Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ассоциация и разобщение ДНК-белковых комплексов доменов хроматина в зависимости от процесса клеточной пролиферации

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Ассоциация и разобщение ДНК-белковых комплексов доменов хроматина в зависимости от процесса клеточной пролиферации"

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ РОССИЙСКОЙ АКАДЕЛШИ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

На правах рукописи УДК 577.113

С Ь Я К С Т Е Николай Изидорович

АССОЦИАЦИЯ И РАЗОБЩЕНИЕ ДНК-БЕЛКОВЫХ КОМПЛЕКСОВ ДОМЕНОВ ХРОМАТИНА В ЗАВИСИМОСТИ ОГ ПРОЦЕССА КЛЕТОЧНОЙ ПРОЛИФЕРАЦИИ

(03.00.04 — биохимия)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

?

/

„' г

Санкт-Петербург 1992

Работа выполнена в Институте органического синтеза Латвийской ЛН, г. Рига (директор — акад. ЛАН. проф. Э. Я. Лукевиц).

Офпальные оппоненты:

чл. — корр. РАМН, доктор медицинских наук, проф. К. П. Хансои

доктор биологических наук, проф. В. И. Воробьев

доктор биологических наук, проф. В. П. Комов

Ведущая организация 1— Институт биологии развитии ни. Н. К. Кольцова РАН

Защита состоится 22 октября в 12.00 часов па заседании специализированного совета Д 001.23.01 при Научно-исследовательском институте экспериментальной медицины РАМН (197022, Санкт-Петербург, ул. академика Павлова, д. 12).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ПЭМ по вышеуказанному адресу.

Автореферат разослан «_» ___ 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета, докт. бцол, наук

Л. В. ПУЧКОВА

ввадишв

Актуальность проблемы. Интенсивное развити исследований по клеточной биологии в последние годы привело к кардинальным сдвигам в понимании процессов регуляции клеточной пролиферации. Охарактеризованы клеточные онкогены, регулирующие прохождение клетки по митотичясксму циклу. Выявляются механизмы злокачественной трансформации. Хорошо изучены онотеми, обеспечивающие реакцию клетки на внешние сигналы к пролиферации. охарактеризованы многочисленные ростовые факторы и и*, рецепторы, в цело внявлен путь передачи сигнала от мембранного рецептора через внутриклеточные посредники из геном. Из целостной картины пока внппдает одно звено - механизм переотроек генетического аппарате в целом, направленный на активацию генов, ответственных г»а регуляцию клеточной пролиферации. К настоящему времени накопилось много данных об изменениях в упаковке хретлатинэ и лодификации отдельних макромолекул в его составе в связи о «пуском или прекращением процесса клеточной пролиферации, а -анже при других физиологических и патологических процессах -[.ифференциропке, старении, злокачественной трансформации и других ;эболеваниях. Модификации затрагивают слагающие хроматин акромолекулы: изменяется его белковый состав, белки подвергаются осттрансляционным модификациям. Изменения . нуклеинового омпонентв хроматина в основном сводятся к изменению степени этилирования оснований и модификации вторичной структуры -скоплению иди репарации разрывов ЦНК. Накопление разрывов ДНК зпровоадает переход клеток в состояние покоя, их •4форенцировку, сопутствует старению оранизков, сопровождает >йствие многих канцерогенов и может вызвать малигкизацию. рушение репарации разрывов ДНК характерно для

;слеток больных наслэдствешыми синдромами, аутоиммунными забслзваняями, повреждению ДНК способствуют стрессовые. состояния. Функциональны» изменениям подвергаются также надмолекулярные комплексы хром&тина - его первичная и вторичная структура, организация доменов. Среди структур клеточного ядра особое внимание уделяется ядерному матриксу {скелету). С ним ассоциированы многие регуляторные последовательности ДНК, ферментативные комплексы, осуществляющие репликацию, транскрипцию и модификацию ДНК и ядерных белков. ПоллпептидниЯ состав срелета и ассоциация с дам различью: последовательностей ДН1-С реагируют на изменении физиологического состояния клетки. Однако, чрезвычайная сложность системы пока не позволяет понять общую картину событий.

Чтобы в некоторой степени заполнить существующий пробел, нами были наследованы Закономерности изменения вторичной и четвертичной структуры ДНК и характер ДНК-белковнх азаимодействиг в доменах хроматина покоящихся и прелиферирующих клеток с цельк установить закономерности в изменениях их структуры, связанные с клеточной пролиферацией и покоем.

Работа является логическим продолжением цикла исследований составивших кандидатскую диссертацию. С использованием оригинального метода нуклеопротэид- целит-хроматографии, позволяющего фракционировать нуклеиновые кислоты по прочности ассоциации с белками в нуклоопротеидах Оыло обнаружено неизвестное в то время явление - ослабление прочности связи ДНК белками в ядрах клеток переходящих от пролиферации к покою. Ослабление прочности связи ДНК-белок, выраженное в меньпе( степени было замечено и при действии многих противоопухолевых ореларгзгое. Были начаты исследования механизмов обнаруженных явлений и была предложена гипотетическая модель оргонигации

домена хроматина, согласно которой обнаруженные явления объяснялись внесением разрывов Д1Ж. Однако, произвести экспериментальное доказательство гипотезы тогда не удалось. При завершении работы над кандидатской диссертацией была предложена новая модификация метода, значительно увеличившая его разрешающую способность. В то г;е время под сомнением оказались многие результаты, по."УЧвнт;е при помощи старой модификации метода.

В настоящем исследовании основное внимание уделено исследованию молекулярного механизма перестроек доменов хроматина при изменении пролу.ферат! -ного статуса ¡слетки. Для етого были подробно изучены ДНК-белковые взаимодействия в ядерных суботруктурах. Проведено картирование • разрывов ДНК, вносимых нуклоаззыи в домейо хроматина. Перестройки хроматина,связанные

0 изменением прслиферативного статуса клетки исследовались на хорошо охарактеризованных моделях при помоци метода НПЦ-хроматографт« в новоЛ модификации, данные которой позволяют производить корректную трактовку результатов.

Дели и задачи исследовашгч. Целью работы было установить закономерные изменения в структуре доменов хроматина, сопутствующие процессам пролиферации и клеточного покоя. В основном мы опирались на данные о характере связи ДНК о белками ядерного магрикоа и хроматина, полученные при г/омоши оригинального метода нуклеопротеид-целит-хромагографли. Для правильного понимания физиологических изменений в структуре хроматина Ошм исследованы особенности ДНК-белкових взаимодействий в оуОкомпартментая домена.

Ныли поставлена следующие конкретнее задачи;

1 .Идентифицировать пики ДНК на НЩ-хроматограымах

де зо кс и рп бон у к.че о прот г днымм комплексами субструктур клеточного

ядра.

2 .Исследовать прочность взаимодействий ДНК с различными субкомпонентами ядерного матрмкса.

3.Охарактеризовать белковай коытюиепт различающихся по прочности нуклвогсротеидов ядерного матрикса.

4.Исследовать характер ДНК-белкових взаимодействий во фракциях хроматина, различающихся г.о транскрипционной активности.

5.Для оценки характера физиологических изменений б структуре доменов хроматина ировести На модальных системах исследование влияния рапршзов ДНК, вносимых нуклсазамл с иявестшм механизмом действия на характер вссогдеввди домонв с ядерным юатриксом.

6. Последовать измэнения в ассоциации ДНК с белками, ядерного матрикса и хроматина при переходе «.каток от пролиферации к покою и обратно на нескольких моделях.

7.Исследовать сопутствухп;яе изменениям пролиферативного статуса клетки нарушения вторичной структура ДНК и изменения степени ее суперспирализации.

8.Последовать распределение разрывов ДНК, связанных с состоянием клеточного покоя во фракциях ДНК, различающихся по структурной сложности и функциональной активности.

Научная новизна рибиты. В настоящей работе впервые:

- обнаружен феномен открепления ДНК от ядерного матрикэа при переходе клеток в состояние покоя.

- описано накопление двунитевых разрывов ДНК в покоящихся клетках и их репарация при возобновлен;!;] деления.

проведено картирование разрывов, вносимых различными нуклоазами э доменах хроматина.

- выявлены белки ядерного мзтр'/.кса, образующие различающиеся пс прочности комплексы о ДШС.

- обнаружена гетерогенность прочно связанны* о ДНК белков по природе ДНК-белковых взаимодействий.

- обнаружены изменения п степени о у перс пира лиза ции ДНК в ходе развития опухолей.

количественно охарактеризована прочность ДНК белковых взаимодействий в трэнскрилционно активном И неактивном хроматина.

- описаны'3 типа частиц хроматина, различающихся но прочности связи ДНК-белок.

- обнаружено обогащение разрывами ДНК фракции активного хроматина в покоящихся клетках.

выявлен неслучайный характер распределения разрывов ДНК, возникающих в покоящихся клетках, в повторяющихся последовательностях и структурных генах.

- на основании данных дисоертации разработана модель структуры домена ДНК в покоящейся и пролиферирующэй клетке.

Научно-практическая значимость. Результаты работы могут быть использованы в разработке новых подходе-о • для оценки степени ди^ференцированности и пролиферативной . активности опухолей, что важно выработки тактики и оценки эффективности терапии опухолей. Разработанные в исследовании подходы смогут быть использованы при изучении механизма действия цитостатических и отимулируюдих пролиферацию <$ермакологических препаратов.

Основные положения, выносимае па защиту. 1. В клеточном ядре выявляются 3 типа ДНЯ, различанцтхоя по прочности связи ДНК-Челок - ДНК О, ДНК I, ДНК II. Домены хроматина ассоциированы с ядерным окелетоы посредством слабой (ДНК I) и прочной (ДНК II) ояязей. Связи образованы различными группами Оелков ядерного матрикоа. Места образования связей разделены пространственно.

2. По прочности связи ДНК-бело* частицы хроматина ÍДНК О) разделяются на 3 класса - диссоциирующие в 1Í.' и ЗМ ЫаСХ. Активный хроматин обогащен 1М и ЗМ частицами, неактивный - ¿M.

3. Белки, сохраняющие сояэь с ДНК пооле ее делротешшзацил гетерогелны по прочности связи о ДНК. сни образуют все три типа вышеупомянутых связей, а кроме н х, еще к ковалеитныо комплексы.

4. В пролиферирулиих клетках животных все ДНГГ. ядра ассоциирована - свчзонц между собой непрерывной молекулой ДНК. Рри перехода к.геток в состояние покоя в молекулу ДИН вносятся двунитевые раприьы, которые приводят к разобщению ДНК-белкоьых комплексов дом?шв хроматина. Это проявляется как открепление части хроматина от адерного матрикса и разобдение ДНК II и ДИК

Í?. Разрыва, приводящее к разобщению ДНЛ распределены по геному неравномэрно - ими обогащеьа несвязанная с матриксом фраюда хроматина, транскрчпционно-вктивнчЛ хроматин, повторяющиеся последовательности.

