Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Свойства и вероятные функции обратной транскриптазы эндогенных ретровирусов в дифференцированных клетках млекопитающих

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Свойства и вероятные функции обратной транскриптазы эндогенных ретровирусов в дифференцированных клетках млекопитающих"

/9 У/

ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ДРУЖБЫ НАРОДОВ АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНСКОЙ ССР ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ имени А. В. ПАЛЛАДИНА

На правах рукописи Том со не Вера Петровна

УДК 577.215

СВОЙСТВА И ВЕРОЯТНЫЕ ФУНКЦИИ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПТАЗЫ ЭНДОГЕННЫХ РЕТРОВИРУСОВ В ДИФФЕРЕНЦИРОВАННЫХ КЛЕТКАХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ

03.00.04 — Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук;

КИЕВ — 1988

Работа выполнена п Институте цитологии и генетики Сибирского отделения Академии наук СССР.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор КИСЕЛЕВ Л. Л.;

член-корреспондент АН СССР, академик АН ЛатвССР, доктор химических наук, профессор ГРЕН Э. Я.;

член-корреспондент АН УССР,' доктор биологических наук, профессор ЕЛЬСКАЯ А. В.

Ведущая организация — Институт молекулярной генетики АН СССР

Защита состоится «............».................................... 1988 года в ............ час

на заседании специализированного совета Д 016.07.01 при Институте био химии им. А. В. Палладина АН УССР по адресу: 252030, Киев-30, ул. Ле оитовича, 9.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан «............» ...................................................... 1988 год;

Ученый секретарь специализированного совета

ОН'ДАЯ ХАРАЮТЕРИСТИКА РАБОТУ

Актуальность проблемы. Одной из. важнейших задач современной биологии является изучение механизмов функционирования генетического аппарата клетки. Вплоть до 70-го года существовало представ лепие о том, что генетическая информация передается только в направлении ДНК—«-РНК—-белок. Открытие в 1970 г. обратной транс-криптазы нарушило эту догму ( Tenin, Mizutani, ig70;' Baltimore, 1970). Было показано, что обратная транскриптазй представляет собой ДНК-полимеразу, которая искоггьзует в качестве матрицы не тол» ко ДНК, но и РНК и обеспечивает таким образом перенос информации о РНК на ДНК. Обратная тракскриптаза была открыта в составе онкс-генных РНК-содержащих ротровирусов. Ввиду уникальной способности этих ретроЕЯрусов репродуцироваться через стадию ДНК-прокируса, они привлекли внимание спецгелистов разных разделов биологической науки. Особое место среди ретровирусов занимает непатсгашые эндогенные ретровирусы, геном которых также содержит ген pol , ко-днрркций обратную транскриптазу, и спнтезпруемэя при участии этого фермента кДНК эндогенного ретровируса встраивается в клвточчн« геном, образуя проретровирусные ДНК, которые обчарутрны у змх изучении: в этом отношении эукарпот.

Экспрессию отделкшх генов проретрсвирусов, такта крк е»? * env, в неопухолевых клетках удается реяютргр&тат* »язчптельно чаде, чем появление цель" вирусов (Стт,у.:, 1982). Зоцо&ях тенкьт практически яег в отяоггэяии продукта гена pol . .ÏÏPiume я:»че.та л середины 70-х годов о нешгш обратяоЛ транприптас*» з nojr'xn по? клетке -уже к ктгду 70-х голов яэ рааргагртаумо*. как уезлвт&п-як? Дело в том, что до 1970 г. о сущестзсваняп и эу&ариотачвокгх клсг яах нескольких ДНК-завгопыых ДШ-патш.;орг.з я« o'hjiv .-¡з-чвотпо, кпп. естественно, и о свойствах ятих ферментов» »5исгио критеррл вчял-лети активности обратной транс«р»птаэа в зуяардояпесквх влетпя? с позшкй приобретаемых зншгай бшга уязиташ. Тажм образом, в т* чекле десятилетия, последовавшего за оггрнтяем обратной троне-криптазн, падежных фактов, подтверждающих участие ртого фермента п процессах, происходящих в нормальной чтстке i п» от>я?®тшх п решткацией рстровирусов, получено не Сяло,

Значительным ербктием явилось открытие в начале 00-х годов в геноме эукартют структур, чрэзвгггаЛно подобиях грорпг^ор^русч" и пряня цпетащч.т иобвлодм дас^'-р^рот»*'^^'*« veim« " лр

tüöl; Ильин, 1982). В этст se период времени при исследовании структуры некоторых типов повторяющихся последоъательно стеi! генома эукариот било обнаружено, что ояп возникли скорее всего в результате обратной транскрипции пояя(А)+мРНК и последующей интеграции копий ДНК в геном ( Hogers, 1985 )•

Следовательно, поток информации от ДНК к РНК и обратно в ЦНК, обнаруженный в случае ретровирусов, по-видимому, обеспечивает также амадификацию и невируснах последовательностей. Представлялось вероятным, что наличие обратной транскриптазы в нормальных клетках взрослых животных могло бы обеспечивать ее физиологические функции, так как синтезированные с ее помощью с транскриптов индуцированных генов кДНК могли бы, с одной стороны, за счет амплификации такого гена или его регуляторных последовательностей увеличить экспрессии данного гена (ТэшХп, 1971), с другой стороны, сами эти кДНК или кодируемые ими РНК могли бы выступать в роли антисмысловых молекул, ингиоируя трансляцию индуцировшшых РНК (HaCarray, Riggs, 1986).

Цель и задачи работы. Цель настоящей работы состояла в том, -иобы выяснить, происходит ли экспрессия гела pol в нормальных клетках взрослых животных, регистрируется ли в таких клетках обратная транскрипция. Если атот процесс имеет место, то каковы свойства и источник обратной транскриптазы, а также можно ли получить какие-либо данные, указывающие на роль обратно? транскриптазы в физиологических функциях клеток.

Для того, чтобы ответить на эти вопросы представлялось необходимым поэтапно решить следующие задачи :

1. Выяснить наличие РНК-зависимой ДНК-полимеразной активности в нормальных клетках и тканях животных.

2. Из дифференцированных клеток животных выделить фермент, обладающий РНК-зависимой ДНК-полимеразной активностью, охарактеризовать его свойства и установить, ооотвотствует ли он критериям, применяемым дчя идентификации обратных транскриптаэ.

3. Выявить 'источник РНК-зависимой ДНК-полимеразной активности б нормальных дифференцированных клетках. Если это эндогенный ретровирус, то охарактеризовать его.

4. Исследовать, присутствуют ли проретровирусные гены в геноме аивотного и зкспрессируется ли ген pol в нормальных клетках взрослого живо'сногоi

5. Иоппрдойпть наличие корреляции меду FHK-эавиоимой ДНК--

полимеразной активностью и такими физиологическими процессами, как индукция экспрессии генов в клетках животного под действие«.-гормонов, субстратов, в ходе иных физиологических процессов, а также в процессе онтогенеза.

6, Оценить возможные пути регуляции РНК-зависимой ДНК-полг-меразной активности в ходе физиологических процессов.

Научная новизна работы. Перечисленные ниже результаты отнс • оятоя к числу наиболее ванных :

1. В нормальных клетках печени, мозга и других тканей взрос ■ дых крыс регистрируется РНК-завпсимая ДШ-полимгразная активности Впервые из дифференцированной ткани взрослого интактного животного (печень крыс) выделена РНК-зависимая ЗШ-полшераза, способна^ копировать гетерополимеряую РНК. Исследованы ой свойства.

2. В печени крыс РНК-завасямая ¿Ж-полимэразная активность обнаружена в цатозоле и в составе частиц фракции макросом.

3. Во фракции микросом печени крыс выявлена ретрозирусопо-добные частицы, которые по морфологические признакам сходны о ретровирусоподобными частицами А-тяпа. С помощью дот-гибрядигацп?' установлено, что они представляют собой интрзцлстерпальнне А-чзс-тицы (МЧ), относящиеся к группе эндогенных, ретровкруссъ та на К. Таким образом, впервые показано чалцчие частиц эндогенных ретр>-вирусов в нормальных тканях взрослых крнс.

4. Из фракции микросом печени крнс, обогащенной ИДЯ, гг-уч? ка РНК-зависимая ДНК-полимераза, подобная РКК-завискмой д'1К-!:опп-наразв из гомогената печени крыс, которая по основным чсслвдсза« ■ ннм свойствам ш способности копировать ггтерсиоликернуп "НК, оптимуму рН, отношению к и Йе .^Чувствительности к к-зтитг малеимиду, оедпментационной характеристике- л сродству г-' кеннпкам, аналогична обратишь транскраптазям ретровирутв. Ср*яч продуктов синтеза обнаружены гибридные РНГС-ДНК-колекулн.

5. Показано, что такие ирорзтроваруснне гены, кат: рид я рг1, содержатся в составе геномной ДНК ряда исследованных тканей щ;'"4

6. Впервые установлено, что в норма пышх тканях взрослых крыо происходит экспрессия ро1-гена 1!АЧ на уровне траискригния « трансляций. Сумма полученных данных позволяет зчклсчитт-, что о" ним из основных источников обратной трапскриптпзм ч трмлч'«'^ печени взросл!« крнп являются НАЧ.

