Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Репарация гамма-индуцированных однонитевых разрывов в транскрибируемой и нетранскрибируемой ДНК клеток человека

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Репарация гамма-индуцированных однонитевых разрывов в транскрибируемой и нетранскрибируемой ДНК клеток человека"

гI и

1 3 т 1397

На правах рукописи УДК 576.362:576.535.5

ИГУШЕВА Ольга Анатольевна

Г?

РЕПАРАЦИЯ у-ИНДУЦИРОВАННЫХ ОДНОНИТЕВЫХ РАЗРЫВОВ В ТРАНСКРИБИРУЕМОЙ И НЕТРАНСКРИБИРУЕМОЙ ДНК КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА

03.00.25 - Клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ

1996

Работа выполнена в Институте цитологии РАН, Санкт-Петербург.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор ВД. Жестяников, Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор В.И. Воробьев, Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург.

кандидат биологических наук М.В.Филатов,

Петербургский институт ядерной физики РАН, Санкт-Петербург, Гатчина.

Ведущее учреждение: Технологический университет, Санкт-Петербург.

Зашита состоится ¿ьЛаЯЛ- 1997 г. в 13 ч.

на заседании Диссертационного совета Д.002.73.01 Института цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН.

Реферат разослан " $¿/¿лСй-Я^ 1996 г.

V

Ученый секретарь Диссертационного совета

д.6.н. // ( ^ ^ Л.Н. Писарева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Важнейшей проблемой клеточной биологии является изучение стабильности генома h,kúk один из сс главных аспектов,исследование репарации ДНК.

К настоящему времени известно, что механизмы репарации ДНК на всех уровнях клеточной организации являются важнейшим фактором, определяющим резистентность клетки к действию УФ-свста, ионизирующей радиации, химическим Мутагенам и канцерогенам. Вместе с тем, действие репарационных систем тесно связано с такими важнейшими матричными процессами как репликация ДНК, транскрипция, рекомбинация ( Sanear, 1995). Основные представления о механизмах репарации ДНК в клетках млекопитающих слогсились в результате изучения процессинга повреждений ДНК в составе целого генома. Тот факт, что в геноме эукариот лишь незначительная часть ДНК представляет собой кодирующие Последовательности л что как у прокариот, так и у эукариот многие гены проявляют свою транскрипционную активность только при определенных условиях, натолкнул исследователей на мысль, что репарация ДНК должна осуществляться прежде всего именно в этих последовательностях. Существенным этапом в решении данной проблемы стала разработка мйода количественного определения индукции и репарации повреждений ДНК в специфических геномных сегментах в зависимости от того, являются ли они транскрибируемыми или нстранскрибирусмыми. Впервые такой метод предложен в лаборатории Ханаволта (Bohr et al., 1985), который позволил выявить более быструю репарацию УФ-шщуцированных пнримидиновых димеров в активном гене, в сравнении с замедленной репарацией во фланкирующих нетранскрибируемых участках ДНК или в геноме в целом. Позднее такая ускоренная репарация была покачана для многих активно транскрибируемых генов в клетках человека, грызунов и Б. coli (Bohr et al., 1987, Lehmann et al., 1992. Hañawalt, 1987). Подобный феномен наблюдали не только при формировании пиримидиновых димеров, но и (б-4)-фотопродуктов и разнообразных аддуктои канцерогенов (Snydervine, Bohr, 1992). Наряду с гсноспецифичсской репарацией обнаружено, что при образовании пиримих .новых димеров, внутриинтспых сшивок и др. в активных генах преимущественно репарируется транскрибируемая шт. ДНК

(Hanawalt, 1989, Lehmann et al„ 1992). Таким образом, подводя итог исследований последних лет, можно сказать, что существует по меньшей мере три уровня репарации ДНК с УФ-индуцированными пиримидиновыми димерами: медленная репарация неактивных генов, быстрая репарация активных генов и еще белее быстрая репарация транскрибируемых нитей активных генов (Hanawalt, 1995). Вместе с тем, репарация радиационно индуцированных разрывов нитей ДНК в транскрипциоппо активном и инертном хроматине изучена крайне недостаточно. Немногочисленные исследования пс данному вопросу дали противоречивые результаты, не позволяющие сделать обобщающего вывода о наличии или отсутствии преимущественной репарации радиоиндуцированных повреждений нитей ДНК в жизненно важных последовательностях генома эукариот. Однако тот факт, что внеплановый синтез ДНК после действия ионизирующей радиации, равно как и УФ-облучения, инициируется на ядерном матркксе (Газиев и др., 1985), с которым ассоциипована транскрибируемая ДНК, позволяет предположить, что радиошшуцируемые разрывы нитей ДНК о клетках млекопитающих должны репарироваться преимущественно в транскрибируемой ДНК. В связи с этим представлялось интересным разработать молельную систему, позволяющую анализировать индукцию и репарацию у-шшуциро ванных однонитевых разрывов как в геноме п целом, так и в генных последовательностях с разной транскрипционной активностью.

Репарация как фундаментальный матричный процесс тесно связана с клеточной пролиферацией.' Имеющиеся данные указывают, что в регуляции репарации ДНК могут принимать участие естественные клеточные метаболиты, влияющие на процессы пролиферации клетки. Специфическими регуляторами клеточной пролиферации являются факторы роста, в частности ¿эпидермальный фактор роста (ЭФР). Ранее было показано, что ЭФР совместно с инсулином ускоряет репарацию однонитевых разрывов ДНК в "у-облученных покоящихся клетках мышей Swiss ЗТб (Вильдин, 1990). Учитывая тот факт, что ЭФР, будучи важным звеном в активации генома, служит стимулятором транскрипции, и тот факт, что в регуляции клеточной пролиферации важная роль принадлежит факторам роста, предегамялось интересным исследовать, в какой мере стимулирующее влияние ЭФР на процесс репарации связано с элиминацией повреждений в активных li инертных участках генома.

