma. Biochem Biophys Res Commun, 1998. 248(3): p. 835-40.

114. N. Amariglio and G. Rechavi, Insertional mutagenesis by transposable elements in the mammalian genome. Environ Mol Mutagen, 1993. 21(3): p. 212-8.

115. H. Herbst, et al., Gene products of human endogenous retrovirus (HERV)-K in germ cell and trophoblastic tumors. German. Verhandlungen der Deutschen Gesellschaft fur Pathologie, 1997. 81: p. 464-470.

116. K. Nakagawa and L. Harrison, The potential roles of endogenous retroviruses in autoimmunity. Immunol Rev, 1996. 152: p. 193-236.

117. S. Indraccolo, et al., Identification of three human sequences with viral superantigen-specific primers. Mamm Genome, 1995. 6(5): p. 339-344.

118. A. Bengtsson, et al., Selective antibody reactivity with peptides from human endogenous retroviruses and nonviral poly(amino acids) in patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum, 1996. 39(10): p. 1654-1663.

119. M. Turbeville, et al., Expression of a putative immunosuppressive protein in human tumors and tissues. Pathobiology, 1996. 64(5): p. 233-238.

120. M. Turbeville, et al., Characterization of a putative retroviral env-related human protein. Pathobiology, 1997. 65(3): p. 123-128.

121. G. Krieg, A.Perl, Endogenous retroviruses: potential etiologic agents in autoimmunity. FASEB J., 1992. 6((8)): p. 2537-44.

122. W. Vogetseder, et al., Detection of a 67-kD glycoprotein in human tumor cell lines by a monoclonal antibody established against a recombinant human endogenous retrovirus-K envelope-gene-encoded protein. Exp Clin Immunogenet, 1995. 12(2): p. 96-102.

123. H. Rasmussen, et al., Expression of endogenous retroviruses in blood mononuclear cells and brain tissue from multiple sclerosis patients. Mult Scler, 1995. 1(2): p. 82-87.

124. K. Badenhoop, et al., IDDM patients neither show humoral reactivities against endogenous retroviral envelope protein nor do they differ in retroviral mRNA expression from healthy relatives or normal individuals. Diabetes, 1999.48(1): p. 215218.

125. A. Muir, et al., The IDDMK(1,2)22 retrovirus is not detectable in either mRNA or genomic DNA from patients with type 1 diabetes. Diabetes, 1999.48(1): p. 219-222.

126. M. Pani, et al., Preliminary evidence that an endogenous retroviral long-terminal repeat (LTR13) at the HLA-DQB1 gene locus confers susceptibility to Addison's disease. Clin Endocrinol (Oxf), 2002. 56(6): p. 773-7.

127. R. Landry, P.Medstrand, D.Mager, The opitz syndrome gene midl is transcribed from a human endogenous retroviral promoter. Mol Biol Evol., 2003. Nov;19(l 1): p. 193442.132,133.134,135,136,137,138139,140141,142143,144145146147,

128. A. Schulte and A. Wellstein, Structure and phylogenetic analysis of an endogenous retrovirus inserted into the human growth factor gene pleiotrophin. J Virol, 1998. 72(7): p. 6065-6072.

129. F. Baribaud, et al., Identification of key amino acids of the mouse mammary tumor virus superantigen involved in the specific interaction with T-cell receptor V(beta) domains. J Virol, 2001. 75(16): p. 7453-61.

130. A. Barnett, et al., Expression of mouse mammary tumor virus superantigen mRNA in the thymus correlates with kinetics of self-reactive T-cell loss. J Virol, 1999. 73(8): p. 6634-45.

131. B. Morse, et al., Insertional mutagenesis of the myc locus by a LINE-1 sequence in a human breast carcinoma. Nature, 1988. 333(6168): p. 87-90.

132. E. Amariglio, et al., Identity of rearranged LINE/c-MYC junction sequences specific for the canine transmissible venereal tumor. Proc Natl Acad Sci USA, 1991. 88(18): p. 8136-9.