7. Исследовано наличии корреляции чр*яу пичуга?!* пгопсггпп интенсивна экспрессии генов и |1»«пич»и«<?» ГНК- глиг.

|,;ыеразной ьктшшости. Показано, что ьовишояие РНК-зависимой ДНК-«алимеразной активности в регенерирующей печени крцо совпадает по примени с усилением ДКК-дависиюго синтеза РНК, но не о периодом интенсивной репликации ДНК. Усиление РНК-зависимой ДНК-полимераз-аой активности сопровождает экспрессию генов, кодирующих адаптив-иио ферменты, индуцированные введением животным индукторов . граискрипции ' Возрастание ДНК-зависимого синтеза РНК в гип-иокампе крио в перисг консолидации памяти при обучении совпадает с усилением РНК-зависимой ДНК-полимеразной активности. Полученные дашые указывали на наличие взаимосвязи между интенсивностью обратной транскрипции и экспрессией генов в дифференцированных клыках взрослых животных, хотя и не позволяют пока говорить о конкретной роли ее в этом процессе.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Определенный уровень экспрессии эндогенных ретровирусов характерен не только для эмбриональных и дифференцирующихся кле-гок, но и для дифференцированных клеток взрослого животного.

2. В печени взрослых интактншс крыс присутствует обратная гранскриптаза, источником которой являются эндогенные ретровируоы.

3. Существует корреляция между индукцией экспрессии генов и РНК-зависимой ДНК-полимеразной активностью.

Практическая значимость работы. Выполненная работа носит теоретический характер. Полученные данные углубляют и расширяет знания ос) эндогенных ретровирусах а их белках, функциях, которые они могут выполнять в нормальной клетке. Результаты могут быть использованы в работах ряда институтов, занимающихся вопросами регуляции экспрессии генов, ролью обратной транскриптазы в жизнедеятельности нормальной клетки (Институт цитологии и генетики, Инс1итут молекулярной биологии, Институт общей физиологии, Институт молекулярной генетики ц др.). Результаты работы используются при чтении курса лекций по молекулярной биологии в Новосибирском юсу царственном университете.

Апробация работы. Представленные в диссертации результаты пололени на 4- м и 5- м Всесоюзных биохимических съездах (Ленинград, 1979; Киев, 1986), на 16-ом съезде Европейских биохимичео-ких зОщесгв (Москва, 1964), на 4-'м и 5-,м съездах ВОГиС им. Н.И. Вавилова (Кишенев, 1982; Москва, 1987), на Международном симпозиуме "Оршнизацил и экспрессия тканеспецифичеоких генов" (Новосибирск, 198;}), на Всесоюзных симпозиумах "Макромолекулы клетки :

структура, функции, взаимодействие" (Москва, 1879; IS84), па Вое союзном симпозиуме "Виротерашш и искусственная гстерсгенизация опухолей" (Рига, 1977), на 9-м Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (Черноголовка, 1987), на 5- м и 6- м Всесоюзных симпозиумах "Молекулярные механизмы генетических процессов (Москва, 1983; 1987), на Международных рабочих совещаниях "Ревертаза-онкоген" (Юрмала, 1982; Любицы, ЧССР, 1984;-Варна, Болгария, 1985).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 8 глав, выводов и списка цитируемой литературы (554 источника). Главы I и 2 представляют обзор литературных данных, главы с 3- й по 7— то - описание и обсуждение собственных результатов, глава 8 - общее обсуждение основных результатов исследования. Работа изло жена на 2SI странице и включает 15 таблиц и 49 рисунков.

Работа выполнена в Институте цитологии и генетики СО АН СССР, в лаборатории молекулярной генетики, возглавляемой чл.-кррр. АН СССР Р.И. Салгаником, которому глубоко признательна за постоянный интерес, вникание и састематическуп помощь. Настоящая работа является обобщением результатов экспериментов, проведенных мною ляч но и совместно с коллегами, возглавляемой .мною группы: ВсревклиоР К.Н., Пыринсвой Г.Б., Короховым Н.П., Куприяновой O.A., а такяо совместно с коллегами нашей лаборатории.Древ::ч П.Ф., Кнорре В.Л. и Соловьевой H.A., с коллегами других .лабораторий Института: Иль-ницкой С.И., Киселевой ЕеВ., Матиенко II.Д., Ншсолвяым В.П., Рома-щенко А.Г., Христолюбовой Н.Б., Шуйской К.А., с коллегами Новосибирского института биоорганической химии СО АН СССР: Вя®нявзгит>: С.Н, и Мертвецовым Н.П., котором трест) пстоянст щшнатальяост'--и благодарность.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава I. СОВРЕМЕННОЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЕ ОБ ЭДЮГШШ

- ВЕРОЯТНОМ ИСТОЧНИКЕ ОБРАТНОЙ.ТРАНСКРИПТАЗЫ В НОРМАЛЬНЫХ

КЛЕТКАХ.

В этой главе дана классификация ретровярусов, строение их ге нома. Рассмотрены возможности активации репродукции эндогенных ретровирусов, клеточный контроль такой экспрессии, а также экспрессия отдельных генов проретровпрусов в нормальных метках. Приведены факты, позволяющие отнести ■»нлогешше регропяруон ч подвиж-

ишл генетическим элементам, иноерционнкм мутагенам, потенциальным трансформирующим агентам. Приведены данные, демонстрирующие возможность эндогенных ретровирусов играть определенную роль при дифференцировке тканей и в процессе эволюции.

Глава 2. ОБРАТНАЯ ТРАНСКРИИГАЗА И ЕЕ ВЕРОЯТНЫЕ ФУНКЦИИ В НОРМАЛЬНЫХ КЛЕТКАХ.

В этой главе рассмотрена представленность в геномной ДНК jyicapHOT гена pol , кодирующего один из основных белков ретровирусов - обратную транскриптазу. Приведены основные свойства обратных транскриптаз и участие этого фермента в синтезе провирусной ДНК, встраиванию такой кДНК в геном клетки. Рассмотрены пути естественного ограничения контакта клеточной РНК с обратной транс-кригггазой, эволюционно выработанные клеткой для контроля за РНК-зависимой ДНК-полимаразной активностью. В связи с этим обсуждается возможность обратной транскрипции в нормальных клетках позвоночных в ьюлекулярао-гецетические доказательства обратной транскрипции в нормальных клетках животных. Приведены примеры использования механизма обратной транскрипции другими вирусами, в частности, вирусом гепатита типа В и вирусом мозаики цветной капусты.

Глава 3. РНК-ЗАВИСИМАЯ ДНК-ЛСШИМЕРАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ В НОРМАЛЬНЫХ КЛЕТКАХ ВРРОСЛЫХ ЖИВОТНЫХ.

В начале 70-х годов, когда наши знания о наличии и свойствах клеточных ДНК-полимераз были ограниченными, включение SH-TM£ в кислотонерастворимый продукт при использовании поли(А)-олиго(дТ) в качестве матрицы-затравки рассматривалось как доказательство наличия в данных клетках обратной транскриптазы. В этот период поли(А)-олмго(дТ)-зависимая ДНК-полимеразная активность была зарегистрирована нами в цитозоле и в ядрах клеток асцитной карциномы Эрлиха, в различных субклеточных фракциях клеток аденокарцино-мы молочной железа мышей линии СЗН/tie - носителей MMTV . К середине 70-х годов стало очевидно, что поли(А)-олиго(дТ) может служить матрицей-затравкой и для некоторых ДНК-зависимых ДНК-полимераз, поэтому был использован дополнительный тест: наряду с определением поли(А)-олиго(дТ)-зависимой ДНК-полимеразноЙ активности исследовали количество MMTV- антигенов на поверхности опухолевых клеток, применив для этого трансплантационный индекс торможения

(Грунтенко, 1977). Была отмечена высокая положительная корреляции регистрируемой активности с трансплантационным индексом торможения = 0,95). Однако этот метод все же мог служить надежным доказательством наличия активности обратной транскриптазы в тканях, инфицированных ретровирусаия, но не в нормальных клетках.

О РНК-зависимой ДШ-полимеразной активности в нормальных клетках ряда органов крыс (печень, мозг, селезенка, семенники, тп муо, почки) мы судили по включению меченых предшественников в полимерный продукт в присутствии 4-х дезоксирябонуклеозидтрифосфато* Высокая доза актпномишгаа Д (80 мкг/мл) и избранная ионная сила (0,1 М KCI) резко угнетали активность одной из основных ДНК-зави-симнх ДНК-полимераз, ДНК-полимеразу ( Sarngadharim et al. ,I97P\, Удаление в ряде опытов ядер и митохондрий - главных источников ДНК-полимераз и ДНК, являющейся матрицей для ДНК-полимераз, но присутствие эндогенной или экзогенной поли(А)+мРНК создавало оптимальные (или близкие к ним) условия для определения РНК-завися-моЗ, но не ДНК-зависимой ДНК-полимеразной активности. Как видно и* рис. I, увеличение включения предшественника во вновь синтезируемый ДНК-проэдкт ферментом пссткиг.росогальпсй фракция печени п гяп покямпа крыс наблюдается при добавлении в реакционную снесь поли (A )+mFHK печени крыс.