Апробаушг диссертации. Результата работы доложены и обсуждены на: XVI и XX конферекдаях <!>КВО (Москза,1984; Будапешт,1990); ТУХ конкуренции йвропсйокого общества по мутагенам ви&шней средк {Мсокг>а, 1SS4); VIII Объединенном симпозиуме биохимических обществ СССР и ГДР "Проблемы современной биохимии и биотехнологии" (Рига, 1985); XI Европейском рабочем совещании по ядру (Суздаль, 19£9); Международном симпозиуме "Митоз и трансмиссия хромосом'1 (Ленинград, 19Э0); VIII, IX и X Всесоюзны:: симпозиумах "Структура и фу ниши клеточного ядро" (Пудино, 1984; Черноголовка, 19S7: Гродно, 1990); V Всесоюзном Снсхюличэеком съезде (Клав, 19Ьо); VI Всесоюзной пколе молодого биолога (Дудаьбо, 1983); Всесоюзных совевдниях "Актуальные вопросы клеточной Г-иологии" (Ленинград, 1989, 1990); VII Нее-

союзном симпозиума "Мо.лекулярны? механизмы генетических процессов" (Москва, 1990); Воесоюзной тколе-семинзре "Молекулярная биология и медицина" (Ленинград, 1990); II Всесоюзном совещании "Генетика развития" (Ташкент, 19У0); III" Всесоюзном симпозиуме "Клеточные механизмы адаптации" (Чернигов, 1391); I Всесоюзной школе-семинаре "Повреяедения ДЬК лейкоцитов человека генотоксич^скьмч агентами производственной и oi<руда'сщей среды" (Ивано-Франковск, 1991); III Всесоюзном симпозиуме ''Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии" (Самарканд, 1991); VII конференции онкологов Прибалтики (Шланга, 1990); VII конференции биохимиков Прибалтики (Kayнас, 1Э90); Конференции молодых ученых Киевского НИИ ренттмиологии, радиологии л онкологии (Киев, 1988); 1 конференции врачей-лаборантов Латв.ССР (Рига, 1981). На заседаниях Латышских обществ биохимиков (1988, 1990), генетиков и селекционеров (1903, 1091), медицинских генетиков (1939). На г.'.емаборяторньчс конференция): в Латвийском НИИ аксперш,читальной и клинической медицины. Институте микробиологии Латвийская АН, ПИЙ онкологии им проф.Петрова, Институте органического синтеза ЛАП.

Публикация. По материалам диссертации получено авторское свидетельство СССР на изобретение ("Способ определения прочности свяби ДНК-белок с нуклеопротеидв*" И 1440В92), опубликованы 55 научных работ включая 1 монографии, j статьи в международных изданиях, 10 - вс всесоюзных, 7 - республиканских. Тезисов докладов на международны* конференциях - 5. всесоюзных И межреспубликанских - 19, республиканских - 2.

Объем д структура диссертации. Диссертация мэлокепа im ЭЭЗ отраницчх чэшчисписнсго текста, включая 50 рисунков. Работе состоит из гшедения, обзора лптерятурп, материалов и методов,

- а -

результатов исследования, обсуждения, заключения и выводов. Указатель литературы содержит 309 ссылок на русском языке и 546 на иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на культивируемых tu uttro трансформированных SV-40 фибробластах джунгарского хомячка линии 4/21, на культуре клеток фибросаркомы легкого человека НТ 1080, а также на перевиваемых опухолях: асцитной карциноме Эрлиха и лейкозе Р 308. Клетки НГ 1080 культивировали в среда Игла с 20% сыворотки крупного рогатого скота, клетки 4/21 - о 10Ж о^вороткк. Клетки «¿/21 переводили в состояние покоя инкубацией в течение 7-9 суток в среде о пониженной до 1$ концентрацией сыворотки. Лейкоз Мышэй Р 388 пассировали на гибридах первого поколения мышей 057B1/DBA, животным внутрибркшинно вводили По 0,2 мл шестикратно разведенной аоцитной хидкооти. На 8-е сутки пооло перевивки Клетки прекращали деление. Аоцитную карциному Эр/>иха, твтраплоидный штамм, пасоировали На беспородных мышах, которым вводили по 0,5 мл аоцитной жидкооти. Асцит забирали на 7-й день пооло перевивки. Для получения еффекта "голодания" клетку инкубировали & аоцитной жидкооти о 1 мг/мл гепарина в течение 1-4 часов (Wieloi'ene et al., 1983).

Препаративные методы. Клеточную ДНК очищали вкстракцие! фенолом, хлороформ-изоамиловым спиртом или высаливанием волков Транскритуюнио-активнне и неактивные последоветельност! раздел/и , методом фенольно-солевой екстракции (Стручков Стражевская, 1971 ). Транокрипционно-активную фракцию получал вкстракцией 75% фенолом рН 7,2 в 1М NaCl, неактивную - 66£ фенол рН 8,3 а 0,14 М Ка01, из нерастворимого остатка при помою депротеинизнции получали "потенциально-активную" фракци» AVí >

Ядра изолировали обработкой клеток 15t Тритоном X10Q. Хромати получали и фракционировали обрабатывая ядра ДНКазой X, ДНКазой II или микрококковой нувдаазой (Уманский, Ермакова, 1982; aintraub 1984) а также рестриктазами AIuI и Uepl (Таг!, dird, 1090) н экстракцией растворами различного ионного состава. Частицы активного и неактивного хроматина разделяли при помощи влектрофореза (Weintraub, 19В4) на установке для препаративного влектрофороза конструкции В.П.Калиновского. Ядерный матрико получали по Berezney, BucJiholz (1981).

Аналитические методы. Нуклеиновые кислоты разделяли по признаку прочности ассоциации с белком в нуклеопротеидах методов нуклеопротеид-целит-хромэтсграфии, Попользовали трохградиентнцй вариант метода (Н.И.Сьяксгг и др., 1985). Исследуемые нукдаоцэотеиди необратимо сорбируются на цедите белковой частью Нуклеиновые кислоты высвобождаются из комплекса о белком последовательными градиентами NaCl (О - 311), ÜCl-мочевияы И температура (0° - 100° С ¡три постоянном пропускании 4M L101, 8М мочевины), Элюат делилоя на фракции, в каждой из которых содержание ДНК определяли радиометрически, если ДНК была предварительно мечена, или по оптической плотности. В некоторых опытах ограничивались поотановкой градиента NaCl. Частоту однонитевых разрывов определяли методом щелочного раскручивания ДНК (Газиев и др., 1979), двойных - нейтральной елюцней ДНК (Bradley, Taylor, 1981). Степень фрагментированности очищенной ДНК определяли при гюмоощ влектрофореза а нейтралы«« или щолочнчх условиях, негативы снимков гелей сканировали, частоту разрывов рассчитывали по Fr «.man et al.(1966 ), Частоту разрывов в повторах раалмчной сложности определяли по Бубнову и др, (1906). Слот-гибридизации о молекулярными зондами проводили

согласно стандартным процедурам (Маниатис и др., 1984). Степень еулерспирализации ДНК определяли методом капиллярной вискозиметрии нуклеоидов (Блохин, Стручков, 19Я9).

.. J

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ На первом втапе работы предстояло идентифицировать фракции ДНК, выявляемые при НПЦ-хроматографироввнии клеточных ядер: ДНК О, влюируемую градиентом Иа01, ДНК I, елюируемую градиентом ЫС1-мочевины и ДНК II, елюируемую при высокой температуре.

Расиределшше 3 типов ДГШ в субструктурах ядра. Для решения этого вопроса провели НПЦ-хроматогрэфирование изолированных оубструктур ядра. Приметим несколько приемов для разделения Хроматина и ядерного матрикса. Связь ДНКП, превалирующая в ядрах лролиферирущих клеток, сохранялась при осторожной экстракции хроматина фенолом, НПЦ-хроматограммы ДНК интактных клеток и комплексов ДНК-матрико после последовательной экстракции активного и неактивного хроматина идентичны.

В препаратах ядерного матрикеэ, выделенных экстракцией 2М МаС1 также преобладает пик ДНК,II. Если ядерный матрикс выделяли из ядер, обработанных ДНКазой1 или микрококковей нуклеазой при НПЦ-хроматографии виявлялись фракции ДНКП, ДНКТ. иногда - ДИКО (рис.2). В препаратах хроматина, полученных обработкой ДНКазойИ и экстракцией низкой ионной силой присутствуют лишь комплексы ДНКП (рис.1), а в препаратах Хроматина, полученных обработкой различными нуклеазами и екстракцией низкой ионной силой - ДИКО (рис.1,2). В комплексе ядерного матрикса с остаточным хроматином после обработки микрококковой нуклеазой обнаруживаются комплексы ДНКО и ДНК1 (рио. 2). Совокупность приведенных данных подтверждает

Рис.1. НЛЦ-хроматогрвммн ДНК из фракций хроматииь, полученных при помощи гидролиза ДНКазой II (100 ед./мл, 1ч, 24 С), в - осадок; б - (^-осаждаемый хроматин; в - Мз-растворимий хроматин.

20 30 40 50 фракции

Рис.£.НПЦ-хроматограммы ДНК субъядерных фракций, полученных обработкой

'яэолирор^нных ядер клеток асшга Эрлиха микрококгсовой нуклеазой (100 ед./мл, 5 мин, 37 С).

Черные коужки - растворимый хроматин, белые

нерастворимый.

днк о

лик I ■ ДНК II

-I I---11--1

20 30

ФРАКЦИИ

утверждений о том, что связь ДНКО образуют белки хроматина, ДНК] и ДНКИ - белки ядерного ыатрикса.

Балки, образуюЕ?ш "прочную'1 и "слабую" связи ДИК с ядерный шгриксои. Высокая устойчивость прочной связи ДНК-матрико I диссоциирующим агентам и ее разрушение при высоко} температуре привели к мысли о ее топологической природе. Предлолоадтедьно, оне образована белковым стержнем, проходящим сквозь локально денатурированный участок ДНК. Подобная связь устойчива к действию денатурирующих агентов и может быть' разрушена только при денатурации ДНК или внесении разрнво, в участок. Гипотеза предполагает дна возможных варианта взаимоотношений прочной и г; да боя связей: 1, точки образования прочной и слабой связей образованы разными группами белков и разделены пространственно и 2. при нарушении целостности топологического ДНК-белкового.комплекса прочная связь сменяете слабой. Согласно етой гипотезе топологическая связь образована белковым стержнем, проходящим сквозь локально расплетешыЯ участок ДНК. Подобная связь устойчива к действию дизооциируюциа агентов и моаат быть разрушена только при денатурации ДНК или внесении разрывов в участок. В пользу последнего предположения свидетельствует гиперчувствительност прочной овяза к действию некоторых нуклеаз (рис 2). Воздействие ДНКазой 1 или микрококковой нуклеазой на изолированные ядра вызывает исчезновение пика ДНКИ. Одгако, после выделения ядерного (лириков на обработанных нукдзазг яд9р, при условии достаточно еисокой удэльнай радиоактивности ) на КЛЦ-лроматогрэммах наряду с ДНК1 обнаруживается и пик ДЬЧП По-видимому, муклеазы атакулт участки ДНК, расположенные бл;*з места образогания прочной связи, домен остается закрепленном н-

матриксе слабой связью. На хроматограммах обработанных нуКлеаззми ядер превалирует пик ДНК1, ДНКII по сравнению с ним незаметен. В ходе экстракции растворами еысокой и низкой ионной силы молекула ДНК фрагментируется гидродинамически, молекулы, связанные О мвтриксом слабой связью укорачиваются, поэтому в конечном препарата пики ДНК1 и ДИКИ сопоставимы. Результаты могут быть объяснены наличием дву* раздельных точек образования связей ДНК1 и ДНКII. Более того, оказалось, что бвлки ядерного мчтрикса, образующие прочные и слабые комплексы с ДНК по-разному чувствительны к протеолизу. ГТри инкубации комплексов ДНК-матрикс с пронвзой Р прочная связь ДНК-мэтрикс сменялась слабой. По-видимому, связи образованы группами белков, рпзличакчцммися по устойчивости к Протеолизу.

Окончательно разнмй белковый состав прочных и слабых комплексов был подтвержден НПЦ-хромат графией Д11К-белког>чх комплексов лизатов ядерного мчтрикса фракционированных по сродетп/ к гидроксияпатиту по методу М.П.Куцего о соавторами (1983). Комплексы ДНК-матрикс из клеток асцитной карциномы Эрлйха обрабатывали рестрпктазями, чтобы удалить лианюю ДНК, не затрагивая мест образования прочной связи и лизировали в 8М мочевине, 0,1Й 1)Б-На. ДНП отделяли от свободных белков г^ль-фильтрацией. Фракцию ДНИ фиксировали на гидроксиапятите в 0,01 М сросфатном буфере, по^ле чего вкстрагировали 0,2М Иа-ФБ, 5М мочевиноЧ (Фр. А); 0,4ЯМ Нп-ФВ (Фр.£1); 0,5М Иа-ФБ, Ы мочевиной, г>,1Я Ов-Пн (Фр. В). Известно, что фракционирование на ГАП позволяет получить группы белкоп матрикса, различающиеся как по составу, так и по функциям (Куцый и др.,19ВЗ). НЛЦ-хромзтография нукл-олротсидон из разных фракций показала, что фракция А, оод^ря'чщая реплициругацуюся ДНК, как правило, обогащена прочными

ДНК-оелковши комплексами, фракция Б - слабыми. Во фракцугч В соотношение пиков колебалось от опыта к опыту. Результаты еще раз подтвервдают различил белкового состава прочных и слабых комплексов ЛНК-метрике и вовлеченность прочней связи ь процесс репликации.

Для препаративного выделения белков, образующих комплексы ДНК1 и ДНКИ использовали различную чувствительность связей к нуклеазной обработке. Для получения прочных комплексов препараты ДНК-матрикеов обрабатывали рестриктазами, лизировали в О/\% Ш-Na, 8Ы мочевине, затем лизвт перенооиТи в 2М 1.1.01, 4Ы мочевину. При втом должны были распасться слабые комплексы и сохраняться прочные, нуклеопротекды отделяли от свободных белков голь-фильграцией в 2W L101, 4Ы мочевине. Для получения слабих комплексов препараты матрикоа обрабатывали ДНКяэой I, лизировали в 0,1% DS-Na, 8W мочевине, Нуклеопротеиды отделяли гель-фильтрацией ь той Чке среде. НЛЦ-хроматографин Д}Ш, полученных двумя методами подтвердила, что в первом олучае действительно преобладал прочный тип связи ДНК-белок, в другом - слабый. Электрофэрэз белков, образующих оба типа комплексов показал, что слабые комплексы составлены полипептидами о Ш 180, 65-75, 50, 47-50 кДа, прочные - 180, 65-75, 63, 61 , 50, 5Р-53 кДа. Поскольку позднее били получена данные о том, что прочная связь частично резиотентна к ДНКазе I, в слабых комплексах по-видимому присутствует лримеоь лрочних. Среди полипептидов особого ьпдаания заслуаощает белок о ММ 180 кДа, по молекулярной массе близкий к топоиэомэразе II - одному из основных компонентов ядерного матрикса (Gaseer et al.,19S6: Earashai/ et al.,1985). Трпплег в области 55-75 кДа сходен с ламинами. В целом т весь набор ^лков натминал ток називаемие прочну.^-овязанннв с ДНК белки, который

сохраняют связь с ДНК посла депратеинизации и, как считается, образуют ковалепгние комплексы о ДНК (Werner et al,,1984; Чернохвостов и др.,1986),

Гетерогенность устойчива* к депрогвинизмцил балков ю прочности связи с ДНК Игвестно, что вти б^лки вводят в состав ядерного матрикса, имеются данные об их участии в транскрипции и репликации, но в целом их функциональная роль непонятна, Ыы предположили, что противоречивость результатов может бить обусловлена разнородностью схожих по молекулярным массам белков, получаемых разными методами. Белки, полученные депротешшзацией ДНК фенолом (Werner et al.,1984) или экстракцией ядер солью jii детергентом (Чернохвостое и др., 1986) могут отличатьоя по прочности ассоциации с ДНК и, следовательно, функциональной роли.

Для проверки етого предположения провели НШ-хроматографию комплексов ДШ( с ирочносвязанными белками. ДНК получали из голодающих клеток асцита Эрлиха ркстракцией фенолом и/или хлороформом. Комплексы ДНь.-белок отделяли от чистой ДНК сорбцией на нитроцеллюлозе (Neuer, Werner,1985). ДНК из голодании* «теток несет в себе разрывы, которые очень мало влияют на НЛЦ-хромато-графическое распределение ДНК, иц воспользовались втим обстоятельством, чтобы прометить ДНК ■'Н-ТТФ в ДНК-полимеразной реакции. Меченную "чистую" ДНК и ДНК-белковые комплексы подвергла НПЦ-хроматографии (рио. 3). "Чиотая" ДНК в основном проходила колонку, небольшие фракции влюироеались градиентами NaCl и ЫСН-мочевинн, очевидно, вто комплексы, образуемые ДМ-полимера-зой I. На НПЦ-хроматограммах ДНК-балкоьых комплексов предотетлбны все три типа связи ДНК-белик, что указывает на их чрйзвычайнук-гетерогенность по характеру ДНК^белковых взаимодействий.

Пои учите воспроизводимые НОД-хрсыатограшш биосиитчт ¡'¿скм

Рис.3, а - НПЦ-хроматография ДНК голодающих клеток асцитной карциномы Эрлиха, меченной в ДНК-полимераэиой реакции. 1 - ДНК о прочиосвязанными белками, нанесена на фильтр в 0,5 N KCl; 2 - чистая ДНК. Стрелки: I - конец градиента NaCl; II - конец градиента LiCl-мочевинн, начало градиента температуры.

О - Температурная елюция о нитроцеллюлозы комплекса ДОК с: прочиосвязанными белками. Наесены на фильтр: 1 - в 1 М KCl; 2 - в 4M LIC1, 8 М мочевине. Стрелки - втапы градиента температуры, верхний ряд - для 1, нижний - для 2. Отдельно стоящие точки - уровень радиоактивности фильтра после завершения градиента температуры.

По оси абсцисс - номера фракций, По оси ординат

радиоактивность JH ймп./мин. » 10 .

ыеченной ДНК прочноовязанних комплексов по непонятным причинам не удавалооь, повгому для исследования ДНК-белковых взаимодействий ъ таких препаратах применили метод влюции о нитроцеллюлозы, специально разработанный для втой цели (авт. свид. N 144Й892). Нуклеопротеиды сорбировали на нитроцеллюлоза в 1М К01, после чего через фильтр пропускали 4ы L1G1, 8М мочевину, лоотепенно нагревая систему от комнатной температуры до 100° С. В данном случае тоже было получено гетерогенное распределение (рис. Э б), часть ДНК влюировалаоь при комнатной температуре (соответствует ДНКО и ДНК1 на НПЦ-хроматогрэммах), часть - при 0О°-9О° С, причем наблюдается несколько разрешившихся пиков. Небольшая часть ДНК оставалась на фильтре VJoojis завершения градиента температуры. По-видимому, именно вта фракция и предотавлявт ковалентние комплексы, наличие остальнш. фракции свидетельствует о чрезвычайной гетерогенноати устойчивых к депратеинизации белков по прочности связи о ДНК,

Соответствие ДНК1 и ДНКII связям ДНК-иатрико других типов. Поскольку нами были выявлены два типа связи ДНК-матрико представляло интерес сравнить их войотва со связями ДНК-матриед, обнаруживаемым и другими методами. Наиболее известны два типа связи, различающиеся по устойчивости к меркаптоетанолу и ЭДТА (Izaurralde et al., 1983i Глазков, 1986) - нуклвоиды X и II типов и, помимо вышеназванных, различающиеся по постоянству и зависимости от транскрипции. Известно, что зависимая от транскрипции связь разрушается в растворах с низкой ионной силой (yazln at al. , 1988). Чтобы выявить соответствие Д1Ш и ДНКП етим связям, ядерные матриксы, выделенные при помощи ДНКазы I инкубировали в средах с различный ионным составам - 1 мМ меркаптоетаноле, 5 мМ Mg01g; и 1 иМ черкангоатано"в, 10 r.i>J ЭДТА, ■ причем ь последнем случае ионы Hg" били исключены дияъ из

вллирующих растворов. Однако, как ДШС1, так и ДИКИ сохранялись после подобных инкубаций, следовательно наши связи не соответствуют нуклеоидам I и II типов. Это подтвердило и исследование распределения повторов в ДНК, образующей отн связи (см. нш;е). Оба типа связи уотойчивы также и к низкой ионной силе (инкубация в 1мМ трио-НОХ, рН 7,6; 2уМ ЭДТА), что указывает на их несоответствие постоянному и зависимому от транскрипции комплексам ДНК о . белками ядерного иатрикса. Таким образом обиарукенчные два типа связи ДНК-матрикс не соответствуют связям, обнаруживаемым другими методами и доступны для исследования только НЛЦ-хроматографией.

