Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Репарация ДНК в нервных клетках млекопитающих: энзиматический, структурный и функциональный аспекты

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Репарация ДНК в нервных клетках млекопитающих: энзиматический, структурный и функциональный аспекты"

российская академия наук

ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ Ш.В.А.ЭНГЕЛЪГАРДГА

т'6 Ой-:-

На правах рукописи УДН 577.151:577.06:591.513

ИВАНОВ Владимир Александрович реплрлщш дас в ики8шт клетках цлисопйтаищ:

зшзшическез, структунш и функционалыши аспекш

(03.00.03. - молекулярная биология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

НОСКВА 1993

• Работа выполнена в Институте биофизики клетки РАН

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор В.Д.ЖЕСТЯНИКОВ доктор химических наук, член-корреспондент РАН А.А.КРАЕВСК® доктор биологических наук В.М.КРУТИКОВ

Ведущее учреждение: Институт биологии развития им.Н.К.Кольцова РА!

Защита состоится _1993 г.

в " ¡(7 " час. на заседании Специализированнсй-о соЕвта Д 002.79.01 □о защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта РАН по адресу: 117964, Москва, ГСЛ-1.ул.Вавилова,32.

О диссертацией мохно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта РАН.

Автореферат разослан " ^М-У0 ®/]^ 1993 г.

УЧЕНЫЙ СЕКРЕТАРЬ Специализированного совета

кандидат химических наук А.М.КРЩМ

0Щ4Я ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность пробхеим

В настоящее время интенсивно развивается новая область молекулярной биологии, объектом исследований которой является нервная клетка. Интерес к таким исследованиям определяется, в значительной степени, становлением одного из наиболее перспективных направлений молекулярной биологии - генетики поведения. Центральную роль здесь играют исследования транскрипции и синтеза ДНК. Синтез ДНК в клетка обусловлен тремя типами биологических процессов: репликацией, эксцинионной репарацией и обратной транскрипцией, - мэзду которыми существует взаимозависимость и функциональная связь (Romberg, 1980; Priedberg,1935). Хотя обратная транскрипция направлена преимущественно на избирательное умнояе-ние части генетического материала, а репликация - на его редупликацию, оба процесса могут слугить и клеточными механизмами репарации (возможна компенсация функции посредством многократного дублирования повреяденного гена с недостаточной функциональной активностью и постреплянативная репарация). С другой стороны, репарация ДНК, направленная на устранение спонтанных и индуцированных повреэдвний, - обязательный компонент матричных процессов (ГДестяников, 1979; Cleaver et al.,1983; Leadon, 1986; Hellon et al., 1986;Plesk0, Richardson, 1984).

Развитие нервной клетки сопровождается глубоки.® перестройками в метаболизма ДНК. В частности, количество ДНК-полимеразы а уменьшается пропорционально скорости падания митотической активности нейробластов: в зрелых нейронах даокортекса этот энзим не тестируется (Hubsclier et al., 1977, 1979). Отсутствие репликатив-ного синтеза нейрональной ДНК вместе с долгим временем яизни нейрона, которое сравнимо с длительностью апзнп организма (Altraan, 1969; Haas et al., 1970), обуславливает: особое значение репарации повреждений ДНК для поддераания функциональной целостности, генома нервной клетки. Однако, до настоящего исследования всего два энзима (ДНК-шлвмэраза (3 и ДНН-лягаза II), обладащие репарационными свойствами, были идентифицированы в нейронах и лишь один из них (ДНК-полимераза р) очищен и детально изучен. РНК-зависимая ДНК-полимерзза в атих клетках тангэ не обнаружена.

Цаль и основные задача исследоаанзл

Цель работы заключалась в идентификации энзимов синтеза ДНК

нервных клеток, изучении их специфических свойств и участия в процессах репарации ДНК. Для корректной идентификации обратной транскриптазы потребовалось предварительное исследование, которое позволило доказать предположение:геном животной клетки (мобильный ИКЕ-элемент) кодирует обратную транскриптазу. В соответствии с этим были поставлены и решены следующие задачи:

1. Выделены в высокоочшценном состоянии: экзодезоксирибонуклеаза (ДНКаза Bill); эндодезоксирибонуилеаза, специфичная к апури-новым и/или апиримидиновым (АП) сайтам; ДНК-топоизомераза I и обратная транскриптаза.

2. Исследованы специфические свойства выделенных энзимов и проведена характеристика катализируемых процессов.

3. Изучены субклеточная и субъядерная локализация энзимов и изменение последней в процессе инициации функциональной активности.

4. Разработаны и проведены эксперименты In vitro по тестированию нуклеолитических энзимов, которые позволяют оценить их специфические свойства, обеспечивающие участие в координированном процессе репарации ДНК.

5. Проведено молекулярное клонирование и экспрессия в E.coli открытой рамки трансляции, предположительно кодирующей обратную транскриптазу, мобильного генетического элемента дрозофилы, родственного ЬШЕ-элементам млекопитающих.

6. Выделена, очищена и идентифицирована рекомбинавтная обратная транскриптаза, кодируемая мобильным элементом генома дрозофилы.

Научная новизна

Впервые в клетках мозга идентифицирована экзодезоксирибонуклеаза /названная ДНКазой Brain (В)Ш/, которая четко отличается от известных ДНКаз млекопитающих и является типичным репарационным (эксцизионным) энзимом.

Впервые.в хроматине неокортекса крыс найдена эвдодезоксири-бонуклеаза, которая узнает АП-поврездения в ДНК. Репарационный (инцизионный) энзим мозга, в отличие от известных АП-эндонуклеаз млекопитающих, высоко специфичен к суперспиральной форме субстрата. Такое свойство, ранее описанное лишь для эндонуклеазы из печени крыс, узнающей другой тип повреждений ДНК, может иметь важное функциональное значение, предохраняя ДНК от двухцепочечно-го разрыва в процессе репарации, который приводит к дисфункции клетки. В экспериментах tn vitro показано, что нуклеолитические

энзима головного мозга (АП-эндонуклеаза нзокортекса крнс и ДНКаза BIXI), действуя последовательно, эксцизирувт АП-сайты из сугор-спиральной ДНК фага Р!£2. Результаты этой работы дают основание предполагать, что упомянутые энзимы, могут участвовать In vivo в координированных действиях в эксцизионной репарации ДНК клеток головного мозга.

Впервые ДНК-топоизомераза 1 найдена в нервных клетках, выделена из нейронов коры головного мозга крыс и очищена до электрофоретической гомогенности. Обнаружено детальное сходство свойств ДНК-топоизо?,иразн I нейронов и лимфоидных клеток и некоторое отличие их от ферментов из других тканой млекопитающих. Показано участив ДНК-топоизомаразн I в процессах репарации ДНК.

Преддоген тест на функциональную активацию In vivo энзимов метаболизма' ДНК: изменение степени ассоциации энзиматического белка с хроматином.

Впервые прямо продемонстрировано, что мобильный генетический элемент класса LINE (этот класс мобильных элементов найден в клетках млекопитающих) кодирует подлинную обратную транскриптазу.

Впервые идентифицирована эндогенная обратная транскриптаза в нейронах головного мозга млекопитающих. Эта ДНК-полимераза по своим свойствам, подобна энзиму, кодируемому ЬШЕ-элементом.

Нвучно-практнческое значение

На основании ряда экспериментов по включению меченого предшественника в условиях тестирования репарзтивного синтеза ДНК слояилось мнение о дефектности репарации ДНК в клетках мозга (Kleltoies Se Buclueler, 19Т7; Dambergs & Kldson, 1979; Heyting & Veer, 1981). В настоящем исследовании доказано наличие в нейронах голонного мозга ряда энзимов системы репарации ДНК и показано изменение их активности в процессе дифференциации этих клеток или шд действием агентов, повреадапцих ДНК. Эти факты вместе с представлением о том, что репарация ДНК клеток мозга имеет исключительно ваяное значение (она обеспечивает целостность генов, ответственных за проявление высших функций головного мозга, = адаптивный поведенческий ответ организма), корректно соответствуют концепции об избирательной репарации активных (транскрибируемых) генов. Эта концепция получает подтверждение и развитие в экспериментах по изучению репарации маркерных генов в составе рекомбинантных ДНК.

Доказательство предположения: геном жиаотной клетки кодирует обратную транскриптазу, - представляет большой теоретический ин-

терес и позволяет корректно ствейть и решать задачи в прикладных областях исследований (например, в медицине: создание селективных антивирусных препаратов).

Идентификация эндогенной обратной транскриптззн в клетках головного мозга обеспечивает инструментальную поддержку гипотезам о приобретенной (ненасладуемой) памяти на уровне генома, которые имеют большое теоретическое и практическое значение.

Структура и объел работы

Диссертация обобгдает результаты более 40 работ, е том числе в таких международных изданиях как European Journal Bioctiemiatry, ?EBS Letters, Biochimica et Biophysics Acta,Keuroscience Lettere, EMBQ Journal, включая 5 обзоров ( 3 из них в журнале "Успехи современной биологии"). Диссертация изложена на 269 е., и состоит из введения, обзора литературы, описания использованных в работе материалов и методов исследования, изложения и обсукдения экспериментальных данных и выводов. Список цитированной литературы содержит 466 наименований.

РЕЗУЛЬТАТЫ И IK СЕСУ5К22Е

ШдаШНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ЭНЗЭЮВ

1.Экзодезоксирабонуклеаза головного иозга крыс (ДНКаза Bill) (1-11,13,14,16,18,22-24,27-29)*** ДНКаза Bill была выделана в электрофоретически гомогенном состоянии. Результаты очистки энзима приведены в табл.1.

Таблица I

Очистка ДНКазы Bralnlll (Bill)

Стадия

Белок (да)

Удельная активность

Выход (Ж)

Очистка

1. Неочищенный экстракт 5300 2,4 100

2. Осаждение (HH+)2S04 3470 3,5 96

3. Хроматография I 660 ЮД 52 на ГГАП

4. Хроматография 24 164 31 на ДНН-агарозе

5. Хроматография II 2,8 935 21 на ГГАП

6. Гель-фальтрзция 0,76 2710 16 через G-200

I

1,5 4,2

6Э

390

ИЗО

Количество превращенного субстрата (мкг) в I ч, отнесенное к весу белка в пробе

Энзим был очищен в ИЗО раз с 1636 выходом. Энзиматический препарат (молекулярная масса ~ 60000) проявляет активность только в присутствии или Ш?* при рН-оптимуме 8,4, чувствителен к высокой ионной силе, п-ЖМЗ полностью ннгийирует активность.