Если в нормальных дифферспцировапчат метках присутствует

фермент, оЯладатагё ШК-завпспоЗ ДНК-tjo-ликеразноЭ акпг-.7ость»-, го не j'c^tr ли у веля пение спнт?з-п> РНК з

МСТКе ПОЛ ЗПИЯЯЯСМ индукторов т^.нскряп-цпл аригод/.гь к обрат ноЗ трчнсппппции этих РНК. Вклад ДЧК-зазкгп

Рис. I. Влияние по-ЛЖАГмРНК на РНК-эр-впсимув ДНК-поли^е-разную активность в печени [I1 и в гиппо• камне (Е) kp'ío (I -

2000

I

хэ

о о

Ю00

1

й

rf

ь

4000

я i

о о

S

2000

rf

А

Т

а

кил ДИК-шшшераз в регистрируемую ДНК-полимеразную активность, мы полагали, можно оценить, если РНК-зависимую ДНК-полимеразную активность определять в период синтеза ДНК и полного отсутствия такового. В качестве модели избрали регенерирующую печень крыс. Через 22 час после операции частичной гепатзктомаи в момент усиления синтеза ДНК ДНК-зависимая ДНК-полимеразная активность была значительно выше у подопытных животных по сравнению о контролем (рис. 2). В этот период в условиях, оптимальных для проявления

Рис. 2. Изменение РНК-зависимой (РДПА) и ДНК-зависимой (ДДПА) ДНК-полимеразноЙ активности в процессе регенерации печени через 5 и 22 час после частичной гепатектоаии. I - интактная печень, 2 - регенерирующая печень j к - различия достоверны.

РНК-вавиоимой ДНК-полимеразноЙ активности различий между контрольными и подопытными животными не выявлено.

Иная закономерность прослеживается через 5 час после операции, в момент индукции транскрипции. В данном случае достоверные различия регистрируются только в условиях определения РНК-зависимой ïHK-полимеразной активности (рио. 2). Анализ таких продуктов реакции подтвердил присутствие в их составе гибридных РНК-ДНК-молекул, занимающих при ультрацентрифугировании в градиенте плотности Csoi облаоть о плотностью 1,76-1,77 г/см®, характерной для полных гибридов РНК-ДЛК (Остерман, 1981 Нрио. 3). Обработка про- 8 -

дуктов реакции нуплеа зой В1 или РНКазой А е декатурирувдих условия» подтвердила наличие среди продуктов реакции гибридных РНК-ДНК-моле кул.

Полученные данные позволили заключить,чт" РНК-зависимый синтез ДНК происходит не только в опухолевых клетках содержащих ретровирусы", но и в клетках нормаль ней дифференцировании тканей взрослых иитакт кых животных. Проведенные опыты впервые продемонстрировала функаи■ ональную разобщенность РНК-заглсистго п ДНК-зависимого синтеза ДНК г; клзткаг пгчекя »фко р г; о ззолпля :.р едпол с-глт ь наличие функционально активной обратной тран-еяря.цази лзргсисып*

Рис. 3. Изменения в" саопрздотопип июодуктсв ГНК-зятомгисЗ ]®К-ко-ламеразяой реакции ъ ггадиантз шютноотз 0з01 год деЯстгаем г;у:с~ леазн 81 и РНКазн А (а - ксягроль: б - лозле обссготки нуклездой 81 ? в - после обработка РИСазой А; 5 чао аоапв оперэпяв частичной гевятэктомип).

тканях взрослых животных. В связи о пояучешшмл данными возникла задача выделения фермента, обладвпчего РНК-зависимой ЯЯК-полимр-разной активностью.

Ггтрп 4. ВНДВШШЯ ОБРАТНОЙ ТГАТСКРШГГА^Ы КЗ ПВШШ КРЫС, ИОСЛГЛОВАНЙЕ СВОЙСТВ И ИЩТГОИКАЦИЯ ИСТОЧНИКА.

П.чгт рнл«ир1ия РЖ-•чариспчпй ЛНЯ-поядавт»» РЗ ярчви» крно

- 9 -

иш[ использован метод Льюиса и др. ( Lewie et al. , 1974), так как он позволяет разделять все основные типы ДНК-завасикых ДНК-нолимераз {ci, [i , <Г) в обратнузз транскриптазу ретроьирусов, если она присутствует в клетках животных. Вначале с помощью хроматографии на ДЭАЗ-целлвлозе ДЕ-23 белки гомогената печени освобозда-ли от нуклеиновых кислот. На 8 том етапе препарат ДНК-шлимераэ проявлял активность только при добавлении вкэогеиной матрицы. Затем в два этапа отделяли обратную транскриптаву от других ДНК-по-лимераз клетки : путем хроматографии на ДЭАЭ-целлшозе ДЕ-52 и на фосфоцеллюлозе P-II. Удалось ввделигь фермент, очищенный примерно в 400 раз, который елюируется с ДЗАЭ-целлюлозы ДЕ-52 0,08 М KCl, с фосфоцеллюдозы P-II - 0,1-0,16 М KCl и способен использовать в качестве матрицы-затравки поли(А)+мРНК-олиго(дТ). Такой фермент катализировал в присутствии полн(А)+мРНК синтез продукта, имеющего плавучую плотность в градиенте плотности csoi 1,77 и 1,69 г/ сы^, что характерно для РИК-ДНК-гибрздов и двунитевой ДНК. соответственно (Остерман, 1981). Некоторые свойотва фермента представлены в табл. I.

Таблица I

Свойотва РНК-зависимых ДНК-полииераа из гомогената печени и ез вирусоподобных частиц 6-даевных и взрослых крыо.

Изучаемые свойства

Фермент аз t

гомогената печена

вирусоподобных. частиц

Хроыатографическое поведение! елюция с ДЭАЭ-целлалозы ДВ-62 с фосфоцеллюлоэы P-II

Оптимум pH

Константа седиментации

Способность использовать матрицы-затравки (в шемоль 3-Н-дНШ) : 2 поли(Ц)-олиго(дГ) + KgST + UnST

поли(А)-олиго(^Г) + Мз5Г + Мп

поли (А)+мРНК-олиго (дЛ1) 2+

0,08. U K0I 0jl-0,I5 М KCl

7.8

6,1 t 0,6 2,1 ± 0,2

Mg

г*

+

+ Ип-

активированная ДНК + Mg~ подо(дТ)-олига(А) + Hgt + олиго(дТи + мв2+ рРНК + KSc;+

2,7 18 3,2

О О

0,2

й £

0,§

0,08-0.1 И KCl

о|1-о,1б м ко!

7,8

4,6 t 0,4

12,0 + 0,8 8 2 { 0 7 4 0 + 0,6 4,7 t 0,4

4,5 + 0,3 3 6 + 0 2 2,9 + 0,2 0,3 " О

г

Следующие факты явились основанием считать, что в печени ин-тактных крыс Вистар присутствуют эндогенные ретровирусы, пред-ставлякщив собой ИЛ.Ч, которые являются вероятным источником обратной транскриптазы.

I. При фракционировании осадка микросом в линейном градиент" плотности сахарозы РНК-зависимая ДНК-полимеразная активность регистрируется в области о плотностью 1,16-1,18 г/см3, в-которой обычно локализуются ретровирусы {Быковский я др., 1983; Уамгаз, 1983) (рио. 4).___________________________________

2. РНК-зависимая ДНК-полдмераза и служащая для нее матрицей РНК обнаружены в соста ве одетых мембраной частиц. Это следует из того, что при добавлении в инкубационную среду Тратона Х-ЮО РШС-зависикая ДНК-поли-.меразная активность

значительно возрастает и резко падает после последувцеа обработка таких частил РНКаэоЯ Л (ряо. 4), •

3. С ПОМГ!ЦЬО электронной микроскопии

2 •

I

с?5 а 1

fp

10

15 с.э

Номер фраиетя

Рис. 4, РНК-зависимая ДНК-полпмеразнэя аптлвлооть в осадке микро-сом после фракционирования его з градиенте шютисоги 20-50 % сахарозы в течение 17 час при 165 ООО 5 (—5— - полная реакционная смесь, —-о—— полная реакционная смесь без Тритона Х-ЮО, _ — полная реакционная смесь + РНКаза А).

фракций осадка микросом, подвергнутого равновесному ультрацентрифугированию в градиенте плотности 20-50 % сахарозы, было показано, что только во фракциях, обладающих РНК-зависп"ой ДНК-полимрразной активностью, нмзптся частит, по горфологическим нрязпакям подобные ретровирусаи типа А, Эти частицы, сферической или округлой формы, диаметром 80-1.20 нм, имеют гладкую Рнеяяпи rrtnmivr и и,у« • леоил. в котором иногда разл1П(*,эт'"1 Зябртпта,

- Tt -

дн да I

4. В составе частиц, ь.среде с четырьмя дезоксврибовуклео-аидтрифосфаташ и ионами , в' присутствии актшюшщина Д, ка вндогешшх матрица происходит синтез гибридных РНК-ДНК-молекул. Эти молекулы в градиенте плотности Сой имеют характерную душ РНК-ДНК-гибридов плотность 1,76 г/см3, Материал с такой плотностью сохраняется посла гидролиза продуктов реакции нуклеазой 51 , которая, как известно, гидролиэует преимущественно одноците-вые молекулы (рис. 5).

5. Из частиц по методу Льюиса и др. ( 1еы18 6t в1., 1974) выделен фермент, который по . воем исследованным свойствам подобен обратной транскрип-тазе рзтровируоов. В табл. I представлены основные-свойства очищенного более, чем в 1500 раз фермента, а в табл. 2 - основные втапи его очистки. Как видно из табл. I, фермент каУализиру-

Рис. 5. Продукт эндогенного РНК-зависимого синтеза ДНК, катализируемого препаратом вирусоподобных частиц, в градиенте плотности 0е01 после обработки нуклеазой 81.