133. D. Givol, Activation of oncogenes by transposable elements. Biochem Soc Symp, 1986. 51: p. 183-96.

134. H. Kazazian, et al., Haemophilia A resulting from de novo insertion of LI sequences represents a novel mechanism for mutation in man. Nature, 1988. 332(6160): p. 164166.

135. B. Moon and J. Friedman, The molecular basis of the obese mutation in ob2J mice. Genomics, 1997.42(1): p. 152-6.

136. A. Schulte, et al., Human trophoblast and choriocarcinoma expression of the growth factor pleiotrophin attributable to germ-line insertion of an endogenous retrovirus. Proc Natl Acad Sci USA, 1996. 93(25): p. 14759-14764.

137. H. Roelofs, et al., Detection of human endogenous retrovirus type K-specific transcripts in testicular parenchyma and testicular germ cell tumors of adolescents and adults: clinical and biological implications. Am J Pathol, 1998. 153(4): p. 1277-1282.

138. Y. Lebedev, et al., Differences in HERV-K LTR insertions in orthologous loci of human and great apes. Gene, 2000. 247(1-2): p. 265-277.

139. A. Femino, et al., Visualization of single RNA transcripts in situ. Science, 1998. 280(5363): p. 585-90.

140. P. Nelson, et al., Negative selection: a method for obtaining low-abundance cDNAs using high-density cDNA clone arrays. Genet Anal, 1999. 15(6): p. 209-215.

141. A. Casau, et al., Germ cell expression of an isolated human endogenous retroviral long terminal repeat of the HERV-K/HTDV family in transgenic mice. J Virol, 1999. 73(12): p. 9976-9983.

142. C. Baust, et al., HERV-K-T47D-Related long terminal repeats mediate polyadenylation of cellular transcripts. Genomics, 2000. 66(1): p. 98-103.

143. D. Mager, et al., Endogenous retroviruses provide the primary polyadenylation signal for two new human genes. Genomics, 1999. 59(3): p. 255-263.

144. A. Feuchter and D. Mager, Functional heterogeneity of a large family of human LTR-like promoters and enhancers. Nucleic Acids Res, 1990. 18(5): p. 1261-1270.

145. H. Ashe, et al., Intergenic transcription and transinduction of the human beta-globin locus. Genes Dev, 1997. 11(19): p. 2494-2509.

146. J. Gribnau, et al., Intergenic transcription and developmental remodeling of chromatin subdomains in the human beta-globin locus. Mol Cell, 2000. 5(2): p. 377-386.

147. J. Pardinas, et al., Differential subtraction display: a unified approach for isolation of cDNAs from differentially expressed genes. Anal Biochem, 1998. 257(2): p. 161-8.

148. N. Ivanova and A. Belyavsky, Identification of differentially expressed genes by restriction endonuclease-based gene expression fingerprinting. Nucleic Acids Res, 1995. 23(15): p. 2954-8.

149. Y. Prashar and S. Weissman, Analysis of differential gene expression by display of 3' end restriction fragments of cDNAs. Proc Natl Acad Sci USA, 1996. 93(2): p. 65963.

150. M. Matz, et al., Ordered differential display: a simple method for systematic comparison of gene expression profiles. Nucleic Acids Res, 1997. 25(12): p. 2541-2.

151. D. Rebrikov, et al., Complete genome sequence of a novel extrachromosomal viruslike element identified in planarian Girardia tigrina. BMC Genomics, 2002. 3(1): p. 15.

152. H. Herbst, et al., Human endogenous retrovirus (HERV)-K transcripts in germ cell and trophoblastic tumours. Apmis, 1998. 106(1): p. 216-20.

153. Grigor, A new classification of germ cell tumours of the testis. Eur Urol., 1993. 23(1): p. 93-100.

154. McGlynn, Trends in the incidence of testicular germ cell tumors in the United States. Cancer, 2003. Jan 1;97(1). p. 63-70.

155. J. Wan, et al., Cloning differentially expressed mRNAs. Nat Biotechnol, 1996. 14(13): p. 1685-91.

156. M. Schummer, et al., Comparative hybridization of an array of 21,500 ovarian cDNAs for the discovery of genes overexpressed in ovarian carcinomas. Gene, 1999. 238(2): p. 375-85.