ДНКаза Bill гидролизует одноцепочечнув (оц-) ДНК из E.coli, тимуса теленка, головного мозга крыс и поли(йА) приблизительно с одинаковой скоростью (табл.2). Энзим активно гидролизует оц-ДНК,

***в скобках указаны номера статей в списке литературы, соот-ветствужщие данной главе.

содержащую апуриновне сайты, в то время как скорость гидролиза УФ-облучэнной ДНК, тестируемая по кислоторастворишм продуктам, составляет только 11% от максимальной.

Таблица 2

Относительная скорость гидролиза различных субстратов ДНКазой Bill

Субстраты Относительная скорость

гидролиза

%

поли(й4) 100

оц-ДНК (головной мозг крыс) 100

оц-ДНК (E.coli) ээ

оц-ДНК (тимус теленка) 95

дц-ДНК (тимус теленка) >1

РНК (дрозки) 5

АП-оц-ДНК 120

АП-дц-ДНК >2

УФ-оц-дак II

УФ-дц-ДНК 4

дд-ДНК (обработанная ДНКазой I) 92

Первая экзодэзоксирибснуклеаза головного мозга, ДНКаза ВШ, в соответствии с номенклатурой, введенной Т.Линдалем, относится к типу энзимов, подобных ДННазеШ млекопитающих: гидролизует ДНК вкзонуклеолитически, освобоздает данонуклэотид-5'-фосфаты в качестве основного продукта деградации, не атакует РНК, имеет щелочной pH оптимум и нуждается в двухвалентных катионах в качестве кофакторов. Но энзим головного мозга отличается по ряду физических и каталитических свойств: молекулярному весу, специфичности к оц-ДНК, оптимальной концентрации действующей концентрации п-ХМБ и хромвтографяческим свойствам. Наконец, ДННаза III широко распространена в различных тканях млекопитаицах (печени, легких,.селезенке, костном мозге), но не в

головном мозге (Lindahl et al., 1969; Lindahl, 19T0). ДНКаза ВШ, представленная здесь, выделена из головного мозга крыс и 2 специальном исследовании на найдена в печени этих животных.

Специальные свойства позволяют предполагать, что этот энзим участвует в репарации поЕреадений ДНК в клетках мозга: ДНКаза, специфичная к одноцепочечной ДНК, также активна по отношении к инцизированной двухцепочечной ДНК /этот энзим, таким образом, может функционировать от внутркцепочзчных разрывов как екзодезоксирибонуклеазы, эксцизионная функция которых в репарации ДНК доказана (Grossman, 1981)/; специфичность ДНКазы Bill подобна специфичности ДНКазы VIII, 5'—3*' экзонуклеазн из плаценты человека, когда она эксцкзирует УФ-облученную деухцепочечную ДНК после инцизии дкмер-спецкфической эндонуклеазой (Pedrlni and Grossman, 1983); знзлиз кинетики гидролаза ДНК с равномерно распределенной по длине молекулы тритиевой меткой и терминально меченой по фосфору, показал, что энзим деградирует полинуклвотиды в направлении от 5'- к 3*-концу по частично процессквному механизму действия; /такой механизм действия характерен для типичных экзодезоксирибонуклеаз, принимающих участие в репарации поврездений ДНК (Grossman, 1981)/; и, наконец, в модельных экспериментах In vitro доказано, что ДНКаза Bill эксцкзирует АЛ-сайты ДНК фага FM2 в координированном процессе репарации ДНК.

При исследовании корреляции между распределением в различных отделах головного мозга крнс нейромедиаторов серотонина и норадреналина (имещих большое значение для- функционирования мозга) и активности ДНКазы Bill, а также непосредственного влияния этих биологически активных веществ на реакцию гидролиза ДНК, катализируемую энзимом, были обнзрунены некоторые закономерности. Так, было показано существование определенного соотношения между активностью этого энззаза и количеством нейромедиаторов в тканях коры и гиппокампа и некоторые эффекты на реакцию гидролиза In vitro. Постановка таких экспериментов имеет смысл и их результаты не являются неожиданными. Так, например, известно, что связанный с ДНК серотонин уменьшает образование индуцированных УФ-светом тимидиновых димеров (фотоиндуцированный биосинтез серотошша лежит в основе фотозащиты дрожжевых клеток от инактивации, вызываемой коротковолновым УФ-светом) (Иванова и Фрадкин, 1985), и доказано, что серотонин в физиологической концентрации (1СГ^ М) стимулирует синтез ДНК In vivo (пролиферацию покоящихся клеток) (Нефедов и соавт., 1985).

На основании анализа ряда фактов можно предполагать, что генетические процессы (например, репарация ДНК), локализованные в ядре, имеют функциональную связь с клеточной мембраной и процессами, происходящими в цитоплазме. Такое предположение может быть подтверждено корреляцией между связыванием с клеточной мембраной прокаина или фенатил-алкоголя и удалением тимидиновых димеров из ДНК E.coll (Tomlyama et al.,1986), и существованием ядерного пула некоторых типичных цитоплазматических гликолитических энзимов. Так, лактат-дегидрогеназа и глицеральдегид-фосфат-дегидро-геназа являются оц-ДНК-связываюцнми белками, которые стимулируют синтез ДНК, действуя на ДНК-полимвраза а - праймазный комплекс (Caliasano et al., 1985; Grosse et al., 1986); последний глико-литический энзим, как показано, является типичным негистоноЕым белком и возможным активатором транскрипции в нейронах (Morgenegg et al.,1986). О Другой стороны, повреждения ДНК индуцируют изменения в метаболизме Сахаров посредством активации поли(АДФ-рибо-за)-полимеразы (Berger et al., 1986).

2.Эпдодазоксхрвйонуклаеза неог.ортексо крас, спецгфгчпоя к АП-сайтаи (19,22,24,27-29)

Энзим был выделен из хроматина неокортекса и очищен. Результаты очистки представлены в табл.3. АП-ДНКаза неокортекса очищена в 78 раз (относительно хроматинового эстракта) с 2035 выходом. Энзима (молекулярная масса 28000) нуждается для проявления активности в или Мп^*, оптимальная концентрация при

pHQnT 7,8 равна 4-7 мМ. Показано, что АП-эндонуклеазв головного мозга является специфичной для АП-сайтов в суперспиральной РМ2 ДНК и не атакует нативннй субстрат. ДНК, инцизированная этим энзимом, служит эффективным прайкэроы для ДНК-полимеразы I E.coll и ДНК-полимеразы ß. Энзим является типичной АП-эндонуклеазой, которая гидролизувт фосфодиэфирную связь в непосредственной близости от АП-сайта на его 5'-стороне, освобождая З'-ОН - концевую группу, которая является подходящим праймером для ДНК-полимераз млекопитающих /или бактерий/ (Heiland et al., 1985; Grossman, 1981 ).

В условиях специфической реакции наблюдали количественное превращение суперспиральной форы ДНК плазмида pBR 322 в открытую кольцевую форму. В продуктах реакции не обнаружено накопления линейной формы ДНК даже при огромном избытке (3 порядка величины) внзиматического белка. На основании этого факта можно сделать

вывод о высокой специфичности эндонуклеазы хроматина головного мозга к суперсдиральной форме субстрата. Такое свойство, ранее

Таблица 3

Очистка АП-ДНК-азы хроматина неокортекса крыс

Стадия

Белок Удельная Выход (мкг) активность (Ж) (ед/мкг)

Очистка

1. Препарат хроматина 1126(3

2. Хроматография 2830 на ГГАП

3. Хроматография 497 на ДЭАЭ-целлюлозе

4. Хроматография 29 на ДНК-агарозе

56 153

592

4391

100 69

47

20

I*

3

II

78

I ед. знзима превращает 0,1 пмоль рВЕ322 ДНК (содержащую 1,0 АП-сайт на молекулу) за 10 мин в релаксированную форму.

*

Очистка.и выход активного белка вычислена относительно стадии хроматинового препарата.

описанное лишь для эндонуклеазы из печени крыс, специфичной к другому типу повревденнй ДНИ (Heiland et al., 1982), может иметь ' важное функциональное значение, предохраняя ДНК от двухцвпочечного разрыва в процессе репарации, который приводит к дисфункции клетки.

В экспериментах In vitro показано, что АП-эндонуклеазз неокортекса крыс участвует в координированном процессе репарации, инцизируя ДНК фага FM2 возле АП-сайтов.

В головном мозге морских свинок также обнаружен энзим этого типа, который, однако, отличается от описанного некоторыми физическими и каталитическими свойствами (K.Subba Нао, персональное сообщение).

3. ДНК-топоизомераза I нейронов головного мозга крыс (12,15,16,24,25,27-29)

Результаты очистки ДНК-топоизомеразы I нейронов неокортекса представлены в табл.4. Энзим очищен в 190 раз с 12% выходом. Очищенный энзим, подобно ДНК-топоизомеразе I из других источников (Gellert, 1981; Терещенко и Хайдарова, 1983), ралаксирует сугор-спиральнув ДНК в отсутствие АТФ и не ингибируется новобиоцином, не нуждается в % и активен в присутствии I мМ NagEDTA. Он имеет оптимум концентрации моновалентных катионов, типичный для энзимов типа I млекопитающих и, подобно другим эукариотическим тогоизоме-разам типа I, связывается с 3* -концами никированных цепей ДНК. По своим характеристическим свойствам ДНК-топоизомераза нейронов коры головного мозга крыс является энзимом типа I.

Наиболее гомогенная фракция нейрональной ДНК-топоизомеразы I представлена только одним полипептидом с молекулярной массой ~ 100000. В других фракциях обнаружены полипептида более низкой молекулярной массы, которые также обладают ДНК-топоизомеразной активностьв.

Ряд биологических функций предполагается для ДНК-топоизомер-азы типа I. Она может участвовать в репликации ДНК (Champoux and Dulbecco.,1972; Niahlsawa et al., 1984; Kaguni and Romberg, 1984), транскрипции (Bauer et al., 1977; Fleischmarm et al., 1984), рекомбинации (Champoux, 1977; Halltgan et al., 1982) и репарации (Nishlzawa et al., 1984; Pedrlni and Ciarrocchi, 1983). В постнатальных нейронах коры голоеного мозга, как известно, нет репликативного синтеза ДНК, связанного с делением клеток (Altman, 1969; Haas et al., 1970). Вместе с тем было обнаружено, что вычисленное содержание активной ДНК-топоизомеразы на ядро нейрона является постоянным в течение дифференциации (созревания) нервной клетки. В связи с этим следует полагать, что-одной из. главных функций ДНК-топоизомеразы является участив в транскрипции и репарации ДНК,- основных матричных процессах постмитотических клеток. ДНК-топоизомераза I в нервных клетках может также быть вовлечена в изменение повторяющейся единицы ДНК нуклеосомы, происходящее в процессе созревания нейронов. Это уникальное изменение организации хроматина в норме для высших эукариот известно только в нейронах корн головного мозга (Brown and Greenwood, 1982) и, по-видимому, обусловлено специфическим функционированием генома в этих клетках.

Следует заметить, что наиболее эффективное ингибирование ДНК-тодаизомероазы I нейронов было обнаружено при использовании

Таблица 4

Очистка ДНК-топоизомеразы I нейронов неокортекса крыс

Стадия Белок (мг) Удельная* активность (х 10~2ед/мг) Выход (*) Очистка

I. Неочищенный экстракт 129 0,65 100 I

2. Осаждение (NH^)oSO^ 32,9 2,25 88 3,5

3. Хроматография 1,74 35,58 74 55

на ДНК-агарозе

4. Гель-фильтрация 0,08 125,73 12 193

через G-200

*

I ед. энзима превращает I мкмоль оснований суперспиральной ДНК за 10 мин в релаксироЕаннум форму.

голи(аО), но не других синтетических полидезоксинуклеотидов. Трудно найти удовлетворительное объяснение этому факту. Однако известно, что ДНК-топоизомераза I из тимуса имеет такое же свойство: она избирательно ингибируется поли(сЮ), но не поли(dA), поли(йГ) или поли(йС) (Prell & Voaberg, 1980). Подобно ДНК-топо-изомеразе I из тимуса теленка, нейрональный энзим имеет такие же хроматографические свойства на ДНК-агарозе и большую молекулярную форму: около 100 кДа. Он также полностью осаждается 40-80SS сульфатом аммония. Детальное сходство свойств ДНК-топоизомеразы нейронов и тимуса, по-Еидамому, не случайно. Оно может быть обусловлено некоторым сходством в функционировании ДНК нейронов и тимус-ных клеток. Такое предположение основано на возможности, что мозг и тимус являются уникальными по своей способности хранить приобретенную (ненаследуемую) информацию (Viola et al., 19ТТ). В этих тканях обнаружена терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза млекопитающих, - уникальная нематричная ДНК-полимераза, которая экс-прессирувтся исключительно в лим$оидных Клетках и головном мозге (Viola et al., 197Т; Deibel, 1983). Эта ДНК-полимераза, как предполагается, играет роль в генерации ненаследуемой ДНК (Baltimore, 1974).

4. Обратная транскриптаза кодируется геномом эукариотической клетки.

Обратные транскршггазы (РНК-зависимые ДНК-полимеразы), обнаруживаемые в клетках млекопитандих, могут быть различного происхождения. Хорошо известные энзимы этого типа, идентифицированные в животных клетках при репродукции онкогенных РНК-содержащих вирусов, являются полифункциональными белками, с которыми ассоциированы, по крайней мере, три разных активности, участвующих в генеративном вирусном цикле (Waisa et al., 1984). Кроме того, имеются сообщения о РНК-зависимых ДНК-полимвразах, которые, как предполагают, происходят из эндогенных ретровирусов (Jaenlach, 1983) и поэтому обладают особыми свойствами, отличапцими их от экзогенных энзимов (Frldlendsr et al., 1972; Bauer and Hofachneider, 1976; Lower et al., 1987). 0 другой стороны, в геномах млекопитающих обнаружены генетические элементы, открытая рамка трансляции которых содержит последовательности, гомологичные консервативным областям, типичным для обратных транскршггаз ретровирусов (БШосега and SaaafcL, 1990). Идентификация обратной транскршггазы в неигфцированных клетках млекопитающих представляет большой интерес, являясь ключевым моментом в исследовании фундаментальных проблем организации генома, регуляции экспрессии генов и эволюции организмов, а также специфических функций нервных клеток.

Клонирование н экспрессия в E.coll обратной транскриптазы, кодируемой мобильным генетическим элементов хокей, родственник ЬШЕ-элементам шшкопитапцих (30-32) На различных стадиях онтогенеза дрозофилы были обнаружены In "vivo полиаденилированные транскрипты жокея, которые имели тот ке размер, что и геномные копии шжея, и соответствовали нити ДНК, кодирующей две длинные открытые рамки трансляции (ОРТ) (Kizrokhl et al., 1988). При дальнейшем развитии этого направления исследований было резонно попытаться клонировать предполагаемый ген pol жокея в подходящем экспрессирупцем векторе. Плазмида pJF1 состояла из Bglll-EcoRI фрагмента (F1) геномной копии длиной 8,1 т.п.н., включающего полноразмерный элемент жокей J1 (Prllmagl et al., 1988), в котором отсутствовала часть в 350 п.н. с 5'- конца, и вектора pTJC19. Фрагменты F1, вставленные в pUG19, были обработаны соответствующими рестриктазами, чтобы выделить послэдова-

ельность, которая кодирует предполагаемую обратную транснриптазу ОТ). Это было достигнуто посредством ряда манипуляций, показания на рис.1.

Как результат стратегии клонирования, полученная плззмада iJPOL содержала фрагмент 0РГ2 (длиной 2228 п.н.), определенной :зк ОРТ гена pol элемента хокей (Priiisagi et al., 1988) плюс те s три нуклеотида (GGT.cm. рис.1.), но происходящие из ¡оследовательности pUC9. У 0РТ2 отсутствовали терминальные часта юследовательности длиной 210 п.н. и 307 п.н. с 5'- и З'-концов, «ответственно. Сравнительный анализ последовательности хокей, идируицвй белки, и таких se последовательностей других .ШЕ-элементов, определяющий области гомологии с соответствующим юнсервативными областями, типичными дня ретровирусных ОТ, ¡емонстрировал сохранность этих участкоЕ в фрагменте гена pol Priimagl et al., 1988). Клетки S.coli DH1 трансформировали [лазмидой pJPOL, показанной на рис Л, индуцировали транскрипцию и [риготовили экстракты. Контрольный экстракт получали из клеток, ■рансформировашшх pUC9 ( нэ содержащих гена pol).

гсао хоо *ахз яякп.в.)

?ec.I. Схема конструирования плазмида pJPOL, кодирующей предполагаемую обратную транскриптазу жокей: а расположение открытых рамок трансляции в элементе жокей; б - расположение сайтов рестрикции предполагаемого гена pol; в и в* - последовательности кодонов при З1-концевом участке расщепления рестриктазой Pst1 плазмиды pJPOL, и элемента жокей, соответственно.

Очистка обратной транскриптазы жокей. Для регистрации активности ОТ измеряли включение /%/dTT, используя синтетическую гоморибошшмерную матрицу в 1фисутствии олигонуклеотидных затравок. ДНК-полшеразную активность можно легко обнаружить как в опытных, так и в контрольных неочищенных экстрактах клеток E.coli в реакционной смеси с 100 мкг/ыл поли(гА)/олиго(<И) в качестве матрицы-затравки. Этот результат не является неожиданным. Клеточная ДНК-полимераза I E.coli, как известно транскрибирует все рибонуклетиднае немодифицироЕашше матрицы с относительно высокой интенсивностью, по крайней мере, в условиях In 7itro (lee-Huang and. Cavalierl, 1964; Ctiamberlin, 1965; Karkas, 1973; Loeb et al., 1973). Однако, хроматографические свойства этой полимеразы и вирусных ОТ чэтко различаются (Richardson et al., 1964; Jovin et al., 1969; Vernia, 1975; Hlsi and JokllK, 1977). Штамм E.coli, содержащий, ts poli и т.о. имэнднй низкий фон полимеразной активности в неочищенных экстрактах (Lander et al.,1937), не был использоезн ввиду сложности его культивирования. Поэтому уменьшили концентрацию матрицы-затравки до 3-5 мкг/мл (в зтих условиях активности ДНК-полимераз не обнаруживаются в неочищенных экстрактах, вероятно, из-за присутствию эндогенных нуклваз) и хроматографиро-вали экстракты. Результаты очистки ОТ представлены в табл.5.

Свойства и идентифпсацая очищенного энзима. Рекомбинантная ДНК-полимераза выделена, очищена и исследованы ее некоторые свойства. Этот энзим идентифицировали как обратную транскриптазу на основании энзиматических свойств и отсутствия в контрольных экстрактах E.coli. Как упомянуто выше, различные "нормальные" ДНК-полимэразы, по крайней мере в специфических условиях In ■vitro, могут транскрибировать рибополшэры подходящих матриц-затравок, поэтому необходимо сравнить свойства энзима жокея и ДНК-полимераз E.coli. Анализ показывает, что ДНК-полимеразы этих клеток и исследуемая ОТ различаются по матричной сдащфгшости, молекулярной массе, pHQnT, оптимальным концентрациям ионов и влиянию ингибиторов. Наконец, хроматографические свойства ОТ хакея на ДЭАЭ-целлшозе и/или фссфоцеллюлозе четко отличаются от таких свойств бактериальных ДНК-полимераз (Richardson et al., 1964; Knippers, 1970; Kornberg and Geiter, 1971; Gefter et al., 1971; Cajnpbell et al., 1972).

Рекомбинантная ОТ жокея относится к типу энзимов, подобных

Таблица 5

Очистка обратной транскриптазы жокея

Стадия

Белок Удельная Выход (мг) активность {%) (ед/мг)

Очистка

1. Неочищенный экстракт 252,4

2. Гель-фильтрация 176,8 через G-S5

3. Хроматография 5,3 11,2 на ДЗАЭ-целлшюзе

4. Хроматография 0,31 134 на фосфоцеллвлозе

5. Гель-фильтрация 0,04 425 через G-200

loci*

70

29

т**

12

38

I ед. энзима включает I шоль нуклеотидов в состав полимера за 15 мин при 26°С.

*0чистка и выход активного белка вычислены относительно стадии хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе, потому что энзиматическая активность не определяется в неочищенных фракциях в описанных условиях реакции (см. "Очистка обратной транскриптазы жокей")

ретровирусным РНК-зэеисимым ДНК-полимеразач, т.е. предпочитает полирибонуклеотида и может использовать поли(гСт) в качестве матрицы, ингибируегся SH-реагентами, нуждается в двухвалентных катионах (Mg или Кп) и детергенте и/или КС1. Но ДНК-полимераза жокея отличается рядом каталитических свойств (табл.6). Ее температурный оптимум равен 26°0 в отличив от ретровирусных ОТ, которые проявляют максимальную активность при t° не ниже 37°С. Температурная чувствительность роста и трансформации некоторых мутантов BSV коррелирует. с термолабильностью их ДНК-полимеразы, ассоциированной с вирионом (Verraa et al., 19Т4), т.е. оптимальная

1Т

\

Таблица б

ХАРАКТЕРИСТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ОТ I О К В Я И РЕТРОВИРУСННХ ДНК-ПО Л ИМЕР43

Количество Мол.масса „ тЛ+л г ,,„24, «... Активность

субъедшш* Р»ош *Чпт ^м,0™ („м,0™ Шаыяшкг^ тззы н Семка

(нЦа) (- или +)

ОТ хотя I

от И-И7 I

92

8,5 26

1,0

2,0

0,1

1,0

0,38

0,28

за

дзннэя работа

[ Уегта,1975 I

ОТ ШГ

Э5 63

7,6 37

[ Рагаз ег а1., 1972 I

Рекомби-нантная ОТ ЯЗУ

97 65

7,07,6

ю.о

0,150,20

[СПетот е1; а1. 19911

10.0

1.01

1.13

2

Прил&ияше. Все параметры относятся к олтималътаал для крвдставленйнз. ДНН-полимйргз ус-чаекя;.*. реакцга с пел:; 1 г Л 1/с,"::т (&Т) е хачзстзе мзтрязца-ззтрэвки.

(функциональная) температура реакции, по-видимому, обусловлена свойством самой молекулы ОТ. Следует заметить, что оптимальная температура культивирования дрозофилы равна 2В°С. Такая же опти-яальная температура реакции означает, что эта ОТ является реком-Зинантным гомологом подлинного энзима дрозофилы и что такой энзим зовлекается в функционирование генома этого организма.

Новобиоцин, ингибитор репликации и транскрипции, как гевестно, подавляет активности различных полимераз (Sung, 1974; fattern and. Painter, 1979). Он также ингибирует ОТ жокея. Сонцентрация новобиоцина (1мМ), полностью ингибирущая реакцию (2% оставшейся активности), является той же самой концентрацией антибиотика, которая действует на геномные энзимы в различных жспериментальных моделях (Snyder et al., 1982; Ivanov, 1988). Саконец, важным свойством ОТ жокея является отсутствие активности ЖСазы Н. Следует заметить, что элемент жокей не содержит ¡уклеотидных последовательностей, гомологичных консервативным збластям РНКазы Н (Prlimagl et al., 1988).

Можно отметить детальное сходство сеойств рекомбинантной ОТ BV и ОТ, ассоциированной с вирионами (Farua et al., 1972; Jhernov et al., 1991). Следует полагать, что специфические звойства ОТ жокея, исследованной здесь, также подобны свойствам jтого энзима, экспрессируемого in vivo. Результаты этих исследо-заний позволяют предполагать, что РНН-зависимая ДНК-голимераза, содируемая элементом жокей, может участвовать в транспозиции этих элементов, где следующий этап катализируется РНКазой Н, которая также обнаружена в клетках дрозофилы, как ее собственный монофункциональный энзим (DiPranceaco & Lehman, 1985).

5.Обратная транскрштаза головного ыозга крыс (33)

Эндогенная обратная транекриптаза обнаружена в субклеточной фракции эмбриональной карциномы BTera2D1 вместе с тРНК-копией jINE (Deragon et al., 1990), и авторы предполагают, чтб такой >нзим появился в результате экспрессии мобильного элемента.

В нормальных соматических клетках было обнаружено юзначительное количество транскриптов. И. Однако, такие фанскрипты можно найти в клетках тератокарциномы человека, фоявляющих эмбриональный фенотип. Следует полагать, что jINE-элементы в норме экспрессируются в раннем онтогенезе [эмбриональных клетках) млекопитающих. Кроме того, амплификация jIHE-элементов также происходит, по-видимому, в этот период.

Клетки головного мозга крыс представляют удобную модельную систему для исследования экспрессии bINE-элементов (энзимов синтеза ДНК). Нервные клетки можно идентифицировать и получать в высоко-очищенном виде на любом этапе их развития: от нейробласта - цро-лиферирунцей клетки-предшественника (на поздних стадиях эмбриогенеза) через неделящийся незрелый нейрон (в раннем постнатальном онтогенезе) до необратимо дифференцированного постмитотического нейрона. Формирование популяций нейронов неокортекса завершается уже к моменту рождения животных, и динамика активности нейронзль-ных ДНК-полимераз а, ß и 7 в процессе онтогенеза является строго специфической и соответствует функциональной роли каждого энзима (Hubacher et al., 1979). Кроме того, дифференцированные, перманентно неделящиеся нервные клетки, как известно, не трансформируются, т.е. не обеспечивают репродукции онкогенных РНК-содержащих вирусов и, очевидно, не могут быть источником экзогенной ретрови-русной обратной транскриптазы.

В работе использовали крыс Вистар трех возрастных групп: новорожденных, 14- и 30-дневных. Из ткани .неокортекса выделяли нервные клетки, используя известный метод (Sellinger et al., 1971) с небольшими модификациями.

Для исследования активности тотальных гомогенатов клетки, тщательно лизировали в присутствии неионного детергента NP-40. ДНК-полимеразная активность с поли(гА) в качестве матрицы была еысокой и неизменной во всех трех группах животных, а с метилированой матрицей поли(гСт) существенно уменьшалась к 14-дн возрасту; активность РНКазы Н падала более, чем в 10 раз (рис.2). Хорошо известно ,что активность ДНК-полимеразы а в нейронах неокортекса, которые прекращают деление перед рождением крыс, быстро падает в раннем постнатальном онтогенезе и не обнаруживается после 30-дн возраста; в то же время активности ДНК-полимераз ß и 7 не коррелируют со скоростью клеточного деления и остаются почти постоянными в течение жизни животного (Kunzle et al., 1978; Hübscher et al., 1979; Inoue et al., 1979; Bradschaw & Schneider, 1980). Известно также, что ДНК-полимераза 7, в отличие от а и ß, проявляют высокую активность с матрицей поли(гА), и все три ДНК-полимеразы не могут использовать метилированную матрицу поли(гСт), которая оказывается высокоспещфкной для ретровирусных обратных транскриптаз (Chandra & Steel, 1977; Gerald et al., 1974). Наблюдаемая здесь с поли(гА) ДНК-полимераз-

Вчараст. днн

Рис.2. РНК-зависимая ДНК-полнмеразная активность и РНКаза Н в нейронах неокортекса развивающихся крыс. 1 - полимераз-ная активность при использовании матрицы поли(гА): радиоактивность 13Н1с1ТТР, включенная в полимер, выражена в имп(х1СГ^)/мин х мг белка; 2 - полимеразная активность при использовании матрицы поли(гСш): радиоактивность [а-32Р1 сКТР, включенная в полимер, выражена в имп(хЮ-^)/мин х мг белка; 3 - активность РНКазы Н: радиоактивность гидролизованного полимера 13Н)поли(гА)/поли(йТ) выражена в имп(хЮ-4)/мин х мг белка.

ная активность обусловлена, в основном, ДНК-полимеразой 7. Неиз-извэстный ранее в клетках головного мозга белок-носитель активности, определяемой с метилированной матрицей, мы будем называть обратной транскриптазой по аналогии с ретровирусным ферментом.

О обратной транскриптазой ретровирусов ассоциирована активность РНКазы Н, которая специфически гидролизует РНК в составе ДНК-РНК гибрида (*е1за е! а1., 1984). Обратная транскрип-таза,которую кодирует геном эукариотической клетки (ЫКЕ-элемент) не имеет такой активности (см. выше), но все эукариотические клетки содержат свободную РНКазу Н, доказанная функция которой связана с репликацией ДНК. Динамика активности РНКазы Н, выявленная в настоящей работе, напоминает описанное ранее поведение свободной РНКазы Н в клетках головного мозга (Ба»а1 еХ а!.,1980).

Для дальнейшего анализа обратной транскриптазы нейроны выделяли из ткани неокортекса новорожденных крыс и проводили субклеточное фракционирование посредством последовательных центрифугирований для шделания фракций ядер, митохондрий и макросом. После лизиса определяли ДНК-полимеразнуга активность в этих фракциях и постмикросомальном сударнатанте. Наиболее шсокая удельная активность с метилированной матрицей была обнаружена в микросомах. Равновесное центрифугирование в градиента плотности (20-60Ж) сахарозы показало, что самая активная фракция микросом (фракция 10 на рис.3) имеет плотность =1,20 г/см .которая подобна плотности ретроЕирусных частиц, измеренной е сходных экспериментальных условиях (?(е1аэ et а1., 1984). Следует заметить, что давно описана ДНК-полимараза в тотальном препарате клеток головного мозга крыс, ассоциированная с фракцией микросом плотностью 1,24 г/см , которая проявляла более высокую активность

Рис.3. Равновесное центрифугирование в градиенте плотности сахарозы микросомальной фракции нейронов неокортекса крыс. I - активность обратной транскриптазы (матрица - поли(гСш)

о р

представлена как радиоактивность [а- РМОТР, включенная в полимер; 2 - градиент плотности сахарозы.

с матрицей поли(гА), чем с поли(й4). Она не была идентифицирована в достаточной мере, но на основании приведенных в оригинальной статье фактов можно предполагать ее отличие от известных

клеточных ДКК-зэнисжых ДНК-полимераз (tVitkin and. Schumaker, 19ТТ).

Чтобн очистить обратную транскриптазу, лизировали микросомальную фракцию 10, после диализа экстракт наносили на колонку с фзсфэцеллвлозой pli и элюировали линейным градиентом К01. Эта хроматография обеспечивает разделение белкового экстракта на единственную фракции обратной транскриптазы и две фракции РНКазы H (рис.4.). Можно отметить, что две последние фракции с пиками элюции » 180 мМ и « 400 мМ К01, соответствуют, очевидно, двум формам этого фермента, обнаруженным ранее в клетках головного мозга крыс (Sawal et al., 1980). Таким образом, исследуемая обратная транскриптаза не ассоциирована с РНКазой Н.

Рис.4. Хроматография на фосфоцеллюлозе полимеразной фракции белков микросомального экстракта нейронов неокортекса крыс. I - активность РНКазы Н: радиоактивность гидро-лизованного полимера [3Н1поли(гА)/поли(сИ) выражена в имп(хЮ-3)/мин х мг белка; 2 - активность обратной транскриптазы выражена как на рис.2.

Активные фракции, элшрованные с фосфоцеллшозы 240-280 мМ К01, соединили, обессолили и сконцентрировали даализом, затем наслоили на градиент концентрации (5-20Ж) сахарозы. После центрифугирования во фракциях определяли ДНК-полимеразную активность, используя матрицы поли(гА) и поли(гСш). Активность, специфичная для поли(гОш), располагается в узкой зоне градиента и четко

отделяется от фракции FHK-зависимой ДНК-полимеразной активности, определяемой с матрицей поли(гА) (рис.5). Необходимо отметить, что NP-40 и KCl обязательны для сохранения активности в процессе выделения и очистки обратной трвнскриптвзы нейронов. Но и в присутствии этих компонентов энзим не стабилен. Так, очищенный препарат обратной транскриптазы, полученный после центрифугирования в градиенте концентрации сахарозы, при +2°С теряет 50-70% активности после хранения в течение 2 дней. Хранение при -20°С в 50% глицерине также не эффективно (не более I0S остаточной активности после 7-дн хранения). По степени лабильности обратная транскриптаза нейронов напоминает энзим, который, по-видимому, появляется в результате экспрессии LINE-элемента в эмбриональных клетках карциномы HTera2DI (Deragpn et al., 1990).

Номер фракции

Рис.5. Очистка обратной транскриптазы нейронов неокортекса крыс посредством центрифугирования в градиенте концентрации сахарозы. I - полимеразная активность при использовании матрицы поли(гА) выражена как на рис.1; 2 - активность обратной транскриптазы выражена как на рис.2; сверху показано положение маркерной фракции гемоглобина НЬ.

В табл.7.приводится активность полученного препарата обратной транскриптазы, определенная с различными матрицами. Обратная транскриптаза голошого мозга использует метилированную матрицу почти также эффективно, как поли(гС)/олиго(с1(1). Фермент предпочитает Мп (который можно заменить на Mg с потерей активности почти в 2 раза). Активность не обнаруживается в отсутствие поли(гСт) и/ или олиго(dG). Такая матричная специфичность соответствует обратной транскриптаза и резко отличается от специфичности клеточных ДНК-зависимых ДНК-полимераз (Gerald, et al-, 1974).

Таблица 7.

Активность обратной транскриптазы нейроноЕ неокортекса крыс при использовании различных матриц

Радиоактивность

Матрица Затравка Условия реакции [имп/мин на пробу

(20 мкг белка)]

поли(гС) олиго(dG) Стандартные 865

поли(гСт) олиго(dG) Стандартные '751

поли(гСш) олиго(dG) - 34

поли(гСт) олиго(ÖG) 392

поли(гСт) - - затравка 46

- олиго(dG) - матрица 35

- - - матрица и 28

затравка

Энзим идентифицирован как обратная транскриптаза на основании использования специфической матрицы поли(гСт) и ассоциации с мак-ромолекулярннм комплексом, имеющим характеристики вирусоподобной частицы. От клеточных ДНК-зависюгых ДНК-полимераз обратная тран-транскриптаза нейронов отличается матричной специфичностью, внутриклеточной локализацией, хроматографгческш поведением на фосфо-цэллшозе и положением на градиенте плотности сахарозы, а также динамикой активности в процессе онтогенеза. Как упомянуто выше,

перманентно неделящиеся клетки, такие как нейроны, не обеспечивают необходимых условий для репродукции ретровирусоЕ. Поэтому обнаруженная в них обратная транскриптаза не может быть типичным вирусным энзимом. Отсутствие ассоциированной с энзиматичэским белком активности РНКазы Н подтверждает это. Специфической чертой исследуемой обратной транскриптазы является очень еысокзя лабильность /которая характерна только для энзима, кодируемого мобильным ЬШЕ-элементом (Бегадоп е1; а1., 1990)/ и зависимость активности от КР-40.

ПЕРЕРАСПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ЭНЗША В СУБФРАКЦИЯХ ХРОМАТИНА, СВЯЗАННОЕ С ИНИЦИАЦИЕЙ ЕГО КЛЕТОЧНОЙ ФУНКЦШ

Изменение активности энзимов в результате повреждающих воздействий является адаптивным ответом клетки, который может отражать участие этих энзимов в процессах восстановления функциональной целостности структур клетки. Одним из механизмов регуляции активности энзима является посттрансляционная энзиматическая модификация белка, которая модифицирует структуру и приводит к соответствующему изменению каталитической активности. Наиболее интересным, по-видимому, является исследование индуцированного перераспределения (функциональной компартментализащш.) активного анзиматического белка среди клеточных, ядерных или хроматиновых субфракций, обусловленного, избирательной модификацией локальных внутриклеточных пулов энзима. Существует ряд фактов, на основании которых можно предполагать, что энзиматический процесс в хроматине локализован в доменах, которые характеризуются еысокой солевой стабильностью. Тогда инициация этого процесса может сопровождаться перераспределением энзима (участвующего в данном процесса) из легко растворимых фракций во фракцию хроматина, растворимую при высоких концентрациях соли.

Модельную клеточную систему, в которой тестируется перераспределение активности в результате функционально значимого для клетки внешнего воздействия, можно использовать двояким образом: как для исследования функции энзима, так и для изучения механизмов регуляции процесса, контролируемого этим энзимом. Здесь представлено подобное исследование ДНК-топоизомеразы I в клеточной системе дифференцирующихся нейронов.

I. ДНК-тспсизомервза I (12,25) В процесса исследования ДНК-топоизомеразы I было показано, что количество энзиматической активности в расчете на ядро нервной клетки остается постоянным от 18 дн. эмбрионов до 60 дн. постнатальных животных. На основании таких данных можно предполагать, что функция ДНК-топоизомеразы I в нейронах связана с транскрипцией и/или репарацией ДНК. Этот результат был повторен через 2 года японскими автора*ли (Таи1;зи1 et а!., 1986). ДНК-топоизоме-раза, как известно, ассоциирована с хроматином. Была сделана попытка исследовать солевую зависимость такого взаимодействия в нервных клетках 18 дн. эмбрионов, а также 14- и 60 дн. крыс. Для этого отдельные аликвоты выделенного хроматина обрабатывали различными концентрациями НаС1, и ДНК с оставшимися белками удаляли осаадением полиэтиленгликолем. Энзиматичвскую активность, элюиро-ванную из хроматиновых препаратов I М НаС1, принимали за 100% (рис.6).

Рис.6. Солевая элюция ДНК-топоизомеразы из хроматина нервных клеток головного мозга развивающихся крас. Количество ДНК-peлаксируицей активности, элюированной из хроматина: (А) нейробластов (18-дн эмбрионы); (Б) незрелых нейронов (14-дн киеотныэ); и (В) тврлинально диф&эренцироЕанных нейронов' (60-дн животные), - было измерено как функция концентрации №01. Каждая фракция была получена из аликвот препаратов хроматина, экстрагированных 0,1, 0,3, 0,5, 0,8 или 1,0 M NaCl. Количество активности, найденной в 1,0 M NaCl (равное I х Ю-3 ед/проба), принято за 10036.

Концентрация соли, необходимая для элюции энзима ив хроматина, строго зависит от стадии развития нервных клеток. Для дифференцированного нейронального хроматина, по крайней мере, 90% ак-

тивности элшровалось в 3QQ мМ NaGl, в то время как только ~ 25% активности было удалено из хроматина нейробластов при этой же концентрации соли. 700 мМ NaCl или более высокая концентрация соли необходимы чтобы удалить 90S активности из хроматина нейробластов. График солевой элюции эндогенного энзима из хроматина нейробластов и дифференцированных нейронов нзпоминает кривую элюции активности ДНК-топоизомеразы I из хроматина растущих и покоящихся культивируемых ЗТЗ клеток (McConaughy et al., 1981)'. Как в случае активности ДНК-топоизомеразы I хроматина ЗТЗ клеток, более 70% активности остаются связанными с хроматином нейробластов ("растущих" клеток) в 300 мМ NaOl, и 90% активности элюирувгся из хроматина зрелых нейронов ("покоящихся" клеток) при этой же концентрации соли. На основании таких данных можно сделать еывод, что степень ассоциации этого энзима с хроматином является функцией стадии развития клетки.

Затем было проведено исследование участия ДНК-топоизомеразы в процессе репарации ДНК. Для этого тестировали солевую зависимость взаимодействия энзима с хроматином зрелых нейронов неокор-текса после 7-облучения животных или инкубируемых срезов (рис.7). Было обнаружено, что активность ДНК-топоизомеразы в хроматиновых экстрактах нейронов после облучения увеличивается не равномерно. Наиболее выраженные относительные изменения обнаружены при кон-концентрации соли >400 мМ. Присутствие новобиоцина (ингибитора транскрипции" и репарации ДНК) препятствует эффектам облучения. Было показано, что используемое облучение на изменяет выхода тотальных белков хроматина. Поэтому удельная активность этого энзима (ед./мкг балка) пропорциональна количеству активности (ед./ проба) в хроматиновых экстрактах нативных и облученных клеток, приготовленных при каждой концентрации соли. Следовательно, увеличивается удельная активность этого энзима после облучения лишь в хроматиновых экстрактах, полученных в >400 мМ NaCl. Эти данные позволяют предполагать, что активность только плотно-СЕязан-ного пула энзима (элюирувмого в >400 мМ NaCl) модифицируется, в то время как активность легко растворимого пула не изменяется.

Зависимое от облучения перераспределение активности ДНК-топоизомеразы I в "устойчивые к соли" фракции хроматина нервных клеток может быть обусловлено активацией 1л vivo репарации ДНК. .Подобный феномен обнаружен для активности ДНК-полимеразы а в регенерирущей печени крыс (Smith and Berezney, 1983). Эти авторы показали перераспределение ДНК-полимеразной активности среди

Концентрация tiaCl, M I

Рис.7. Солевая апяция ДНК-топоизомеразы нейронов из хроматина неокортекса крыс. Ядврше фракции были выделены из облученных или нэоблучешых (контрольных) животных, и облученных или необлученных (контрольных) срезов, инкубированных в присутствии новобиоцина (или без него ). Ядра каждой фракции разделили на 5 аликвот (2 х I06 ядер в наядой) и обработали 0,1, 0,3, 0,5, 0,8 или 1,0 M KaCl, соответственно. Определяли ДНН-релаксирущую активность, элшрованнуа из хроматина (•) нативнах нейронов и (О) облученных нейронов как функции концентрации NaOl. Количество активности, найденной в 1,0 M KaCl экстрактах хроматина нативных нейронов (равное 1,0 ед/проба), принято за 100®. А - нейроны, облученные In vivo; Б - нейроны, облученные In vitro; В - нейроны, облученные in vitro в присутствии новобиощша (X мМ).

ядерных субфракций в течение репликации 1п у!уо. Наиболее замечательно "движение" этой активности к ядерному матриксу, которое может представлять прямое "превращение" энзима из функционально не активного (растворимого при низкой концентрации соли), в функционально активное (еысоко резистентное к соли) матрикс-связанноа состояние. Вариации активности ДНК-топоизомера-зы I нейронов, обнаруженные в настоящей работе, показывает, что энзим вовлекается в репарации ДНК нервных клеток. Эти выводы подтверждаются результатами, полученными при исследовании кислой ДНКазы в сперматозоидах Еьюна.

2. Кислая ДНКаза в спер^атозсндах вьша (34)

Очистка и вдентифшшцая знзиыа. Ранее сообщалось о физиологической релаксации In vivo сутрспиральной ДНК сперматозоидов вьша (Sp-клэток) в летний сезон (Nectiaeysky et al., 1983), что предполагает присутствие соотЕетствундего энзима (или энзимов) в этих клетках. Здесь экстракт Sp-клеток тестировали в стандартных условиях реакции эукариотических ДНК-топоизомераз типа I и II, а также эндонуклаазной реакции. Эта фракция характеризовалась активностью кислой ДНКазы, которая нэ нувдалась в присутствии двухвалентных катионов, но не ДНК-тогоизомеразными активностями. Как известно, кислая ДНКаза (ДНКазаП) очень широко распространена в животных клетках. Такая активность обнаружена и в сперматозоидах скумбрии в следовых количествах, но свойства ее в этих клетках не исследованы. Поэтому попытались очистить ДНКазную активность для идентификации энзима сперматозоидов вьюна.

Очистка, результаты которой представлены е табл.8, дает 70-кратное увеличение активности кислой ДНКаза, по сравнению с неочищенным экстрактом SF-клеток, с выходом 9%. Кислая SP-ДНКаза проявляет максимальную активность при рН 5,5. Энзим активен в диапозоне температур Q-4Q°C с выраженным оптимумом при 14°С. При 0°0 скорость гидролиза ДНК слабо ингибировалась (>80Ж максимальной скорости). Активность ингибируется Kg и слабо стимулируется Na,EDTA в низких концентрациях (1-5 мМ). Максимум активности наблюдается в реакционной смеси, содержащей 10 MU ацетата натрия и 80 мМ КС1. При более низкой и более высокой ионных силах скорость гидролиза ДНК уменьшается. Кислая SP-ДНКаза расщепляет нативную суперспиральную ковалентно связанную ДНК плззмиды pUC19 с накоплением исключительно линейной форг.гы.

Этот энзим, подобно ДНКазе II, широко распространенной в различных источниках (Swingle & Cole, 1964-; Cordmnler & Bernard!, 1968; Lesea, 1968; Bernard!, 1971; Slor, 1873; УалашКа et al., 1974; lesea, 1976), гидролизует ДНК эндонуклеолитически при кислом рНшт в отсутствие двухвалентных катионов. Он может активироваться HagЮТА и ингибироваться Kg. Таким образом, ДНКаза SP-клеток выша относится к типу энзимов, подобных ДНКазе II млекопитающих, однако она имеет некоторые специфические свойства: гидролизует суперспиральную ДНК до линейной формы без накопления, в тестируемых количествах, интермедиата (кольцевой ДНК с разрывом в одной цепи), с температурным оптимумом при 14° и существенной активностью при Q°G.

Таблица 8 Очистка ДНК-азы сперматозоидов вьюна

Стадия

Белок Удельная Выход (мкг) актианость {%) (ед/йкг)

Очистка

1. Неочищенный экстракт 5790 5,1

2. Диализат 5X20 5,7

3. Хроматография 310 89 на ДЭАЭ-целлшозе

4. Хроматография 8 354 на фосфоцеллюлозе

100 99 93

I 1,1 17

69

I ед. энзима превращает 1,0 мкг суперспиральной рИС19 ДНК за 60 мин при 14°С в линейную форму.

9

Субклеточная локализация БР-энзима. Большинство кислой ДНКазной активности, как показано, ассоциировано с лизосомами в различных клетках и животных тканях, но не в SP-клетках (Cordonnier and Bernard!; 1968; Bernardi, 1971; Bulaney and Touater, 19T2). G другой стороны кислая ДНКаза обнаружена также в ядерных фракциях печени 1фыс (Swingle and Cole, 1964), печени мышей (Lesca, 1968), тимуса теленка (Slor and Ley, 1971), и клеток Hela (Slor, 1973). Следует предполагать, что кислая ДНКаза в животных клетках существует в виде двух пулов: большого лизосомального и малого ядерного, - которые могут играть различные биологические роли. SP-клетки вьюнов не имеют лизосом или родственных им органелл (также и цитоплазмы, которая в таких клетках этих и других видов животных почти полностью элиминирована), и поэтому Sp-ДНКаза существует только ввиде ядерного пула: более 90% общей ДНКазной активности было обнаружено во фракции ядер SP-клеток. В предварительных экспериментах было показано, что энзиматический белок может взаимодействовать с хроматином облученных SP-клеток. Чтобы изучить это явление, исследовали дозовую зависимость взаимодействия энзима с хроматином после гамма-облучения зрелых SP-клеток. .

Солевая алилия ДНКазы из облученных SP-клеток. Для этой цели отдельные аликвоты выделенных SP-клеток облучали различными дозами и получали экстракты, удаляя ДЩ, с оставшимися ассоциированными белками, осаждением полиэтиленгликолем. Энзиматическую активность, элюированную из необлученных клеток, принимали за 100%. Выход энзима зависел от дозы облучения. При 20 рад, по крайней мере, 6056 активности элшровались в низко солевых экстрактах, в то время как только 20% этой энзиматической активности было элкжровано при 100 рад (рис.8А). Результаты показывают, что облучение увеличивает ассоциацию ДНКазы с хроматином.

Чтобы исследовать солевую зависимость этого взаимодействия, облученные при 100 рад клетки делили на 5 аликвот, отдельные аликвоты обрабатывали различными концентрациями NaCl и ДНК с оставшимися ассоциированными белками удаляли как описано выше. Энзиматическую активность, элюированную из лизированных при 2 М NaCl клеток, принимали за 100%. Результаты, представленные на рис.ВБ, показывают увеличение выхода кислой ДНКазы в опытных

Рис.в.Элюция кислой ДНКазы из облученных SP-клеток. Было измерено количество ДНКазной активности элюированной из: (А) -клеток, облученных различными дозами (элюция посредством 0,14 М NaCl); и (Б) - клеток, облученных дозой 100 рад, как функция концентрации NaOl. Каждая фракция была приготовлена из аликвот клеток, облученных 20, 50, 100, 200, 500 или 1000 рад, соответственно (в - левая диаграмма), и облученных единичной дозой (• -) или необлученных (0 - правая диаграмма). Количество активности, найденной в 0,14 М экстрактах необлученных клеток (5 х Ю-* ед/проба), принимали га 100%.

экстрактах в зависимости от концентрации соли, в то время как в экстрактах необлучэнных клеток (контроль) выход энзима оставался постоянным при всех исследованных концентрациях соли и соответствовал максимальной активности (количеству) энзима. Обусловленное облучением перераспределение активности кислой ДНКазы среди хроматиновых субфракций SP-клеток, очевидно, связано с инициацией деградации ДНК. Результаты этой работы подтверждают феномен ассоциации с нейрональннм хроматином другого энзима, ДНК-тогоизомеразы I, - в зависимости от активности генома (инициации энзиматической функции).

функция кислой ДНКазы неизвестна, однако следует полагать, что ядерный пул энзима может участвовать в таких важных процессах как репликация или транскрипция. Обнаружение кислой ДНКазной активности, ассоциированной с лизосомами (лизосомальный пул), которые, как известно, содержат все энзимы, необходимые для деградации нуклеиновых кислот, позволяет предполать, что кислая ДНКаза вовлекается в деградацию ДНК. На основании фактов, полученных в этой работе и известных ранее, можно полагать, что кислая ДНКаза в SP-клетках вьюна элиминирует повреаденную ДНК, приводя к элиминации дефектные SP-клетки. Чтобы обеспечить эту функцию кислая ДННвза обладает подходящими свойствами: предпочитает атаковать двухцепочечную ДНК (Yanamaka et al., 1974; Хеаса, 1976), после первого одноцепочечного разрыва может сразу и в непосредственной близости от него расщеплять комплементарную цепь, приводя к быстрому формированию двухцепочечных разрывов (Taubota et al.,' 1974-), является оц-ДНК-связывающим белком, которому необходима именно одна цепь для ' связывания (это позволяет связываться с оц-сайтами нативной суперспиральной ДНК (Drew, 1984), и, как показано в данном исследовании, "достигает генома", чтобы действовать на ДНК (ассоциируется с хроматином после повреждения ДНК).

РЕПАРАЦИЯ ЭКСПЕРШЕИШЬНО ИНДУЦИРОВАННЫХ ПОВРЕЖДЕНИИ ДНК (17,20,21,26)

Отсутствие решшкативного синтеза ДНК при длительном времени жизни нейрона, которое сравнимо с длительностью жизни организма, обуславливает особое значение репарации повреждений ДНК для поддержания функциональной целостности генома нервной, клетки. Однако, на основании экспериментальных фактов высказывается мнение о дефзктности репарации индуцированных повревдений ДНК в

перманентно неделящихся высоко дифференцированных нервных клетках (Kleihuea & Bucïieler, 1977; Wang & ffiieeler, 1978; Damberga & Kid-son, 1977, 1979; Heiting and Veer, 1981). Вместе с тем следует полагать, что репарация ДНК в клетках головного мозга должна быть более точной и эффективной, чем в других тканях организма, так как от функциональной целостности экспрессируемых генов нервных клеток прежде всего зависит выживаемость (адаптивный поведенческий ответ) животного.

В настоящем исследовании идентифицированы энзимы системы репарации ДНК нейронов и представлены доказательства, что ДНК-топоизомераза I в этих клетках также участвует в репаративном процессе. Наличие активных высокоспециализированных энзимов в нейронах, индуцированное изменение энзиматической активности, обнаруженное для некоторых из них, а, с другой стороны, низкий уровень репаративного синтеза ДНК, тестируемый да включению меченого предавственника, заставили предположить, что процесс репарации ДНК является избирательным (избирательная репарация ограниченного числа последовательностей генома, например, активных генов). В этом плане необходимо было попытаться исследовать возможный механизм, посредством которого происходит этот выбор рвпарируемых последовательностей. Известно, что процесс созревания нейронов неокортекса сопровождается уникальным сокращением размеров вуклеосомной ДНК и уменьшением количества ДНК-полимеразы а, которая отсутствует в зрелых нервных клетках. Поэтому нейроны в течение онтогенеза предоставляют уникальную возможность исследовать влияние структуры хроматина и содержания ДНК-полимеразы а на процессы репарации ДНК.

Исследовали синтез ядерной ДНК в нейронах неокортекса новорожденных, 14- и 60-суточных крыс после облучения in vitro изолированных срезов по включению меченого предшественника в ДНК. УФ- и 7-излучение повышают интенсивность синтеза ДНН в клетках всех представленных возрастных групп животных. Однако репарационная активность УФ-облученных нейронов резко падает в процессе постнатального онтогенеза, в то время как эта активность ^-облученных клеток уменьшается в меньшей степени. Такой факт, по-видимому, можно объяснить существованием двух, известных в не нервных клетках, путей репаративного синтеза ДНК: короткими (7-тип) и длинными (УФ-тип) фрагментами (Grossman, 1981). Предполагается, что репарация ДНК длинными фрагментами происходит с участием ДНК-полимерззн а. В то же время известно,

что процесс развития нервной клетки сопровождается снижением содержания ДНК-полимеразы а, которая в нейронах неокортекса крыс после 30 сут постнатального онтогенеза полностью отсутствует (Bubscher et al., 1979). Следовательно, ДНК-полимераза а в нервных клетках принимает участие в репарации УФ-повреждений ДНК. Такое предположение подтверждают другие автора, которые наблюдали полное блокирование УФ-индуцированного синтеза ДНК в культуре нейрональннх клеток мозжечка мышей в условиях ингибирования ДНК-полимеразы а (Llcastro et al., 1985).

Можно отметить также некоторое уменьшение величины 7-индуцироваиного синтеза ДНК в процессе развития. Этот результат хорошо согласуется с обнаруженным в экспериментах In rivo медленным процессом репаративного синтеза ДНК в нервных клетках. Падение индуцированного синтеза ДНК в процессе постнатальной дифференциации нейронов неокортекса в исследуемый период развития может быть обусловлено сокращением длины нуклеосомной единицы хроматина, что сопровождается уменьшением доступности ДНК действию энзимов репарации. Действительно, индуцированный синтез ДНК в клетках печени почти не отличается от синтеза в нейронах новорожденных крас, размер нуклеосош которых еще не изменился.

На основании этих данных можно говорить о том, что уменьшение скорости репарации ДНК в нервных клетках происходит в процессе постнатальной дифференциации нейрона. Это предположение поддерживается данными о высокой скорости репарации повреждений ДНК в клетках эмбрионального мозга, идентичной для различных пренатальшх тканей (Wani et al., 1985). >

В процессе исследования феномена репаративного синтеза ДНК накопилось огромное количество экспериментального материала (полученного при использовании не нервных тканей), который можно представить в виде следупцих положений: I) повреждения ДНК блокируют транскрипцию на уровне матрицы; 2) репарация ДНК структурно связана с другими матричными процессами (единство большого ряда энзимов и факторов, физическая ассоциация типичных репарационных энзимов с энзимами других процессов синтеза нуклеиновых кислот; 3) активность систем репарации ДНК в пролиферирущих клетках несравнимо выше, чем в покоящихся; 4) в дифференцированных клетках сохраняются многочисленные повреждения ДНК и в то же время избирательно репарируются гены, активные в транскрипции; 5) не существует связи между интенсивностью

репарации ДНК и выживаемостью (функциональной активностью) клеток. Чтобы объяснить эти факты в совокупности, была предложена концепция (см.статьи 24,27-29), которую можно сформулировать следующим образом:

НатиЕНый процесс функционирования клетки сопровождается нарушениями канонической структуры ДНК, как случайными (эндогенными и экзогенными), так и индуцированными посредством клеточных систем модификации. Эти нарушения являются генетическими сигналами, которые в норма блокируют активность ДНК-матрица. Репарация ДНК, элиминируя нарушения, разрешает копирование исправленной ДНК-матрицы, кодирующей интактную генетическую информацию.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Энзпш выделяли из коры головного мозга (неокортекса) или нейронов неокортекса крыс линии Wistar. Ряд экспериментов по анализу степени ассоциации ДНК-топокзомеразы с хроматином нейронов проводили на шрегяЕащих срезах неокортекса. Ядра нейронов неокортекса выделяли из предварительно полученного (Ъу Selltnger et al.,1971) препарата нервных клеток (перикзряонов) и идентифицировали, определяя длину повторяющейся единицы ДНК хроматина (ПЕ) /известно,что длина ПЕ в нейронах неокортекса крыс составляет „ 160 п.н. протйЕ ~200 п.н. в глиальных клетках (Thomas & Thompson, 1977)/. Нейроны неокортекса - модельная система для изучения энзимов синтеза ДНК, разработанная в настоящем исследовании экспериментально и теоретически (см.обзоры:16,24,27-29)/. Методы выделения, очистки и идентификации энзимов головного мозга крыс: ДНК-азы Bill, ДНК-топоизомеразы, АД-ДНКазы и обратной транскриптазы, - предложенные в настоящем исследовании, детально описаны в соответствующих оригинальных статьях (11,12,15,22,33). (¿етод, предложенный для анализа функциональной активации ДНК-топоизоыераза (исследования репаративной функции энзима), основан на определении степени ассоциации этого энзима с хроматином нейронов (12, 25). (католический подход для исследования In vitro специфических свойств энзимов, обеспечивающих их участие в координированном процессе репарации ДНК, описан в оригинальной статье (22). Для молекулярного клонирования и экспрессии 0BF,соответствующей предполагаемому гену pol мобильного элемента жокей, использовали мэ-методы и приемы, описанные в (Maniatia et.al.,1982). Метод выделения и очистки рекомбинантной ОТ жокей, предложенный в данной работе, подробно описан в оригинальной статье (31).

LO^Üf^l

1. Разработана модальная система, для исследования энзимов синтеза ДНК (и экспрессии мобильных генетических элементов), представленная монотипическими нервными клетками головного мозга млекопитающих. Клетки в процессе развития /от реплицирующегося нейробласта до терминально дифференцированного перманентно неде-лящегося, но долгоживущего нейрона/ доступны для выделения и получения в еысокоочищ9нном состоянии.

2. Выделена, очищена до элвктрофоретической гомогенности и исследована первая экзодезоксирибонуклеаза головного мозга крыс, обладашая спэцифичностья к одноцепочечной ДНК, но активная такке по отношению к инцизированной двухцепочечной ДНК. Энзим,названный ДНКазой Bralnlll (Bill), локализован преимущественно в нейронах и по свойствам четко отличается от известных экзодезоксирибонук-леаз млекопитающих. В соответствии с представленными данными ДНК-аза BIII является репарационным энзимом.

3. Впервые обнаружена в ткани головного мозга, выделена, очищена и охарактеризована АП-ДНКаза хроматина неокортекса крыс. Репарационный энзим обладает высокой специфичностью к суперспиральной ДНК, гидролизуя фосфодиэфирную связь возле АП-сайта с образованием З'-ОН и 5'-фосфатной концевых групп. ДНК, инцизиро-Еанная этим энзимом, служиг аффективным прайкером для ДНК-полиме-разы р из печени крыс или ДНК-полимеразы I из E.coli.

4. Разработан метод тестирования энзимов In vitro, который позволяет оценить ах специфические свойства, обеспечивающие участие в координированном процессе синтеза ДНК.

При использовании этого метода показано, что нуклеолитичес-кие энзимы головного мозга: АП-ДНКаза неокортекса и ДНКаза Bill, - действуя последовательно, эксцизируют АП-сайты из сугорспираль-ной ДНК.

5. Впервые найдена в ткани головного мозга, выделена, очищена до электрофоретической гомогенности и исследована ДНН-топсизо-мераза I нейронов неокортекса крнс. Обнарукено детальное сходство свойств ДНК-топсизомеразы I из клеток мозга и лиыфоидных клеток и некоторое отличие их от энзимов из других тканей кивотных. Пока-ззно, что вычисленное количество энзима на ядро нервной клетки остается постоянным в процессе развития от 18 дн. нейробласта до 60 дн. терминально дифференцированного постнатального нейрона. Гамма-облучение животных и паре&ивающих срезов индуцирует пере-

распределение активности ДНК-топоизомеразы I среди субфракций хроматина нейронов неокортекса, которое может быть обусловлено участием этого энзима в репарации ДНК.

6. Разработан метод изучения функциональной активации энзимов метаболизма ДНК (основанный на изменении степени ассоциации энзима с хроматином по тесту: солевая растворимость энзиматичес-кого белка),- который может быть использован и для исследования биологической роли энзимов. При использовании этого метода в другой клеточной системе (сперматозоид вьюна и кислая ДНК-аза) получено подтверждение феномена, обнаруженного в нервных клетках для ДНК-топоизомэразы I: активация энзима метаболизма ДНК в клетке сопровождается увеличением степени ассоциации энзиматического белка с хроматином.

7. Фрагмент ДНК из области жокея дрозофилы - мобильного генетического элемента класса LINE, - кодирующий предполагаемую обратную транскриптазу, стабильно введен в векторную систему под контролем 1ас-промотора. В E.eoli экспрессирован белок, который идентифицирован как обратная транскриптаза. Таким образом, получено прямое доказательство того, что мобильные генетические элементы класса LINE,- длинные умеренно повторяющиеся последовательности ДНК, распространенные в геномах всех высших эукариот, кодируют подлинную'обратную транскриптазу.

8. Впервые идентифицирована эндогенная обратная транскриптаза в нервных клетках головного мозга крыс. Специфическими особенностями обратной транскриптазы нейронов являются: отсутствие ассоциированной с энзиматическим белком активности РНКазы Н и очень высокая лабильность,- которые не характерны для вирусных энзимов.

9. Обнаружено уменьшение скорости репаративного синтеза ДНК (по тесту включения меченого предшественника) в процессе развития нервной клетки. Показано, что ДНК-полимераза а в нервных клетках головного мозга крыс принимает участив в репаративном синтезе ДНК длинными фрагментами (УФ-тип повреждений). Доказано, что падение скорости репарации в процессе постнатальной дифференциации нейрона совпадает (по времени) с сокращением длины нуклеосомной единицы хроматина.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Иванов В.А.,Третьяк Т.М..Смирнова Г.Н. Изучение нуклеаз ткани головного мозга крыс. Биохимия,1977, т.42, N 2,с.287-292.

2. IvanoY V.A.,Tretyak Т.ff. .Smirnova C.N. Study of rat brain

nucleases. In: Anino-acida, peptides and proteins. 7.6. London,1977, p.25-26.

3. Трэтьяк Т.M.,Иванов В.А..Тертшловская О.Н. Пуклеазы клеточных

фракций ткани головного мозга крыс. Укражн.яурн.биохтш., 1979, т.51, N 6,с.624-628.

4. Семвновз Т.П..Иванов В.А..Третьяк Т.М. Содержание норадрена-

дкна.допамана и серотонина в мозге крыс, различающихся уровнем двигательной активности. Зурн.шсз.нерв.депт. ,1979, т.29, N 3,с.640-642.

5. Иванов В.А..Третьяк Т.Н..Газиев А.И..Санталов Б.Ф. Щелочная

ДНКазэ головного мозга крыс. Виопсдш, 1380,т.45,N 5,с.912-922.

6. Третьяк Т.Н., Архяпова Л.В., Иванов В.А. Взаимодействие

диояскфенилаланина с кислы:,га белками голоеного мозга крыс. Дом.АН CCCP,I98I,t.257,N 5,c.I262-I264.

7. Иванов В.А., Терпиловская О.Н., Третьяк Т.Ы., Смирнова Г.Н.

Характеристика ДНКазы головного мозга крыс. Бкохекия,1982, т. 47,с.398-404.

8. Иванов В.А. Эязонуклеаза голоеного мозга, специфичная к

одноцепочечной апуриновой ДНК.В кн. .-Структурно-функциональные аспекты репликации и репарации ДНК. Пущине: НЦБИ.1983, с.163-168.

9. Тертшловская О.Н. .Иванов В.А..Абрамова 3.И.,Белова М.М. Белки

клеточных ядер головного мозга крыс в онтогенезе. Нейрохя-|ЯШ,1983,т.2,Н 2,с. 164-173.

10. Иванов В.А..Терпиловская О.Н..Третьяк Т.М. Ядерная ДНКаза

клеток головного мозга крыс. Украип.гурн.биохим.,1983,т.55, N 2,С.162-168.

11. Ivanov V.A.,Gasiey A.I.,Tretyak. T.M.Exodeoxyribomicleass from

rat brain specific for single-stranded ША.Епгор. J.Blochen, 1983,7.137,м 2,p.517-522.

12. IvsnoY V.A..Melnikov A.A. Alternate domains oi neuron DNA to-

poisomerase I in developing rat brain. FEBS Lettera, 1984, y. 177,p.300-304.

13. Третьяк т.И..Иванов В.А. Особенности синтеза ДНК в клетках

центральной нервной системы. В кн.:Нуклеазы и их практическое использование. Рига,1985,с.164-168.

14. Третьяк Т.М.,Иванов В.А. Множественность форм дезоксирибонук-

леаз головного мозга крыс. В кн.: Нуклеазц. Биологическая роль и практическое использование. Киев:Наукова душа, 1985, с.28-32.

15. IvanoY V.A..MelnikoY A.A..Teipilovska О.Н. DMA topoisomerase

I from rat brain neurons. Biochira.Biopbys.Acta,1986,v.866, N 2/3,p.154-160.

16. Иванов В.А..Трэтьяк Т.М. Ферменты синтеза ДНК в нервных клет-

ках млекопитающих. Успехи современ.биологии,1986,т.101,N 2, с. 174-187.

17. Иеэнов В.А., Терпиловская О.Н..Куликов А.В.,Третьяк Т.М. Ре-

парация ДНК в нервных клеток млекопитающих. I.Синтез ДНК в неокортексе.индуцированный гамма-облучением крыс.Цитология, 1987,т.XXIX,N I.e.73-78.

18. Иванов В.А.,Третьяк Т.М..Терпиловская О.Н..Сьшряова Г.Н. Ме-

ханизм действия ДНКаза головного мозга крыс. Биохимия,1987, t.52.N 5,с.842-845.

19. Иванов В.А. Специфичная к апурин-апиримнднновой ДНК эндодезо-

ксирибонуклеаза голоеного мозга крыс. Биохимия,1987,т.52, N 7.C.II33-II37.

20. Иванов В.А. Синтез ДНК в неокортексе развивающихся крыс. Ней-

рохтшя,1987,T.6,N 3,с.390-396.

21. Иванов В.А. 7- и У$>-индуцированныа синтез ДНК в нейронах нео-

кортекса крыс. Радиобиология,1987,т.27,N 5,с.586-590.

22. Ivanor V.A..Tretyak Т.К..Afonin Yu.H.Exision of apurinic and/

or apyrimidinic sites from DKA by nucleolytical enzymes from rat brain. Europ.J.Biochem. ,1988,y.172,H 1,p.155-159.

23. Иванов В.А.,Семенова Т.П..Третьяк Т.М.,Громова Е.А. Влияние

норадреналина и серотонина на активность ДНКазы голоеного мозга крыс. Нейрохишш,1988,т.7,К 2,0.255-258.

24. Иванов В.А..Тушмалова Н.А. Синтез ДНК и высшие функции голов-

ного мозга. Успеха совреыен.биологии, 1988,т.106,сЛ63-178.

25. Ivanov V.A. Variations in DHA topoisomerase I activity alter

gamma irradiation of mature neurons. Neuroacience letters, 1988,v.94,N 1,2, p.99-103.

26. йЕанов В.А.Репарация ДНК в нервных клетках млекопитающих. II.

Синтез ДНК в нейронах,индуцированный гамма-облучением переживающих срезов неокортекса крыс.Цитология, 1Э88,т.XXX,N II, с.1338-1344.

27. Иванов В.А. Особенности репарации ДНК в нервных клетках мле-

копитающих. Радиобиология,1988,т.28,N 6,с.723-730.

28. Иванов В.А. Репарация ДНК в нервных клетках млекопитающих.

Нейрохимия,1989,т.8,Ы 2,с.293-306.

29. Терпиловская О.Н. .Иванов В.А. Структурно-функциональная ор-

ганизация хроматина нервных клеток млекопитающих. Успехи современ.биологии, 1990, т. ПО, N 4,с.И8-133.

30. Иванов В.А., Мельников А.А..Сиунов А.В.,Фодор И.И..Ильин Ю.В.

Мобильный генетический элемент жокей кодирует ДНК-полиме-разу.подобную обратным транскриптазам ретровирусов. Докл. АН СССР,I99I,T.320,N 2,с.473-476.

31. Ivanov V.A.,Melnikov A.A.,Simov A.V.,?odor I.I., Ilyin Yu.V.

Authentic reverse transcriptase is coded by Jockey,a mobile Drosophila element related to mammalian LINE3. ШВ0 J.,1991 v.10, N 9,p.2489-2495.

32. Иванов В.А.,Сиунов А.В.,Фодор И.И..Ильин Ю.В. Клонирование и

экспрессия в Esherichia coll обратной транскриптазы, кодируемой мобильным генетическим элементом жокей. Молекулярная биология, 1992, т.26,Н I.e.70-82.

33. Иванов В.А.,Пахотин П.И.,Бобкова Н.В.,Ильин Ю.В. Обратная

транскриптаза головного мозга крыс. Докл. РАН, 1992, т.323, 173-177.

34. Nechaevsky Yu.V.,Ivanov V.A. Dynamic locations of deoxyribo-

nuclease in irradiated loach. (Misgurnua fossilis L.) sperm cells. PEBS Lettere, 1993, in press.

Материалы диссертации были доложены на: Всесоюзном симпозиуме "Метаболизм белков центральной нервной системы" (Днепропетровск, 1978); IV Всесоюзный конференции "Память и следовые про-процессы" (Пущино, 1979); VIII (Минск, 1980) и IX (Ереван, 1983) Всесоюзных конференциях "Биохимия нервной системы" ; Всесоюзной итоговой конференции "Нуклеазы и их практическое использование" (Рига, 1985); заседании Московского физиологического общества (Москва, 1989); X Всесоюзной конференции "Структура и функция клеточного ядра" (Гродно, 1990) и других научных конференциях.