ет оинтез ДНК на поли(А)+мРНК-олиго(дТ), может использовать в качестве матрицы-затравка полн(Ц)-олиго(дГ), поли(А)-олиго(дТ), активированную да( но не поли(дТ)-алиго(А) или олиго(дТ). Фермент активируется Ме^+, преимущественно Ме2+ . Оптимум реакции определяется в области рН 7,8, в присутствии всех четырех деаокирябо-нуклеозидтрифосфатов, низкой ионной силы. Конотанта седиментации его составляет 4,6 8г0 . Фермент чувствителен к М- этилмалеимиду, блокирующему тиоловые группы. Среди продуктов синтеза обнаружены полинуклеотиды со свойствами гибридных РНК-ДНК-молеиул. Таким об- 12 -

Таблица 2

Очистка РНК-зависимой ЭДК-подикерази из вирусоподобных чаотпц никросокального осадка печени крас.

Стадия очистки

Гомогекат печени

Суперпатант после удаления ядер п митохондрий

Мвкросомалышй осадок

Частицы о (з = 1,16-1,18 г/с;«3

Материал пика, ялшруемого О ДЕг-52 ОД IS KCl

Материал пика, злвируемого о P-II 0,13 М KCl

Общий белок, иг Общая активность, ед.акт. Удельная актива., од.акт./ мг белка. Степень очистки

4000 T8-I04 , 45 I

2000 I8-I04 90 Z

хо 24'I03 73 1,6

КО I8-I03 IG 4 3,6

ОД 7,6-Ю3 7.S-I04 1690

я.о. '18*10® н.о. и.о.

Прямечанвв: и.о. - концентрацию бохка пэ определяли.

разом, выделенный фермент по всем азугешшм крилеграм подобен обратным транскрштазаа ряда ретрозируоов (Verma, -1977; ЯагпзнйКагвг об al., 197В).

6. FfflC из частгщ являстся по;в(.\)-солсржаиой с поястантой ое-дшасзтацЕЯ более 23 о , что харакнрпо для вгруо-оЛ гекогшой РНК, Такая РНК гомологична ДНК ЮТ яшй (pcrpcñ *nyeu тли. А) а изгомо-логична ÍHK Mo-KuLY мшей (ретрогзруо? тйед С)¡рис. G). 3 качестве годков нсдользокглп провирусну« ЛЯК ИАЧ :паей п прогаруслг» SIK Mo-fíuiiV*, Плаэкзда рвкзЯ'.: с витсгрпрсэадчнм ЯвгЛХ-EsoRl- фратмеатом Ш.Ч ддгмой 2,2 т.в.л. гасла ювя? внла получена от д. А. Кг.зизрсвл (КМБ АИ СССР, Зоо-ава). Так как ра?;х>вирусы ткга .3 од-^цогатоскд отяказтся от друг!« типов цотровярусез н ойяадагт тровпостьв к молоиго'а яодзза гадай (но не пр??о) в ее опухолям, а ретрсвлргеи тина Д характерна для пряяатов, то додается buso» о той, что одам из

Рйо. 6. Гибридизация ¡толи(Л)+И!К шфусоподобпнх частиц печени крио о ДНК ИЛЧ и ДНК fío-UubV . На нятроцеяявлозшзо фильтры нанесены :

Т. — rnП1Тí"Д1 рогтпг Г1*ич v mfr.'-fT . ... \ _ Суммарная

ридизовали С

чиновных источников обратной транскриптазы в нормальной печени взрослых крыс являются НАЧ.

Таким образом, в настоящем разделе работы приведены оригинальные данные о наличии в печени взрослых интактных крыс обратной транскриптазы. Фермент очищен более, чем в 1500 раз, изучен ряд его свойств. Впервые в нормальных дифференцированных клетках взрослых животных (печень крыс) обнаружены ендогенные ретровиру-сы А-типа - ИАЧ.

Глава 5. ПРОВИРУСНАЯ ФОРМА ИАЧ И ОБНАРУЖЕНИЕ РНК ИАЧ В СОСТАВЕ ПОЛИСОМНОЙ поли(А)+мРНК ПИШИ КРИС.

ИАЧ, вндогецные ретровирусы типа А, характеризующиеся отсутствием внеклеточной фазы и инфекционности, выявлены нами в составе геномной ДНК печени, гаппокампа и семенников,крыс, что согласуется с литературными данными о наличии последовательностей ИАЧ в геномной ДНК крыс ( шаЛага, Кигг , 1983). Различий в представленности ИАЧ в виде прозируса в ДНК указанных органов мы не обиа-г ружили.

Используемый в лаборатории метод бездетзргентного фзшхйьного фракционирования, предложенный Страяевокой к Стручковым (1971) в модифицированный Дашкевич н'Арииновой (1973), позволяет отделать транскрипдионно активную ДНК от транокрипционно неактивной а потенциально активной ДНК, Дог-габридяеация трэдгскрпвдионно активной ДНК печени крыс с 3 Р-ДНК ИАЧ .мышей.¡.показала, что последовательности ИАЧ. присутствуют "во .всех фракциях гепошой^ |ЙК:'Ерцо/.в том числе и в транскрадаионнй • активной ,1ЩК.. ,

Изучая экспрессию ИАЧ, мы обнаружили присутствие поли(А)+РНК ИАЧ в составе поли(А)+мРНК полисом печени крыо. При проведении ' дот-гибридизации.РНК из фракций градиента плотности 20-50 % сахарозы, после равновесного ультрацентрифутированвя осадка макросом, о ^Р-ДНК ИАЧ были получены данные, указывающие на присутствие последовательностей, гомологичных ИАЧ не только в области плотности 1,16-1,18 г/см®, где присутствуют ИАЧ, но и в донных фракциях градиента, где активность обратной транскриптазы не, регистрировалась. Электронная микроскопия позитивно контрастированного материала донной фракции сахарозного градиента не обнаружила в них ИАЧ, но выявила наличие полисом. Поли(А)+мР11К, выделенная ив полисом печени крыс, действительно, гибридизовалась с 32Р-Д1К ИАЧ мышей и практически не гибридизовалась о рРНК, взятой в качестве

контроля (ряс. 7). .

Полученные результат однозначно указыва ют на наличие РНК ИАЧ в полисомах печени крнс, что предполагает трансляцию этих частиц. Зонд, которым мы пользовались в гибридизационных экспериментах, включает в себя 3*-конец гена gag и 5*-участок гена pol , захватывающий значительную часть последовательностей, кодирующих протеазу и, очевидно, обратную трано-крпптазу. Выявляя с помощью данного зонда по-

Рис. 7. Дот-гибридизация полисомной полл(А)+(/РНК печени крыс с 32-Р-ДНК ИАЧ мыаей: I - полисов осаждали 0,1 М KgCi2 ; 2 - поли-сош осаждали центрифугированием материала в ступенчатом градиен те шготностя сахарозы (0,5 - 1,8 М)г 3 - рРНК печени крыс (контроль ).

ли(А)+РНК ИАЧ в полисомах печени крыс, кы фактически регистрируем наличие в составе полисомной воли(А)+ьРНК последовательностей, кодирующих продукты гена gas к pol , в тем числе, по-видимому, и обратную транскршггазу.

Таким образом, в настоящем раздело работы показано, что в геноме крыс Вистар в провнрусной форма содержатся последоватась-лооти, гомологичные ИАЧ иыаой. Различий, з содержании проварусся 1!АЧ в ДНК разных органов (печень, гаппокаот. секзннпкп) не выявлено. Впервые последовательности гскоз z^z и pol. обнаружены л составе траискрипцпопно активной ДНК, а гакго з соотйзз полисомной поли(А)+!'РНК печени взрослых г.рис, что свидетельствует сб их транскрипции я трансляции.

Глава 6. ВЕРОЯТНАЯ Рй1Ь ЭНДОГШШХ Р&РОВИРГСОБ D Ф0РККГ0;г\~ НШ АДАПТИВНЫХ РЕ\ИШЙ КЛЕТКИ.

Беля изменение экспрессии вндогеяанх регровпрусов подчиняется клеточным регуляторншл механизмам, то могло ожидать гзяенечял виспрессяа проретрозирусов и их генов в процессе онтогенеза, ч также прз определенных ситуациях и в ллффзреттрсванчнк клетках взрослого организма.

Сравнительный анализ РНК-зависимой ДНК-полнмеразноЙ активности в осадке макросом в постмикросомальяой фракции печени 18 дневных вибрионов, трех-, тести- и 14~диев1гах крнелт и язрослпх жявотячх в возрасте от Я, 5 до 5 nenn'^" ппкчзрлг, что * пепрм

удильная активность & шстадросошлыюй фракции более, чем в два раза вше у крысят в возраста от трех до седа дней по сравнению со взрослима крысами. Эта отличия относятся как к свободной форме фермента, так и к ферменту шкросоиального о садка, но в последнем случае разница выражена гораздо резче : активность фермента, ассоциированного о вирусоподобными частицами, падает в вооемь раз в течение второй недели со дня рождения (рис. 8).

Электронно-микроскопический анализ фракций с плотностью 1,17 т/сг? из печени 6-дневных крысят, соответствующих шку РНК-зависимой ДДК-псшшеразиой активности, показал, что в втих фракциях, как и у взрослых крыс, содержатся вирусоподобные частицы диаметром 80-1С0 ти. Эта частицы имеют внешнюю оболочку, электронно-плотный нук-леоид. Из осадка кппросом печени 6-даевннх крысят была выделена обратная транскрипт аза. Свойства втого фермента полноотьа совпали со свойствами обратной тракскраптазы, ваделея-

Рао. 8. РНК-зависимая ДНК-яолишразная активность поотшкроооааль-ного супернатаытф (А) и осадка микрооом (Б) печени крыо разного возраста.

ной из печени взрослых крыс, в объединены в табл. 1, Таким образом, полученные данные демонстрируют большую активнооть проретро-вируоных генов в ранний поотлаталышй период, что согласуется б литературными данными,

При изучение генетичеокой индукции адаптивных ферментов в пе-

Возраст хюотшгс

чени взрослых крыс нами было зарегистрировано одновременное увеличение РНК-зависимой ДНК-полимеразной активности. Так, увеличение РНК-зависимой ДНК-по лимеразной активности выявлялось при введения крысам смеси аминокислот, которые, как известно, активируют в печени гввотиых ферменты, метаболизирувдие аминокислоты. В частности, в десятки раз возрастала активность сериядегидратазы в 22 ООО g суперяатанте печени крыо после введения животным 33 %-го гидролизата казеина (3 раза в день в течение двух дней, в поолед-няй раз за 12 чао до забоя). В этот же период примерно в два раза увеличивалось включение предшественников в кислотонерастворимый продукт, образующийся в условиях РНК-зависимой ДНК-полимеразной реакции (рис. 9)..Как видно из того же риоунка, ДНК-зависимая ДНК-полимеразная активность достоверно не изменялась.

Введение крнсам кортизола (5 мг на 100 г веса тела) приводило к увеличению в 100 ООО в супернатанте печени таких животных включения предиественников в кислотонерастворимый продукт, фиксируемый на ватмане ЗММ, образующийся в условиях РНК-зависимой ДНК-полиме-

5»?* Влияние гидролизата казеина на активность сериндегидрата-

зн (А), РНК-зависимую ДНК-полимераэную активнооть (Б) и ДНК-г*рви-скмую ДНК-полимеразную активность (В). CZJ - контроль, Г/7771 - опыт.

разной реакции, уже через 3 чао пооле инъекции гормона, правда,' достоверными эти различия становились к 5 чао. Никаких изменений пи в ядрах, ни в цитоплазме не наблюдали, если условия проведения реакции были оптимальными для ДНК-зависимой. ДНК-шшшеразной реакции. Более того, из литературных данных известно, что кортизол угнетает синтез ДНК (Сергеев и др., 1971)..

Как уже было описано ранее (гл. 3), увеличение РНК-зависимого синте.за ДНК происходило и в регенерирующей печени крыс в период индукции синтеза РНК и белков (5 час после операции частичной гепатэктомии), но не синтеза ДНК (22 чао после операции). Обратная описанной закономерность прослеживается для ДНК-зависимого синтеза ДНК (рис. 2).

В результате постнатального введения крысятам линии и/взм галактозы о первого по 13-й день после рождения, в клетках печени регистрируется индукция синтеза РНК, активности глюкозо-6-фосфаг-дегидрогеназы (одного из ферментов, программируемых, очевидно, индуцированными галактозой РНК) и возрастание РНК-зависимой ДНК-по-лимеразной активности. Повышенный уровень РНК-зависимой ДНК-поли-меразной активности у таких животных сохраняется не менее, чем в течение пяти месяцев.

Известно, что процесс обучения сопровождается индукцией ДНК-зависимого синтеза РНК в ^летках мозга, в частности, в гиппокампе, в отделе мозга, ответственном за явление долговременной памяти ( ирЬоиэв et а1. , 1974; Шумская, Корочкин, 1975; СирвПо, Нуавп, 1976). Корреляция способности к запоминанию с уровнем РНК-зависимой ДНК-полимеразной активности в клетках мозга могла бы указы- . вать на роль этого процесса в явлениях памяти.

Были проведены опыты в двух группах ранее селекционированных крыс Вистар, у одной из которых наследственно закреплена способность С хтро обучаться, тогда как крысы второй группы обучаются медленно. Отбор крыс проводился по способности к обучению простому пищедобывателыгому условному рефлексу (Шумская и др., 1975). Оказалось, что в гиппокампе способных к обучению крыс РНК-зависимая ДНК-полимеразная активность была в два раза выше, чем у медленно обучащихоя животных. При значительных различиях в уровне РНК-зависимой ДНК-полимерааной активности в гиппокампе двух изучаемых групп крыс разница в уровне ДНК-зависимой ДНК-полимеразной активности отсутствовала. Опыты показала, что РНК-зависима* ДНК-полимеряэная активность возрастает в гиппокампе крыс после обучв-

I

0

1

о о

1

10000

еооо

6000

4000

2000

ния (рис. 10) в период консолидации памяти, которая наступает,как показано в наших опытах, через 40 мин. В то ле время достоверные изменения в'РНК-зависимой ДИК- толимеразной активности отсутствовали в передаем мозге и в мозжечке, хотя наблюдалась тенденция к повышению активности в клетках переднего мозга и к снижению ее в клетках мозжечка._________

В материале из мик-росом гиппокампа, занимающим при фракционировании в градиенте 20-50 % сахарозы область с шютностью 1,20-1,23 г/см3, обнару-Еены вирусоподобные частицы, имеющие, в основном, в диаметре 60 нм, по морфологии напоминающие минимальные формы ретрови-русов типа А, МаФ типа А (Быковский и др., 1583). В этой яе области градиен та,регистрируется РНК-зависимая ДНК-полимеразная активность.

Таким образом, представленные данные показывают, что генетические индукторы транокрипции ге■ пов (кортизол, смесь ами-

п 17

О 6

20

4

40 б

120 3

мин

Рис. 10. Изменение РНК-зависимой ДНК-яолимеразиой-активности посткаяросомальной фракции гиппокампа крио в процессе обучения (п-число опытов).

нокиолот, галактоза),, а также операция частичной гепатэктомии влияют, яе только-иг сгптез-соответствующих адаптивных ферментов, цо и гтовшают РНК-гавпсгг.'уэ ДНК-полнмеразиув активность в поот-микрооомальной фратагл пгченя крыс. Как следует кз опытов, в которых изучали изменение РНК-зависимой ДНК-полимераэной активности в процессе обучения крю, и здесь проолежииаетоя четкая корреляция ме*ду уровнем РНК-гавиоимоЙ ДНК-полимер*зной активности ,

способностью к обучении и консолидацией памяти. Кромо того, в ранний постнатальный период уровень РНК-зависимой ДНК-полимеразной активности значительно выше, чем у взрослых животных. Многократное введение в этот период генетического индуктора транскрипции, в частности галактозы, приводит к увеличении РНК-зависимой ДНК-полимеразной активности, сохранению повышенного уровня этой активности, по крайней мере в течение 5 месяцев. При однократном введения крысам гидрокортизона РНК-зависимая ДНК-полимеразная активность снижается до уровня контроля уже через 8 час.

Глава 7. ВОЗМОЖНЫЕ ПУТИ РЕГУЛЯЦИИ РНК-ЗАВИСИМОЙ ДНК-ПОЛИМЕРАЗНОЙ АКТИВНОСТИ В ХОДЕ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ.

Берт и др. ( Hurt et al., 1984 ) показали, что в MR MIA RH (ИАЧ), инсертированном в ген Ran-2 мышей линии dbá/2 , присутствует консенсус, узнаваемый глюкокортикоид-рэдоптортш комплексом, который находится в ltr рядом с энхансером, как в имет , как в промоторах иных генов, индуцируемых кортизолом. Авторы полагают, что такое сочетание ответственно за чувствительность генов к гормональному воздействию. Анализируя наличие указанных консенсусов в MR ИАЧ, последовательности которых опубликованы в литературе, ш выявили их присутствие практически во всех известных случаях.

Возникло предположение, что увеличение РНК-зависимой ДНК-полимеразной активности в 100 ООО g супернатанте печени крыс при введении животным смеси аминокислот, галактозы или в процессе регенерации этого органа могло бы быть результатом влияния эндогенного кортизола. Так, введение крысам гидролизата казеина индуцирует ■увеличение активности специфических ферментов, ыетаболизиру-ющах аминокислоты, увеличение включения дезоксирибонуклеозвдыопо-фосфатов в кислотонерастворимый продукт в присутствии актпноьгацп-на Д (80 мкг/ыл) и в отсутствие в инкубационной среде ДНК ( см. . гл. 6) й, как описано у Сергеева и др. (1971), увеличение активности, генов, регулируемых глюкокортикоидами, в частности гена TAT. Возможно, к повышению РНК-зависЬмой ДНК-псшшеразной активности в регенерирующей печени также приводил послеоперационный стресс. Как показано Мертвецовым и др. (IS66), индукция TAT в этот период значительна. Налги опыты с введением крысам гидрокортизона, казалось, подтверждали такую возможность. Однако разовое введение животным гормона не привело через 4,5 час к увеличению удельного количества РНК ИАЧ в суммарно^ поли(А)+РНК клеток печени.

Что в то? Ошибочная трактовка полученных наш данных или результат использования клеткой иных путей регуляции активности РНК-зависшой ДНК-далимеразы? В мс ;ельных опытах были проверены другие возможные пути регуляции данной активности.

Оказалось, что повышение РНК-зависимой ДНК-полимеразной активности может быть следствием модификации фермента в результате фосфорилировавия его. Так, в опытах Т,Б. Пыриновой, проведенных в нашей группе, показано, что в условиях, оптимальных' для фосфори-лирования протеинкиназой С, опосредующей передачу внутрь метки различных физиологических сигналов, активность обратной транс-криптазн, выделенной из материала печени крыс, обогащенного ЙАЧ, возрастает более, чем в два раза.

При сопоставлении полученных нами данных вырисовывается следующая закономерность: достоверное увеличение РНК-зависимой ДЙК-полимеразной активности происходит в период максимального ответа Iслетки на индуктор транскрипции РНК-матриц адаптивных ферментов. Возможно, генетический индуктор, увеличивая транскрипцию определенных генов, увеличивает и количеотво молекул РНК, способны* выполнять роль матриц для обратной транскриптазы.

Одним из подходов, позволяющих проверить возможность обратной транскриптазы копировать в клетке невирусную РНК, если повышение РНК-зависимой ЛНК-палимеразной активности под влиянием генетических индукторов связано о увеличением количества молекул РНК, доступных для фермента, может служить насыщение клетки-реципиента экзогенной, чужеродной для нее РНК о последующим изучением судьбы втой РНК.

Мы показали, что экзогенная РНК, попадая в клетку, может программировать там появление новых антигенов, характерных для ткани-донора РНК. Так, инкубация клеток асцктной карциномы Кребо-2 с РНК как сингенных, так и 'аллогенных мйией не влияла в избранных концентрациях на прививаемость этих клеток и скорость роста опухоли у непммуииэированпнх реципиентов. Однако предварительная иммунизации животных гомогенатом ткани аллогенной печени (источник РНК) приводила к отатистически достоверному торможению роста обработанной РНК опухоли, при условии, что иммунизирующий материал и ГНК относятся к одной и той же линии мыией. Описанный эффект РНК снимался РНКазой А, но не проназой. В дальнейших экспериментах вскрылась еще одна особенность. После пролиферации инкубированных с П1!( клеток пока "ю сохранение изменений в антигенной структуре тчсих

клеток. Сохранение и размножение неоантигенов нельзя объяснить . только трансляцией экзогенной РНК, оказавшейся внутри клеток. Процесс этот оказался чувствительным к 3 -азидо-3 -дезокситимдци-ну ( дат ) - эффективному ингибитору обратной транскрипции (Кра-евский и др., 1987).

Как выяснилось, под влиянием экзогенной РНК в клетках адено-карциномн молочной железы мышей линии СЗНД1е меняются свойства почкующегося ретровируса ммту . Экспериментальные данные позволяют предположить, что экзогенная РНК участвует в формировании дефектных ретровирусов, амплифицируяоь затем в составе вириона вирусной обратной транскриптазой.

Таким образом, в настоящей главе приведены результаты, которые свидетельствуют о нескольких возможностях клетки влиять на РНК-зависимую ДНК-полимеразную активность. Показано, что увеличение активности под влиянием генетичеоких индукторов может быть связано с :

1) наличием в х/гп ИАЧ последовательностей, опознаваемых глюкокортякоид-рецепторным комплексом;

2) модификацией фермента, например, за счет фосфоршшрования;

3) увеличением доступных для фермента РНК-матриц.

Все рассмотренные возможности повышения РНК-зависимой ДНК-полиме-разной активности под влиянием генетических индукторов транскрипции кажутся нам реальными 'и, по-видимому,, используются меткой в соответствующие моменты ее жизнедеятельности.

Глава 8. ОБСВДШИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Известно, что эндогенные ретровирусы в виде провирусов широко представлены в геномной ДНК плеток всех изученных в этом отношении позвоночных. В определенных уоловиях информация, содержащаяся в таких последовательностях, реализуется. Продукты генов рет-рогирусов, а особенно обратная транскриптаза, могут существенно влиять на физиологические процессы клетки.

В 1983 г. было опубликовано наше сообщение, в котором представлены оригинальные данные о наличии в печени интактных взрослых и новорожденных крыс фермента, обладающего РНК-зависимой ДНК-полимеразной активностью. Этот фермент подобен обратным трано-приптазам ретровирусов млекопитающих. Он может использовать в качестве матрицы-затравки поли(А)+юРНК-ояиго(дТ), поли(Ц)-олиго(дГ), поли(А)-олиго(дТ), активированную ДНК, но не полЖдТ)-олиго(А)

шш олиго(дТ). Это Kg-зависимая ДНК-голимераза, оптимум реакции которой определяется в области pH 7,8 в присутствии всех четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов. Константа седиментации его 4,6 д. Среди продуктов синтеза обнаружены гибридные молекулы РНК-ДНК. Активность фермента подавляется n- этилмалеимидом. Элюируется фермент с ДЭАЭ-целлюлозн Д&-52 0,08-0,1 М KCl и с фосфоцеллюлози P-II 0,1-0,15 М KCl.

Как нами показано, источником обратной транскриптазы печени крыс являются эндогенные ретровирусы, которые в дальнейшем мы идентифицировали как крысиные ИАЧ. В то время у взрослых животных, в частности. у крыс, ИАЧ регистрировали только в виде провирусов. Мы же обнаружили ИАЧ во фракции макросом печени взрослых интакт-ных крыс.- Более того, методом дот-гибридизации нами было показано присутствие поли(А)+РНК ИАЧ в составе транскрилционно активной ДНК и в составе полисомной поли(А)+мРНК печени взрослых крыс. Тан как зонд, который мы использовали в гибридозационных опытах содержит последовательности генов gag и pol , то это позволило сделать заклшеяие о транскрипции и трансляции gag- и pol-после довательностей в нормальных дифференцированных клетках крыс. Возможно, наличие свободной формы обратной транскриптазы, регистрируемой в печени крыс, объясняется трансляцией pol-последовательностей на полисомах этих клеток .

Наблюдаемое нами увеличение РНК-зависимой ДНК-полимераз-ной активности в печени крыс при генетической индукции адаптивных ферментов' в период максимального проявления действия индуктора и в процессе регенерации (через 5 чао после операции, когда регистрируется первый пик синтеза РНК) позволяет предполо-яить участие обратной транскриптазы в формировании адаптивного ответа клетки. Эти данные, а также тот факт, что в ранний постна тальный период уровень РНК-зависимой ДНК-полимеразной активности в печени крысят, по оравиению со взрослыми ливотьыми, выше, позволили сформулировать предположение о механизме ферментативного импринтинга, изучаемого в лаборатории молекулярной генетики Института цитология и генетики СО АН СССР под руководством чл.-корр АН СССР Р.И. Салганика.

Суть ферментативного импринтинга состоит в том, что память о многократных воздействиях генетического индуктора, произведенных в ранний постнаталышй период, сохраняется в течение длительного времени, а иногда в течение целой жизни животного. Причиной стой- 23 -

.;ого изменения уровня транскрипции генов у импринтированных животных могли бы быть изменения в первичной структуре ДНК, овязанные с рехропозицией диспергированных повторенных последовательностей, а также в результате амплификации соответствующих генов и/или их ре-гуляторных структур. Для подобных процессов обратная транскриптаза является, по-видимому, необходимым инструментом. Обнаружение ам-шшфицированных генов или повторов у импринтированных животных по сравнению с контрольными явилось бы подтверждением приведенного выше предположения. Такие работы в лаборатории продолжаются. Однако уже наши опыты продемонстрировали, что, во-первых, РНК-зависимая ДНК-полимеразная активность в печени крыс значительно выше в ранний постнатальный период по сравнению со взрослыми животными. Во-вторых, в отличие от взрослых животных, у которых РНК-зависимая ДНК-полимеразная активность посла разового воздействия индуктора быстро возвращается к норме, у импринтированных крыс повышенный уровень активности сохраняется не менее, чем в течение пяти меся-пев. В-третьих, наши опыты продемонстрировали функциональную разобщенность' ДНК- и РНК-зависимых ДНК-полимераз: РНК-зависимая активность возрастает в период индукции адаптивных ферментов, тогда как активность ДНК-зависимых ДНК-полимераз увеличивается в период синтеза ДНК.

Кроме того, к настоящему времени накопилось уже немало фактов, подтверждающих влияние1 генетических индукторов транскрипции и дифференцировки на экспрессию генов ряда проретровирусов и рет-ратрэяспозонов, Данные, полученные нами, также указывают на то, что обратная транскриптаза эндогенных ретровирусов может участвовать в повседневных физиологических процессах, происходящих в клетках млекопитающих, таких как экспрессия генов под влиянием генетических индукторов, в процессе обучения. Не исключено, что синтезируемые о индуцированных РНК их ДНК-копии выступают в определенные моменты жизнедеятельности клетки и в роли ингибиторов трансляции. таких РНК по аналогии с антисмысловыми РНК. На рис. II представлена схема возможного участия обратной транскриптазы эндогенных ретровирусов в жизнедеятельности дифференцированной клетки. В случае почкующихся ретровирусов в схему дополнительно необходимо ввести внеклеточную стадию существования ретровируса.

Изменение РНК-зависимой ДНК-полимеразной активности в пост-микросомальноВ фракции в определенные периоды жизнедеятельности меток печени и гиппокампа позволяет допустить возможность обрат' - 84 -

Рис. II. Возможное влияние обратной транскриптазы эндогенных не-почкутацнхся ретровирусов на жизнедеятельность нормальных клеток.

ÍI - обратная транскрипция скорее всего осуществляется свободной ормой фермента. Продуктом реакции являются процессированные псевдогены. II - обратная транскрипция происходит в вирионе, клеточная РНК попадает под вирусный промотор, возможно образование мозаичных молекул, состоящих из последовательностей вирусной и клеточной РНК. В олучае, если ретровирус имеет внеклеточную стадию, возможен перенос таких молекул в другие клетки).

ной транокрипции при участии свободного, находящегося вне вириона, фермента тех клеточных РНК, синтез которых индуцирован. С другой стороны, известно, что обратная транскрипция вирусной РНК происходит внутри вириона ( Wagner, 1986 ), поэтому обратная транскрипция клеточных РНК может происходить и в вирусной частице, если эти РНК способны упаковываться в вирион. Накапливающиеся лите ратурные данные позволяют предположить, что подобный процеоо, действительно, может происходить в вирионах эндогенных или экзогенных ретровирусов ( Etava et al., 1974 | Shoyab et al., 1975 i Staoey, 19SO ; Taylor, Cywinnaki, 1984 f Ohen et al., 1955 )• По-видимому, определенные преимущества будут иметь те молекулы РНК, которые представлены в большем количестве. Показательны в етом отношении данные Икавн и др. ( rkava et al.,. 197t ), демонстрирующие наличие глобиновой РНК только в вирионах, выделенных либо из константно глобин-нродуцируюших клеток, либо из клеток

после индукции в них синтеза глобиновой РНК.

Именно такой процесс скорее всего мы регистрируем в клетках, инфицированных почкующимися ретровирусами (клетки асцитной карциномы Эрлиха и Кребс-2, клетки аденокарциномы молочной железы мышей линии СЗН/Не) при инкубации их с экзогенной РНК. Действительно, проведение опытов с экзогенной РНК выявило ряд возможностей этих молекул влиять на свойства клетки-реципиента. В частности, была описана способность экзогенной РНК не только привносить в клетку-реципиент антигенные детерминанты, характерные для ткани-донора, но и способность таких клеток сохранять при пролиферации привнесенные РНК алло- и ксеноантигены. Процесс, как показано, чувствителен к АгТ. Некоординированное изменение РНК-зависимой ДНК-полимеразной активности и вирус-специфических поверхностных антигенов в клетках аденокарциномы молочной железы мышей линии СЗН/Не в ответ на введение животным экзогенной РНК вместе с выше упомянутыми фактами послужили основанием предположить, что экзогенная ГИК участвует в формировании дефектных ретровирусов, ам-плифицируясь затем в составе вириона с помощью обратной транс-кряптазы. Не исключено при этом появление рекомбинантных мозаичных молекул кДНК. Эти предположения позволяют объяснить сохранение в поколениях клеток-реципиентов РНК антигенных детерминант, характерных для ткани-донора этой РНК.

На основании полученйых данных высказано предположение о том, что обратная транскрипция клеточной РНК в дифференцированных клетках при определенных условиях, в частности под влиянием генетических индукторов транскрипции,происходит как при участии свободного фермента, так и фермента вириона. Наше исследование показало, что у высших эукариот есть все предпосылки для подобного процесса. В частности, в ьтп провирусов. эндогенных ретровирусов, в том числе в ьтн провирусов ИМ, имеются последовательности, способные отвечать на регуляторные сигналы клетки. Гены про-ретровирусов ИАЧ взрослых ннтактных крыс, как впервые показано в наших исследованиях, транскрибируются и транслируются. Среди продуктов трансляции в нормальных дифференцированных клетках взрослых интактных животных обнаружена обратная трзисяриптаза, активность которой коррелирует с изменением под еляянирм генетических индукторов ДНК-зависимого синтеза РНК.

ВЫВОДЫ :

1. В нормальных тканях взрослых крыс (печень, семенники, мозг и др„) выявлена РНК-зависимая ДНК-полимеразная активность, а из печени таких животных выделена РНК-зависимая ДНК-полимераза, идентичная по основным свойствам обратной транскриптазе ретровиру сов :

а) Фермент катализирует синтез ДНК, используя в качестве мат рицы-затравки поли(А)+мРНК-олиго(дТ), а также поли(Ц)-олиго(дГ), поли(А)-олиго(дТ), но не олиго(дТ). или поли(дТ)-олиго(А),

б) Для катализируемого ферментом синтеза ДНК на поли(А)*мРНК необходимы все четыре дезоксирибонуклеозидтрифосфата : дАЧФ, ТТФ, дГТФ и дЦТФ ; оптимум реакции определяется в области рН 7,8 ; активаторами фермента являются преимущественно Мйг+ ; активность фермента подавляется н-атилмалеимидом.

в) Среди продуктов реакции, катализируемых ферментом, обнаружены полинуклеотиды, идентифицируемые по ряду свойств как РНК-ДНК-гибриды.

г) Константа седиментации фермента составляет 4,6 з20. *

д) Установлено, что в печени крыс фермент находится в свободной растворимой форме и в составе частиц фракции микросом.

2. Получен ряд данных, говорящих о том, что в составе фракции микросом печени крыо находятся ретровирусы типа А, представля ющие собой интрацистернальвые А-частвды (ИАЧ), которые служат источником обратной транскриптазы :

а) После равновесного центрифугирования микросом печени крыс в градиенте плотности 20-50 % сахарозы РНК-зависимая ДНК-полимеразная активность обнаруживается только в области с плотностью-1,16-1,18 г/см3. Электронная микроскопия только в этой области выявляет вирусоподобные сферические частицы диаметром 80-120 нм ; при негативном контрастировании и на ультратонких срезах видно, что частицы имеют гладкую внешнюю оболочку и нуклеоид, в котором различают фибриллы ; по морфологическим признакам частицы сходни о ретровирусами типа А.

б) Из частиц выделена поли(А)+РНК с конотантой седиментации больше 2? 8.

в) После обработки частиц детергентом Тритоном Х-100 в них обнаруживали РНК-зависимую ДНК-полимераэную активность, что говорит о том, что такая активность принадлежит ферменту, нехоптпрму-ся внутри частиц, окруженному мембраной. '

г) Из частиц получена обратная транскриптаза, по всем свойствам подобная ферменту, выделенному ранее из печени взрослых интактных крыс,

д) В составе частиц в среде с четырьмя дезоксирибонуклеозид-трифосфатами и ионами Ме2+, в присутствии актиномицина Д, происходит синтез гибридных РНК-ДНК-молекул.

е) Установлено, что РНК, выделенная из частиц,гомологична ДНК ИАЧ мышей, содержащей последовательности гена gag и значительную часть гена pol.

ж) Полученные данные впервые демонстрируют наличие зрелых ретровирусных частиц в дифференцированных клетках интактных взрослых крыо.

3. Показано, что в геноме крыс Вистар в провирусной форме содержатся последовательности, гомологичные ИАЧ. Различий в содержании провирусов ИАЧ в ДНК разных органов крыс (печень, семенники, гиппокамп) не выявлено.

4. В составе транскрипционно активной фракции хромосом печени крыс обнаружены нуклеотидные последовательности, гомологичные кодирующему обратную транскриптазу. гену pol ИАЧ ; такие последовательности обнаружены также в составе полисомной поли(А)+мРНК печени крыо. Полученные данные впервые демонстрируют экспрессию гена pol ИАЧ в дифференцированных клетках взрослых крыс.

5. Показано, что индукция экспрессии генов, кодирующих адаптивные ферменты или обеспечиватацих протекание физиологических процессов, сопровождается возрастанием РНК-зависимой ДНК-полиме-разной активности :

а) Интенсивность РНК-зависимой ДНК-полимеразной активности высока в печени новоровденнкх крысят в течение первой недели жизни, а затем снижается до уровня, характерного для взрослых особей,

б) Интенсивность РНК-зависимой ДНК-полимеразноЙ активности возрастает в печени крыс под влиянием индукторов транскрипции адаптивных ферментов и в процессе регенерации органа через 5 чпо после операции частичной гепатэктомии, в период интенсивного ДНК-зависймого синтеза РНК.

в) Обнаружено, что в гиппокампе, в структуре мозга, ответственной ва Формирование долговременной памяти, интенсивность РНК-зависимого синтеза ДНК существенно выше у крно с генетически

детершнированншл свойством к быстрому обучению, чей у животных, селекционированных по признаку медленного обучения. У этих двух групп животных не наблюдали отличий в интенсивности ДНК-зависимого синтеза ДНК.

г) Показано, что при выработке пищедобывательного условного рефлекса у крыс интенсивность РНК-зависимой ДНК-полимеразной активности в гиппокампе возрастает в период консолидации следа памяти, совпадает во времени с усилением синтеза РНК, которое сопровождает процесс обучения ; при обучении интенсивность ДНК-зависимого синтеза ДНК не меняется.

6. Рассмотрены основные пути изменения интенсивности обратной транскрипции в клетках животных s

а) усиление экспрессии гена pol, кодирующего обратную транс-криптазу, обеспечивающее возрастание содержания этого фермента в клетках }

б) увеличение удельной активности обратной транскриптазы за счет ферментативной модификации ее путем фосфоршгарования ;

в) интенсификация обратной транскрипции за счет увеличение содержания мРНК, синтез которых индуцируют гормоны, субстраты и шше физиологические регуляторы.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ГО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Томсонс В.П., Веревкина К.Н., Матиенко H.A. Влияние РНК на рост опухоли у мышей факторных и бесфакторных линий // Докл. лН СССР.- 1977.- Т. 232, № I,- С. 217-220.

2. Томсоно В.П., Ромащенко А.Г., Веревкана К.Н. а др. Зависит,гость противоопухолевого эффекта РНК от присутствия онкорнавв-руса в опухолях мышей // Тез. докл. Всесоюзного симпоз. "Вироте-рапия и искусственная гетерогенизация опухолей",- Рига*. Занатне, 1977.- С. 80-84.

3. Салганик Р.И., Дробинко Т.А., Панфилова С.И., Ромащенко А,Г., Сидельникова Н.П., Томсонс В.П.-Обратная транокрипция и индукция ферментов // Тез. докл. 4-го Всесоюзного биохим. сгезда,-M.s Наука, 1979.- С. 169.

4. Салганик Р.И., Панфилова З.И., Ромащенко А.Г., Сердюкова Н.П., Сидельникова H.H., Томсоно В.П. Возрастание'активности обратной транскриптазы при индукции ферментов // Таз. докл. Всесоюзного симпоз. "Макромолекулы клетки, структура, функция, взя№г> действия"..- М., 1979,- С. 99.

5. Томсонс В.П., Роыащенко А.Г., Веревкина К.Н. и др. Связь противоопухолевого эффекта РНК с наличием онкорнавируса в опухоли мышей // Гетерогенизация опухолей.- Рига: Зинаткс, 1980.- С. 67-73.

6. Томсонс В.П., Пыринова Г.Б. Изменение свойств карциномы молочной железы мышей линии СЗН под влиянием экзогенной РНК // Докл. АН СССР.- 1980,- Т. 251, S 4.- С. 987-991.

7. Томсонс В.П., Веревкина К.Н., Пыринова Г.Б., Салганик

Р.И. Влияние экзогенной РНК на активность поли(А)-олиго(дТ)-зависимой ДНК-полимеразы в опухолях мышей // Биохимия.- 1980,- Т. 45, № 8.- С. I4I2-I4I6.

8. Салганик Р.И., Томсонс В.П., Древич В.Ф. Увеличение РНК-зависимой ДНК-полимеразной активности печени крыс при генетической индукции адаптивных ферментов // Докл. АН СССР.- 1980,- Т. 254, № 6.- С. 1482-1486.

9. Николин В.П., Ильницкая С.И., Томсонс В.П. и др. Антигенная модификации опухолевых клеток препаратами аллогеннсй РНК // Докл. АН СССР,- 1980.- Т. 251, № 2.- С. 506-509.

10. Салганик Р.И., Шуйская И.А., Томсонс В.П. Вероятная роль обратной транскриптазы в нейронной памяти //.Докл. АН СССР,-

1981.— Т. 256, № 5,- С. 1269-1272.

11. Салганик Р.И., Соловьева H.A., Мананкова Н.М., Томсонс

B.П, Коррекция наследствеЖшх ферментопатий в эксперименте путем неонатальной индукции ферментов // Вопросы мед. химии.- 1982,В 3.- С. 8-16.

12. Томсонс В.П., Пыринова Г.Б., Кррохов Н.П., Салганик Р.И. Активация обратной транскрипции при индукции экспрессии генов в клетках животных. Характеристика обратной транскриптазы и продуктов транскрипции // Тез. докл. Международного симпоз. "Организация и экспрессия тканеспецифическях генов".- Новосибирск, Т93Я.-

C. 00

13. Салганик Р.И., Аргутинская C.B., Аршинова Т.В., Грязнова Й.М., Древнч В.Ф., Соловьева Н.'А., Томсонс В.П. Стабильные изменения в экспрессия генов при неонаталыюм введении животным индукторов транскрипции, коррекция наследственных фериентопатий в эксперименте // Уест, теоретич. и приклада, генетики,- Новосибигок.

1982.- 0. 10-12.

14. Салганик Р.И., Соловьева H.A., Томсоно В.П. Экспериментальна! наследственная галактоземкя : молекулярные механизмы и

способ коррекций // Тез. сшлпоз, докл. 4-го съезда БОГиС ем. H.1L Вавилова.- М.: Наука, 1932.- С. 227-228.

15. Томсоно В.П., Пыриногч Г.Б., Корохов Н.П. и др. Обратная транскриптаза из печени крыс : происхождение и вероятные функции // Докл. АН СССР.- 1983.- Т. 272, № 6.- С. I498-I50I.

16. Salganik H.I., Parvez H., Tournons V.P. at al. Probable role of reverse transcription in learning s correlation between hippo campai îlîîA-depsndent DNA oyntheaia and learning ability in rata // Iîeuroscienoe Lett.- 1983-- V. 36.- P. ?17-322.

17. Салганик P.И., Грязнова И.M., Соловьева H.A., Древич В.t , Кнорре В.Л., -Томсоно В.П., Шринова Г.Б., Корохов Н.П. Индукция стабильных изменений в экспрессии генов животных // Тез. докл. 5-го Всесоюзного-симпоз. "Молекулярные механизмы генетических процессов",- М.; Наука, 1983.- С. 46-47.

, 18. Салганик Р.И., Томсоно В.П., Шуйская И.А. и др. Вероятная роль РНК-зависимого синтеза ДНК в клеточной памяти // Тез. докл. 9-ой Всесоюзной коифер. гр биохимии нервной системы",- Ереван, 1983.- С. 23-24.

19. Корохов Н.П., Томсоно В.П., Салганик Р.И. Выделение и характеристика продуктов обратной транскрипции из регенерирующей печени крыс // Изв. Сиб. отд. АН СССР.- 1984.-Т . I, Й 6,- С I09-II4,

20. Пыринова Г.Б., Томсонс В.П., Блинова H.H., Салганик Р.И. РНК-зазпсимаз ДНК-полимераза из печени крыс // Молекул, биология.- 1984.- Т. 18, » 3.- С. 743-750.

21. Пыринова Г.Б., Корохов Н.П., Киселева Е.В., Томсоно В.П., Христолюбова Н.Б., Салганик Р.И. Связь РНК-зависимой ДНК-нолиме-разы из печени крыс с вирусоподобными частицами // Молекул, биология,- 1984,- Т. 18, JS 4.- С. 919-924.

22. Пыринова Г.Е., Корохов Н.П., Киселева Е.В., Томоонс В.П., Христолюбова Н.Б., Салганик Р.И. Изменение РНК-зависимой ДНК-поли-меразной активности ретровирусоподобных частиц печени крис в процессе постнатального онтогенеза // Онтогенез.- 1Р84,- Т. 15, Я 6,3. 637-643.

23. Николин В,П., Ильницкая С.И., Грунтенко Е.В., Томсоно З.П. Появление новых трансплантационных антигенов'в опухолевых тетках, обработанных препаратами РНК // Эксл, онкология,- Т904,-Г. fi, » I,- С. 42-47.

24. Томсонс В.П., Пириновк Г.Б., Корохов Н.П. и дя, (Wimtm

- ЗГ -

гранскриптаза эндогенных ретровируоов в печени крыс. Свойства и. вероятная биологическая роль // Тез. докл. 16-го съезда Европейских биохим. обществ,- М., 1984,- С. 302.

25. Салганик Р.И., Соловьева Н.А., Кнорре В.Л., Томсоно В.П., Юркина Э.А., Пыринова Г.Б. Изучение механизма ферментативного иы-прингинга, индуцированного у крыс ранним постнатальным введением галактозы // Вопросы мёд. химии.- 1985,- В 4,- С. 65-70.

26. Корохов Н.П., Томсонс В.П., Салганик Р.И. Идентификация ендогенных ретровируоов в печени крыс при помощи молекулярной гибридизации // Докл. АН СССР.- 1985,- Т. 283, В 6.- С. 1504-1507

27. Salganik R.I., Tomsons V.P., Pyrinova G.B. et al. Reverse transcriptase of rat liver aseooiated with the endogenous retrovirus related to the mouse intracisternal A-partioles // Biochsm. and Eiophys. Rso. Comaun. - 1985.- V. 131, И 1.- P. 49228. Корохов Н.П., Пыринова Г.Б., Курцман М.Я., Томсоно В.П.,

Салганик Р.И. Исследование природы эндогенных ретровирусоподоб-!шх частиц печени крыс // Эксп. онкология.- 1986,- Т. 8, № 2,-С. 29-32.

29. Томсоно В.П., Пыринова Г.Б., Корохов Н.П. и др. Исследование экспрессии генов интрацистернальных А-частиц и активности обратной транскриптазы в тканях крыс под действием генетических индукторов // Тез. докл. 6-го Всесоюзного симпоз. "Молекул- меха паа№ генетических процессов".- М., 1987,- С. 52-53.

30. Томсонс Б.П., Пыринова Г.Б., Куприянова О.А. и др. Веро ятная роль обратной транскрипции в экспрессии генов // Тез. доо 9-го Всесоюзного симпоз. "Структура и функции клеточного ядра".-Черпоголовка, 1987.- С. 250.

31. Томсонс В.П., Пыринова Г.Б., Корохов Н.П., Куприянова О.А. Экспрессия проретровирусного гена интрацистернальных А-частиц, кодирующего обратную транскриптазу, в клетках крыс // Тез. докл. 5-го съезда ВОГиС.- М., 1987.- Т. I.- С. 275-277.

32. Салганик Р.И., Томсонс В.П., Пыринова Г.Б. и др. Эндо-гейные ретровирусы : вероятная роль в экспрессии генов // Тез. докл. 5-го съезда ВОГиС.- М., 1987.- Т. 6,- С. 49-50.

33. Куприянова О.А., Корохов Н.П., Томсоно В,П. и др. Обнаружение РНК интрацистернальных А-частиц в составе полисомной полп(А)1 РНК печени крнс // Риополишрн ч клетка.- 1987.- Т. 3. Р S.~ С, 152, ^

no „