Цепь и залами исследования

Цель настоящей работы - исследовать репарацию одношгтевых разрывов, вызванных действием ионизирующей радиации в транскрибируемой и нстранскрибируемой ДНК в нормальных клетках человека, а также в клетках больных наследственными заболеваниями - атахсисй-тслеангиэктазией и синдромом Кокейна - и возможное участие в этом процессе ЭФР. Общая задача требовала следующих конкретных исследований:

1. Разработать адекватную экспериментальную модель-систему, позволяющую исследовать рспаращПо однонитевых разрывов после действия у-облучения в участках ДНК с разной транскрипционной активностью генома клеток эукариот.

2. Исследовать репарацию у-индуцированных однонитевых разрывов в транскрибируемой (протоонкоген с-тус). нстранскрибируемой сателлит IH человека) и тотальной ДНК клеток HcLa.

3. Исследовать индукцию однонитевых разрывов после действия у-обл учения в транскрибируемой (протоонкоген с-шус) и нетранскрибируемой (сателлит III человека) ДНК клеток HcLa в условиях прямого и опосредованного действия радиации и изучить репарацию однонитевых разрывов в этих ДНК.

4. Исследовать индукцию и репарацию однонитевых разрывов после у-облучения в транскрибируемой и кзтранскрибирусмой ДНК в клетках больного атаксией-телсанглэктазисй.

5. Исследовать индукцию и репарацию у-индулироваиных однонитевых разрывов в транскрибируемой -л нстранскрибируемой ДНК в клетках больного с синдромом Кокейна.

6. Оценить эффективность репарации у-индуцированных однонитевых разрывов в транскрибируемой и нстранскрибируемой ДНК в покоящихся и стимулированных из состояния покоя митогеном (ЭФР) клетках HcLa.

Научная новизиа и значимость работы"

Впервые предложен методический подход, позполяюнмй анализировать воссоединение у-иидуиированных разрывов нитей ДНК в транскриминошю-активных и инертных участках генгча млекопитающих, основанный im гибридизации 5Н-мсчснной тотальной клеточной ДНК с "Р-мсчсннымн ЛИК

содержащими анализируемые последовательности. С помощью разработанной системы выявлено наличие преимущественной репарации у-ицдуцированных однонитеврх разрывов (ОР) в пролиферирующих клетках НеЬа. Повреждения элиминируются быстрее в транскрибируемой ДНК, чем в н(транскрибируемой и тотальной ДНК. Анализ индукции одиоиитевых разрывов после у облучения в присутствии перехватчика свободных радикалов димстилсульфоксила (ДМСО) показал, что повышенная индукция разрывов в транскрибирумом лротоонкогене с-шус является результатом непрямого действия ионизирующей радиации.

Впервые получены данные о репарации одноиитевых разрывов после у-облучения в транскрибируемой и нстранскрибирусмой ДНК в клетках больного атаксисй-телеангиэктазисй, которые выявили два различия по сравнению с нормальными клетками: отсутствие повышенной индукции образования одиоиитевых разрывов и отчетливый дефект преимущественной репарации одиоиитевых разрывов в активно транскрибируемом протооикогсме с-тус, что, возможно, является молекулярным дефектом, определяющим фсиотнпическис особенности атаксии-тсл сапгиэктазии (АТ). На клетках больного с другим наследственным заболсванисм-синдромом Коксйпа (СК)-показано. что у-облучение вызывает сходный уровень индукции разрывов как в целом геноме, так и в транскрибируемой и нстранскрибирусмой ДНК. Однако, уровень репарации в транскрибируемой ДНК не превышает такового в геномной ДНК, то есть имеет место дефект преимущественной репарации в транскрибируемой ДНК у-индуцированных ОР ДНК (как и при эксцизиониой репарации УФ-индуцированных пиримидиновых лимеров и у-ипдуннро ванных изменений оснований).

При исследовании стимулирующего эффекта ЭФР на репарацию одиоиитевых разрывов в активном и молчащем участках ДНК покоящихся и стимулированнь . митогеном клетках НеЬа обнаружено, что митогенная стимуляция "заторможенных" клеток приводит к преимущественной (более быстрой) репарации одноиитевых разрывов в нстранскрибирусмой сатсллитиой ДНК по сравнению с репарацией в транскрибируемо;« с-тус-содсржащсй ДНК.

Практическая ценность работы

Предложенный в работе метод количественного определения индукннн и репарации ОР в транскрибируемой и пстрансхрибнрусмой ДИК существенно расширяет методические возможности анализа нроцсссинга поврежден!юн ДНК в Клетках млекопитающих после действия ионизирующей радиации. Это позволяет качественно более точно охарактеризовать течение пострадиационной репарации в клетках, различающихся рснарационым фенотипом (как это сделано в данной работе при синдроме Коксйна и ата1:сии-телсашнэктазии). Полученные результаты Открывают новые возможности целенаправленного управления процессами репарации ДНК в определенных участках генома эукариот.

Апробация работы

Материалы диссертации были доложены па Всероссийских научных конференциях и научных семинарах лаборатории радиационной цитологии Института цитологии РАН.

По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

Структура и объем лиссертаннн

Работа изложена на^ЙРстраницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав и выводов; содержит ¡Г таблиц и /3 рисунков. Список литературы включаете/названий, из котор. х^ума русском языке.

ОР - однонитевой разрыв ДНК; у - гамма лучи;

АТ - атаксия-телеангиэктазия; СК - синдром Коксйна; ДМСО - диметилсульфоксид; ЭФР - эпидермальный фактор роста.

g

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали клетки НеЬа и нормальные челопсчески( фибробласты легкого, полученные из банка клеточных культур Институп цитологии РАН, а также фибробласты кожи от больных синдромом Кокейна I атаксисн-тслеангиэктазией, полненные в лаборатории радиационной цитологи) Инрппуга цитологии РАН. Клетки НеЬа культивировали в среде Игла I добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота. Нормальные фибробласты I фибробпаети больных СК и АТ культивировали в среде ДМЕМ, содержащей 153 фстачьной сыворотки (С1ВСО) Клетки выращивали на чашках Петри (№пк) I атмосфере с 5%-пмм СОг. Культуры. и<:нсльзуемыс для исследования индукции I репарации однонитевых разрывов после у-</>л учения, мстили через 12 - 14 часо! после посева 3Н-тимидином. По достижении логарифмической фазы роста, з. один час до облучения, клетки отмывали сгх:жсй средой и инкубировали в с веже! ростовой среде, не содержащей меченого предшественника. В экспериментах ■ покоящейся культурой, среду с меткой заменяли па свежую культуральную срсду 0.25%-пой сывороткой, в которой клетки выдерживали в течение 4 дней, дорашива их до монослоя. Эпилермальный фактор роста

Э<1>Р вызелен в лаборатории физиологии клеточного цикла Институт ннтолопш РАН. Во всех экспериментах ЭФР вводили за 2 часа до облучения 1 использовали в конечной концентрации 10 иг/мл.

Клетки облучали либо в монослос па чашках, либо в суспензии в 0.02%-hoi растворе Всрссна при температуре тающего льда на установке ЛМБ-у-1 (источни излучения u' Cs, мощность дозы 36.8 Гр/мин) в дозе 100 - 150 Гр. Регистрация репарации ОР

Об образовании и репарации ОР ДНК судили по изменению молекулярно массы (Mw), определяемой методом седиментации в щелочных сахарозны градиентах. ДИК выделяли в процессе лизиса на поверхности 5-20Ч> - сахарозног гродныпа. приготовленного по методу Ноля ( Noll. 1967 ). Для этого клетк! собранные с поверхности чашек 't in в суспензии, цапгрифугировали ( 3 мин. 150

об/мин ) и ресуспендировалм в 0.02%-ном растворе Всрссиа, охлажденном до 4ПС. 100 мкл суспензии, содержащей 105 клеток, осторожно наслаивали на 150 мкп лизируюшего раствора ( 1% саркозил, 0.2 М NaCI. 0.6 М NaOH. 0.02 М ЭДТА. 0.5 мкг/мл протеиназы К (Merk), ранее нанесенного на вершину сахарозною |радис:гта. Центрифугирование проводили в ультрацентрифуге L2-65K (Beckman), ротор SW-50.1 при 30 000 об/мин в течение 90 мин при 20° С Дня анализа репарации О Г' ДНК в определенных участках генома применяли методику i нбршшзашш иммобилизованной 3Н-мсченной клеточной ДНК с исследуемыми 32Р-мсчсшшмн зондами, содержащими анализируемые последовательности. С этой целью градиенты фракционировали на 14 фрикций па капроновую мембрану (Hybond, Magna;, предварительно помещенную в аппарат для дот-блоттинга. Мембрану о иммобилизованной клеточной ДНК высушивали, после чего облучали в течение 10 мин УФ-светом ( длина волны 260 нм. доза подобрана эмпирически). Далее иембрану инкубировали 6-24 часа при 64СС в 15-30 мл буфера, содержащего SxSSC, 0.5% SDS. 5храствор Дснхардта, 100 мкг/мл денатурированной ДНК из :пермы лосося. Гибридизацию проводили в том же составе буфера с добавлением 3.01М ЭДТА и 0.2 - 1.0 мкг денатурированной плазмидной ДНК в обьеме 3-5 мл в течение 24-48 часов. Затем мембрану отмывали в жестких условиях, высушивали на юздухе и радноавтографировали на рентгеновской пленке (AGFA) в течение 24-48 «асов при -70° С. ОЬшзмшы

В работе использовали следующие плазмндм: pRT301 (4.8кп). содержащая ZcoRI фрагмент (1.8 кВ) сателлита lit человека, любезно ррсдост-ии,сипая ВН. Толторацким; pGEM112f (США), содержащая HindlII-SacIII фрагмент гена 1словека с-шус (3.0 кВ). Фратенты выделяли указанными рсстрпх газами и (^акционировали в 1.2% а|арозном геле. Очищенные продукты рсстринированной IHK использовали в реакции ник-трансляции. Реакцию проводили по тапдартной методике ( Маниатис и др ., 1984 ) в течение 2 часов при 16° С. !спключивпшеся меченые нуклсозидтрифосфаты удаляли гель-фильтрацией на •сфадсксс G50 (Sigma). Удельная активность зондов соааичяла К)7- ¡0* нмп/мин на мкг ДНК.

Определение радиоактивности

Подсчет радиоактивности проводили в стандартном толуольном сцинтилляторс на счстчикс Bcckman LS 8100 с использованием двухканалыюй про!раммы счета.

Для количественной оценки индукции и репарации ОР ДНК проводили следующие расчеты:

Молекулярная масса (Mw) фратентов ДНК получена в результате мате» тичсской обработки в соответствии с общепринятой терминологией:

XFIMI

Mw = _ ,

2 Fi

где Fi - радиоактивность ¡-фракции, Mi - молекулярная масса i-фракции (Studier. 1965). При расчете три менисковые фракции не учитывались. Среднее число разрывов на 1х109 Да (X):

1 1

X = 2х [--------- -----] »

(Mw)o,r (Mw)k

где (Mw)o - молекулярная масса облученной ДНК, (Mw)k - молекулярная масса необученной ДНК, (М*)г - молекулярная масса ДНК после пострадиационной инкубации в ростовой срсдс при 37° С.

Эффективность репарации ДНК (Эр):

(Mw)r - (Mw)o

Эр = _ х 100 % ,

(Mw)k - (Mwlo

где (Mw)k,(Mw)o,(Mw)r - молекулярные массы ДНК из контрольных, облученных нсипкубиропапных, облученных инкубированных в ростовой срсдс клеток.

При статистической оСуаСоткс результатов среднее арифметическое и его стандартную ошибку вычисляли, как описано (Урбах, 1963). Оценку достоверности ра шнчня средних значений проводили с помощью l-крнтерия Стыодснта при уровне значимости Р ^ 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Репарация у-нняунировзнных ОР в транскрибируемом и Петрацскрнбирусмой

Для изучения индукции и репарации ОР в транскрибируемой и нстрапскрибирусмой ДНК в настоящей работе разработан методический подход, включающий в себя центрифугирование клеточных лнзатов в |ралиснтах плотности щелочной сахарозы с .последующей гибридизацией згР-мсчснных зондов, содержащих анализируемые последовательности, с 3Н-мсчеиной тотальной ДНК, распределенной по фракциям сахарозного градиента. О повреждении и репарации ,ОР судили по степени гибридизации плазмидной ДНК с клеточной ДНК.

Выбранный методический подход складывается из 3-х этапов. На первом этапе получали эН-мечспную тотальную ДНК для проведения последующей гибридизации с "Р-мсчснными плазмшшыми ДНК (мсчспис клеточной ДНК. лизис клеток на поверхности сахарозного градиента, центрифугнро'вапне клеточных лизатов, фракционирование градиентов на мембрану). На втором этапе проводили гибридизацию клеточной ДНК . с 32Р-мечснными зондами (пришивание иммобилизованной ДНК к капроновой основе мембраны, гибридизация, включающая предгибридизацию. собственно гибридизацию, отмывку). На третьем этапе определяли степень гибридизусмости 3Н-ДНК клеток с "р-плазмидными ДНК с помощью методов радиоавтографни и жидкостной снинтилляциомнон спектроскопии с одновременным подсчетом импульсов для 3Н - и ,2Р -меченных образцов. Была сделана проверка контроля гибридизусмости тотальной ДНК с плазмшшыми векторами рпЮ22 и риС19, не содержащими генных плавок, которая показала отрицательный отпет гибридизации, что позволило использовать в настоящей работе неристршшропанные илазмндные ДНК п качестве зондов. РаСчпу проводили на монослойной, асинхронной культуре клеток, человека НсЬа. На рис. I предега. хны результаты одной серии эксперимент» по шбрилщаннн тгачмюй

ДИК с с-шус- н сатслпит-содсржащсй ДНК. На рис. 2 приведены ссднмстограммы юталыюй и гнбридизоваиных ДИК. Из сопоставления данных рис. ! и 2 видно, что пики седиментации совпадают с точками наиболее иптспснпных радиоавтографов. Как хорошо видно из рис. 2, на котором прсдставлспь1 результаты репрезентативною опыта, легко убедиться, что приведенные седимсптограммы во всех случаях отражают типичную картину образования и элиминации ОР ДНК: ускоренная седиментация в контроле, сдвиг профилей седиментации в сторону легких фракций сразу после облучения, перемещение пиков профилей седиментации в сторону тяжелых фракций при пострадиационной инкубации.

Ц\ уОч * у 1, t г ( >С

^ .1

Рис. I. Радиоавтографы гибриднзованных Р-мсчснных ДНК (зонды) гена c-myc (1 и сателлита III (2) с тотальной клеточной ДНК, распределенной по фракциям 1раднс11гов щелочной сахарозы.

I - Гибридизация зонда с ДНК из псобл ученных клеток HcLa;. 2-6 - гибридизация зонда с ДНК облученных клеток без инкубации (2) и инкубированных в ростовой среде при 37"с в течение 10 (3). 20 (4). 40 (5) и 60 (б) мин. Стрелками указаны нанрашгепия фракционирования фадиептои. Ралиолпофафм образцов 1,2,4 -сооiвс 1 снуют профилям сецг.чамацнн ид рис. 2 (С,п).

20

1510 5 И

ys

«Л.

---

—i—i—,—i—.—i ■—i—■—i—i—i—■—i— 2 4 6 8 10 12 И

20-1 15 10 5-

Рис. 2. Профили седиментации тотальной ДНК из меченных 'Н-тимидином клеток HcLa (а) н меченных 32Р ДНК сателлита III человека (б) и ДНК гена с-тус (в). По осп абсцисс - номера фракций от дна 1рааиснта, но оси ординат -радиоактивность, 9f> от обшей. • - ДНК из необлученных клеток;

О - ДНК и; клегок после сблучении бет посфпдмапиопиоп инкубации; И - ДНК in облученных клепж 'нтле инкубации клиок л р.кгокон среле п 1СЧСРНС 20 мин при .17° С.

Таблица 1. Изменение молекулярных масс (Mw) тотальной, сатсллнтнон и с-тус-содсржашен ДНК при у-облучении клеток HcLa в дозе 100 Гр

Mw. хЮ"6 f "X+Sx

Анализируемые необлученный образцы контроль 0 10 20 40 60

Тотальная ДНК 311±9 И4±7 159+5 1б8±7 195±б 220±8

Сатсллитная ДНК 317±6 165±12 200±8 218±7 239±8 256±7

Протооикоген с-шус 300±5 80±5 143±9 161±2 1У2±3 227±3

Эти данные позпаляют полагать, что предложенная модель адекватно отражает процесс формирования и элиминации ОР ДНК не только в тотальной ДНК, по и в транскрибируемом (протооикоген с-шус) и нстрамскрнбнруемом (сателлит III) участках генома. Эго даст возможность количественно оценивать этот процесс по степени гибридизации 5Н-мечспной тотальной ДНК и мР-мсчснных зондов.

Анализ изменения молекулярных масс (табл. 1) показал, что при у-облучении в сатсллитпой ДНК образуется па 30% меньше ОР (различия достовсрны-Р 2 0.001), а в с-тус-содсржашсй ДНК на 40% больше ОР ( Р >0.001), чем в тотальной ДНК.

Обнаружены также рахжчия в ходе пострадиационной инкубации ( в пашем случае это 10, 20, 40 и 60 мин ), иллюстрированные рис. 3 : наибольшая скорость репарации наблюдается в транскрибируемой ДНК и наименьшая в негранскрнбирусмой сателлитнон ДНК. Уже в первые 10 мин в гене с-шус нсришрнрпплнпыми остаются 40% ОР, число которых через час инкубации падает

до 10%, тогда как в сателлитной ДНК через 20 мим число разрывов составляет 55% от начально индуцированных, всего же за 60 мин - 25% повреждений. Судя по кинетике элиминации ОР в тотальной ДНК, в первые 10 мин се скорость занимает промежуточное положение между таковой в сателлитмой и с-тус-содсржащсй ДНК. Однако, в последующие 20-60 мин кривые убывания ОР ДНК в тотальной и сателлитной ДНК совпадают. Следует отмстить, что при построении кривых элиминации ОР ДНК, представленных на рнс. 3. число разрывов во время 1=0 (момент окончания 30-минутного лизиса) принято за 100% во всех случаях. Однако, следует сделать поправку на истинное значение величин начальной индукции ОР ДНК: как в момент облучения, так и во время лизиса облученных клеток возможна их некоторая дополнительная индукция за счет атаки ДНК свободными радикалами ОН" , образующимися в результате радиолиза воды. Для проверки этой возможности облучение клеток проводили в растворе 1.0 М ДМСО, который, как известно, является перехватчиком свободных радикалов. Как видно из рис. 4, обработка клеток ДМСО значительно снижает индукцию ОР в транскрибируемой ДНК, в которой па долю прямого действия у-облучения

Рис. 3. Кинетика элиминации ОР в тотальной (-•-), сагсллитной (-О-) и с-шус-содержашсй (-■-) ДНК.

юоб

10 20 30 40 50 60 , НИН

приходится около 34% рсгастрируемых разрывов, в то время как в тотальной и сатсллитной ДНК - 75 и 87 %, соответственно^ эти соотношения в образовании ОР сохраняются, как для клеток, облученных в отсутствии перехватчика.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о преимущественной повреждаемости транскрибируемой ДНК в условиях непрямого действия ионизирующей радиации вследствии большей се доступности свободным радикалам, чем нетранскрнбирусмой ДНК.

Анализ репарации транскрибируемой и нетранскрнбирусмой ДНК после облучения клеток в растворе ДМСО показал, что и в этих условиях элиминация у-индуцированпых ОР в транскрибируемой ДНК происходит быстрее, чем в нетранскрнбирусмой (при этом скорость элиминации ОР в транскрибируемой и пегранскрибнруемой ДНК сопостмима с таковой в клетках, не обработанных ДМСО). Поскольку в присугствии ДМСО в гене с-шус образуется меньше разрывов, чем в сатсллитной ДНК, полученные результаты приобретают особенно важное значение: большая скорость репарации разрывов в транскрибируемой ДНК не связана с большей индукцией ОР в ней, а имеет место в действительности.

тотальна« днк с а т е лл и т iii ч е л о я ек а п р о т о о н к о г с н с >м vc

Рис. 4. Количество ОР в тотальной, сатсллитной и с-шус-содсржашсн ДНК, после у-облучения клеток HeLa в дозе 100 Гр в 0.02 % растворе Верссна (!) и в растворе 1.0 М ДМСО (2).

ДНК в клетках больного с еннпромом Кокейпа.

Для понимания механизмов преимущественной репарации ДНК в функционально важных последовательностях генома значительный интерес представляет исследование репарации радиационных повреждений ДНК в клетках бальных с нарушенной репарацией ДНК . Показателем биологической значимости преимущественной репарации транскрибируемой ДНК служит наследственное заболевание с дефектом такого рода репарации - синдром Коксйна. При этой болезни обнаружен дефект экецнзионпой репарации, как УФ-индуцированных циклобзтанопых пиримилпповых димеров, так и у-индуцированных измененных оснований (Venema et а!.. 1990, Leadon. Cooper, 1993). Нам представлялось интересным исследовать не требующую этапа инцнзии репарацию у-индуцнрованных ОР в транскрибируемой и петрапскрибируемой ДНК при этом заболевании. Исследование проводили с использованием метода гибридизации геномной ДНК пролиферирующих фибробластов больного СК, облученных у-лучами в дозе 150 Гр с "Р-ДНК, содержащими транскрибируемый протоонкоген с-шус и нстраискрнбиру^мую ДНК сателлита III человека. Как было показано выше, при у-облучении пролиферирующих клеток HeLa наблюдается большая индукция и преимущественная репарация ОР в транскрибируемом гене с-шус в сравнении с замедленной репарацией в нстрансхрибирусмой сатсллитной ДНК. В данном исследовании показано, что уровень индукции и репарации ОР в тотальной ДНК клеток СК схож с таковым для клеток HeLa и нормальных фибробластов человека (данные представлены на рис. 5 и в таблице 2): наибольшая часть повреждений элиминируется в первые 20- 30 мин пострадиационного восстановления. Наряду с этим важно то, что после у-облучения не наблюдается существенных рапччий в количестве индуцированных ОР между транскрибируемым геном с-шус и сатсллитной ДНК - 5.8 и G.3 ОР на 1х109 Да ДНК, соответственно. При этом репарация в ieiic c-myc и сатсллитной ДНК фибробластов больного СК протекает со

f 1» » M

У.кш

• *f M )• 44 M M

• 10 W M 4#

• 1в 2* M 4« M W

с io го x> 40 so «

111

• 1Q M M

I II » H M H u

0 10 20 Э0 40 » 60

* 1 и

11флч at2si* ck

Рис. S. Элиминация OP n ioivimiiiü (а.б.п). сатсллишон (гл.с) и

с-тус-солсржашсй (ж,1.н) ДНК нормальных фнбробласюп лс1ко|о чслопскэ (НФЛЧ), фнбрибласюп больною аыксисй -тслсашHjKiaшей (AT2SP) к фибробласиш больного с енниромом Коксйна (CK).

Попей абении - Н|к;мя it< >с ■ рол ii i и->i 11 ■• <Г) инкубации, мин: I'D <i и ip;,Him п-чнма'ии" irpciupiipoiunnm Ol'. ''.

скоростью, характерной для клеток с нормальным уровнем репарационного восстановления: после у-облучения и 20-минутпой инкубации в ростовой среде, как в гене с-тус, так и в сатсллитной ДНК остается нсрспариропанпыми около 40% индуцированных разрывов, а к моменту часовой инкубации - 15 - 20%. соответственно. Полученные данные свидетельствуют о том, что в клетках больного СК при у-облучении отсутствует как преимущественная индукция, так и быстрый компонент в репарации ОР в транскрибируемой ДНК. Таким обратом, как и в случае дефекта преимущественной эксцизии пиримидиновых днмеров и у-индуцированных шелочсстабильных сайтов из транскрибируемой ДНК при синдроме Кокейна имеет место дефект преимущественной репарации у-ипдуцированных ОР в транскрибируемой ДНК. для которых не требуется экснизия поврежденных участков.

Таблица 2. Изменение молекулярных масс (М\у) тотальной, сатсллитной и с-тус- содержащей ДНК при у-облучении фнбробластов больного с синдромом Кокейна в дозе 150 Гр

Анализируемая нсобл ученный у- время пострадиационной

последовательность ко<ггроль облучение инкубации, мин

Тотальная ДНК 313±5 138+8 192±3 19717 202±9 25714

Сателлитная ДНК 326±3 157±4 196110 22116 26416 27413

Протоонкогсн с-тус 31815 173±7 18912 21415 24318 25414

Репарзпия -у-милупирмзтшт ПР и транскрибируемой и нетранскрибируемой

ДНК « клпжа! (мутьпрго ЛТ.

Как известно, при AT имеет место повышенная чувствительность клеток к у— радиации и повышенна! индукция хромосомных нарушений. Однако молекулярный дефект до сих пор остается невыясненным. Вопрос об избирательной репарации транскрибируемой ДНК также не исследован. Между тем, нам представляется, что именно исследование избирательной репарации может прояснить молекулярную природу дефекта репарации ДНК при AT и природу связанных с этим фенотипических особенностей. Работу проводили на пролнферирующей культуре нормальных фибробяастов легкого и фибробластах кожи больного AT. облуу^иных ■у-лучами в дозе 100 Гр. Сопоставление характера ссдиментограмм обеих линий показало типичную картину образованна и репарации ОР ДНК. Анализ данных табл. 3 показывает, что при "р-облучении нормальных фибробластов в сателлитпой ДНК образуется на 30% меньше OP. а в с-тус-содсржащей ДНК на 60% больше ОР. чем в тотальной ДНК, тоща как в фибробластах AT различия в индукции ОР в транскрибируемой и нетранскрибируемой последовательностях оказываются на 20% меньше, чем в тотальной ДНК. В ходе пострадиационной инкубации происходит восстановление ОР. что отчетливо видно на рис. 5, демонстрирующем элиминацию ОР ДНК в ходе репарации в ростовой среде, где число разрывов во время 1=0 принято во всех случаях за 100%. Видно, что скорость репарации в тотальной ДНК схожа в нормальных фибробластах и клетках AT: через 10-20 мин пострадиационной инкубации количество нерепарированных ОР ДНК различается несущественно.

Однако, наиболее важно, что скорость репарации в транскрибируемом raie с-шус клеток AT отлична от таковой в нормальных фибробластах. Даже в течение 60 мин пострадиационной инкубации из iciia элиминирует только 40% индуцированных разрывов, тогда как в нормальных фибробластах только за первые Юмии восстанавливается 55% разрывоп. уровень которых за 1 час шиубанпи

Таблица 3. Изменение молекулярных масс (М«) тотальной, еатеплнтной и с-тус-еодержатсей ДНК при у-ойтучетт нормальных фибробласгов легкого человека (НФЛЧ) и фкбробластов больного атакеией-телеангиэктазией (АТ2ХР) в дозе 100 Гр

Доза Инкубация после

(Гр) -у-облучения <иин> Тотальная ДНК Протооикоген е-тте Сатсллст III

нфлч лтгяр ифлч дтар нфлч ат2ур

0 32419 301+5 300 ±5 336 ±3 308 ±6 27418

100 ' — 165±7 172±3 103±5 205+5 174112 17719

100 10 171±5 190±7 16519 212±7 2051« 194+6

100 20 19117 20S16 209+2 22416 23217 20517

100 40 264±6 24715 254+3 24113 26618 23313

100 60 277±8 269+9 270±3 245+4 289+7 25414

падает до 10%. Так же отчетливо видны различия в ходе репарации ОР в сателлитной ДНК: если в норме за 20 кии рснаратнытого синтеза восстанавливается 60% разрывов, то в клетках AT только 40%. Однако, к 40 Mim ипкубзцаи посстанавпивастся большая часть ОР ДНК - около 80"Ж. Таким обраюм. полученные данные показывают, что в фибропластах здорового донора происходит существенно большее образовашгс и более быстрая элиминация ■у-иядушфежтттах ОР в транскрибируемом гене с-шуе. чем в нсграгкгкрнбируемоя сате.'цпгпгой ДНК. Эти данные совпадают с описанными выше результатами из клетках HeLa. Следует особо заметить, что ч т-облучеигая флбробгтаггах AT гго> сравпстгитп с нормой имеются дка cyinccTBci'irbrx рагоичмя: тс выятоепа ггогаяшегтггая итсукпи*

образования ОР ДИК и 2- имеет место дефект предпочтительной репарации ОР в гене с-тус. По-видимому, последнее обстоятельство дйгт объяснение таким важным фспотипичсским признакам АТ, как повышенная чувствительность клеток АТ к ионизирующей радиации и повышенная частота радноиндуцнруемых хромосомных нарушении. Вместе с тем,нельзя исключить, что весь спектр фенотипичсских проявлений при АТ на клеточном уровне обусловлен пока неизвестным молекулярным механизмом, при котором в гене с-тус не образуется большее, чем в сатсллитной и тотальной ДИК, число ОР, то есть не формируется выявляемый в нашей экспериментальной модели субстрат преимущественной репарации повреждений в транскрибируемой ДНК.

Как известно, для покоящихся у-облученных клеток характерно снижение скорости репарационных процессов. Тем не менее,при стимуляции таких клеток они оказываются способным» не только благополучно реплицировать свою ДНК. но и. пройдя митоз, дать жизнеспособное потомство . Это предполагает существование в клетках особой, связанной с клеточной пролиферацией, репарации ДНК. Вместе с тем можно предположить, что агенты, запускающие клеточную пролиферацию, яиляются.кромс того,регуляторами процессов репарации ДНК. В их число входят факторы роста, в частности, энияермальнмй фактор роста. Ранее было показано, чго ЭФР в комбинации с инсулином ускоряет репарацию ОР ДНК в у-облученных покоящихся клегках мышей Swiss ЗТб (Бильдин и др.. 1990). Учитывая тот факт, чго ЭФР служи г стимулятором транскрипции,и тот факт, что он принимает участие в роуляцни клеточной пролиферации, представляется интересным исследовать, в какой мере стимулирующее влияние ЭФР на процесс репарации у- индуцированных ОР свжано с элиминацией этого типа повреждений в активном и инертном

\4-icli:.'ix ichom.i.

Исследования проводили па покоящейся культуре клеток НеЬа облученной у-лучамн в дозе 150 Гр. Результаты приведены на рис. бив табл. 4. Данные совпадают с результатами, полученными ранее на клетках, находящихся в логарифмической фазе роста. В гене с-шус репарация ОР ДНК протекает с большей эффективностью, чем в сатсллитной ДНК: эффективность репарации (Эр) при инкубации в течение 20 и 60 мин составляет в первой 33 и 67%, во второй 13 и 30%, соответственно. Репарация ОР в тотальной ДНК "заторможеииых" клеток в первые 20 мин более эффективна, чем в сателлитной ДНК, но менее, чем в гене с-шус. Предрадиационная обработка остановленных клеток ЭФР не отражается на репарации ОР в тотальной ДНК, наблюдается несущественное увеличение ее при 60-минупюй инкубации. ■

а б ■ е б ■

Рис. б. Эффективность репарации у-шшуцированных ОР в тотальной (а), сателлитной (б) и с-тус-содсржащсй (в) ДНК клеток НсЬа при пострадиационной инкубации клеток в течение 20 и 60 мин при 37°С без воздействия ЭФР (1) и при предрадмационной обработке клеток ЭФР (2).

Таблица 4. Влияние ЭФР на репарацию ОР в тотальной, сателлитной и с-туе - содержащей ДНК после у-облучения клеток НеЬа

Анализируемая /Зрсмя пост- ••

последовательность Воздействие радиационной Ми ДНК х 10"* Да

ДНК у ЭФР инкубации, мин

Тотальная 291.7

У 168J

У 20 168.7

у ; ЭФР 20 1653

У 60 185 J

у ; ЭФР 60 206.5

Сателлитная 252.5

У 137.5

У 20 146.5

у; ЭФР 20 179 J

Y 60 1695

у ; ЭФР 60 239.5

Протоонкоген с-тус 238.0

У 142.0

У 20 181.5

у ; ЭФР 20 180.5

У 60 210.5

у ; ЭФР 60 1783

• - Y-облучение для всех вариантов по 150 Гр.

** - Приведены средние данные из 3 независимых опытов.

Вместе с тем. в гене с-тус Эр в первые 20 мин пострадиационной инкубации при стимуляции ЭФР возрастает с 1.4 раза, а за 60 мин имеет место небольшое снижение Эр. В сателлитной ДНК при воздействии ЭФР репарация ОР протекает существенно быстрее. Значение Эр увеличивается с 13 до 39% за 20 мин и сЗО до 92% за 60 мин инкубации, то есть в 3 раза. Следует отмстить, что в этом случае 60-минугная инкубация стимулированных митогепом клеток приводит к почти полному

восстановлению молекулярной массы ДНК, которая становится близкой к таковой в контроле.

Полученные данные позволяют утверждать, что в покоящихся клетках НсЬа митогенная стимуляция приводит к преимущественной^ более быстрой ) репарации ОР в нетранскрибируемой ' сателлитиой ДНК по сравнению с репарацией в транскрибируемой с-тус-содержащсй ДНК. Так как ЭФР в комбинации с инсулином в клетках мышей Янт ЗТб, культивируемых ь бессывороточной среде, стимулирует репарацию ОР ( Бильдин и др., 1990 ), допустимо предположить что этот эффект обусловлен преимущественной репарацией нсгранскрибируемой ДНК.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Данные настоящей работы показывают, что у-индуцировапные ОР репариругатся преимущественно из транскрибируемой ДНК. В этом отношении они не выделяются из других типов повреждений (пиримидиновые димеры, (6-4) фотопродукты и др.), хотя их репарация протекает без участия большого комплекса белков и ферментов, необходимых для инцизии ДНК рядом с повреждением. Иными словами, преимущественная репарация транскрибируемой ДНК отражает общую закономерность: и находится в согласии с данными о предпочтительной инициации основных матричных процессов на ядерном матриксс. Биологическое значение преимущественной репарации у-индуцнруемых ОР из транскрибируемой ДНК отражает общий смысл этого процесса тем. что существуют наследственные заболевания, при которых преимущественная репарация ОР ДНК в транскрибируемых участках дефектна - это синдром Кокейна и атаксия-тслеангиэктазия. Другая сторона нашей работы - предпочтительная стимуляция репарации ОР в нетранскрибируемой ДНК таким фактором регуляции репарации, как ЭФР (этот феномен обнаружен для клеток, находящихся в состоянии,покоя). Отсюда вероятно предположение, что в покоящихся клетках именно в нетранскрибируемой ДНК вероятно накопление спонтанных ОР ДНК, проявление и репарация которых осуществляется ЭФР,

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод определения индукции и репарации у-индуцированных однонитевых разрывов (ОР) в транскрибируемой (протоонкогеи с-шус) и нетранскрибируемой (сателлит III человека) ДНК клеток человека, основанный на гибридизации 32Р-мсчснных зондов, содержащих анализируемые последовательности, с 3Н-меченой тотальной ДНК, распределенной по фракциям сахарозного градиента.

2. В транскрибируемой ДНК гена с-шус у-облучение вызывает существенно большую индукцию ОР, обусловленную непрямым действием радиации, чем в нетранскрибируемой и тотальной ДНК клеток НеЬа.

3. Выявлена преимущественная репарация у-индуцнро ванных ОР в активно транскрибируемом гене с-шус, имеющая место в первые 10 - 15 мин пострадиационной инкубации, по сравнению с репарацией в нетранскрибируемой сателлттгой и тотальной ДНК клеток НеЬа и нормальных фибробластов человека.

4. В у-облученных клетках больного синдромом Корейца (СК) не выявлено различий в индукции ОР в гене с-шус и сателлигной ДНК. Индукция в обоих случаях существенно ниже, чем в фибробластгх здорового донор. . Вместе

, с тем, в клетках больных СК быстрая репарация ДНК. не наблюдается и, следовательно, имеет место дефект репарации у-индуцированных ОР в транскрибируемом гене с-шус.

5. В у-облученных фибробластах больного атаксией-телеангнэктазией по сравнению с клетками здорового донора отсутствует повышенная индукция ОР

и не выявляется преимущественная репарация ОР в транскрибируемой ДНК гена с-шус, тогда как в сателлитной ДНК уровень индукции ОР н кинетика репарации сопоставимы с таковыми в нормальных клетках.

б. Эпидермальный фактор роста стимулирует репарацию у-индуцированных ОР ДНК в покоящихся клетках НеЬа преимущественно в нетранскрибируемой сателлигной ДНК.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Бильдин В.Н., Игушева O.A. Репарация гамма-индуцированных одпонитевых разрывов ДНК в транскрибируемых и нстранекрибирумых нухлеотидных последовательностях генома человека // Тез. докл. Всесоюзного совещания "Функциональная морфология клетки". Цитология. - 1991. - Т. 33. - N 9. - С 53.

2. Игушева O.A., Бильдин В.Н., Жестяников В .Д. Влияние эпидермального фактора роста на репарацию у-индуцированных одмонитевых разрывов в транскрибируемой и нетранскрибируемой ДНК клеток HeLa // Цитология. -1993. - Т. 35. - N 10. - С 73-74.

3. Игушева O.A., Бильдин В.Н.,Жестяников В.Д. Репарация у-индуцированных одно: ггевых разрывов в транскрибируемой и нетранскрибируемой ДНК клеток HeLa // Цитология. - 1993. - Т.35. - N 11/12. - С 54-63.

4. Игушева O.A.. Бильдин В.Н., Жестяников ВД. Эпидермальный фактор роста стимулирует репарацию у-индуцированных одпонитевых разрывов ДНК в клетках HeLa преимущественно в нетранскрибируемой ДНК // Доклады Академии наук. - 1994. - Т. 338. - N 3. - С 416-419.

5. Игушева O.A., Бильдин В.Н., Жестяников В.Д. Индукция одпонитевых разрывов при у-облучении в транскрибируемой и нетранскрибируемой ДНК клеток HeLa // Цито^гия. - 1996. - Т. 33. - N 2 . - С. 203.

6. Игушева O.A., Бильдин З.Н., Плескач Н.М., Михельсон В.М., Жестяников В.Д. Репарация у-индуцированных однонитевых разрывов в транскрибируемой и нетранскрибируемой ДНК в клетках с синдромом Кокейна // Цитология. - 1996. - Т. 38 N. 2. - С. 204.

7. Igusheva O.A., Pleskash N.M., Mikhelson V.M. and Zhcstyanikov V.D. Repair of y-ray-indueed sir.glc-stiand breaks ir. transcribed ar.d ron-transcribed DNA in cells of ataxia telangiectasia patient //FEBS Letters, направлена в печать.