Диизательотва топологического характера связи Д1Ш.Т и ее ьовлеченностп в пхжзцесс репликации. Догадку об участии в образовании прочной связи расплетенного участка ДНК подтвердили; 1. наличие прочных комплексов во фракции лиэата матрикса, обогащенного одноиитевой ДНК (фралсция А); 2. чувствительности втсй связи к специфическим к однонитевоЛ ДНК нуклеазам (см. текст ниже); и 3. снижение температуры елюции ДНК в условиях, опоеоботвушчшс плавлении ДНК. Лоследаие достигались резким снижением ионной силы елмирующего раствора ( от 4 М до 0,12 11 ЫОЗ). Температура елюции при втом падала от 100иС до 1б°С),

Об участии втой связи в репликации убедительно свидетельствуют получетшо ранее данные по включению меченного тимидина в этот комплекс) (Сьяксть и др. ,1981). Теперь ето подтверждено препаративным выделением обогащенной репликативными вилкь..л5 фракции А, а такие данные 1.1 .М. Бабой кипа с соавторами (1увв). Постоянная овяэь домена о риплякагивным комплексом подтверждается многими исследователями (Войлаг, 1968; ИаггПьу е КаЗалдайго «1, а!., 19901 и др).

- 19 -

ДПК-белковио взаимодействия во фракциях хроматина, различаюядася по транскрипционной активности. Пики ДНК I и А»ПС II, как правило, чету» выражены и занижают неизменное положение на хроматогрьммах. В отличив от них, пик. ДМ 0 часто гетерогенен, состоит из нескольких субфракцчй (рис.1, 2). Представляло интерес выявить причину гетерогенности ДНК-белковых взаимодействия в хроматине. И выяснить следствия изменения характера ДНК-болковах взаимодействий, отмеченных при активации хроматина (Преображенская и др , 1984), на НГЩ-хроматограммах. В первой серии огытов исследовали ДНК-белтовые взаимодействия в растворимом и нерастворимом хроматине, полученном обработкой ядер ДНКьзоП I, ДНКазой II (Ермекова, Уманский, 1982) и микрококковой нуклоазой (Чалке,

, 1986). Известно, что растворимая фракция в известной мере обогащена транскрибируемыми последовательностями.Во всех случаях ДНК растворимого хроматина вяшровалаеь меньшими концентрациями НаС1 по сравнялию с ДНК нерастворимого хроматина. Это и&блмдали в препаратах хроматина, полученных обработкой ДНКчыоЯ I, после обработки ДНКаЗой II Мй-растворимыЯ хроматин елюирова оя большими концентрациями соли, чем нерастворимый хроматин (рис. 1). Примерно твкже различаются окстрагируемый и невкстрогируемнй низкой ионной силой хроматин из ядер, обработанных микрокпкковоА нуклеазой (рио. 2). Следовательно, .о данным НПЦ-хромотографии, ДНК и белок во фрпмцмх хроматина, обогащении* транскрибируемыми последовательностями связаны слабее, чем в Неактивном хроматине.

Поскольку п гюол^дни года стали появляться данные о наличии ангинных генов и наалунлейзоресиотентиой «фракции, ряпднлвн т активного и э&ктишюго хро! тини провели также при помощи

-а-о -

влектрофорааа в агврозном геле по Víelntraub (1984). Растворимый хроматин, полученный после обработки ядер микрококковой нуклеазой раэдвляетоя електрофорезом на мазок у старта (а-частицы) и свободные моно- и динуклаосомы (с- и b-частицы). а-частицы представляю?' о обо Я окрепленный гистоном Н1 агрегат неактивного хроматина, Ъ- и о-частици обогащены транскрибируемыми последовательностями. ' Чаотицы получали препаративным электрофорезом в аппарате конструкции В.П.Калиновского. На рис.4а представлены НЩ-хроматограммы исходного препарата хроматина, 46 - а-частиц, 4в - с-чаотиц. ДНК а-честиц - неактивного хроматина елмируется большими концентрациями соли, чем ДНК исходного хроматине, следовательно ДНК и белок тпм 'связаны прочнее. В с-частицах картина более сложная, имеются пики на 1М и ЗМ NaOl, то есть большая часть ДНК связана о белком олабее, чем в хроматине в целом, но имеется и прочноовязанная фракция.

Таким образом, при помощи двух подходов показано ослабление ДНК-белковых - взаимодействий в активном хроматине. Однако, ценность результатов выла бы существенно умалена, если бы обнаруженные различия были бы обусловлены меньшим размером частиц в растворимой и бистродвижущейся фракциях.Подобного недостатка лишен метод выделения активного и неактивного хроматина, основанный на избирательной чувствительности первого к реотриктазе MspI, второго - AluI, В промоторных областях активных генов находятся иеметилированнш СрО островки, которые избирательно атакует реслриктаза Мер! по последовательности OOGG, Б неактивных генах ети последовательности метилированы и недоступны ферменту. Alul атакует последовательность АООТ, отсутствующую в СрО оотровквх и «олыбилизирует в oohobijom неактивный хроматин. НТЩ-хроматогрзммы хроматина, полученного

1 М

.1 м

Рис .4. НПЦ-хроматограммы активного и неактивного хроматина клеток асцмтиоЛ карциномы Эрлиха. Проводили только грациент . а-в - хроматш. получали обработкой ядер микрококхсшой пуклеазой н Фракционировали электрофорезом, а - тотальный хроматин; 6 - а-чаетицы ОыактиапыА хроматин) ; в - с-частчць: (активный); г - ».роматии, сопювилнзнрииаиш.!») рестрнктазой Мзр1 (активный); д-А]г-.1 (иееггивиыП). Стрелками обозначены концентрации НаСЗ. !Ъ оси вбсцикс - н.-.»л-ра Фракций, ло оси ордлнат - ЗИ илп./мин. лЮ(-З) 1а-в) нлн оп'И1Ч1'сьая плотность пои 260 ни (г,д)

вкстракцией ядер, обработанных рестриктазой físpl, раствором с физиологической ионной силой (активный) представлены на рис.4г,

AluT (неактивный) - 4д. ДНК активного хроматина елвдруется в оонопном 1М NaOJ., частично - ЗМ NaCl. В неактивном большая часть ДНК елюируется 2М NaCl. Бросается в глаза сходство о НЩ-хроматографической картиной а- и.о-частиц (рис.4 я,б). В данном случае частица неактивного хроматина были фрагментированы Alui" до олигонуклеосом, активный был представлен крупными фрагментами (примерно 11 тыс пар оснований). Таким образом, попожение фракции ДНК на хроматограмма не определяется размером молекул. Препараты хроматина, фрагментированные в различной степени делятся на аналогичные хроматогр^фические фракции. В препаратах активна«) хроматина преобладает слабо связанная ДНК, неактивного - елвируемая 2KI NaCl независимо от того, какой из препаратов фрвгментивован сильнее. При. разделении активного и неактивного хроматина влектрофоразом активный хроматин нридотаьлен мелкими фрагментами, при экстракции мосле лероварлнания рестриктазой MupI - крупными, но особенности НПЦ-хроматограмм остаются общими для обоих препаратов.

Частицы хроматина трех тилои, различиюциеоя по тэочности связи ДНК-белок. Учитывая ваююсть этих выводов, зависимость КЛЦ-хромато! рафичеоких свойств от размера частиц была исследована дополнительно. На рио. 5 представлены ШЩ-хроматогрьммы (только градионг UíiOi, число фракций увеличено ло сравнению со стандартной процедурой) хроматина, в возрастаю« й отенеии переваренного микре.кокковой нучлеазой. Видно, что При начальной фрагментации ДНК в основном илъ/руется при концентрации NaCl около ЭМ. по маре • усиления нераьйрь появляется mnt или плечо около ¿U, затем - 1М. Kft3-.fi'."си, Ч'.ч>, д,оЛепепельно, положение пика ДНК на IIПЦ-хроматог

- аз

0.2 0.1-I

1M

i

¡V

2ГЛ 3M

i |

IT

i» ¿i' -''1.

0,6

0,3

10

20

tí ,

4 '■, ■jV1' Si

f>;

иН

iJ.H

t

[

I ¡

\

f'

I ь

Рис.5. НПЦ-хроматогрмммн (NaOl) хроматина и &лектро$ор&граммы ÍU1K, осаждаемой иа фракциЛ. а - ядра бил и обработан« микрскокксвоМ гуклеазсЛ 100 ед./мл при 3? С 3 минуты; b - 10 минут.

!lr,dí

ISpl

lol

vil7

¿—fl 1А

Aiuí Su.,3 Ч tcol l .'btl Pvu: I

OCD

Ci'ilq -He, -

Hft - 13*HCHvlMe,

AhK¿au *tvp

; vy r ¡ ■ ;: i ¡;

"aH b^n^^^V^o-voV

1 'TJ

í ñ

Рис.Модель ассоциации ДНК с ядерник ма-грнкси». Слева

проливерирукися клетка, стрелкам обозначены w-wu

ятзкл нуклевз, ппргнад - хю.соящбж;/? клетм.

9 -.' ::/

\

I , . <1«1

| , С 1 <>!•

* о» t

CKCí «

- гч -

граммах зависит от размера частиц хроматина, ДНК иа хромато-графических фракций была осаждена отанолом и разделена електро-форетически, Оказалось, что а ДИК, влюируемой меньшими концентрациями соли больше мелких фрагментов, в ДНК, шинируемой большими концентрациями - крупных, однако эта тенденция выражена далеко не всегда, притом все фракции содержат значительное число фрагментов одинакового размера. Таким -Срезом, размер частицы не является определяющим фактором для положения ДНК на НЛЦ-хромато-грамме.

Применение растянутого градиента НаС1 позволило выявить дискретнооть положения пиков ДНК в втом градиенте. Максимумы наблюдаются при концентрациях соли около 1М, ?,Ы и ЗМ. Если выражен один ио пиков, оотальиые представлены в виде плеч. По мере переваривания хроматина изменяется »отношение пиков, но промежуточные формы не выявляются. По-видимому, речь идет о наличии трех классов частиц хроматина, различгшхчихсн по прочности ДНК-белковых взаимодействий. Активный хроматин обогащен 1М и ЭМ частицами, неактшний - 2М. Различил в прочности связи ДНК-белок могут быть обусловлены характером ДШ-гистоновых взаимодействий, например заменой точки контакта с ДН'Л. в глобулярной части тиотона на оьнзь ь хвостоьой чаоти молекулы (ИдоЬеуа еI а1., 1989) или нмличием ни линкерной негистоновых белков ДНК, которые теряются при Фрагментации.

Картировали« мо«т атаки нуклдизами внутри доиенн. Изложенный ьтип исслодоьания покнеил, что оьязи ДНКТ и ДИКИ образованы различными группами белков ядерного матрикоа, причем ДНКII рчсгК'Жш->на у места начала сопликацил. ДИКО рагвдвьнз белками хромяг ¡ша. ДНИ, ог^щух.щии ьту фраки'1» долятся нч три класса по прочное?и ДНК-йьЛкышх изаимодо ¿сгний, йо.шожно, чг<7

принадлежность к одном из классов обусловлена транскрипционной активностью фрагмента хроматина. В таком случае, домен хроматина можно представить следующим образом: петля ДНК закреплена в репликативном комплексе прочной топологической связью, слабая связь ДНК-матрике звмыкаьт субпетли, ДНК-гиотоновые комплексы, соответствующие связи ДНКО расположены в теле петли (рио. 6), Исходя из втой модели легко предотавить себе последствия разрыьсв ДНК, расположенных в различных частях домена. Однонитевне разршш в области топологической овязи, однонитивяе или двойные близ нее приведут к тому, что домен будет связан с матриксом только олабоЛ связью, «а НПЦ-хроматограммах произойдет переход ДНКИ - ДНК1. Двойные разрывы в теле петли гызопут открепление части ДНК от ядерногг матрикоа (переход ДНКII - ДНКО).

Нами были исследованы последствия атаки нуклеизами различного механизма действия па характер ШЦ-хроматографичиокого распределения ДНК. Это позволило не. только локализовать моста атаки различных ферментов, но и промоделировать происходящие б покоящейся клетке процессы. Обработка ядер пролиферируицих клеток ДНКаэой1 и ^икрококковой нукллазой вызывает резкий переход ДНКИ - ДНК1 при (рио. ?.). Первоначально было предположено, что ферменты атакуют непосредственно топологическую связь, но в препаратах яцерного митрике. , выделенного посла такой обработки небольшая фракция ДНКИ сохраняется. Скоре всего, ии ферменты атакуют и топологическую связь, и ев би'лжаРюев окружение,

Обработка ДНКнзоЛН сказывается нь НГЩ-хроматогрммм/)* инч'ш (рио. 1). В препаратах матрикса с остаючним ».ремонтом, полученного из ядер, обработанных ДНКозоНЛ, чшпмячтпн я основном ДНКГ1, причем о магриксом может оставаться евяинжшм оч^нь норотклЛ фрагмент ДНК. По-киди 1му, ДНКь'."-»П но зитрнггчвй^Т

непосредственно близко расположенной к репликативному комплексу ДНК и участок, соединяющий точки образования прочной и слабой связей.

Так как фрагментация ДНК в покоящихся клетках, о veo горой будет сказано ниже, зызшэется некими ендогенными ферментами, била проведена попытка найти подобные ферменты путем активации эндогенных ДНКазннх активностей клеточных ядер. Изолированные йдра, полученные из клеток лейкоза Р JQ8 инкубировали в средах, благоприятных для активац/и I,¡g2^-,- -, Мп2+-зависимых и

кислой эндогенных нуклеаз. Время инкубации было выбрано таким ос>разом, чтобы степень Фрагментации во всех случаях била примерно одинаковой. Активация ¡?тих ферментов вызывает переход ДНКП - ДНКО, фракция ДНК1 не появляется. Ло-вмдимому, ферменты вносят разрши в диетальнкх частях домена, не затрагивая мест связываний о ядерным матрмчеом. Похожие результаты получены на клетках асцитной карциномы Эрлиха. Поскольку в живых ПОКОЛ1ЦИХСЯ клетках переход чаще всего осуществляется по схеме ДККИ - ДНК1 •• ДНК'О, то есть'в первую очередь затрагиваются точки, связи ДНК с матрикоом, по-видлмо:лу, он осуществляется, ферментами, не входными в число исследованных нами.

Действительно, наиболее подходящими кандидатами оказались нуклэаои, имеющие сродство к однонитееой ДНК - Е1 и Bal 31. При обработка изолированных ядер кукло&зой ¡3., н&блдделся переход ДНК1Г - ДНК1, что подтверждает наличие участков одноьитевой ДН!С в месте образования прочной связи ДНК-матрикс. В выделенных препаратах ядерного метрикой индуцировался аналогичный переход, котсруй был более выражен, Нуклеаза Bal 31 обладала тем же действием, что и нуклеаза По-видимому, фермент с подобие»1 •механизмом дайствяя активируется & пскоя!цихся клетках, изЁ>еот»и|

нуклеаза, ассоциированная о ДНгС-полишразоЬ с, и имеющая сродство к однонитевой ДНК (Тимченко и др., 1903). Схема предполагаемых мест атаки различными нуклеазами представлена на ркс .6.'

Распределение повторяющихся последовательностей в доиене хроматина. Возможность локализовать разрыв в домене позволила провести иеслэдо&зние распределения повторов ДНК различного мотива вдоль петель ДНК при помощи НПЦ-хроматсграфиров&Ния препарате» изолированных ядер, обработанных различными рестриктй--зами. На рис. 7 представлены хроматограммы ядер, обработанных ростриктазами, атакующими тогрануклеотид и гекоануклеотид, включайся ту же последовательность. Видно, что рестриктазы вызнпамт переход ДНК II - Т. - 0, причем с увеличением частоты разрывов формзнтом, атакующим тетрануклеотид, но сравнению с узнающим гексануклеотид возрастает его эффективность (сопоставьте AluI (АООТ) и PvuII (GAGCTG), Sau3AI (С,ATO) и BainHI (С'.ОАТОУ). При сравнении раотриктаз, атакующих различные гексануклеотиды, обнаруживаются очевиднее различил. SalOI, HlniU'II, BarnlII вызывают мбнее выраженнный переход по оравнении о КооЯ!, Ра tí, FvuII Несмотря на различия в структуре генома мыши и человека такая же зависимость наблюдалась в клетках I1T1O80. Дннниз неоднозначно свидетельств?"« о неоднородности распределения повторяющихся последовательностей в домене хроматина, ото рпепроделиние сходно у мликопитакмих разных видов. Места образовиния прочной синий (район репллкь'гивного коИплчкса), по-ьи;1имоиу обогащены последоватилыюотями GAATTG, 8AG0TG, 0AGCTG, из татрынуклооч «дои - GATO, A GOT. Последовательности ААСОМ (ШлгЯП), ('CU.'} Шор I) п этой част домона представлены реке иг»к в кдоткэх мшаи, V*k и шлонека. Првдполчгримая локализации меот нчичи npi\roft>n.">-)fit ни эио.6. Получ« ные распределении еще. рад евцц^тлльствуи.т о

несоотвегптаии ДНК1 и ДНК1Х нуклеоидам I и II типов, так как ДНК, образующая ЭДТА -чувствительную связь содержит повторы сеЯтов для Рво!, БаХй1, нечувствительную - НооМ, ИпйНТ (Глазков, 1Э'?6). По нгшим данным ДИКИ должна быть обогащена сайтами узначан.м

и ЕооШ, следовательно, отличается и от ЭДТА-чувствителиюй и от н< :увотвитвльноЙ связей.

Таким образом, проведено моделирование изменений на НЯЦ-хроматогра.'Лмэх при помощи внесения разрывов ДНКазами с различным механизмом дели бия. Показяна принадлежность белков, обравуюи;их связи ДНК1 и ДНКП к двум различным группам белков ядерного матрикса, ДНКО - л белкам хроматина. Подфракции ДНКО ьанимахут '."ри дискретных положения а градиенте N301, положение определяется транскрипционной активностью частжш хроматина. Таккн образом, исходя из результатов изложенного этапе, исследований на оскоЕе■ изменений НПЦ-хроматографлческого распределения ДНК можно сделать заклхмение о модификации структуры доменов хроматина. Это позволило нам перейти к оледухпдему втапу исоледопаний - изменению организации домоноо хроматина в зависимости от процесса клеточной пролиферации.

Изменения НПЦ-хроиатографического распределения ДНК в зависимости от пролиферативного статуса клетки. В наших предыдущих исследованиях быж< обнаружено изменение характера ШЦ~хроматограмм при лерехо4е клеток в состояние покоя (Н.Ч.Сьяксте и др., 19Э1). На ланном этапе работы аналогичные исследования были проведены при помощи намного болэе умфсрматшзного трехградиентною варианта метода. Клетка 4/21, меченние "Н-тииидином, инкубировали в среде с сшзорстки по 9 суток л подвергали ЫЩ-хроматографии. ДНК пролиферирущих клеток «дтаровч/арь ь виде одного пика а градиенте температур с

i ------1 ■ ■ |г

ШЩ-хроштограциц ядер клеток аоцитнсЯ карцннон.ч Орлшга обработанных реогриктаззяи, узнавщиыи А или б пар основания, а: 1 -А1и1 (ДОСТ), 2 - Р\пи11 (ОАООГО): 0: 1 - ОаиЭА! (ОАТО), 2 -< ВмгИГ (СОАТСО).

Боэ - 600 ед./мл, 37*0, 1ч а орвднеоолавои рвотриктааном бу§вря»

- эо -

максимумом около 90° С. По маре инкубации в среде с 1 % оыворотю наблюдалось появление фракций, елюируемых градиентами Иа01 и 1ДС1~мочевиьн. Особенно била выражена фракция НаС1, содержание которой нарастало по море углубления состояния покоя. На 9-й дет инкубации дгалч ДНЧ, елюируемой ЫаС1, достигала 51Я>, при ето! митотический индекс снизился от 20 °/оо до 1-2 "Ло. Лосле повторной стимуляции полноценной средой через 2 суток митотический индекс почти вернулся к походному значение (1б %>о) одновременно снизилось до 1(>% содержание ДНК, елюируемой ЛаС1 (рис. В).

Аналогичные изменения наблюдались при замедлении роста перевиваемой опухоли Р388. Клетки прекращали деление на 8-й день после перевивки, в этому времени постепенно нарастало содержание ДНКХ и ДН1С0 по сравнению с первыми днями развития опухоли, когда клетки активно,. пролиферировали.

Изменения вторичной и четвертичной структуры ДНК. В обоих случаях изменения на НПЦ-хроматограммах сопровождались накоплением раорнчов ДНК. По даииим щелочного раскручивания ДИК содержание фрагыеитироьанной ДНК в пропиферируюцих клетках 4/21 составляет 13.04 ± 3.00$ (п = 10), в покоящихся увеличивается -39,7 ± 3,555 (п = 7), а после повторной стимуляции к делению снижается до 24,4 + (п = 5). Эти данные свидетельствуют о

накоплении и репарации однонитевих разрывов ДНК. Нейтральная элюция ДНК показала наличие и двойных разрывов, (рио.9), после стимуляции клэток к делению наблюдалась ид репарация.

Наличие двойных разрывов оказывается и на влектрофэретичеокой подвижности очищенной ДНК. Увеличение эликтр'хТорвтическоМ нодвиянооти ДМ было отмечено как при переходе в покой клеток 4z.i1, так и на последних днях развитил

ю м 'а ч ¡1 и м

V

л

'О 1а ' Ю 40 Ю 60

Рис.9. _ нщ-яроматогратш /ОГК платок 4721 при инменинин ни прали^вративного статуса: а - вые потенциально рэатутдзя культура; О -клетки в состоянии контактного торможения; в-д - кльтки, нзходл.'чиьол в течение 2, 5 и 9 сут. соот&етотвенно а среде о IX ошюроткой; е.ж -клетки посла стимуляции к росту полноценной ооздей а течение 1 и ?. суток соответственно. Стрелки см5озн£ч&юг: 1 - нг.ньц г(лди«нта 1/а01 2 - конец градиекта Ы.С1~моч4Вим" 3 - точки 90'С

Рис.9- Кривые нейтральной елюции ДНК клеток 4/21 с различные пролифвративным статусом. 1 - экспоненциально растущие платки (2-; день после посева); 2 - покоящиеся клетки (инкубация Ö сут а среде с сывороткой)! 3 - стимулированные к пролиферации клетки (48 ч после замещения среды о Iii сывороткой на полноценную.

Рис. 10 Зависимость эластовязкости нуклеоидов клеток Р 38В о' концентрации бромистого втидия в среде. 1 - 3-й сутки развипи опухали; 2 - 8-е. По оси абсцисс - концентрация бромистого втидия, и< оси ординат - еластовязкость. I - для 1; II - для 2.

- ээ -

лейкоза Р 388.

Наряду с ДНК-бэлковыми взаимодействиями и вторичной структурой ДШ( изменялась такж» степень суперспирализации ДНК нуклеоидоп. Не последних дчях развития точка вкпивр/ентности сдвигалась в сторону больших концентраций бромистого етидия (рис. 10».

Токим образом, при переходе клеток п состояние покоя наблюдаетоя накопление двуните,зых разрывов ДНК, которые•прчводят к откреплении части хроматина от ядерного мвтрикса. Открепившаяся Ф>рчкция хроматин;» претерпевает определении» изменения.

ДИКО иокшппихся клеток. При переходе меток 4/21 в состояние покоя енявляптся рпзличвющиося по • прочности связи ДНК-белок частицы (рис.8). На первых стадиях открепления хроматина от мвтрикса преобладают 1М и ?М фракции, о углублением покоя появляется 1М фракция. В препаратах хроматина, полученных из ядер пролифприрукщих и покояшлхоя клеток 4/21 после обработки ДНК.830Й1 НГЩ-хро«»этографическг>е распределение также различается. При уо.согиях перевара, когда ДНК пролиферирукидих клеток влюируется ЗМ №»01, в хроматине покоящихся клеток обнаруживаются 1М и 2М пики. Вштлинию чтих чястиц, по-видимому, способствуют двойные разрывы ДНК, накчиливающиекся в покоящихся клэтках.

Для понимания функционального значения обнаруженного феномена фрагментации хроматина в покоящихся клетках необходимо било выяснить, распределены " ли вти разрывы но геному случайно, или обладают к&коЯ-либо специфичностью.

Распределена разрывов в покоящияся клетках во фракциях ДНК, различающихся по '^точности ассоциации с иатриксом. Для того, что'1м опред1гдить, ДНК какой из фракций несет в себе больше разрывов, ядра клоток лейкоза Р ЭВ8 на последних днях развития,

когда в них накапливается значительное число одно- и дьунитерих разрывов ДНК метили ^Н-тим/Динтрифосфатом по прэдсущэствуыцим брешам в ДШС-полимеразной реакции, посла чего проводили НЛЦ-хроматографию (рис.11а). Как видно, метка распределилась следующим образом; ДНК О » ДНК I > ДНК XI. На хроматограмме аналогичного препарата, меченного биосилтегичаски имеет иеото обратное-распределение. Таким образом, наименьшая по массе ДНК 0 содержит большее чиоло разрывов, чем остальные фракции. Поскольку при выделении ядер возможно внесение артефактных разрыв в, опыты были повторен« на пермеабилизировашшх клетках Р 388. Включение метки в ядра было подтверждено радиоавто-графически. Метка почти исключительно включалась в ДНКО. Положение пика ДНКО совпадает у ДНК, меченной биоеинтетически и ник-трансляцией и отражает особенности развития опухоли, ча 4-й день пики представлены ЭМ частицами, на 8-й - 1Н и 2М.

Распределение разрывов ДНК ьо фракциях, различающихся па транскрипционной активцсс-ш. Известно, что регуляция процесса транскрипции связана с внесением и репарацией разрывов ДНК (Адлер и др., 1982 J Carpenter, 1984), цоэтому представляло интерес выявить распределение разрывов в транскрибируемой И нетранскри-бируемой ДНК. ДНК разделяли на транскрипционно-активную, неактивную И потенциально-активную фракции при помощи фонольцо-оолбБой экстракции и подвергали електрофорезу в нейтральных условиях. Исследован« покоящиеся и пролиферирумцие клетки 4/21, клетки Р 388 на 8-й день развития опухоли и голодающие клетки асцита Эрлиха.

Последние ь ходе инкубации в асцитической жидкости накапливают разрыва ДНК ца фоне активного синтеза поли-АПР-рибозц, что позволяет рассматривать процесс кг> ч модель клеточной

-1--1-. —--1-г-

10 20 30 40 50

Рио.11. Нуклеопротеид-иелит-хрсмагограмми ДНК , клеток Р меченных ник-трансляцией.

а - ядра, выделенные на 8-е сутки развития опухоли, б - пермеабилизироЕанные клетки. 1 - 4-е сутки развития; £

Я-а.

Стрелки обозначим'; I - кониц градиента НаС]; II - П.С1 мочевины; III - точку 90 С. , ..

По оси абсцисс - фракции; ординат - И ими./мин ■< 10" .

дифференцировки (И1е1окег>8 рЛ ал., 1983). Электрофорезом удавалось выявить быстродвижуадюся фракцию в тотальной ДНК всех трех препаратов, после фракционирования низкомолекулярная ДНК присутствовала лишь в транскрипционно-активной фракции. В клетках 4/21 низкомслекулярная ДНК выявлялась в транскрипционно-активной фракции, выделенной и из пролиферирукщих клеток, хотя в тотальной ДНК из-за своего низкого содержания она незаметна. Таким образом, в покоящихся клетках 4/21, РЭ08 и голодающих клетках асцитноР карциномы Зрлиха двойные разрывы ДНК накапливаются в транзкрип-ционно-активном хроматине.

Распределение разрывов ДНК в повторяющихся последовательностях различной сложности. Поскольку повторяющимся последовательностям ДНК в геноме еукариот приписывается регуляторная роль, представляло интерес выяснить, не накапливаются ли "регуляторные" разрывы именно в этих последовательностях. ДНК из пролиферирующи* и покоящихся клеток Р388, интактных и голодающих клеток асцита Ррлиха подвергали денатурации, злтем - ренатурацлл до определенных значений С ^ и разделяли елекгрофорезом в геле щелочной агарозы. Сравнивая електрофоретическую подвижность препаратов, определяли частоту разрывов для каждого ьначения . Полученные значения сильно колебались от опыта к опыту, но сохранялась неизменная тенденция: число разрцьов в повторах было всегда выше, чем е тотальной ДНК, а среди повторен различной сложности частота нарастала со снижением значения

Распределение разрывов ДНК в различных структурных генах. Техника молекулярной гибридизации с зондами на различные гены позволила исследовать их распределение ь електрофоретически разделенной ДНК покоящихся и голодающих клеток. ДНК подвергали електрофорчзу в нейтральных или щелочных условиях, после ч«го

переносили на фильтр и гибридизовали с зондами на клаотер генов пистонов и на .ген актина. Сравнивали распределение ДНК по окраске бромистым етидием и распределение последовательностей на радиоавтографе. Для генов гистонов распределение совпадало с распределением ДНК в целом, последовательности гена актина гибридизовалисъ в основном с высокомолекулярной ДНК, Таким образом, в голодакчцих и покоящихся клеткам разрывы затрагивают структурные гены в неодинаковой степени: накапливаются в кластера генов гиотоноэ, но практически отсутствуют в гене актина.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Для обобщения результатов работы вновь обраткмоя к схеме на рис. 6. Домен хроматина закреплен на ядерном матриксе в лепликативном комплексе топологической связью, образованной локально денатурированным участком ДНК. О наличии здесь однонитевой ДНК свидетельствует чувствительность прочной связи ДНК-матрикс к специфическим к однонитевой ДНК нуклеазам и обогащенность прочной связью фракции лизатов белков матрикса, содержащих од{нонитевую ДНК. Белковая часть прочного комплекса цродстчвлена полипептидами о ММ 180, 65-75, 63, 61, 5S, 52-53 кДн. Дезоксирибонуклемновея часть комплекса, по-видимому, содержит специфические последовательности, в частности, обогащена сайтами рестрикции длн EooRT, Pet.X, PvuIX, Alul, Sau TAX. Хроматин n этой области имевт достаточно открытую конформацию, повтому участок гиперчувсгвителен к ДНКазе1 и микрококковой нуклСвязь чувствительна к протголизу. Другая, слабая г.ьизь ДИН с яперным мптриксом образоьана ио+ншйи и водородными ойлзяки, ни ней замыкается субпетли. Здесь о ДНК взаимодействуют белки о Ml/ I ПО, 65-VO, 58, 47--г;0 кДд. ДМКазлХТ не зетрйгиыаот субпетля,

соединяющую места образования прочной и слабей связей. В дистальной части домена хроматин организован в нуклеосомную структуру. В зависимости от особенностей белкового состава частиц они разделяются на 3 класса - диссоциирующие в 1М, 2М и ЗМ КаС1. В транскрибируемых последовательностях преобладают 1М и ЗМ частицы, нетраискрибируемнх - 2Н. В дистальной части домона расположены участки, чувствительные к эндогенным ДНКазам и рестриктазам Илл<Ш1 и Мер!. 3 пролиферирукхцей клетке ДНК-белковые комплексы ассоциированы - они соединены непрерывной молекулой ДНК. При переходе клеток к покою наблюдается разобщение ДНК-белковых комплексов цоМенов. В области репликативкого комплекса вносятся однонитевые разрывы в -локально денатурированный участок ДНК, в детальные части домена -двунитевые. Однонитевые разрывы в основном накапливаются в повторяющихся последовательностях, ими обогащена также открепившаяся от матрккса ДНК. Двунигевые разрывы накапливаются в транскрибируемом хроматине. Домены различных генов затрагиваются разобщением в неодинаковой степени *

- 39 -ВЫВОДЫ.

1.В домене•хроматина еукяриот при помощи нуклеопротеид-целит-хзматографии обнаружены три типа ДНК-белковых комплексов, эяличпетциесл по устойчивости К диссоциирующим агентам! ДНКО, (сооциирующея n Т1яШ , ДНК1 •- в 1ЛС1-мочовине и ДШЦ'.1 - при jooxofl темперягуро.

2.ДИКИ и ДНКЛ образованы различными группвми белков верного матрикоч. С ДНКН ассоциированы белки реплгкативНого змплекса о М 180, 65-75 , 63, 61 , 58, 52-53 кДа. JJIKI образует эмплеко с полипчитидпми о ММ 180, 65-75, 5В, 47-50 кДа. Две вти йязи ДНК-мпгрипо не соответствуют овязям, обнаружипяетм Другими »•годями.

3.ДНКО обраяоппна белками хромптиня. По прочности связи НК--бедок частицы хромчтина разделяются на 3 класса: ассоциирующие в 1М, 2М и ЗМ NaOl.

4.Активный и нр^ктивный хроматин, разделенные по признаком уклея почувствителнюстн, влектрофоретической подвижности и эличив неметилировяннНх СрО островков различаются по содержанию !)Стиц, относящихся к разшш "прочностным" классам - активный ?от'й!».рц 1М и 'ЗМ, неактивный - 2М чзстицпми.

5 ..Устойчивые к депротеинизации белки, связанные с ДНК чг'чюгенмн по прочности связи ДНК-белок и образуют комплексы, оотпчтетпумцие ДИКО, ДНК1, ДИКИ, а также ковалентиые.

6.Переход клеток п состояние покоя сопровождается чрушениями вторичной и четвертичной структуры ДНК. В пок щихсп л°тках 4/2) и Р383 накапливают!. одно- и двунитевме разрывы ДНК, оторыг ренарирустся при возобновлении пролиферации. В ход« 9:'пития лейкоза Р?08 усиливается степень суперспирализации ДНК.

7.Накопление разрывов нарушает ассоциацию ДНК с ядерным

ыатривдох, часть ДНК сткрепляетсл от него и регистрируется на НЛЦ-хроматогриммах как. ЦНКО, часть теряет связь с реплмквтишшм комплексом - ДНК1. При етом происходит разобщение доменов ДНК.

8. ШЩ-хроматография позволяет картировать разрыв и внутри домена ДНК- ДНКаза1 вносит разрывы близ решшкативного комплекс; ДНКазаИ - на расстоянии, не нарушая ассоциацию точек связи ДИКИ и ДНК1.-Специфические к одчонитевой ДНК нуклеаз 3.! и Bal', вносят разрывы непосредственно в место образования прочной свнзг - в локально денатурированный участок в репликатионом коыплаксе. Эндогенные Ca^/llg2*-, Mn2+-, зависимые и кислая нуклеазц в дистальные части домена.

9.При помощи НЩ-хроматографни ядер, обработанных различишь рертриктазами проведено исследование распределения повторов с различным мотивом б домене ДНК- В клетках человека и мшии близ мест связи с репликативиьм комплексом представлены последовательности GUI'fO, QAGOTO, OG&.TOG, GTfiOAG, GATO, A.OCT, в •го время как AAGCM и COGG - в дао таль них частях домена.

10.Разрывы в покоящихся клетках распределены иерашюмерно г. геному. Двойные разрывы преобладают в транскрипциовдшо-активнай ДНК. Однолитевые сопутствуй им и накапливаются в открепившейся от Мйтрикса вследствие накопления двойных разрыаов фракц! хром&тина. Однонитевыми разрывами обогащены повторяющиеся последовательности. Домыш разных гыюв затронута фрагментацией i неодинаковой степени.

СПИСОК РАБОТ, 0ПУТУ111КО1Ш0Ш IIO ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1 .А.В.Лихтенштейн, Н.И.Сьяксте, М,М.8абойкий, В.С.Шрпот. Два типа взаимодействия ДНК о ядерным матриксоМ.// Тезисы докл. VIII Всео. симп. "Структура Н функции клеточного ядра". - Пущино, 1984. - С.174-175.

Я.Е.А.Эренпрейса, Н.И.Сьяксте. Структурные взаимодействия ДНК с внутриядерном матриксом.// ТеЭисы докл. VIII Воео. симя. "Структура и функции клеточного ядра". ~ Пущина, 1934. -D.184-736.

3.Т.Г.Сьлкетп, Н.К.Сьяксте. НПЦ-хромятогрофия как метод скрининга мутагенов.// Тезисы докладов XIV Ежегодной конференции Европейского обществ» по мутагенам внешней сромч. - Москва, 19В4.

- Г.481.

4.Д.И.Горин, А.В.Ермаков, Н.В.Челяпов, A.M.Серебряный, Л.В.Лихтенштейн, Н.И.Сьяксте, П.И.Цейтлин. Исследование возможных аффектов действия мутагенов-канцерогенов на генетические мишени оушариотов.// Тезисы докладов XIV Ежегодной конференции Европейского общества rio мутагенам внешней среды. Москва, 1904.

- С.РОО.

5.Н.И.Сьяксте, Т.Г.Сьякоте. НПЦ-хроматографня - метод для эпрнделенил пуло покоящихся и пролиферирующих клеток и рмоктивчостн противоопухолевых препаратов.// Тезисы докл. i Конференции прачей-лаборантоя Латн.СС! . - Рига, 1904. -2.140-141 .

6.Н.И.Сьяксте, Т.Г.Сьйкоте, Е.А.ЗренпреЙса. Зависимые от '1роли'{^ративного стг.тyen клетки изменения связи ДНК-матрикс.// Гезисы докл. VIII ОСиед. Симпозиума биохимических обществ СССР и ГДР "Проблемы современной биохимии и биотехнологии". - Рига

19Й5. - 0.197.

7.Н.И.Сыкс"ге, А.В.Лихтенштейн, В.О.Шапот. индуцированное гамма-облучением ослабление прочности связи ДНК с белками ядерного матрлкса.// Медицинская радиологи/!. - 1985. - Т. 19, вип.5. -,-,С.'.74~7б.

8.Н. И.Оьякоте, И.М.Вабойку , А.В.Лихтенштейн,

Е.Л Эронпрейпа, В.С.Шапют. Анализ вдеточьых нуклеопрэтгидов методом нуклеопротеид-пелит-хромятогряфии. ИХ.Два типа кзчимодэйствия ДНК с яд^рньм матрикоом.// Молекул, оиол. - Л,ЭЬЪ

- Т.19. вып.5. - Слгэч -1241 .

9.1'е.А.£г«1ргв!ва, ША йгкЗ лис1«аг п)з(.т'Х:{

геХ^Лопе: и! гглб-1гис1>ига1 мн! оу1ооЬет1оа.1 в^ийу оТ тоДе! кге^ей »НА .М^ rr.ri.Lar.lty ]_\С1-игоа.// 1тИнп «Г.,В>ф. В1оЛ . -198"?. У.23, Ко2. -?.126-130.

Ю.Н.Й.Сьшссте, Т.Г1 .Сьиксте. Открепление ДНК от ядерного мзтрикса в переведенных в постоянно покоя трансформированных фибропластах даулгарсчогс хомячка.// Ьиополкмерц и клетка..-,- 19

- Т.2, Н1. - С. 50-52.

11 Л).И.Оьяксть, Т.Г.Сьякете, Н.Д.Зале-окая. Обратимое накопление щзу- и одноичтеви рееривов ДНК при переходе клеток состояние локля.// Екля. вксп. биэл. мед. - 19Э6. - И3. -С. 167-169. <

1 2.Я.Г.Зренпройо, И.И.Сьяксте, Е.А.Эрентгрчйоа. Молекулярпа и клеточная гниетика в Латвийском научно-исследовательском институте е.чеперимйнтально'Л и клинической медицины,// Генетик!) селекция р. Латьмйокор ССР. - Рига,193?. - С.4-10.

13.Н.И.Сьяксте. Роль рчзргывеь Д?К в регуляции процессов клеточной пролиферации, дисйорегедероЕки и старени;'. Онтогенез. 1?Р7. - Т.1В, 1= Э. - С .229-238.

- 43 -

14.Н.И.Сьяксте. Модель топологической связи ЛИН-матрикс. 7 Всесоюзный Симпозиум '' Структура и Функции л легочного ядро", лис»; докладов. - Черноголовка. 1937. - C.G01 .

1Г>.Н.И.Сьяксте, Т.Г.Сьякств, А.В.Буд.'лин. Открепление ДНК от арного метрикса в покоящиеся гслетчах.// 17 Всесоюзный Симпогиун* груктура и функцли клеточного ядрп", Теоион ;,ойлрдов. -рноч-оловка, 1537. -- С.202.

16.Н.К.Сьякгто, А.Б.Будплин, Н.И.Сьпксте. Взаимоотношения :i и белков ядерного матрикоя при различных физиологических зто^никх клетки.// В кн.: Чслекулчрчые мехаьизмн регуляции гяболических ирспнссон. Сборник кратких научных сообщений эхимикоь Белорусской, Литовской, Латвийской и Эстонской ¡3eT<j|uix Социалистических Республик. - Минск, 1937. -■ С.'0-34.

17-Н.И.Сьяксте, Л.В.Вудилин. Изменение взаимодействий ДНК с лками хроматина и ядерного маурикоа при перевяр^опнии ядер стриктяэьми и пуклеэзсй Бэ131.// Биохимия. - - Т.1??,

п.1 . - С.С'4-60.

Ю.Н.И.Сьякгтр, Взаимодействия рагличных групп белков арного мятрчкга о ДНК.// Виохимия. - 1988. - Т.53» внп.Э. -

19.Н.И.Сьнксте, Т.Г.Сьикоте. Роль разрывов ДНК Е тологических процессах.// Вопр. мед. химии. - 19Р0. - Н4> -9-17 .

20.Н.И.Сьякоте, Л.В.Будылин. Прочность ДНК-белковых

вимодействий в различающихся, по чувствительности к нуклеазам акциях хроматина./'/ Молекул, генетика, микробиология И руоология. - 1980. - N10, - 0.30-34.

21.П.И.Сьмксте, Т.Г.Сьякств. Специфичность взаимодействия нцерогенных и цитостатичееких агентов с елэментями генома нб

пчзных уровня* его организации.// Экспериментальная онкология. 1988,, - Г.10, N2. - 0.3-8.

22.Н.И.Сьякоте. Роль разрывов ДНК и ДНК-белковых взаимодействий в регуляции пролиферации опухолевых клеток.// Цитология. - 1903,- Г.30, N9. - С.1146-1147.

23. Т.Р.Сьяксте, Н.И.Свяксте. Однонитевыв разрывы, вызван действием етилового спирта.// В кн.: ^коперименэашьные исследования патологических процеосов. - Рига, "Зинатне",1988. С.141-144.

24.Т.Г.Сьякоте, Е.Л.Эренпрейоа, Р А.Зирне, Н.И.Сьякоте. Ранние эффекты действия диметилсулъфзксида.// В кн.: Экотримедтольине исследования патологических процессов, - Ри "Зинатне",1983. - С.145-151.

25.Н.И.Сьяксте. Изменения надструктур1/ ДНК как показатель пролуЦэративной активности опухолевой клстш.// Объединенная научная конференция молодых ученых-медикс Латвийской ССР и студентов Рижского медицинского инотитута, посвященная 70-лети ВЛКСМ. Тезисы докладов. - Рига, 1988. - Т.1. - 4.2. - С.164-16

26.Н.И.Сьякоте, Д.Ю.Влохин. Всжовый состав комплекоов о "прочным" и "слабым" тишм связи, выделенных из клеток асцитно карциномы Эрлиха.// Биохимия. - 1989. - Т.546, вып.7. -

С.1217-122.1.

27.Н.И.Сьякоте, А.В.Будылин, Е.А.Эренпрейов. Роль структурных перестроек доменов ДНК в передаче сигналов факторе роста и Дифференцировки.// Цитология. - 1989. - Т.Э1. N9 -0.1129-1130.

28.Т.В.Аршавокая, Р.А.Йирне, Н.И.Сьякоте, Т.Г.Сьякоте,

В.А.Эр^нпреИоа, Д.К.Бондаре. Характеристик трансформированных вируоом 5У-40 фиброблаотов джунгарского хомячка линии 4/21.//

- 4Ь -

иестия АН Латвийской ССР. - 1989. - N7. - С.72-77.

2S.H.iI.Ci>flki'tb, А.В.Вудылин. Изменения вторичной и твертичиой структуры ДНК в ходе развития лейкоза 83.//Известия АН Латвийской ССР.- 1939. -N12 - 0.76-87.

ЗО.Н.И.Сьяксте, А.В.Будылин. Разрывы ДИК в голодающих [етках асцита Орлиха: распределение в участках ДНК, отличающихся ■ транскрипционной активности и с^руктупноЯ сложности.// !В«сгия АН ЛптвийоксИ ССР.- 1989. -N12 - С.88-95.

31.1.'.I.Sja1:ste, Т/рев o.f DM-proteir ¿rjteraetions rfJVeaied ' mo-clirorr'atosr^phy and their physioj.o£;loal blApiifiepnoe.// ih Nuolear t<or!:t,hop. Stpt. 18-23, 1989, ЯиясЗаХ. USSF. Frogram rl Abstraite, Cï.eriiOgolovHa, 1989. - P.16?.

Зг.Н.И.Сьяксте, А.В.Бу^ылин. Накопление разрывов в )Д|,ержащ1.й транскрибируемые последовательности фрзчций ДНК. жоящихся и голодающих.// Биополимеры и клетка. - 1930. - Т.6, . - С.'01-95.

зз.А.В.Будылин, Н.Я.Сьяксте. Структурные и?л-.»>нения доменов и хс.де развития некоторых пиреьиваем^х опухолей.//

V .туальние вопросы клинической и теоретической онкологии", »г-вриплы '/ конференции онкологов Литовской ССР, Латвийской ССР, зточскэй ССР.'Паланга, 28-30 марта, 1Э90 г. - Вильнюс, 1990. -ïis-b I. - С.68-70.

зи.сья1'0т9, а.В.Бу;'ЫЛ1лн. Ньрушениа вторичной структуры 1!С ;-ак грено адаптивной резкими 'сЛетки на изменение внешних 1Лоьий.// VII всесоюзный симпозиум 'Молекулярные механизмы пиитических лр^цессов". Тезисы докладов. - îîookbs ,1950. -O.Ç36.

Зй.Н.И.Сьякоте, Т.Г.Сьиксге. Исследование сопряженных с ро.ти'^рацией и диффоронцкроькой изменений в структуре доменов роматиня: перспективный подход для кли чческоН биохимии.//

- 46 -

Всеооюзна» школа-семинар "Молекулярная биология и медицина", 1 г—1 а .лая 1950 г., Ленинград. Тезисы докладов - Москва, 1990. С.бз.

Зб.Н.Н.С'.яксте. Локализация мест нуклеазйой атаки в домен хроматина, определяемая о помощью метода

н;<1июолро",'еу1д-целит-хроматограф1и.// Экспериментальная биологи (Вильнкс) - 1930. - N2 - С.160-161 .

37 .Н.И.Оьяксте, Т.Г.Сьяксте. Кеод.чородность ДНК-б«чковых взаимодействий в комплексах о прочное вязанными белками./'/ Вкспериме тальная биология (Вильнюс) - 1990. - N2 - С.162.

Зе.Н.И.Сьякоте, А.В.Вуднлин. Локализации разрывов, вносим нуклеазами, в доменах 3\роматина при помощи нуклеопротеид-целит -хроттогра^ми.// 'Л Всэосхй ый симпозиум "Структура и функции клеточного ядра", 10-14 окт. 1990 г., г.Гродно. - Москва, 1990. -С.119.

ЗЗ.Н.Н.Сьякоте, А.В.Вудилин. Распределение ДШТ различной прочности р активном и неактивном хроматине.// X Всесоюзный симпозиум "Структура и функции клеточного ядра", 4 0-1/, окт 1990 г., г.Гродно. -Москва,1990. -С.11?.

40.А.*.Будвши, Н.И.Сьзксте. Неоднородность распределении геноме'разрывов ДНК, возникающих при адаптации к изменениям условий существования клетки.// X Всесоюзный огмпозиум "Структ и функции клеточного ядра", 10-14 окт. 1990 г., г.Гродно - Москва,1990. - С.119-

41 .Н.И.Сь.чксте, А.В.Будшгиц. Распределение ДНК во фракция рязличаотдихся по прочности ассоциации и ядерным матриксом при аятиБЕЦИи ДНК.-ендонуклеаз клеточных ядер и действии ЬЧ-хукл^аэ // Молекул, генетика, микробиология и вирусология. - 1990. - N - Р.21-24.

- 47 -

42.Н.И.Сьяксте, Т.Г.Сьяксте. Гетерогенность по прочности связи с ДКК бэлков, устойчивых к депротеинизации.// Бюдл. екеп. биол. мяд. - 1990. -Т,1Ю, ИЗ. - С,194-196.

43 ..T.Erenpreisp, R.Zirne, Т.Arsha^skaya, N.Sjakste. Characterization of induced cliondrogenssiB. Histological and hisiooheinioal studies.// Latv. Zinätm AUadäraiJäs Vöatis. - 1990. -Nr.11. - 102.-107. 1pp.

44.H.H.Сьяксге, A.В.Будылин. Изменения в отруктуре доменов хроматина как этап генетического контроля пролиферации.// Второе всесоюзное совещание "Генетии ргзвития", Ташкент, 29-Э1 августа 1990. Тезису докладов. Тгрм Т (Часть II), "Генетика развития растений и животних". - Ташкент, 1990. - С.255-257.

45.N.I.S.jakste, A.V.Burtylin, T.G.Sjalote. Disoonnection of DK A domains in quiescieit and .iiiferentiating celle.// In: IJuolear Sfr-noture and Function. - Mew York, Plenum Publishing Corporation, 1990. -P.365-3S9. '

46.i{.I.Sjak6te, A.V.Budylin. NPC-ohromatography as a tool for studying chromatin domain integri-fcy and activity.// Abstracts. 20th Meeting of the Federation of European Biochemical Societies Organized by the Hungarian Biochemical Society. Budapest, Hungary. Ausist 19-24, 1Э90 - P.74.

47. Т.Г.Сьяксте, Н.И.Сьяксте. Химические соединения, повреждающие ДНК. - Рига, "Виттне", 1991. - 152 С.

4B.'Liohtenstein К.У.. ZaboiklnM.M., Sjaksta N.J., Aleohina R.P. BiiXerentiai distäooiatlon oi chromatin digests: a novel approach revealing a hierarohy of ENA-protein interaction» within chromatin domairis.// J. Cell Sol. -1991. - 7.S9. - P.503-S13.

49.Сьяксте H.H., будылин A.B. Ассоциация доменов хроматина с ядерным скелетом в клетках асцитной карцинома Эрлиха. Анализ

- AQ -

методом нуклеопротеид-целит-хроматографии// Биополимеры и клетка. - 1991. - Т.7, Н5. - С. 71-80.

50. Будылин A.B., Эренпрейоа Е.А., Сьяксте H.H. Изменения генетического аппарата клеток асцитной карциномы Эрлиха при их адаптации к голоданию: Тез докл.и сообщ., представл.на Всесоюз. соеещ. Клеточные механизм« адаптации, Чернигов, 22-24 ипр. 1991 // Цитология, 1991. - Т.33, N5. - С. 01.

51.Будылин A.B., ЭрениреЙса Е.А, Сьяксте Н.И. Предшеотвунхцие вгюптозу изменения в генетическом аппарате опухолеъы/ клеток // Второй Всесоюзный симпоз. Теорет. и прикл. аспекты молекулярн. биологии, Самарканд, 22-28 септ. 1991 : Тыз. докл - М., 1991. -С. 38.

52.Сьяксте Н.И. Три прочностных класса ДНП хроматпня // Второй Веесокуз. симпоз. Теорет и прикл, аспекты мол?куляр. биологии, Самарканд, 22-28 сент. 1991 ; докл.- М., 1991. - С 189.

53.Сьяксте Н.И., Вуднлин A.B. Структурные изменения хроматина на различных уровнях его организации при старении.// Онтогенез. - 1992. - Т.22, N 3. - С.34-45.

54.Сьякоте Т.Г., Сьяксте Н.И. Оообеннозти молекулярной организации клеточного ядра высших растений и ее изменения при развитии.// Цитология. - I992. - Т.34, N 3. - 0.3-16.

55.Сьякоте Н.И. ДНК-белксдене взаимодействия в различающихся по електрофоретической подвижности частицах хроматина.// Молекулярная генетика, вирусология и микробиология. - 199?. -N 1-2 - у.7-13.

чех. юс