157. K. Eisfeld, et al., Binding of NF1 to the MMTV promoter in nucleosomes: influence of rotational phasing, translational positioning and histone HI. Nucleic Acids Res, 1997. 25(18): p. 3733-37342.

158. U. Scherf, et al., A gene expression database for the molecular pharmacology of cancer. Nat Genet, 2000. 24(3): p. 236-244.

159. P. Medstrand and D. Mager, Human-specific integrations of the HERV-K endogenous retrovirus family. J Virol, 1998. 72(12): p. 9782-9787.

160. R. Tonjes, F. Czauderna, and R. Kurth, Genome-wide screening, cloning, chromosomal assignment, and expression of full-length human endogenous retrovirus type K. J Virol, 1999. 73(11): p. 9187-95.

161. G. Diculescu, The sources of variation in the human genome and genome instability in human cancers. Rom J Physiol, 1997. 34(1-4): p. 3-17.

162. R. Slebos, M. Resnick, and J. Taylor, Inactivation of the p53 tumor suppressor gene via a novel Alu rearrangement. Cancer Res, 1998. 58(23): p. 5333-5336.

163. K. Becker, et al., Binding of the ubiquitous nuclear transcription factor YY1 to a cis regulatory sequence in the human LINE-1 transposable element. Hum Mol Genet, 1993. 2(10): p. 1697-702.

164. K. Huebner, et al., The role of deletions at the FRA3B/FHIT locus in carcinogenesis. Recent Results Cancer Res, 1998. 154: p. 200-15.

165. K. Kuo, et al., Expression of transposon LINE-1 is relatively human-specific and function of the transcripts may be proliferation-essential. Biochem Biophys Res Commun, 1998. 253(3): p. 566-70.

166. H. Pomykala, et al., Breakpoint junctions of chromosome 9p deletions in two human glioma cell lines. Mol Cell Biol, 1994. 14(11): p. 7604-10.

167. G. Swergold, Identification, characterization, and cell specificity of a human LINE-1 promoter. Mol Cell Biol, 1990. 10(12): p. 6718-29.

168. Leuer, Somatic mosaicism in hemophilia A: a fairly common event. Am J Hum Genet, 2001. Jul;69(l): p. 75-87.

169. Moyhuddin, Somatic mosaicism in neurofibromatosis 2: prevalence and risk of disease transmission to offspring. J Med Genet., 2003. Jun;40(6): p. 459-63.

170. Sippel, Frequency of somatic and germ-line mosaicism in retinoblastoma: implications for genetic counseling. Am J Hum Genet, 1998. Mar;62(3): p. 610-9.

171. S. Boissinot, P. Chevret, and A. Furano, LI (LINE-1) retrotransposon evolution and amplification in recent human history. Mol Biol Evol, 2000. 17(6): p. 915-28.

172. E. Ostertag, et al., A mouse model of human LI retrotransposition. Nat Genet, 2002. 32(4): p. 655-60.

173. M. Matz, et al., Amplification of cDNA ends based on template-switching effect and step- out PCR. Nucleic Acids Res, 1999. 27(6): p. 1558-1560.

174. Автор выражает глубокую признательность и благодарность за создание творческой атмосферы, за помощь, поддержку и доброжелательное отношение всем сотрудникам и аспирантам Лаборатории Структуры и Функций Генов Человека ИБХ РАН.

175. Автор благодарен В. К. Потапову и Н. В. Скапцовой за сотрудничество и синтез олигонуклеотидных праймеров, без которых данная работа была бы невозможна.

176. Автор благодарен Сенюте Наталье Борисовне и Клейман Анне за сотрудничество и предоставленные для работы материалы.

Информация о работе

Леппик, Людмила Паульевна
кандидата биологических наук
Москва, 2004
ВАК 03.00.03

Диссертация

Сравнительный анализ активности ретроэлементов в нормальных и опухолевых тканях человека - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы